CN104703971B - 新型偶氮化合物及其利用、以及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对受激能级状态下表现出发光现象的物质具有猝灭能力的新型偶氮化合物、含有新型偶氮化合物的猝灭剂、该猝灭剂的利用以及偶氮化合物的制造方法。本发明的猝灭剂在波长的吸收区域中显示出优异的特性。

Description

新型偶氮化合物及其利用、以及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种新型偶氮化合物、含有上述偶氮化合物的新型猝灭剂、 上述猝灭剂的利用以及上述偶氮化合物的制造方法。
背景技术
关于荧光共振能量转移(FRET)的猝灭现象是指，从因光而处于受激能 级状态的作为报告体(reporter)的能量给体中，能量转移到位于近距离的作 为猝灭剂的能量受体的现象(J.R.Lakowicz，Principles of fluorescence spectroscopy，1999，KluwerAcademic/Plenum Publishers，New York)。此时， 能量转移效率与报告体和猝灭剂之间的距离密切关联，转移效率与报告体和 猝灭剂之间距离的6次方成反比例关系。因此，此两者之间的距离相隔一定 距离以上时，不会发生荧光共振能量转移(FRET)猝灭现象。
作为荧光共振能量转移猝灭现象的一例，将TAMRA荧光物质作为能量 受体使用时，即，作为猝灭剂使用时，来自能量给体的发光能量能够在能量 受体的吸光区域内进行吸收。所吸收的能量转变成受激能级状态，并在能量 受体的发光区域内发光。
如上所述的猝灭现象在由偶氮化合物构成的猝灭剂的情况下，其能量转 移过程也相同。但是，在作为能量受体的猝灭剂中不会发生发光现象。该转 移过程中的偶氮化合物等猝灭剂代替发光以热或其他作用方式释放能量，其 在该方面上与前述物质有所不同。将上述偶氮化合物等猝灭剂称为暗猝灭剂 (Dark quencher)。
暗猝灭剂在转移能量时不以光的形式释放能量，而是以热的形式释放能 量，因此，其是不带有荧光的染料。显示荧光的猝灭剂在分析时，猝灭剂与 报告体的荧光光谱重叠，从而增加了背景噪音。但是，暗猝灭剂没有荧光光 谱而不存在噪音问题，因此对于上述的增加背景噪音的缺点提供了解决方案。 另外，暗猝灭剂还可以提供同时使用两个以上的报告体-猝灭剂的探针的优 点。
作为具有暗猝灭剂的结构的代表性化合物，典型的有BHQ猝灭剂衍生物 的BHQ1、BHQ2以及BHQ3(WO2001/086001A1)。这些猝灭剂由作为电 子给体物质的二烷基苯胺和具有电子受体性质的芳香族物质之间的重氮键构 成，大约在500700nm的波长区域中吸收荧光。但是，具有盐结构的猝灭 剂的情况下，低聚物合成和提纯过程时表现出不稳定的状态，BHQ3为其一 例。
此外，可例举：BBQ猝灭剂(WO2006/084067A2)和作为醌类猝灭剂的 爱荷华黑猝灭剂(Iowa black猝灭剂)(US7504495B2)。但是，这些猝灭剂 相比于上述BHQ猝灭剂波长吸收能力差。
一方面，猝灭剂与荧光物质相结合而主要在化学或者生物学领域中使用。 为了检测所需的分子、蛋白质或核酸，使能够与其互补性结合的分子、猝灭 剂以及荧光物质相结合而测定荧光的发光程度，由此能够判断出目标物质的 存在。其对化学以及生物学领域的进一步发展起到了重要作用。生物学领域 中最有效应用荧光共振能量转移理论的是，即时聚合酶链锁反应(Real Time Polymerase Chaine Raction，RT-PCR)中探针的使用。探针用于碱基序列等特 定部位的检测，最近在即时聚合酶链锁反应(RT-PCR)中频繁使用。
探针的种类有TaqMan探针和分子信标(Molecular Beacon)探针等。 TaqMan探针是，一侧端部上附着有报告体(能量给体)，相反侧端部上附着 有猝灭剂的探针。进行聚合酶链锁反应时，报告体脱离猝灭剂影响的同时显 现出报告体本身的荧光。荧光的量随着聚合酶链锁反应更多实施，成比例地 增加。通过定量化该荧光的量而用作间接的测定手段。分子信标探针以发夹 形状由茎和环构成。随着聚合酶链锁反应的进行，特定部位上附着有分子信 标探针时，结构分解，并且脱离猝灭剂的影响范围而发出荧光。
基于荧光共振能量转移理论的猝灭现象能够说明猝灭剂在探针内与报告 体进行的能量转移。因此，探针中报告体和猝灭剂的关系对探针性能起到重 要作用。当猝灭剂对连接于探针的报告体的各种波长区域进行吸收时，可使 用的荧光物质不存在任何限制，能够制作出检测更加容易且优异的探针。即， 猝灭剂吸收波长的范围变宽时，可制作出猝灭剂与各种荧光染料进行连接的 探针。
基于此，本发明人等为了开发出效率更加优异的猝灭剂进行悉心研究的 结果，发现：具有新型偶氮化合物的猝灭剂作为猝灭剂具有优异的性质，以 此完成了本发明。
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种新型偶氮化合物以及含有上述偶氮化合物 的新型猝灭剂。
本发明的另一目的在于，提供一种含有上述猝灭剂的寡核苷酸。
本发明的又一目的在于，提供一种新型偶氮化合物以及上述偶氮化合物 的制造方法。
解决课题所用的方法
为了达成上述目的，本发明提供一种含有以下述化学式1表示的化合物 的猝灭剂。
[化学式1]
A1-N＝N-A2-N＝N-A3
上述化学式1中，
A1具有下述化学式2或者化学式3的结构；
A2为取代或未取代的C6-C12的亚芳基(arylenegroup)、或者取代或未 取代的C4-C12的杂亚芳基(heteroarylenegroup)；
A3为取代或未取代的C6-C30的芳基、或者取代或未取代的C3-C30的杂 芳基。
[化学式2]
上述化学式2中，
Z1至Z4为相互独立的CR1或者氮；
R1为氢、卤素、C1-C10的烷氧基、硝基、氰基或者磺酰基；
X1为CH2、NH、硫或者氧，X2为CH或者氮。
[化学式3]
上述化学式3中，
Ζ5至Ζ9为相互独立的CR2或者氮；
R2为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NR9R10、C1-C10的烷基、C1-C10的 羧基或者卤素；
R9以及R10为相互独立的氢或者C1-C10的烷基。
上述化学式1中，A2优选具有下述化学式4的结构。
[化学式4]
上述化学式4中，
Ζ10至Ζ13为相互独立的CR3或者氮；
R3为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NR11R12、C1-C10的烷基、C1-C10 的羧基、C6-C30的芳氧基或者卤素；
R11以及R12为相互独立的氢或者C1-C10的烷基。
另外，上述化学式1中，A3优选具有下述化学式5的结构。
[化学式5]
上述化学式5中，
Z14至Z17为相互独立的CR4或者氮；
R4为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NR13R14、C1-C10的烷基、C1-C10 的羧基或者卤素；
R13以及R14为相互独立的氢或者C1-C10的烷基；
Z18为CH或者氮；
L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代 的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C30的烷基、C1-C30的羧基、 C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷基或者C3-C30的杂芳基。
为了达成本发明的另一目的，本发明提供一种含有上述的猝灭剂的寡核 苷酸。
此外，为了达成本发明的又一目的，本发明提供一种新型偶氮化合物以 及包括从苯胺依次进行第一次偶氮偶合反应和第二次偶合反应的步骤的上述 偶氮化合物的制造方法。
发明效果
本发明的由新型偶氮化合物构成的猝灭剂具有强且宽的吸收区域，相比 于以往的猝灭剂，在更加宽的荧光波长中起到猝灭作用。因此，基于本发明 的猝灭剂，作为能量给体能够使用更多种形式的荧光染料(fluorophore)。另 外，本发明的猝灭剂在与低聚物进行的合成过程以及提纯过程中显示稳定性。 其在生物学、化学领域中能够以各种形式应用。
另外，本发明的偶氮化合物的制造方法克服了以往不易合成含有三个以 上杂环结构的偶氮化合物的局限性，能够容易合成出不易合成的含有三个以 上杂环结构的偶氮化合物。
附图说明
图1是表示各猝灭剂的荧光发光量(发射强度：emission intensity)的图 表。
图2是表示作为荧光物质使用FAM、作为猝灭剂使用本发明的猝灭剂570 以及BHQ1分别进行合成而成的探针在即时(real-time)-PCR中测定的结果 的图表。图表中横轴表示周期(cyde)，纵轴表示荧光强度(fluorescence intensity)(在下述图3至图6中均相同)。
图3是表示作为荧光物质使用TET、作为猝灭剂使用本发明的猝灭剂570 以及BHQ1分别进行合成而成的探针在即时(real-time)-PCR中测定的结果 的图表。
图4是表示作为荧光物质使用TAMRA、作为猝灭剂使用本发明的猝灭 剂570以及BHQ1分别进行合成而成的探针在即时(real-time)-PCR中测定 的结果的图表。
图5是表示作为荧光物质使用ROX、作为猝灭剂使用本发明的猝灭剂570 以及BHQ2分别进行合成而成的探针在即时(real-time)-PCR中测定的结果 的图表。
图6是表示作为荧光物质使用Texas-Red、作为猝灭剂使用本发明的猝灭 剂570以及BHQ2分别进行合成而成的探针在即时(real-time)-PCR中测定 的结果的图表。
具体实施方式
下面，对本发明进行详细说明。
本发明提供一种含有以下述化学式1表示的偶氮化合物的猝灭剂。
[化学式1]
A1-N＝N-A2-N＝N-A3
上述化学式1中，
A1具有下述化学式2或者化学式3的结构；
A2为取代或未取代的C6～Cl2的亚芳基，或者，取代或未取代的C4-C12 的杂亚芳基；
A3为取代或未取代的C6～C30的芳基，或者，取代或未取代的C3-C30 的杂芳基。
上述“取代”是指，对未取代的取代基进一步进行取代的情况，其取代 基是选自于由重氢、卤素、(C1-C30)烷基、卤素取代的(C1-C30)烷基、 (C6-C30)芳基、(C3-C30)杂芳基、(C6-C30)芳基取代的(C5-C30)杂 芳基、(C3-C30)环烷基(cycloalkyl)、杂环烷基，三(C1-C30)烷基硅烷 基(tri(C1-C30)alkylsilyl)、三(C6-C30)芳基硅烷基(tri(C6-C30)arylsilyl)、 二(C1-C30)烷基(C6-C30)芳基硅烷基(di(C1-C30)alkyl(C6-C30)arylsilyl)、 (C1-C30)烷基二(C6-C30)芳基硅烷基((C1-C30)alkyldi(C6-C30)arylsilyl)、 (C2-C30)烯基、(C2-C30)炔基、氰基、咔唑基、二(C1-C30)烷基氨基、 二(C6-C30)芳氨基、(C1-C30)烷基(C6-C30)芳氨基、二(C6-C30)芳 基硼羰基(di(C6-C30)arylboronyl)、二(C1-C30)烷基硼羰基(di(C1-C30) alkylboronyl)、(C1-C30)烷基(C6-C30)芳基硼羰基、(C6-C30)芳香基(C1-C30)烷基((C6-C30)ar(C1-C30)alkyl)、(C1-C30)烷基(C6-C30) 芳基、(C1-C30)烷氧基、(C6-C30)芳氧基、羧基、硝基以及羟基所组成 的组中的一个以上。
[化学式2]
上述化学式2中，
Z1至Z4为相互独立的CR1或者氮；
R1为氢、卤素、C1-C10的烷氧基、硝基、氰基或者磺酰基；
X1为CH2、NH、硫或者氧，X2为CH或者氮.
[化学式3]
上述化学式3中，
Z5至Z9为相互独立的CR2或者氮；
R2为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NR9R10、C1-C10的烷基、C1-C10的 羧基或者卤素；
R9以及R10为相互独立的氢或者C1-C10的烷基。
上述化学式1中，A2优选具有下述化学式4表示的结构。
[化学式4]
上述化学式4中，
Z10至Z13为相互独立的CR3或者氮；
R3为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NR11R12、C1-C10的烷基、C1-C10 的羧基或者卤素；
R11以及R12为相互独立的氢或者C1-C10的烷基。
上述化学式1中，A3优选具有下述化学式5表示的结构。
[化学式5]
上述化学式5中，
Z14至Z17为相互独立的CR4或者氮；
R4为氢、羟基、C1-C10的烷氧基、NR13R14、C1-C10的烷基、C1-C10 的羧基或者卤素；
R13以及R14为相互独立的氢或者C1-C10的烷基；
Z18为CH或者氮；
L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代 的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C30的烷基、C1-C30的羧基、 C1～C30的羰氧基取代的C1-C30的烷基或者C3-C30的杂芳基。
含有以上述化学式5表示的A3的猝灭剂还可含有通过连接子(linker) 与选自于上述L1或者L2中的任意一个进行连接的载体(cleavablesupport)。 另外，上述猝灭剂还可含有作为保护基以DMT(4，4’-二甲氧基三苯基：4， 4’-dimethoxytritylgroup)或者其类似物进行保护的羟基。
上述载体是指，有助于核酸或者多肽等连接猝灭剂而进行合成的固体状 物质，其在猝灭剂和低聚物结合中固定3'侧端部以使低聚物链 (oligomerchains)的合成更加容易。上述载体包括树脂、固体载体、固相材 料等起到同等作用的物质。上述载体可由聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟 乙烯(polyfluoroethylene)、聚乙烯氧基(polyethyleneoxy)、聚丙烯酰胺 (polyacrylamide)或者它们的共聚物(co-polymer)构成，也可由玻璃、二 氧化硅、CPG、或反相二氧化硅(reverse-phasesilica)构成。优选选自于CPG (可控多孔玻璃：controlled pore glass)或者聚苯乙烯。
本发明连接子的主要作用仅在于使猝灭剂和其它物质进行连接，起到这 种作用的所有物质均可成为本发明的连接子。作为本发明的连接子一例，可 举出：连接有1个至6个的乙二醇基团(ethyleneglycolmoieties)或者碳链， 但并非限定于此。这些连接子对反应的官能团(reactivefunctionality)、荧光 以及猝灭作用涉及的影响不存在或微弱。
另外，上述猝灭剂内具有反应性的官能团可由保护基进行保护，该保护 剂为选自于由DMT(二甲氧三苯甲基：dimethoxytritylgroup)、MMT(单甲 氧基三苯甲基：Monomethoxytritylgroup)、三苯甲基(trityl)、取代的三苯 甲基、苯基呫吨基(pixylgroup)以及三烷基硅烷基所组成的组中的一个以上。 其中，优选DMT。本发明的羟基可通过DMT进行结合。低聚物合成时，可 去除DMT后合成所需的低聚物。
上述化学式1表示的化合物优选为选自于化学式6或者化学式7的化合 物，但并非限定于此。
[化学式6]
[化学式7]
Z18为CH或者氮；
L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代 的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C30的烷基、C1-C30的羧基、 C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷基、或者C3-C30的杂芳基；
R15至R18为相互独立的H、C1-C10的烷氧基、或者C1-C10的烷基。
上述化学式1表示的化合物更加优选为以下述化学式8至化学式12表示 的化合物中的任意一个，但并非限定于此。
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
含有以上述化学式8至化学式12表示的化合物中的任意一个的猝灭剂还 可含有连接子以及连接于载体的结构以便与低聚物进行合成。此时，连接子 可通过胺化羧基来进行连接(参考制造例)。载体优选CPG(可控多孔玻璃： controlled pore glass)或者聚苯乙烯，更加优选CPG。
另外，上述猝灭剂还可含有官能团，此官能团选自于不影响报告体和猝 灭剂的作用的物质中。官能团提供可更加有效地与低聚物连接的作用。因此， 为了此低聚物合成，上述猝灭剂可通过DMT或者其衍生物对能够与低聚物进 行反应的官能团进行保护，并且，还可含有连接于载体的中间体(intermediate) 结构。
为了低聚物合成，本发明的上述猝灭剂更加优选含有以下述化学式13至 化学式17的结构表示的化合物。
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
更加优选的是，上述化学式13至化学式17中Y作为载体选自于CPG(可 控多孔玻璃：controlled pore glass)或者聚苯乙烯(polystyrene)，其中优选 CPG。
含有化学式13至化学式17的结构的猝灭剂分别通过连接子将载体连接 于化学式8至化学式12，羟基由DMT来进行保护。其在与低聚物进行连接 的前步骤中合成反应特异性低聚物，以便低聚物与上述的猝灭剂进行连接而 应用于各种化学以及生物学研究。
本发明中，包含化学式13的结构的猝灭剂命名为猝灭剂570，包含化学 式14的结构的猝灭剂命名为猝灭剂545，包含化学式15的结构的猝灭剂命 名为猝灭剂630，包含化学式16的结构的猝灭剂命名为猝灭剂640，包含化 学式17的结构的猝灭剂命名为猝灭剂530。在以下的实施例以及附图中所使 用的“猝灭剂000”分别指本发明的猝灭剂。
本发明的一实施例中对猝灭剂570、猝灭剂630、猝灭剂640、作为以往 公知的猝灭剂的BHQ1以及BHQ2的荧光发光量进行测定的结果，本发明的 猝灭剂显示出相比于已公知的猝灭剂BHQ能够在更宽的波长范围内吸收荧 光(参考图1)。特别是，猝灭剂570具有如下猝灭能力：相比于以往的某一 猝灭剂对荧光波长范围起到的猝灭作用范围，在相对更宽的荧光波长区域中 起到猝灭作用。由此，只通过猝灭剂570就可在以往BHQ1以及BHQ2的猝 灭范围内进行猝灭。其意味着：本发明的猝灭剂作为荧光物质的能量受体， 通过电子给体和电子受体的官能团的有效排列，可实现强且宽的吸收区域， 从而可有效发挥猝灭剂功能。
另外，本发明的另一方式涉及一种含有上述猝灭剂的寡核苷酸。本发明 的猝灭剂结合于寡核苷酸而使用于生物学分析或者化学分析。根据这些分析 目的，上述寡核苷酸可进行适当变形。
上述寡核苷酸是指一个至几百个核苷酸的聚合物，包括DNA、RNA或 者PNA。另外，它们的类似物是，如对上述核苷酸施加化学改性的物质或者 结合糖的物质等本领域技术人员容易施加变形的所有物质均包含，由单链或 者双链所构成的物质也均包含。
上述寡核苷酸优选含有探针。更优选该探针是能够与成为靶的核酸进行 互补性结合的探针，但并非限定于此。
上述探针可选自于核酸、肽、糖类、寡核苷酸、蛋白质、抗体或者它们 的组合中，但并非限定于此。
另外，上述探针优选含有荧光物质。所含有的荧光物质可含有选自于香 豆素(Coumarin)、荧光素(Fluorescein)、罗丹明(Rhodamine)、氟硼荧 (BODIPY)、菁(Cyanine)等所构成的荧光物质系列或者荧光物质系列的 衍生物中的一个以上。另外，本发明的猝灭剂的波长吸收范围宽，因此，作 为报告体可以使用各种荧光物质，并不限制于上述荧光物质。
这些寡核苷酸在化学、生物学领域中以各种形式应用。特别是，有效应 用于即时聚合酶链锁反应或者微量分析(microassay)等中，但并非限定于此。
本发明提供一种含有上述寡核苷酸的核酸检测用组合物。上述组合物含 有能够与靶核酸进行互补性结合的寡核苷酸，从而能够对靶核酸实施特异性 检测。另外，上述组合物还可含有本领域技术人员容易选择的能够包含在检 测用组合物的组成。
另外，本发明提供一种利用上述探针检测目标核酸或蛋白质的方法。此 方法包括：本发明的探针与具有目标物质的样品进行接触的步骤；分析荧光 量的步骤。
本发明提供一种选自于下述化学式6或者化学式7的新型偶氮化合物。
[化学式6]
[化学式7]
上述化学式中，
Z18为CH或者氮；
L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代 的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C10的烷基、C1-C30的羧基、 C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷基、或者C3-C30的杂芳基；
R15至R18为相互独立的H、C1-C10的烷氧基或者C1-C10的烷基。
另外，本发明提供一种含有三个以上的杂环的偶氮化合物的制造方法。 具体地，本发明提供一种以上述化学式6和化学式7表示的偶氮化合物的制 造方法。
本发明的以上述化学式6表示的偶氮化合物的制造方法包括：
使下述化学式6a的苯胺和化学式6b进行偶氮偶合反应而获得化学式6c 的化合物的步骤；
获得上述化学式6c的化合物的步骤之后，使下述化学式6c和下述化学 式6d进行偶氮偶合反应而获得化学式6的步骤。
[化学式6a]
[化学式6b]
[化学式6c]
[化学式6d]
[化学式6]
另外，本发明的具有下述化学式7的结构的偶氮化合物的制造方法包括： 在获得上述化学式6c的化合物的步骤之后，使化学式6c和下述化学式7a进 行偶氮偶合反应而获得化学式7的步骤。
[化学式7a]
[化学式7]
上述化学式中，
Z18为CH或者氮；
L1以及L2为相互独立的氢、C1-C30的烷基、C6-C30的芳基、羟基取代 的C1-C30的烷基、C6-C30的芳基取代的C1-C10的烷基、C1-C30的羧基、 C1-C30的羰氧基取代的C1-C30的烷基、或者C3-C30的杂芳基；
R15至R18为相互独立的H、C1-C10的烷氧基或者C1-C10的烷基。
以往，含有三个以上的杂环的偶氮化合物的合成并不容易，因此具体公 开含有三个以上的杂环的偶氮化合物的例子罕见。
本发明的偶氮化合物的制造方法的特征在于，合成含有三个以上的杂环 的偶氮化合物，根据本发明，能够提供一种含有三个以上的杂环的偶氮化合 物的制造方法，其特征在于，具有从作为起始化合物的苯胺进行第一次偶氮 偶合反应之后进行第二次偶氮偶合反应的工序。
先连接与苯胺进行连接的两个杂环化合物，之后通过偶氮偶合反应使连 接的两个杂环化合物与苯胺进行连接的以往的公知方法在实际合成时并不容 易。
对此，本发明可提供一种能够容易合成含有三个以上杂环的偶氮化合物 的方法。本发明的偶氮化合物的制造方法的特征在于，依次进行两次偶合反 应。
以往公知的有使用吸电子基团(EWG，electron withdrawing group)的合 成法，但是其在下述方面存在局限性：在导入强烈的吸电子基团的状况下， 二次结合时反应性显著下降而反应不易进行。因此，在合成经过偶氮偶合的 猝灭剂化合物时，若通过一次偶氮偶合合成的偶氮化合物具有强的吸电子基 团时，由于吸电子基团的强的吸电子作用，一次偶氮化合物的碱性降低。基 于相同的理由，二次偶氮偶合时，反应的进行变得困难。作为对此的解决方 案，本发明的偶氮化合物的制造方法在一次偶氮偶合中通过具有给电子基的化合物进行反应。
在铵盐和偶氮盐的竞争反应中为了使偶氮盐(azonium salt)的生成占有 优势，应考虑反应速度的调节和适当溶剂的选择。然后，与具有强的吸电子 基团的化合物进行二次偶氮偶合。为了提高一次、二次偶氮偶合的反应性， 通过有效调节温度、溶剂、pH等反应条件以使反应性的最大提高。为了克服 这样的局限性，从给电子基开始进行合成，最终通过二次偶氮偶合导入吸电 子基团，由此能够合成出导入有强烈的吸电子基团的猝灭剂。
下面提供优选制造例以及实施例以便理解本发明。下述制造例以及实施 例仅为了便于理解而用于例示本发明，但本发明的内容并不限定于下述制造 例以及实施例。另外，本说明书中所使用的用语、叙述等在没有特别限定的 情况下，其具有本发明所属技术领域中常用的含义。
<制造例1>-化学式13的化合物(猝灭剂570)的制造
1-1.1工序化合物的制造-胺化(Amination)
加入N-乙基苯胺(N-ethylaniline)30g(250mmol，1当量)、丙烯酸乙 酯37.2g(370mmol，1.5当量)、硝酸铈(Ⅳ)铵13.57g(25mmol，0.1当量) 并进行搅拌。提升温度至60℃并搅拌15小时。降低温度至室温(常温)，用 二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对提取液进行减压浓 缩并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物47g (黄色液体，85.8％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.27-7.20ppm(2H，t)，6.73-6.67ppm(3H， m)，4.20-4.11ppm(2H，q)，3.67-3.61ppm(2H，t)，3.43-3.35ppm(2H， q)，2.63-2.57ppm(2H，t)，1.31-1.24ppm(3H，t)，1.19-1.14ppm(3H， t)
1-2.2工序化合物的制造-第一次偶氮偶合(Azo coupling)
加入亚硝基硫酸10.37g(32.64mmol，1当量)、盐酸50ml、甲醇150ml 并进行搅拌。降低温度至-78℃并搅拌20分钟。
2，5-甲氧基苯胺5g(32.64mmol，1当量)溶解于甲醇100ml后进行滴 加，然后提升温度至室温并搅拌2小时。
滴加溶解于甲醇的1工序化合物7.95g(35.91mmol，l.l当量)之后，搅 拌1小时。用饱和碳酸氢钠水溶液进行中和以达到pH6～8。完成中和后，搅 拌15小时。进行减压浓缩去除甲醇。用二氯甲烷进行提取。对过滤液进行减 压浓缩并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物 5.87g(橙色液体，46.7％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.90-7.86ppm(2H，d)，7.27-7.25ppm(1H， s)，7.01-6.93ppm(2H，m)，6.75-6.72ppm(2H，d)，4.20-4.12ppm(2H， q)，3.99-3.97ppm(3H，s)，3.84-3.82ppm(3H，s)，3.75-3.69ppm(2H， t)，3.50-3.44ppm(2H，q)，2.67-2.61ppm(2H，t)，1.30-1.18ppm(6H， m)
1-3.3工序化合物的制造-第二次偶氮偶合(Azo coupling)
加入硝酸钠1.05g(15.23mmol，l当量)、磷酸150ml并进行搅拌。降低 温度至0℃，并搅拌20分钟。加入4-氨基吡啶1.43g(15.23mmol，l当量)。 室温下搅拌30分钟。将2工序化合物5.87g(15.23mmol，l当量)溶解于乙 酸50ml。滴加之后，搅拌1小时。加入蒸馏水200ml，用饱和碳酸氢钠水溶 液进行中和以达到pH4～8，然后搅拌15小时。用二氯甲烷进行提取。用硫酸 钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩并用色谱柱进行分离。减 压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物1.6g(暗紫色固体，21.4％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.81-8.78ppm(2H，d)，7.96-7.92ppm(2H，d)，7.74-7.71ppm(2H，d)，7.50-7.48ppm(1H，s)，7.47-7.45ppm(1H， s)，6.77-6.74ppm(2H，d)，4.22-4.14ppm(2H，q)，4.10-4.08ppm(3H， s)，4.06-4.04ppm(3H，s)，3.79-3.73ppm(2H，t)，3.54-3.48ppm(2H， q)，2.70-2.64ppm(2H，t)，1.31-1.21ppm(6H，m)
1-4.4工序化合物的制造-水解(Hydrolysis)
加入3工序化合物1.49g(3.04mmol，l当量)、甲醇200ml、二氯甲烷 200ml并进行搅拌。加入1N氢氧化钠9.11ml(9.11mmol，3当量)，搅拌3 天。再加入1N氢氧化钠3.04ml(3.04mmol，l当量)，搅拌1天之后，进行 减压浓缩。加入蒸馏水400ml后进行搅拌。用1N盐酸进行中和以达到pH6～8。 用二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压 浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物1.9g(暗紫色固体)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.77-8.74ppm(2H，d)，7.93-7.89ppm(2H， d)，7.76-7.73ppm(2H，d)，7.47-7.45ppm(1H，s)，7.45-7.43ppm(1H， s)，6.80-6.76ppm(2H，d)，4.09-4.07ppm(3H，s)，4.05-4.03ppm(3H， s)，3.83-3.77ppm(2H，t)，3.59-3.51ppm(2H，q)，2.76-2.70ppm(2H， t)，1.29-1.23ppm(3H，t)
1-5.5工序化合物的制造-胺保护化(Amine Protection)
加入6-氨基癸酸(6-aminocapricacid)10g(76.2mmol，l当量)、三乙胺 31.8ml(228.6mmol，3当量)、甲醇76ml并进行搅拌。加入三氟乙酸乙酯 11.9g(83.76mmol，l.l当量)并搅拌15小时。进行减压浓缩。用乙酸乙酯进 行提取。用硫酸镁干燥有机层并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩之后实施 真空干燥而获得所需化合物16.9g(98.0％)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：11.97-11.95ppm(1H，s)，9.38-9.36ppm (1H，s)，3.18-3.10ppm(2H，q)，2.21-2.14ppm(2H，t)，1.53-1.41ppm (4H，m)，1.29-1.18ppm(2H，m)
1-6.6工序化合物的制造-NHS酯化(Esterification)
加入5工序化合物5.28g(23.24mmol，l当量)、甲醇120ml、吡啶9.38ml(116.2mmol，5当量)并进行搅拌。加入N-琥珀酸亚胺基三氟乙酸酯 (N-succinimidyltrifluoroacetate)8.81g(41.83mmol，1.8当量)并搅拌1天。 进行减压浓缩。用二氯甲烷进行提取。用硫酸镁干燥有机层并进行过滤。对 过滤液进行减压浓缩。进行真空干燥而获得所需化合物7.08g(白色固体， 94.8％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：6.80-6.78ppm(1H，s)，3.40-3.32ppm(2H， q)，2.84-2.82ppm(4H，s)，2.64-2.58ppm(2H，t)，1.83-1.73ppm(2H， m)，1.67-1.57ppm(2H，m)，1.52-1.44ppm(2H，m)
1-7.7工序化合物的制造-酰胺化(Amidation)(C6-间隔区(Spacer))和DMT添加
加入6工序化合物lg(3mmol，1.2当量)、二甲基甲酰胺5ml、3-氨基 -1,2-丙二醇0.23g(2.57mmol，l当量)并搅拌1小时。加入二氯甲烷50ml， 降低温度至0℃。加入二乙基氯化物(diethylchloride)1.13g(3.33mmol，1.3 当量)并进行搅拌。
在二氯甲烷10ml中稀释三乙胺0.84ml(6.05mmol，2.4当量)并进行滴 加。室温下搅拌15小时。进行减压浓缩。用二氯甲烷进行提取。用硫酸镁干 燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，并用色谱柱进行分离。减压 浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物0.98g(淡黄色固体，64.5％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.42-7.20ppm(9H，m)，6.84-6.80ppm (4H，d)，5.87-5.85ppm(1H，t)，3.94-3.82ppm(1H，m)，3.79-3.77ppm (6H，s)，3.59-3.47ppm(1H，m)，3.37-3.10ppm(5H，m)，2.12-2.07ppm (2H，t)，1.64-1.50ppm(4H，m)，1.35-1.26ppm(2H，m)
1-8.8工序化合物的制造-胺脱保护(Amine Deprotection)
加入7工序化合物0.98g(1.62mmol，l当量)、甲醇4ml并进行搅拌。 滴加氨水(25％)30ml(213.98mmol，132当量)，并搅拌15小时。用二氯 甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩之 后实施真空干燥而获得所需化合物0.8g(淡黄色固体，97％)。
1HNMR(300MHz，CDC13)：7.42-7.14ppm(9H，m)，6.83-6.79ppm (4H，d)，6.04-6.02ppm(1H，t)，3.87-3.79ppm(1H，m)，3.78-3.76ppm (6H，s)，3.59-3.50ppm(1H，m)，3.22-3.07ppm(3H，m)，2.66-2.60ppm (2H，t)，2.12-2.06ppm(2H，t)，1.62-1.52ppm(2H，m)，1.43-1.35ppm (2H，m)，1.33-1.25ppm(2H，m)
1-9.9工序化合物的制造-酰胺化(Amidation)(C9-间隔区(Spacer))
加入4工序化合物1.9g(4.11mmol，l当量)、双-2-氧代-3-恶唑烷基次 磷酰氯(bis-2-oxo-3-oxazolidinylphosphoric chloride)2g(4.52mmol，l.l当量)、 1-羟基苯并三唑0.61g(4.52mmol，l.l当量)、8工序化合物2.29g(4.52mmol， l.l当量)、二氯甲烷1L并进行搅拌。加入三乙胺2.85ml(20.54mmol，5当 量)并搅拌15小时。进行减压浓缩。用乙酸乙酯进行提取。用硫酸钠干燥有 机层并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，用色谱柱进行分离。减压浓缩之 后实施真空干燥而获得所需化合物2.1g(暗紫色固体，53.7％)。
1HNMR(300MHz，CDC13)：8.82-8.79ppm(2H，d)，7.93-7.90ppm (2H，d)，7.74-7.71ppm(2H，d)，7.49-7.47ppm(1H，s)，7.46-7.44ppm (1H，s)，7.44-7.17ppm(9H，m)，6.83-6.79ppm(4H，d)，6.76-6.72ppm (2H，d)，6.02-5.97ppm(1H，t)，5.90-5.85ppm(1H，t)，4.08-4.06ppm (3H，s)，4.04-4.02ppm(3H，s)，3.88-3.81ppm(1H，m)，3.81-3.75ppm (7H，m)，3.58-3.47ppm(5H，m)，3.28-3.08ppm(6H，m)，2.52-2.47ppm (2H，t)，2.11-2.05ppm(2H，t)，1.62-1.42ppm(4H，m)，1.34-1.18ppm (5H，m)
1-10.10工序化合物的制造-琥珀酰化(Succinylation)
加入9工序化合物1.97g(2.07mmol，l当量)、琥珀酸酐0.62g(6.22mmol， 3当量)、N，N-二甲氨基吡啶25mg(0.21mmol，0.1当量)、吡啶80ml并 进行搅拌。提升温度至60℃并搅拌15小时。再加入琥珀酸酐0.62g(6.22mmol， 3当量)，并搅拌1天。进一步加入N，N-二甲氨基吡啶25mg(0.21mmol， 0.l当量)，并搅拌1天。降低温度至常温，并进行减压浓缩。用二氯甲烷进 行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，并用色 谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物1.76g(暗紫色 固体，80.9％)。
1HNMR(300MHz，CDC13)：8.76-8.73ppm(2H，d)，7.92-7.88ppm (2H，d)，7.73-7.70ppm(2H，d)，7.48-7.46ppm(1H，s)，7.43-7.19ppm (10H，m)，6.83-6.80ppm(4H，d)，6.74-6.71ppm(2H，d)，6.50-6.46ppm (1H，m)，6.43-6.39ppm(1H，t)，5.24-5.20ppm(1H，m)，4.08-4.06ppm (3H，s)，4.04-4.02ppm(3H，s)，3.89-3.72ppm(9H，m)，3.57-3.45ppm (7H，m)，3.37-3.19ppm(6H，m)，2.58-2.50ppm(2H，t)，2.18-2.11ppm (2H，t)，1.69-1.40ppm(4H，m)，1.32-1.17ppm(5H，m)
1-11.11工序化合物的制造-LCAA-CPG偶合(Coupling)
加入LCAA-CPG3g、10工序化合物0.44g(0.418mmol，3.5当量)、双 -2-氧代-3-恶唑烷基次磷酰氯0.18g(0.418mmol，3.5当量)、1-羟基苯并三 唑0.06g(0.418mmol，3.5当量)、二氯甲烷35ml、三乙胺0.29ml(2.09mmol， 17.5当量)。常温下搅拌1天。过滤，并用甲醇进行洗涤。对过滤物进行真 空干燥而获得所需化合物2.9g(紫色固体)。
1-12.12工序化合物的制造-封端(Capping)
加入11工序化合物2.9g、吡啶35ml、乙酸酐3.59ml(38mmol，91当量)、 1-甲基咪唑3.03ml(38mmol，91当量)之后，反应1天。过滤，并用甲醇进 行洗涤。对过滤物进行真空干燥而获得所需化合物2.8g(紫色固体)。
<制造例2>-化学式16的化合物(猝灭剂640)的合成
2-1.1工序化合物的制造-丙醇(propanol)取代
加入N-(2-乙酰氧乙基)苯胺12.3g(68.63mmol，1当量)之后加入水 40ml，然后加入3-氯-1-丙醇(3-chloro-1-proppanol)19.86g(205.90mmol，3 当量)和碳酸钙6.87g(68.63mmol，1当量)，并在100℃下搅拌19小时。 降低温度至常温并用乙酸乙酯进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。 对过滤液进行减压浓缩并用色谱柱进行分离。减压浓缩而获得所需的化合物 13.8g(黄色液体，84％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.23-7.19ppm(2H，m)，6.79-6.75ppm (3H，m)，4.25-4.19ppm(2H，t)，3.71-3.66ppm(2H，t)，3.59-3.54ppm (2H，t)，3.48-3.43ppm(2H，t)，2.66-2.82ppm(1H，s，H-OH)，2.05-2.03ppm (3H，s，H-Ac)，1.90-1.76ppm(2H，m)
2-2.2工序化合物的制造―第一次偶氮偶合(Azo coupling)
加入亚硝基硫酸(nitrosylsulfuricacid)8.4g(26.12mmol，1当量)、盐 酸4.8ml(52.24mmol，2当量)、甲醇400ml并进行搅拌。降低温度至-78℃ 并搅拌20分钟。将2，5-甲氧基苯胺4g(26.12mmol、1当量)溶解于甲醇100ml后进行滴加，然后提升温度至室温，并搅拌2小时。滴加溶解于甲醇 的1工序化合物12.5g(52.24mmol，2当量)之后，搅拌1小时。用饱和碳 酸氢钠水溶液进行中和以达到pH6～8。完成中和后搅拌15小时。进行减压浓 缩去除甲醇。用二氯甲烷进行提取。对过滤液进行减压浓缩并用色谱柱进行 分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物5.6g(红色液体，53％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.89-7.85ppm(2H，d)，7.27-7.25ppm(1H， d)，7.02-6.92ppm(2H，m)，6.82-6.78ppm(2H，d)，4.30-4.25ppm(2H， t)，3.98-3.97ppm(3H，s)，3.83-3.82ppm(3H，s)，3.76-3.66ppm(4H， m)，3.60-3.55ppm(2H，t)，2.03-2.02ppm(3H，s)，1.94-1.87ppm(2H， m)，1.65-1.64ppm(1H，s)
2-3.3工序化合物的制造-第二次偶氮偶合(Azo coupling)
加入2-氨基-6-硝基-苯并噻唑2.3g(12mmol，l当量)并降低温度至0℃ 之后，加入磷酸50ml后加入硝酸钠0.83g(12mmol，l当量)并搅拌1小时。 将2工序化合物4.8g(12mmol，l当量)溶解于乙酸30ml后进行滴加。降低 温度至0℃之后，加入饱和碳酸氢钠水溶液以达到pH8～9之后，在常温下搅 拌15小时。过滤固体而获得的固体中加入甲醇600ml并煮沸2小时。降低温 度至常温之后，过滤沉淀物。用甲醇进行洗涤之后，真空干燥固体而获得所 需化合物3.2g(古铜色固体，44％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.81-8.80ppm(1H，s)，8.42-8.36ppm(1H， d)，8.25-8.21ppm(1H，d)，7.96-7.93ppm(2H，d)，7.68-7.67ppm(1H， s)，7.41-7.40ppm(1H，s)，6.87-6.83ppm(2H，d)，4.31-4.30ppm(2H， t)，4.13-4.12ppm(3H，s)，4.03-4.02ppm(3H，s)，3.77-3.75ppm(4H， m)，3.70-3.60ppm(2H，t)，2.05-2.06ppm(3H，s)，2.00-1.90ppm(2H， m)
2-4.4工序化合物的制造-DMT保护化(protection)
加入3工序化合物2.1g(3.46mmol，l当量)，用二氯甲烷100ml进行溶 解之后，加入三乙胺1.16g(11.39mmol)。加入二乙基氯化物1.64g(4.84mmol) 并在常温下搅拌2小时。用二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行 过滤。减压浓缩并用色谱柱进行分离。
减压浓缩而获得所需化合物2g(古铜色固体，63％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.76-8.74ppm(1H，d)，8.34-8.30ppm(1H， dd)，8.20-8.16ppm(1H，d)，7.90-7.86ppm(2H，d)，7.64-7.63ppm(1H， s)，7.48-7.44ppm(2H，d)，7.38-7.20ppm(8H，m)，6.88-6.78ppm(6H， m)，4.28-4.23ppm(2H，t)，4.12-4.11ppm(3H，s)，4.03-4.02ppm(3H， s)，3.80-3.78ppm(6H，s)，3.64-3.59ppm(4H，t)，3.22-3.17ppm(2H， t)，2.05-2.04ppm(3H，s)，1.98-1.92ppm(2H，m)
2-5.5工序化合物的制造-水解(Hydrolysis)
加入4工序化合物2g(2.2mmol，l当量)、甲醇150ml、二氯甲烷150ml 并进行搅拌。加入1N氢氧化钠100ml，并在常温下搅拌3天。用二氯甲烷进 行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩之后实施 真空干燥而获得所需化合物1.3g(古铜色固体，68％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.74-8.73ppm(1H，s)，8.33-8.30ppm(1H， d)，8.18-8.15ppm(1H，d)，7.87-7.83ppm(2H，d)，7.62-7.61ppm(1H， s)，7.43-6.80ppm(16H，m)，4.09-4.08ppm(3H，s)，4.00-3.99ppm(3H， s)，3.78-3.76ppm(8H，m)，3.61-3.60ppm(2H，t)，3.53-3.52ppm(2H， t)，3.17-3.16ppm(2H，t)，1.92-1.91ppm(2H，m)
2-6.6工序化合物的制造-琥珀酰化(Succinylation)
加入5工序化合物1.3g(1.50mmol，l当量)和吡啶100ml进行完全溶解。 加入N，N-二甲氨基吡啶0.018g(0.15mmol，0.l当量)和琥珀酸酐0.5g (4.50mmol，3当量)，并在50℃下搅拌15小时。利用真空泵去除吡啶之后 用二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压 浓缩并用色谱柱进行分离。减压浓缩而获得所需化合物0.85g(古铜色固体， 57％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.75-8.74ppm(1H，s)，8.33-8.30ppm(1H， d)，8.20-8.16ppm(1H，d)，7.89-7.85ppm(2H，d)，7.63-7.60ppm(1H， s)，7.47-6.70ppm(16H，m)，4.35-4.27ppm(2H，t)，4.11-4.10ppm(3H， s)，4.02-4.01ppm(3H，s)，3.79-3.78ppm(6H，s)，3.62-3.61ppm(4H， m)，3.19-3.18ppm(2H，t)，2.66-2.60ppm(4H，m)，1.93-1.92ppm(2H， m)
2-7.7工序化合物的制造-LCAA-CPG偶合(Coupling)
加入LCAA-CPG1g、6工序化合物0.08g(0.083mmol，2当量)、双-2- 氧代-3-恶唑烷基次磷酰氯0.03g(0.066mmol，1.6当量)、1-羟基苯并三唑 0.01g(0.066mmol，1.6当量)、二氯甲烷10ml、三乙胺0.042ml(0.41mmol， 10当量)。常温下搅拌15小时。过滤，并用甲醇进行洗涤。对过滤物进行真 空干燥而获得所需化合物0.8g(蓝色固体)。
2-8.8工序化合物的制造-封端(Capping)
加入7工序化合物0.8g、吡啶35ml、乙酸酐1.23ml、1-甲基咪唑0.8ml 之后，反应2小时。过滤，并用甲醇进行洗涤。对过滤物进行真空干燥而获 得所需化合物0.69g(蓝色固体)。
<制造例3>-化学式15的化合物(猝灭剂630)的制造
3-1.1工序化合物的制造-胺化(Amination)
加入N-乙基苯胺(N-ethylaniline)30g(250mmol，1当量)、丙烯酸乙 酯37.2g(370mmol，1.5当量)、硝酸铈(Ⅳ)铵13.57g(25mmol，0.1当量) 并进行搅拌。提升温度至60℃并搅拌15小时。降低温度至室温，用二氯甲烷 进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。减压浓缩提取液并用色谱柱进 行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物47g(黄色液体，85.8％)
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.27-7.20ppm(2H，t)，6.73-6.67ppm(3H， m)，4.20-4.11ppm(2H，q)，3.67-3.61ppm(2H，t)，3.43-3.35ppm(2H， q)，2.63-2.57ppm(2H，t)，1.31-1.24ppm(3H，t)，1.19-1.14ppm(3H， t)
3-2.2工序化合物的制造-第一次偶氮偶合(Azo coupling)
加入亚硝基硫酸17.37g(54.67mmol，1.5当量)、盐酸7.6g、甲醇400ml 并进行搅拌。降低温度至-78℃并搅拌10分钟。
将2-甲氧基-5-甲基苯胺5g(36.45mmol，l当量)溶解于甲醇50ml后进 行滴加。室温下搅拌1小时。将1工序化合物8.87g(40.09mmol，1.1当量) 溶解于甲醇后进行滴加，然后搅拌2小时。用饱和碳酸氢钠水溶液进行中和 之后，搅拌15小时。进行减压浓缩去除甲醇。用二氯甲烷进行提取。用硫酸 钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，并用色谱柱进行分离。 减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物6.26g(橙色液体，46.5％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.90-7.86ppm(2H，d)，7.27-7.25ppm(1H， s)，7.01-6.93ppm(2H，m)，6.75-6.72ppm(2H，d)，4.20-4.12ppm(2H， q)，3.99-3.97ppm(3H，s)，3.84-3.82ppm(3H，s)，3.75-3.69ppm(2H， t)，3.50-3.44ppm(2H，q)，2.67-2.61ppm(2H，t)，1.30-1.18ppm(6H， m)
3-3.3工序化合物的制造.
加入2-氨基-6-硝基-苯并噻唑1.59g(8.12mmol，l当量)，温度降低至0℃ 之后，加入磷酸42ml，然后加入硝酸钠0.56g(8.12mmol，l当量)并搅拌1 小时。将2工序化合物3g(8.12mmol，l当量)溶解于乙酸15ml后进行滴加。 温度降低至0℃之后，加入饱和碳酸氢钠水溶液进行中和，然后在常温下搅拌 15小时。过滤固体之后，溶解于20ml二氯甲烷，并用乙醇500ml进行沉淀， 并过滤。真空干燥固体而获得所需化合物1.5g(暗褐色固体，32％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.82-8.81ppm(1H，d)，8.41-8.37ppm(1H， d)，8.28-8.24ppm(1H，d)，7.95-7.91ppm(2H，d)，7.66-7.60ppm(2H， d)，6.77-6.74ppm(2H，d)，4.22-4.14ppm(2H，q)，4.05-4.04ppm(3H， s)，3.79-3.73ppm(2H，t)，3.55-3.50ppm(2H，q)，2.78-2.77ppm(3H， s)，2.70-2.64ppm(2H，t)，1.31-1.21ppm(6H，m)
3-4.4工序化合物的制造.水解(Hydrolysis)
加入3工序化合物1.5g(2.61mmol，l当量)、二氯甲烷50ml、乙醇50ml 并进行搅拌。将氢氧化钾3.88g(69.15mmol，26.5当量)溶解于水40ml之后 进行滴加，然后在30℃下搅拌2天。进行减压浓缩。用1N盐酸进行中和以 达到pH4～5。过滤固体并用水和甲醇进行洗涤。真空干燥固体而获得所需化 合物0.9g(暗褐色固体，63％)。
3-5.5工序化合物的制造-酰胺化(Amidation)(C9-间隔区(Spacer))
加入4工序化合物0.9g(1.64mmol，l当量)、双-2-氧代-3-恶唑烷基次 磷酰氯0.73g(1.64mmol，l当量)、1-羟基苯并三唑0.22g(1.64mmol，l当 量)、实施例1的8工序化合物0.83g(1.64mmol，l当量)、二氯甲烷80ml 并进行搅拌。加入三乙胺0.83g(8.20mmol，5当量)，并搅拌15小时。用 二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取物并进行过滤。对过滤液进行减压浓 缩，并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物1.55g(暗蓝色固体，91％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.64-8.62ppm(1H，d)，8.26-8.22ppm(1H， m)，8.16-8.12ppm(1H，d)，7.76-7.72ppm(2H，d)，7.53-7.52ppm(1H， s)，7.46-7.45ppm(1H，s)，7.41-7.37ppm(2H，d)，7.30-7.16ppm(7H， m)，6.82-6.78ppm(4H，d)，6.68-6.63ppm(2H，d)，6.22-6.18ppm(1H， t)，5.90-5.85ppm(1H，t)，3.98-3.97ppm(3H，s)，3.87-3.86ppm(1H， s)，3.76-3.75ppm(6H，s)，3.57-3.48ppm(4H，m)，3.37-3.36ppm(1H， s)，3.28-3.07ppm(6H，m)，2.66-2.65ppm(3H，s)，2.64-2.60ppm(1H， d)，2.51-2.46ppm(2H，t)，2.11-2.05ppm(2H，t)，1.60-1.43ppm(4H， m)，1.34-1.16ppm(4H，m)
3-6.6工序化合物的制造-琥珀酰化(Succinylation)
加入5工序化合物1.55g(1.50mmol，l当量)、琥珀酸酐0.45g(4.49mmol， 3当量)、N，N-二甲氨基吡啶0.02g(0.15mmol，0.l当量)、吡啶30ml并 在50℃下搅拌20小时。降低温度至常温，并进行减压浓缩。用二氯甲烷进行 提取。用硫酸钠干燥提取物并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，并用色谱 柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1)进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得 所需化合物1.38g(暗紫色固体，81％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.79-8.78ppm(1H，d)，8.40-8.35ppm(1H， dd)，8.27-8.23ppm(1H，d)，7.91-7.87ppm(2H，d)，7.65-7.57ppm(2H， m)，7.43-7.39ppm(2H，d)，7.31-7.19ppm(7H，m)，6.84-6.80ppm(4H， d)，6.75-6.71ppm(2H，d)，6.38-6.37ppm(1H，m)，6.01-6.00ppm(1H， t)，5.21-5.20ppm(1H，s)，4.04-4.03ppm(3H，s)，3.91-3.70ppm(8H， m)，3.50-3.18ppm(9H，m)，2.79-2.65ppm(8H，m)，2.54-2.51ppm(2H， t)，2.15-2.12ppm(2H，t)，1.66-1.49ppm(4，m)，1.35-1.19ppm(4H， m)
3-7.7工序化合物的制造-LCAA-CPG偶合(Coupling)
加入LCAA-CPG 2g、6工序化合物0.18g(0.16mmol，2当量)、双-2- 氧代-3-恶唑烷基次磷酰氯0.07g(0.16mmol，2当量)、1-羟基苯并三唑0.02g (0.16mmol，2当量)、二氯甲烷30ml、三乙胺0.09g(0.88mmol，11当量)。 搅拌20小时。反应完成后，过滤反应液，然后用甲醇进行洗涤。之后，进行 真空干燥而获得所需化合物2g。
3-8.8工序化合物的制造-封端(Capping)
加入7工序化合物2.9g、吡啶40ml、乙酸酐5ml、1-甲基咪唑3.2ml之后， 反应1小时。过滤，并用甲醇进行洗涤。对过滤物进行真空干燥而获得所需 化合物23.5g(蓝色固体)。
<制造例4>-化学式14的化合物(猝灭剂545)的制造
4-1.1工序化合物的制造-胺化(Amination)
加入N-乙基苯胺(N-ethylaniline)10g(83mmol，1当量)、丙烯酸乙酯 12.5g(120mmol，1.5当量)、硝酸铈铵4.5g(8.3mmol，0.1当量)并进行搅 拌。提升温度至60℃并搅拌1天。降低温度至常温，用二氯甲烷进行提取。 用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。减压浓缩提取液并用色谱柱进行分离。减 压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物12.53g(68.2％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.25-7.17(2H，t)，6.71-6.64(3H，m)，4.18-4.09(2H，q)，3.65-3.58(2H，t)，3.41-3.32(2H，q)，2.61-2.54(2H， t)，1.28-1.21(3H，t)，1.17-1.08(3H，t)
4-2.2工序化合物的制造-第一次偶氮偶合(Azo coupling)
加入亚硝基硫酸17.37g(54.67mmol，1.5当量)、盐酸20ml、甲醇20ml 并进行搅拌。降低温度至-78℃并搅拌20分钟。2，5-甲氧基苯胺5g(36.45mmol， 1当量)溶解于甲醇120ml后进行滴加，然后提升温度至室温并搅拌1小时。
滴加溶解于甲醇的1工序化合物8.87g(40.09mmol，l.l当量)之后，搅 拌1小时。用饱和碳酸氢钠水溶液进行中和以达到pH6～8。完成中和后，搅 拌1天。进行减压浓缩去除甲醇。用二氯甲烷进行提取。对过滤液进行减压 浓缩并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物 6.26g(46.5％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.88-7.85(2H，d)，7.44-7.42(1H，s)， 7.17-7.14(1H，d)，6.96-6.93(1H，d)，6.75-6.71(2H，d)，4.20-4.08 (2H，m)，4.00-3.95(3H，s)，3.74-3.69(2H，m)，3.51-3.44(2H，q)， 2.67-2.62(2H，t)，2.34-2.32(3H，s)，1.32-1.19(6H，m)
4-3.3工序化合物的制造-第二次偶氮偶合(Azo coupling)
加入硝酸钠0.79g(11.40mmol，l当量)、磷酸10ml并进行搅拌。降低 温度至0℃搅拌20分钟。加入4-氨基吡啶1.07g(11.40mmol，l当量)。室 温下搅拌30分钟。将2工序化合物4.21g(11.40mmol，l当量)溶解于乙酸 60ml。滴加后，搅拌1小时。加入蒸馏水100ml，用饱和碳酸氢钠水溶液进 行中和以达到pH4～8，之后搅拌1天。用二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥 提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，并用色谱柱进行分离。减压浓 缩之后实施真空干燥而获得所需化合物0.25g(4.6％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.82-8.80(2H，d)，7.93-7.90(2H，d)， 7.74-7.72(2H，d)，7.60-7.58(1H，s)，7.45-7.43(1H，s)，6.76-6.73(2H， d)，4.20-4.13(2H，q)，4.05-4.01(3H，s)，3.77-3.72(2H，t)，3.52-3.47 (2H，q)，2.75-2.73(3H，s)，2.68-2.63(2H，t)，1.30-1.21(6H，m)
4-4.4工序化合物的制造-水解(Hydrolysis)
加入3工序化合物0.25g(0.53mmol，l当量)、甲醇20ml、二氯甲烷20ml 并进行搅拌。加入1N氢氧化钠1.58ml(1.58mmol，3当量)并搅拌3天。进 一步加入1N氢氧化钠1.58ml(1.58mmol，l当量)并搅拌1天之后，进行减 压浓缩。加入蒸馏水100ml并进行搅拌。用1N盐酸进行中和以达到pH4～7。 用二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压 浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物0.24g。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.79-8.77(2H，d)，7.92-7.89(2H，d)， 7.74-7.71(2H，d)，7.59-7.57(1H，s)，7.43-7.41(1H，s)，6.78-6.75(2H， d)，4.05-4.03(3H，s)，3.77-3.75(2H，t)，3.54-3.51(2H，q)，2.75-2.72 (5H，m)，1.27-1.22(3H，t)
4-5.5工序化合物的制造-胺保护化(Amine Protection)
加入6-氨基癸酸15g(114mmol，l当量)、三乙胺48ml(342mmol，3 当量)、甲醇230ml并进行搅拌。加入三氟乙酸乙酯15ml(125mmol，l.l当 量)并搅拌1天。进行减压浓缩。
用乙酸乙酯进行提取。用硫酸镁干燥有机层并进行过滤。对过滤液进行 减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物16.67g(64％)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：11.99-11.97(1H，s)，9.39-9.37(1H， s)，3.20-3.12(2H，q)，2.22-2.16(2H，t)，1.55-1.41(4H，m)，1.31-1.19 (2H，m)
4-6.6工序化合物的制造-NHS酯化(Esterification)
加入5工序化合物5.28g(23.24mmol，l当量)、甲醇120ml、吡啶9.38ml(116.2mmol，5当量)并进行搅拌。加入N-琥珀酸亚胺基三氟乙酸酯8.81g (41.83mmol，1.8当量)并搅拌1天。进行减压浓缩。
用二氯甲烷进行提取。用硫酸镁干燥有机层并进行过滤。对过滤液进行 减压浓缩。进行真空干燥而获得所需化合物7.08g(白色固体，94.8％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：6.80-6.78ppm(1H，s)，3.40-3.32ppm(2H， q)，2.84-2.82ppm(4H，s)，2.64-2.58ppm(2H，t)，1.83-1.73ppm(2H， m)，1.67-1.57ppm(2H，m)，1.52-1.44ppm(2H，m)
4-7.7工序化合物的制造-酰胺化(Amidation)(C6-间隔区(Spacer))和DMT添加
加入6工序化合物1.17g(3.61mmol，l当量)、二甲基甲酰胺6ml、3- 氨基-1，2-丙二醇0.49g(5.42mmol，1.5当量)并搅拌1天。加入二氯甲烷50ml并降低温度至0℃。加入二乙基氯化物1.83g(5.42mmol，l当量)并进 行搅拌。在二氯甲烷10ml中稀释三乙胺3.03ml(21.68mmol，4当量)并进 行滴加。室温下搅拌4小时。进行减压浓缩。用二氯甲烷进行提取。用硫酸 镁干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，并用色谱柱进行分离。 减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物0.92g(41.9％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.55-7.53(1H，s)，7.43-7.39(2H，m)， 7.32-7.15(7H，m)，6.83-6.78(4H，d)，6.17-6.15(1H，s)，3.87-3.85 (1H，m)，3.75-3.73(6H，s)，3.68-3.65(1H，m)，3.53-3.46(1H，m)， 3.32-3.22(2H，m)，3.20-3.09(2H，m)，2.11-2.04(2H，t)，1.61-1.46 (4H，m)，1.33-1.24(2H，m)
4-8.8工序化合物的制造-胺脱保护(Amine Deprotection)
加入7工序化合物0.84g(1.39mmol，l当量)、甲醇5ml并进行搅拌。 滴加氨水(25％)4.26ml(27.8mmol，20当量)并搅拌1天。用二氯甲烷进 行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩之后实施 真空干燥而获得所需化合物0.78g(>100％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.42-7.38(2H，m)，7.31-7.17(7H，m)， 6.83-6.78(4H，d)，6.61-6.59(1H，s)，3.91-3.89(1H，m)，3.76-3.74 (6H，s)，3.54-3.48(2H，m)，3.20-3.09(2H，m)，2.93-2.89(2H，m)， 2.16-2.10(2H，m)，1.70-1.56(4H，m)，1.38-1.31(2H，m)
4-9.9工序化合物的制造-酰胺化(Amidation)(C9-间隔区(Spacer))
加入4工序化合物0.24g(0.54mmol，l当量)、双-2-氧代-3-恶唑烷基次 磷酰氯0.26g(0.59mmol，l.l当量)、1-羟基苯并三唑0.08g(0.59mmol，l.l 当量)、8工序化合物0.3g(0.59mmol，l.l当量)、二氯甲烷100ml并进行 搅拌。加入三乙胺0.37ml(2.69mmol，5当量)并搅拌15小时。进行减压浓 缩。用乙酸乙酯进行提取。用硫酸钠干燥有机层并进行过滤。对过滤液进行 减压浓缩，并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化 合物0.46g(91.1％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.82-8.79(2H，d)，7.91-7.88(2H，d)， 7.74-7.72(2H，d)，7.59-7.57(1H，s)，7.43-7.34(3H，m)，7.30-7.18 (7H，m)，6.82-6.79(4H，d)，6.75-6.72(2H，d)，5.94-5.92(1H，t)，5.83-5.82(1H，t)，4.03-4.01(3H，s)，3.86-3.80(1H，m)，3.77-3.74(6H， s)，3.57-3.44(4H，m)，3.27-3.08(6H，m)，2.76-2.74(3H，s)，2.51-2.40 (2H，t)，2.10-2.05(2H，t)，1.61-1.42(4H，m)，1.31-1.17(5H，m)
4-10.10工序化合物的制造-琥珀酰化(Succinylation)
加入9工序化合物0.46g(0.49mmol，l当量)、琥珀酸酐0.25g(2.46mmol， 5当量)、N，N-二甲氨基吡啶0.03g(0.25mmol，0.5当量)、吡啶35ml并 进行搅拌。提升温度至60℃并搅拌1天。降低温度至常温，并进行减压浓缩。 用二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压 浓缩，并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物 0.03g(5.9％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.83-8.81(2H，d)，7.92-7.89(2H，d)， 7.74-7.73(2H，d)，7.60-7.58(1H，s)，7.43-7.33(3H，m)，7.31-7.17 (7H，m)，6.83-6.80(4H，d)，6.74-6.71(2H，d)，6.45-6.35(1H，s)， 5.31-5.17(1H，s)，4.05-4.03(3H，s)，3.79-3.77(1H，m)，3.76-3.74 (6H，s)，3.48-3.46(4H，m)，3.26-3.18(6H，m)，2.90-2.60(7H，m)， 2.64-2.62(2H，m)，2.53-2.43(2H，m)，1.60-1.28(4H，m)，1.25-1.18 (5H，m)
4-11.11工序化合物的制造-LCAA-CPG偶合(Coupling)
加入LCAA-CPG16.8g、10工序化合物1.14g(1.1mmol，1当量)、双-2- 氧代-3-恶唑烷基次磷酰氯0.5g(1.1mmol，1当量)、1-羟基苯并三唑0.15g (1.1mmol，1当量)、二氯甲烷100ml、三乙胺0.6ml(5.5mmol，5当量)。 常温下反应1天。过滤，并用甲醇进行洗涤。对过滤物进行真空干燥而获得 所需化合物17.16g(紫色固体)。
4-12.12工序化合物的制造-封端(Capping)
加入11工序化合物17.16g、吡啶90ml、乙酸酐3.59ml(38mmol)、1- 甲基咪唑18ml(225mmol)之后，反应1.5小时。过滤，并用甲醇进行洗涤。 对过滤物进行真空干燥而获得所需化合物16.7g。
<制造例5>-化学式17的化合物(猝灭剂530)的制造
5-1.1工序化合物的制造-胺化(Amination)
加入N-乙基苯胺(N-ethylaniline)10g(83mmol，1当量)、丙烯酸乙酯 12.5g(120mmol，1.5当量)、硝酸铈铵4.5g(8.3mmol，0.1当量)并进行搅 拌。提升温度至60℃并搅拌1天。降低温度至常温，用二氯甲烷进行提取。 用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。减压浓缩提取液并用色谱柱进行分离。减 压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物12.53g(68.2％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.25-7.17(2H，t)，6.71-6.64(3H，m)， 4.18-4.09(2H，q)，3.65-3.58(2H，t)，3.41-3.32(2H，q)，2.61-2.54(2H， t)，1.28-1.21(3H，t)，1.17-1.08(3H，t)
5-2.2工序化合物的制造-第一次偶氮偶合(Azo coupling)
加入亚硝基硫酸3.67g(53.12mmol，1.5当量)，降低温度至0℃后搅拌 5分钟。加入磷酸100ml并搅拌20分钟。加入4-氨基吡啶5g(53.12mmol) 并搅拌40分钟。进行中和后，室温下搅拌1天。
用二氯甲烷进行提取。对过滤液进行减压浓缩，并用色谱柱进行分离。 减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物2.07g(25.6％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.70-8.68(2H，d)，7.76-7.73(1H，d)， 7.63-7.61(2H，d)，6.29-6.26(2H，m)，4.41-4.13(2H，br)，3.97-3.95 (3H，s)
5-3.3工序化合物的制造-第二次偶氮偶合(Azo coupling)
加入硝酸钠0.63g(9.07mmol，1.5当量)、磷酸20ml并进行搅拌。降低 温度至0℃搅拌20分钟。将2工序化合物2.07g(9.07mmol，1.5当量)溶解 于乙酸30ml。滴加后，搅拌40分钟。将1工序化合物1.34g(6.05mmol，1 当量)溶解于丙酮20ml后加入。搅拌40分钟。用饱和碳酸氢钠水溶液进行 中和后搅拌1天。用二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。 对过滤液进行减压浓缩，并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥 而获得所需化合物0.11g(3.9％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.80-8.78(2H，d)，7.93-7.90(2H，d)， 7.86-7.83(1H，d)，7.72-7.70(2H，d)，7.60-7.58(1H，s)，7.55-7.52(1H， d)，6.78-6.75(2H，d)，4.21-4.14(5H，m)，3.78-3.73(2H，t)，3.56-3.49 (2H，q)，2.69-2.65(2H，t)，1.30-1.22(6H，m)
5-4.4工序化合物的制造-水解(Hydrolysis)
加入3工序化合物0.07g(0.15mmol，l当量)、甲醇10ml、二氯甲烷10ml 并进行搅拌。加入1N氢氧化钠0.46ml(0.46mmol，3当量)并搅拌1天。再 加入1N氢氧化钠1.58ml(1.58mmol，l当量)并搅拌1天之后，进行减压浓 缩。加入蒸馏水50ml并进行搅拌。用1N盐酸进行中和以达到pH4。用二氯 甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩之 后实施真空干燥而获得所需化合物0.06g(92.8％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.77-8.75(2H，d)，7.90-7.87(2H，d)， 7.83-7.80(1H，d)，7.73-7.71(2H，d)，7.59-7.57(1H，s)，7.53-7.50(1H， d)，6.80-6.77(2H，d)，4.14-4.12(3H，s)，3.79-3.77(2H，t)，3.56-3.53 (2H，q)，2.75-2.71(2H，t)，1.30-1.22(3H，m)
5-5.5工序化合物的制造-胺保护化(Amine Protection)
加入6-氨基癸酸15g(114mmol，l当量)、三乙胺48ml(342mmol，3 当量)、甲醇230ml并进行搅拌。加入三氟乙酸乙酯15ml(125mmol，l.l当 量)并搅拌1天。进行减压浓缩。用乙酸乙酯进行提取。用硫酸镁干燥有机 层并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物 16.67g(64％)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：11.99-11.97(1H，s)，9.39-9.37(1H， s)，3.20-3.12(2H，q)，2.22-2.16(2H，t)，1.55-1.41(4H，m)，1.31-1.19 (2H，m)
5-6.6工序化合物的制造-NHS酯化(Esterification)
加入5工序化合物5.28g(23.24mmol，l当量)、甲醇120ml、吡啶9.38ml(116.2mmol，5当量)并进行搅拌。加入N-琥珀酸亚胺基三氟乙酸酯8.8lg (41.83mmol，1.8当量)并搅拌1天。进行减压浓缩。用二氯甲烷进行提取。 用硫酸镁干燥有机层并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩。进行真空干燥而 获得所需化合物7.08g(白色固体，94.8％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：6.80-6.78ppm(1H，s)，3.40-3.32ppm(2H， q)，2.84-2.82ppm(4H，s)，2.64-2.58ppm(2H，t)，1.83-1.73ppm(2H， m)，1.67-1.57ppm(2H，m)，1.52-1.44ppm(2H，m)
5-7.7工序化合物的制造-酰胺化(Amidation)(C6-间隔区(Spacer))和DMT添加
加入6工序化合物1.17g(3.61mmol，l当量)、二甲基甲酰胺6ml、3- 氨基-1，2-丙二醇0.49g(5.42mmol，1.5当量)并搅拌1天。加入二氯甲烷 50ml后降低温度至0℃。加入二乙基氯化物1.83g(5.42mmol，l当量)并进 行搅拌。在二氯甲烷10ml中稀释三乙胺3.03ml(21.68mmol，4当量)后进 行滴加。室温下搅拌4小时。进行减压浓缩。用二氯甲烷进行提取。用硫酸 镁干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，并用色谱柱进行分离。 减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物0.92g(41.9％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.55-7.53(1H，s)，7.43-7.39(2H，m)， 7.32-7.15(7H，m)，6.83-6.78(4H，d)，6.17-6.15(1H，s)，3.87-3.85 (1H，m)，3.75-3.73(6H，s)，3.68-3.65(1H，m)，3.53-3.46(1H，m)， 3.32-3.22(2H，m)，3.20-3.09(2H，m)，2.11-2.04(2H，t)，1.61-1.46 (4H，m)，1.33-1.24(2H，m)
5-8.8工序化合物的制造-胺脱保护(Amine Deprotection)
加入7工序化合物0.84g(1.39mmol，l当量)、甲醇5ml并进行搅拌。 滴加氨水(25％)4.26ml(27.8mmol，20当量)并搅拌1天。用二氯甲烷进 行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压浓缩，并实施 真空干燥而获得所需化合物0.78g(＞100％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.42-7.38(2H，m)，7.31-7.17(7H，m)， 6.83-6.78(4H，d)，6.61-6.59(1H，s)，3.91-3.89(1H，m)，3.76-3.74 (6H，s)，3.54-3.48(2H，m)，3.20-3.09(2H，m)，2.93-2.89(2H，m)， 2.16-2.10(2H，m)，1.70-1.56(4H，m)，1.38-1.31(2H，m)
5-9.9工序化合物的制造-酰胺化(Amidation)(C9-间隔区(Spacer))
加入4工序化合物0.23g(0.54mmol，l当量)、双-2-氧代-3-恶唑烷基次 磷酰氯0.26g(0.59mmol，l.l当量)、1-羟基苯并三唑0.08g(0.59mmol，l.l 当量)、8工序化合物0.3g(0.59mmol，l.l当量)、二氯甲烷100ml并进行 搅拌。加入三乙胺0.37ml(2.69mmol，5当量)并搅拌15小时。进行减压浓 缩。用乙酸乙酯进行提取。用硫酸钠干燥有机层并进行过滤。对过滤液进行 减压浓缩，并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化 合物0.42g(84.2％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：8.80-8.78(2H，d)，7.93-7.90(2H，d)， 7.86-7.83(1H，d)，7.72-7.70(2H，d)，7.60-7.58(1H，s)，7.55-7.52(1H， d)，7.46-7.38(2H，m)，7.31-7.17(7H，m)，6.82-6.78(4H，d)，6.78-6.75 (2H，d)，6.50-6.44(1H，t)，6.15-6.13(1H，s)，4.04-4.02(3H，s)， 4.00-3.98(3H，s)，3.88-3.86(1H，m)，3.75-3.73(8H，m)，3.55-3.21 (4H，m)，3.23-3.07(4H，m)，2.48-2.46(2H，t)，2.10-2.04(2H，t)， 1.58-1.42(4H，m)，1.29-1.15(5H，m)
5-10.10工序化合物的制造-琥珀酰化(Succinylation)
加入9工序化合物0.46g(0.49mmol，l当量)、琥珀酸酐0.25g(2.46mmol， 5当量)、N，N-二甲氨基吡啶0.03g(0.25mmol，0.5当量)、吡啶35ml并 进行搅拌。提升温度至60℃并搅拌1天。降低温度至常温，并进行减压浓缩。 用二氯甲烷进行提取。用硫酸钠干燥提取液并进行过滤。对过滤液进行减压 浓缩，并用色谱柱进行分离。减压浓缩之后实施真空干燥而获得所需化合物 0.03g(6.7％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：8.77-8.75(2H，d)，7.90-7.87(2H，d)， 7.83-7.80(1H，d)，7.73-7.71(2H，d)，7.59-7.57(1H，s)，7.53-7.50(1H， d)，7.48-7.38(2H，m)，7.32-7.18(7H，m)，6.84-6.80(4H，d)，6.80-6.77 (2H，d)，6.40-6.38(1H，t)，5.93-5.91(1H，t)，5.24-5.22(1H，m)， 4.08-4.06(3H，s)，4.04-4.02(3H，s)，3.91-3.82(2H，m)，3.79-3.77 (8H，m)，3.50-3.46(2H，m)，3.29-3.17(4H，m)，2.72-2.50(6H，m)， 2.05-1.96(2H，t)，1.64-1.49(4H，m)，1.36-1.18(5H，m)
5-11.11工序化合物的制造-LCAA-CPG偶合(Coupling)
加入LCAA-CPG16.8g、10工序化合物1.14g(1.1mmol，1当量)、双-2- 氧代-3-恶唑烷基次磷酰氯(bis-2-oxo-3-oxazolidinylphosphoric chloride)0.5g (1.1mmol，1当量)、1-羟基苯并三唑0.15g(1.1mmol，1当量)、二氯甲 烷100ml、三乙胺0.6ml(5.5mmol，5当量)。常温下搅拌1天。过滤，并用 甲醇进行洗涤。对过滤物进行真空干燥而获得所需化合物18.03g。
5-12.12工序化合物的制造-封端(Capping)
加入11工序化合物18.03g、吡啶90ml、乙酸酐3.59ml(38mmol)、1- 甲基咪唑18ml(225mmol)之后，反应1.5小时。过滤，并用甲醇进行洗涤。 对过滤物进行真空干燥而获得所需化合物15.00g。
上述制造例中制造的生成物的1H NMR分析与相应的结构相一致。
<实施例1>利用寡核苷酸的荧光量测定
为了确认本发明中所使用的猝灭剂的荧光发光量，以10mer的寡核苷酸 (表1)作为模板链，并在3′末端中分别结合BHQ1、BHQ2、猝灭剂570、 猝灭剂630、猝灭剂640，从而合成出寡核苷酸，利用上述合成的寡核苷酸在 200nm-l000nm范围对荧光发光性能进行确定。
为了确认本发明的荧光发光，利用OptizenPOP(分光光度计，美卡希斯 (Mecasys)公司)设备，按照下述顺序进行了反应。
(1)将各个合成的猝灭剂稀释至100pmole/ul，并反应lnmole。
(2)如表2所示，使最终体积达到l00ul，并用分光光度计在 200nm～1000nm范围测定荧光。
表1
碱基序列(5′→3′)
10mer碱基序列 ACG TCA CGG T
表2
猝灭剂(100pmole/ul) 10ul
蒸馏水 最终达到100ul
总体积 100ul
其结果，可确认各猝灭剂发出荧光，将结果示于图1中。
<实施例2>利用猝灭剂570的RT-PCR分析
为了确认用猝灭剂570进行合成的探针在RT-PCR中的性能，以λ噬菌 体DNA(Lambda phage DNA；Bioneer公司)作为模板链，并设计RT-PCR 用引物以及探针(表3)。
上述本发明中使用的探针为25mer，在5'末端用荧光标记FAM、TET、 TAMRA、ROX以及Texas-Red进行标记，并在3'末端用猝灭剂570进行标记。 作为对照组使用如下探针：在5'末端用荧光标记FAM、TET、TAMRA、ROX 以及Texas-Red进行标记，并在3'末端用BHQ1、BHQ2进行标记。
为了本发明的即时定量核酸扩增反应，利用AccuPower DualStarTM RT-PCRPreMix(Bioneer公司)，并利用作为即时基因扩增设备 (Real-TimePCRmachine)的Exicycler(Bioneer公司)设备，按照下述顺序 进行了反应。
(1)准备噬菌体DNA(Lambda DNA、10ng/ul～10pg/ul)10-倍量(10-fold)。
(2)如表4所示，准备每试样总量为20ul。
(3)以表5所示的条件实施RT-PCR。
表3
碱基序列(5′→3′)
正向引物 GGA CTG GCT GAT GAA CTT GTT A
反向引物 GTG GCT GAA ACA GTT GTT GAT T
探针 ATG CAC TGG ATG CAC GTA AAT CCC G
表4
表5
其结果，可确认猝灭剂570具有优异的猝灭性能。
下述表6至表10表示针对上述RT-PCR试验(图2至图6)的各自Ct (循环阈值：cyclethreshold)值。
表6至表10的Ct值是，针对每10-倍量(10-fold)的DNA浓度测定的 循环阈值。使用本发明的猝灭剂的情况下，测定出各DNA浓度具有约3.3的 Ct差，由此可确认其在即时PCR(Real Time PCR)中稳定扩增。因此，可确 认本发明的猝灭剂具有不差于以往的猝灭剂BHQ的猝灭能力。
表6
猝灭剂570/FAM和BHQ1/FAM的Ct比较
表7
猝灭剂570/TET和BHQl/TET的Ct比较
表8
猝灭剂570/TAMRA和BHQl/TAMRA的Ct比较
表9
猝灭剂570/ROX和BHQ2/ROX的Ct比较
表10
猝灭剂570/Texas-Red和BHQ2/Texas-Red的Ct比较
上述的本发明并不限定于上述记述的实施例，本领域技术人员对其可进 行各种变形以及变更，此外还可利用于各种生物学、化学领域中，其包括在 由所附的权利要求书定义的本发明构思以及范围内。

Claims (10)

1.一种猝灭剂，其中，其含有选自于通过下述化学式8至化学式11表示的化合物中的任意一个，
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
2.一种猝灭剂，其中，其含有选自于通过下述化学式13至化学式16表示的化合物中的任意一个，
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
上述化学式13至化学式16中，Y为CPG。
3.一种寡核苷酸，其中，其含有权利要求1或2所述的猝灭剂。
4.如权利要求3所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸含有探针。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸，其中，所述探针含有作为报告体的荧光物质。
6.如权利要求5所述的寡核苷酸，其中，所述荧光物质是选自于由荧光物质系列或者荧光物质系列衍生物所组成的组中的一个以上，所述荧光物质系列包括香豆素、荧光素、罗丹明、氟硼荧和菁。
7.一种核酸检测用组合物，其含有权利要求4所述的寡核苷酸。
8.一种偶氮化合物，其中，其选自于通过下述化学式8至化学式11表示的化合物，
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
9.一种偶氮化合物的制造方法，其包括：
使下述化学式6a的化合物和化学式6b的化合物进行偶氮偶合反应而获得化学式6c的化合物的步骤；
获得上述化学式6c的化合物的步骤之后，使下述化学式6c的化合物和下述化学式6d的化合物进行偶氮偶合反应而获得一个选自于下述化学式8、9所表示的化合物的步骤，
[化学式6a]
[化学式6b]
[化学式6c]
[化学式6d]
并且，上述化学式中，
是或者是
是
[化学式8]
[化学式9]
10.一种偶氮化合物的制造方法，其包括：
使下述化学式6a的化合物和化学式6b的化合物进行偶氮偶合反应而获得化学式6c的化合物的步骤；
使获得的该化学式6c的化合物和下述化学式7a的化合物进行偶氮偶合反应而获得一个选自于下述化学式10、11所表示的化合物的步骤，
[化学式6a]
[化学式6b]
[化学式6c]
[化学式7a]
并且，上述化学式中，
是或者是
是或者是
[化学式10]
[化学式11]
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