CN106188339A - 一种免疫增强剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及海洋生物技术领域，具体讲是一种免疫增强剂及其制备方法。免疫增强剂的有效成分为壳聚糖硫酸酯类化合物，其壳聚糖硫酸酯类化合物为β‑C‑2，3，6‑硫酸酯‑壳聚糖。其结构式如下，其中n为聚合度：4‑40；该化合物的活性基团—硫酸酯基(OSO3 －)的含量为30‑35％。本发明化合物可显著增加NO及TNF‑α、COX‑2等多种细胞因子的表达，并从基因和蛋白水平进行了机理确定，该体外免疫增强活性，受活性基团硫酸酯基及其分子量的影响显著，有望开发成为一种新型免疫佐剂。其制备方法属均相反应。

Description

一种免疫增强剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体讲是一种免疫增强剂及其制备方法。
背景技术
免疫增强剂通常指的是在单用或与抗原同时使用时可增强机体免疫应答的物质，亦被称为免疫调节剂或免疫刺激剂。免疫增强剂可通过不同的作用途径发挥作用，如增强巨噬细胞的活性、增强抗原物质的免疫原性和稳定性以及促进抗体的合成与分泌等，从而增强机体的特异性和非特异性免疫应答。随着免疫学研究的不断深入，开发高效、稳定、安全的免疫增强剂越来越受到人们的重视。
巨噬细胞是调节机体固有免疫和适应性免疫反应重要的抗原递呈细胞，在宿主对病原菌感染的防御系统中扮演着重要角色，被刺激后可产生不同的炎性介质、细胞因子等，从而抵抗病原菌。因而本发明以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，测量NO表达量，并从mRNA和蛋白表达水平上测定iNOS、TNF-α、COX-2等细胞因子的表达量，为β-壳聚糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用提供参考依据。
甲壳素是世界第二大纤维素资源，由于来源不同，其构型可分为α-甲壳素、β-甲壳素、γ-甲壳素，目前研究最多的为α-甲壳素，为反平行结构，其次为β-甲壳素，为平行结构，不同构型的甲壳素可能显示不同的功效。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰得到的产物，其生物相容性好，但由于其难溶于水和大部分有机溶剂而限制了其应用；而本发明所用的衍生物壳聚糖硫酸酯除了具有以上优点外还具有良好的水溶性，因而应用更加方便。本发明制备了不同分子量β-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯，并以小鼠腹腔巨噬细胞为模型，测定其免疫指标及机理，从而为开发新的免疫增强剂提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫增强剂及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种免疫增强剂，免疫增强剂的有效成分为壳聚糖硫酸酯类化合物；其壳聚糖硫酸酯类化合物为不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。
所述不同分子量的β-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯有效剂量为50-200μg/mL。
所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖，其结构式为：
其中n为聚合度：4-40；该化合物的活性基团—硫酸酯基(OSO3 －)的含量为30-35％。
所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：
(1)磺化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌条件下滴加氯磺酸，使其在0-5℃反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5：1)-(10：1)；
(2)不同分子量的β-壳聚糖的制备：将高分子量β-壳聚糖溶于过量的酸性溶液中，而后再加入双氧水(使溶液中H2O2最终体积分数为3％)，混匀后于60-80℃水浴搅拌10-60分钟，得到不同分子量的β-壳聚糖；
(3)β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：称取上述获得的不同分子量的β-壳聚糖，加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后，再加入上述磺化试剂，混合均匀后，于微波降解反应器中，在微波辐射40-70℃条件下，40-70℃反应，反应后纯化后得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖；其中，β-壳聚糖、甲酸或二氯乙酸、N,N-二甲基甲酰胺按质量体积比为1:1-2.5：20-25(g：ml：ml)；β-壳聚糖与磺化试剂按质量体积比为1：15-25(g：ml)。
所述高分子量β-壳聚糖的分子量为2000kDa-4573kDa。其，来源于鱿鱼软骨、墨鱼软骨等材料。
所述步骤(2)酸性溶液为浓度为1-3％甲酸、乙酸或盐酸。
所述步骤(3)将分子量低于10KDa的壳聚糖原料，在40-45℃的微波辅助条件下反应1-3分钟，得到1000-4000Da分子量的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯；
将分子量在10-100KDa的壳聚糖原料，在45-55℃的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到4.5-10KDa的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯；
将分子量在100KDa以上的壳聚糖原料，在45-70℃的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到10-100KDa的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯。
所述步骤(3)微波辐射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积量的无水乙醇，沉淀，室温沉化30-60min，得到的沉淀物即是不同分子量的β-壳聚糖硫酸酯的粗产品；将上述粗产品抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，再用NaOH溶液将其中和，透析(根据制备的分子量的区别，将上述溶液用1500Da或3500Da的透析袋进行透析，除盐后取透析液；)，透析液浓缩，冷冻干燥得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。
一种壳聚糖硫酸酯类化合物的应用，其特征在于：壳聚糖硫酸酯类化合物作为免疫增强剂的应用；其中，壳聚糖硫酸酯类化合物为不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。
经测定可见不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖能够明显促进RAW264.7细胞产生NO，且具有剂量依赖性。
不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖可显著增加RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-1α、PGE2细胞因子的表达，且具有剂量依赖性。
不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖可促进TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上的表达，且随着时间的延长，呈先上升后下降趋势。
不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖可促进TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上的表达，且随着时间的增加，各细胞因子的蛋白表达量也增加。
本发明所具有的优点：
本发明所用壳聚糖硫酸酯类化合物是在壳聚糖经磺化后所得2，3，6位壳聚糖硫酸酯衍生物，并具有强聚阴离子性质，且无明显细胞毒性。同时本发明采用的壳聚糖硫酸酯类化合物的含硫量高，对壳聚糖原料利用率高；制备过程采用均相反应，制备方法简单快速，操作成本低，污染少。
本发明以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，通过产生的NO及IL-6、IL-lβ、IL-1α、TNF-α、PGE2等细胞因子的多少，可快速、准确地判断免疫活性强弱并了解其机理，且可检测是否有细胞毒性，为新型免疫增强剂的开发提供依据。
附图说明
图1为β-壳聚糖的红外表征谱图。在1645cm-1附近，β-壳聚糖只有一个氨基峰，而另一氨基峰则位于1598cm-1附近，符合β-壳聚糖结构特征。
图2为分子量为3169Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1215.33cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在809.04cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3 -)的存在。
图3为分子量为5030Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1219.52cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在811.99cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3 -)的存在。
图4为分子量为14481Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1213.41cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在810.16cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3 -)的存在。
图5为β-壳聚糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子mRNA水平的影响。
图6为β-壳聚糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子蛋白水平表达量的影响。
具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步说明如下。
本发明一种免疫增强剂β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备方法实施例如下：
(1)称取定量的β-壳聚糖；
(2)加1-3％的酸溶液，1-3％酸溶液与β-壳聚糖的体积/重量比为：6-30:1，将β-壳聚糖充分溶解；所述酸溶液主要为甲酸、乙酸、氯乙酸等。
(3)将上述充分溶解的原料，按β-壳聚糖与N,N－二甲基甲酰胺按照重量体积比1:20-25的量加入N,N－二甲基甲酰胺，充分搅拌混匀；
(4)在(3)中滴加30-60ml氯磺酸磺化剂，滴加完成后，充分搅拌均匀；
(5)将(4)充分混匀的原料放入到微波炉中反应2-8分钟；
(6)将上述反应液加入3倍体积的无水乙醇，出现大量白色絮状沉淀，放置室温沉化30min，得到的沉淀物即为较低分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的粗产品；
(7)将上述沉淀物进行抽滤，取白色或淡黄色滤饼；
(8)将上述滤饼用蒸馏水溶解，用2M NaOH溶液调节PH值至7；
(9)根据制备的分子量的区别，将上述溶液用1500Da或3500Da的透析袋进行透析，除盐后取透析液；
(10)将上述溶液浓缩，浓缩液冷冻干燥得淡黄色粉末状固体，即为β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。
表1不同辐射能量和作用时间对β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖各参数的影响
应用例
1不同浓度的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(5030Da)对RAW264.7细胞NO表达量的影响
(1)试验材料及试剂：
①将β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(5030Da)首先配制成50mg/mL，加药前用RPMI1640完全培养基稀释为400ug/mL，然后倍比稀释至400，200，100，50，25，12.5ug/mL；
②Griess A试剂配制：对氨基苯磺酰胺400mg溶于40mL5％的磷酸溶液中；
③Griess B试剂配制：40mgN-1-萘乙二胺盐酸盐溶于40mL超纯水中；
④RAW264.7细胞、RPMI1640培养基、胎牛血清。
试验方法：
①取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106cell/mL，于96孔板每孔接种100ul。
②在5％的CO2培养箱中37℃培养24h后，加入不同浓度的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(5030Da)各100uL，使其终浓度分别为6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每个样品设置3个复孔。LPS做阳性对照，终浓度为1ug/ml。
③将96孔板继续培养24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等体积(100ul)的Griess试剂(Griess A和Griess B等体积混合，现配现用)，室温避光放置10min，以完全培养基加显色剂作为空白对照，用酶联免疫检测仪570nm下测吸光度，平行重复3次，代入标准曲线y＝0.00755x+0.00023求出NO量。
④标准曲线的绘制：将1mol/L的NaNO2贮存液用水稀释至100μmol/L后，依次倍比稀释为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0umol/L浓度的NaNO2标准溶液。吸取100ul各浓度标准溶液于96孔板中，各浓度重复3孔，然后每孔加入100ulGriess试剂(Griess A和Griess B等体积混合，现配现用)，室温避光反应10min后，使用酶联免疫检测仪测540nm吸光度。以NaNO2标准溶液浓度为横坐标，以OD540为纵坐标，各浓度OD值扣除培养基空白对照OD值后，绘制NO标准曲线。
试验结果：不同浓度的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(5030Da)增加NO表达量的结果如下：
表1：不同浓度的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(5030Da)对NO表达量的影响：
从上表可以看出，β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(5030Da)能够明显促进细胞产生NO，且具有剂量依赖性。
2.β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)细胞毒性评价
(1)试验材料及试剂:
①0.5mg/mL的MTT溶液：噻唑蓝用超纯水配制为5mg/mL母液，避光保存，用前避光稀释10倍；
②Stopping buffer配制：10％(w/v)的十二烷基硫酸钠与0.01mol/L的盐酸配制200ml。
③RAW264.7细胞、RPMI1640培养基、胎牛血清。
(2)试验方法：
①取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。
②在5％的CO2培养箱中37度培养24h后，加入不同浓度的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖100ul，使其终浓度分别为6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每个浓度设置3个复孔。LPS做阳性对照，终浓度为1ug/ml。
③将96孔板继续培养24h后，弃去旧的培养基，然后每孔加入100uL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液。
④放入培养箱中培养4小时后，每孔加入100uLstopping buffer(终止液)，继续培养18小时，取出用酶联免疫检测仪于550nm测OD值。
(3)试验结果
用RAW264.7细胞评价细胞毒性结果如下：
表2：β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)的细胞毒性评价
由上表可以看出，低浓度的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)无明显的细胞毒作用，当浓度超过100ug/mL时有细胞毒性。
3.β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)对RAW264.7细胞细胞因子表达量的影响：
试验材料与试剂：
IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2细胞因子ELISA试剂盒试验方法：
①取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。
②在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)100ul，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每个浓度设置3个复孔。同时设置LPS阳性对照组，终浓度为1ug/ml，3个复孔。
③将96孔板继续培养24h后，收集细胞上清液，按照相应ELISA试剂盒说明测定细胞上清液中IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2的含量。
试验结果不同浓度β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)对各类细胞因子表达量的影响如下：
表3不同浓度β-壳聚糖硫酸酯对各类细胞因子表达量的影响
由上表可以看出，随着壳聚糖硫酸酯浓度的增加，其细胞因子表达量也增加，最高浓度的壳聚糖硫酸酯各细胞因子表达量可达空白对照的10倍，表明β-壳聚糖硫酸酯可显著增加各细胞因子的表达，且具有剂量依赖性。
4.β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)对RAW264.7细胞因子mRNA水平的影响
根据细胞增殖试验和NO试验结果，选择100ug/mL进行试验。
试验材料及试剂
①DEPC水配制：100mL超纯水中加入0.1mL的DEPC，37℃放置12小时后，121高压灭菌20分钟。
②Trizol、氯仿、异丙醇、溴化乙锭、琼脂糖、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒
(2)试验方法
①细胞的培养和处理：将RAW264.7细胞接种于六孔板中，接种密度为2.5×106个/mL，5个孔中每孔接种2mL。培养24小时后，弃去旧的培养基，除空白对照外，每孔加入β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)，使其终浓度为100ug/mL，置于细胞培养箱中分别培养0.5、1、3、6小时后，收集细胞于小离心管中。
②细胞RNA提取：每管中加入1mLTrizol试剂，用移液枪吹打数次促进细胞裂解，然后置于冰上静置10分钟，使核蛋白充分解离。然后每管中加入100μL氯仿，小心盖好管，充分剧烈震荡15秒，于冰上静置5分钟。然后4℃12000g离心15分钟，取上清液400μL，加入400uL异丙醇，轻轻混匀5次，室温下静置10分钟。4℃12000g离心8分钟后弃去上清，向沉淀中加入1mL的75％乙醇DEPC水，混匀。离心弃去上清，晾干后每管中加入30uLDEPC水溶解，然后测定提取的RNA量。
③逆转录反应：1uL的oligo dT与1uL的10×dNTP混合，加一定量的RNA和DEPC水，总体积达12uL，65℃变性5分钟，迅速转移到冰上，按试剂盒说明书加入FSB buffer、DTT、DEPC水，混匀，37℃水浴2分钟，于冰上冷却。然后每管加入1uL的M-MLVRT，逆转录反应条件为37℃，50min；70℃，15min。得到20uLcDNA体系，加入60uL灭菌水，置于-20℃冰箱保存。
④PCR扩增：采用试剂盒进行反应，体系如下：2×Es Taq Master Mix 10uL，正向引物Forward Primer(10uM)1uL，反向引物Reverse Primer(10uM)1uL，cDNA 2uL，不含RNA酶的水RNase-Free water加至20uL。PCR反应条件如下：
Program1：94℃，2min；1个循环数
Program2：94℃，30s；55-65℃，30s；72℃，30s；20-30个循环数Program3：72℃，2min
⑤电泳检测：0.25g琼脂糖加25mL0.5×TAE及0.5uL溴化乙锭制胶，每孔加入PCR反应后的溶液10uL，100v，30min跑电泳。放入电泳成像系统，拍照保存(参见图5)。
(3)试验结果
β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)对于TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上表达量的影响如图1，其中GAPDH为内参，由图5可以看出，β-壳聚糖硫酸酯可以促进上述细胞因子的表达，随着时间的延长，呈上升趋势。
5.β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)对RAW264.7细胞因子蛋白水平表达量的影响
(1)试验材料及试剂：
BCA法蛋白定量测定试剂盒、玻璃珠、蛋白裂解液、PVDF膜、对应的TNF-α、COX2、iNOS、β-actin一抗和二抗。
(2)试验方法
①细胞的培养和处理：将RAW264.7细胞接种于六孔板中，接种密度为2.5×106个/mL，5个孔中每孔接种2mL。培养24小时后，弃去旧的培养基，除空白对照外，每孔加入用新鲜培养基配制的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)2mL，浓度为100ug/mL，置于细胞培养箱中分别培养0.5、1、3、6小时后，收集细胞于小离心管中
②蛋白的提取：每管加入200uL蛋白裂解液和一小匙玻璃珠，充分震荡，4℃、12000rpm离心15min，取上清液即为蛋白提取液，BCA法测定蛋白浓度。
③煮沸变性后，以每孔40μg的核蛋白点样，SDS-PAGE分离。通过电转仪将凝胶上蛋白样品移至PVDF膜上，分别与一抗和辣根过氧化氢酶标记的二抗孵育，洗膜后加入发光剂和稳定剂，曝光拍照。
(3)试验结果
β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖(分子量5030Da)对TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上表达量的影响如图6，其中β-actin为内参，可以看出随着时间的增加，各细胞因子的蛋白表达量也增加。

Claims (7)

1.一种免疫增强剂，其特征在于：免疫增强剂的有效成分为壳聚糖硫酸酯类化合物；其壳聚糖硫酸酯类化合物为不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。
2.按权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：所述不同分子量的β-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯有效剂量为50-200μg/mL。
3.按权利要求1或2所述的免疫增强剂，其特征在于：所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖，其结构式为：
其中n为聚合度：4-40；该化合物的活性基团—硫酸酯基(OSO3 －)的含量为30-35％。
4.按权利要求1所述的免疫增强剂制备方法，其特征在于：所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：
(1)磺化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌条件下滴加氯磺酸，使其在0-5℃反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5：1)-(10：1)；
(2)不同分子量的β-壳聚糖的制备：将高分子量β-壳聚糖溶于过量的酸性溶液中，而后再加入双氧水混匀后于60-80℃水浴搅拌10-60分钟，得到不同分子量的β-壳聚糖；
(3)β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：称取上述获得的不同分子量的β-壳聚糖，加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后，再加入上述磺化试剂，混合均匀后，于微波降解反应器中，在微波辐射条件下，40-70℃反应，反应后纯化得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖；
其中，β-壳聚糖、甲酸或二氯乙酸、N,N-二甲基甲酰胺按质量体积比为1:1-2.5：20-25:(g：ml：ml)；β-壳聚糖与磺化试剂按质量体积比为1：15-25(g：ml)。
5.按权利要求4所述的免疫增强剂制备方法，其特征在于：所述步骤(3)将分子量低于10KDa的壳聚糖原料，在40-45℃的微波辅助条件下反应1-3分钟，得到1000-4000Da分子量的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯；
将分子量在10-100KDa的壳聚糖原料，在45-55℃的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到4.5-10KDa的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯；
将分子量在100KDa以上的壳聚糖原料，在45-70℃的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到10-100KDa的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯。
6.按权利要求4所述的免疫增强剂制备方法，其特征在于：所述步骤(3)微波辐射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积量的无水乙醇，沉淀，室温沉化30-60min，得到的沉淀物即是不同分子量的β-壳聚糖硫酸酯的粗产品；将上述粗产品抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，再用NaOH溶液将其中和，透析，透析液浓缩，冷冻干燥得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。
7.一种壳聚糖硫酸酯类化合物的应用，其特征在于：壳聚糖硫酸酯类化合物作为免疫增强剂的应用；其中，壳聚糖硫酸酯类化合物为不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。
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