CN104797242A - 含有病毒的配制物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及配制物，其包含(i)至少一种基于病毒的材料，(ii)选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物的至少一种聚合物，(iii)至少一种糖，(iv)至少两种不同的氨基酸，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。这种配制物特别适于冻干。本发明还涉及相应的干燥产物以及其制备方法。本发明还涉及包含所述干燥产物的复水材料，所述复水材料可以给需要其的患者施用。这种配制物和复水材料可用作疫苗，优选用于治疗和/或预防癌症、感染性疾病和/或自身免疫疾病。

Description

含有病毒的配制物及其应用
技术领域
本发明涉及生物学活性材料如基于病毒的材料(例如病毒、病毒颗粒、病毒疫苗……)的配制物，或者更精确地，涉及适于其贮存的配制物的领域。本发明还涉及这种配制物的制备。更精确地，本发明涉及一种配制物，其包含(i)基于病毒的材料，(ii)选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物的至少一种聚合物，(iii)至少一种糖，(iv)至少两种不同的氨基酸，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐，及任选地，(vi)药物学可接受的缓冲液。更特别地，本发明的配制物适于干燥加工，更特别是冷冻干燥加工。本发明进一步涉及获得的干燥产物，及更特别是获得的冷冻干燥的产物。本发明的配制物和干燥产物可用作疫苗以预防和/或治疗疾病如癌症、自身免疫疾病和感染性疾病。
发明背景
在例如制药工业中使用的生物学活性材料的贮存和运输存在问题，因为这些材料容易降解，特别是热降解。特别地，这在生物学活性材料如疫苗的情况中确实如此，所述疫苗可在世界范围内分布，并且因此需要根据分布的国家而经受不同温度或者经受转运期间的温度变化。这进一步限制了所述生物学材料在基础设施有限的发展中国家的分布。
基于病毒的材料，包括病毒、病毒颗粒、病毒疫苗的治疗活性要求在贮存和/或运输期间保持其结构完整性，以使其具有感染性和/或生物学活性。
基于病毒的材料的结构完整性在配制过程中通常被损害，因此妨碍其治疗应用。所述治疗活性进一步要求病毒滴度丧失及特别是感染性滴度丧失是有限的。
因此开发新的方法或配制物以使用于工业化应用如疫苗的生物学活性材料稳定、改善这些生物学材料的贮存和运输能力是制药工业的持续目标。
已经提出的一种方案是将生物学活性材料维持在特定温度范围内，特别是在较低温度，即低于0℃，特别是直至-30℃及更优选直至-80℃。这种超低温贮存不仅非常昂贵，而且产生显著的贮存、转运和临床应用的不便。因此，开发可以在冷藏条件贮存的配制物是必需的。
根据一种选择，已经提议所述生物学活性材料与动物或人来源添加剂，如白蛋白、蛋白胨、明胶或尿素交联明胶，一起配制。然而，这些成分的使用由于安全性问题而受限，如过敏反应的危险或感染性物质(例如BSE(牛海绵状脑病))污染或传播的危险。此外，这种方案通常是昂贵的，因此与工业化生产不相容。
此外，假设基于病毒的材料当以液体形式在冷藏条件下贮存很长时间不保持其感染性。结果，关于在冷藏条件下以液体形式配制和贮存病毒尚无报道的研究。因此，仍需要长期贮存稳定的病毒制备物配制物。
另一选择是以干燥形式保存生物学活性材料，特别是基于病毒的材料。在可利用的干燥生物材料的技术中，冷冻干燥(也称作冻干法)代表生产生物学药物如疫苗的关键步骤。冷冻干燥使得干燥的生物学产物在大约4℃-8℃是稳定的，及在一些情况中在直至大约25℃是稳定的。冻干法已经广泛用于改良各种病毒疫苗和重组蛋白质产物的稳定性。
冷冻干燥方法包括以下连续步骤，冷冻生物学材料的溶液或悬浮液及随后进行初级和次级干燥步骤(参见Adams,2007,Methods Mol.Biol.368,15-38)。基本上，这种技术基于水在零下温度在真空下的升华而无溶液熔化。然而，水蒸气从冷冻的生物学材料中的扩散速率非常低，因此该程序很耗时。此外，冷冻和干燥阶段引入胁迫例如盐浓度、沉淀/结晶、剪应力、极端pH、通过冷冻干燥方法保留的残余水分……)，其迫使生物学材料经历明显的化学和物理改变，及对于一些生物学材料如基于病毒的材料造成极大损害。因此适合的配制物以在干燥期间及有利地进一步在贮存和/或运输期间保存该生物学活性材料是必需的。
现有技术领域提供了用于冷冻干燥生物学材料、更精确地是基于病毒的材料的配制物的实例。
为了限制脊髓灰质炎病毒制备物的感染性滴度丧失，WO89/06542提议在37℃在存在由10％海藻糖作为唯一防护剂的稳定化溶液的条件下干燥病毒原液。然而，感染性滴度的下降仍很大且高于对非干燥的疫苗的观测结果。
EP 0 872 249描述了重组病毒载体制备物，其包含谷氨酸或其钠盐和葡萄糖的组合。
WO 95/10601揭示了水性重组病毒溶液，其包含糖、高分子量结构添加剂、氨基酸、缓冲液和水。
WO 03/053463揭示了痘苗病毒配制物，其包含蔗糖、葡聚糖、谷氨酸和无磷酸盐的缓冲液。
WO 2005/066333描述了一种病毒组合物，其包含尿素、糖、盐、缓冲液、分散剂以及必需和非必需氨基酸的混合物。
WO 2007/056847揭示了含有病毒的配制物，其包含蔗糖、山梨糖醇、聚乙烯吡咯烷酮、尿素、TRIS缓冲液、谷氨酸一钠及另一氨基酸如精氨酸、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。
WO2008/114021和WO2011/121306描述了病毒组合物，其包含聚乙烯亚胺化合物，任选地，与一或多种糖组合。
然而，仍需要一种新的配制物，使得可以稳定生物学材料，特别是基于病毒的材料，使得可以工业化应用、贮存而不影响产物的生物学活性，更特别是避免病毒滴度丧失。
本发明提供了含有基于病毒的材料的配制物，更特别是适于冷冻干燥的水性配制物。根据优选的实施方案，本发明的配制物在如后文定义的长期稳定性测试中，更特别是在贮存期间在温度高于0℃，特别是在大约4℃-30℃之间，优选在大约4℃-25℃之间，更优选在大约2℃-8℃之间及更优选在大约4℃-5℃之间(例如冷藏温度)是稳定的。
发明内容
配制物
根据第一个实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含(i)至少一种基于病毒的材料，(ii)选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物的至少一种聚合物，(iii)至少一种糖，(iv)至少两种不同的氨基酸，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
除非另外指出，在本申请中使用的如下术语具有如下含义。
在本文中“和/或”包括“和”、“或”及“该术语联系的要素的所有或任何其它组合”的含义。
“包含(comprising)”和“包含(comprise)”是指材料、产物、配制物、组合物和方法包括引用的成分或步骤，但是不除外其它。“基本由…组成(consisting essentially of)”和“基本由…组成(consist essentially of)”当用于定义产物、组合物和方法时，是指排除任何本质意义的其它成分或步骤。因此，例如基本由所列举的成分组成的组合物不排除微量的污染物和药物可接受的载体。“由…组成(consisting of)”和“由…组成(consist of)”是指排除超过微量要素的其它成分或步骤。
如本文使用，“大约”或“近似”是指在指定数值或范围的10％，更优选在5％以内。根据这个定义的特定实施方案，“大约x”也包括x。
根据优选的实施方案，本发明的配制物是水性配制物。这种配制物，特别是冷冻干燥的，适于贮存在冷藏温度或者贮存在非冷藏温度(例如室温)。
根据本发明，“基于病毒的材料或产物”是指病毒、病毒颗粒、病毒载体和病毒疫苗。这些术语是同义词且可互换使用。该术语包括野生型病毒、杀灭、活的减毒的、失活的和重组的病毒。其进一步包括基于病毒的产物，如病毒载体、病毒颗粒如病毒样颗粒(VLPs)或核壳体。
根据本发明，“病毒”优选涉及在疫苗中使用的那些病毒，更优选DNA病毒，如腺病毒科、疱疹病毒科和痘病毒科。
根据更优选的实施方案，“病毒”是指痘病毒载体。本发明的痘病毒更优选是指脊索痘病毒(Chordopoxvirus)(脊椎动物痘病毒)。脊索痘病毒包括但不限于正痘病毒、副痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒(Lepripoxvirus)、猪痘病毒、软疣痘病毒或者亚塔痘病毒。本发明优选的脊索痘病毒是正痘病毒。根据另一个优选的实施方案，其选自痘苗病毒，合适的痘苗病毒包括但不限于Copenhagen毒株(Goebel et al.,1990,Virol.179,247-266and517-563；Johnson et al.,1993,Virol.196,381-401)、Wyeth毒株、Elstree、Western Reserve(WR)、IHDJ，及其衍生的高度减毒的病毒包括MVA、NYVAC(见WO 92/15672-Tartaglia et al.,1992,Virology,188,217-232)。所述载体也可以得自痘病毒科任何其它成员，特别是鸟痘病毒(例如TROVAC，见Paoletti et al,1995,Dev Biol Stand.,84,159-163)、金丝雀痘病毒(例如ALVAC,WO 95/27780,Paoletti et al,1995,Dev Biol Stand.,84,159-163)、鸽子痘病毒、猪痘病毒等。
根据一个实施方案，所述病毒载体是能复制的载体，其能感染哺乳动物细胞，特别是分裂细胞(即溶瘤载体)，及更特别是选自痘苗病毒毒株Copenhagen或WR的能复制的痘病毒载体(见例如WO2009/065547、WO2009/065546或WO9531105)。
根据另一个实施方案，所述病毒载体是减毒的痘病毒，特征在于其在人细胞系中再生性复制能力丧失。
根据优选的实施方案，本发明的基于病毒的材料是选自痘苗病毒(VV)和修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)的病毒或病毒颗粒。
优选的VV可以是如专利申请WO2009/065546、WO2009/065547或WO95/31105中描述的VV，上述申请描述了具有免疫刺激细胞因子GM-CSF或者具有自杀基因的VV。
本发明优选用修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)进行(Sutter et al.,1994,Vaccine,12,1032-40)。典型的MVA毒株是MVA 575，其保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心，保藏号为ECACC V00120707。根据本发明可用的MVA毒株的其它例子是保藏在CNCM的保藏号为No I-721的MVA毒株，保藏在ECACC的保藏号为V00083008.MVA II/85的MVA-BN，保藏在ECACC的保藏号为V94012707的MVA-572，或者任一这种病毒的衍生物。
如前文定义，本发明的病毒可以是野生型、减毒的或重组病毒，更优选是重组痘病毒。
术语“重组”病毒是指这样的病毒，特别是痘病毒，其包含插入其基因组中的外源序列。如本文所用，外源序列是指不天然存在于亲代病毒中的核酸。
这种重组病毒的实例是JX-594/TG6006，其是胸苷激酶失活的痘苗病毒(Wyeth毒株)，表达免疫刺激细胞因子，所述免疫刺激细胞因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，即GM-CSF(见WO95/31 105、WO2007/030668和WO2008/1 13078)。另一实例是胸苷激酶(TK-)和核糖核苷酸还原酶(I4L-)双失活的痘苗病毒TG6002(Copenhagen毒株)，其表达自杀基因如FCU1自杀基因(见WO2009/065546)。
所述外源序列也可以置换靶细胞中有缺陷的基因的功能。哺乳动物包括人有几千种遗传疾病是由有缺陷的基因导致的，例如包括囊性纤维化、杜氏肌营养不良或镰状细胞贫血病的疾病。许多类型的癌症也是由有缺陷的基因导致的，特别是原癌基因及经历突变的肿瘤阻抑物基因，例如原癌基因ras、src、bcl等。肿瘤阻抑物基因的例子是p53和Rb。
根据另一种可能性，所述外源序列可以编码肿瘤相关抗原(TAA)。TAA是指在肿瘤细胞比在相同组织类型的非肿瘤细胞中以较高频率或密度检测到的分子。TAA的例子包括但不限于CEA、MART1、MAGE1、MAGE3、GP-100、MUC1，如在并入本文作参考的WO 92/07000、WO 95/09241中所述，优选MUC1。
所述外源基因进一步编码抗原。优选地，所述抗原衍生自病毒如HIV-1(例如gp 120或gp 160)、任何猫免疫缺陷病毒、人或动物疱疹病毒如gD或其衍生物或者即早蛋白质如来自HSV1或HSV2的ICP27、巨细胞病毒(如gB或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(如gpI、II或III)，或者来自肝炎病毒如乙肝病毒(HBV)例如乙肝病毒表面抗原或其衍生物(见WO201 1/015656和WO2013/007772)、甲肝病毒(HAV)、丙肝病毒(HCV，见WO 04/111082，优选来自基因型1b毒株的非结构HCV蛋白质)及戊肝病毒(HEV)，或者来自其它病毒病原体如呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒(HPV，见WO90/10459、WO 95/09241、WO 98/04705、WO 99/03885和WO 07/121894，优选来自HPV16毒株的E6和E7蛋白质，也见Liu et al.Proc Natl Acad SciU S A.2004Oct 5；101Suppl 2:14567-71)或者流感病毒，或者衍生自细菌病原体如沙门氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋体(例如OspA或OspB或其衍生物)，或者衣原体，或者鲍特氏菌如P.69、PT和FHA，或者衍生自寄生虫如疟原虫或弓形虫。根据本发明，优选地，所述抗原选自HCV或HPV。在这方面，用于本发明的配制物中的这种优选的重组病毒是MVA-HCV(见WO 04/111082)，也称作TG4040，其是表达HCV NS3、NS4和NS5B抗原的MVA(NS3和NS4表达为融合蛋白，NS5B单独表达)。
所述重组病毒可包含多于一个外源序列，每个外源序列可编码多于一个分子。例如，其可用于在同一重组病毒中使编码例如TAA的外源序列(如前述)或抗原(如前述)的外源序列与编码细胞因子(例如白细胞介素(IL，如IL2)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素-(IFN)、集落刺激因子(CSF))的外源序列相关联。
在这方面，根据本发明所使用的优选的重组病毒是：
.MVA-[MUC1-IL2]，其是表达MUC-1抗原和IL-2的MVA(见WO92/07000和WO 95/09241)，也称作TG4010；及
.MVA-[HPV-IL2]，其是表达HPV-16的非致癌E6和E7抗原和IL-2的MVA(见WO 90/10459、WO 95/09241、WO 98/04705、WO 99/03885和WO07/121894)，也称作TG4001。
根据优选的实施方案，本发明的基于病毒的材料是基于痘病毒的产物，特别是基于VV的产物如所谓的JX-594/TG6006和TG6002或者基于MVA的产物如所谓的TG4040、TG4010和TG4001。
本发明的配制物中含有的痘病毒可以是天然存在的痘病毒、减毒的痘病毒或者重组痘病毒。
用于生产和纯化本发明所使用的基于病毒的材料、尤其是病毒载体和/或病毒的方法为本领域技术人员已知。更特别地，关于痘病毒，可利用的生产方法包括在细胞系(例如HelaS3或鸭细胞系)、含胚卵或者鸡胚成纤维细胞(CEF)中复制病毒。CEF细胞更特别用于生产基于MVA的产物。可以将其在本领域技术人员已知条件下培养。根据WO 07/147528，从CEF或细胞系上清中产生的病毒可以通过深度过滤、微过滤和透析过滤纯化。
WO 2010/130753描述了一种使用核酸酶生产痘病毒及使用阴离子交换吸附剂进一步纯化该病毒的方法。
然而，使用本发明的配制物获得的结果与配制物中的病毒是未纯化的、纯化的或者部分纯化的病毒无关。优选纯化或部分纯化的病毒。如本文使用，“纯化的”是指与粗制的病毒制备物的蛋白质含量相比蛋白质含量降低至少90％，而“部分纯化的”是指相对于粗制病毒制备物的蛋白质含量显著降低(例如至少20％)。
根据本发明的一个实施方案，所述配制物包含至少一种基于病毒的材料，其是病毒，且所述配制物中该病毒滴度在1×106Pfu/mL-1×1010Pfu/mL之间，优选在1×107Pfu/mL-1×109Pfu/mL之间，更优选在1×107Pfu/mL-5×108Pfu/mL之间，及更优选在1×108Pfu/mL-5×108Pfu/mL之间。
本发明的配制物进一步包含(ii)选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物及其混合物的至少一种聚合物。
如本文所用，术语“聚乙烯吡咯烷酮”是指由单体N-乙烯吡咯烷酮制成的水溶性的聚合物。该术语和缩写PVP、聚维酮(povidone)、聚维酮(plasdone)、聚维酮(polyvidone)、交聚维酮、科利当可互换使用。
如本文所用，术语“PVP衍生物”及其变化是指包含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的物质及其取代的形式，包括但不限于：共聚维酮(例如聚维酮S-630和科利当VA-64，及交联的PVP(例如交聚维酮，也称作聚乙烯聚吡咯烷酮或PVPP)。
根据本发明，PVP及其衍生物的分子量在5kDa-400kDa范围，更优选在5kDa-70kDa范围。根据有利的实施方案，PVP及其衍生物具有低分子量，即其分子量不超过55kDa，优选在10kDa-40kDa之间，优选在15kDa-30kDa之间，更优选为25kDa。低分子量的PVP比高MW的PCP免疫原性低，且在注射期间更好耐受。
根据优选的实施方案，本发明的配制物包含5g/L-80g/L的PVP或其衍生物或其混合物，优选10g/L-50g/L，更优选15g/L-40g/L，及更优选20g/L-35g/L的PVP或如上文定义的其衍生物。根据一个特定的实施方案，本发明的配制物包含33.25g/L的PVP，更特别是分子量为25kDa的PVP。
本发明的配制物进一步包含(iii)至少一种糖。
所述糖更优选选自单糖、二糖、三糖和四糖及其衍生物。
根据本发明优选单糖如葡萄糖、半乳糖和甘露糖。
根据本发明的二糖优选选自蔗糖(也称作saccharose)、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、异麦芽糖和麦芽酮糖。
根据本发明优选三糖如蜜三糖。
根据本发明也考虑四糖如水苏糖。
根据优选的实施方案，本发明的配制物包含至少一种二糖。根据更优选的实施方案，所述二糖选自蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖纤维二糖、异麦芽糖和麦芽酮糖，有利地，是蔗糖。
根据优选的实施方案，本发明的配制物包含10g/L-100g/L的糖，优选20g/L-80g/L，更优选30g/L-70g/L及更优选40g/L-60g/L。根据本发明的一个更优选的实施方案，所述配制物包含50g/L的糖，优选50g/L蔗糖。
根据优选的实施方案，本发明的配制物的糖与PVP的重量比率(糖/PVP(w/w))是至少1，优选1-5，更优选1-2，优选1.5。
本发明的配制物进一步包含(iv)至少两种不同的氨基酸。
优选地，所述氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸盐、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸盐、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、吡咯赖氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸及其衍生物，包括它们的两种立体异构体在内。
谷氨酸盐是指谷氨酸的药物可接受的盐形式，优选其是谷氨酸的单价盐，更优选是单钠盐，即谷氨酸一钠(MSG)。
根据一个优选的实施方案，本发明的配制物包含选自L-立体异构体的至少一种氨基酸，例如L-精氨酸。
根据一个优选的实施方案，本发明的配制物包含选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸的至少一种氨基酸。
根据另一个优选的实施方案，本发明的配制物包含选自天冬氨酸盐和谷氨酸盐的至少一种氨基酸。
根据优选的实施方案，本发明的配制物包含精氨酸和谷氨酸盐。
根据优选的实施方案，本发明的配制物包含氨基酸总量为10g/L-200g/L，优选10g/L-150g/L，更优选10g/L-100g/L。
根据另一个优选的实施方案，本发明的配制物包含5g/L-100g/L及优选5g/L-80g/L的精氨酸。浓度为5g/L-20g/L的精氨酸更适于高病毒滴度(例如大约1×108PFU/mL或更高)的病毒配制物，较高浓度的精氨酸更适于较低病毒滴度(例如低于1×108PFU/mL)的病毒配制物。
根据更优选的实施方案，本发明的配制物包含1g/L-50g/L，优选1g/L-20g/L，更优选1g/L-10g/L及更优选1g/L-5g/L的谷氨酸盐。根据本发明更优选的实施方案，所述配制物包含2.49g/L的谷氨酸盐。
根据本发明的一个特定实施方案，所述配制物包含2.49g/L的谷氨酸盐和8.43g/L的精氨酸。
根据本发明的更优选的实施方案，所述配制物包含2.49g/L的谷氨酸盐和42.13g/L的精氨酸。
根据本发明的更优选的实施方案，所述配制物包含2.49g/L的谷氨酸盐和56.04g/L的精氨酸。
本发明的配制物进一步包含(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐。
已知磷酸盐导致pH改变，并且认为其用于配制物中存在问题(见例如Freeze Drying of Pharmaceuticals&Biologicals Conference,August 6-9,2008,Great Divide Lodge Breckenridge,Colorado)。相似地，EP1418942表明，在含有基于病毒的材料特别是痘病毒的配制物中，磷酸盐的存在诱导病毒聚集和沉淀，特别是在干燥期间。令人惊奇地，本发明的发明人说明，在本发明中磷酸盐缓冲液参与所要求保护的配制物的稳定化性质。
根据一个实施方案，本发明的药物可接受的盐的至少一种选自钠盐和钾盐，及其组合。
根据优选的实施方案，所述配制物的至少一种药物可接受的盐是磷酸盐，选自磷酸二氢盐、磷酸一氢盐和正磷酸盐。
根据一个实施方案，所述配制物的至少一种药物可接受的盐是磷酸盐，选自磷酸一钠(NaH2PO4)和磷酸一钾(KH2PO4)。
根据另一个实施方案，所述配制物的至少一种药物可接受的盐是磷酸盐，选自磷酸二钠(Na2HPO4)和磷酸二钾(K2HPO4)。
根据另一个实施方案，所述配制物的至少一种药物可接受的盐是磷酸盐，选自磷酸三钾(K3PO4)和磷酸三钠(Na3PO4)。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述配制物的至少一种药物可接受的盐是磷酸二钠Na2HPO4。
根据另一个实施方案，本发明的配制物包含(v)至少两种磷酸盐，其形成磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液更优选是包含至少一种磷酸二氢盐和至少一种磷酸一氢盐的混合物。所述磷酸盐缓冲液更优选是包含磷酸二钾盐(KH2PO4)和磷酸二钠盐(Na2HPO4)的混合物。因此，根据一个优选的实施方案，本发明的配制物包含(v)磷酸二钾盐(KH2PO4)和磷酸二钠盐(Na2HPO4)。
根据一个特定的实施方案，本发明的配制物包含(v)磷酸二钾盐(KH2PO4)和磷酸二钠盐(Na2HPO4)的比率为大约1:5。
根据另一个优选的实施方案，本发明的配制物包含至少0.1g/L，优选0.1g/L-10g/L及更优选0.1g/L-5g/L的磷酸盐。
根据本发明的一个特定的实施方案，所述配制物包含至少0.1g/L，优选0.19g/L的磷酸盐。
根据另一个优选的实施方案，本发明的配制物包含至少0.1g/L的Na2HPO4，优选0.1g/L-5g/L的Na2HPO4。
根据本发明的一个特定的实施方案，所述配制物包含0.19g/L的磷酸盐，特别是0.19g/L的Na2HPO4。
根据另一个优选的实施方案，本发明的配制物包含至少0.1g/L的KH2PO4，优选0.1g/L-5g/L of KH2PO4，更优选0.1g/L-1g/L的KH2PO4，及更优选0.1g/L-0.6g/L的KH2PO4。
根据本发明的另一个特定的实施方案，所述配制物包含0.94g/L磷酸盐，优选0.79g/L的Na2HPO4和0.15g/L的KH2PO4。
根据本发明另一个特定的实施方案，所述配制物包含1.88g/L磷酸盐，优选1.59g/L的Na2HPO4和0.29g/L的KH2PO4。
根据本发明的另一个特定实施方案，所述配制物包含3.75g/L磷酸盐，优选3.17g/L的Na2HPO4和0.58g/L的KH2PO4。
在本发明中，优选所述配制物包含至少1g/L磷酸盐缓冲液(例如至少1.2、1.5、1.6、1.7或1.8g/L)。优选的配制物包含如上文定义的这两种磷酸盐缓冲液(例如1.59g/L的Na2HPO4和0.29g/L的KH2PO4，或者3.17g/L的Na2HPO4和0.58g/L的KH2PO4)及如上文定义的精氨酸(例如大约8.43g/L或更多)。
根据另一个特定实施方案，本发明的配制物包含(v)至少一种另外的药物可接受的盐，其不是磷酸盐。
根据一个实施方案，所述另外的药物可接受的盐是单价盐。根据一个优选的实施方案，所述另外的药物可接受的盐选自NaCl和KCl，优选NaCl。
根据一个实施方案，本发明的配制物包含1g/L-10g/L，优选不超过5g/L及更优选1g/L-5g/L的所述另外的药物可接受的盐。
根据本发明的一个特定实施方案，所述配制物包含3.89g/L的NaCl。
根据本发明的一个特定实施方案，所述配制物包含1.94g/L的NaCl。
本发明的配制物可进一步包含(vi)药物可接受的缓冲液。
根据一个实施方案，本发明的配制物包含药物可接受的缓冲液。
根据一个实施方案，本发明的配制物的pH为大约7-大约8.5，优选7.5±0.5，更优选7.5。可以用各自量的磷酸盐，优选KH2PO4和Na2HPO4根据本领域技术人员熟知的方法如Sorensen in Hayat,1986所述方法调节pH。
所述药物可接受的缓冲液可选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐。根据优选的实施方案，所述缓冲液是TRIS或HEPES，优选TRIS。
根据一个优选的实施方案，本发明的配制物包含大约1mM-大约100mM及优选大约1mM-大约50mM所述药物学可接受的缓冲液。
根据本发明的一个特定实施方案，所述配制物包含大约10mM的TRIS，特别是1.61g/L的TRIS。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)至少一种基于病毒的材料，(ii)至少一种聚合物，选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物，(iv)至少两种不同的氨基酸，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种盐是磷酸盐，及其中所述磷酸盐是磷酸二钠盐，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液，其更优选选自TRIS或HEPES。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)至少一种基于病毒的材料，(ii)至少一种聚合物，选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物，(iv)至少两种不同的氨基酸，(v)磷酸二钠盐与磷酸单钾盐的混合物，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液，优选选自TRIS或HEPES。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)至少一种基于病毒的材料，(ii)至少一种聚合物，选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物，(iv)至少两种不同的氨基酸，(v)磷酸盐二钠盐、磷酸单钾盐和NaCl的混合物，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液，其更优选选自TRIS或HEPES。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐，及任选地，(vi)一种药物可接受的缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少一种单价磷酸盐和/或至少一种二价磷酸盐的混合物，及任选地，(v)药物可接受的缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少一种磷酸盐和至少一种单价盐，优选NaCl，及任选地，(vi)一种药物可接受的缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少一种单价磷酸盐和/或至少一种二价磷酸盐及至少一种单价盐，优选NaCl，及任选地，(v)一种药物可接受的缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐及至少一种单价盐，优选NaCl，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和磷酸单钾盐及至少一种单价盐优选NaCl的混合物，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少一种单价磷酸盐和/或至少一种二价磷酸盐的混合物，及任选地，(v)药物可接受的缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和磷酸单钾盐的混合物，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少一种磷酸盐和一种单价盐，优选NaCl，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸盐二钠盐和至少一种单价盐，优选NaCl，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸盐二钠盐和磷酸单钾盐及至少一种单价盐优选NaCl的混合物，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和磷酸单钾盐的混合物，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少一种磷酸盐和一种单价盐，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和至少一种单价盐优选NaCl，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和磷酸单钾盐及至少一种单价盐优选NaCl的混合物，及(vi)一种药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和磷酸单钾盐及NaCl的混合物，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少一种单价磷酸盐和/或至少一种二价磷酸盐的混合物，及(vi)一种药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和磷酸单钾盐的混合物，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)至少一种磷酸盐和一种单价盐，优选NaCl，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和至少一种单价盐优选NaCl，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和磷酸单钾盐及至少一种单价盐优选NaCl的混合物，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)磷酸二钠盐和磷酸单钾盐及NaCl的混合物，及(vi)药物可接受的缓冲液，选自TRIS、BES、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、HEPPSO、POPSO、MOPS、HEPES和碳酸氢盐，优选TRIS缓冲液。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)大约0.1g/L-大约1g/L磷酸二钠盐和大约1g/L-大约10g/L，优选大约1g/L-大约5g/L单价盐优选NaCl。
根据另一有利的实施方案，本发明涉及一种配制物，其包含：(i)痘病毒，选自MVA和VV，(ii)PVP，(iii)蔗糖，(iv)精氨酸和谷氨酸盐，(v)大约0.1g/L-大约1g/L磷酸二钠盐和大约1g/L-大约10g/L，优选大约1g/L-大约5g/L单价盐优选NaCl，及(vi)大约1g/L-大约10g/L及优选大约1g/L-大约5g/L的TRIS缓冲液。
典型的适于冷冻干燥的含有病毒的配制物包含(ii)33.25g/L的PVP 25kDa，(iii)50g/L的蔗糖，(iv)2.49g/L的谷氨酸盐和8.43g/L的精氨酸，(v)0.79g/L的Na2HPO4和0.15g/L的KH2PO4。
根据本发明的另一个特定实施方案，所述配制物包含1.88g/L磷酸盐，特别是1.59g/L的Na2HPO4和0.29g/L的KH2PO4。
根据本发明的另一个特定实施方案，所述配制物包含3.75g/L磷酸盐，优选3.17g/L的Na2HPO4和0.58g/L的KH2PO4。
根据本发明的另一个特定实施方案，所述配制物包含3.89g/L的NaCl。
根据本发明的一个特定实施方案，所述配制物包含1.94g/L的NaCl。
根据本发明的另一个特定实施方案，所述配制物包含3.89g/L的NaCl和1.61mM的TRIS。
根据本发明的一个特定实施方案，所述配制物包含1.94g/L的NaCl和1.61g/L的TRIS。
干燥产物
本发明进一步涉及一种稳定的含有基于病毒的材料的疫苗，其包含干燥，优选冷冻干燥形式的如上述配制物。
术语“干燥”是指配制物、组合物、产物、疫苗等，其呈现出剩余水分含量低于3％产物重量，优选低于2％及更优选1％或更低。根据特定的实施方案，干燥的材料(包括干燥的配制物、干燥的组合物、干燥的产物、干燥的疫苗、干燥的含有基于病毒的材料的疫苗)在大约5℃、室温直至大约45℃是结晶或非结晶形式的固体。
根据一个特定的实施方案，所述剩余水分含量是通过Karl Fisher方法确定的。
根据本发明，“干燥的材料”(包括干燥的配制物、干燥的组合物、干燥的产物、干燥的疫苗、干燥的含有基于病毒的材料的疫苗)的剩余水分如上文定义。
根据一个实施方案，所述干燥的材料可以通过冷冻干燥上述配制物优选水性配制物而获得。因此，根据优选的实施方案，干燥的材料(特别是本发明的干燥的配制物或者干燥的含有基于病毒的材料的疫苗)是指“冷冻干燥的”或“冻干的”材料(特别是本发明的“冷冻干燥的”或“冻干的”配制物，或者“冷冻干燥的”或“冻干的”含有基于病毒材料的疫苗)。
术语“冷冻干燥的”和“冻干的”是等价的，以及术语“冻干法”和“冷冻干燥”也是等价的。
根据优选的实施方案，在冻干后病毒滴度的丧失，即由于冷冻干燥方法的丧失，不超过0.3log，优选不超过0.2log，更优选不超过0.1log。
此外，有利地，所述“干燥的材料”是稳定的(见下文)，即其病毒滴度的累积丧失是有限的。
此外，已知注意到，尽管在文献中已知磷酸盐如十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4,[12H2O])在低温沉淀，因此可明显降低产物pH(Croyle et al.,《Factors that influence stability of recombinant adenoviral preparations forhuman gene therapy,Pharmaceutical development and technology》,3(3),373-383,1998)，本发明的配制物的pH在所有温度下冷冻期间出乎预料地得以保持。
进一步希望本发明的“干燥的材料”具有较低的剩余水分(RM)含量，因为本领域技术人员已知其是稳定性的指征，因为在贮存期间暴露于水分可使产物不稳定及因此降低保存时间。RM是在冻干产物中保留的结合水的量。可以使用熟知的检测剩余水分的比色Karl Fisher技术以通过容量滴定确定水含量(Jennings,T.A.,"Lyophilization,Introduction and Basic Principles",Interpharm Press,Denver,CO,US,1999,ISBN 1-57491-081-7,pages415-418)。这是根据剩余水与干燥产物总重量相比的重量百分比而测量。欧洲药典(第五版)推荐RM低于3％产物重量。
更特别地，本发明的“干燥的材料”中，RM低于3％产物重量，优选低于2％及更优选低于1％产物重量或更低。
也期望本发明的“干燥的材料”显示便利方面。实际上，合适的干燥的组合物呈现出平滑的白色层或“块状物”，在冻干后不从小瓶的侧面缩回。较不合适的“干燥的材料”看起来是“熔化的”、“沸腾的”或者其它畸形的，且在贮存后从小瓶的侧面缩回。
所述“干燥的材料”可以干燥粉末形式获得。得自例如冷冻干燥的块状物可以研磨成粉末形式。因此，本发明的固体“干燥的材料”可以是自由流动颗粒形式。固体组合物通常以在密封小瓶、安瓿或注射器中的粉末形式提供。或者固体基质可以片状提供。可以将粉末压缩成片剂形式。
冷冻干燥方法
如上所述，本发明的配制物，优选水性配制物适于干燥，优选冷冻干燥。优选地，如上所述，将进行冷冻干燥的配制物中包含的基于病毒的材料进行纯化或者至少部分纯化。
根据一个特定的实施方案，本发明涉及一种制备“干燥的材料”的方法，其中所述方法包括冷冻干燥水性配制物的步骤，所述水性配制物包含(i)至少一种基于病毒的材料，(ii)至少一种聚合物，选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物，(iii)至少一种糖，(iv)至少两种不同氨基酸，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
冷冻干燥的方法为本领域技术人员已知(Day,J.and McLellan,M.,Methods in Molecular Biology,Humana Press,(1995)vol.38)。
冷冻干燥方法通常有三个主要阶段，即冷冻、初级干燥及次级干燥。冷冻通常使用冷冻干燥机进行。在这个步骤期间，重要的是使生物材料冷却低于其低共熔点(Teu，在简单结晶产物情况中)，或者玻璃态转变温度(Tg'，在非结晶产物情况中)，即低于该材料的固相和液相可共存的最低温度。这样保证在随后的初次干燥阶段中发生升华而不是熔化。
在初级干燥期间，压力通过应用适当水平的真空而控制，同时提供足够的热量以使得水升华。材料中至少50％、通常60-70％的水在此阶段升华。初级干燥可以缓慢，因为太多的热量可降解所述生物学材料或改变所述生物学材料的结构。冷却的冷凝器腔和/或冷凝器平板提供了在其上通过再凝固而捕集水蒸气的表面。
在次级干燥过程中，水合水通过进一步应用加热而除去。通常地，也降低压力以促进进一步干燥。在完成冷冻干燥过程后，可以在密封之前使用惰性气体如氮气破坏真空，或者可以在真空下密封所述材料。
在本发明中，令人惊奇地发现在次级干燥步骤可以应用高温，即直至50℃，以加快冻干过程而不损害病毒。
因此，本发明更优选涉及一种冻干方法，包括干燥本发明的液体组合物及其中次级干燥步骤是在变化直至50℃±5℃温度进行，优选在30℃-45℃之间进行，优选在40℃±5℃进行。
此外，应注意，可以降低的体积产生具有相同滴度参数的干燥产物，例如降低至填充体积的1/3，因此与本领域通常已知的病毒如痘病毒冻干相比可以增加1/3的浓度及进一步降低冻干循环持续时间。
复水的材料
本发明进一步涉及复水的材料。“复水的材料”(包括复水的配制物、复水的组合物、复水的产物、复水的疫苗、复水的含有基于病毒的材料的疫苗)对应已经通过加入合适量的药物可接受的溶剂复水的“干燥的材料”(包括干燥的配制物、干燥的组合物、干燥的产物、干燥的疫苗、干燥的含有基于病毒的材料的疫苗)。根据特定的实施方案，所述药物可接受的溶剂选自注射用水(WFI)、生理学血清或盐水溶液如NaCl溶液。
当本发明的配制物含有另外的盐，优选单价盐如NaCl时，如果需要，其更特别用于调节复水的材料的渗透压。更精确地，本发明的复水的材料的渗透压应与注射应用相容，即应为280mOsm/kg-900mOsm/kg，特别是280mOsm/kg-600mOsm/kg及更优选280mOsm/kg-350mOsm/kg。
病毒滴度
干燥方法，更特别是冷冻干燥方法的一个主要缺点是不稳定，导致病毒中整体病毒滴度丧失，所述丧失在贮存期间可以增加。
本发明的一个目的是提供稳定的配制物，优选水性配制物。其进一步涉及如上所述的稳定的干燥的，优选冻干的配制物。更特别地，所述稳定性是指本发明配制物(水溶液或干燥形式)中含有的基于病毒的材料或产物是有生物学活性的，及当根据本发明配制时保留其生物学活性(即基于病毒的材料例如痘病毒保留感染性)。根据本发明，如果所述基于病毒的材料在指定时间的生物学活性是在制备所述配制物时呈现的生物学活性的大约10％内(在测定误差内)，则所述基于病毒的材料当根据本发明配制时保留其生物学活性。在病毒的情况中，当配制物的病毒滴度在最初滴度的一个log内时，其生物学活性可以认为是保留的。根据特定的实施方案，当在温育温度+5℃+/-3℃在至少60天期间(例如90天或者甚至几个月或几年)病毒滴度整体丧失低于0.7log，优选低于0.5log，更优选低于0.4log及更优选低于0.3log时，本发明的含有基于病毒的材料的配制物是稳定的。
本发明的“病毒滴度的整体丧失”定义为在干燥步骤之后测量的及在干燥的配制物的贮存期间测量(在将所述材料在水中复水之后进行测量)的病毒滴度的累积丧失。
“在干燥步骤之后病毒滴度的丧失”对应在制备配制物时与在干燥步骤之后之间的病毒滴度的丧失，即由于如此干燥方法而丧失的病毒滴度。在如下实验中，其相应于在第0天对第-1天测量的病毒滴度的丧失(见实施例章节)。
“在干燥步骤之后病毒滴度的丧失”是不依赖于温度的及优选低于0.3log，更优选低于0.2log。
所述干燥配制物的“贮存期间病毒滴度的丧失”对应在干燥步骤之后及在确定贮存期间“n”天在确定的贮存温度测量的病毒滴度的丧失。
“贮存期间病毒滴度的丧失”优选在+5℃+/-3℃贮存至少60天低于0.4log，优选在+5℃+/-3℃温度贮存至少60天(例如90天或者更长时间)低于0.3log。
或者，可以通过进行在升高的温度下的加速的稳定性研究而缩短本发明的配制物的稳定性评估。实际上，这种加速的稳定性研究允许预测在较低温度的结果，而不用等待实时稳定性数据，即通常在+5℃+/-3℃温度1-3年时间(对应例如在37+/-5℃温度大约1周及在45+/-5℃温度大约3-5天)。为此，在本领域中描述了不同数学模型，及可以使用所述模型以推断在较低温度的结果。这些模型中的一种熟知模型是基于Arrhenius原理的多变量模型，其如下所示：
ln ( ln ( C 0 C ) ) = β 1 + β 1 * 1 T + β 2 * ln ( t )
其中C0是初始滴度(PFU/mL)，T是开氏度温度，t是时间(天)，C是在相应时间t的滴度(PFU/mL)，β0、β1和β2是模型参数(其可以根据模型的特定数据而变化)。
通常地，加速稳定性检测是在大约37+/-5℃温度进行大约1周时间(世界卫生组织推荐)。在本发明中，这种加速研究在45+/-5℃温度以不同时间进行(见实施例章节)。
如本说明书中所用，“室温”(RT)对应在大约20℃-大约25℃之间的温度。
用于确定痘病毒滴度的测定是例如噬斑测定技术(见例如Kaufmann andKabelitz,2002,Methods in Microbiology Vol.32:Immunology of Infection.Academic Press.ISBN 0125215320)。来自这个测定的滴度以每毫升的噬斑形成单位(PFU/mL)报告。确定病毒滴度及由此确定病毒滴度的整体丧失的详细方案在实施例章节给出。然而，也可以使用确定病毒滴度的任何其它方案。
本发明的包含基于病毒的材料或复水材料的配制物可以给需要其的患者或动物施用，更特别是作为疫苗用于治疗性或预防性应用。
根据另一个实施方案，本发明涉及包含如前文定义的用作疫苗的基于病毒的材料或复水材料的配制物。其可以通过不同途径施用，例如通过静脉内、肿瘤内、肌肉、皮内、皮下或腹腔内途径。从业人员已知含有痘病毒的这种配制物，特别是水性配制物可怎样正确施用。所述施用可以以单一剂量进行或在一定时间间隔后重复一次或几次。适当的施用途径和剂量与各种参数成函数变化，例如个体、治疗的疾病或者待转移的感兴趣的基因。
本发明还涉及将包含如前文定义的基于病毒的材料或复水材料的配制物给需要其的宿主施用的方法，特征在于在生理学可接受的溶剂中复水干燥的产物，所述溶剂优选选自水PPI、WFI、生理学血清或盐水溶液如NaCl溶液，然后给需要其的宿主施用。
本发明还涉及包含如前文定义的基于病毒的材料或复水材料的配制物，其用于治疗和/或预防疾病，优选选自癌症、感染性疾病和/或自身免疫疾病的病症。
如本文所用，“癌症”是指但不限于肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、支气管癌、食管癌、咽癌、头颈癌(例如喉癌、唇癌、鼻腔和鼻旁窦癌以及咽喉癌)、口腔癌(例如舌癌)、胃部癌症(例如胃癌)、肠癌、胃肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肛门癌、肝癌、胰腺癌、尿道癌、膀胱癌、甲状腺癌、肾癌、癌、腺癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)或者转移性结肠直肠癌(mCRC)、皮肤癌(例如黑色素瘤)、眼癌(例如成视网膜细胞瘤)、脑癌(例如神经胶质瘤、成神经管细胞瘤和脑星形细胞瘤)、中枢神经系统癌、淋巴瘤(例如皮肤B细胞淋巴瘤、Burkitt's淋巴瘤、Hodgkin's综合征及非-Hodgkin's淋巴瘤)、骨癌、白血病、乳腺癌、生殖道癌、子宫颈癌(例如子宫颈上皮内瘤样病变)、子宫癌(例如子宫内膜癌)、卵巢癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、睾丸癌。“癌症”也是指病毒诱导的肿瘤，包括但不限于乳头瘤病毒诱导的癌瘤、疱疹病毒诱导的肿瘤、EBV诱导的B细胞淋巴瘤、乙型肝炎诱导的肿瘤、HTLV-1-诱导的淋巴瘤及HTLV-2-诱导的淋巴瘤。
在癌症的情况中，本发明的组合物的这种施用可进一步与一线化疗结合。
如本文所用，“感染性疾病”是指由感染性生物体所致任何疾病。感染性生物体包括但不限于病毒(例如单链RNA病毒，单链DNA病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，甲型、乙型和丙型肝炎病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，巨细胞病毒(CMV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，Epstein-Barr病毒(EBV)或者人乳头瘤病毒(HPV))，寄生虫(例如原生动物和后生动物病原体如疟原虫、利什曼虫、血吸虫或者锥虫)，细菌(例如分支杆菌特别是结核分支杆菌(M.tuberculosis)，沙门氏菌，链球菌，大肠杆菌(E.coli)或葡萄球菌)，真菌(例如假丝酵母或者曲霉)，卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)，以及朊病毒。
如本文所用，“自身免疫疾病”是指两种一般类型：系统性自身免疫疾病(即破坏许多器官或组织的病症)和局部自身免疫疾病(及破坏仅单个器官或组织的病症)。然而，局部自身免疫疾病的影响通过间接影响其它机体器官和系统而可以是系统性的。系统性自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎，其影响关节，及可能影响肺和皮肤；狼疮，包括系统性红斑狼疮(SLE)，其可以影响皮肤、关节、肾、心脏、脑、红细胞以及其它组织和器官；硬皮病，其可以影响皮肤、肠和肺；Sjogren's综合征，其可以影响唾液腺、泪腺和关节；Goodpasture's综合征，其可以影响肺和肾；Wegener's肉芽肿病，其可以影响鼻窦、肺和肾；风湿性多肌痛，其可影响大肌肉群，及颞动脉炎/巨细胞性动脉炎，其可影响头和颈部动脉。局部自身免疫疾病包括但不限于1型糖尿病，其影响胰岛；桥本氏甲状腺炎和Graves'病，其影响甲状腺；乳糜泻，Crohn's病和溃疡性结肠炎，其影响胃肠道；多发性硬化(MS)和Guillain-Barre综合征，其影响中枢神经系统；Addison's病，其影响肾上腺；原发性胆管硬化、硬化性胆管炎和自身免疫性肝炎，其影响肝脏；以及Raynaud's现象，其可影响手指、脚趾、鼻、耳。
因此，本发明进一步涉及使用包含如前文定义的基于病毒的材料或复水材料的配制物治疗或预防如上述疾病的方法。这种方法更优选包括复水如上述冻干产物，及将相应的复水的材料给需要其的宿主施用。
然后，本发明的另一实施方案涉及用包含如前文定义的基于病毒的材料或复水的材料的配制物给需要其的动物包括人接种疫苗的方法。
如果需要，本发明的组合物可进一步与本领域技术人员熟知的常规疫苗运载体一起配制。
本发明以举例的方式描述，应理解文中使用的术语是描述用语的性质而不是限制之意。显然，根据上述教导可以对本发明进行许多修饰和变化。因此应理解在所附权利要求范围内，本发明可以与本文特别描述的方式的不同方式实施。
所有上述引用的专利、出版物和数据库条目所公开的内容以参考的形式全文明确地并入，与各个这种专利、出版物或条目如果以参考的形式明确地单独并入相同。
除非另外指出，实现如下实施例使用的所有材料均可商购。
附图说明
图1例证了在不存在磷酸盐(黑色条)或者存在增加浓度的磷酸盐(浅灰色至深灰色)条件下配制的并在5℃(图1A)或45℃(图1B)温度下贮存指定时间的MVA载体(TG4001)的感染性滴度的累积丧失。浅灰色条代表组合物I，中等灰色条代表组合物II，深灰色条代表组合物III，黑色条代表后文描述的参考样品RS1。
实施例
材料
-盐酸L-精氨酸粉末(J.T BACKER-SIGMA)
-SVF(PAA)
-TRIS＝TRIS(羟甲基)氨基甲烷粉末(J.T BACKER)，
-盐酸(HCI)1M(MERCK)
-氢氧化钠(NaOH)1N(VWR)
-蔗糖粉末(MERCK)
-氯化钠(NaCl)粉末(MERCK)
-PVP25粉末(MERCK)
-L-谷氨酸一钠盐(MERCK)
-磷酸盐氢二钠，无水粉末(MERCK)
-磷酸二氢钾无水粉末(MERCK)
-注射用水(COOPER)
-小瓶＝小瓶(SCHOTT)，塞子(STELMI)
-DAB＝3,3'-二氨基联苯胺(SIGMA)
-宿主细胞BHK-21(ATCC,CCL10)
-抗-疫苗抗体(Meridian Life science)
-与过氧化物酶组合的抗-兔抗体(DAKO)
-水MilliQ(Millipore)
-PBS(DULBECCO SIGMA)
-Triton X-100(SIGMA)
-DMEM(GIBCO)
-阳离子100X(10g/L四水合乙酸镁MERCK和10g/L二水合氯化钙JT BAKER)。
应注意在下面的表格中，当以“-”表示时，是指相应配料在相应组合物中不存在。
方法
后文详细描述了病毒滴定方法以评估本发明配制物在冻干期间和在长期贮存期间的稳定性。
在冻干后立即复水一些干燥的样品并滴定以评估冻干方法对于病毒稳定性的影响(即在如下实施例中在第0天的病毒滴度丧失)。
其它干燥的样品在冻干后在不同温度贮存(例如在5℃和45℃)直至复水进行滴定以评估在贮存期间的滴度丧失，包括由于冻干方法所致病毒滴度丧失(即在如下实施例中在第4、7、28、60和/或90天的病毒滴度丧失)。
如前文所示，本发明的目的是获得干燥的产物，其总体病毒滴度丧失在高于0℃，优选在4℃-25℃及更优选在大约4℃或5℃是有限的。因为等待实时稳定性数据(在2-8℃进行1-2年)是耗时的，稳定性测试通常可在升高的温度进行，如在45℃进行大约3-5天，使用Arrhenius方程将其结果与在较低温度预期的结果相关联。
用于在冻干之前的配制物及复水的组合物的病毒滴定的方案已经在BHK-21细胞上使用噬斑测定技术进行。在这种方法中，确定样品中噬斑形成单位(pfu/mL)的数目。当病毒感染固定的细胞单层中的细胞时，形成病毒噬斑(Kaufmann and Kabelitz,2002,Methods in Microbiology Vol.32:Immunology of Infection.Academic Press.ISBN 0125215320)。针对每种如下本发明的示例性配制物进行的具体步骤在后文“实施例”部分详细描述。
实施例1：制备要冷冻干燥的液态含有痘病毒的配制物
后文提及的液态配制物I-V已经根据如下步骤制备。这些配制物包含基于MVA的产物。更精确地，配制物I-III包含TG4001，配制物IV和V包含TG4040。
a)首先将TG4001和TG4040以冷冻状态分别维持在溶液A1和溶液A2中。溶液A1(包含TG4001)和溶液A2(包含TG4040)的成分在下表1中详细描述。
表1
溶液A1和A2是解冻的。
如果需要，可将溶液A1和A2根据本领域技术人员熟知的方法进一步稀释。例如，溶液A1不进一步稀释，如此使用以制备配制物I-III。关于溶液A2，将其用对应于上述溶液A2的溶液A’2(不包含TG4040)稀释以获得终病毒滴度为6.70E+07pfu/mL。
然后将获得的病毒悬浮液通过简单搅动而均质化。
b)然后，将170μl如下溶液B分别加入在步骤a)中获得的340μL的病毒溶液A1和A2中。
更精确地：
-将170μl溶液B1-B3加入340μL步骤a)的包含TG4001的病毒溶液A1中，以制备配制物I-III，及
-将170μl溶液B4和B5加入340μL步骤a)的包含TG4040的病毒溶液A’2中，以制备配制物IV和V。
然后将混合物通过简单搅动而均质化。
溶液B1-B5的详细成分在如下表2中示出。
表2
c)在冻干之前获得的液态组合物I-V(510μL)在如下表3中详细描述。
表3
上述液态配制物I-V也是本发明的一部分。
实施例2：制备相应的冷冻干燥的配制物I-V
在如下实施例中，所有冻干法均是在冻干机TELSTAR LYOBETA 25中进行。
冻干方案如下：
a)制备干燥的产物I-III
将小瓶(SCHOTT)充填如实施例1所述液体配制物I-III，并如下进行冻干方法：
冷冻步骤
描述 压力(mbar) 温度(℃) Ramp(h:min) 稳定化(h:min)
加样 AP(大气压) 室温
冷冻 AP -45 2:00 0:30
初级干燥步骤
描述 压力(mbar) 温度(℃) Ramp(h:min) 稳定化(h:min)
初级1 0.1 -10 0:15
初级2 0.1 -35 5:00 8:00
次级干燥步骤
描述 压力(mbar) 温度(℃) Ramp(h:min) 稳定化(h:min)
次级干燥1 0.0047mbar 40 0:15 8:00
次级干燥2 0.0047mbar 20 0:30
b)制备干燥产物IV和V
将小瓶(SCHOTT)充填在实施例1中获得的液态配制物IV和V，如下进行冻干方法。方案与针对配制物I-III进行的方案相似，但是在这种情况中进一步进行真空步骤。
冷冻
描述 压力(mbar) 温度(℃) Ramp(h:min) 稳定化(h:min)
加样 Atm.P 室温
冷冻 Atm.P -50 2:00 0:30
初次干燥步骤
描述 压力(mbar) 温度(℃) Ramp(h:min) 稳定化(h:min)
初级1 0.150 -35 0:15 18:00
初级2 0.150 -10 1:00 0
二次干燥步骤
描述 压力(mbar) 温度(℃) Ramp(h:min) 稳定化(h:min)
次级干燥1 最小 40 2:00 8:00
次级干燥1 最小 20 1:00
次级干燥2 最小 10 0:02 3:00
获得的干燥的产物I-V形成合适的块状物，即平滑的白色“块状物”，其在冻干后不从小瓶的侧面缩回。
在冷冻干燥后所述产物I-V的各病毒滴度在如下表4中详细描述。
表4
干燥的产物I-V也是本发明的一部分。
研磨所述块状物，然后将获得的粉末复水根据前述病毒滴定方法确定病毒滴度。
实施例3：稳定性研究：评估总体病毒滴度丧失，即在长期贮存期间，包括由于冻干方法所致丧失
3.a)干燥的产物I-V的复水
在冻干之后用WFI以终体积680μL制备复水的材料(Reconstit.Compo.)I-V在下表5中详细描述(即不贮存的t0)。
表5
为了评估干燥的产物I-V在5℃或45℃贮存指定时间后的病毒滴度，干燥的产物I-V需要首先复水。在如下实施例中，将其用WFI以终体积680μL复水，各自的滴度根据先前描述的噬斑测定技术评估。
复水的材料I-V也是本发明的一部分。
3.b)评估干燥的组合物I-V在5℃的病毒滴度丧失
如前述，使用噬斑测定技术在BHK-21细胞上评估每种干燥的产物的累积病毒滴度丧失(即在长期贮存期间的丧失，包括由于冻干方法所致丧失)。
在这方面针对每种组合物I-V进行的步骤在后文详细描述。
1.细胞分散
将宿主细胞BHK-21在DMEM中单层生长。在铺满时，将细胞用10mL的PBS洗涤，然后用胰蛋白酶消化。在除去胰蛋白酶后，将细胞在37℃再悬浮于具有10％SFV的10mL DMEM中。
然后，将细胞悬浮液均质化，并在多孔平板中分配(每个平板6个孔，2mL/孔)。然后，将所述平板在37℃、5％CO2条件下温育。
2.细胞感染
在细胞分散后大约1天，将等份的病毒悬浮液加入包含步骤1的BHK-21细胞的每个孔中。如果需要，将所述悬浮液首先在PBS，阳离子100X和1％SVF中系列稀释，根据本领域技术人员熟知的方法进行。根据情况，加入步骤1的BHK-21细胞中的病毒悬浮液是冻干前液态含有病毒的组合物或者复水的含有病毒的组合物(即冻干后，在不同时间和温度)。
然后除去培养基及在室温搅动60分钟之后，将2mL感染培养基(DMEM+5％SVF)分配于每个孔中。然后将平板在37℃、5％CO2条件下温育。
3.细胞固定
在除去培养基后，将细胞用PBS洗涤(大约1mL/孔)。然后，加入1mL甲醇/丙酮溶液(50/50)，将所得混合物在室温轻轻搅动。
然后将平板在室温放置干燥。
4.检测和滴度确定
根据熟知的过氧化物酶反应使用抗-疫苗抗体和与过氧化物酶组合的抗-兔抗体进行病毒的滴度确定。更精确地，在反应之前将抗-疫苗抗体在PBS+2％SVF中稀释100倍。然后，在每个孔中加入500μL所述抗体，在37℃温育大约30分钟，然后用1mL PBS+1％Triton X-100洗涤3次。
以相同方式进行抗-兔抗体组合过氧化物酶的反应，不同的是在反应之前将所述抗体在PBS+2％SVF中稀释200倍。
通过将一片商购的DAB溶解于15mL的TRIS 0.05M中制备DAB溶液。然后，将获得的溶液在2μm滤过单元NALGENE上过滤，将所得过滤的溶液加入15μL的H2O230％水溶液中。制备后，将1mL的DAB溶液加入每个孔中，放置直至出现褐色。将生色的溶液随后除去，目测结果。
然后，使用如下公式计算感染性滴度(PFU/mL)：
[平均病毒噬斑数×4]×稀释倍数＝PFU/mL数
结果
在5℃的稳定性研究结果在下表6中示出，其中：
-SD＝标准误差
-在-1天的病毒滴度对应于冻干前液态组合物I-V的病毒滴度
-在第0天的病毒滴度对应于在冻干后立即的干燥组合物I-V的病毒滴度。将其与冻干前液态组合物I-V的病毒滴度对比，可以确定在冻干期间的病毒滴度丧失。
-在第28、60和90天的病毒滴度对应于分别贮存28、60和90天后干燥组合物I-V的病毒滴度。将其与在冻干之后立即复水的组合物I-V的病毒滴度(即第0天)对比，可以确定在5℃贮存期间的病毒滴度丧失。
表6(在+5℃)
*是指log平均值已经适应于680μL体积(＝log(滴度平均值×0.510/0.680))。
正如所期望地，干燥的产物I-V在5℃是稳定的。实际上，在5℃贮存至少90天之后其累积病毒滴度丧失不超过0.6log。
3.c)评估在45℃干燥的产物I-V的病毒滴度丧失
为了进一步评定干燥产物I-V的稳定性，在45℃进行稳定性研究。如前所述，这种升高的温度使得以加速方式预测病毒的降解。
每种干燥的产物I-V在45℃贮存4、28、60和90天。
使用如前述滴定方法(在BHK-21细胞上噬斑测定技术)评估每种干燥的产物的累积病毒滴度丧失(即在长期贮存期间的丧失，包括由于冻干方法所致丧失)。
结果
在45℃的加速的稳定性研究结果在下表7中示出，其中：
-SD，在-1天的病毒滴度及在第0天的病毒滴度与在表6中具有相同含义。
-在第4、7、28和60天的病毒滴度分别对应分别贮存4、7、28和60天后干燥组合物I-V的病毒滴度。将其与在冻干之后立即复水的组合物I-V的病毒滴度(即第0天)对比，可以确定在45℃贮存期间的病毒滴度丧失。
表7(在+45℃)
*是指log平均值已经适应于680μL体积(＝log(滴度平均值×0.510/0.680))
NA：不适用
应注意在上表7中，组合物IV和V在第3、3.5和4天在45℃的结果根据下述标准统计学分析估计，即使用软件SAS 9.2和一阶基于Arrhénius原理的多变量模型，所述模型如下文方程定义：
ln ( ln ( C 0 C ) ) = β 1 + β 1 * 1 T + β 2 * ln ( t )
其中：
-C0是初始滴度pfu/mL(在冻干后)，
-T是开氏度温度，
-t是时间天数，
-C是在相应时间t的滴度pfu/mL。
由于在这个实施例中使用仅一个温度，即45℃，该方程可以简化为：
ln ( ln ( C 0 C ) ) = β 0 + β 2 * ln ( t )
当估算该模型的参数时，在指定时间点的滴度可以通过如下公式估算：
C ^ = C 0 exp ( exp ( β ^ 0 + β ^ 2 * ln ( t ) ) )
其中：
-C0是初始滴度(pfu/mL)(在冻干后)，
-t是时间天数，
-是估算的在相应时间t的滴度(pfu/mL)，
-是估算的该模型的参数。
然后通过下式估算丧失估值：
L ^ = log ( C ^ ) - log ( C - 1 * 0.51 / 0.68 )
其中
-是估算的滴度(pfu/mL)，
-C-1是在冻干前一天的滴度(pfu/mL)，
-是估算的丧失。
关于组合物IV，调整的R2，等于0.995，意味着模型与数据正确相配。
关于组合物IV，调整的R2，等于0.999，意味着模型与数据正确相配。
因此，上述结果示出液态配制物I-V在冻干期间发生的热量刺激(challenge)之后可以保持病毒稳定性，及进一步的病毒稳定性在长期稳定性测试期间进一步保持。
最后，在本发明的配制物中，病毒得以保护免于由在冻干期间(即由于冷冻、冷冻干燥和解冻步骤所致)和在高于0℃，特别是大约5℃的温度贮存期间的热胁迫所致的损害。
实施例4：无磷酸盐的病毒制备物的配制
三种参考样品(RS2至RS4)是从TG4040纯化批次的中产生的，一种参考样品(RS1)从纯化的TG4001病毒批次中产生。参考样品与实施例1-3所述组合物I-V一起处理，不同的是RS样品不用无磷酸盐配制。Arg和NaCl的浓度也根据样品而变化。
如上所述，将340μL病毒溶液与170μL稳定化溶液混合。每种参考产物S1-S4的稳定化溶液的详细成分在下表8中示出。
表8
获得的冻干前液态参考产物RS1-RS4在下表9中详细描述。
表9
然后将参考产物RS1-RS4如上所述冻干，并用WFI以终体积680μL复水。
在冻干后立即制备(即无贮存期)的复水的参考产物RS1-RS4(680μL)的详细组成在下表10中详细描述。
表10
如实施例3所述在5℃和45℃进行稳定性研究。为此，将每种干燥的参考产物RS1-RS4在5℃或45℃贮存一段时间，使用前述滴定方法在不同时间点评估累积的病毒滴度丧失(即在长期贮存期间的丧失，包括由于冻干所致丧失)。
配制物TG4001和TG4040在5℃的稳定性结果在表11中示出。
表11
配制物TG4001和TG4040在45℃的稳定性结果在下表12中示出。
表12
如图1及表6和11所例证，磷酸盐的存在有益于病毒制备物的稳定性。事实上，在28、60或90天后感染性TG4001滴度在5℃的累积丧失在存在磷酸盐与不存在磷酸盐条件下相比降低(见图1A)。例如，在5℃在60天后，对于包含0.94g/L磷酸盐缓冲液的组合物I的累积丧失为-0.25log，对于包含1.88g/L和3.75g/L磷酸盐的组合物II和III的结果为-0.03log，相比之下在不存在磷酸盐条件下配制的参考样品RS1的相应结果为-0.25log。由包含磷酸盐缓冲液的配制物提供的增加的稳定性在加速的稳定性研究中也观测到，在存在磷酸盐条件在45℃在60天后获得累积滴度丧失为大约-2log(组合物I、II和III的结果分别为-2.40log、-2.31log和-1.98log)，在不存在磷酸盐条件下相应结果为大于-3log(-3.24log，RS1)。
使用TG4040配制物观测到相同趋势。例如，对于RS4样品在+5℃在90天后测量的累积丧失比用配制物V检测的结果更重大(分别为-0.17log和-0.07log)。这种作用在45℃在60天后也观测到(分别为-2.08log对-1.81log)。
实施例5：长期稳定性
如上所述配制TG4040病毒制备物。更特别地，检测两种不同浓度，分别为高剂量(大约1.70×108pfu/mL)和低剂量(大约7.00×107pfu)，并且所述病毒制备物配制为含有1mM Na2HPO4和Tris 10mM、谷氨酸Na 10mM、蔗糖3.75％、NaCl 50mM、PVP 25kDa 2.5％和30mM Arg的配制物。也用低剂量TG4040制备物检测具有150mM的Arg的配制物。
如上述对三种TG4040配制物进行处理，并根据半工业生产方法(IDT)冻干。复水冷冻干燥的产物，并在5℃贮存一年时间评定病毒稳定性(在5℃在冻干前、冻干后立即及在冻干后28、90、180、270和365天评定病毒丧失)。
针对每种TG4040配制物均观测到在5℃贮存一年后总病毒丧失不及-0.60log(分别为在30mM Arg的高剂量配制物中为-0.33log；在30mM Arg低剂量配制物为-0.42log，及在150mM Arg低剂量配制物中为-0.24log)。
总之，这些结果表明磷酸盐的存在有益于病毒制备物的稳定性。Arg在病毒稳定性中也起作用，特别是当冻干前病毒浓度低于108PFU/mL时。含有剩余蛋白质的产物基质以相同方式在低病毒浓度稀释，这些蛋白质可有助于稳定高浓度病毒。Arg将代替在基质中剩余蛋白质在冷冻干燥期间的稳定化作用。
本申请书中列举的所有文献(例如专利、专利申请、出版物)均以参考形式并入本文。本领域技术人员在不偏离本发明范围和精神的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。尽管结合特定的优选实施方案已经对本发明加以描述，但是应理解正如权利要求书声称本发明应不仅限于这种特定的实施方案。事实上，为本领域技术人员显而易见的进行本发明的希望模式的各种修改包含在如下权利要求书的范围内。

Claims (23)

1.一种配制物，其包含(i)至少一种基于病毒的材料，(ii)选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物的至少一种聚合物，(iii)至少一种糖，(iv)至少两种不同的氨基酸，(v)至少两种药物可接受的盐，其中至少一种所述盐是磷酸盐，及任选地，(vi)药物可接受的缓冲液。
2.权利要求1的配制物，其是水性配制物。
3.权利要求1的配制物，其是冷冻干燥的配制物。
4.权利要求1或2的配制物，其中所述(ii)至少一种聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物及其混合物。
5.权利要求4的配制物，其中所述聚乙烯吡咯烷酮或其衍生物的分子量在10kDa-40kDa之间，优选在15kDa-30kDa之间，及更优选为25kDa。
6.权利要求4或5的配制物，其中所述配制物包含10g/L-50g/L，优选15g/L-40g/L及更优选20g/L-35g/L的聚乙烯吡咯烷酮或其衍生物或混合物。
7.前述任何权利要求的配制物，其中所述(iii)至少一种糖选自单糖、二糖、三糖和四糖及其衍生物。
8.权利要求7的配制物，其中所述配制物包含选自蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、异麦芽糖和麦芽酮糖的至少一种二糖。
9.权利要求7或8的配制物，其中所述配制物包含20g/L-80g/L，优选30g/L-70g/L及更优选40g/L-60g/L的糖。
10.权利要求9的配制物，其中所述配制物包含50g/L蔗糖。
11.前述任何权利要求的配制物，其中所述(iv)至少两种不同的氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸盐、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸盐、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、吡咯赖氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸及其衍生物，包括它们的两种立体异构体在内。
12.权利要求11的配制物，其中所述配制物包含5g/L-100g/L及优选5g/L-80g/L的精氨酸。
13.权利要求11或12的配制物，其中所述配制物包含1g/L-10g/L及优选1g/L-5g/L的谷氨酸盐。
14.前述任何权利要求的配制物，其中至少一种所述盐是磷酸盐，且选自钠盐和钾盐及其组合。
15.权利要求14的配制物，其中所述磷酸盐选自磷酸二氢盐、磷酸氢盐和正磷酸盐。
16.权利要求14或15的配制物，其中其进一步包含另外的药物可接受的一价盐。
17.权利要求16的配制物，其中所述另外的药物可接受的盐选自NaCl和KCl，优选NaCl。
18.权利要求16或17的配制物，其中所述配制物包含1g/L-5g/L的所述另外的药物可接受的盐。
19.前述任何权利要求的配制物，其中所述(i)基于病毒的材料是野生型、弱化或重组的病毒或病毒颗粒。
20.权利要求19的配制物，其中所述基于病毒的材料是选自痘苗病毒(VV)和修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)的病毒或病毒颗粒。
21.权利要求20的配制物，其中所述基于病毒的材料是重组MVA，选自表达HCV NS3、NS4和NS5B抗原的MVA；表达MUC-1抗原和IL-2的MVA及表达HPV-16的非致癌E6和E7抗原和IL-2的MVA。
22.权利要求20的配制物，其中所述基于病毒的材料是重组痘苗病毒，选自表达免疫刺激细胞因子的胸苷激酶(TK)-失活的痘苗病毒，所述免疫刺激细胞因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，及表达自杀基因的胸苷激酶(TK-)和核糖核苷酸还原酶(I4L-)双失活的痘苗病毒。
23.权利要求19-22任一项的配制物，其中所述配制物中病毒滴度为1×106Pfu/mL-1×1010Pfu/mL。
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