KR101717953B1 - 신규 아조화합물, 이의 이용 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 들뜬 에너지준위상태에서 발광현상을 보이는 물질에 대한 소광능력을 갖는 새로운 아조 화합물, 신규 아조화합물을 포함하는 소광자, 이러한 소광자의 이용, 및 아조화합물의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 소광자는 파장의 흡수영역에서 우수한 특성을 나타낸다.

Description

신규 아조화합물, 이의 이용 및 이의 제조방법{New azo compound, use thereof, and process for preparing of the same}
본 발명은 새로운 아조화합물, 상기 아조화합물을 포함하는 신규 소광자, 상기 소광자의 이용 및 상기 아조화합물의 제조방법에 관한 것이다.
형광공명에너지전달(FRET)에 관한 소광현상은 빛에 의해 들뜬 에너지준위상태가 된 리포터인 에너지공여체가 근접한 거리에 있는 소광자인 에너지수용체에 에너지가 전이되는 현상이다(J.R.Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, 1999, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York). 이 때 에너지 전이효율은 리포터와 소광자 사이의 거리와 깊은 연관이 있으며, 전이효율은 리포터와 소광자 사이 거리의 6승에 반비례한다. 그러므로 이 두 사이의 거리가 일정이상 떨어지면 형광공명에너지전달(FRET) 소광현상은 일어나지 않는다.
형광공명에너지전달 소광현상의 한 예로서, 탐라(TAMRA)형광물질을 에너지수용체 즉, 소광자로 쓴다면 에너지공여체에서의 발광에너지는 에너지수용체의 흡광 영역 내에서 흡수되어진다. 흡수된 에너지는 들뜬 에너지준위상태가 되어 에너지수용체의 발광영역 내에서 발광한다.
이와 같은 소광현상은 아조화합물로 이루어진 소광자인 경우에서도 에너지전이과정은 동일하다. 그러나 에너지수용체인 소광자에서의 발광현상은 일어나지 않는다. 이 전이과정에서의 아조화합물과 같은 소광자는 열이나 다른 작용으로 발광 대신 에너지를 방출된다는 점이 앞의 물질과 다른 점이다. 이러한 아조 화합물과 같은 소광자를 다크소광자(Dark quencher)라고 부른다. 다크소광자는 에너지 전이시 빛이 아닌 열로 에너지를 방출하기 때문에, 형광을 가지지 않는 염료이다. 형광을 내는 소광자는 분석시 소광자와 리포터의 형광 스펙트라가 겹칠 수 있기 때문에 배경 노이즈를 증가시킬수 있다. 그러나 다크소광자는 형광스펙트라가 없어 노이즈가 없기 때문에 이러한 단점에 대한 해결책을 제공해준다. 또한 다크소광자는 두개 이상의 리포터-소광자의 프로브를 함께 사용할 수 있는 이점을 제공해준다.
다크소광자의 구조를 갖는 대표적인 화합물로 BHQ 소광자 유도체인 BHQ1, BHQ2 및 BHQ3가 대표적이다(WO2001/086001A1). 이들 소광자는 전자주게 물질인 디알킬아닐린과 전자받게 성질을 갖고 있는 아로마틱 물질과의 디아조결합으로 이루어져 있고 대략 500 에서 700 nm 의 파장영역에서 형광을 흡수한다. 그러나 염의 구조를 갖고 있는 소광자의 경우 올리고 합성과 정제과정 시 불안정한 모습을 보이는데, BHQ3가 한 예이다.
그 외에 BBQ 소광자(WO2006/084067A2)와 큐논계열의 소광자인 아이오화블랙소광자(US7504495B2)를 들 수 있다. 그러나 이들 소광자들은 상기의 BHQ 소광자보다 파장 흡수 능력이 떨어진다.
한편 소광자는 형광물질과 연결하여 화학 또는 생물학 분야에서 주로 사용된다. 원하는 분자, 단백질, 핵산을 검출하기 위해서 그와 상보적으로 결합할 수 있는 분자들과 소광자, 그리고 형광물질을 연결하여 형광의 발광 정도를 측정하여 목적하는 물질이 존재하는지 판단할 수 있다. 이는 화학 및 생물학 영역에 진보적인 발달에 큰 역할을 하고 있다. 생물학 영역에서 형광공명에너지전달이론을 가장 잘 응용한 분야는 실시간 중합효소연쇄반응 (Real Time Polymerase Chaine Raction, RT-PCR)에서의 프로브 사용이다. 프로브란 염기서열 등의 특정 부위를 검출하는데 사용하는 것으로서, 최근에는 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)에서 많이 사용되고 있다.
프로브의 종류는 택맨(TaqMan) 프로브와 분자비이콘(Molecular Beacon) 프로브 등이 있다. 택맨 프로브는 한쪽 끝에는 리포터(에너지공여체)를 붙이고 반대쪽 끝에는 소광자를 붙인 프로브이다. 중합효소연쇄반응의 진행 시, 리포터가 소광자의 영향으로부터 벗어나면서 리포터 고유의 형광을 낸다. 형광의 양은 중합효소연쇄반응이 많이 진행될수록 비례적으로 증가한다. 이 형광의 양을 정량화하여 간접적인 측정수단으로 이용한다. 분자비이콘 프로브는 헤어핀모양으로 스템과 루프로 구성되어있다. 중합효소연쇄반응 진행에 따라 특정부위에 분자비이 콘프로브가 붙으면, 구조가 풀리면서 소광자의 영향권에서 벗어나 형광을 발산한다.
소광자는 형광공명에너지전달이론의 소광현상에 의거하여 프로브 안에서 리포터와의 에너지전이를 설명할 수 있다. 따라서 프로브에서 리포터와 소광자의 관계는 프로브의 성능에 중요한 역할을 한다. 소광자가 프로브에 함께 연결된 리포터의 다양한 파장 영역을 흡수한다면 사용할 수 있는 형광물질의 한계가 없어지고, 더욱 검침이 용이하고 뛰어난 프로브를 제작할 수 있다. 즉, 소광자가 파장을 흡수하는 범위가 넓어진다면 소광자를 다양한 형광염료와 연결하여 프로브를 만들 수 있게 될 것이다.
이에 본 발명자들은, 더욱 효율이 좋은 소광자를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 새로운 아조 화합물을 가지는 소광자가 소광자로서 우수한 성질을 가지는 것을 확인하고서 본 발명을 완성하게 되었다.
국제공개공보 WO 2001-086001A1 (2001년 11월 15일 공개) 국제공개공보 WO 2006-084067A2 (2006년 08월 10일 공개) 미국등록특허공보 US 2005-0227254A (2005년 10월 13일 공개)
본 발명의 목적은 새로운 아조화합물 및 상기 아조화합물을 포함한 신규 소광자를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 소광자를 포함한 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규 아조화합물 및 상기 아조화합물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 소광자를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112013070113112-pat00001
상기 화학식 1에서,
A1은 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 가지며;
A2는 치환된 또는 비치환된 C6-C12의 아릴렌기, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C12의 헤테로 아릴렌기이며;
A3는 치환된 또는 비치환된 C6-C30의 아릴기, 또는 치환된 또는 비치환된 C3-C30의 헤테로아릴기이다.
[화학식 2]
Figure 112013070113112-pat00002
상기 화학식 2에서,
Z1 내지 Z4는 서로 독립적으로 CR1 또는 질소이고;
R1은 수소, 할로겐, C1-C10의 알콕시기, 나이트로기, 시아노기 또는 설포닐기이며;
X1은 CH2, NH, 황 또는 산소이고, X2는 CH 또는 질소이다.
[화학식 3]
Figure 112013070113112-pat00003
상기 화학식 3에서,
Z5 내지 Z9은 서로 독립적으로 CR2 또는 질소이고;
R2는 수소, 하이드록시기, C1-C10의 알콕시기, NR9R10, C1-C10의 알킬기, C1-C10의 카르복시기, 또는 할로겐이며;
R9 및 R10은 서로 독립적으로 수소 또는 C1-C10의 알킬기이다.
상기 화학식 1에서 A2는 하기 화학식 4의 구조를 가지는 것이 바람직하다.
[화학식 4]
Figure 112013070113112-pat00004
상기 화학식 4에서,
Z10 내지 Z13은 서로 독립적으로 CR3 또는 질소이고;
R3 는 수소, 하이드록시기, C1-C10의 알콕시기, NR11R12, C1-C10의 알킬기, C1-C10의 카르복시기, C6-C30의 아릴옥시기, 또는 할로겐이며;
R11 및 R12 은 서로 독립적으로 수소 또는 C1-C10의 알킬기이다.
또한 상기 화학식 1에서, A3는 하기 화학식 5의 구조를 가지는 것이 바람직하다.
[화학식 5]
Figure 112013070113112-pat00005
상기 화학식 5에서,
Z14 내지 Z17 은 서로 독립적으로 CR4 또는 질소이고;
R4는 수소, 하이드록시기, C1-C10의 알콕시기, NR13R14, C1-C10의 알킬기, C1-C10의 카르복시기, 또는 할로겐이고;
R13 및 R14은 서로 독립적으로 수소 또는 C1-C10의 알킬기이고;
Z18은 CH 또는 질소이고;
L1 및 L2는 서로 독립적으로 수소, C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기, 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기로 치환된 C1-C30의 알킬기, C1-C30의 카르복실기, C1-C30의 카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기 또는 C3-C30의 헤테로 아릴이다.
본 발명의 다른 목적을 위해, 본 발명은 상기의 소광자를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적을 위해, 본 발명은 신규 아조화합물 및 아닐린에서 첫번째 아조커플링 반응과 두번째 커플링반응을 순차적으로 수행하는 단계를 포함하는 상기의 아조화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 새로운 아조화합물로 구성된 소광자는 강하고 넓은 흡수영역을 갖고 있어, 기존의 소광자에 비해 더 넓은 형광파장에서 소광작용을 한다. 따라서 본 발명의 소광자는 에너지공여체로서 더 다양한 형광염료 (fluorophore)의 사용을 가능하게 한다. 또한 본 발명에 따른 소광자는 올리고머와 합성 및 정제과정에서 안정성을 가진다. 생물학적, 화학적 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 아조화합물의 제조방법은 종래 헤테로 사이클 구조를 세 개 이상 포함하는 아조화합물은 쉽게 합성할 수 없었던 한계를 극복하여, 합성이 쉽지 않은 헤테로 사이클 구조가 세 개 이상 포함되는 아조화합물들을 용이하게 합성할 수 있게 한다.
도 1은 각 소광자들의 형광 발광량(emission intensity)을 보여주는 그래프이다.
도 2는 형광물질로 FAM을 사용하고 소광자로는 본 발명의 소광자인 소광자570 및 BHQ1로 각각 합성된 프로브가 실시간(real-time)-PCR에서 측정되는 것을 보여주는 그래프이다. 그래프에서 가로축은 cycle, 세로축은 형광강도(fluorescence intensity)를 가리킨다(이는 이하 하기 도 3 내지 도 6에서도 모두 동일하다).
도 3은 형광물질로 TET를 사용하고 소광자로는 본 발명의 소광자인 소광자570 및 BHQ1 로 각각 합성된 프로브가 실시간(real-time)-PCR에서 측정되는 것을 보여주는 그래프이다.
도 4는 형광물질로 TAMRA를 사용하고 소광자로는 본 발명의 소광자인 소광자570 및 BHQ1로 각각 합성된 프로브가 실시간(real-time)-PCR에서 측정되는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5는 형광물질로 ROX를 사용하고 소광자로는 본 발명의 소광자인 소광자570 및 BHQ2로 각각 합성된 프로브가 실시간(real-time)-PCR에서 측정되는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6은 형광물질로 Texas-Red를 사용하고 소광자로는 본 발명의 소광자인 소광자570 및 BHQ2로 각각 합성된 프로브가 실시간(real-time)-PCR에서 측정되는 것을 보여주는 그래프이다.
이하에서 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아조화합물을 포함하는 소광자를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112013070113112-pat00006
상기 화학식 1에서,
A1은 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 가지며;
A2는 치환 또는 비치환된 C6~C12의 아릴렌기, 또는 치환된 또는 비치환된 C4~C12의 헤테로 아릴렌기이며;
A3는 치환 또는 비치환된 C6~C30의 아릴기, 또는 치환된 또는 비치환된 C3~C30의 헤테로아릴기이다.
상기 '치환'은 비치환된 치환기에 더 치환되는 경우를 뜻하며, 그 치환기는 중수소, 할로겐, (C1-C30)알킬, 할로겐이 치환된 (C1-C30)알킬, (C6-C30)아릴, (C3-C30)헤테로아릴, (C6-C30)아릴이 치환된 (C5-C30)헤테로아릴, (C3-C30)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 트리(C1-C30)알킬실릴, 트리(C6-C30)아릴실릴, 디(C1-C30)알킬(C6-C30)아릴실릴, (C1-C30)알킬디(C6-C30)아릴실릴, (C2-C30)알케닐, (C2-C30)알키닐, 시아노, 카바졸릴, 디(C1-C30)알킬아미노, 디(C6-C30)아릴아미노, (C1-C30)알킬(C6-C30)아릴아미노, 디(C6-C30)아릴보로닐, 디(C1-C30)알킬보로닐, (C1-C30)알킬(C6-C30)아릴보로닐, (C6-C30)아르(C1-C30)알킬, (C1-C30)알킬(C6-C30)아릴, (C1~C30)알킬옥시, (C6-C30)아릴옥시, 카르복실, 니트로 및 히드록시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 의미한다.
[화학식 2]
Figure 112013070113112-pat00007
상기 화학식 2에서,
Z1 내지 Z4는 서로 독립적으로 CR1 또는 질소이고;
R1은 수소, 할로겐, C1-C10 -의 알콕시기, 나이트로기, 시아노기 또는 설포닐기이며;
X1은 CH2, NH, 황 또는 산소이고, X2는 CH 또는 질소이다.
[화학식 3]
Figure 112013070113112-pat00008
상기 화학식 3에서,
Z5 내지 Z9은 서로 독립적으로 CR2 또는 질소이고;
R2는 수소, 하이드록시기, C1-C10의 알콕시기, NR9R10, C1-C10의 알킬기, C1-C10의 카르복시기, 또는 할로겐이며;
R9 및 R10은 서로 독립적으로 수소 또는 C1-C10의 알킬기이다.
상기 화학식 1에서, A2는 하기의 화학식 4로 표시되는 구조를 가지는 것이 바람직하다.
[화학식 4]
Figure 112013070113112-pat00009
상기 화학식 4에서,
Z10 내지 Z13은 서로 독립적으로 CR3 또는 질소이고;
R3 는 수소, 하이드록시기, C1-C10의 알콕시기, NR11R12, C1-C10의 알킬기, C1-C10의 카르복시기, 또는 할로겐이며;
R11 및 R12은 서로 독립적으로 수소, 또는 C1-C10의 알킬기이다.
상기 화학식 1에서, A3는 하기의 화학식 5로 표시되는 구조를 가지는 것이 바람직하다.
[화학식 5]
Figure 112013070113112-pat00010
상기 화학식 5에서,
Z14 내지 Z17은 서로 독립적으로 CR4 또는 질소이고;
R4는 수소, 하이드록시기, C1-C10의 알콕시기, NR13R14, C1-C10의 알킬기, C1~C10의 카르복시기, 또는 할로겐이고;
R13 및 R14은 서로 독립적으로 수소 또는 C1-C10의 알킬기이고;
Z18 은 CH 또는 질소이고;
L1 및 L2는 서로 독립적으로 수소, C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기, 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기로 치환된 C1-C30의 알킬기, C1-C30의 카르복실기, C1~C30의 카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기 또는 C3-C30의 헤테로 아릴이다.
상기 화학식 5로 표시되는 A3를 포함하는 소광자는 상기 L1 또는 L2 중에서 선택되는 어느 하나와 링커(linker)에 의해 연결되는 지지체(cleavable support)를 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 소광자는 보호기로서 DMT(4,4′-dimethoxytrityl group) 또는 그의 유사체로 보호되는 하이드록시기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 지지체는 핵산 또는 폴리펩티드 등이 소광자와 연결되어 합성되는 것을 도와주는 고체상 물질을 의미하는 것으로, 소광자와 올리고머와의 결합에서 3´쪽 끝을 고정하여 올리고사슬의 합성을 더욱 용이할 수 있게 해준다. 상기 지지체는 레진, 고체 지지체, 고체상 등의 동일한 역할을 하는 것을 지칭하는 것을 모두 포함한다. 상기 지지체는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플르오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시, 폴리아크릴아미드, 또는 이들의 공중합체(co-polymer)들로 구성될 수 있으며, 유리, 실리카, CPG, reverse-phase 실리카로 구성될 수 있다. 바람직하게는 CPG(controlled pore glass) 또는 폴리스티렌에서 선택될 수 있다.
본 발명의 링커는 단지 소광자와 다른 물질을 연결해주는 역할이 주목적인 것으로, 이러한 역할을 하는 것들은 모두 본 발명의 링커가 될 수 있다. 본 발명의 링커의 일례로 1 내지 6개가 연결되어 있는 에틸렌글리콜이나 탄소체인을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 링커는 반응의 작용기나 형광 및 소광작용에 미치는 영향이 거의 없거나 미미하다.
또한 상기 소광자 내의 반응성을 가지는 작용기는 DMT(dimethoxytrityl group), MMT(Monomethoxytrityl group), 트리틸기(trityl), 치환된 트리틸기, pixyl group, 및 트리알킬실릴기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 보호기에 의해 보호될 수 있다. 이 중 DMT가 바람직하다. 본 발명의 하이드록시기는 DMT에 의해 결합될 수 있다. 올리고 합성시, DMT를 제거한 후 원하는 올리고머를 합성할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 바람직하게는 화학식 6 또는 7로부터 선택되는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 6]
Figure 112013070113112-pat00011
[화학식 7]
Figure 112013070113112-pat00012
Z18은 CH, 또는 질소이고;
L1 및 L2는 서로 독립적으로 수소, C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기, 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기로 치환된 C1-C30의 알킬기, C1-C30의 카르복실기, C1-C30의 카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기 또는 C3-C30의 헤테로 아릴이며;
R15 내지 R18은 서로 독립적으로 H, C1-C10의 알콕시기 또는 C1-C10의 알킬기이다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 보다 바람직하게는 하기 화학식 8 내지 12로 표시되는 화합물 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 8]
Figure 112013070113112-pat00013
[화학식 9]
Figure 112013070113112-pat00014
[화학식 10]
Figure 112013070113112-pat00015
[화학식 11]
Figure 112013070113112-pat00016
[화학식 12]
Figure 112013070113112-pat00017
상기 화학식 8 내지 12로 표시되는 화합물 중 어느 하나를 포함하는 소광자는 올리고머와의 합성을 위해 링커 및 지지체와 연결된 구조를 추가로 포함할 수 있다. 이 때 링커는 카르복시기를 아민화시켜서 연결할 수 있다(제조예 참조). 지지체는 CPG(controlled pore glass) 또는 폴리스티렌이 바람직하며, 보다 바람직한 것은 CPG이다.
또한 상기 소광자는 작용기를 더욱 추가하여 포함할 수 있으며, 이러한 작용기는 리포터와 소광자의 역할에 영향을 주지 않는 것으로 선택된다. 작용기는 올리고머와 더욱 효율적으로 연결할 수 있는 역할을 제공한다. 따라서 상기 소광자는 이러한 올리고머 합성을 위해 올리고머와 반응이 가능한 작용기를 DMT 또는 그의 유도체에 의해 보호시킬 수 있으며, 그리고 지지체와 연결되는 중간체(intermediate)구조를 포함할 수 있는 것이다.
본 발명에 따른 상기 소광자들은 올리고머 합성을 위해 아래의 화학식 13 내지 17의 구조로 표시되는 화합물을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
[화학식 13]
Figure 112013070113112-pat00018
[화학식 14]
Figure 112013070113112-pat00019
[화학식 15]
Figure 112013070113112-pat00020
[화학식 16]
Figure 112013070113112-pat00021
[화학식 17]
Figure 112013070113112-pat00022
보다 바람직하게는
상기 화학식 13 내지 17에서, Y는 지지체로서 CPG(controlled pore glass) 또는 폴리스티렌(polystyrene)에서 선택될 수 있으며, 이 중 CPG가 바람직하다.
화학식 13 내지 17의 구조를 포함하는 소광자는 화학식 8 내지 12에 각각 링커에 의해 지지체가 연결되어 있고, 하이드록시기는 DMT로 보호된다. 이는 올리고머와의 연결을 위한 바로 전단계로 반응에 특이적인 올리고머를 합성하여 상기의 소광자와 연결하여 다양한 화학 및 생물학의 연구에 응용할 수 있다.
본 발명에서는 화학식 13의 구조를 포함하는 소광자를 소광자570 , 화학식 14의 구조를 포함하는 소광자를 소광자545, 화학식 15의 구조를 포함하는 소광자를 소광자630, 화학식 16의 구조를 포함하는 소광자를 소광자640, 화학식 17의 구조를 포함하는 소광자를 소광자530 명명하였다. 이하 하기의 실시예 및 도면에서 사용된 ‘소광자000’ 는 각각 본 발명의 소광자들을 가리키는 것이다.
본 발명의 일실시예에서 소광자570, 소광자630, 및 소광자640 과 기존의 공지된 소광자인 BHQ1, 및 BHQ2 의 형광 발광량을 측정해 본 결과, 본 발명에 따른 소광자들은 공지된 소광자 BHQ 보다 더 넓은 파장 범위에서 형광을 흡수할 수 있음을 보여주었다(도 1 참조). 특히 소광자570은 기존의 한 소광자의 형광 파장 범위에 대한 소광작용의 범위에 비해 상대적으로 더 넓은 형광파장영역에서 소광작용을 하는 소광능력을 가지고 있어, 종래 BHQ1 및 BHQ2의 소광범위를 소광자570만으로도 소광이 가능할 수 있게 한다. 이는 본 발명에 따른 소광자는 형광물질의 에너지수용체로서, 전자주게와 전자받게 작용기의 효율적인 배치로 인해 강하고 넓은 흡수영역이 가능해져 소광자의 기능을 효율적으로 수행할 수 있음을 나타낸다.
또한 본 발명의 다른 양상은 상기 소광자를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 소광자는 올리고뉴클레오티드에 결합하여 생물학적 분석, 또는 화학적 분석에 사용될 수 있다. 이러한 분석의 목적에 따라 상기 올리고뉴클레오티드는 적절하게 변형이 가능하다.
상기 올리고뉴클레오티드는 1 내지 수백개의 뉴클레오티드의 폴리머를 의미하는 것으로, DNA, RNA, 또는 PNA를 모두 포함한다. 또한 이들의 유사체들, 예를 들어 상기 뉴클레오티드에 화학적 변경이 가해진 것, 또는 당이 결합된 것들 등 통상의 기술자가 용이하게 변형을 가할 수 있는 것들을 모두 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 된 것을 모두 포함하는 것을 의미한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 프로브를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는 타겟이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 프로브는 핵산, 펩타이드, 사카라이드, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 항체 또는 이들의 조합에서 선택된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한 상기 프로브는 형광물질을 포함하는 것이 바람직하다. 포함되는 형광물질은 쿠마린(Coumarin), 플루오레세인(Fluorescein), 로다민(Rhodamine), BODIPY, 사이아닌(Cyanine)등으로 구성되는 형광물질계열 또는 이들 형광물질계열의 유도체에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 소광자는 파장의 흡수범위가 넓기 때문에, 리포터로서 다양한 형광물질의 사용을 가능하게 할 수 있으며, 상기 형광물질들에 한정되지 않는다.
이러한 올리고뉴클레오티드는 화학적, 생물학적 영역에서 다양하게 활용할 수 있다. 특히 실시간 중합효소연쇄반응 또는 마이크로어세이(microassay)등에서 유용하게 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이에 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 검출용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 표적 핵산에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하여, 표적 핵산을 특이적으로 검출할 수 있다. 또한 상기 조성물은 통상의 기술자가 자명하게 채택 가능한 검출용 조성물에 포함될 수 있는 조성을 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 프로브를 이용하여 목적하는 핵산이나 단백질을 탐침할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 이러한 방법은 본 발명에 따른 프로브와 목적하는 물질을 가지고 있는 샘플을 접촉하는 단계와, 형광량을 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명은 하기 화학식 6 또는 화학식 7에서 선택되는 신규 아조화합물을 제공한다.
[화학식 6]
Figure 112013070113112-pat00023
[화학식 7]
Figure 112013070113112-pat00024
상기 화학식에서,
Z18는 CH 또는 질소이고;
L1 및 L2는 서로 독립적으로 수소, C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기, 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기로 치환된 C1-C10의 알킬기, C1-C30의 카르복실기, C1-C30의 카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기 또는 C3-C30의 헤테로 아릴이며;
R15 내지 R18은 서로 독립적으로 H, C1-C10의 알콕시기 또는 C1-C10의 알킬기이다.
또한 본 발명은 3개 이상의 헤테로고리를 포함하는 아조화합물의 제조방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 하기 화학식 6과 화학식 7로 표시되는 아조화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 하기 화학식 6으로 표시되는 아조화합물의 제조방법은
하기 화학식 6a의 아닐린과 화학식 6b를 아조커플링 반응을 하여 화학식 6c의 화합물을 얻는 단계;
상기 화학식 6c의 화합물을 얻는 단계 이후에, 하기 화학식 6c와 하기 화학식 6d를 아조커플링 반응을 하여 화학식 6을 얻는 단계를 포함한다.
[화학식 6a]
Figure 112013070113112-pat00025
[화학식 6b]
Figure 112013070113112-pat00026
[화학식 6c]
Figure 112013070113112-pat00027
[화학식 6d]
Figure 112013070113112-pat00028
[화학식 6]
Figure 112013070113112-pat00029

또한 본 발명에 따른 하기 화학식 7의 구조를 가진 아조화합물의 제조방법은 상기 화학식 6c의 화합물을 얻는 단계 이후에, 화학식 6c와 하기 화학식 7a를 아조커플링 반응을 하여 화학식 7을 얻는 단계를 포함한다.
[화학식 7a]
Figure 112013070113112-pat00030
[화학식 7]
Figure 112013070113112-pat00031
상기 화학식에서,
Z18는 CH 또는 질소이고;
L1 및 L2는 서로 독립적으로 수소, C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기, 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기, C6-C30의 아릴기로 치환된 C1-C10의 알킬기, C1-C30의 카르복실기, C1-C30의 카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기 또는 C3-C30의 헤테로 아릴이며;
R15 내지 R18은 서로 독립적으로 H, C1-C10의 알콕시기 또는 C1-C10의 알킬기이다.
종래 3개 이상의 헤테로 고리를 포함하는 아조 화합물을 합성하기가 용이하지 않았으며, 이에 따라 3개 이상의 헤테로 고리를 포함하는 아조화합물이 구체적으로 개시된 예가 드물다.
본 발명에 따른 아조화합물의 제조방법은 3개 이상의 헤테로 고리를 포함하는 아조화합물에 대한 합성을 특징으로 하는 것으로, 본 발명에 따르면, 시작화합물인 아닐린에서 첫번째 아조 커플링 반응을 진행한 후, 두번째 아조 커플링 반응을 진행하는 공정을 가지는 것을 특징으로 하는 3개 이상의 헤테로 고리를 포함하는 아조화합물의 제조방법을 제공한다.
기존의 공지방법인 아닐린에 연결된 두개의 헤테로 고리화합물을 먼저 연결하고, 연결된 두개의 헤테로 고리 화합물을 아닐린에 아조 커플링 반응에 의해 연결하는 방법은 실질적으로 합성하는데 있어서 용이하지 않다.
이에 본 발명은 세 개 이상의 헤테로 고리를 포함하는 아조화합물을 용이하게 합성할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 아조 화합물의 제조방법은 두번의 커플링 반응을 순차적으로 진행하는 것을 특징으로 한다.
종래에는 전자끄는기(EWG, electron withdrawing group)를 사용하는 합성법이 공지되어 있었으나, 강력한 전자끄는기를 도입하게 되면 2차 결합시 반응성이 현저히 떨어져 반응의 진행이 쉽지 않은 한계점을 가진다. 따라서 아조 결합을 통한 소광자 화합물을 합성시, 1차 아조 결합을 통해 합성된 아조 화합물이 강한 전자끄는기를 갖고 있으면 전자끄는기의 강한 전자끄는 작용으로 인해 1차 아조 화합물의 염기도가 떨어진다. 이와 같은 이유로 2차 아조 결합시, 반응의 진행이 힘들어진다. 이에 대한 해결책으로 본 발명의 아조 화합물의 제조방법은 1차 아조결합에서 전자주는기를 갖고 있는 화합물로 반응을 진행시킨다. 암모늄염과 아조늄염과의 경쟁반응에서 아조늄염의 생성을 우세하게 하기 위해, 반응 속도의 조절과 적절한 용매의 선택이 고려되어야 한다. 그리고 나서, 강한 전자끄는기를 갖고 있는 화합물과 2차 아조결합을 진행한다. 1, 2차 아조 결합의 반응성을 높이기 위해, 온도, 용매, pH 등과 같은 반응 조건을 효율적으로 조절해서 반응성을 극대화시킨다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 전자주는기로부터 합성을 시작하고 최종 전자끄는기를 2차 아조 결합을 도입하므로서 강력한 전자끄는기를 도입한 소광자를 최종 합성할 수 있었다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실시예를 제시한다. 하기 제조예 및 실시예는 이해를 돕기 위하여, 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
< 제조예1 >- 화학식 13의 화합물( 소광자570 )의 제조
Figure 112013070113112-pat00032
Figure 112013070113112-pat00033
Figure 112013070113112-pat00034

1-1. 1공정화합물의 제조- 아민화 ( Amination )
엔-에틸아닐린 30g (250mmol, 1eq), 에틸아크릴레이트 37.2g (370mmol, 1.5eq), 세륨(Ⅳ) 암모늄 나이트레이트 13.57g (25mmol, 0.1eq)을 투입하고 교반한다. 60℃로 온도를 올려서 15시간 동안 교반한다. 상온으로 온도를 내리고, 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 47g (노란색 액체, 85.8%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 7.27~7.20ppm (2H, t), 6.73~6.67ppm (3H, m),4.20~4.11ppm (2H, q), 3.67~3.61ppm (2H, t), 3.43~3.35ppm (2H, q), 2.63~2.57ppm (2H, t), 1.31~1.24ppm (3H, t), 1.19~1.14ppm (3H, t)
1-2. 2공정화합물의 제조- 첫번째 아조커플링 ( Azo Coupling )
니트로실썰퍼릭엑시드 10.37g (32.64mmol, 1eq), 염산 50ml, 메탄올 150ml를 투입하고 교반한다. -78℃로 온도를 내려서 20분동안 교반한다. 2,5-메톡시아닐린 5g (32.64mmol, 1eq)을 메탄올 100ml에 녹여서 적가한 후, 실온으로 올려 2시간동안 교반한다.
메탄올에 녹인 1공정화합물 7.95g (35.91mmol, 1.1eq)을 적가한 후, 1시간동안 교반한다. 포화 쏘듐하이드로카보네이트 수용액으로 pH 6~8이 될 때까지 중화한다. 중화가 완료되고, 15시간동안 교반한다. 감압농축하여 메탄올을 제거한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 5.87g (주황색 액체, 46.7%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 7.90~7.86ppm (2H, d), 7.27~7.25ppm (1H, s), 7.01~6.93ppm (2H, m), 6.75~6.72ppm (2H, d), 4.20~4.12ppm (2H, q), 3.99~3.97ppm (3H, s), 3.84~3.82ppm (3H, s), 3.75~3.69ppm (2H, t), 3.50~3.44ppm (2H, q), 2.67~2.61ppm (2H, t), 1.30~1.18ppm (6H, m)
1-3. 3공정화합물의 제조- 두번째 아조커플링( Azo Coupling )
쏘듐나이트레이트 1.05g (15.23mmol, 1eq), 포스포릭엑시드 150ml를 투입하고 교반한다. 0℃로 온도를 내려서 20분동안 교반한다. 4-아미노피리딘 1.43g (15.23mmol, 1eq)을 투입한다. 실온에서 30분동안 교반한다. 2공정화합물 5.87g (15.23mmol, 1eq)을 아세틱엑시드 50ml에 녹인다. 적가한 후, 1시간동안 교반한다. 증류수 200ml를 투입하고, 포화 쏘듐하이드로카보네이트수용액으로 pH 4~8이 될 때까지 중화한 후, 15시간동안 교반한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 1.6g (어두운 보라색 고체, 21.4%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.81~8.78ppm (2H, d), 7.96~7.92ppm (2H, d), 7.74~7.71ppm (2H, d), 7.50~7.48ppm (1H, s), 7.47~7.45ppm (1H, s), 6.77~6.74ppm (2H, d), 4.22~4.14ppm (2H, q), 4.10~4.08ppm (3H, s), 4.06~4.04ppm (3H, s), 3.79~3.73ppm (2H, t), 3.54~3.48ppm (2H, q), 2.70~2.64ppm (2H, t), 1.31~1.21ppm (6H, m)
1-4. 4공정화합물의 제조- 가수분해( Hydrolysis )
3공정화합물 1.49g (3.04mmol, 1eq), 메탄올 200ml, 메틸렌클로라이드 200ml를 투입하고 교반한다. 1N 쏘듐하이드록사이드 9.11ml (9.11mmol, 3eq)를 투입하고, 3일동안 교반한다. 1N 쏘듐하이드록사이드 3.04ml (3.04mmol, 1eq)를 추가투입하고, 1일동안 교반한 후, 감압농축한다. 증류수 400ml 투입하여 교반한다. 1N 염산로 pH 6~8이 될 때까지 중화한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액을 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 1.9g (어두운 보라색 고체)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.77~8.74ppm (2H, d), 7.93~7.89ppm (2H, d), 7.76~7.73ppm (2H, d), 7.47~7.45ppm (1H, s), 7.45~7.43ppm (1H, s), 6.80~6.76ppm (2H, d), 4.09~4.07ppm (3H, s), 4.05~4.03ppm (3H, s), 3.83~3.77ppm (2H, t), 3.59~3.51ppm (2H, q), 2.76~2.70ppm (2H, t), 1.29~1.23ppm (3H, t)
1-5. 5공정화합물의 제조-아민 보호화( Amine Protection )
6-아미노카프릭엑시드 10g (76.2mmol, 1eq), 트리에틸아민 31.8ml (228.6mmol, 3eq), 메탄올 76ml를 투입하고 교반한다. 에틸트리플루오로아세테이트 11.9g (83.76mmol, 1.1eq)을 투입하고, 15시간동안 교반한다. 감압농축한다. 에틸아세테이트로 추출한다. 유기층을 마그네슘썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 16.9g (98.0%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, DMSO-d6)： 11.97~11.95ppm (1H, s), 9.38~9.36ppm (1H, s), 3.18~3.10ppm (2H, q), 2.21~2.14ppm (2H, t), 1.53~1.41ppm (4H, m), 1.29~1.18ppm (2H, m)
1-6. 6공정화합물의 제조- NHS 에스터화( Esterification )
5공정화합물 5.28g (23.24mmol, 1eq), 메탄올 120ml, 피리딘 9.38ml (116.2mmol, 5eq)를 투입하고 교반한다. 엔-썩시니미딜트리플루오로아세테이트 8.81g (41.83mmol, 1.8eq)을 투입하고 1일동안 교반한다. 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 유기층을 마그네슘썰페이트로로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축한다. 진공건조하여 원하는 화합물 7.08g (흰색 고체, 94.8%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 6.80~6.78ppm (1H, s), 3.40~3.32ppm (2H, q), 2.84~2.82ppm (4H, s), 2.64~2.58ppm (2H, t), 1.83~1.73ppm (2H, m), 1.67~1.57ppm (2H, m), 1.52~1.44ppm (2H, m)
1-7. 7공정화합물의 제조- 아미드화 ( Amidation )( C 6 - Spacer ) and DMT 첨가
6공정화합물 1g (3mmol, 1.2eq), 다이메틸포름아마이드 5ml, 3-아미노-1,2-프로판다이올 0.23g (2.57mmol, 1eq)을 투입하고 1시간동안 교반한다. 메틸렌클로라이드 50ml를 투입하고 0℃로 온도를 내린다. 다이엠티클로라이드 1.13g (3.33mmol, 1.3eq)을 투입하고 교반한다. 트리에틸아민 0.84ml (6.05mmol, 2.4eq)를 메틸렌클로라이드 10ml에 희석해서 적가한다. 실온에서 15시간동안 교반한다. 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 마그네슘썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.98g (연노랑색 고체, 64.5%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 7.42~7.20ppm (9H, m), 6.84~6.80ppm (4H, d), 5.87~5.85ppm (1H, t), 3.94~3.82ppm (1H, m), 3.79~3.77ppm (6H, s), 3.59~3.47ppm (1H, m), 3.37~3.10ppm (5H, m), 2.12~2.07ppm (2H, t), 1.64~1.50ppm (4H, m), 1.35~1.26ppm (2H, m)
1-8. 8공정화합물의 제조. -아민 탈보호화( Amine Deprotection )
7공정화합물 0.98g (1.62mmol, 1eq), 메탄올 4ml를 투입하고 교반한다. 암모니아용액(25%) 30ml (213.98mmol, 132eq)를 적가하고, 15시간동안 교반한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.8g (연노랑색 고체, 97%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 7.42~7.14ppm (9H, m), 6.83~6.79ppm (4H, d), 6.04~6.02ppm (1H, t), 3.87~3.79ppm (1H, m), 3.78~3.76ppm (6H, s), 3.59~3.50ppm (1H, m), 3.22~3.07ppm (3H, m), 2.66~2.60ppm (2H, t), 2.12~2.06ppm (2H, t), 1.62~1.52ppm (2H, m), 1.43~1.35ppm (2H, m), 1.33~1.25ppm (2H, m)
1-9. 9공정화합물의 제조. -아미드화( Amidation )( C 9 - Spacer )
4공정화합물 1.9g (4.11mmol, 1eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 2g (4.52mmol, 1.1eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.61g (4.52mmol, 1.1eq), 8공정 화합물 2.29g (4.52mmol, 1.1eq), 메틸렌클로라이드 1L를 투입하고 교반한다. 트리에틸아민 2.85ml (20.54mmol, 5eq)를 투입하고, 15시간동안 교반한다. 감압농축한다. 에틸아세테이트로 추출한다. 유기층을 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 2.1g (어두운 보라색 고체, 53,7%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.82~8.79ppm (2H, d), 7.93~7.90ppm (2H, d), 7.74~7.71ppm (2H, d), 7.49~7.47ppm (1H, s), 7.46~7.44ppm (1H, s), 7.44~7.17ppm (9H, m), 6.83~6.79ppm (4H, d), 6.76~6.72ppm (2H, d), 6.02~5.97ppm (1H, t), 5.90~5.85ppm (1H, t), 4.08~4.06ppm (3H, s), 4.04~4.02ppm (3H, s), 3.88~3.81ppm (1H, m), 3.81~3.75ppm (7H, m), 3.58~3.47ppm (5H, m), 3.28~3.08ppm (6H, m), 2.52~2.47ppm (2H, t), 2.11~2.05ppm (2H, t), 1.62~1.42ppm (4H, m), 1.34~1.18ppm (5H, m)
1-10. 10공정화합물의 제조. - 숙시닐화( Succinylation )
9공정화합물 1.97g (2.07mmol, 1eq), 썩씨닉언하이드라이드 0.62g (6.22mmol, 3eq), 엔-엔-다이메틸아미노피리딘 25mg (0.21mmol, 0.1eq), 피리딘 80ml를 투입하고 교반한다. 60℃로 온도를 올려서 15시간동안 교반한다. 썩씨닉언하이드라이드 0.62g (6.22mmol, 3eq)을 추가투입하고, 1일동안 교반한다. 엔-엔-다이메틸아미노피리딘 25mg (0.21mmol, 0.1eq)을 추가투입하고, 1일동안 교반한다. 상온으로 온도를 내리고, 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 1.76g (어두운 보라색 고체, 80.9%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.76~8.73ppm (2H, d), 7.92~7.88ppm (2H, d), 7.73~7.70ppm (2H, d), 7.48~7.46ppm (1H, s), 7.43~7.19ppm (10H, m), 6.83~6.80ppm (4H, d), 6.74~6.71ppm (2H, d), 6.50~6.46ppm (1H, m), 6.43~6.39ppm (1H, t), 5.24~5.20ppm (1H, m), 4.08~4.06ppm (3H, s), 4.04~4.02ppm (3H, s), 3.89~3.72ppm (9H, m), 3.57~3.45ppm (7H, m), 3.37~3.19ppm (6H, m), 2.58~2.50ppm (2H, t), 2.18~2.11ppm (2H, t), 1.69~1.40ppm (4H, m), 1.32~1.17ppm (5H, m)
1-11. 11공정화합물의 제조. - LCAA - CPG 커플링화( Coupling )
엘씨에이씨피지 3g, 10공정화합물 0.44g (0.418mmol, 3.5eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 0.18g (0.418mmol, 3.5eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.06g (0.418mmol, 3.5eq), 메틸렌클로라이드 35ml, 트리에틸아민 0.29ml (2.09mmol, 17.5eq)를 투입한다. 상온에서 1일동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 2.9g(보라색 고체)을 얻는다.
1-12. 12공정화합물의 제조.- 캡핑( Capping )
11공정화합물 2.9g, 피리딘 35ml, 아세틱언하이드라이드 3.59ml (38mmol, 91eq), 1-메틸이미다졸 3.03ml (38mmol, 91eq)를 투입한후, 1일동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 2.8g(보라색 고체)을 얻는다.
< 제조예2 >-화학식 16의 화합물( 소광자640 ) 합성
Figure 112013070113112-pat00035
Figure 112013070113112-pat00036
Figure 112013070113112-pat00037
Figure 112013070113112-pat00038
2-1. 1공정화합물의 제조.- 프로판올 ( Propanol ) 치환
엔-(2-아세톡시에틸)아닐린 12.3g (68.63mmol, 1eq)을 넣고 물 40ml를 넣은 후 3-클로로-1-프로판올 19.86g (205.90mmol, 3eq)과 칼슘카보네이트 6.87g (68.63mmol, 1eq)를 넣고 100℃에서 19시간 교반한다. 상온으로 온도를 내리고 에틸아세테이트로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 컬럼으로 분리한다. 감압농축하여 원하는 화합물 13.8g (노란색 액체, 84%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 7.23~7.19ppm (2H, m), 6.79~6.75ppm (3H, m), 4.25~4.19ppm (2H, t), 3.71~3.66ppm (2H, t), 3.59~3.54ppm (2H, t), 3.48~3.43ppm (2H, t), 2.66~2.82ppm (1H, s, H-OH), 2.05~2.03ppm (3H, s, H-Ac), 1.90~1.76ppm (2H, m)
2-2. 2공정화합물의 제조. - 첫번째 아조커플링( Azo Coupling )
니트로실썰퍼릭엑시드 8.4g (26.12mmol, 1eq), 염산 4.8ml (52.24mmol, 2eq), 메탄올 400ml를 투입하고 교반한다. -78℃로 온도를 내려서 20분동안 교반 한다. 2,5-메톡시아닐린 4g (26.12mmol, 1eq)을 메탄올 100ml에 녹여서 적가한 후, 실온으로 올려 2시간동안 교반한다. 메탄올에 녹인 1공정화합물 12.5g (52.24mmol, 2eq)을 적가한 후, 1시간동안 교반한다. 포화 쏘듐하이드로카보네이트 수용액으로 pH 6~8이 될 때까지 중화한다. 중화가 완료되고, 15시간동안 교반한다. 감압농축하여 메탄올을 제거한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 5.6g (빨간색 액체, 53%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 7.89~7.85ppm (2H, d), 7.27~7.25ppm (1H, d), 7.02~6.92ppm (2H, m), 6.82~6.78ppm (2H, d), 4.30~4.25ppm (2H, t), 3.98~3.97ppm (3H, s), 3.83~3.82ppm (3H, s), 3.76~3.66ppm (4H, m), 3.60~3.55ppm (2H, t), 2.03~2.02ppm (3H, s), 1.94~1.87ppm (2H, m), 1.65~1.64ppm (1H, s)
2-3. 3공정화합물의 제조. - 두번째 아조 커플링( Azo Coupling )
2-아미노-6-니트로-벤조싸이아졸 2.3g (12mmol, 1eq)을 넣고 0℃로 온도를 내린 후, 포스포릭엑시드 50ml를 투입한 후 쏘듐나이트레이트 0.83g (12mmol, 1eq)를 넣고 1시간 교반한다. 2공정화합물 4.8g (12mmol, 1eq)을 아세틱엑시드 30ml에 녹여 적가한다. 0℃로 온도를 내린 후, 포화 쏘듐하이드로카보네이트 수용액을 넣어pH8~9로 맞춘 후 상온에서 15시간 교반한다. 고체를 여과한 후 얻은 고체에 메탄올 600ml를 넣고 2시간 끓인다. 상온으로 온도를 내린 후, 침전물을 여과한다. 메탄올로 씻어준 후, 고체를 진공 건조하여 원하는 화합물 3.2g (고동색 고체, 44%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.81~8.80ppm (1H, s), 8.42~8.36ppm (1H, d), 8.25~8.21ppm (1H, d), 7.96~7.93ppm (2H, d), 7.68~7.67ppm (1H, s), 7.41~7.40ppm (1H, s), 6.87~6.83ppm (2H, d), 4.31~4.30ppm (2H, t), 4.13~4.12ppm (3H, s), 4.03~4.02ppm (3H, s), 3.77~3.75ppm (4H, m), 3.70~3.60ppm (2H, t), 2.05~2.06ppm (3H, s), 2.00~1.90ppm (2H, m)
2-4. 4공정화합물의 제조. - DMT 보호화( protection )
3공정화합물 2.1g (3.46mmol, 1eq)을 넣고 메틸렌클로라이드 100ml에 녹인 후, 트리에틸아민 1.16g (11.39mmol)을 넣는다. 다이엠티클로라이드 1.64g(4.84m mol)을 넣고 상온에서 2시간 교반한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 감압농축하고 컬럼으로 분리한다. 감압농축하여 원하는 화합물 2g (고동색 고체, 63%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.76~8.74ppm (1H, d), 8.34~8.30ppm(1H, dd), 8.20~8.16ppm (1H, d), 7.90~7.86ppm (2H, d), 7.64~7.63ppm(1H, s), 7.48~7.44ppm (2H, d),7.38~7.20ppm (8H, m), 6.88~6.78ppm (6H, m), 4.28~4.23ppm (2H, t), 4.12~4.11ppm (3H, s), 4.03~4.02ppm (3H, s), 3.80~3.78ppm (6H, s), 3.64~3.59ppm (4H, t), 3.22~3.17ppm (2H, t), 2.05~2.04ppm (3H, s), 1.98~1.92ppm (2H, m)
2-5. 5공정화합물의 제조. - 가수분해( Hydrolysis )
4공정화합물 2g (2.2mmol, 1eq), 메탄올 150ml, 메틸렌클로라이드 150ml를 투입하고 교반한다. 1N 쏘듐하이드록사이드 100ml를 투입하고, 3일동안 상온에서 교반한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액을 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 1.3g (고동색고체, 68%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.74~8.73ppm (1H, s), 8.33~8.30ppm (1H, d), 8.18~8.15ppm (1H, d), 7.87~7.83ppm (2H, d), 7.62~7.61ppm (1H, s), 7.43~6.80ppm (16H, m), 4.09~4.08ppm (3H, s), 4.00~3.99ppm (3H, s), 3.78~3.76ppm (8H, m), 3.61~3.60ppm (2H, t), 3.53~3.52ppm (2H, t), 3.17~3.16ppm (2H, t), 1.92~1.91ppm (2H, m)
2-6. 6공정화합물의 제조. - 숙시닐화( Succinylation )
5공정화합물 1.3g (1.50mmol, 1eq)과 피리딘 100ml를 넣고 완전히 녹인다. 엔-엔-다이메틸아미노피리딘 0.018g (0.15mmol, 0.1eq)과 썩씨닉언하이드라이드 0.5g (4.50mmol, 3eq)을 넣고 50℃에서 15시간 동안 교반한다. 진공펌프를 이용하여 피리딘을 제거한 후 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액을 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 컬럼으로 분리한다. 감압농축하여 원하는 화합물0.85g (고동색 고체, 57%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.75~8.74ppm (1H, s), 8.33~8.30ppm (1H, d), 8.20~8.16ppm (1H, d), 7.89~7.85ppm (2H, d), 7.63~7.60ppm (1H, s), 7.47~6.70ppm (16H, m), 4.35~4.27ppm (2H, t), 4.11~4.10ppm (3H, s), 4.02~4.01ppm (3H, s), 3.79~3.78ppm (6H, s), 3.62~3.61ppm (4H, m), 3.19~3.18ppm (2H, t), 2.66~2.60ppm (4H, m), 1.93~1.92ppm (2H, m)
2-7. 7공정화합물의 제조. - LCAA - CPG 커플링( Coupling )
엘씨에이씨피지 1g, 6공정화합물 0.08g (0.083mmol, 2eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 0.03g (0.066mmol, 1.6eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.01g (0.066mmol, 1.6eq), 메틸렌클로라이드 10ml, 트리에틸아민 0.042ml (0.41mmol, 10eq)를 투입한다. 상온에서 15시간 동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 0.8g(파란색 고체)을 얻는다.
2-8. 8공정화합물의 제조.- 캡핑( Capping )
7공정화합물 0.8g, 피리딘 35ml, 아세틱언하이드라이드 1.23ml, 1-메틸이미다졸 0.8ml를 투입한 후, 2시간 동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 0.69g(파란색 고체)을 얻는다.
< 제조예3 >- 화학식 15의 화합물( 소광자630 )의 제조
Figure 112013070113112-pat00039
Figure 112013070113112-pat00040
Figure 112013070113112-pat00041
Figure 112013070113112-pat00042
Figure 112013070113112-pat00043
3-1. 1공정화합물의 제조.-아민화( Amination )
엔-에틸아닐린 30g (250mmol, 1eq), 에틸아크릴레이트 37.2g (370mmol, 1.5eq), 세륨(Ⅳ) 암모니움 나이트레이트 13.57g (25mmol, 0.1eq)을 투입하고 교반한다. 60℃로 온도를 올려서 15시간동안 교반한다. 상온으로 온도를 내리고, 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출물은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 감압농축하고 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 47g (노란색 액체, 85.8%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 7.27~7.20ppm (2H, t), 6.73~6.67ppm (3H, m), 4.20~4.11ppm (2H, q), 3.67~3.61ppm (2H, t), 3.43~3.35ppm (2H, q), 2.63~2.57ppm (2H, t), 1.31~1.24ppm (3H, t), 1.19~1.14ppm (3H, t)
3-2. 2공정화합물의 제조.- 첫번째 아조 커플링( Azo Coupling )
니트로실썰퍼릭엑시드 17.37g (54.67mmol, 1.5eq), 염산 7.6g, 메탄올 400ml를 투입하고 교반한다. -78℃로 온도를 내려서 10분 동안 교반한다. 2-메톡시-5-메틸아닐린 5g (36.45mmol, 1eq)을 메탄올 50ml에 녹여서 적가한다. 실온에서 1시간 동안 교반한다. 1공정화합물 8.87g (40.09mmol, 1.1eq)을 메탄올에 녹여서 적가한 후, 2시간동안 교반한다. 포화 쏘듐하이드로카보네이트 수용액으로 중화한후, 15시간동안 교반한다. 감압농축하여 메탄올을 제거한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 6.26g (주황색 액체, 46.5%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 7.90~7.86ppm (2H, d), 7.27~7.25ppm (1H, s), 7.01~6.93ppm (2H, m), 6.75~6.72ppm (2H, d), 4.20~4.12ppm (2H, q), 3.99~3.97ppm (3H, s), 3.84~3.82ppm (3H, s), 3.75~3.69ppm (2H, t), 3.50~3.44ppm (2H, q), 2.67~2.61ppm (2H, t), 1.30~1.18ppm (6H, m)
3-3. 3공정화합물의 제조.
2-아미노-6-니트로-벤조싸아아졸 1.59g (8.12mmol, 1eq)을 넣고 0℃로 온도를 내린 후, 포스포릭엑시드 42ml를 투입한 후 쏘듐나이트레이트 0.56g (8.12mmol, 1eq)를 넣고 1시간 교반한다. 2공정화합물 3g (8.12mmol, 1eq)을 아세틱엑시드 15ml에 녹여 적가한다. 0℃로 온도를 내린 후, 포화 쏘듐하이드로카보네이트 수용액을 넣어 중화시킨 후, 상온에서 15시간 교반한다. 고체를 여과한 후 20ml 메틸렌클로라이드에 녹여 에탄올 500ml로 침전시키고 여과한다. 고체를 진공 건조하여 원하는 화합물 1.5g (어두운 갈색고체, 32%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.82~8.81ppm (1H, d), 8.41~8.37ppm (1H, d), 8.28~8.24ppm (1H, d), 7.95~7.91ppm (2H, d), 7.66~7.60ppm (2H, d), 6.77~6.74ppm (2H, d), 4.22~4.14ppm (2H, q), 4.05~4.04ppm (3H, s), 3.79~3.73ppm (2H, t), 3.55~3.50ppm (2H, q), 2.78~2.77ppm (3H, s), 2.70~2.64ppm (2H, t), 1.31~1.21ppm (6H, m)
3-4. 4공정화합물의 제조. 가수분해( Hydrolysis )
3공정화합물 1.5g (2.61mmol, 1eq), 메틸렌클로라이드 50ml, 에탄올 50ml를 투입하고 교반한다. 포타슘하이드록사이드 3.88g (69.15mmol, 26.5eq)를 물 40ml에 녹여 적가 한 후, 30℃에서 2일 동안 교반한다. 감압농축한다. 1N 염산으로 pH 4~5이 될 때까지 중화한다. 고체를 여과하고 물과 메탄올로 씻는다. 고체를 진공 건조하여 원하는 화합물 0.9g(어두운 갈색고체, 63%)을 얻는다.
3-5. 5공정화합물의 제조. -아미드화( Amidation )( C 9 - Spacer )
4공정화합물 0.9g (1.64mmol, 1eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 0.73g (1.64mmol, 1eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.22g (1.64mmol, 1eq), 실시예1의 8공정화합물 0.83g (1.64mmol, 1eq), 메틸렌클로라이드 80ml를 투입하고 교반한다. 트리에틸아민 0.83g (8.20mmol, 5eq)를 투입하고, 15시간 동안 교반한다 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출물은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공 건조하여 원하는 화합물 1.55g (어두운 푸른색 고체, 91%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.64~8.62ppm (1H, d), 8.26~8.22ppm (1H, m), 8.16~8.12ppm (1H, d), 7.76~7.72ppm (2H, d), 7.53~7.52ppm (1H, s), 7.46~7.45ppm (1H, s), 7.41~7.37ppm (2H, d), 7.30~7.16ppm (7H, m), 6.82~6.78ppm (4H, d), 6.68~6.63ppm (2H, d), 6.22~6.18ppm (1H, t), 5.90~5.85ppm (1H, t), 3.98~3.97ppm (3H, s), 3.87~3.86ppm (1H, s), 3.76~3.75ppm (6H, s), 3.57~3.48ppm (4H, m), 3.37~3.36ppm (1H, s), 3.28~3.07ppm (6H, m), 2.66~2.65ppm (3H, s), 2.64~2.60ppm (1H, d), 2.51~2.46ppm (2H, t), 2.11~2.05ppm (2H, t), 1.60~1.43ppm (4H, m), 1.34~1.16ppm (4H, m)
3-6. 6공정화합물의 제조. - 숙시닐화( Succinylation )
5공정화합물 1.55g (1.50mmol, 1eq), 썩씨닉언하이드라이드 0.45g (4.49mmol, 3eq), 엔-엔-다이메틸아미노피리딘 0.02g (0.15mmol, 0.1eq), 피리딘 30ml를 투입하고 50℃에서 20시간 동안 교반한다. 상온으로 온도를 내리고, 감압 농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출물은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼(메틸렌클로라이드 : 메탄올 = 20 : 1)으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 1.38g (어두운 보라색 고체, 81%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3)： 8.79~8.78ppm (1H, d), 8.40~8.35ppm (1H, dd), 8.27~8.23ppm (1H, d), 7.91~7.87ppm (2H, d), 7.65~7.57ppm (2H, m), 7.43~7.39ppm (2H, d), 7.31~7.19ppm (7H, m), 6.84~6.80ppm (4H, d), 6.75~6.71ppm (2H, d), 6.38~6.37ppm (1H, m), 6.01~6.00ppm (1H, t), 5.21~5.20ppm (1H, s), 4.04~4.03ppm (3H, s), 3.91~3.70ppm (8H, m), 3.50~3.18ppm (9H, m), 2.79~2.65ppm (8H, m), 2.54~2.51ppm (2H, t), 2.15~2.12ppm (2H, t), 1.66~1.49ppm (4, m), 1.35~1.19ppm (4H, m)
3-7. 7공정화합물의 제조. - LCAA - CPG 커플링( Coupling )
엘씨에이에이씨피지 2g, 6공정화합물 0.18g (0.16mmol, 2eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 0.07g (0.16mmol, 2eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.02g (0.16mmol, 2eq), 메틸렌클로라이드 30ml, 트리에틸아민 0.09g (0.88mmol, 11eq)를 투입한다. 20시간 동안 반응한다. 반응 종료 후, 반응액을 여과 한 뒤 메탄올로 씻어준 후 진공건조 하여 원하는 화합물 2g을 얻는다.
3-8. 공정화합물의 제조. -캡핑( Capping )
7공정화합물 2.9g, 피리딘 40ml, 아세틱언하이드라이드 5ml, 1-메틸이미다졸 3.2ml를 투입한후, 1시간 동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 23.5g(보라색 고체)을 얻는다.
< 제조예4 >- 화학식 14의 화합물( 소광자545 )의 제조
Figure 112013070113112-pat00044
Figure 112013070113112-pat00045
Figure 112013070113112-pat00046
Figure 112013070113112-pat00047
Figure 112013070113112-pat00048
4-1. 1공정화합물의 제조-아민화( Amination )
엔-에틸아닐린 10g (83mmol, 1eq), 에틸아크릴레이트 12.5g (120mmol, 1.5eq), 세륨 암모늄 나이트레이트 4.5g (8.3mmol, 0.1eq)을 투입하고 교반한다. 60로 온도를 올려서 1일 동안 교반한다. 상온으로 온도를 내리고, 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 12.53g (68.2%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :7.25~7.17(2H, t), 6.71~6.64(3H, m), 4.18~4.09(2H, q), 3.65~3.58(2H, t), 3.41~3.32(2H, q), 2.61~2.54(2H, t), 1.28~1.21(3H, t), 1.17~1.08(3H, t)
4-2. 2공정화합물의 제조- 첫번째 아조커플링 ( Azo Coupling )
니트로실썰퍼릭엑시드 17.37g (54.67mmol, 1.5eq), 염산 20ml, 메탄올 20ml를 투입하고 교반한다. -78로 온도를 내려서 20분동안 교반한다. 2,5-메톡시아닐린 5g (36.45mmol, 1eq)을 메탄올 120ml에 녹여서 적가한 후, 실온으로 올려 1시간동안 교반한다.
메탄올에 녹인 1공정화합물 8.87g (40.09mmol, 1.1eq)을 적가한 후, 1시간동안 교반한다. 포화 쏘듐하이드로카보네이트 수용액으로 pH 6~8이 될 때까지 중화한다. 중화가 완료되고, 1일 동안 교반한다. 감압농축하여 메탄올을 제거한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 6.26g (46.5%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :7.88~7.85 (2H, d), 7.44~7.42 (1H, s), 7.17~7.14 (1H, d), 6.96~6.93 (1H, d), 6.75~6.71 (2H, d), 4.20~4.08 (2H, m), 4.00~3.95 (3H, s), 3.74~3.69 (2H, m), 3.51~3.44 (2H, q), 2.67~2.62 (2H, t), 2.34~2.32 (3H, s), 1.32~1.19 (6H, m)
4-3. 3공정화합물의 제조- 두번째 아조커플링( Azo Coupling )
쏘듐나이트레이트 0.79g (11.40mmol, 1eq), 포스포릭엑시드 10ml를 투입하고 교반한다. 0로 온도를 내려서 20분동안 교반한다. 4-아미노피리딘 1.07g (11.40mmol, 1eq)을 투입한다. 실온에서 30분동안 교반한다. 2공정화합물 4.21g (11.40mmol, 1eq)을 아세틱엑시드 60ml에 녹인다. 적가한 후, 1시간동안 교반한다. 증류수 100ml를 투입하고, 포화 쏘듐하이드로카보네이트수용액으로 pH 4~8이 될 때까지 중화한 후, 1일 동안 교반한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.25g (4.6%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.82~8.80 (2H, d), 7.93~7.90 (2H, d), 7.74~7.72 (2H, d), 7.60~7.58 (1H, s), 7.45~7.43 (1H, s), 6.76~6.73 (2H, d), 4.20~4.13 (2H, q), 4.05~4.01 (3H, s), 3.77~3.72 (2H, t), 3.52~3.47 (2H, q), 2.75~2.73 (3H, s), 2.68~2.63 (2H, t), 1.30~1.21 (6H, m)
4-4. 4공정화합물의 제조- 가수분해( Hydrolysis )
3공정화합물 0.25g (0.53mmol, 1eq), 메탄올 20ml, 메틸렌클로라이드 20ml를 투입하고 교반한다. 1N 쏘듐하이드록사이드 1.58ml (1.58mmol, 3eq)를 투입하고, 3일동안 교반한다. 1N 쏘듐하이드록사이드 1.58ml (1.58mmol, 1eq)를 추가투입하고, 1일동안 교반한 후, 감압농축한다. 증류수 100ml 투입하여 교반한다. 1N 염산로 pH 4~7이 될 때까지 중화한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액을 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.24g을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.79~8.77 (2H, d), 7.92~7.89 (2H, d), 7.74~7.71 (2H, d), 7.59~7.57 (1H, s), 7.43~7.41 (1H, s), 6.78~6.75 (2H, d), 4.05~4.03 (3H, s), 3.77~3.75 (2H, t), 3.54~3.51 (2H, q), 2.75~2.72 (5H, m), 1.27~1.22 (3H, t)
4-5. 5공정화합물의 제조-아민 보호화( Amine Protection )
6-아미노카프릭엑시드 15g (114mmol, 1eq), 트리에틸아민 48ml (342mmol, 3eq), 메탄올 230ml를 투입하고 교반한다. 에틸트리플루오로아세테이트 15ml (125mmol, 1.1eq)을 투입하고, 1일 동안 교반한다. 감압농축한다. 에틸아세테이트로 추출한다. 유기층을 마그네슘썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 16.67g (64%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, DMSO-d6) :11.99~11.97 (1H, s), 9.39~9.37 (1H, s), 3.20~3.12 (2H, q), 2.22~2.16 (2H, t), 1.55~1.41 (4H, m), 1.31~1.19 (2H, m)
4-6. 6공정화합물의 제조- NHS 에스터화( Esterification )
5공정화합물 5.28g (23.24mmol, 1eq), 메탄올 120ml, 피리딘 9.38ml (116.2mmol, 5eq)를 투입하고 교반한다. 엔-썩시니미딜트리플루오로아세테이트 8.81g (41.83mmol, 1.8eq)을 투입하고 1일동안 교반한다. 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 유기층을 마그네슘썰페이트로로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축한다. 진공건조하여 원하는 화합물 7.08g (흰색 고체, 94.8%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3): 6.80~6.78ppm (1H, s), 3.40~3.32ppm (2H, q), 2.84~2.82ppm (4H, s), 2.64~2.58ppm (2H, t), 1.83~1.73ppm (2H, m), 1.67~1.57ppm (2H, m), 1.52~1.44ppm (2H, m)
4-7. 7공정화합물의 제조- 아미드화 ( Amidation )( C 6 - Spacer ) and DMT 첨가
6공정화합물 1.17g (3.61mmol, 1eq), 다이메틸포름아마이드 6ml, 3-아미노-1,2-프로판다이올 0.49g (5.42mmol, 1.5eq)을 투입하고 1일 동안 교반한다. 메틸렌클로라이드 50ml를 투입하고 0로 온도를 내린다. 다이엠티클로라이드 1.83g (5.42mmol, 1eq)을 투입하고 교반한다. 트리에틸아민 3.03ml (21.68mmol, 4eq)를 메틸렌클로라이드 10ml에 희석해서 적가한다. 실온에서 4시간동안 교반한다. 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 마그네슘썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.92g (41.9%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :7.55~7.53 (1H, s), 7.43~7.39 (2H, m), 7.32~7.15 (7H, m), 6.83~6.78 (4H, d), 6.17~6.15 (1H, s), 3.87~3.85 (1H, m), 3.75~3.73 (6H, s), 3.68~3.65 (1H, m), 3.53~3.46 (1H, m), 3.32~3.22 (2H, m), 3.20~3.09 (2H, m), 2.11~2.04 (2H, t), 1.61~1.46 (4H, m), 1.33~1.24 (2H, m)
4-8. 8공정화합물의 제조. -아민 탈보호화( Amine Deprotection )
7공정화합물 0.84g (1.39mmol, 1eq), 메탄올 5ml를 투입하고 교반한다. 암모니아용액(25%) 4.26ml (27.8mmol, 20eq)를 적가하고, 1일 동안 교반한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.78g (>100%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :7.42~7.38 (2H, m), 7.31~7.17 (7H, m), 6.83~6.78 (4H, d), 6.61~6.59 (1H, s), 3.91~3.89 (1H, m), 3.76~3.74 (6H, s), 3.54~3.48 (2H, m), 3.20~3.09 (2H, m), 2.93~2.89 (2H, m), 2.16~2.10 (2H, m), 1.70~1.56 (4H, m), 1.38~1.31 (2H, m)
4-9. 9공정화합물의 제조. -아미드화( Amidation )( C 9 - Spacer )
4공정화합물 0.24g (0.54mmol, 1eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 0.26g (0.59mmol, 1.1eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.08g (0.59mmol, 1.1eq), 8공정 화합물 0.3g (0.59mmol, 1.1eq), 메틸렌클로라이드 100ml를 투입하고 교반한다. 트리에틸아민 0.37ml (2.69mmol, 5eq)를 투입하고, 15시간동안 교반한다. 감압농축한다. 에틸아세테이트로 추출한다. 유기층을 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.46g (91.1%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.82~8.79 (2H, d), 7.91~7.88 (2H, d), 7.74~7.72 (2H, d), 7.59~7.57 (1H, s), 7.43~7.34 (3H, m), 7.30~7.18 (7H, m), 6.82~6.79 (4H, d), 6.75~6.72 (2H, d), 5.94~5.92 (1H, t), 5.83~5.82 (1H, t), 4.03~4.01 (3H, s), 3.86~3.80 (1H, m), 3.77~3.74 (6H, s), 3.57~3.44 (4H, m), 3.27~3.08 (6H, m), 2.76~2.74 (3H, s), 2.51~2.40 (2H, t), 2.10~2.05 (2H, t), 1.61~1.42 (4H, m), 1.31~1.17 (5H, m)
4-10. 10공정화합물의 제조.- 숙시닐화( Succinylation )
9공정화합물 0.46g (0.49mmol, 1eq), 썩씨닉언하이드라이드 0.25g (2.46mmol, 5eq), 엔-엔-다이메틸아미노피리딘 0.03g (0.25mmol, 0.5eq), 피리딘 35ml를 투입하고 교반한다. 60로 온도를 올려서 1일 동안 교반한다. 상온으로 온도를 내리고, 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.03g (5.9%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.83~8.81 (2H, d), 7.92~7.89 (2H, d), 7.74~7.73 (2H, d), 7.60~7.58 (1H, s), 7.43~7.33 (3H, m), 7.31~7.17 (7H, m), 6.83~6.80 (4H, d), 6.74~6.71 (2H, d), 6.45~6.35 (1H, s), 5.31~5.17 (1H, s), 4.05~4.03 (3H, s), 3.79~3.77 (1H, m), 3.76~3.74 (6H, s), 3.48~3.46 (4H, m), 3.26~3.18 (6H, m), 2.90~2.60 (7H, m), 2.64~2.62 (2H, m), 2.53~2.43 (2H, m), 1.60~1.28 (4H, m), 1.25~1.18 (5H, m)
4-11. 11공정화합물의 제조.- LCAA - CPG 커플링화( Coupling )
엘씨에이씨피지 16.8g, 10공정화합물 1.14g (1.1mmol, 1eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 0.5g (1.1mmol, 1eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.15g (1.1mmol, 1eq), 메틸렌클로라이드 100ml, 트리에틸아민 0.6ml (5.5mmol, 5eq)를 투입한다. 상온에서 1일동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 17.16g(보라색 고체)을 얻는다.
4-12. 12공정화합물의 제조.- 캡핑( Capping )
11공정화합물 17.16g, 피리딘 90ml, 아세틱언하이드라이드 3.59ml (38mmol), 1-메틸이미다졸 18ml (225mmol)를 투입한후, 1.5시간 동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 16.7g을 얻는다.
< 제조예5 >- 화학식 17의 화합물( 소광자530 )의 제조
Figure 112013070113112-pat00049
Figure 112013070113112-pat00050
Figure 112013070113112-pat00051
Figure 112013070113112-pat00052
Figure 112013070113112-pat00053
5-1. 1공정화합물의 제조-아민화( Amination )
엔-에틸아닐린 10g (83mmol, 1eq), 에틸아크릴레이트 12.5g (120mmol, 1.5eq), 세륨() 암모늄 나이트레이트 4.5g (8.3mmol, 0.1eq)을 투입하고 교반한다. 60로 온도를 올려서 1일 동안 교반한다. 상온으로 온도를 내리고, 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 12.53g (68.2%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :7.25~7.17(2H, t), 6.71~6.64(3H, m), 4.18~4.09(2H, q), 3.65~3.58(2H, t), 3.41~3.32(2H, q), 2.61~2.54(2H, t), 1.28~1.21(3H, t), 1.17~1.08(3H, t)
5-2. 2공정화합물의 제조- 첫번째 아조커플링 ( Azo Coupling )
니트로실썰퍼릭엑시드 3.67g (53.12mmol, 1.5eq)을 투입하고 0로 온도를 내려서 5분동안 교반한다. 포스포릭엑시드 100ml를 넣고 20분간 교반한다. 4-아미노피리딘 5g (53,12mmol)을 투입하고, 40분간 교반한다. 중화시킨 후, 실온에서 1일 동안 교반한다.
메틸렌클로라이드로 추출한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 2.07g (25.6%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.70~8.68 (2H, d), 7.76~7.73 (1H, d), 7.63~7.61 (2H, d), 6.29~6.26 (2H, m), 4.41~4.13 (2H, br), 3.97~3.95 (3H, s)
5-3. 3공정화합물의 제조- 두번째 아조커플링( Azo Coupling )
쏘듐나이트레이트 0.63g (9.07mmol, 1.5eq), 포스포릭엑시드 20ml를 투입하고 교반한다. 0로 온도를 내려서 20분동안 교반한다. 2공정화합물 2.07g (9.07mmol, 1.5eq)을 아세틱엑시드 30ml에 녹인다. 적가한 후, 40분 동안 교반한다. 1공정화합물 1.34g (6.05mmol, 1eq)을 아세톤 20ml에 녹이고 투입한다. 40분간 교반한다. 포화 쏘듐하이드로카보네이트수용액으로 중화한 후, 1일 동안 교반한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.11g (3.9%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.80~8.78 (2H, d), 7.93~7.90 (2H, d), 7.86~7.83 (1H, d), 7.72~7.70 (2H, d), 7.60~7.58 (1H, s), 7.55~7.52 (1H, d), 6.78~6.75 (2H, d), 4.21~4.14 (5H, m), 3.78~3.73 (2H, t), 3.56~3.49 (2H, q), 2.69~2.65 (2H, t), 1.30~1.22 (6H, m)
5-4. 4공정화합물의 제조- 가수분해( Hydrolysis )
3공정화합물 0.07g (0.15mmol, 1eq), 메탄올 10ml, 메틸렌클로라이드 10ml를 투입하고 교반한다. 1N 쏘듐하이드록사이드 0.46ml (0.46mmol, 3eq)를 투입하고, 1일 동안 교반한다. 1N 쏘듐하이드록사이드 1.58ml (1.58mmol, 1eq)를 추가투입하고, 1일 동안 교반한 후, 감압농축한다. 증류수 50ml 투입하여 교반한다. 1N 염산으로 pH 4가 될 때까지 중화한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액을 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.06g (92.8%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.77~8.75 (2H, d), 7.90~7.87 (2H, d), 7.83~7.80 (1H, d), 7.73~7.71 (2H, d), 7.59~7.57 (1H, s), 7.53~7.50 (1H, d), 6.80~6.77 (2H, d), 4.14~4.12 (3H, s), 3.79~3.77 (2H, t), 3.56~3.53 (2H, q), 2.75~2.71 (2H, t), 1.30~1.22 (3H, m)
5-5. 5공정화합물의 제조-아민 보호화( Amine Protection )
6-아미노카프릭엑시드 15g (114mmol, 1eq), 트리에틸아민 48ml (342mmol, 3eq), 메탄올 230ml를 투입하고 교반한다. 에틸트리플루오로아세테이트 15ml (125mmol, 1.1eq)을 투입하고, 1일 동안 교반한다. 감압농축한다. 에틸아세테이트로 추출한다. 유기층을 마그네슘썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 16.67g (64%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, DMSO-d6) :11.99~11.97 (1H, s), 9.39~9.37 (1H, s), 3.20~3.12 (2H, q), 2.22~2.16 (2H, t), 1.55~1.41 (4H, m), 1.31~1.19 (2H, m)
5-6. 6공정화합물의 제조- NHS 에스터화( Esterification )
5공정화합물 5.28g (23.24mmol, 1eq), 메탄올 120ml, 피리딘 9.38ml (116.2mmol, 5eq)를 투입하고 교반한다. 엔-썩시니미딜트리플루오로아세테이트 8.81g (41.83mmol, 1.8eq)을 투입하고 1일동안 교반한다. 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 유기층을 마그네슘썰페이트로로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축한다. 진공건조하여 원하는 화합물 7.08g (흰색 고체, 94.8%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3): 6.80~6.78ppm (1H, s), 3.40~3.32ppm (2H, q), 2.84~2.82ppm (4H, s), 2.64~2.58ppm (2H, t), 1.83~1.73ppm (2H, m), 1.67~1.57ppm (2H, m), 1.52~1.44ppm (2H, m)
5-7. 7공정화합물의 제조- 아미드화 ( Amidation )( C 6 - Spacer ) and DMT 첨가
6공정화합물 1.17g (3.61mmol, 1eq), 다이메틸포름아마이드 6ml, 3-아미노-1,2-프로판다이올 0.49g (5.42mmol, 1.5eq)을 투입하고 1일 동안 교반한다. 메틸렌클로라이드 50ml를 투입하고 0로 온도를 내린다. 다이엠티클로라이드 1.83g (5.42mmol, 1eq)을 투입하고 교반한다. 트리에틸아민 3.03ml (21.68mmol, 4eq)를 메틸렌클로라이드 10ml에 희석해서 적가한다. 실온에서 4시간동안 교반한다. 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 마그네슘썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.92g (41.9%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :7.55~7.53 (1H, s), 7.43~7.39 (2H, m), 7.32~7.15 (7H, m), 6.83~6.78 (4H, d), 6.17~6.15 (1H, s), 3.87~3.85 (1H, m), 3.75~3.73 (6H, s), 3.68~3.65 (1H, m), 3.53~3.46 (1H, m), 3.32~3.22 (2H, m), 3.20~3.09 (2H, m), 2.11~2.04 (2H, t), 1.61~1.46 (4H, m), 1.33~1.24 (2H, m)
5-8. 8공정화합물의 제조. -아민 탈보호화( Amine Deprotection )
7공정화합물 0.84g (1.39mmol, 1eq), 메탄올 5ml를 투입하고 교반한다. 암모니아용액(25%) 4.26ml (27.8mmol, 20eq)를 적가하고, 1일 동안 교반한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.78g (>100%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :7.42~7.38 (2H, m), 7.31~7.17 (7H, m), 6.83~6.78 (4H, d), 6.61~6.59 (1H, s), 3.91~3.89 (1H, m), 3.76~3.74 (6H, s), 3.54~3.48 (2H, m), 3.20~3.09 (2H, m), 2.93~2.89 (2H, m), 2.16~2.10 (2H, m), 1.70~1.56 (4H, m), 1.38~1.31 (2H, m)
5-9. 9공정화합물의 제조. -아미드화( Amidation )( C 9 - Spacer )
4공정화합물 0.23g (0.54mmol, 1eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 0.26g (0.59mmol, 1.1eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.08g (0.59mmol, 1.1eq), 8공정 화합물 0.3g (0.59mmol, 1.1eq), 메틸렌클로라이드 100ml를 투입하고 교반한다. 트리에틸아민 0.37ml (2.69mmol, 5eq)를 투입하고, 15시간동안 교반한다. 감압농축한다. 에틸아세테이트로 추출한다. 유기층을 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.42g (84.2%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.80~8.78 (2H, d), 7.93~7.90 (2H, d), 7.86~7.83 (1H, d), 7.72~7.70 (2H, d), 7.60~7.58 (1H, s), 7.55~7.52 (1H, d), 7.46~7.38 (2H, m), 7.31~7.17 (7H, m), 6.82~6.78 (4H, d), 6.78~6.75 (2H, d), 6.50~6.44 (1H, t), 6.15~6.13 (1H, s), 4.04~4.02 (3H, s), 4.00~3.98 (3H, s), 3.88~3.86 (1H, m), 3.75~3.73 (8H, m), 3.55~3.21 (4H, m), 3.23~3.07 (4H, m), 2.48~2.46 (2H, t), 2.10~2.04 (2H, t), 1.58~1.42 (4H, m), 1.29~1.15 (5H, m)
5-10. 10공정화합물의 제조.- 숙시닐화( Succinylation )
9공정화합물 0.46g (0.49mmol, 1eq), 썩씨닉언하이드라이드 0.25g (2.46mmol, 5eq), 엔-엔-다이메틸아미노피리딘 0.03g (0.25mmol, 0.5eq), 피리딘 35ml를 투입하고 교반한다. 60로 온도를 올려서 1일 동안 교반한다. 상온으로 온도를 내리고, 감압농축한다. 메틸렌클로라이드로 추출한다. 추출액은 쏘듐썰페이트로 건조하고 여과한다. 여과액을 감압농축하고, 컬럼으로 분리한다. 감압농축하고 진공건조하여 원하는 화합물 0.03g (6.7%)을 얻는다.
1H NMR (300MHz, CDCl3) :8.77~8.75 (2H, d), 7.90~7.87 (2H, d), 7.83~7.80 (1H, d), 7.73~7.71 (2H, d), 7.59~7.57 (1H, s), 7.53~7.50 (1H, d), 7.48~7.38 (2H, m), 7.32~7.18 (7H, m), 6.84~6.80(4H, d), 6.80~6.77 (2H, d), 6.40~6.38 (1H, t), 5.93~5.91 (1H, t), 5.24~5.22 (1H, m), 4.08~4.06 (3H, s), 4.04~4.02 (3H, s), 3.91~3.82 (2H, m), 3.79~3.77 (8H, m), 3.50~3.46 (2H, m), 3.29~3.17 (4H, m), 2.72~2.50 (6H, m), 2.05~1.96 (2H, t), 1.64~1.49 (4H, m), 1.36~1.18 (5H, m)
5-11. 11공정화합물의 제조.- LCAA - CPG 커플링화( Coupling )
엘씨에이씨피지 16.8g, 10공정화합물 1.14g (1.1mmol, 1eq), 비스-2-옥소-3-옥사졸리디닐포스포릭클로라이드 0.5g (1.1mmol, 1eq), 1-하이드록시벤조트리아조 0.15g (1.1mmol, 1eq), 메틸렌클로라이드 100ml, 트리에틸아민 0.6ml (5.5mmol, 5eq)를 투입한다. 상온에서 1일동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 18.03g을 얻는다.
5-12. 12공정화합물의 제조.- 캡핑( Capping )
11공정화합물 18.03g, 피리딘 90ml, 아세틱언하이드라이드 3.59ml (38mmol), 1-메틸이미다졸 18ml (225mmol)를 투입한후, 1.5시간 동안 반응한다. 여과하고, 메탄올로 씻어준다. 여과물을 진공건조하여 원하는 화합물 15.00g을 얻는다.
상기 제조예들에서 제조된 생성물의 1H NMR 분석은 할당된 구조와 일치했다.
< 실시예 1> 올리고뉴클레오티드를 이용한 형광량 측정
상기 본 발명에 사용된 소광자의 형광 발광량을 확인하기 위하여 10mer의 올리고뉴클레오타드(표 1)를 주형가닥으로 하여 3′말단에 BHQ1, BHQ2, 소광자570, 소광자630, 소광자640을 각각 바인딩시켜 합성한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 형광발광 성능을 200nm~1000nm까지 확인하였다.
본 발명의 형광발광을 확인하기 위하여 Optizen POP(분광광도계, Mecasys사) 장비를 이용하여 하기 순서에 따라 반응하였다.
(1) 각 합성된 소광자는 100pmole/ul로 희석하여 1nmole을 반응시킨다.
(2) 표 2와 같이 최종 부피 100ul로 분광광도계로 200nm~1000nm까지 형광을 측정한다.
염기서열(5′→ 3′)
10mer 염기서열 ACG TCA CGG T
소광자(100pmole/ul) 10ul
distilled water 최종 100ul가 되도록
총 부피 100ul
그 결과, 각 소광자의 형광이 발산되는 것을 확인하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
< 실시예 2> 소광자 570을 이용한 RT - PCR 분석
소광자570으로 합성된 프로브로 RT-PCR에서의 성능을 확인하기 위하여 람다파지 DNA(Lambda phage DNA; 바이오니아)를 주형가닥로 하여 RT-PCR용 프라이머와 프로브를 디자인하였다(표 3).
상기 본 발명에 사용된 프로브는 25mer로 5′말단에 형광표지 펨(FAM), 테트(TET), 탐라(TAMRA), 록스(ROX) 와 텍사스레드(Texas-Red)로 표지하였고, 3′말단에는 소광자570으로 표지 하였으며, 대조군으로 5′말단에 형광표지 펨(FAM), 테트(TET), 탐라(TAMRA), 록스(ROX) 와 텍사스레드(Texas-Red)로 표지하였고, 3′말단에 BHQ1, BHQ2로 표지한 프로브를 사용하였다.
본 발명의 실시간 정량핵산 증폭반응을 위하여, AccuPower DualStarTM RT-PCR PreMix(바이오니아사)를 이용하였으며, 실시간 유전자 증폭장치(Real-Time PCR machine)인 엑시사이클러(Exicycler, 바이오니아사) 장비를 이용하여 하기 순서에 따라 반응을 진행하였다.
(1) Lambda DNA(10ng/ul~10pg/ul) 10-폴드(fold)로 준비한다.
(2) 표 4와 같이 시료를 총 20ul 씩 준비한다.
(3) 표 5와 같은 조건으로 RT-PCR을 수행한다.
염기서열(5′→ 3′)
정방향(Forward)프라이머 GGA CTG GCT GAT GAA CTT GTT A
역방향(Reverse) 프라이머 GTG GCT GAA ACA GTT GTT GAT T
프로브 ATG CAC TGG ATG CAC GTA AAT CCC G
1tube 반응시
Lambda DNA(10ng~1pg) 각 1ul
정방향(Forward) 프라이머 10pmole/ul
역방향(Reverse) 프라이머 10pmole/ul
프로브 10pmole/ul
증류수 최종 20ul가 되도록
총 부피 20ul
반응 온도(시간) 사이클 수
Pre-Denaturing 95도씨(5분) 1회
Denaturing 95도씨(20초) 45회
Annealing & Extension 55도씨(30초)
Detention(Scan)
그 결과, 소광자570의 우수한 소광성능을 확인할 수 있었다.
하기 표 6 내지 표 10은 상기 RT-PCR 실험들(도 2 내지 도 6)에 대한 각각의 Ct(cycle threshold) 값을 보여준다.
표 6에서 표 10까지의 Ct의 값은 10-fold별 DNA 농도에 따라서 측정되는 사이클을 기록한 것으로, 본 발명에 따른 소광자를 사용할 경우 DNA농도에 따라서 약 3.3Ct가 차이나게 측정되는 것으로 보아, 이는 Real Time PCR에서 안정적으로 증폭이 잘 되는 것을 나타내는 것이다. 따라서 본 발명의 소광자들이 기존의 소광자인 BHQ에 못지 않은 소광능력을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
소광자570/FAM 와 BHQ1/FAM의 Ct 비교
FAM 소광자 batch1 소광자 batch1 BHQ1
1x10^7copies/rxn 1 18.03 18.31 18.46
2 18.09 18.12 18.22
평균 18.06 18.215 18.34
1x10^6copies/rxn 1 21.02 21.19 21.15
2 20.72 20.95 21.10
평균 20.87 21.07 21.13
1x10^5copies/rxn 1 25.14 25.19 25.17
2 24.86 25.07 25.00
평균 25 25.13 25.09
1x10^4copies/rxn 1 28.52 28.61 28.69
2 28.38 28.55 28.17
평균 28.45 28.58 28.43
소광자570/TET 와 BHQ1/TET의 Ct 비교
TET 소광자 batch1 소광자 batch1 BHQ1
1x10^7copies/rxn 1 18.25 18.56 18.27
2 18.09 17.97 18.05
평균 18.17 18.265 18.16
1x10^6copies/rxn 1 21.03 21.19 21.12
2 21 20.87 21.03
평균 21.015 21.03 21.08
1x10^5copies/rxn 1 25.01 24.81 25.18
2 24.65 24.59 24.72
평균 24.83 24.7 24.95
1x10^4copies/rxn 1 28.6 28.67 28.52
2 28.36 28.28 28.30
평균 28.48 28.475 28.41
소광자570/TAMRA 와 BHQ1/TAMRA의 Ct 비교
TAMRA BHQ1 소광자570
1x10^7copies/rxn 1 23.4 23.47
2 23.37 23.14
평균 23.39 23.31
1x10^6copies/rxn 1 26.5 26.7
2 26.68 26.36
평균 26.59 26.53
1x10^5copies/rxn 1 29.55 29.61
2 29.36 29.28
평균 29.46 29.46
1x10^4copies/rxn 1 31.91 32.06
2 31.96 31.84
평균 31.94 31.95
소광자570/ROX 와 BHQ2/ROX의 Ct 비교
ROX 소광자 batch1 소광자 batch1 BHQ2
1x10^7copies/rxn 1 17.85 17.78 18.01
2 17.9 17.56 18.01
평균 17.875 17.67 18.01
1x10^6copies/rxn 1 20.9 20.94 21.23
2 21.03 21.08 20.98
평균 20.965 21.01 21.11
1x10^5copies/rxn 1 25.2 24.5 24.53
2 24.36 24.3 24.37
평균 24.78 24.405 24.45
1x10^4copies/rxn 1 27.83 27.89 27.83
2 27.38 27.78 27.52
평균 27.605 27.835 27.68
소광자570/Texas-Red 와 BHQ2/Texas-Red의 Ct 비교
Texas-Red 소광자 batch1 소광자 batch1 BHQ2
1x10^7copies/rxn 1 17.83 17.89 17.82
2 17.87 17.76 17.46
평균 17.85 17.825 17.64
1x10^6copies/rxn 1 20.88 21.09 20.92
2 21.23 21.03 20.80
평균 21.055 21.06 20.86
1x10^5copies/rxn 1 24.19 23.36 24.13
2 24.2 24.3 24.17
평균 24.195 23.88 24.15
1x10^4copies/rxn 1 27.76 27.64 27.63
2 27.47 27.77 27.26
평균 27.615 27.705 27.45
이상의 본 발명은 상기에서 기술된 실시예에 의해 한정되지 않고, 통상의 기술자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그외에 다양한 생물학적, 화학적 분야에서 이용될 수 있고, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 소광자.
    [화학식 1]
    Figure 112016066616512-pat00086

    상기 화학식 1에서,
    A1은 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 가지고;
    Z10 내지 Z13은 서로 독립적으로 CR3 또는 질소이고;
    R3은 수소, 하이드록시기, C1-C10의 알콕시기 또는 C1-C10의 알킬기이며;
    Z14 내지 Z17 은 서로 독립적으로 CR4이고;
    R4는 수소, C1-C10의 알킬기, C1-C10의 카르복시기 또는 할로겐이고;
    L1은 C1-C30의 알킬기 또는 C1-C30의 알킬카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며,
    L2는 카르복실기가 치환된 C1-C30의 알킬, C1-C30의 알콕시카보닐이 치환된 C1-C30의 알킬 또는 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이다.
    [화학식 2]
    Figure 112016066616512-pat00055

    상기 화학식 2에서,
    Z1 내지 Z4는 서로 독립적으로 CR1이고;
    R1은 수소 또는 나이트로기이며,
    X1은 황 또는 산소이고;
    X2는 질소이다.
    [화학식 3]
    Figure 112016066616512-pat00056

    상기 화학식 3에서,
    Z5 내지 Z9는 서로 독립적으로 CR2 또는 질소이되, Z5 내지 Z9중 어느 하나는 반드시 질소이며,
    R2는 수소이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 소광자는 하기 화학식 6 또는 7로부터 선택되는 화합물을 포함하는 소광자.
    [화학식 6]
    Figure 112016066616512-pat00059

    [화학식 7]
    Figure 112016066616512-pat00060

    상기 화학식에서,
    Z18은 질소이고;
    L1은 C1-C30의 알킬기 또는 C1-C30의 알킬카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며;
    L2는 카르복실기가 치환된 C1-C30의 알킬, C1-C30의 알콕시카보닐이 치환된 C1-C30의 알킬 또는 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며;
    R15 내지 R18은 서로 독립적으로 H, C1-C10의 알콕시기 또는 C1-C10의 알킬기이다.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 소광자는 하기 화학식 8 내지 12로부터 선택되는 화합물을 포함하는 소광자.
    [화학식 8]
    Figure 112016066616512-pat00061

    [화학식 9]
    Figure 112016066616512-pat00062

    [화학식 10]
    Figure 112016066616512-pat00063

    [화학식 11]
    Figure 112016066616512-pat00064

    [화학식 12]
    Figure 112016066616512-pat00065
  6. 제 4항에 있어서, 상기 L1 또는 L2와 링커(linker)에 의해 연결되는 유리, 실리카, CPG(controlled pore glass), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플르오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시 또는 폴리아크릴아미드인 지지체(cleavable support)를 추가로 포함하며, 4,4-dimethoxytrityl(DMT)로 보호되는 하이드록시기를 추가로 포함하는 소광자.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 소광자는 하기 화학식 13 내지 17로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 소광자.
    [화학식 13]
    Figure 112017006053635-pat00066

    [화학식 14]
    Figure 112017006053635-pat00067

    [화학식 15]
    Figure 112017006053635-pat00068

    [화학식 16]
    Figure 112017006053635-pat00069

    [화학식 17]
    Figure 112017006053635-pat00070

    상기 화학식 13 내지 17에서 Y는 유리, 실리카, CPG(controlled pore glass), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플르오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시 또는 폴리아크릴아미드인 지지체이다.
  8. 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 소광자를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제 8항의 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 검출용 조성물.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 프로브는 리포터인 형광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 형광물질은 쿠마린(Coumarin), 플루오레세인(Fluorescein), 로다민(Rhodamine), BODIPY 및 사이아닌(Cyanine)으로 구성되는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  13. 하기 화학식 6 또는 7로부터 선택되는 신규 아조화합물.
    [화학식 6]
    Figure 112016066616512-pat00071

    [화학식 7]
    Figure 112016066616512-pat00072

    상기 화학식에서,
    Z18는 질소이고;
    L1은 C1-C30의 알킬기 또는 C1-C30의 알킬카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며;
    L2는 카르복실기가 치환된 C1-C30의 알킬, C1-C30의 알콕시카보닐이 치환된 C1-C30의 알킬 또는 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며;
    R15 내지 R18은 서로 독립적으로 H, C1-C10의 알콕시기 또는 C1-C10의 알킬기이다.
  14. 하기 화학식 6a의 화합물과 화학식 6b을 아조커플링 반응을 하여 화학식 6c의 화합물을 얻는 단계;
    상기 화학식 6c의 화합물을 얻는 단계 이후에 하기 화학식 6c와 하기 화학식 6d를 아조커플링 반응을 하여 화학식 6의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 하기 화학식6으로 표시되는 아조화합물의 제조방법.
    [화학식 6a]
    Figure 112016066616512-pat00073

    [화학식 6b]
    Figure 112016066616512-pat00074

    [화학식 6c]
    Figure 112016066616512-pat00075

    [화학식 6d]
    Figure 112016066616512-pat00076

    [화학식 6]
    Figure 112016066616512-pat00077

    상기 화학식에서,
    Z18는 질소이고;
    L1은 C1-C30의 알킬기 또는 C1-C30의 알킬카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며;
    L2는 카르복실기가 치환된 C1-C30의 알킬, C1-C30의 알콕시카보닐이 치환된 C1-C30의 알킬 또는 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며;
    R15 내지 R18은 서로 독립적으로 H, C1-C10의 알콕시기 또는 C1-C10의 알킬기이다.
  15. 하기 화학식 6a의 화합물과 화학식 6b을 아조커플링 반응을 하여 화학식 6c의 화합물을 얻는 단계; 및
    하기 화학식 6c와 하기 화학식 7a를 아조커플링 반응을 하여 화학식 7의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 하기 화학식 7로 표시되는 아조화합물의 제조방법.
    [화학식 6a]
    Figure 112016066616512-pat00087

    [화학식 6b]
    Figure 112016066616512-pat00088

    [화학식 6c]
    Figure 112016066616512-pat00089

    [화학식 7a]
    Figure 112016066616512-pat00078

    [화학식 7]
    Figure 112016066616512-pat00079

    상기 화학식에서,
    Z18는 질소이고;
    L1은 C1-C30의 알킬기 또는 C1-C30의 알킬카보닐옥시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며;
    L2는 카르복실기가 치환된 C1-C30의 알킬, C1-C30의 알콕시카보닐이 치환된 C1-C30의 알킬 또는 하이드록시기로 치환된 C1-C30의 알킬기이며;
    R15 내지 R18은 서로 독립적으로 H, C1-C10의 알콕시기 또는 C1-C10의 알킬기이다.
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