CN104792916B - 中药制剂乙肝扶正胶囊的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药制剂乙肝扶正胶囊的检测方法。该检测方法包括性状、显微观察、薄层色谱定性鉴别、含量测定项目，所述薄层色谱定性鉴别包括对制剂中虎杖和博落回的鉴别、贯众的鉴别、沙苑子和猪屎豆的鉴别；所述含量测定包括对制剂中丹参特征成分丹酚酸B的含量测定。本发明所述检测方法不仅有效地控制了乙肝扶正胶囊中博落回和猪屎豆的混入，同时有效地控制了乙肝扶正胶囊的成分和含量，使该药品更加安全、有效。

Description

中药制剂乙肝扶正胶囊的检测方法

技术领域

本发明涉及一种药物的检测方法，特别涉及一种中药制剂乙肝扶正胶囊的检测方法。

背景技术

乙肝扶正胶囊是《卫生部药品标准》中药成方制剂第一册收载的品种，其标准编号为WS3-B-0001-89，处方何首乌、虎杖、贯众、肉桂、明矾、石榴皮、当归、丹参、沙苑子、人参、麻黄，是纯中药制成的胶囊剂，具有补肝肾，益气活血的作用。临床上用于治疗乙型肝炎，辨证属于肝肾两虚证候。临床表现为：肝区隐痛不适，全身乏力，腰膝酸软，气短心悸，自汗，头晕，纳少，舌淡脉弱的常用药品。该药品标准是卫生部最早制定的药品标准，收载于第一册第一页，在当时是比较好的药品标准。原标准中仅对当归和肉桂进行了显微鉴别，没有对其它几种药材和任何成份进行定性定量的质量控制，既没有质量指标，也没有这些质量指标的鉴别和检验方法，由此会导致不法厂商在生产药品时可能不严格按照处方的剂量配料，肆意减少原料，致使药品的疗效明显下降，影响药品的安全有效，严重损害患者的利益。

处方中的虎杖，为常用中药材；主产于江苏、浙江及安徽等地。因其采收期叶均枯萎、脱落，仅剩残茎，与博落回的残茎相似，均为中空似竹，故在浙江某些地方民间均称作“猢狲竹”或“蛤蟆竹”，药农极易误采误收，导致虎杖商品中混有博落回根。而博落回为罂粟科植物，含多种生物碱，毒性较大，文献上已屡有口服或肌注后中毒乃至死亡的报道，主要为引起急性心源性脑缺血综合征。因此，控制乙肝扶正胶囊中博落回的混入非常必要。

处方中用到沙苑子，为豆科植物扁茎黄芪的干燥、成熟种子，具有温补肝肾、固精、缩尿、明目等功效，是一种常用中药材，临床应用广泛且疗效肯定。由于市场需求量大，一些不法分子为达到其赢利的目的，常以次充好、以假乱真，造成市场上沙苑子的品种比较混乱，常有混入紫云英、猪屎豆的种子等情况发生。猪屎豆，又名太阳麻，为豆科多年生草本或直立矮小灌木，其种子和幼嫩枝叶有毒，人畜误食种子或茎叶，严重者会因腹水和肝功能丧失而导致死亡。因此，控制猪屎豆，不让其混入沙苑子中，对保证乙肝扶正胶囊的安全性十分必要。

在现有乙肝扶正胶囊的检测方法中，均未对博落回和猪屎豆进行鉴别。根据乙肝扶正胶囊的处方特点，制定确实可行的检测方法，尤其是对处方中虎杖和博落回、沙苑子和猪屎豆的鉴别，以保证产品的质量和临床疗效非常迫切。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种中药制剂乙肝扶正胶囊的检测方法。该检测方法通过性状、显微观察以及对制剂中的虎杖和博落回、沙苑子和猪屎豆、贯众主要药材进行薄层色谱定性鉴别，同时对丹参特征成分丹酚酸B进行含量测定，有效地控制了乙肝扶正胶囊的成分和含量，使该药品更加安全、有效。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明所述乙肝扶正胶囊的制备方法为：分别称取何首乌15g、虎杖25g、贯众50g、肉桂5g、明矾10g、石榴皮6g、当归10g、丹参15g、沙苑子10g、人参10g、麻黄6g。将当归、肉桂、丹参、明矾粉碎为细粉；将余下七味药材加水煎煮二次，第一次3h，第二次2h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏状，然后加入上述细粉，混匀，于70～80℃干燥，再粉碎成细粉，过筛，装胶囊，即得乙肝扶正胶囊。

本发明所述中药制剂乙肝扶正胶囊的检测方法，包括性状、显微观察、薄层色谱定性鉴别、含量测定项目，所述薄层色谱定性鉴别包括对制剂中虎杖和博落回的鉴别、贯众的鉴别、沙苑子和猪屎豆的鉴别；所述含量测定包括对制剂中丹参特征成分丹酚酸B的含量测定；

(1)性状

本品内容物为棕褐色粉末，味苦；

(2)显微观察

取本品，置显微镜下观察，薄壁细胞纺锤形，直径18～34μm，壁略厚非木化，有极微细的斜向交错纹理；

(3)薄层色谱定性鉴别

虎杖和博落回的鉴别：分别以虎杖对照药材和博落回对照药材为对照品，以体积比氯仿∶甲醇＝11～15∶3的氯仿-甲醇混合液为展开剂，用薄层色谱法鉴别；

贯众的鉴别：以贯众对照药材为对照品，以体积比氯仿∶丙酮∶冰醋酸＝13～17∶2.5～3.5∶0.5的氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为展开剂，用薄层色谱法鉴别；

沙苑子和猪屎豆的鉴别：分别以沙苑子对照药材和猪屎豆对照药材为对照品，以体积比甲醇∶水＝7～9∶3的甲醇-水混合液为展开剂，用薄层色谱法鉴别；

(4)含量测定

丹酚酸B的含量测定：照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录VI D测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比甲醇∶乙腈∶甲酸∶水＝28～32∶9～11∶1∶57～61的甲醇-乙腈-甲酸-水混合液为流动相；检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

精密称取丹酚酸B对照品适量，加70～80v％甲醇制成对照品溶液；

取本品，取其内容物，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70～80v％甲醇，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用70～80v％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，本品每粒含丹酚酸B不得少于0.5mg。

贯众，多年生草本，为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨的根茎及叶柄残基，性味苦、涩、微寒、有小毒；归肝经、胃经。其功能杀虫、清热、解毒、凉血止血。因为贯众有毒，所以必须严格控制好其在乙肝扶正胶囊中的含量，否则会对患者带来不良反应。现有技术中，许多厂家由于无法严格控制贯众在乙肝扶正胶囊中的含量，导致许多厂家直接取消贯众入药，而贯众为乙肝扶正胶囊中的主要药方，取消贯众入药会显著影响乙肝扶正胶囊的疗效。因此，对乙肝扶正胶囊中的贯众进行鉴别非常重要。

虎杖，为常用中药材；主产于江苏、浙江及安徽等地。因其采收期叶均枯萎、脱落，仅剩残茎，与博落回的残茎相似，均为中空似竹，故在浙江某些地方民间均称作“猢狲竹”或“蛤蟆竹”，药农极易误采误收，导致虎杖商品中混有博落回根。而博落回为罂粟科植物，含多种生物碱，毒性较大，文献上已屡有口服或肌注后中毒乃至死亡的报道，主要为引起急性心源性脑缺血综合征。因此，控制乙肝扶正胶囊中博落回的混入非常必要。

沙苑子，为豆科植物扁茎黄芪的干燥、成熟种子，具有温补肝肾、固精、缩尿、明目等功效，是一种常用中药材，临床应用广泛且疗效肯定。由于市场需求量大，一些不法分子为达到其赢利的目的，常以次充好、以假乱真，造成市场上沙苑子的品种比较混乱，常有混入紫云英、猪屎豆的种子等情况发生。猪屎豆，又名太阳麻，为豆科多年生草本或直立矮小灌木，其种子和幼嫩枝叶有毒，人畜误食种子或茎叶，严重者会因腹水和肝功能丧失而导致死亡。因此，控制猪屎豆，不让其混入沙苑子中，对保证乙肝扶正胶囊的安全性十分必要。

丹参，为唇形科植物丹参的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。现代研究表明，丹参中含有丹参酮Ⅱ A、丹酚酸B、原儿茶醛等多种成份，其主要有效成份的热稳定性差，其中以丹酚酸B的热稳定性最差，甚至在高于60℃的温度时，低浓度下受热20min左右即损失50％以上。因此在乙肝扶正胶囊生产过程中，如果没有控制好工艺条件，乙肝扶正胶囊中的有效成份会发生损失，直接影响到乙肝扶正胶囊的疗效。对热稳定性最差的丹酚酸B进行含量测定，不仅可有效保证丹参中其它有效成份不受影响，也基本上保证了乙肝扶正胶囊中其它成份不受影响，从而保证了乙肝扶正胶囊的疗效。

在本发明所述丹酚酸B的含量测定中，采用超声提取，与传统的加热水流提取方式相比，提取效果相当，但是操作更加简单，易掌握。采用体积比甲醇∶乙腈∶甲酸∶水＝28～32∶9～11∶1∶57～61的甲醇-乙腈-甲酸-水混合液为流动相，丹酚酸B在5min内即可出峰，出峰时间短，而且分离度好，图谱基线稳定。

本发明所述检测方法通过对贯众、虎杖、博落回、沙苑子、猪屎豆进行薄层色谱鉴别，并对丹酚酸B进行含量测定，有效地控制了乙肝扶正胶囊的成分和含量，使该药品更加安全、有效，从而保证了该胶囊制剂的临床疗效，维护了患者利益。

优选地，所述(3)项下虎杖和博落回薄层色谱定性鉴别的具体步骤为：取本品，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇，振摇，超声提取，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取虎杖对照药材，博落回对照药材，按照供试品溶液的制备方法分别制成虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述供试品溶液、虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比氯仿∶甲醇＝11～15∶3的氯仿-甲醇混合液为展开剂，展开，取出，晾干，置于365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与虎杖对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与博落回对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

上述虎杖和博落回的色谱定性鉴别方法可以有效地对制剂中的虎杖和博落回定性鉴别，采用体积比氯仿∶甲醇＝11～15∶3的氯仿-甲醇混合液为展开剂，展开时间短，展开效果好，斑点显色清晰。

进一步优选地，所述虎杖和博落回薄层色谱定性鉴别中氯仿-甲醇混合液为体积比的氯仿∶甲醇＝12～14∶3。最佳优选地，所述虎杖和博落回薄层色谱定性鉴别中氯仿-甲醇混合液为体积比的氯仿∶甲醇＝13∶3。通过以上优选，可以进一步地优化展开效果，更容易观察比较分析样品中的有效成分。

优选地，所述(3)项下贯众的薄层色谱定性鉴别的具体步骤为：取本品，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇，振摇，超声提取，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取贯众对照药材，按照供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比氯仿∶丙酮∶冰醋酸＝13～17∶2.5～3.5∶0.5的氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为展开剂，展开，取出，晾干，先喷以8～12wt％磷钼酸乙酸溶液，再喷以0.2～0.6wt％氢氧化钠溶液，于日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

上述贯众的色谱定性鉴别方法可以有效地对制剂中的贯众定性鉴别，采用体积比氯仿∶丙酮∶冰醋酸＝13～17∶2.5～3.5∶0.5的氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为展开剂，展开时间短，展开效果好，斑点显色清晰。

进一步优选地，所述贯众的薄层色谱定性鉴别中氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为体积比的氯仿∶丙酮∶冰醋酸＝14～16∶2.5～3∶0.5。最佳优选地，所述贯众薄层色谱定性鉴别中氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为体积比的氯仿∶丙酮∶冰醋酸＝15∶3∶0.5。通过以上优选，可以进一步地优化展开效果，更容易观察比较分析样品中的有效成分。

优选地，所述(3)项下沙苑子和猪屎豆的薄层色谱定性鉴别的具体步骤为：取本品，取其内容物，置锥形瓶中，加入沸程为60～90℃的石油醚，间歇性振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加70～80v％乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取沙苑子对照药材，猪屎豆对照药材，按照供试品溶液的制备方法分别制成沙苑子对照药材溶液和猪屎豆对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述供试品溶液、沙苑子对照药材溶液、猪屎豆对照药材溶液，点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比甲醇∶水＝7～9∶3的甲醇-水混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以l～2wt％三氯化铝乙酸溶液，加热显色，于365nm紫外灯下检视；在供试品色谱中，在与沙苑子对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与猪屎豆对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

上述沙苑子和猪屎豆的色谱定性鉴别方法可以有效地对制剂中的沙苑子和猪屎豆定性鉴别，采用体积比甲醇∶水＝7～9∶3的甲醇-水混合液为展开剂，展开时间短，展开效果好，斑点显色清晰。

进一步优选地，所述沙苑子和猪屎豆的薄层色谱定性鉴别中甲醇-水混合液为体积比的甲醇∶水＝7～8∶3的甲醇-水混合液为展开剂。最佳优选地，所述沙苑子和猪屎豆薄层色谱定性鉴别中甲醇-水混合液为体积比的甲醇∶水＝8∶3。通过以上优选，可以进一步地优化展开效果，更容易观察比较分析样品中的有效成分。

在本发明所述的沙苑子和猪屎豆的薄层色谱定性鉴别中，申请人经多次试验发现，采用沸程为60～90℃的石油醚进行供试品溶液的提取，提取效率高，且安全可靠。采用30～60℃沸程的石油醚，虽然对供试品的提取率略高于本发明所述60～90℃的石油醚，但是30～60℃沸程规格的石油醚挥发性太强，爆炸危险性大。而90～120℃沸程的石油醚对供试品的提取率显著降低。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明所述检测方法包括对虎杖和博落回的鉴别，有效避免了有毒博落回的混入而引起的急性心源性脑缺血综合征等。

(2)本发明所述检测方法包括对沙苑子和猪屎豆的鉴别，有效避免了有毒猪屎豆的混入而引起的腹水和肝功能丧失等。

(3)本发明所述检测方法通过对虎杖和博落回、沙苑子和猪屎豆、贯众药材进行薄层色谱定性鉴别，还对丹参中的丹酚酸B进行含量测定，有效地控制了乙肝扶正胶囊的成分和含量。本方法科学合理、切实可行，处方中的虎杖、贯众、沙苑子三种主要药材都得到了有效的成分监测，不应该混入的博落回和猪屎豆也能够得到控制，使该药品更加安全、更加有效，从而保证了该胶囊制剂的临床疗效，维护了患者的利益。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所述的乙肝扶正胶囊的检测方法，包括如下步骤：

(1)性状

本品内容物为棕褐色粉末，味苦；

(2)显微观察

取本品，置显微镜下观察：薄壁细胞纺锤形，直径18～34μm，壁略厚非木化，有极微细的斜向交错纹理；纤维大多单个散在，少数2～3个并列成束，完整或碎断，呈长棱形，边缘微波状或凹凸，末端渐尖，钝圆或斜尖，长195～630μm，直径24～50μm，壁极厚，木化，纹孔及孔沟不明显，或孔沟稀少而细短，胞腔线形。部分木纤维多成束，呈长棱形，末端长尖或稍倾斜，直径18～25μm，壁厚2～4μm，纹孔斜裂缝状或十字状，孔沟较稀。

(3)薄层色谱定性鉴别

虎杖和博落回的鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇20～40ml，振摇，超声提取25～40min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇1～3ml使溶解，作为供试品溶液；另取虎杖对照药材2g，博落回对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法分别制成虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述供试品溶液、虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液各4～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比氯仿∶甲醇＝11～15∶3的氯仿-甲醇混合液为展开剂，展开，取出，晾干，置于365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与虎杖对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与博落回对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

贯众的鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇20～40ml，振摇，超声提取25～40min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇1～3ml使溶解，作为供试品溶液；另取贯众对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比氯仿∶丙酮∶冰醋酸＝13～17∶2.5～3.5∶0.5的氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为展开剂，展开，取出，晾干，先喷以8～12wt％磷钼酸乙酸液，再喷以0.2～0.6wt％氢氧化钠溶液，于日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

沙苑子和猪屎豆的鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入沸程为60～90℃的石油醚40～60ml，间歇性振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加70～80v％乙醇1～3ml使溶解，作为供试品溶液；另取沙苑子对照药材2g，猪屎豆对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法分别制成沙苑子对照药材溶液和猪屎豆对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述供试品溶液、沙苑子对照药材溶液、猪屎豆对照药材溶液各5～10μl，点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比甲醇∶水＝7～9∶3的甲醇-水混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以l～2wt％三氯化铝乙酸溶液，加热显色，于365nm紫外灯下检视；在供试品色谱中，在与沙苑子对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与猪屎豆对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

(4)含量测定

丹酚酸B的含量测定：照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录VI D测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比甲醇∶乙腈∶甲酸∶水＝28～32∶9～11∶1∶57～61的甲醇-乙腈-甲酸-水混合液为流动相；检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

精密称取丹酚酸B对照品适量，加70～80v％甲醇制成每1ml含丹酚酸B0.12～0.16mg的对照品溶液；

取本品40粒，取其内容物，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70～80v％的甲醇50～55ml，称定重量，采用功率120W、频率50KHz超声处理10～20min，取出，放冷，再称定重量，用70～80v％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各8～12μl，注入高效液相色谱仪，测定，本品每粒含丹酚酸B不得少于0.5mg。

以下采用具体的实施例和对比例来说明本发明检测方法的有益效果。在以下的实施例和对比例中，乙肝扶正胶囊的制备方法为：分别称取何首乌15g、虎杖25g、贯众50g、肉桂5g、明矾10g、石榴皮6g、当归10g、丹参15g、沙苑子10g、人参10g、麻黄6g。将当归、肉桂、丹参、明矾粉碎为细粉；将余下七味药材加水煎煮二次，第一次3h，第二次2h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏状，然后加入上述细粉，混匀，于70～80℃干燥，再粉碎成细粉，过筛，装胶囊，即得乙肝扶正胶囊。

功能主治：补肝肾，益气活血。用于乙型肝炎，辨证属于肝肾两虚证候。临床表现为肝区隐痛不适，全身乏力，腰膝酸软，气短心悸，自汗，头晕，纳少，舌淡脉弱。

用法与用量：口服，一次4粒，一日3次；儿童酌减或遵医嘱。

规格：每粒重0.25g。

贮藏方法：密闭，防潮。

实施例1

(1)性状

本品内容物为棕褐色粉末，味苦；

(2)显微观察

取本品，置显微镜下观察：薄壁细胞纺锤形，直径18～34μm，壁略厚非木化，有极微细的斜向交错纹理；纤维大多单个散在，少数2～3个并列成束，完整或碎断，呈长棱形，边缘微波状或凹凸，末端渐尖，钝圆或斜尖，长195～630μm，直径24～50μm，壁极厚，木化，纹孔及孔沟不明显，或孔沟稀少而细短，胞腔线形。部分木纤维多成束，呈长棱形，末端长尖或稍倾斜，直径18～25μm，壁厚2～4μm，纹孔斜裂缝状或十字状，孔沟较稀。

(3)薄层色谱定性鉴别

虎杖和博落回的薄层色谱定性鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇20ml，振摇，超声提取30min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取虎杖对照药材2g，博落回对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法分别制成虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液、虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇混合液(13∶3)为展开剂，展开50min，取出，晾干，置于365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与虎杖对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与博落回对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

贯众的薄层色谱定性鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇20ml，振摇，超声提取40min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取贯众对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮-冰醋酸混合液(17∶3.5∶0.5)为展开剂，展开50min，取出，晾干，先喷以8～12％磷钼酸乙酸液，再喷以0.6wt％氢氧化钠溶液，于日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

沙苑子和猪屎豆的薄层色谱定性鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入沸程为60～90℃的石油醚50ml，间歇性振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加75v％乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取沙苑子对照药材2g，猪屎豆对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法分别制成沙苑子对照药材溶液和猪屎豆对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液、沙苑子对照药材溶液、猪屎豆对照药材溶液各8μl，点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-水混合液(8∶3)为展开剂，展开40min，取出，晾干，喷以l％的三氯化铝乙酸溶液，加热显色(在105℃加热3～6分钟)，于365nm紫外灯下检视；在供试品色谱中，在与沙苑子对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与猪屎豆对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

(4)含量测定

丹酚酸B的含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比的甲醇∶乙腈∶甲酸∶水＝32∶9∶1∶61为流动相；检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

精密称取丹酚酸B对照品适量，加80v％甲醇制成每1ml含丹酚酸B 0.16mg的对照品溶液；

取本品40粒，取其内容物，研细，精密称定，置于带塞的锥形瓶中，精密加入80v％甲醇55ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率50KHZ)20min，取出，放冷，再称定重量，用80v％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各12μl，注入液相色谱仪，测定，本品每粒含丹酚酸B为0.56mg。

实施例2

(1)性状

同实施例1。

(2)显微观察

同实施例1。

(3)鉴别

虎杖和博落回的薄层色谱定性鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇40ml，振摇，超声提取25min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇3ml使溶解，作为供试品溶液；另取虎杖对照药材2g，博落回对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法分别制成虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液、虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇混合液(11∶3)为展开剂，展开50min，取出，晾干，置于365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与虎杖对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与博落回对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

贯众的薄层色谱定性鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇40ml，振摇，超声提取25min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇3ml使溶解，作为供试品溶液；另取贯众对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮-冰醋酸混合液(13∶2.5∶0.5)为展开剂，展开50min，取出，晾干，先喷以8％磷钼酸乙酸液，再喷以0.2wt％氢氧化钠溶液，于日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

沙苑子和猪屎豆的薄层鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入沸程为60～90℃的石油醚40ml，间歇性振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加70％的乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取沙苑子对照药材2g，猪屎豆对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法分别制成沙苑子对照药材溶液和猪屎豆对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液、沙苑子对照药材溶液、猪屎豆对照药材溶液各5μl，点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-水混合液(7∶3)为展开剂，展开40min，取出，晾干，喷以lwt％三氯化铝乙酸溶液，加热显色(在105℃加热3～6分钟)，于365nm紫外灯下检视；在供试品色谱中，在与沙苑子对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与猪屎豆对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

(4)含量测定

丹酚酸B的含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比的甲醇∶乙睛∶甲酸∶水＝28∶9∶1∶57为流动相；检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

精密称取丹酚酸B对照品适量，加70v％甲醇制成每1ml含丹酚酸B 0.12mg的对照品溶液；

取本品40粒，取其内容物，研细，精密称定，置于带塞的锥形瓶中，精密加入70v％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率50KHZ)10min，取出，放冷，再称定重量，用70v％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各8μl，注入液相色谱仪，测定，本品每粒含丹酚酸B为0.55mg。

实施例3

(1)性状

同实施例1。

(2)显微观察

同实施例2。

(3)薄层色谱定性鉴别

虎杖和博落回的薄层色谱定性鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇20ml，振摇，超声提取30min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取虎杖对照药材2g，博落回对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法分别制成虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液、虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇混合液(14∶3)为展开剂，展开50min，取出，晾干，置于365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与虎杖对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与博落回对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

贯众的薄层色谱定性鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇30ml，振摇，超声提取30min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取贯众对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮-冰醋酸混合液(15∶3∶0.5)为展开剂，展开50min，取出，晾干，先喷以10wt％磷钼酸乙酸液，再喷以0.4wt％氢氧化钠溶液，于日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

沙苑子和猪屎豆的薄层鉴别：取本品10粒，取其内容物，置锥形瓶中，加入沸程为60～90℃的石油醚50ml，间歇性振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加75％乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取沙苑子对照药材2g，猪屎豆对照药材2g，按照供试品溶液的制备方法分别制成沙苑子对照药材溶液和猪屎豆对照药材溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液、沙苑子对照药材溶液、猪屎豆对照药材溶液各8μl，点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-水混合液(8∶3)为展开剂，展开40min，取出，晾干，喷以lwt％三氯化铝乙酸溶液，加热显色(在105℃加热3～6分钟)，于365nm紫外灯下检视；在供试品色谱中，在与沙苑子对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与猪屎豆对照药材色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。

(4)含量测定

丹酚酸B的含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比的甲醇∶乙腈∶甲酸∶水＝30∶10∶1∶59为流动相；检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

精密称取丹酚酸B对照品适量，加75v％甲醇制成每1ml含丹酚酸B 0.14mg的对照品溶液；

取本品40粒，取其内容物，研细，精密称定，置于带塞的锥形瓶中，精密加入75v％甲醇55ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率50KHz)15min，取出，放冷，再称定重量，用75v％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每粒含丹酚酸B为0.56mg。

对比例1

考察虎杖和博落回的薄层色谱定性鉴别中，展开剂对薄层色谱定性鉴别的影响，其余均同实施例1。

(1)采用氯仿-甲醇混合液(10∶3)为展开剂，展开仅需要40min，但是分离效果差，无法对虎杖和博落回进行有效鉴别。

(2)采用氯仿-甲醇混合液(16∶3)为展开剂，分离效果与实施例1～3基本相当，但是展开时间需要63min。

由本对比例可知，当氯仿-甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比小于10∶3，虽然展开时间由50min缩短到40min，但是分离效果差，无法对虎杖和博落回进行有效鉴别。当氯仿-甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比大于16∶3，分离效果与实施例1～3基本相当，但是展开时间需由50min延长至63min。因此，本发明所述的以氯仿-甲醇混合液(11～15∶3)为展开剂，展开效果好，展开时间适宜，以较大的优势处于较佳的效果。

对比例2

考察贯众的薄层色谱定性鉴别中，展开剂对薄层色谱定性鉴别的影响，其余均同实施例1。

(1)采用氯仿-丙酮-冰醋酸混合液(12∶4∶0.5)为展开剂，展开时间需要67min，分离效果与实施例1～3基本相当。

(2)采用氯仿-丙酮-冰醋酸混合液(18∶2∶0.5)为展开剂，展开需要71min，分离效果与实施例1～3基本相当。

(3)采用氯仿-丙酮-冰醋酸混合液(13∶2.5∶1)为展开剂，展开需要40min，但是分离效果差，无法对贯众进行有效鉴别。

由对比例2可知，当氯仿-丙酮-冰醋酸混合液中氯仿、丙酮、冰醋酸的体积比不在本发明的保护范围内，其中氯仿和/或丙酮所占的体积比过大，会使展开时间由50min延长至65min以上，而展开效果与实施例1～3基本相当；当氯仿和/或丙酮所占的体积比过小，虽然展开时间缩短了，但是分离效果差，导致无法对贯众进行有效的鉴别。因此，本发明所述的以氯仿-丙酮-冰醋酸混合液(13～17∶2.5～3.5∶0.5)为展开剂，展开效果好，展开时间适宜，以较大的优势处于较佳的效果。

对比例3

考察沙苑子和猪屎豆的薄层色谱定性鉴别中，展开剂对薄层色谱定性鉴别的影响，其余均同实施例1。

(1)采用甲醇-水混合液(6∶3)为展开剂，展开需要36min，分离效果差，无法对沙苑子和猪屎豆进行有效鉴别。

(2)采用甲醇-水混合液(10∶3)为展开剂，展开需要54min，分离效果与实施例1～3基本相当。

由本对比例可知，当甲醇-水混合液中甲醇与水的体积比小于7∶3，虽然展开时间由40min缩短到36min，但是分离效果差，无法对沙苑子和猪屎豆进行有效鉴别。当甲醇-水混合液中甲醇与水的体积比大于9∶3，分离效果与实施例1～3基本相当，但是展开时间需由50min延长至54min。因此，本发明所述的以甲醇-水混合液(7～9∶3)为展开剂，展开效果好，展开时间适宜，以较大的优势处于较佳的效果。

对比例4

考察提取方法对丹酚酸B含量测定的影响。

丹酚酸B的含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比的甲醇∶乙腈∶甲酸∶水＝30∶10∶1∶59为流动相；检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

精密称取丹酚酸B对照品适量，加75v％甲醇制成每1ml含丹酚酸B 0.14mg的对照品溶液；

供试品溶液的制备：取本品40粒，取其内容物，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75v％甲醇50ml，称定重量，间隙振摇，浸渍过夜，再称定重量，用75v％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每粒含丹酚酸B0.54mg。

对比实施例1～3和本对比例4可知，常规的间隙振摇浸渍过夜的提取方法与本发明所述的超声提取方法提取含量测定结果基本相当，因此更优选操作更加方便简单、时间最短的超声方法提取。

实施例5

考察超声提取时间对丹酚酸B含量测定的影响。

取同一批次制得的乙肝扶正胶囊，按照实施例1中的实施过程测试，各项均符合国家标准。在丹酚酸B的测试过程中，超声处理(功率120W，频率50KHz)5min、10min、20min、30min，分别取样，按照实施例1中的高效液相色谱条件进行测试。测定丹酚酸B的含量结果分别为本品每粒含丹酚酸B0.49mg、0.53mg、0.54mg、0.54mg。

由对比例5可知，提取时间为5min时，丹酚酸B的含量较低。当提取时间增长到30min后，丹酚酸B的含量基本不再变化，因此超声提取时间为10～20min为宜，其中提取时间20min时的提取效果以较小的优势处于较佳的效果。

Claims (7)

1. 一种中药制剂乙肝扶正胶囊的检测方法，包括性状、显微观察、薄层色谱定性鉴别、含量测定项目，其特征在于：所述薄层色谱定性鉴别包括对制剂中虎杖和博落回的鉴别、贯众的鉴别、沙苑子和猪屎豆的鉴别；所述含量测定包括对制剂中丹参特征成分丹酚酸B的含量测定；

（1）性状

本品内容物为棕褐色粉末，味苦；

（2）显微观察

取本品，置显微镜下观察，薄壁细胞纺锤形，直径18～34μｍ，壁略厚非木化，有极微细的斜向交错纹理；

（3）薄层色谱定性鉴别

虎杖和博落回的鉴别：分别以虎杖对照药材和博落回对照药材为对照品，以体积比氯仿∶甲醇=11～15∶3的氯仿-甲醇混合液为展开剂，用薄层色谱法鉴别；

贯众的鉴别：以贯众对照药材为对照品，以体积比氯仿∶丙酮∶冰醋酸=13～17∶2.5～3.5∶0.5的氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为展开剂，用薄层色谱法鉴别；

沙苑子和猪屎豆的鉴别：分别以沙苑子对照药材和猪屎豆对照药材为对照品，以体积比甲醇∶水=7～9∶3的甲醇-水混合液为展开剂，用薄层色谱法鉴别；

（4）含量测定

丹酚酸B的含量测定：照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录 VI D测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比甲醇∶乙腈∶甲酸∶水=28～32∶9～11∶1∶57～61的甲醇-乙腈-甲酸-水混合液为流动相；检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸B峰计算不低于2000；

精密称取丹酚酸B对照品适量，加70~80v％甲醇制成对照品溶液；

取本品，取其内容物，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70~80v％甲醇，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用70~80v％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；

所述（3）项下虎杖和博落回薄层色谱定性鉴别的具体步骤为：取本品，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇，振摇，超声提取，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取虎杖对照药材，博落回对照药材，按照供试品溶液的制备方法分别制成虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述供试品溶液、虎杖对照药材溶液和博落回对照药材溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比氯仿∶甲醇=11～15∶3的氯仿-甲醇混合液为展开剂，展开，取出，晾干，置于365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与虎杖对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与博落回对照药材色谱相应的位置上，不显相同颜色的斑点；

所述（3）项下贯众的薄层色谱定性鉴别的具体步骤为：取本品，取其内容物，置锥形瓶中，加入甲醇，振摇，超声提取，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取贯众对照药材，按照供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比氯仿∶丙酮∶冰醋酸=13～17∶2.5～3.5∶0.5的氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为展开剂，展开，取出，晾干，先喷以8~12wt%磷钼酸乙酸溶液，再喷以0.2~0.6wt％氢氧化钠溶液，于日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

所述（3）项下沙苑子和猪屎豆的薄层色谱定性鉴别的具体步骤为：取本品，取其内容物，置锥形瓶中，加入沸程为60~90℃的石油醚，间歇性振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加70~80v%乙醇使溶解，作为供试品溶液；另取沙苑子对照药材，猪屎豆对照药材，按照供试品溶液的制备方法分别制成沙苑子对照药材溶液和猪屎豆对照药材溶液；照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，吸取上述供试品溶液、沙苑子对照药材溶液、猪屎豆对照药材溶液，点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比甲醇∶水=7~9∶3的甲醇-水混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以l~2wt％三氯化铝乙酸溶液，加热显色，于365nm紫外灯下检视；在供试品色谱中，在与沙苑子对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在与猪屎豆对照药材色谱相应的位置上，不显相同颜色的斑点。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述虎杖和博落回薄层色谱定性鉴别中氯仿-甲醇混合液为体积比的氯仿∶甲醇=12~14∶3。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述虎杖和博落回薄层色谱定性鉴别中氯仿-甲醇混合液为体积比的氯仿∶甲醇=13∶3。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述贯众的薄层色谱定性鉴别中，氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为体积比的氯仿∶丙酮∶冰醋酸=14~16∶2.5~3∶0.5。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述贯众的薄层色谱定性鉴别中，氯仿-丙酮-冰醋酸混合液为体积比的氯仿∶丙酮∶冰醋酸=15∶3∶0.5。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述沙苑子和猪屎豆的薄层色谱定性鉴别中甲醇-水混合液为体积比的甲醇∶水=7~8∶3。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述沙苑子和猪屎豆的薄层色谱定性鉴别中甲醇-水混合液为体积比的甲醇∶水=8∶3。