ES2928670T3 - Formulación que contiene virus y utilización de la misma - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una formulación que comprende (i) al menos un material basado en virus, (ii) al menos un polímero seleccionado del grupo de polivinilpirrolidona y sus derivados, (iii) al menos un azúcar, (iv) al menos dos diferentes aminoácidos, (v) al menos dos sales farmacéuticamente aceptables, donde al menos una de dichas sales es una sal de fosfato y, opcionalmente (vi) un tampón farmacéuticamente aceptable. Una formulación de este tipo es particularmente adecuada para la liofilización. La presente invención también se relaciona con el producto seco correspondiente, así como con su proceso de preparación. La presente invención también se refiere a un material reconstituido que comprende dicho producto seco, que puede administrarse a un paciente que lo necesite. Tal formulación y material reconstituido son útiles como vacunas, preferiblemente para el tratamiento y/o la prevención de cánceres, enfermedades infecciosas y/o trastornos autoinmunes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Formulación que contiene virus y utilización de la misma
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de la formulación de materiales biológicamente activos tales como materiales basados en virus (por ejemplo, virus, partículas virales, vacuna viral, etc.) o, más precisamente, a una formulación adecuada para su almacenamiento. Se refiere también a la preparación de dicha formulación. Más precisamente, la presente invención se refiere a una formulación deshidratada por congelación obtenida por deshidratación por congelación de una formulación acuosa que comprende (i) por lo menos un material basado en poxvirus (ii) entre 5 g/L y 80 g/L de por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo de polivinilpirrolidona, copovidona y mezclas de la misma, (iii) entre 20 g/L y 80 g/L de por lo menos un disacárido, (iv) entre 5 g/L y 100 g/L de arginina y entre 1 g/L y 10 g/L de glutamato, (v) por lo menos 0.1 g/L de por lo menos una sal de fosfato farmacéuticamente aceptable y entre 1 g/L y 5 g/L de por lo menos una sal monovalente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable. Más particularmente, la formulación de la invención es adecuada para procedimientos de secado, más particularmente procedimientos de deshidratación por congelación. La invención se refiere además al producto secado obtenido, y más particularmente el producto deshidratado por congelación obtenido. Las formulaciones y productos secados según la presente invención son útiles como una vacuna para prevenir y/o tratar trastornos tales como cáncer, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades infecciosas.
Antecedentes de la invención
El almacenamiento y envío de materiales biológicamente activos usados, por ejemplo, en la industria farmacéutica, son problemáticos puesto que estos materiales son propensos a la degradación, especialmente la degradación térmica. Esto es particularmente cierto en el caso de materiales biológicamente activos tales como vacunas que pueden ser distribuidas globalmente y pueden ser sometidas de esta manera a diferentes temperaturas, dependiendo de los países de distribución o la variación de la temperatura durante el transporte. Esto limita adicionalmente la distribución de los materiales biológicos a naciones en desarrollo con infraestructura limitada.
La actividad terapéutica de los materiales basados en virus, incluyendo virus, partículas virales y vacuna viral, requiere que su integridad estructural sea mantenida durante el almacenamiento y/o envío para que sean infecciosos y/o biológicamente activos.
Esta integridad estructural de un material basado en virus está comprometida con frecuencia durante el procedimiento de formulación, excluyendo de esta manera su utilización terapéutica. Dicha actividad terapéutica requiere además que la pérdida del título viral, y en particular la pérdida del título infeccioso, sea limitada.
El desarrollo de nuevos métodos o formulaciones para estabilizar materiales biológicamente activos para aplicaciones industriales tales como vacunas, para mejorar las capacidades de almacenamiento y envío de estos materiales biológicos, es de esta manera un propósito continuo de la industria farmacéutica.
Una de las soluciones propuestas ha sido mantener los materiales biológicamente activos dentro de escalas de temperatura específicas, más particularmente a bajas temperaturas, es decir, por debajo de 0°C, más particularmente hasta -30°C, y aún más preferentemente hasta -80°C. Este almacenamiento a temperatura ultrabaja no sólo es muy costoso, sino que crea una inconveniencia significativa para el almacenamiento, la transportación y la utilización clínica. Fue de esta manera necesario desarrollar formulaciones que puedan almacenarse a condición refrigerada.
Según una alternativa, se ha propuesto de esta manera formular los materiales biológicamente activos con aditivos de origen animal o humano, tales como albúmina, peptona, gelatina o hemacel. Sin embargo, el uso de dichos componentes es limitado por problemas de seguridad tales como riesgos de reacciones alérgicas o riesgos de contaminación con o la transmisión de un agente infeccioso (por ejemplo, BSE (encefalopatía espongiforme bovina)). Además, esta solución es generalmente costosa y de esta manera no es compatible con el desarrollo industrial.
Además, se asume que el material basado en virus no mantendrá su infecciosidad cuando se almacena a condición refrigerada en una forma líquida por un período extendido. Como resultado, no existen estudios reportados sobre la formulación y el almacenamiento de virus a condición refrigerada en una forma líquida. De esta manera, continúa existiendo la necesidad de formulaciones estables de preparaciones virales de almacenamiento a largo plazo.
Otra alternativa fue preservar los materiales biológicamente activos, especialmente materiales basados en virus, en una forma secada. Entre las técnicas disponibles de secado de biomaterial, la deshidratación por congelación (denominada también liofilización) representa una etapa clave para fabricar productos biofarmacéuticos tales como vacunas. La liofilización lleva a productos biológicos secados que son estables a aproximadamente 4°C a 8°C, y en algunos casos hasta aproximadamente 25°C. La liofilización se ha usado ampliamente para mejorar la estabilidad de varios productos de proteínas recombinantes y de vacunas virales.
El procedimiento de deshidratación por congelación implica etapas sucesivas de congelación de soluciones o suspensiones de biomateriales, seguido de etapas de secado primario y secundario (para una revisión, ver Adams, 2007, Methods Mol. Biol. 368, 15-38). Básicamente, esta técnica se basa en la sublimación de agua a temperatura bajo cero bajo vacío sin la fusión de la solución. Sin embargo, la tasa de difusión de vapor de agua del biomaterial congelado es muy baja y por lo tanto el procedimiento consume tiempo. Además, las etapas de congelación y secado introducen estreses (por ejemplo, concentración de sales, precipitación/cristalización, estrés por esfuerzo cortante, extremos de pH, humedad residual que queda a través del procedimiento de deshidratación por congelación, etc.) que pueden forzar al material biológico a que sufra cambios físicos y químicos significativos y sean muy perjudiciales para algunos materiales biológicos tales como los materiales basados en virus. De esta manera, es necesario tener formulaciones adaptadas que permitan la preservación del material biológicamente activo durante el procedimiento de secado, y ventajosamente durante adicionalmente las etapas de almacenamiento/envío.
La técnica anterior proporciona ejemplos de formulaciones usadas para deshidratar por congelación materiales biológicos, más precisamente materiales basados en virus.
Para limitar la pérdida del título infeccioso de una preparación de poliovirus, el documento WO89/06542 ha propuesto secar la solución de repuesto de virus a 37°C en presencia de una solución estabilizadora formada de trehalosa a 10% como el único agente protector. Sin embargo, la disminución en el título infeccioso continúa siendo grande y mayor que la observada para la vacuna no secada.
El documento EP 0 872 249 describe una preparación de vector de virus recombinante que comprende una combinación de ácido glutámico o su sal de sodio y glucosa.
El documento WO 95/10601 divulga una solución acuosa de virus recombinante que comprende un sacárido, un aditivo estructural de alto peso molecular, un aminoácido, un regulador de pH y agua.
El documento WO 03/053463 divulga formulaciones de virus de la vaccinia que comprenden sacarosa, dextrano, ácido glutámico y un regulador de pH que está libre de fosfato.
El documento WO 2005/066333 describe una composición viral que comprende urea, un azúcar, una sal, un regulador de pH, un agente de dispersión y una mezcla de aminoácidos esenciales y no esenciales.
El documento WO 2007/056847 divulga una formulación que contiene virus que comprende sacarosa, sorbitol, una polivinilpirrolidona, urea, un regulador de pH de TRIS, glutamato monosódico y otro aminoácido tal como arginina, alanina, serina o glicina.
Los documentos WO2008/114021 y WO2011/121306 describen composiciones virales que comprenden compuestos de polietilenimina, opcionalmente en combinación con uno o más azúcares.
Sin embargo, continúa existiendo la necesidad de nuevas formulaciones que permitan la estabilización de materiales biológicos, y en particular materiales basados en virus, que permitan aplicaciones industriales, almacenamiento sin que se afecte la actividad biológica del producto, y más particularmente que eviten la pérdida del título del virus.
La presente descripción proporciona una formulación que contiene materiales basados en virus, más particularmente una formulación acuosa, adecuada para deshidratación por congelación. Según la forma de realización preferida, la formulación de la invención es estable durante las pruebas de estabilidad a largo plazo como se definen en adelante, y más particularmente durante el almacenamiento a temperaturas por encima de 0°C, en particular entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 30°C, preferentemente entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 25°C, más preferentemente entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C, y aún más preferentemente entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 5°C (por ejemplo, temperatura refrigerada).
Divulgación de la invención
Formulación
Según una primera forma de realización, la presente invención se refiere a una formulación como se define en las reivindicaciones. La presente descripción divulga además una formulación que comprende (i) por lo menos un material basado en virus, (ii) por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo de polivinilpirrolidona, y derivados del mismo, (iii) por lo menos un azúcar, (iv) por lo menos dos aminoácidos diferentes, (v) por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables, en la que por lo menos una de dichas sales es una sal de fosfato y, opcionalmente, (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
A menos que se indique de otra manera, los siguientes términos como se usan a lo largo de toda la solicitud, tienen el siguiente significado:
El término “y/o” incluye en la presente el significado de “y”, “o” y “ la totalidad o cualquier otra combinación de los elementos relacionados por dicho término”.
Se pretende que los términos “que comprende” y “comprende” indiquen que los materiales, productos, formulaciones, composiciones y métodos incluyan los componentes o etapas referidos, pero no excluyendo otros. El término “que consiste esencialmente en” o “consiste esencialmente en”, cuando se usa para definir productos, composiciones y métodos, significará que excluye otros componentes o etapas de cualquier significado esencial. De esta manera, por ejemplo, una composición que consiste esencialmente en los componentes citados, no excluiría los contaminantes traza ni los vehículos farmacéuticamente aceptables. El término “que consiste en” o “consiste en” significará que excluye más que elementos traza de otros componentes o etapas.
El término “alrededor” o “aproximadamente”, como se usa en la presente memoria, significa dentro de 10%, y más preferentemente dentro de 5% de un valor o escala dados. Según una forma de realización especial de esta definición, “alrededor de x” incluye también x.
La formulación divulgada en la presente memoria puede ser una formulación acuosa. Dicha formulación es adecuada para almacenamiento a temperatura refrigerada o para almacenamiento a temperatura no refrigerada (por ejemplo, temperatura ambiente), especialmente tras la deshidratación por congelación.
Según la presente descripción, el “material o producto basados en virus” significa virus, partículas virales, vectores virales y vacuna viral. Dichos términos son sinónimos, y son intercambiables. Este término incluye virus de tipo silvestre, destruidos, atenuados vivos, inactivados y recombinantes. Incluye además productos basados en virus tales como vectores virales, partículas virales tales como partículas tipo virus (VLP) o nucleocápsides.
De acuerdo con la presente descripción, el término “virus” se refiere preferentemente a aquellos virus usados en vacunas, y más preferentemente a virus de ADN, tales como Adenoviridae, Herpesviridae y Poxviridae.
Preferentemente, el término “virus” pretende designar un vector poxviral. Según la presente invención, los poxvirus se refieren más preferentemente a Cordopoxvirus (poxvirus de vertebrados). Los Cordopoxvirus incluyen, pero no están limitados a, Ortopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Lepripoxvirus, Suipoxvirus, Moluscipoxvirus o Yatapoxvirus. Los Cordopoxvirus preferidos según la invención son los Ortopoxvirus. Según otra forma de realización preferida, se selecciona de entre el grupo que consiste en virus de la vaccinia, el virus de la vaccinia adecuado incluye, sin limitación, la cepa Copenhague (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 y 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401), la cepa de Wyeth, Elstree, Western Reserve (WR), IHDJ, y el virus altamente atenuado derivado del mismo que incluye MVA, NYVAC (ver el documento WO 92/15672 - Tartaglia et al., 1992, Virology, 188, 217-232). El vector puede obtenerse también a partir de cualquier otro miembro de los Poxviridae, en particular los virus de la viruela de las aves de corral (por ejemplo, TROVAC; ver Paoletti et al., 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163); viruela del canario (por ejemplo AlVa C, documento WO 95/27780, Paoletti et al., 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163); viruela de la paloma; viruela porcina, y similares.
El vector viral puede ser un vector de replicación competente capaz de infectar a células de mamífero, en particular células en división (es decir, vectores oncolíticos), y más específicamente es un vector poxviral de replicación competente seleccionado de entre el grupo que consiste en las cepas del virus de la vaccinia Copenhague o WR (ver, por ejemplo, los documentos WO2009/065547, WO 2009/065546 o WO9531105).
El vector viral puede ser alternativamente un poxvirus atenuado, caracterizado por la pérdida de su capacidad para replicarse reproductivamente en líneas de células humanas.
Según una forma de realización preferida, el material basado en poxvirus es una partícula poxviral o poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en el virus de la vaccinia (VV) y el virus de la vaccinia modificado Ankara (MVA).
El VV preferido puede ser VV como se describe en las solicitudes de patente WO2009/065546, WO2009/065547 o WO95/31105 que describen concretamente VV armado con una citocina inmunoestimuladora que es el GM-CSF, o con un gen suicida.
La invención se lleva a cabo preferentemente con el virus de la vaccinia modificado Ankara (MVA) (Sutter et al., 1994, Vaccine, 12, 1032-40). Una cepa del MVA típica es MVA 575, que ha sido depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures bajo el número de depósito ECACC V00120707. Otros ejemplos de cepas de MVA utilizables según la invención, son la cepa de MVA depositada en CNCM bajo el número N° I-721, MVA-BN depositada en ECACC bajo el número V00083008, MVA II/85 o MVA-572 depositada en ECACC bajo el número de depósito V94012707, o un derivado de cualquiera de dichos virus.
Como se definió anteriormente, un virus según la presente invención puede ser un virus de tipo silvestre, atenuado o recombinante, más preferentemente un poxvirus recombinante.
El término virus “recombinante” se refiere a un virus, más particularmente un poxvirus, que comprende una secuencia exógena insertada en su genoma. Como se usa en la presente memoria, una secuencia exógena se refiere a un ácido nucleico que no está presente naturalmente en el virus precursor.
Un ejemplo de dicho virus recombinante es JX-594/TG6006, que es un virus de la vaccinia inactivado respecto a timidina cinasa (cepa de Wyeth), que expresa una citocina inmunoestimuladora que es un factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos, es decir, GM-CSF (ver los documentos WO95/31105, WO2007/030668 y WO2008/113078). Otro ejemplo es el virus de la vaccinia doblemente inactivado respecto a timidina cinasa (TK) y ribonucleótido reductasa (I4L) TG6002 (cepa Copenhague), que expresa un gen suicida tal como el gen suicida FCU1 (ver el documento WO2009/065546).
La secuencia exógena puede reemplazar también la función de un gen defectuoso en la célula objetivo. Existen varios miles de enfermedades genéticas heredadas de mamíferos, incluyendo humanos, que son causadas por genes defectuosos tales como, por ejemplo, enfermedades que incluyen la fibrosis quística, distrofia muscular de Duchenne o enfermedad de células falciformes. Muchos tipos de cáncer son causados también por genes defectuosos, especialmente protooncogenes, y genes supresores de tumores que han sufrido mutación tales como, por ejemplo, los protooncogenes ras, src, bcl, etc. Los ejemplos de genes supresores de tumores son p53 y Rb.
Según otra posibilidad, la secuencia exógena puede codificar un antígeno asociado con tumores (TAA). El TAA se refiere a una molécula que es detectada a una frecuencia o densidad mayor en células tumorales, que en células no tumorales del mismo tipo de tejido. Los ejemplos del TAA incluyen, pero no están limitados a, CEA, MART1, MAGE1, MAGE3, GP-100 y MUC1, tal como se describe en los documentos WO 92/07000 y WO 95/09241, más preferentemente MUC1.
El gen exógeno puede codificar además un antígeno. Preferentemente el antígeno deriva de un virus tal como, por ejemplo, el VIH-1 (tal como gp 120 o gp 160), cualquiera del virus de la inmunodeficiencia felina, virus del herpes humano o animal, tal como gD o derivados del mismo o una proteína temprana inmediata tal como ICP27 del HSV1 o HSV2, citomegalovirus (tal como gB o derivados del mismo), virus de la varicela zoster (tal como gp l, II o III), o de un virus de la hepatitis tal como el virus de la hepatitis B (HBV), por ejemplo, el antígeno de superficie de la hepatitis B o un derivado del mismo (ver los documentos WO2011/015656 y WO2013/007772), virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis C (HCV; ver el documento WO 04/111082; preferentemente la proteína no estructural del HCV de la cepa del genotipo 1b), y virus de la hepatitis E (HEV), o de otros patógenos virales, tales como el virus sincicial respiratorio, virus del papiloma humano (HPV; ver los documentos W o 90/10459, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885 y WO 07/121894; se prefieren las proteínas E6 y E7 de la cepa del HPV16; ver también Liu et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Octubre 5 de 2004; 101 Supl. 2: 14567-71) o virus de la influenza, o derivados de bacterias patógenas tales como Salmonella, Neisseria, Borrelia (por ejemplo, OspA u OspB, o derivados de los mismos), o Chlamydia, o Bordetella, por ejemplo, P.69, PT y FHA, o derivados de parásitos tales como Plasmodium o Toxoplasma. Según la presente invención o descripción, dicho antígeno se selecciona más preferentemente del HCV o HPV. A este respecto, dicho virus recombinante preferido usado en una formulación según la presente invención o que se divulga en la presente memoria es MVA-HCV (ver el documento WO 04/111082), denominado también TG4040 que es un MVA que expresa los antígenos del HCV NS3, NS4 y NS5B (NS3 y NS4 siendo expresados como una proteína de fusión y NS5B, independientemente).
El virus recombinante puede comprender más de una secuencia exógena, y cada secuencia exógena puede codificar para más de una molécula. Por ejemplo, puede ser útil asociar en un mismo virus recombinante una secuencia exógena que codifique, por ejemplo, un TAA (como se describió anteriormente) o un antígeno (como se describió anteriormente) con una secuencia exógena que codifique una citocina (por ejemplo, interleucina (IL como por ejemplo, IL2); factor de necrosis tumoral (FNT); interferón (IFN); o factor estimulador de colonias (CSF)).
A este respecto, los virus recombinantes preferidos usados según la presente invención o descripción, son:
• MVA-[MUC1-IL2], que es un MVA que expresa el antígeno MUC-1 e IL-2 (ver los documentos WO 92/07000 y WO 95/09241) denominado también t G4010; y
• MVA-[HPV-IL2], que es un MVA que expresa los antígenos E6 y E7 no oncogénicos del HPV-16 e IL-2 (ver los documentos WO 90/10459, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885 y WO 07/121894) denominado también TG4001.
Según una forma de realización preferida, un producto basado en poxvirus, más particularmente un producto basado en VV tal como el denominado JX-594/TG6006 y TG6002, o un producto basado en MVA tal como el denominado TG4040, TG4010 y TG4001 se utiliza en la invención.
El poxvirus contenido en la formulación según la presente invención puede ser un poxvirus de ocurrencia natural, un poxvirus atenuado o un poxvirus recombinante.
Los métodos para producir y purificar material basado en virus, especialmente vectores virales y/o virus son conocidos por los expertos en la materia. Más particularmente, respecto a poxvirus, los métodos de producción disponibles comprenden la replicación del virus en una línea de células (por ejemplo, HelaS3 o una línea de células de pato), en huevos embrionados o en fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Las células CEF se dedican más particularmente a la producción de productos basados en MVA. Pueden cultivarse bajo condiciones conocidas por los expertos en la materia. Según el documento WO 07/147528, el virus producido de células CEF o el sobrenadante de líneas de células puede purificarse mediante filtración profunda, microfiltración y diafiltración.
El documento WO 2010/130753 describe un método para producir un poxvirus usando nucleasas y purificando adicionalmente el virus usando adsorbente de intercambio aniónico.
Sin embargo, los resultados observados con la formulación de la invención se obtienen sin tener en cuenta si el virus en la formulación es un virus no purificado, purificado o parcialmente purificado. Se prefieren los virus purificados o parcialmente purificados. El término “purificado”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una reducción de por lo menos 90% del contenido de proteína en comparación con el contenido de proteína de la preparación viral cruda, mientras que el término “parcialmente purificado” significa una reducción significante (por ejemplo, de por lo menos 20%) con respecto al contenido de proteína de la preparación viral cruda.
La formulación según la invención o divulgada en la presente memoria comprende preferentemente por lo menos un material basado en virus que es un virus, y el título del virus en dicha formulación está comprendido entre 1x106 Pfu/mL y 1x1010 Pfu/mL, más preferentemente entre 1x107 Pfu/mL y 1x109 Pfu/mL, más preferentemente entre 1x107 Pfu/mL y 5x108 Pfu/mL, y más preferentemente entre 1x108 Pfu/mL y 5x108 Pfu/mL, en la que el virus es un poxvirus en formulaciones según la invención.
La formulación divulgada en la presente memoria comprende además (ii) por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo de polivinilpirrolidona y derivados de la misma, y mezclas de la misma.
El término “polivinilpirrolidona”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un polímero soluble en agua formado del monómero N-vinilpirrolidona. Los términos y abreviaturas PVP, povidona, plasdona, polividona, crospovidona y kollidon se usan con el mismo significado.
Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término “derivados de PVP” y variaciones del mismo, signifiquen sustancias que comprenden polivinilpirrolidona (PVP) y versiones sustituidas de la misma incluyendo, pero no limitadas a: copovidona (por ejemplo, plasdona S-630 y kollidon VA-64; y PVP entrelazada (por ejemplo, crospovidona, denominada también polivinilpolipirrolidona o PVPP). La formulación según la invención comprende además (ii) por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo de polivinilpirrolidona, copovidiona y mezcla de las mismas.
Según la presente invención y descripción, la PVP y derivados de la misma tienen un peso molecular en el intervalo de 5 kg/mol (kDa) a 400 kg/mol (kDa), más preferentemente en un intervalo de 5 kg/mol (kDa) a 70 kg/mol (kDa). Según una forma de realización ventajosa, la PVP y derivados de la misma tienen un bajo peso molecular, es decir, un peso molecular de no más de 55 kg/mol (kDa), preferentemente comprendido entre 10 kg/mol (kDa) y 40 kg/mol (kDa), preferentemente entre 15 kg/mol (kDa) y 30 kg/mol (kDa), y el cual es más preferentemente de 25 kg/mol (kDa). A bajo peso molecular, el polímero de PVP sería menos inmunógeno que a alto PM, y mejor tolerable durante la inyección.
La formulación acuosa a partir de la cual la formulación deshidratada por congelación de la invención se ha obtenido por deshidratación por congelación o la formulación divulgada en la presente memoria comprende entre 5 g/L y 80 g/L de PVP o derivados o mezclas de la misma, preferentemente entre 10 g/L y 50 g/L, más preferentemente entre 15 g/L y 40 g/L, y más preferentemente entre 20 g/L y 35 g/L de PVP, o derivados de la misma como se definió anteriormente. Según una forma de realización específica, la formulación de la invención comprende 33.25 g/L de PVP, y más específicamente de PVP que tiene un peso molecular de 25 kg/mol (kDa).
La formulación divulgada en la presente memoria comprende además (iii) por lo menos un azúcar.
Dicho azúcar se selecciona más preferentemente de entre monosacárido, disacárido, trisacárido y tetrasacárido, y derivados de los mismos. En la formulación según la invención, dicho azúcar es seleccionado de entre disacáridos.
Los monosacáricos tales como glucosa, galactosa y manosa se seleccionan en formulaciones divulgadas en la presente memoria.
Los disacáridos utilizados en la formulación según la presente invención se seleccionan preferentemente entre sucrosa (denominada también sacarosa), lactulosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, isomaltosa y maltulosa.
Un trisacárido tal como rafinosa se selecciona preferentemente en las formulaciones divulgadas en la presente memoria.
Un tetrasacárido tal como estaquiosa se contempla también en las formulaciones divulgadas en la presente memoria.
Una formulación de la presente invención comprende por lo menos un disacárido. Según una forma de realización aún más preferida, dicho disacárido se selecciona de entre el grupo que consiste en sacarosa, lactulosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, isomaltosa y maltulosa, y ventajosamente es sacarosa.
La formulación acuosa a partir de la cual la formulación deshidratada por congelación de la invención se ha obtenido mediante deshidratación por congelación o la formulación divulgada en la presente memoria comprende entre 20 g/L y 80 g/L, preferentemente entre 30 g/L y 70 g/L, y aún más preferentemente entre 40 g/L y 60 g/L. Según una forma de realización más preferida de la presente invención, dicha formulación comprende 50 g/L de azúcar, ventajosamente 50 g/L de sacarosa.
Según una forma de realización preferida, en una formulación de la presente invención la relación en peso de azúcar respecto a PVP (azúcar/PVP (en p/p)) es de por lo menos 1, más preferentemente entre 1 y 5, más preferentemente entre 1 y 2, y es preferentemente 1.5.
La formulación divulgada comprende además (iv) por lo menos dos aminoácidos diferentes.
En la formulación divulgada en la presente memoria, dichos aminoácidos se seleccionan entre alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamina, glutamato, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, pirrolisina, selenocisteína, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina, y derivados de los mismos, incluyendo ambos estereoisómeros.
El término glutamato se refiere a la forma de sal farmacéuticamente aceptable de ácido glutámico, preferentemente es una sal monovalente y más preferentemente una sal monosódica de ácido glutámico, es decir, glutamato monosódico (MSG).
Una formulación divulgada en la presente memoria comprende preferentemente por lo menos un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en L-estereoisómeros, por ejemplo, L-arginina.
Una formulación divulgada en la presente memoria comprende preferentemente por lo menos un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en arginina, histidina y lisina.
Una formulación divulgada en la presente memoria comprende preferentemente por lo menos un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en aspartato y glutamato.
Una formulación de la presente invención comprende arginina y glutamato.
Según una forma de realización preferida, la formulación acuosa a partir de la cual la formulación deshidratada por congelación de la invención se ha obtenido por deshidratación por congelación o la formulación divulgada en la presente memoria comprende cantidades totales de aminoácido comprendidas entre 10 g/L y 200 g/L, más preferentemente entre 10 g/L y 150 g/L, y más preferentemente entre 10 g/L y 100 g/L.
La formulación acuosa a partir de la cual la formulación deshidratada por congelación de la presente invención se ha obtenido por deshidratación por congelación o la formulación divulgada en la presente memoria comprende entre 5 g/L y 100 g/L, y más preferentemente entre 5 g/L y 80 g/L de arginina. La concentración de arginina de 5 g/L a 20 g/L es más adecuada para la formulación de virus con un alto título viral (por ejemplo, de aproximadamente 1x108 PFU/mL o más) y la mayor concentración de arginina para la formulación de virus con un título viral menor (por ejemplo, menos de 1x108 PFU/mL).
Una formulación divulgada en la presente memoria comprende preferentemente entre 1 g/L y 50 g/L, más preferentemente entre 1 g/L y 20 g/L, más preferentemente entre 1 g/L y 10 g/L, y más preferentemente entre 1 g/L y 5 g/L de glutamato. La formulación acuosa a partir de la cual la formulación deshidratada por congelación según la invención se ha obtenido por deshidratación por congelación comprende entre 1 g/L y 10 g/L, preferentemente entre 1 g/L y 5 g/L de glutamato. Según una forma de realización más preferida de la presente invención, dicha formulación comprende 2.49 g/L de glutamato.
Según una forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 2.49 g/L de glutamato y 8.43 g/L de arginina.
Según una forma de realización más preferida de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 2.49 g/L de glutamato y 42.13 g/L de arginina.
Según una forma de realización más preferida de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 2.49 g/L de glutamato y 56.04 g/L de arginina.
La formulación divulgada en la presente memoria comprende además (v) por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables, en la que por lo menos una de dichas sales es una sal de fosfato. En la formulación de la invención, dichas por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables son por lo menos una sal de fosfato farmacéuticamente aceptable y por lo menos una sal monovalente farmacéuticamente aceptable.
Los fosfatos son conocidos por causar cambios de pH, y su utilización en la formulación se ha considerado como problemática (ver, por ejemplo: Freeze Drying of Pharmaceuticals & Biologicals Conference, Agosto 6 - 9, 2008, Great Divide Lodge Breckenridge, Colorado). De igual manera, el documento EP1418942 indica que la presencia de fosfato en la formulación que contiene material basado en virus, especialmente poxvirus, induce agregación y precipitación del virus, especialmente durante el procedimiento de secado. En forma sorprendente, los inventores de la presente invención han mostrado que en el contexto de la presente invención, el regulador de pH de fosfato participa en las propiedades de estabilización de la formulación reclamada.
Según una forma de realización, por lo menos una de las sales farmacéuticamente aceptables de la invención se selecciona de entre el grupo que consiste en sales de sodio y de potasio, y combinaciones de las mismas.
Según una forma de realización preferida, por lo menos una de las sales farmacéuticamente aceptables de la formulación es una sal de fosfato y se selecciona de entre el grupo que consiste en sales de fosfato monobásico, sales de fosfato dibásico y sales de fosfato tribásico.
Según una forma de realización, por lo menos una de las sales farmacéuticamente aceptables de la formulación es una sal de fosfato y se selecciona de entre el grupo que consiste en fosfato monosódico (NaH2PO4) y fosfato monopotásico (KH2PO4).
Según otra forma de realización, por lo menos una de las sales farmacéuticamente aceptables de la formulación es una sal de fosfato y se selecciona de entre el grupo que consiste en fosfato disódico (Na2HPO4) y fosfato dipotásico (K2HPO4).
Según otra forma de realización, por lo menos una de las sales farmacéuticamente aceptables de la formulación es una sal de fosfato y se selecciona de entre el grupo que consiste en fosfato tripotásico (K3PO4) y fosfato trisódico (NaaPO4).
Según una forma de realización preferida de la presente invención, por lo menos una de las sales farmacéuticamente aceptables de la formulación es fosfato disódico Na2HPO4.
Según otra forma de realización, una formulación según la presente invención comprende (v) por lo menos dos sales de fosfato las cuales forman un regulador de pH de fosfato. Dicho regulador de pH de fosfato es más preferentemente una mezcla que comprende por lo menos una sal de fosfato monobásico y por lo menos una sal de fosfato dibásico. Dicho regulador de pH de fosfato es más preferentemente una mezcla que comprende fosfato dipotásico (KH2PO4) y fosfato disódico (Na2HPO4). De esta manera según una forma de realización preferida, la formulación de la presente invención comprende (v) fosfato dipotásico (KH2PO4) y fosfato disódico (Na2HPO4). Según una forma de realización específica, la formulación de la presente invención comprende (v) fosfato dipotásico (KH2PO4) y fosfato disódico (Na2HPO4) a una relación de aproximadamente 1:5, respectivamente. La formulación acuosa a partir de la cual la formulación deshidratada por congelación de la invención se ha obtenido por deshidratación por congelación comprende y la formulación divulgada en la presente memoria comprende por lo menos 0.1 g/L, más preferentemente entre 0.1 g/L y 10 g/L, y aún más preferentemente entre 0.1 g/L y 5 g/L de sal de fosfato.
Según una forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende por lo menos 0.1 g/L, preferentemente 0.19 g/L de sal de fosfato.
Según otra forma de realización preferida, la formulación de la invención o divulgada en la presente memoria comprende por lo menos 0.1 g/L de Na2HPO4, y preferentemente entre 0.1 g/L y 5 g/L de Na2HPO4.
Según una forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 0.19 g/L de sal de fosfato, y aún más específicamente 0.19 g/L de Na2HPO4.
Según otra forma de realización preferida, la formulación de la invención o divulgada en la presente memoria comprende por lo menos 0.1 g/L de KH2PO4, preferentemente entre 0.1 g/L y 5 g/L de KH2PO4, aún preferentemente entre 0.1 g/L y 1 g/L de KH2PO4, y más preferentemente entre 0.1 g/L y 0.6 g/L de KH2PO4.
Según otra forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 0.94 g/L de sal de fosfato, y aún más específicamente 0.79 g/L de Na2HPO4 y 0.15 g/L de KH2PO4.
Según otra forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 1.88 g/L de sal de fosfato, y aún más específicamente 1.59 g/L de Na2HPO4 y 0.29 g/L de KH2PO4.
Según otra forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 3.75 g/L de sal de fosfato, y aún más específicamente 3.17 g/L de Na2HPO4 y 0.58 g/L de KH2PO4.
En el contexto de la invención o divulgación, se prefiere que dicha formulación comprenda por lo menos 1 g/L de regulador de pH de fosfato (por ejemplo, por lo menos 1.2, 1.5, 1.6, 1.7 o 1.8 g/L). Una formulación preferida comprende regulador de pH de fosfato como se definió anteriormente (por ejemplo, 1.59 g/L de Na2HPO4 y 0.29 g/L de KH2PO4 o 3.17 g/L de Na2HPO4 y 0.58 g/L de KH2PO4) y arginina como se definió anteriormente (por ejemplo, aproximadamente 8.43 g/L o más).
Según otra forma de realización específica, la formulación divulgada en la presente memoria comprende (v) por lo menos una sal farmacéuticamente aceptable adicional, la cual no es una sal de fosfato.
En la invención, dicha sal farmacéuticamente aceptable adicional es una sal monovalente. Según una forma de realización preferida, dicha sal farmacéuticamente aceptable adicional se selecciona de entre el grupo que consiste en NaCl y KCl, y es preferentemente NaCl.
Según una forma de realización, la formulación divulgada en la presente memoria comprende entre 1 g/L y 10 g/L, preferentemente no más de 5 g/L, y más preferentemente entre 1 g/L y 5 g/L de dicha sal farmacéuticamente aceptable adicional. La formulación acuosa a partir de la cual la formulación deshidratada por congelación según la invención se ha obtenido por deshidratación por congelación comprende entre 1 g/L y 5 g/L de dicha sal farmacéuticamente aceptable adicional.
Según una forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 3.89 g/L de NaCI.
Según una forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 1.94 g/L de NaCI.
La formulación de la invención o divulgación puede comprender además (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización, la formulación de la invención o divulgación comprende además un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización, el pH de una formulación según la presente invención o divulgación está comprendido entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8.5, preferentemente es de 7.5±0.5, y más preferentemente es 7.5. El pH puede ajustarse con las cantidades respectivas de las sales de fosfato, más preferentemente KH2PO4 y Na2HPO4, según métodos bien conocidos por el experto en la materia, tal como en Sorensen en Hayat, 1986.
Dicho regulador de pH farmacéuticamente aceptable puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos. Según una forma de realización preferida, dicho regulador de pH es TRIS o HEPES, y aún más preferentemente es TRIS.
Según una forma de realización preferida, la formulación acuosa a partir de la cual la formulación deshidratada por congelación de la invención se ha obtenido por deshidratación por congelación o la formulación divulgada en la presente memoria comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 mM y más preferentemente entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM de dicho regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende aproximadamente 10 mM de TRIS, más específicamente 1.61 g/L de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) por lo menos un material basado en virus, (ii) por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo de polivinilpirrolidona y derivados de la misma, (iv) por lo menos dos aminoácidos diferentes, (v) por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables, en la que por lo menos una de dichas sales es una sal de fosfato y en la que dicha sal de fosfato es una sal de fosfato disódico, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable el cual se selecciona más preferentemente entre TRIS o HEPES.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) por lo menos un material basado en virus, (ii) por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo de polivinilpirrolidona y derivados de la misma, (iv) por lo menos dos aminoácidos diferentes, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y sal de fosfato monopotásico, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable el cual se selecciona más preferentemente entre TRIS o HEPES.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) por lo menos un material basado en virus, (ii) por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo de polivinilpirrolidona y derivados de la misma, (iv) por lo menos dos aminoácidos diferentes, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico, sal de fosfato monopotásico y NaCl, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable el cual se selecciona más preferentemente entre TRIS o HEPES.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables, en la que por lo menos una de dichas sales es una sal de fosfato y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de por lo menos una sal de fosfato monovalente y/o por lo menos una sal de fosfato divalente, y opcionalmente (v) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y sal de fosfato monopotásico, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos una sal de fosfato y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCI, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos una sal de fosfato monovalente y/o por lo menos una sal de fosfato divalente y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y opcionalmente (v) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) sal de fosfato disódico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCI, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y sal de fosfato monopotásico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCI, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables, en la que por lo menos una de dichas sales es una sal de fosfato y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de por lo menos una sal de fosfato monovalente y/o por lo menos una sal de fosfato divalente, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y sal de fosfato monopotásico, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos una sal de fosfato y una sal monovalente, preferentemente NaCl, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) sal de fosfato disódico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y fosfato monopotásico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y opcionalmente (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y sal de fosfato monopotásico, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos una sal de fosfato y una sal monovalente, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) sal de fosfato disódico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y fosfato monopotásico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, Mo Ps , HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y fosfato monopotásico y NaCl, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables, en la que por lo menos una de dichas sales es una sal de fosfato, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de por lo menos una sal de fosfato monovalente y/o por lo menos una sal de fosfato divalente, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, Mo BS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, He PES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y sal de fosfato monopotásico, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, Mo Ps , HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos una sal de fosfato y una sal monovalente, preferentemente NaCl, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, h Ep ES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) sal de fosfato disódico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, h Ep ES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y fosfato monopotásico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y fosfato monopotásico y NaCl, y (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOpS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un regulador de pH de TRIS.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) de aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 1 g/L de sal de fosfato disódico y de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 10 g/L, preferentemente de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 5 g/L de sal monovalente, preferentemente NaCI.
Según otra forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una formulación que comprende (i) un poxvirus seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA y VV, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) de aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 1 g/L de sal de fosfato disódico y de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 10 g/L, preferentemente de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 5 g/L de sal monovalente, preferentemente NaCI, y (vi) de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 10 g/L, y más preferentemente de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 5 g/L de regulador de pH de TRIS.
Una formulación típica que contiene virus adecuada para deshidratación por congelación comprende (ii) 33.25 g/L de PVP de 25 kDa, (iii) 50 g/L de sacarosa, (iv) 2.49 g/L de glutamato y 8.43 g/L de arginina, (v) 0.79 g/L de Na2HPO4 y 0.15 g/L de KH2PO4.
Según otra forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 1.88 g/L de sal de fosfato, y aún más específicamente 1.59 g/L de Na2HPO4 y 0.29 g/L de KH2PO4.
Según otra forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 3.75 g/L de sal de fosfato, y aún más específicamente 3.17 g/L de Na2HPO4 y 0.58 g/L de KH2PO4.
Según otra forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 3.89 g/L de NaCI.
Según una forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 1.94 g/L de NaCI.
Según otra forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 3.89 g/L de NaCI y 1.61 mM de TRIS.
Según una forma de realización específica de la presente invención o divulgación, dicha formulación comprende 1.94 g/L de NaCI y 1.61 g/L de TRIS.
Producto seco
La presente descripción se refiere además a un material estable basado en virus que contiene una vacuna que comprende la formulación como se describió anteriormente en forma secada, preferentemente deshidratada por congelación.
El término “seco” denota una formulación, composición, producto, vacuna y similares que exhibe un contenido de humedad residual de menos de 3% en peso de producto, preferentemente menos de 2%, y más preferentemente de 1% o menos. Según una forma de realización particular, el material secado (incluyendo formulación seca, composición seca, producto seco, vacuna seca, material seco basado en virus que contiene vacuna) es sólido en forma cristalina o amorfa a aproximadamente 5°C, temperatura ambiente y hasta aproximadamente 45°C.
Según una forma de realización específica, dicho contenido de humedad residual se determina mediante el método de Karl Fisher.
Según la presente descripción, el “material seco” (incluyendo formulación seca, composición seca, producto seco, vacuna seca, material seco basado en virus que contiene vacuna) tiene un contenido de humedad residual tal como se definió anteriormente.
Según una forma de realización, dicho material seco puede obtenerse deshidratando por congelación una formulación, preferentemente una formulación acuosa, como se divulga anteriormente. De esta manera, según una forma de realización preferida, un material seco (en particular formulación seca o material seco basado en virus que contiene vacuna de la presente invención) se refiere a un material “deshidratado por congelación” o “ liofilizado” (en particular formulación “deshidratada por congelación” o “liofilizada”, o material basado en virus “deshidratado por congelación” o “liofilizado” que contiene vacuna). Las formulaciones según la invención están deshidratadas por congelación.
Los términos “deshidratado por congelación” y “liofilizado” son equivalentes, así como los términos “ liofilización” y “deshidratación por congelación”.
Según una forma de realización preferida, la pérdida en el título del virus después de la liofilización, es decir, la pérdida debida al procedimiento de deshidratación por congelación, es no más de 0.3 log, preferentemente no más de 0.2 log, y más preferentemente no más de 0.1 log.
Además, dicho “material seco” es ventajosamente estable (ver a continuación), es decir, su pérdida acumulada en el título del virus es limitada.
Además, debe apreciarse que, mientras que es conocido en la literatura que las sales de fosfato tales como el dodecahidrato de fosfato ácido disódico (Na2HPO4, [12H2O]) se precipita a bajas temperaturas, de esta manera disminuyendo posiblemente el pH del producto drásticamente (Croyle et al., «Factors that influence stability of recombinant adenoviral preparations for human gene therapy, Pharmaceutical development and technology», 3(3), 373-383, 1998), el pH de la formulación según la presente invención se mantuvo inesperadamente durante la congelación a todas las temperaturas.
Se desea además que el “material seco” según la presente invención o divulgación tenga un bajo contenido de humedad residual (RM), puesto que es conocido por los expertos en la materia que es un indicador de estabilidad, ya que la exposición a la humedad durante el almacenamiento puede desestabilizar un producto y de esta manera permite un menor término de preservación. La RM es la cantidad de agua unida que permanece en un producto deshidratado por congelación. La técnica colorimétrica de Karl Fisher bien conocida para poner a prueba la humedad residual puede usarse para determinar el contenido de agua mediante la titulación volumétrica (Jennings, T. A., "Lyophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491­ 081-7, págs. 415-418). Esta se mide como el porcentaje en peso de agua que queda en comparación con el peso total del producto secado. La Farmacopea Europea (edición V) recomienda una RM por debajo de 3% en peso de producto.
Más particularmente, en el “material seco” según la presente invención o divulgación, la RM es menor de 3% en peso de producto, más preferentemente menor de 2%, y es más preferentemente 1% en peso de producto o menos.
Se espera también que el “material seco” según la presente invención o divulgación muestre un aspecto conveniente. En realidad, las composiciones secas adecuadas presentan una capa blanca uniforme o “torta”, la cual no se retrae de los lados del vial después de la liofilización. Un “material seco” menos adecuado aparece “fundido”, “hervido” o de otra manera malformado, y retraído de los lados del vial después del almacenamiento.
El “material seco” puede obtenerse en forma de un polvo seco. Una torta que resulta de, por ejemplo, deshidratación por congelación, puede ser molida en forma de polvo. Un “material seco” sólido según la invención puede adoptar de esta manera la forma de partículas de flujo libre. La composición sólida se proporciona típicamente como un polvo en un vial sellado, ampolla o jeringa. La matriz sólida puede proporcionarse alternativamente como un parche. Un polvo puede ser comprimido en forma de comprimido.
Procedimiento de deshidratación por congelación
Como se mencionó anteriormente, la formulación, preferentemente formulación acuosa de la descripción, es adecuada para secado, preferentemente deshidratación por congelación. Preferentemente, el material basado en virus comprendido en la formulación sometida a deshidratación por congelación, es purificado o por lo menos parcialmente purificado como se definió anteriormente.
Según una forma de realización especial, la presente descripción se refiere a un método para la preparación de “material seco”, en el que dicho método comprende la etapa de deshidratar por congelación una formulación acuosa que comprende (i) por lo menos un material basado en virus, (ii) por lo menos un polímero seleccionado de entre el grupo de polivinilpirrolidona y derivados de la misma, (iii) por lo menos un azúcar, (iv) por lo menos dos aminoácidos diferentes, (v) por lo menos dos sales farmacéuticamente aceptables, en el que por lo menos una de dichas sales es una sal de fosfato y, opcionalmente, (vi) un regulador de pH farmacéuticamente aceptable.
Los métodos de deshidratación por congelación son generalmente conocidos por los expertos en la materia (Day, J. y McLellan, M., Methods in Molecular Biology, Humana Press (1995), vol. 38).
Existen usualmente tres etapas principales para el método de deshidratación por congelación, a saber, congelación, secado primario y secado secundario. La congelación se lleva a cabo típicamente usando una máquina de deshidratación por congelación. Durante esta etapa, es importante enfriar el material biológico por debajo de su punto eutéctico (Teu) en el caso de productos cristalinos simples, o temperatura de transición de vidrio (Tg') en el caso de productos amorfos, es decir, abajo de la temperatura más baja a la cual la fase sólida y líquida del material puede coexistir. Esto asegura que la sublimación más que la fusión ocurrirá en la siguiente etapa de secado primario.
Durante el secado primario, la presión es controlada por la aplicación de niveles apropiados de vacío mientras se suministra calor suficiente para permitir que el agua se sublime. Por lo menos 50%, típicamente 60 a 70% del agua en el material, es sublimada en esta etapa. El secado primario puede ser lento, ya que demasiado calor podría degradar o alterar la estructura del material biológico. Una cámara de condensador y/o placas de condensador frías proporcionan superficies sobre las cuales el vapor de agua es atrapado por resolidificación.
En el procedimiento de secado secundario, el agua de hidratación es removida por la aplicación adicional de calor. Típicamente, la presión es disminuida también para fomentar más secado. Después de que concluya el procedimiento de deshidratación por congelación, el vacío puede ser interrumpido con un gas inerte tal como nitrógeno antes del sellado, o el material puede ser sellado bajo vacío.
En el contexto de la presente descripción, se ha encontrado en forma sorprendente que podrían aplicarse altas temperaturas, es decir, hasta 50°C, a la etapa de secado secundaria para asegurar el procedimiento de deshidratación por congelación, sin que se deteriore el virus.
De esta manera, la presente descripción se refiere más preferentemente a un procedimiento de deshidratación por congelación, que consiste en secar una composición líquida según la presente invención, y en el que la etapa de secado secundario se lleva a cabo a una temperatura que varía hasta 50°C±5°C, más preferentemente entre 30°C y 45°C, y se lleva a cabo preferentemente a 40°C±5°C.
Además, se observará que un producto seco con los mismos parámetros del título podría producirse en un volumen que está siendo reducido, por ejemplo, hasta una tercera parte del volumen de llenado, permitiendo de esta manera el aumento de la concentración de una tercera parte y disminuyendo además la duración del ciclo de liofilización, en comparación con lo que se conoce usualmente en la materia para virus tales como los poxvirus.
Material reconstituido
La presente invención y divulgación se refieren además a material reconstituido. El “material reconstituido” (incluyendo formulación reconstituida, composición reconstituida, producto reconstituido, vacuna reconstituida, material reconstituido basado en virus que contiene vacuna) corresponde a un “material seco” (incluyendo formulación seca, composición seca, producto seco, vacuna seca, material seco basado en virus que contiene vacuna) el cual ha sido reconstituido por la adición de una cantidad adecuada de un solvente farmacéuticamente aceptable. Según una forma de realización especial, el solvente farmacéuticamente aceptable se selecciona de entre el grupo que consiste en agua para inyección (WFI), suero fisiológico, o soluciones salinas tales como solución de NaCl.
Cuando la formulación según la presente invención o divulgación contiene sal adicional, más preferentemente sal monovalente tal como NaCl, está más particularmente dedicada a ajustar, si es necesario, la osmolalidad del material reconstituido. Más precisamente, la osmolalidad de un material reconstituido según la presente invención será compatible con el uso para inyección, es decir, estará comprendida entre 280 mOsm/kg y 900 mOsm/kg, más particularmente entre 280 mOsm/kg y 600 mOsm/kg, y más preferentemente entre 280 mOsm/kg y 350 mOsm/kg.
Título viral
Uno de los inconvenientes principales del procedimiento de secado, y más particularmente el procedimiento de deshidratación por congelación, es que pueden ser inestables, llevando a una pérdida general del título del virus que puede incrementarse durante el almacenamiento.
Un objetivo de la presente invención fue proporcionar una formulación, preferentemente una formulación acuosa, que sea estable. Se refiere además a una formulación seca preferentemente deshidratada por congelación como se describió anteriormente, que sea estable. Más particularmente, dicha estabilidad significa que el material basado en virus o producto contenido en la formulación (incluyendo una forma acuosa o seca) de la invención o divulgación, es biológicamente activo y retiene su actividad biológica (es decir, el material basado en virus, por ejemplo poxvirus en la invención, continúa siendo infeccioso), cuando se formula según la invención o divulgación. El material basado en virus retiene su actividad biológica cuando se formula según la invención o divulgación, si la actividad biológica del material basado en virus en un tiempo dado está dentro de aproximadamente 10% (dentro de los errores de la prueba) de la actividad biológica exhibida en el momento en el que la formulación se preparó. En el caso de virus, la actividad biológica puede considerarse retenida cuando el título viral de la formulación está dentro de un log del título inicial. Según una forma de realización particular, el material basado en virus que contiene la formulación de la presente invención o divulgación es estable cuando la pérdida general en el título del virus a una temperatura de incubación de 5°C+/-3°C durante por lo menos 60 días (por ejemplo, 90 días o incluso más, tal como varios meses o años), es menor de 0.7 log, preferentemente menor de 0.5 log, más preferentemente menor de 0.4 log, y aún más preferentemente menor de 0.3 logs.
La “pérdida general en el título del virus” se define como la pérdida acumulada en el título del virus medida después de la etapa de secado y medida durante el almacenamiento de la formulación seca (la medición se lleva a cabo después de la reconstitución del material en agua).
La “pérdida en el título del virus después de la etapa de secado” corresponde a la pérdida del título del virus entre el momento en el que se preparó la formulación y después de la etapa de secado, es decir, es la pérdida en el título del virus debido al procedimiento de secado como tal. En los siguientes experimentos, corresponde a la pérdida en el título del virus medida en el día 0 contra el día -1 (ver la sección de ejemplos).
La “pérdida en el título del virus después de la etapa de secado” es independiente de la temperatura y es generalmente menor de 0.3 log, más preferentemente menor de 0.2 log.
La “pérdida en el título del virus durante el almacenamiento” de dicha formulación seca, corresponde a la pérdida del título del virus después de la etapa de secado y durante un período de almacenamiento determinado de “n” días a una temperatura de almacenamiento determinada.
La “pérdida en el título del virus durante el almacenamiento” es preferentemente menor de 0.4 log a 5°C+/-3°C durante por lo menos 60 días, más preferentemente menor de 0.3 log a 5°C+/-3°C durante por lo menos 60 días (por ejemplo, 90 días o incluso más).
Alternativamente, es posible acortar la evaluación de la estabilidad de las formulaciones según la presente invención o divulgación, llevando a cabo estudios de estabilidad acelerados a temperaturas elevadas. En realidad, dichos estudios de estabilidad acelerados permiten predecir los resultados a menor temperatura, sin que tengan que esperarse datos de estabilidad en tiempo real, es decir, generalmente 1 a 3 años a 5°C+/-3°C (frente a, por ejemplo, aproximadamente 1 semana a 37+/-5°C y aproximadamente 3 a 5 días a 45+/-5°C). Para este propósito, se describen diferentes modelos matemáticos en el estado de la técnica, y pueden usarse para extrapolar los resultados a temperaturas más bajas. Uno de estos modelos, es el modelo multivariable basado en el principio de Arrhenius bien conocido, el cual se lee como sigue:
Figure imgf000015_0001
en el que C0 es el título inicial en PFU/mL, T es la temperatura en grados Kelvin, t es el tiempo en días, C es el título en el tiempo correspondiente t en PFU/mL, y p0, p1 y p2 son parámetros del modelo (los cuales pueden variar, dependiendo de los datos específicos del modelo).
Usualmente, se llevan a cabo pruebas de estabilidad aceleradas durante aproximadamente 1 semana a 37+/-5°C (recomendación de la Organización Mundial de la Salud). En el presente caso, dichos estudios acelerados se han llevado a cabo a 45+/-5°C en diferentes períodos (ver la sección de ejemplos).
El término “temperatura ambiente” (RT), como se usa en la presente memoria descriptiva, corresponde a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C.
La prueba que se usa para determinar el título del poxvirus, por ejemplo, es la técnica de prueba en placa (ver, por ejemplo, Kaufmann y Kabelitz, 2002, Methods in Microbiology Vol. 32: Immunology of Infection. Academic Press. ISBN 0125215320). El título de esta prueba se reporta como unidades formadoras de placa por mililitro (PFU/mL). Un protocolo detallado para determinar el título del virus y de esta manera la pérdida general en el título del virus, se proporciona en la sección de ejemplos. Sin embargo, puede usarse también cualquier protocolo alternativo para determinar el título viral.
La formulación que comprende el material basado en virus o el material reconstituido según la invención o divulgación, puede administrarse a un paciente o un animal que necesita de la misma, más particularmente como una vacuna para una utilización terapéutica o profiláctica.
Según otra forma de realización, la invención y la descripción se refieren a una formulación que comprende el material basado en virus o un material reconstituido como se definió anteriormente, para su utilización como una vacuna. Puede administrarse mediante diferentes vías que pueden ser, por ejemplo, las vías intravenosa, intratumoral, intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraperitoneal. Está dentro de las aptitudes del médico general cómo dicha formulación, en particular una formulación acuosa que contiene poxvirus, puede administrarse apropiadamente. La administración puede realizarse como una dosis individual, o puede repetirse una vez o varias veces después de un cierto intervalo de tiempo. La vía de administración y dosificación apropiada varía como una función de varios parámetros, por ejemplo, del individuo, de la enfermedad que se va a tratar, o de los genes de interés que van a ser transferidos.
La presente descripción se refiere también a un método para administrar una formulación que comprende el material basado en virus o un material reconstituido como se definió previamente a un hospedero que necesita del mismo, caracterizado por que un producto seco es reconstituido en un solvente fisiológicamente aceptable, seleccionado preferentemente de entre agua PPI, WFI, suero fisiológico, o solución salina tal como solución de NaCl, y entonces administrado a dicho hospedero que necesita del mismo.
Las presentes invención y descripción se refieren también a una formulación que comprende el material basado en virus o un material reconstituido como se definió anteriormente, para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades y más preferentemente de estados de enfermedad seleccionados de entre cánceres, enfermedades infecciosas y/o trastornos autoinmunitarios.
Como se usa en la presente memoria, el término “cáncer” se refiere, pero no está limitado a, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinomas de pulmón de células pequeñas y carcinomas de pulmón de células no pequeñas), cáncer bronquial, cáncer esofágico, cáncer faríngeo, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, cáncer de laringe, cáncer de labio, cáncer del seno paranasal y de la cavidad nasal y cáncer de garganta), cáncer de la cavidad oral (por ejemplo, cáncer de lengua), cáncer gástrico (por ejemplo, cáncer de estómago), cáncer intestinal, cáncer gastrointestinal, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer anal, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer del tracto urinario, cáncer de vejiga, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, carcinoma, adenocarcinoma, hepatocarcinoma, carcinoma hepatocelular (HCC) o cáncer colorrectal metastásico (mCRC), cáncer de piel (por ejemplo, melanoma), cáncer de ojo (por ejemplo, retinoblastoma), cáncer de cerebro (por ejemplo, glioma, meduloblastoma y astrocitoma cerebral), cáncer del sistema nervioso central, linfoma (por ejemplo, linfoma cutáneo de células B, linfoma de Burkitt, síndrome de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin), cáncer de hueso, leucemia, cáncer de mama, cáncer del tracto genital, cáncer cervical (por ejemplo, neoplasia intraepitelial cervical), cáncer uterino (por ejemplo, cáncer endometrial), cáncer de ovario, cáncer vaginal, cáncer vulvar, cáncer de próstata y cáncer testicular. El término “cánceres” se refiere también a tumores inducidos por virus que incluyen, pero no están limitados a, carcinoma inducido por virus del papiloma, tumores inducidos por virus del herpes, linfoma de células B inducido por el EBV, tumores inducidos por hepatitis B, linfoma inducido por el HTLV-1 y linfoma inducido por el HTLV-2.
En el caso de cánceres, dicha administración de una composición según la presente invención o divulgación puede asociarse adicionalmente con una quimioterapia de primera línea.
Como se usa en la presente memoria, el término “enfermedad infecciosa” se refiere a cualquier enfermedad que es causada por un organismo infeccioso. Los organismos infecciosos incluyen, pero no están limitados a, virus (por ejemplo, virus de ARN de cadena sencilla, virus de ADN de cadena sencilla, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis A, B y C, virus del herpes simple (HSV), citomegalovirus (CMV), virus sincicial respiratorio (RSV), virus de Epstein-Barr (EBV) o virus del papiloma humano (HPV)), parásitos (por ejemplo, protozoarios y metazoarios patógenos tales como especies de plasmodios, especies de Leishmania, especies de esquistosoma o especies de Trypanosoma), bacterias (por ejemplo, micobacterias, en particular, M. tuberculosis, Salmonella, estreptococos, E. coli o estafilococos), hongos (por ejemplo, especies de Candida o especies de Aspergillus), Pneumocystis carinii y priones.
Como se usa en la presente memoria, el término “trastorno autoinmunitario” se refiere a dos tipos generales: “enfermedades autoinmunitarias sistémicas” (es decir, trastornos que dañan a muchos órganos o tejidos, y “enfermedades autoinmunitarias localizadas”, es decir, trastornos que dañan a sólo un órgano o tejido). Sin embargo, el efecto de las “enfermedades autoinmunitarias localizadas” puede ser sistémico, afectando indirectamente a otros órganos y sistemas del cuerpo. Las “enfermedades autoinmunitarias sistémicas” incluyen, pero no están limitadas a, artritis reumatoide, que puede afectar articulaciones, y posiblemente el pulmón y la piel; lupus, que incluye lupus eritematoso sistémico (SLE), el cual puede afectar a la piel, articulaciones, riñones, corazón, cerebro y eritrocitos, así como otros tejidos y órganos; esclerodermia, la cual puede afectar a la piel, el intestino y los pulmones; síndrome de Sjogren, el cual puede afectar a las glándulas salivales, glándulas lagrimales y articulaciones; síndrome de Goodpasture, el cual puede afectar a los pulmones y riñones; granulomatosis de Wegener, la cual puede afectar a los senos, pulmones y riñones; polimialgia reumática, la cual puede afectar a grandes grupos de músculos, y arteritis temporal/arteritis de células gigantes, la cual puede afectar a arterias de la cabeza y cuello. Las “enfermedades autoinmunitarias localizadas” incluyen, pero no están limitadas a, diabetes mellitus tipo 1, la cual afecta a los islotes pancreáticos; tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Graves, las cuales afectan a la tiroides; enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, las cuales afectan al tracto gastrointestinal; esclerosis múltiple (MS) y síndrome de Guillain-Barré, los cuales afectan al sistema nervioso central; enfermedad de Addison, la cual afecta a las glándulas suprarrenales; esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante y hepatitis autoinmunitaria, las cuales afectan al hígado; y fenómeno de Raynaud, el cual puede afectar a los dedos, dedos del pie, nariz y oídos.
De esta manera, la presente descripción se refiere además a un método para tratar o prevenir estados de enfermedad como se mencionó anteriormente, usando una formulación que comprende el material basado en virus o un material reconstituido como se definió previamente. Dicho método comprende más preferentemente reconstituir un producto liofilizado como se definió anteriormente, y administrar el material reconstituido correspondiente a un hospedero que necesita del mismo.
Entonces, otra forma de realización de la presente descripción se refiere a un método para la vacunación de un animal, incluyendo un humano, que necesita del mismo, con una formulación que comprende el material basado en virus o un material reconstituido como se definió anteriormente.
Si es necesario, la composición de la invención puede formularse adicionalmente con vehículos de vacuna convencionales, los cuales son bien conocidos por los expertos en la materia.
Debe entenderse que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ponerse en práctica de diferente manera a la que se describe específicamente en la presente memoria.
A menos que se especifique de otra manera, todos los materiales usados para lograr los siguientes ejemplos están disponibles comercialmente.
Descripción de las figuras
La figura 1 ilustra la pérdida acumulativa del título infeccioso de un vector de MVA (TG4001) formulado en ausencia de fosfato (barras negras) o en presencia de concentraciones crecientes de fosfato (gris claro a gris oscuro) y almacenado a 5°C (figura 1A) o 45°C (figura 1B) durante el período indicado. Las barras en gris claro representan la composición I, las barras en gris intermedio representan la composición II, las barras en gris oscuro representan la composición III, y las barras negras representan la muestra de referencia RS1 descrita en adelante.
Ejemplos
Material
- Clorhidrato de L-arginina, polvo (J. T BAKER - SIGMA);
- SVF(PAA)
- TRIS = TRIS (hidroximetil)aminometano, polvo (J. T BAKER);
- Ácido clorhídrico (HCI) 1M (MERCK);
- Hidróxido de sodio (NaOH) 1N (VWR);
- Sacarosa, polvo (MERCK);
- Cloruro de sodio (NaCI), polvo (MERCK);
- PVP25, polvo (MERCK);
- Sal monosódica de ácido L-glutámico (MERCK);
- Fosfato ácido disódico, polvo anhidro (MERCK);
- Fosfato diácido de potasio, polvo anhidro (MERCK);
- Agua para inyección (COOpER);
- Viales = Viales TopLyo® (SCHOTT); tapones (STELMI);
- DAB = 3,3'-diaminobencidina (SIGMA);
- Células hospederas BHK-21 (ATCC, CCL10);
- Anticuerpo antivacuna (Meridian Life science);
- Anticuerpo anticonejo combinado con peroxidasa (DAKO);
- Agua MilliQ (Millipore);
- PBS (DULBECCO SIGMA);
- Triton X-100 (SIGMA);
- DMEM (GIBCO);
- Cationes 100X (10 g/L de tetrahidrato de acetato de magnesio MERCK y 10 g/L de dihidrato de cloruro de calcio J. T BAKER).
Debe señalarse que en los siguientes cuadros, cuando se indica “-”, significa que el ingrediente correspondiente no está presente en las composiciones correspondientes.
Método
El método de titulación viral para evaluar la estabilidad de la formulación según la presente invención durante la liofilización y durante el almacenamiento con el tiempo, se detalla en adelante.
Algunas muestras secas se reconstituyeron y se titularon inmediatamente después de la liofilización para evaluar el efecto del procedimiento de liofilización sobre la estabilidad del virus (es decir, pérdida del título del virus en el día 0 en los siguientes ejemplos).
Otras muestras secas se almacenaron después de la liofilización a diferentes temperaturas (por ejemplo, a 5°C y 45°C) hasta la reconstitución para la titulación para evaluar la pérdida del título del virus durante el almacenamiento, incluyendo la pérdida del título del virus debido al procedimiento de liofilización (es decir, pérdida del título del virus en los días 4, 7, 28, 60 y/o 90 en los siguientes ejemplos).
Como se indicó anteriormente, el objetivo de la presente invención es obtener un producto seco cuya pérdida del título del virus general sea limitada con el tiempo a una temperatura por encima de 0°C, más preferentemente entre 4°C y 25°C, y más preferentemente a aproximadamente 4°C o 5°C. Puesto que lleva tiempo esperar los datos de estabilidad en tiempo real (1 a 2 años a 2 a 8°C), las pruebas de estabilidad pueden llevarse a cabo típicamente a temperaturas elevadas, tales como 45°C durante aproximadamente 3 a 5 días, y sus resultados pueden correlacionarse con lo que puede esperarse a una menor temperatura, usando la ecuación de Arrhenius.
El protocolo usado para la titulación de la formulación del virus antes de la deshidratación por congelación y de las composiciones reconstituidas, se ha llevado a cabo en células BHK-21 usando la técnica de prueba en placa. En dicho método, se determina el número de unidades formadoras de placa (pfu/mL) en una muestra. Una placa viral se forma cuando un virus infecta a una célula dentro de la monocapa de células fijada (Kaufmann y Kabelitz, 2002, Methods in Microbiology Vol. 32: Immunology of Infection. Academic Press. ISBN 0125215320). Las etapas específicas llevadas a cabo para cada uno de los siguientes ejemplos de formulación según la invención, se detallan en la parte de “EJEMPLOS” en adelante.
Ejemplo 1: preparación de una formulación líquida que contiene poxvirus que va a ser deshidratada por congelación
Las formulaciones líquidas I a V a las que se hace referencia en adelante, se han preparado de acuerdo con las etapas siguientes. Estas formulaciones comprenden productos basados en Mv A. Más precisamente, las formulaciones I a III comprenden TG4001, y las formulaciones IV y V comprenden TG4040.
a) Se mantuvieron inicialmente TG4001 y TG4040 en un estado congelado en la solución A1 y solución A2, respectivamente. El contenido de cada solución A1 (que comprende TG4001) y A2 (que comprende TG4040), se detalla en la tabla 1 siguiente:
Tabla 1
Figure imgf000018_0001
Si es necesario, las soluciones A1 y A2 pueden diluirse adicionalmente de acuerdo con métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la solución A1 no fue diluida adicionalmente, y se usó como tal para preparar las formulaciones I a III. Respecto a la solución A2, ha sido diluida con una solución A'2 que corresponde a la solución A2 descrita anteriormente (no incluyendo TG4040), para obtener un título del virus final de 6.70+07 pfu/mL.
Las suspensiones de virus obtenidas se homogeneizaron entonces brevemente mediante agitación.
b) Entonces, 170 |jl de las siguientes soluciones B se añadieron a 340 jL de las soluciones virales A1 y A2, respectivamente, según se obtuvieron en la etapa a).
Más precisamente:
- 170 |jl de las soluciones B1 a B3 se añadieron a 340 jL de la solución viral A1 de la etapa a) que comprende TG4001, para preparar las formulaciones I a III, y
- 170 j l de las soluciones B4 y B5 se añadieron a 340 jL de las soluciones virales A2 de la etapa a) que comprende TG4040, para preparar las formulaciones IV y V.
Las mezclas se homogeneizaron entonces brevemente mediante agitación.
Las composiciones detalladas de las soluciones B1 a B5 se proporcionan en la tabla 2 siguiente:
Tabla 2
Figure imgf000019_0001
_______ ______
c) Las composiciones líquidas I a V obtenidas (510 jL ) antes de la liofilización, se detallan en la tabla 3 siguiente:
Tabla 3
Figure imgf000019_0002
Las formulaciones líquidas I a V descritas anteriormente, forman también parte de la presente invención.
Ejemplo 2: preparación de las formulaciones liofilizadas I a V correspondientes
En los siguientes ejemplos, todas las liofilizaciones se realizaron en un liofilizador TELSTAR LYOBETA 25. El protocolo de liofilización fue el siguiente:
a) Preparación de los productos secos I a III
Se llenaron viales TopLyo® (SCHOTT) con las formulaciones líquidas I a III como se obtuvieron previamente en el ejemplo 1, y el procedimiento de liofilización se llevó a cabo como sigue:
Etapa de congelación
Figure imgf000020_0001
Etapa de secado primario
Figure imgf000020_0002
Etapa de secado secundario
Figure imgf000020_0003
b) Preparación de los productos secos IV y V
Se llenaron viales TopLyo® (SCHOTT) con las formulaciones líquidas IV y V como se obtuvieron previamente en el ejemplo 1, y el procedimiento de liofilización se llevó a cabo como sigue. El protocolo es similar al llevado a cabo para las formulaciones I a III, pero una etapa adicional de vacío se lleva a cabo en este caso.
Congelación
Figure imgf000020_0004
Secado primario
Figure imgf000020_0005
Secado secundario
Figure imgf000020_0006
Los productos secos I a V obtenidos formaron una torta de aspecto adecuado, es decir, una “torta” blanca uniforme la cual no se retrae de los lados del vial después de la liofilización.
El título del virus respectivo de dichos productos I a V después de la liofilización, se detalla en la tabla 4 siguiente:
Tabla 4
Figure imgf000020_0007
Los productos secos I a V, forman también parte de la presente invención.
Dichas tortas se molieron, y el polvo obtenido se reconstituyó entonces para determinar el título del virus de acuerdo con el método de titulación del virus descrito previamente.
Ejemplo 3: estudios de estabilidad: evaluación de las pérdidas generales del título del virus, es decir, durante el sobretiempo de almacenamiento, incluyendo la pérdida debida al procedimiento de liofilización 3.a) Reconstitución de los productos secos I a V
Los materiales reconstituidos (compuestos reconstituidos) I a V preparados con WFI en un volumen final de 680 pL poco después de la liofilización, se detallan en la tabla 5 siguiente (es decir, sin período de almacenamiento para t0).
Tabla 5
Figure imgf000021_0001
Para evaluar el título del virus de los productos secos I a V después del almacenamiento a 5°C o 45°C durante el período indicado, los productos secos I a V necesitaron primero ser reconstituidos. En los siguientes ejemplos, se reconstituyeron con WFI en un volumen final de 680 pL, y los títulos virales respectivos se evaluaron de acuerdo con la técnica de prueba en placa detallada anteriormente.
Los materiales reconstituidos I a V, forman también parte de la presente invención.
3.b) Evaluación de la pérdida del título del virus de las composiciones secas I a V a 5°C
Como se indicó anteriormente, la pérdida acumulada del título del virus de cada producto seco (es decir, la pérdida durante el sobretiempo de almacenamiento, incluyendo la pérdida debida al procedimiento de liofilización), se evaluó usando la técnica de prueba en placa en células BHK-21.
Las etapas llevadas a cabo a este respecto para cada una de las composiciones I a V, se detallan a continuación.
1. Esparcimiento de las células
Se cultivaron células hospederas BHK-21 en monocapas en DMEM. A confluencia, las células se lavaron con 10 mL de PBS y entonces se sometieron a tripsinización. Después de la remoción de la tripsina, las células se resuspendieron entonces en 10 mL de DMe M con SFV a 10% a 37°C.
Entonces, la suspensión de células se homogeneizó y se distribuyó en las placas de cavidades múltiples (2 mL en cada una de las 6 cavidades de la placa). Entonces, dichas placas se incubaron a 37°C y CO2 a 5%.
2. Infección de las células
Aproximadamente 1 día después del esparcimiento de las células, se añadieron alícuotas de la suspensión de virus a cada cavidad que comprendía las células BHK-21 de la etapa 1. Si era necesario, dichas suspensiones se diluyeron primero en serie en PBS, cationes 100X y SVF a 1%, de acuerdo con métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Dependiendo del caso, las suspensiones del virus que se añadieron a las células BHK-21 de la etapa 1 eran composiciones líquidas que contenían virus antes de la deshidratación por congelación, o composiciones reconstituidas que contenían virus (es decir, después de la liofilización, en períodos y temperaturas diferentes).
Se removió entonces el medio de cultivo, y después de agitación durante 60 minutos a temperatura ambiente, se distribuyeron 2 mL del medio de infección (DMEM SFV a 5%) en cada cavidad. Las placas se incubaron entonces a 37°C y CO2 a 5%.
3. Fijación de las células
Después de que el medio había sido removido, las células se lavaron con PBS (aproximadamente 1 mL por cavidad). Entonces, se añadió 1 mL de una solución de metanol/acetona (50/50), y la mezcla resultante se agitó suavemente a temperatura ambiente.
Se dejó entonces que las placas se secaran a temperatura ambiente.
4. Detección y determinación del título
La determinación del título del virus se llevó a cabo de acuerdo con la reacción de peroxidasa bien conocida usando anticuerpos antivacuna y anticuerpos anticonejo combinados con peroxidasa. Más precisamente, antes de la reacción, se diluyeron anticuerpos antivacuna 100 veces en PBS SFV a 2%. Entonces, se añadieron 500 pL de dichos anticuerpos a cada cavidad, y se incubaron a 37°C durante aproximadamente 30 minutos, y entonces se lavaron 3 veces con 1 mL de PBS Triton X-100 a 1%.
La reacción con anticuerpos anticonejo combinados con peroxidasa se llevó a cabo de la misma manera, salvo que antes de la reacción, dichos anticuerpos se diluyeron 200 veces en PBS SFV a 2%.
La solución de DAB se preparó disolviendo un comprimido de DAB comercial en 15 mL de TRIS 0.05M. Entonces, la solución obtenida se filtró en una unidad de filtración NALGENE de 2 pm, y la solución filtrada resultante se añadió a 15 pL de solución acuosa de H2O2 a 30%. Una vez preparada, se añadió 1 mL de la solución de DAB a cada cavidad, y se dejó hasta que apareciera una coloración parda. La solución de coloración se removió posteriormente, y los resultados se interpretaron visualmente.
Entonces, se calculó el título infeccioso en PFU/mL, usando la siguiente fórmula:
[media del número de placas virales x 4] x factor de dilución = número de PFU/mL Resultados
Los resultados del estudio de estabilidad a 5°C se muestran en la tabla 6 siguiente, en la que:
- SD = desviación estándar.
- El título del virus en el día -1 corresponde al título del virus de las composiciones líquidas I a V antes de la liofilización.
- El título del virus en el día 0 corresponde al título del virus de las composiciones secas I a V, poco después de la liofilización. Su comparación con el título del virus de las composiciones líquidas I a V antes de la liofilización, permite determinar la pérdida del título del virus durante la liofilización.
- El título del virus en los días 28, 60 y 90 corresponde al título del virus de las composiciones secas I a V después de períodos de almacenamiento de 28, 60 y 90 días, respectivamente. Su comparación con el título del virus de las composiciones reconstituidas I a V poco después de la liofilización (es decir, en el día 0), permite determinar la pérdida del título del virus durante el almacenamiento a 5°C.
Tabla 6 (A 5°C)
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Como era de esperar, los productos secos I a V son estables a 5°C. En realidad, su pérdida acumulada del título del virus es no mayor de 0.6 log después de por lo menos 90 días de almacenamiento a 5°C.
3.c) Evaluación de la pérdida del título del virus de los productos secos I a V a 45°C
Para evaluar adicionalmente la estabilidad de los productos secos I a V, se han llevado a cabo estudios de estabilidad a 45°C. Como se explicó previamente, dicha temperatura elevada permite predecir la degradación del virus en una manera acelerada.
Cada producto seco I a V se almacenó durante 4, 28, 60 y 90 días a 45°C.
La pérdida acumulada del título del virus de cada producto seco (es decir, pérdida durante el sobretiempo de almacenamiento incluyendo la pérdida debida al procedimiento de liofilización) se evaluó usando el método de titulación (técnica de prueba en placa en células BHK-21), como se describió anteriormente.
Resultados
Los resultados del estudio de estabilidad acelerado a 45°C se muestran en la tabla 7 siguiente, en la que:
- SD, el título del virus en el día -1, y el título del virus en el día 0 tiene el mismo significado que en la tabla 6 previa.
- El título del virus en los días 4, 7, 28 y 60 corresponde al título del virus de las composiciones secas I a V después de períodos de almacenamiento de 4, 7, 28 y 60 días, respectivamente. Su comparación con el título del virus de las composiciones reconstituidas I a V poco después de la liofilización (es decir, en el día 0), permite determinar la pérdida del título del virus durante el almacenamiento a 45°C.
Tabla 7 (A 45°C)
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000024_0004
NA = No aplicable.
Debe señalarse que en la tabla 7 anterior, los resultados indicados para las composiciones IV y V en los días 3, 3.5 y 4 a 45°C, se han estimado de acuerdo con el análisis estadístico como se describe a continuación, es decir, usando el software SAS 9.2 y el modelo multivariable de orden 1 basado en el principio de Arrhenius, el cual se define con la siguiente ecuación:
Figure imgf000024_0001
en la que:
- Co es el título inicial en pfu/mL (después de la liofilización),
- T es la temperatura en grados Kelvin,
- t es el tiempo en días,
- c es el título en el tiempo t correspondiente en pfu/mL.
Puesto que sólo se usa una temperatura en el presente ejemplo, es decir, 45°C, la ecuación puede simplificarse:
Figure imgf000024_0002
Cuando se estiman los parámetros del modelo, el título en un punto de tiempo dado puede estimarse mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000024_0003
en la que:
- Co es el título inicial en pfu/mL (después de la liofilización),
- t es el tiempo en días,
- C es el título estimado en el tiempo t correspondiente en pfu/mL, y
- j60, j62 son los parámetros estimados del modelo.
Y la estimación de la pérdida se estima entonces mediante:
en la que:
- C es el título estimado en pfu/mL,
- C-i es el título un día antes de la liofilización en pfu/mL, y
- C es la pérdida estimada.
Respecto a la composición IV, la R2 ajustada, igual a 0.995, significa que el modelo se ajusta correctamente a los datos.
Respecto a la composición IV, la R2 ajustada, igual a 0.999, significa que el modelo se ajusta correctamente a los datos.
De esta manera, los resultados descritos anteriormente muestran que las formulaciones líquidas I a V permiten preservar la estabilidad del virus después del desafío con calor que ocurre durante el procedimiento de liofilización, y que además la estabilidad del virus fue preservada adicionalmente durante las pruebas de estabilidad a largo plazo.
Para concluir, en las formulaciones según la presente invención, los virus fueron protegidos contra el daño causado por el estrés térmico, durante el procedimiento de liofilización (es decir, debido a las etapas de congelación, deshidratación por congelación y descongelación), y durante el almacenamiento a temperaturas por encima de 0°C, más particularmente a aproximadamente 5°C.
Ejemplo 4: formulación de la preparación viral sin fosfato
Tres muestras de referencia (RS2 a RS4) se generaron a partir de un lote purificado de TG4040 y una (RS1) a partir de un lote viral de TG4001 purificado. Las muestras de referencia se trataron juntas con las composiciones I a V descritas en los ejemplos 1 a 3, salvo que las muestras de RS se formularon sin fosfato. Las concentraciones de Arg y NaCl estuvieron variando también de acuerdo con la muestra.
Como se describió anteriormente, 340 pL de la solución viral se mezclaron con 170 pL de la solución estabilizadora. Las composiciones detalladas de la solución estabilizadora para cada producto de referencia S1 a S4, se proporcionan en la tabla 8 siguiente:
Tabla 8
Figure imgf000025_0001
Los productos de referencia líquidos RS1 a RS4 obtenidos antes de la liofilización se detallan en la tabla 9 siguiente: Tabla 9
Figure imgf000026_0001
Los productos a los que se hace referencia RS1 a RS4 se liofilizan entonces como se describió anteriormente, y se reconstituyen con WFI en un volumen final de 680 pL.
Las composiciones detalladas de los productos de referencia reconstituidos RS1 a RS4 (680 pL) preparados justo después del procedimiento de liofilización (es decir, sin período de almacenamiento), se detallan en la tabla 10 siguiente:
Tabla 10
Figure imgf000026_0002
_______ _______
Se llevaron a cabo estudios de estabilidad a 5°C y 45°C como se describió en el ejemplo 3. Para este propósito, cada producto de referencia seco RS1 a RS4 se almacenó a 5°C o 45°C durante un período, y la pérdida acumulada del título del virus (es decir, pérdida durante el sobretiempo de almacenamiento incluyendo la pérdida debida al procedimiento de liofilización), se evaluó en varios puntos de tiempo usando el método de titulación descrito anteriormente.
Los resultados de la estabilidad de las formulaciones de TG4001 y TG4040 a 5°C, se proporcionan en la tabla 11 siguiente:
Tabla 11
Figure imgf000026_0003
Figure imgf000027_0001
Los resultados de la estabilidad de las formulaciones de TG4001 y TG4040 a 45°C se proporcionan en la tabla 12 siguiente:
Tabla 12
Figure imgf000027_0002
Como se ilustra en la figura 1 y en las tablas 6 y 11, la presencia de fosfato es beneficiosa para la estabilidad de las preparaciones virales. Por supuesto, la pérdida acumulativa del título infeccioso de TG4001 después de 28, 60 o 90 días a 5°C, se reduce en presencia de regulador de pH de fosfato en comparación con su ausencia (ver la figura 1A). Por ejemplo, después de 60 días a 5°C, la pérdida acumulativa es de -0.25 log para la composición I que comprende 0.94 g/L de regulador de pH de fosfato, -0.03 log para las composiciones II y III que comprenden 1.88 g/L y 3.75 g/L de regulador de pH de fosfato, en comparación con -0.25 log para la muestra de referencia RS1 formulada en ausencia de fosfato. La estabilidad incrementada provista por las formulaciones que comprenden regulador de pH de fosfato se observó también en los estudios de estabilidad acelerados, dando como resultado pérdidas acumulativas del título de aproximadamente -2 log después de 60 días a 45°C en presencia de fosfato (­ 2.40 log, -2.31 log y -1.98 log para las composiciones I, II y III, respectivamente), frente a más de -3 log en ausencia de fosfato (-3.24 log para Rs 1).
La misma tendencia se observa con las formulaciones de TG4040. Por ejemplo, la pérdida acumulativa medida después de 90 días a 5°C para la muestra RS4, es más importante que la detectada con la formulación V (-0.17 log y -0.07 log, respectivamente). Este efecto se observa también después de 60 días a 45°C (-2.08 log contra -1.81 log, respectivamente).
Ejemplo 5: estabilidad a largo plazo
Se formularon preparaciones virales TG4040 como se describió anteriormente. Más particularmente, se pusieron a prueba dos consideraciones diferentes; respectivamente a alta dosis (aproximadamente 1.70x108pfu/mL) y una baja dosis (aproximadamente 7.00x107pfu), y las preparaciones virales se formularon en formulaciones que contienen Na2HPO4 1 mM y Tris 10 mM; glutamato sódico 10 mM, sacarosa a 3.75%, NaCI 50 mM, PVP de 25 kDa a 2.5% y Arg 30 mM). Una formulación con 150 mM de Arg se puso a prueba también con la preparación TG4040 a baja dosis.
Las tres formulaciones de TG4040 se trataron como se describió anteriormente, y se liofilizaron de acuerdo con un procedimiento semiindustrial (IDT). El producto deshidratado por congelación se reconstituyó, y se evaluó la estabilidad del virus a 5°C durante un período de un año (la pérdida del título del virus se evaluó antes de la liofilización, poco después de la reconstitución (tü) y a 28, 90, 180, 270 y 365 días a 5°C.
Una pérdida del título viral total inferior a -0.60 log después de un año a 5°C, se observó para cada formulación de TG4040 (respectivamente -0.33 log para la formulación a alta dosis en Arg 30 mM; -0.42 log para la formulación a baja dosis en Arg 30 mM, y -0.24 log para la formulación a baja dosis en Arg 150 mM).
En conjunto, estos resultados resaltan que la presencia de fosfato es beneficiosa para la estabilidad de la preparación viral. La Arg desempeña también una función en la estabilidad del virus, especialmente cuando la concentración del virus antes de la liofilización es menor de 108 PFU/mL. La matriz del producto que contiene proteínas residuales se diluye a baja concentración del virus de la misma manera; estas proteínas podrían contribuir a estabilizar el virus a alta concentración. La Arg reemplazará la función de estabilización de la proteína residual en la matriz durante la operación de deshidratación por congelación.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Formulación deshidratada por congelación obtenida deshidratando por congelación una formulación acuosa que comprende (i) por lo menos un material basado en poxvirus, (ii) entre 5 g/L y 80 g/L de por lo menos un polímero seleccionado en el grupo de polivinilpirrolidona, copovidona y mezclas de las mismas, (iii) entre 20 g/L y 80g/L de por lo menos un disacárido, (iv) entre 5 g/L y 100 g/L de arginina y entre 1 g/L y 10 g/L de glutamato, (v) por lo menos 0.1 g/L de por lo menos una sal de fosfato farmacéuticamente aceptable y entre 1 g/L y 5 g/L de por lo menos una sal monovalente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente (vi) un amortiguador farmacéuticamente aceptable.
2. Formulación deshidratada por congelación según la reivindicación 1, en la que dichas polivinilpirrolidona o copovidona presentan un peso molecular comprendido entre 10 kg/mol (kDa) y 40 kg/mol (kDa), preferentemente entre 15 kg/mol (kDa) y 30 kg/mol (kDa) y más preferentemente de 25 kg/mol (kDa).
3. Formulación deshidratada por congelación según la reivindicación 1 o 2, en la que dicha formulación acuosa comprende entre 10 g/L y 50 g/L, preferentemente entre 15 g/L y 40 g/L y más preferentemente entre 20 g/L y 35 g/L de polivinilpirrolidona o copovidona o mezcla de las mismas.
4. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho disacárido es seleccionado de entre el grupo que consiste en sacarosa, lactulosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, isomaltosa y maltulosa.
5. Formulación deshidratada por congelación según la reivindicación 4, en la que dicho disacárido es la sacarosa.
6. Formulación deshidratada por congelación según la reivindicación 4 o 5, en la que dicha formulación acuosa comprende entre 20 g/L y 80 g/L, preferentemente entre 30 g/L y 70 g/L y más preferentemente entre 40 g/L y 60 g/L de disacárido, más preferentemente dicha formulación comprende 50 g/L de sacarosa.
7. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha formulación acuosa comprende entre 5 g/L y 80 g/L de arginina.
8. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha formulación acuosa comprende entre 1 g/L y 5 g/L de glutamato.
9. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha sal de fosfato es seleccionada en el grupo que consiste en sales de sodio y potasio, y una combinación de las mismas, preferentemente dicha sal de fosfato es seleccionada en el grupo que consiste en sales de fosfato monobásico, sales de fosfato dibásico y sales de fosfato tribásico.
10. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha formulación acuosa comprende (v) por lo menos dos sales de fosfato que forman un amortiguador de fosfato, preferentemente la formulación comprende una mezcla que comprende por lo menos una sal de fosfato monobásico y por lo menos una sal de fosfato dibásico, más preferentemente la formulación comprende (v) KH2PO4 y Na2HPO4.
11. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha sal monovalente es seleccionada en el grupo que consiste en NaCl y KCl, y es preferentemente NaCl.
12. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicha formulación acuosa comprende:
a) (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos una sal de fosfato y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y opcionalmente (vi) un amortiguador farmacéuticamente aceptable; b) (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos una sal de fosfato monovalente y/o por lo menos una sal de fosfato divalente y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y opcionalmente (v) un amortiguador farmacéuticamente aceptable;
c) (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) sal de fosfato disódico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y opcionalmente (vi) un amortiguador farmacéuticamente aceptable; d) (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) una mezcla de sal de fosfato disódico y fosfato monopotásico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCl, y opcionalmente (vi) un amortiguador farmacéuticamente aceptable;
e) (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) por lo menos una sal de fosfato y una sal monovalente, y (vi) un amortiguador farmacéuticamente aceptable seleccionado en el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOb S, tA p SO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un amortiguador TRIS; o
f) (i) un poxvirus, (ii) PVP, (iii) sacarosa, (iv) arginina y glutamato, (v) sal de fosfato disódico y por lo menos una sal monovalente, preferentemente NaCI, y (vi) un amortiguador farmacéuticamente aceptable seleccionado en el grupo de TRIS, BES, TES, DIPSO, MOBS, TAPSO, HEPPSO, POPSO, MOPS, HEPES y bicarbonatos, preferentemente un amortiguador TRIS.
13. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho (i) material basado en poxvirus es una partícula poxvírica o poxvirus de tipo salvaje, atenuado o recombinante, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en virus de la vaccinia (VV) y virus de la vaccinia modificado Ankara (MVA).
14. Formulación deshidratada por congelación según la reivindicación 13, en la que dicho material basado en poxvirus es un MVA recombinante seleccionado de entre el grupo que consiste en MVA que expresa los antígenos NS3, NS4 y NS5B de HCV; un MVA que expresa el antígeno Mu C-1 e IL-2, y un MVA que expresa los antígenos E6 y E7 no oncogénicos de HPV-16 e IL-2.
15. Formulación deshidratada por congelación según la reivindicación 13, en la que dicho material basado en poxvirus es un virus de la vaccinia recombinante seleccionado de entre el grupo que consiste en un virus de la vaccinia inactivado respecto atimidina cinasa (TK) que expresa una citocina inmunoestimuladora que es un factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos y un virus de la vaccinia inactivado doblemente respecto a timidina cinasa (TK-) y ribonucleótido reductasa (I4L-) que expresa un gen suicida.
16. Formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que el título de poxvirus en dicha formulación está comprendido entre 1.106 Pfu/mL y 1.1010 Pfu/mL.
17. Formulación reconstituida obtenida mediante la adición de una cantidad adecuada de disolvente farmacéuticamente aceptable a la formulación deshidratada por congelación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
18. Formulación reconstituida según la reivindicación 17, para la utilización como una vacuna.
19. Formulación para la utilización según la reivindicación 18, para la utilización en el tratamiento y/o la prevención de estados de enfermedad seleccionados de entre cánceres, enfermedades infecciosas y/o trastornos autoinmunitarios.
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