CN103436620B - 八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用 - Google Patents
八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103436620B CN103436620B CN201310379653.0A CN201310379653A CN103436620B CN 103436620 B CN103436620 B CN 103436620B CN 201310379653 A CN201310379653 A CN 201310379653A CN 103436620 B CN103436620 B CN 103436620B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- fluorophore
- yuan
- nucleotide sequence
- functional group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- CONWISUOKHSUDR-LBCLZKRDSA-N cucurbit[8]uril Chemical compound N1([C@@H]2[C@@H]3N(C1=O)CN1[C@@H]4[C@@H]5N(C1=O)CN1[C@@H]6[C@@H]7N(C1=O)CN1[C@@H]8[C@@H]9N(C1=O)CN1[C@@H]%10[C@@H]%11N(C1=O)CN1[C@@H]%12[C@@H]%13N(C1=O)CN([C@H]1N(C%14=O)CN%13C(=O)N%12CN%11C(=O)N%10CN9C(=O)N8CN7C(=O)N6CN5C(=O)N4CN3C(=O)N2C2)C3=O)CN4C(=O)N5[C@@H]6[C@H]4N2C(=O)N6CN%14[C@H]1N3C5 CONWISUOKHSUDR-LBCLZKRDSA-N 0.000 title abstract 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 239000010975 amethyst Substances 0.000 claims abstract description 20
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical group N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 41
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims description 40
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 40
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 34
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 17
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- -1 -isopropyl chloro phosphoramidite Chemical compound 0.000 claims description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 12
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 11
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 claims description 8
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 7
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 125000004890 (C1-C6) alkylamino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000171 (C1-C6) haloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 claims description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-diisopropylethylamine Substances CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000987 azo dye Substances 0.000 claims description 3
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XJHABGPPCLHLLV-UHFFFAOYSA-N benzo[de]isoquinoline-1,3-dione Chemical compound C1=CC(C(=O)NC2=O)=C3C2=CC=CC3=C1 XJHABGPPCLHLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N trans-stilbene Chemical group C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 claims description 3
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 12
- 238000010791 quenching Methods 0.000 abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 5
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 0 CCC(C1=CN=C1)=CN* Chemical compound CCC(C1=CN=C1)=CN* 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 2
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 125000004957 naphthylene group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIAFURWZWWWBQT-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanol Chemical compound NCCOCCO GIAFURWZWWWBQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWVTWFVJZLCBMC-UHFFFAOYSA-N 4,4'-bipyridine Chemical compound C1=NC=CC(C=2C=CN=CC=2)=C1 MWVTWFVJZLCBMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRYNJOJHKYNLIS-UHFFFAOYSA-N 6-hydroxynaphthalene-2-carbaldehyde Chemical compound C1=C(C=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 PRYNJOJHKYNLIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- BDKZHNJTLHOSDW-UHFFFAOYSA-N [Na].CC(O)=O Chemical class [Na].CC(O)=O BDKZHNJTLHOSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229920000547 conjugated polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- PBGGNZZGJIKBMJ-UHFFFAOYSA-N di(propan-2-yl)azanide Chemical compound CC(C)[N-]C(C)C PBGGNZZGJIKBMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000005311 nuclear magnetism Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920013636 polyphenyl ether polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明提供了一种八元瓜环自组装型分子信标，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团、在带有淬灭团Q的一端有一个紫晶和/或其衍生物官能团、所述萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内。本发明的分子信标可最大限度消除背景荧光，提高检测灵敏度，特别地，即使发生核酸酶降解，其荧光团F和淬灭团Q仍将被八元瓜环“锁定”，不会产生假阳性信号，为分子信标性能优化提供了一种创新思路，对分子生物学和生物医学的发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种八元瓜环（CB[8]）自组装型分子信标及其制备方法和应用。
背景技术
1996年，Tyagi和Krammer设计了一种可以特异性识别核苷酸序列的新型荧光探针-分子信标（Molecular Beacon，MB），它是由寡核苷酸形成的发夹型分子，分子的一端标记荧光染料，另一端标记淬灭团。该探针与核苷酸靶分子杂交后发生构象变化而发出荧光，没有识别靶序列的MB不发荧光，可以不必从检测体系中分离出来，大大简化了操作。茎环结构使MB对靶序列的识别有很强的特异性，甚至可以区分单碱基错配。由于其独特的性质和多功能性，MB在短时间内即得到了迅速发展，广泛应用于实时定量PCR监测、核苷酸动态定量测定、活细胞成像以及DNA/蛋白质相互作用研究等，临床医学上用于SARS病毒、乙肝病毒及癌症诊断等，并且其应用领域仍在不断拓展。
随着MB应用研究的深入开展，特别是后基因组时代的到来，对细胞内mRNA的表达、折叠、运输和亚细胞定位的了解显得愈发重要，尤其是在单个活细胞内进行mRNA追踪，对于广大生物学家和化学家来说更是一个富有挑战性的课题。要想实现MB对活体mRNA的高灵敏检测，必须面对以下二个方面的挑战：第一是核苷酸酶对MB骨架的降解和破坏，其不可避免地产生假阳性信号（MB包括一段核苷酸片断，普通MB在细胞中稳定存在的时间大概为45分钟，随后细胞内核苷酸酶的酶切使荧光团与淬灭团分开，背景信号显著增强）；第二是灵敏度，尽管MB已经具有其他核苷酸探针无可比拟的灵敏度，但在不进行扩增的情况下，要实时监测单细胞内低丰度目标物，其灵敏度仍远远不够。
为解决上述问题，研究者开展了大量的工作。首先，为避免核苷酸酶降解，提高MB在细胞中的稳定性，尝试对MB的结构进行各种改造修饰。如采用2’-氧-甲基化碱基修饰MB、硫代修饰MB、肽核苷酸MB（PNA）等。但遗憾的是，2’-氧-甲基化碱基修饰的MB与蛋白质可以进行非特异性结合，在细胞内背景信号很强；硫代化MB本身毒副作用比较大；肽核苷酸MB受限于其溶解度和团聚现象，使其应用受到了限制。
提高灵敏度的研究则主要集中在增强荧光团的荧光强度和提高淬灭团的淬灭效率两个方面。在荧光团的改进方面，Tan研究组将具有高量子产率的水溶性聚电解质PPEs（Poly(phenylene ethynylene)）通过聚合反应联结到DNA的末端作为分子信标的荧光团，虽然增强了分子信标与靶分子结合后的荧光信号强度，一定程度上提高了检测灵敏度，但其合成相对复杂（Huang H.,et al.Design of a modular-based fluorescent conjugated polymer forselective sensing.Angewandte Chemie International Edition,2004,43:5635-5638）。Kim等设计了一种用巯基乙酸包覆的量子点作为荧光团的分子信标，但其灵敏度还有待提高（Kim J.H.,et al.Adaptation of inorganic quantum dots for stable molecular beacons.Sensors and Actuators B:Chemical,2004,102:315-319）。在提高淬灭团的淬灭效率方面，Tan研究组将多个淬灭团同时修饰在分子信标上形成超淬灭分子信标，与带有单个淬灭团的分子信标相比，其灵敏度提高了将近14倍，但其合成难度及加工成本显著增加（Yang C.J.,et al.Molecular assembly ofsuperquenchers in signaling molecular interactions.Journal of the American Chemical Society,2005,127:12772-12773）。
发明内容
目前对分子信标性能的改进都是围绕其茎-环结构，以及对荧光团、淬灭团进行修饰和调整，但现有方法都不能同时解决核苷酸酶切带来的假阳性和提高灵敏度两个难题。其根本原因是，现有分子信标中荧光团和淬灭团与核苷酸的连接都是借助柔性的长链，两者在空间上的相对自由势必导致彼此不能最大限度靠近，而荧光团与淬灭团在空间上的充分靠近是其发生能量转移导致荧光淬灭的必要前提。
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能同时解决这两个难题的八元瓜环自组装型分子信标，并提供该分子信标的制备方法和应用。
本发明的发明人经大量研究发现，解决假阳性信号的有效办法是保证核苷酸酶切后荧光信号团和淬灭团彼此不发生分离，而提高荧光灵敏度的有效途径则是最大限度降低其背景荧光。
依据文献，电子云密度较高的2,6-二羟基萘（Np(OH)2）可以在带有正电荷的甲基紫晶（MV2+）陪伴下，通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，三者自组装得到稳定性较高的1∶1∶1配位化合物-甲基紫晶/2,6-二羟基萘/八元瓜环（MV2+/Np(OH)2/CB[8]）。而染料与八元瓜环的自组装建立在热力学最稳定的构型基础之上。本发明的发明人在该现象的基础上通过深入研究，发现如果将萘及其衍生物引入到分子信标的荧光团末端，将紫晶及其衍生物引入到淬灭团末端，利用八元瓜环独特的自组装特性将分子信标的荧光团和淬灭团在底部“套箍”在一起，再加上分子信标茎部碱基对的“束缚”，就可彻底消除两者在空间上的相对自由度使彼此充分靠近，获得最高效率的荧光淬灭及高的信背比（signal-background ratio），大大提高检测灵敏度。此外，即使发夹的茎部被核苷酸酶降解切开，八元瓜环仍能将荧光团和淬灭团紧紧“锁定”，彼此不能分离，因此不会产生核苷酸酶切造成的假阳性信号，显著提高检测灵敏度。
本发明的八元瓜环自组装型分子信标正是基于上述设计思想完成的发明，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团、在带有淬灭团Q的一端有一个紫晶和/或其衍生物官能团、所述萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，其结构式如通式Ⅰ所示：
通式Ⅰ中，
表示由核苷酸序列组成的茎-环结构，其中环部分为与所要特异性识别的碱基序列成互补的单链碱基序列，茎部分为由5-8对互补的碱基序列组成的双链结构；
表示八元瓜环；
Ax、Ay各自独立地选自C1-10烷基、C1-10烷基氨基、C1-10烷氧基、C1-10酰胺基、C1-10卤代烷基和(CH2)xO(CH2)y，其中x、y为1～10的整数；
F独立地选自荧光素类染料、罗丹明类染料、菁染料、二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芳香烃类及其衍生物官能团中的任意一种；
Q独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-6烷基、CHO、COOH、NH2、C1-6烷基氨基、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6酰胺基、取代或未取代的苄基、卤素和C1-6卤代烷基；
m、n为1～10的整数。
除另有说明外，本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C6烷基、C5烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴、碘。
本发明中，优选Ax、Ay各自独立地选自C1-10烷基、C1-10烷氧基和(CH2)xO(CH2)y，更优选各自独立地选自C1-6烷基和(CH2)2O(CH2)2。
优选R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-6烷基和C1-6烷氧基，更优选各自独立地选自H和甲基。优选R4选自C1-6烷基、OH和C1-6烷氧基，更优选选自OH和甲氧基。
此外，优选m、n为1-6的整数。
最优地，本发明的八元瓜环自组装型分子信标为如下化合物：
本发明用于制备上述八元瓜环自组装型分子信标的方法包括如下步骤：
用于制备八元瓜环自组装型分子信标的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）合成带有紫晶或其衍生物官能团及NHS酯活性基团的淬灭团
（a）中间体I的合成
将化合物a、EDC、NHS溶解在干燥四氢呋喃、乙腈、DMF或其混合溶剂中搅拌并加热至50-100℃，反应6-12 h后旋转蒸发除去溶剂，得到的油状物质用二氯甲烷溶解后，硅胶色谱柱层析分离，得到中间体I；
（b）中间体II的合成
将中间体I、三乙胺、DMAP在丙酮、乙腈、二氯甲烷或其混合溶剂中冰浴搅拌5-20 min，将对甲苯磺酰氯溶入二氯甲烷中，然后将该二氯甲烷溶液滴入上述反应液中反应过夜，旋转蒸发蒸干溶剂，用二氯甲烷溶解，再加入冰水洗涤，分液后干燥，得到二氯甲烷溶液，蒸干溶剂，残渣用二氯甲烷溶解后，硅胶色谱柱分离，得到中间体II；
（c）中间体III的合成
将中间体II、NaI加入丙酮、乙腈、四氢呋喃或其混合溶剂中，回流6-12 h，过滤除去固体，旋转蒸发除去溶剂，用二氯甲烷溶解后用硅胶色谱柱分离，得到中间体III；
（d）淬灭团IV的合成
将中间体III与带有取代基R2的单边紫晶衍生物b溶入干燥乙腈、DMF或其混合溶剂中，氮气保护下回流12-48 h，反应结束后过滤，用CH2Cl2洗涤，得到固体IV；
（2）合成带有萘或其衍生物官能团及2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺的荧光团
（a）中间体V的合成
将化合物c和d溶于乙二醇单甲醚、DMF或其混合溶剂中，氮气保护下回流6-12h，停止反应后旋转蒸发除去溶剂，用CH2Cl2溶解固体，硅胶柱层析得到中间体V；
（b）荧光团VI的合成
分别将中间体Ⅴ和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺e溶解在干燥二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或其混合溶剂中，先向V溶液中加入N,N-二异丙基乙胺，再在氮气保护下缓慢滴加2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺溶液，室温反应10-60min后，反应液用饱和NaHCO3溶液洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤后旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析纯化得到荧光团VI；
（3）八元瓜环自组装型分子信标的制备
（a）核苷酸序列的合成
采用常规的固相亚磷酰胺三酯法在DNA自动合成仪上得到需要的核苷酸序列（例如采用Wang(Edge R.).核酸探针的合成、标记及应用.北京：科学出版社1998:10记载的方法）；
（b）在核苷酸序列的5’端连接荧光团
经过脱DMT、偶联、封闭、氧化四步反应将荧光团VI连接到核苷酸序列上，然后用25%的浓氨水于55-75℃下反应8-15h进行氨解，将核苷酸序列从CPG上切除下来同时脱掉荧光团VI上的氰乙基保护基，将得到的溶液在冰上冷却，真空除去氨，离心除去CPG后即可得到5’端带有荧光团的核苷酸序列；
（c）在核苷酸序列的3’端连接淬灭团
在核苷酸序列的3’-OH端修饰上一个带Ax’的氨基末端，然后与带有NHS酯活性基团的淬灭团IV反应，经HPLC分离纯化，得到在核苷酸序列的5’端、3’端分别连接荧光团和淬灭团的核苷酸序列，即新型MB；
（d）将该新型MB与八元瓜环的水溶液混合，萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，得到八元瓜环自组装型MB；
上述各反应式中，Ax、Ay、F、Q、R1、R2、R3、R4、m、n的含义同上，X表示卤素，Ax’为Ax的反应前体；表示CPG微珠。
由本发明的方法合成的分子信标，可以采用核磁、质谱和液相色谱来确定其结构。
本发明还提供上述自组装型分子信标在特异性识别核苷酸序列中的应用。即，通过将本发明自组装型分子信标环部分的核苷酸序列设计成与所要特异性识别的靶核苷酸序列成互补的序列，就可用来特异性识别靶核苷酸序列。
本发明的有益效果在于：
（1）利用八元瓜环的自组装将分子信标中的荧光团F和淬灭团Q在底部“锁住”，既拉近了荧光团与淬灭团之间的距离，又增加了分子信标的荧光淬灭效率，有助于进一步提高分子信标的信噪比，最大限度消除背景荧光，提高检测灵敏度。
（2）即使发生核酸酶降解，本发明分子信标的荧光团F和淬灭团Q仍将被八元瓜环“锁定”，不会产生假阳性信号。
（3）本发明分子信标的结构简单，制备原料易得，通过几步反应即可合成目标分子，易产业化。
（4）本发明为分子信标性能优化提供了一种创新思路，对分子生物学和生物医学的发展具有重要意义。
附图说明
图1是分子信标荧光团Ⅴ-9的荧光光谱及淬灭团Ⅴ-5的紫外吸收光谱。
图2是分子信标淬灭团Ⅴ-5对荧光团Ⅴ-9淬灭效果的紫外吸收光谱。
图3是分子信标淬灭团Ⅴ-5对荧光团Ⅴ-9淬灭效果的荧光光谱。
图4是分子信标与八元瓜环自组装前后的相对荧光强度测试结果。
图5是分子信标与八元瓜环自组装前与靶序列cDNA作用的性能测试结果。
图6是分子信标与八元瓜环自组装后与靶序列cDNA作用的性能测试结果。
图7是分子信标与八元瓜环自组装前后与靶序列cDNA作用的性能测试的对比图。
图8是分子信标与八元瓜环自组装前的抗酶切能力测试结果。
图9是分子信标与八元瓜环自组装后的抗酶切能力测试结果。
图10是分子信标与八元瓜环自组装前后抗酶切能力的对比柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不限定于此。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，这些都应当落入本发明的保护范围内。
一、淬灭团的合成
（1）中间体Ⅴ-1的合成
将4-氨基苯甲酸（10.0g，73.0mmol）溶解在18%盐酸（150mL）中，冷却至0℃。然后在4℃下半小时内将冰冻的NaNO2水溶液（5.2g，75.4mmol）逐滴加入，很快形成淡黄色的重氮化溶液。将重氮化溶液缓慢加入到N-甲基-N-羟乙基苯胺（11.0g，73.0mmol）与37%盐酸（50mL）的溶液中，形成深红色反应液，反应在4℃以下进行2h后，用饱和醋酸钠溶液中和至中性，产生大量红色沉淀，过滤，水洗，烘干得到红色固体18.5g，产率85%。
（2）中间体Ⅴ-2的合成
称取3.0g（10.0mmol）中间体Ⅴ-1，4.0g（20.8mmol）EDC，2.3g（20.0mmol）NHS，溶解在35mL干燥DMF中搅拌并加热至60℃，反应12h后旋转蒸发除去DMF，将剩余油状物质用二氯甲烷溶解后，硅胶色谱柱层析分离，洗脱液为CH2Cl2/CH3OH（500/1-200/1，v/v），得红色固体2.98g，产率75%。1H NMR（400MHz,CDCl3），δ=8.23（d,J=8.6Hz,2H），7.92（d,J=8.8Hz,2H），7.91（d,J=8.8Hz,2H），6.83（d,J=9.2Hz,2H），3.90（t,J=5.7Hz,2H），3.65（t,J=5.6Hz,2H），3.15（s,3H），2.92（s,4H）。
（3）中间体Ⅴ-3的合成
取3.45g（8.7mmol）中间体Ⅴ-2溶于80mL丙酮中，再量取3.6mL（26.1mmol）三乙胺加入溶液中，加入催化量的DMAP（10mg），将此溶液冰浴搅拌10分钟。将4.96g（26.1mmol）对甲苯磺酰氯（TsCl）溶入50mL二氯甲烷中，然后将该二氯甲烷溶液滴入上述反应液中，14小时后，发现继续增加反应时间转化率也不再提高。旋转蒸发蒸干溶剂，用150mL二氯甲烷溶解，再加入约200mL冰水洗涤，分液后干燥，得到二氯甲烷溶液，蒸干溶剂，残渣用二氯甲烷溶解后，硅胶色谱柱分离，洗脱液为CH2Cl2/CH3OH（200/1，v/v），得到2.4g产物，产率51%。1H NMR（400MHz,CDCl3），δ=8.24（d,J=8.7Hz,2H），7.99–7.88（d,J=9.0Hz,2H），7.84（d,J=9.1Hz,2H），7.69（d,J=8.3Hz,2H），7.23（d,J=8.0Hz,2H），6.62（d,J=9.2Hz,2H），4.23（t,J=5.7Hz,2H），3.74（t,J=5.7Hz,2H），3.03（s,3H），2.92（s,4H），2.36（s,3H）。
（4）中间体Ⅴ-4的合成
将中间体Ⅴ-3（1.5g，2.73mmol），NaI（0.82g，5.46mmol）加入50mL丙酮中，回流10h，过滤除去固体，旋转蒸发除去溶剂，用二氯甲烷溶解固体后用硅胶色谱柱分离，洗脱液为甲醇/二氯甲烷（1/500，v/v），得红色粉末状固体V-4（1.3g，2.57mmol），产率94%。1H NMR（400MHz,CDCl3），δ=8.24（d,J=8.7Hz,1H），8.05–7.85（m,2H），6.77（d,J=9.2Hz,1H），4.05–3.69（m,1H），3.40–3.22（m,1H），3.15（s,1H），2.92（s,2H）。
（5）中间体单边甲基紫晶的合成
向溶解有10g（0.064mol）4,4’-联吡啶的150mL干燥二氯甲烷中缓慢滴加1.6mL（0.022mol）碘甲烷，室温氮气保护下搅拌2天。将生成的沉淀过滤，用二氯甲烷洗涤（50mL×3），干燥得到产品5.6g（0.0187mol），产率85%，直接用于下一步反应。
（6）淬灭团Ⅴ-5的合成
称取1.424g（2.81mmol）中间体Ⅴ-4及0.422g（1.4mmol）单边甲基紫晶溶入30mL除水乙腈中，氮气保护下回流48h。反应结束后过滤得黄黑色固体，用CH2Cl2洗至无黄色（50mL×2），得固体90.0mg，产率：8.8%。1H NMR（400MHz,D2O），δ=9.34（d,J=5.1Hz,1H），9.17（d,J=5.9Hz,1H），8.70（d,J=5.2Hz,1H），8.64（d,J=6.4Hz,1H），8.33（d,J=8.0Hz,1H），7.98（d,J=7.8Hz,1H），7.85（d,J=8.2Hz,1H），6.94（d,J=9.0Hz,1H），5.21（s,1H），4.55（s,2H），4.38（s,1H），3.19（s,2H），3.09（s,2H）；HRMS（TOF MS EI+）calculated forC31H30N6O4 2+550.2329，Found550.2320，（M-2I-）2+。
二、荧光团的合成
（1）中间体Ⅴ-6的合成
分别称取7.74g（4.5mmol）6-羟基-2-萘甲醛，2.4g（60mmol）氢氧化钠溶于75mL乙醇中，加热至缓慢回流，反应液由开始的绿色荧光、不太溶解变为荧光消失，直至完全溶解。向反应液中缓慢滴加CH3I（4mL），点板监测至反应物消失，将乙醇旋转蒸发除去，用乙酸乙酯溶解，氢氧化钠水溶液洗至无荧光，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到7.2g白色固体（产率86%）。
（2）中间体Ⅴ-7的合成
将上述Ⅴ-6溶于100mL甲醇中，溶液呈浑浊状，加入5mL甲胺水溶液后，反应物开始溶解直至完全溶解，常温搅拌过夜。往反应液中分批加入1.7g（45mmol）硼氢化钠，有大量气泡产生，加完后再在常温下反应2小时。反应完成后往反应液中加入约10mL水，产生少量白色沉淀，旋出甲醇，产物为不溶于水的油状物，静置冷却过夜，产物凝固，滤出，得白色固体7.2g。
（3）中间体Ⅴ-8的合成
将5.54g（20mmol）4-溴萘酐、2.4mL（24mmol）2-（2-胺基乙氧基）乙醇溶于100mL乙醇中，回流6h，放置过夜，析出晶体，过滤，再用100mL乙醇重结晶，得灰色晶状固体N-（2-（2-羟乙氧基）乙基）-4-溴-1,8-萘酰亚胺（即中间体Ⅴ-8）5.8g，收率80.0%。
（4）荧光团Ⅴ-9的合成
将1.2g（3.3mmol）中间体Ⅴ-8、2.1g（10.4mmol）中间体Ⅴ-7溶于20mL乙二醇单甲醚中，氮气保护下回流10h，停止反应后旋转蒸发除去溶剂，用CH2Cl2溶解固体并过硅胶柱，洗脱液为CH2Cl2/CH3OH（100/1，v/v）。柱层析分出黄色粉末产物Ⅴ-90.9g（1.9mmol），产率56.3%。1H NMR（400MHz,CDCl3），δ=8.59（d,J=6.3Hz,1H），8.56（d,J=7.8Hz,1H），8.51（d,J=8.2Hz,1H），7.89–7.82（m,1H），7.78（d,J=16.3Hz,1H），7.75（d,J=8.4Hz,1H），7.66–7.58（m,1H），7.35（d,J=8.4Hz,1H），7.22（d,J=8.3Hz,1H），7.20（d,J=2.6Hz,1H），7.16（s,1H），4.69（s,2H），4.45（m,J=7.0Hz,2H），3.94（t,J=4.6Hz,2H），3.87（t,J=4.6Hz,2H），3.79–3.57（m,5H），3.03（s,3H）。
（5）荧光团V-10的合成
将484mg（1.0mmol）中间体Ⅴ-9溶解在20mL干燥二氯甲烷中，再加入0.5mL N,N-二异丙基乙胺，量取0.34mL（1.5mmol）2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺溶解在5mL干燥二氯甲烷中，氮气保护下缓慢滴加到反应混合液中。室温反应30min后，用二氯甲烷稀释至50mL，反应液用饱和NaHCO3溶液洗涤2次，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤并旋转蒸发除去溶剂。硅胶柱层析纯化残留固体（石油醚/二氯甲烷/三乙胺=1:1:0.1，V/V/V）得390mg黄色油状中间体Ⅴ-10，产率57.0%。1H NMR(400MHz,CDCl3)，δ=8.55(d,J=7.3Hz,1H),8.52(d,J=9.4Hz,1H),8.48(d,J=8.2Hz,1H),7.78(s,1H),7.74(d,J=8.4Hz1H),7.73(m,J=8.8Hz1H),7.60(t,J=8.4Hz1H),7.35(d,J=8.4Hz,1H),7.20–7.15(m,3H),4.65(s,2H),4.42(t,J=6.2Hz,2H),3.92(s,3H),3.84-3.69(m,10H),3.63–3.45(m,2H),3.00(s,3H),2.60(t,J=6.0Hz,2H),1.13(dd,J=6.7,5.1Hz,12H).HRMS(TOF MS EI+),calculated forC38H45N4O6P+H+：685.7688,Found：685.2895，(M+H)+。
三、八元瓜环自组装型分子信标的制备
（1）核苷酸序列的设计
靶序列cDNA（互补DNA）：AGG TAT GGG TTC TTC CTT C。
分子信标中的核苷酸序列：5’-GCTCG TCC ATA CCC AAG AAG GAA G CGAGC-3’（其中划线部分为分子信标的茎部，未划线的部分为分子信标的环部）。
（2）分子信标的合成
分子信标的合成在DNA自动合成仪上进行。先用乙腈充分洗涤固相柱后，加入三氯乙酸，除去与CPG载体结合的核苷酸5’-OH上的DMT保护基团，形成游离羟基。彻底冲洗固相柱后通入氩气干燥，除去残留的乙腈。向柱上加入亚磷酰胺修饰的碱基以及亚磷酰胺活化剂四唑。亚磷酰胺与四唑快速反应，二异丙酰胺被质子化而且被四唑取代，亚磷酰胺的亚磷酸根与CPG结合的核苷酸上5’-OH发生偶联反应，形成5’-3’核苷酸键，将亚磷酰胺成功连接到与CPG结合的核苷酸上。将乙酐和1-甲基咪唑同时等体积输送到固相柱上，通过乙酰化封闭游离羟基。再用碘的四氢呋喃溶液作为氧化剂，将三价的亚磷酸三酯氧化成稳定的五价磷酸三酯。通过以上四个步骤，将一个脱氧核苷酸连接到固相载体CPG的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去该脱氧核苷酸5’-OH上的DMT保护基团，不断重复以上过程，直到得到需要的核苷酸序列。
加入荧光团V-10，重复上述步骤，得到5’端带有荧光团V-10的核苷酸序列。用25%的浓氨水于70℃下反应8h进行氨解，将核苷酸序列从CPG上切除下来，同时可脱掉氰乙基保护基。将得到的溶液在冰上冷却，真空除去氨，离心除去CPG。由于切割是在CPG载体的起始核苷酸3’-OH之间不稳定的酯键上进行，切下的核苷酸序列带有一个3’-OH。加入3’-氨基C6，用该C6氨基修饰核苷酸序列的3’-OH端，然后与带有NHS酯活性基团的淬灭团V-5反应，经HPLC分离纯化，得到新型MB。
通过MS及HPLC确定分子信标的正确性及其纯度，目标分子信标的理论分子量为10084.1Da，质谱得到的分子离子峰为10076.5Da，分子质量相差7.6Da，而且HPLC确定纯度大于98%。这说明合成的分子信标准确无误而且纯度很高，可用于相关测试。
（3）与八元瓜环的自组装
将上述合成的分子信标与八元瓜环的水溶液混合，萘官能团及甲基紫晶官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，得到八元瓜环自组装型MB。
实施例1荧光团Ⅴ-9及淬灭团Ⅴ-5的光谱测试
分别配制荧光团Ⅴ-9及淬灭团Ⅴ-5的去离子水溶液（浓度分别为1.0mM），得到母液。取荧光团Ⅴ-9母液和淬灭团Ⅴ-5母液进一步稀释，分别得到浓度为0.01mM的荧光团Ⅴ-9待测液和淬灭团Ⅴ-5待测液。分别测定荧光团Ⅴ-9待测液的荧光光谱（激发波长λex=437nm，荧光分光光度计型号：FP-6500）和淬灭团Ⅴ-5待测液的紫外吸收光谱（紫外可见分光光度计型号：HP8453），结果如图1所示。
实施例2淬灭团Ⅴ-5对荧光团Ⅴ-9淬灭效果的光谱测试
配制八元瓜环的去离子水溶液（浓度为0.1mM），作为八元瓜环母液。取实施例1配制的荧光团Ⅴ-9待测液，测定其紫外吸收光谱和荧光光谱，向其中加入相同量的实施例1配制的淬灭团Ⅴ-5母液，超声5分钟后测定其紫外吸收光谱和荧光光谱，然后再加入与荧光团Ⅴ-9待测液相同量的八元瓜环母液，超声5分钟后测定其紫外吸收光谱和荧光光谱，结果分别如图2和图3所示。激发波长和所用仪器同实施例1。
由图3可以看出，八元瓜环的加入大大提高了荧光淬灭效率，由此可以推知体系内形成了荧光染料-淬灭染料-八元瓜环的三元络合物，八元瓜环拉近了带有萘基团的荧光团及带有甲基紫晶基团的淬灭团之间的距离。
实施例3分子信标与八元瓜环自组装前后的相对荧光强度测试
将合成的分子信标用Tris-HCl缓冲溶液（50mM，pH7.5）配制成浓度为500nM的溶液，测定其荧光光谱，再加入两倍当量的八元瓜环，搅拌30分钟后测定其荧光光谱，结果如图4所示。激发波长和所用仪器同实施例1。
八元瓜环促进了分子信标的荧光淬灭，由此可以推知八元瓜环与分子信标上的萘基团及甲基紫晶基团作用形成三元络合物，使分子信标荧光进一步降低。
实施例4分子信标与八元瓜环自组装前后与靶序列cDNA作用的性能测试
将合成的分子信标用Tris-HCl缓冲溶液（50mM，pH7.5）配制成浓度为500nM的溶液，测定其荧光光谱，再加入十倍当量的靶序列cDNA，加热至95℃使分子信标发夹结构打开，然后退火，使其与cDNA互补配对结合，从而发出荧光，测定其荧光光谱，结果如图5所示。激发波长和所用仪器同实施例1。
由图5可以看出，当游离分子信标单独存在时，由于发夹结构的形成，荧光团与淬灭团靠近从而导致荧光淬灭，荧光强度很低，当加入cDNA后，由于发夹结构打开，使得荧光团与淬灭团远离，荧光增强约1.5倍。
此外，将合成的分子信标用Tris-Hcl缓冲溶液（50mM，pH7.5）配制成浓度为500nM的溶液，向其中加入两倍当量的八元瓜环母液（浓度为0.1mM），室温下搅拌30分钟，测试其荧光光谱，接着向八元瓜环自组装后的分子信标中加入十倍当量的cDNA，分别取搅拌15min及30min的样品，按实施例4那样进行高温退火、互补配对，当荧光不再增强时，测试其荧光光谱，结果如图6所示。分子信标与八元瓜环自组装前后与靶序列cDNA作用的性能测试的对比结果如图7所示。激发波长和所用仪器同实施例1。
实施例5分子信标与八元瓜环自组装前后抗酶切能力测试
将合成的分子信标用Tris-HCl缓冲溶液（50mM，pH7.5）配制成浓度为500nM的溶液，测定其荧光光谱。在另一个相同浓度的分子信标溶液中加入两倍当量的八元瓜环母液（浓度为0.1mM），室温下搅拌30分钟，测试其荧光光谱。待荧光强度稳定后分别向两个分子信标体系中加入1个单位的脱氧核糖核苷酸酶（DNaseⅠ）并快速搅拌4秒，测试样品的荧光光谱图，结果如图8和9所示。此外，分子信标与八元瓜环自组装前后抗酶切能力的对比结果如图10所示。激发波长和所用仪器同实施例1。
如图10所示，单独的分子信标被水解后荧光增强至约1.5倍，而当分子信标与八元瓜环混合搅拌完成自组装后，再加入水解酶时，荧光仅增强至1.16倍，这说明八元瓜环的自组装能够在一定程度上阻止酶切导致的假阳性信号。
Claims (3)
1.一种八元瓜环自组装型分子信标，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘或其衍生物官能团、在带有淬灭团Q的一端有一个紫晶或其衍生物官能团、所述萘或其衍生物官能团及紫晶或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，其结构式如通式Ⅰ所示：
通式Ⅰ中，
表示由核苷酸序列组成的茎-环结构，其中环部分为与所要特异性识别的碱基序列成互补的单链碱基序列，茎部分为由5-8对互补的碱基序列组成的双链结构；
表示八元瓜环；
Ax、Ay各自独立地选自C1-10烷基、C1-10烷基氨基、C1-10烷氧基、C1-10酰胺基、C1-10卤代烷基和(CH2)xO(CH2)y，其中x、y为1～10的整数；
F独立地选自荧光素类染料、罗丹明类染料、菁染料、二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芳香烃类及其衍生物官能团中的任意一种；
Q独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-6烷基、CHO、COOH、NH2、C1-6烷基氨基、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6酰胺基、取代或未取代的苄基、卤素和C1-6卤代烷基；
m、n为1～10的整数。
2.一种用于制备八元瓜环自组装型分子信标的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成带有紫晶或其衍生物官能团及NHS酯活性基团的淬灭团
(a)中间体I的合成
将化合物a、EDC、NHS溶解在干燥四氢呋喃、乙腈、DMF或其混合溶剂中搅拌并加热至50-100℃，反应6-12h后旋转蒸发除去溶剂，得到的油状物质用二氯甲烷溶解后，硅胶色谱柱层析分离，得到中间体I；
(b)中间体II的合成
将中间体I、三乙胺、DMAP在丙酮、乙腈、二氯甲烷或其混合溶剂中冰浴搅拌5-20min，将对甲苯磺酰氯溶入二氯甲烷中，然后将该二氯甲烷溶液滴入上述反应液中反应过夜，旋转蒸发蒸干溶剂，用二氯甲烷溶解，再加入冰水洗涤，分液后干燥，得到二氯甲烷溶液，蒸干溶剂，残渣用二氯甲烷溶解后，硅胶色谱柱分离，得到中间体II；
(c)中间体III的合成
将中间体II、NaI加入丙酮、乙腈、四氢呋喃或其混合溶剂中，回流6-12h，过滤除去固体，旋转蒸发除去溶剂，用二氯甲烷溶解后用硅胶色谱柱分离，得到中间体III；
(d)淬灭团IV的合成
将中间体III与带有取代基R2的单边紫晶衍生物b溶入干燥乙腈、DMF或其混合溶剂中，氮气保护下回流12-48h，反应结束后过滤，用CH2Cl2洗涤，得到淬灭团IV；
(2)合成带有萘或其衍生物官能团及2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺的荧光团
(a)中间体V的合成
将化合物c和d溶于乙二醇单甲醚、DMF或其混合溶剂中，氮气保护下回流6-12h，停止反应后旋转蒸发除去溶剂，用CH2Cl2溶解固体，硅胶柱层析得到中间体V；
(b)荧光团VI的合成
分别将中间体Ⅴ和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺e溶解在干燥二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或其混合溶剂中，先向V溶液中加入N,N-二异丙基乙胺，再在氮气保护下缓慢滴加2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺溶液，室温反应10-60min后，反应液用饱和NaHCO3溶液洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤后旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析纯化得到荧光团VI；
(3)八元瓜环自组装型分子信标的制备
(a)核苷酸序列的合成
采用常规的固相亚磷酰胺三酯法在DNA自动合成仪上得到需要的核苷酸序列；
(b)在核苷酸序列的5’端连接荧光团
经过脱DMT、偶联、封闭、氧化四步反应将荧光团VI连接到核苷酸序列上，然后用25％的浓氨水于55-75℃下反应8-15h进行氨解，将核苷酸序列从CPG上切除下来同时脱掉荧光团VI上的氰乙基保护基，将得到的溶液在冰上冷却，真空除去氨，离心除去CPG后即可得到5’端带有荧光团的核苷酸序列；
(c)在核苷酸序列的3’端连接淬灭团
在核苷酸序列的3’-OH端修饰上一个带Ax’的氨基末端，然后与带有NHS酯活性基团的淬灭团IV反应，经HPLC分离纯化，得到在核苷酸序列的5’端、3’端分别连接荧光团和淬灭团的核苷酸序列，即新型MB；
(d)将该新型MB与八元瓜环的水溶液混合，萘或其衍生物官能团及紫晶或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，得到八元瓜环自组装型MB；
上述各反应式中，
Ax、Ay各自独立地选自C1-10烷基、C1-10烷基氨基、C1-10烷氧基、C1-10酰胺基、C1-10卤代烷基和(CH2)xO(CH2)y，其中x、y为1～10的整数；
Ax’为Ax的反应前体；
F独立地选自荧光素类染料、罗丹明类染料、菁染料、二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芳香烃类及其衍生物官能团中的任意一种；
Q独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-6烷基、CHO、COOH、NH2、C1-6烷基氨基、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6酰胺基、取代或未取代的苄基、卤素和C1-6卤代烷基；
m、n为1～10的整数；
X表示卤素；
表示CPG微珠，表示八元瓜环。
3.权利要求1所述的八元瓜环自组装型分子信标在非疾病诊断或治疗目的特异性识别核苷酸序列中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310379653.0A CN103436620B (zh) | 2013-08-27 | 2013-08-27 | 八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310379653.0A CN103436620B (zh) | 2013-08-27 | 2013-08-27 | 八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103436620A CN103436620A (zh) | 2013-12-11 |
| CN103436620B true CN103436620B (zh) | 2015-02-04 |
Family
ID=49690334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310379653.0A Expired - Fee Related CN103436620B (zh) | 2013-08-27 | 2013-08-27 | 八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103436620B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108976434B (zh) * | 2018-08-03 | 2021-02-12 | 贵州大学 | 一种基于八元瓜环的超分子框架材料的制备方法和应用 |
| JP2024000312A (ja) * | 2022-06-20 | 2024-01-05 | Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 | 蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチド |
-
2013
- 2013-08-27 CN CN201310379653.0A patent/CN103436620B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 分子信标研究进展;康燕等;《化学传感器》;20080630;第28卷(第2期);第1-11页 * |
| 紫精与八元瓜环的超分子组装及光切割质粒DNA;张同艳等;《高等学校化学学报》;20120229;第33卷(第2期);第292-297页 * |
| 蔡元志.葫芦脲(瓜环)及其超分子化学简介.《兴义民族师范学院学报》.2010,(第3期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103436620A (zh) | 2013-12-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3946443B2 (ja) | 非対称シアニン色素クエンチャー | |
| KR20180129896A (ko) | 강성 공간군을 갖는 매우 밝은 이량체성 또는 중합체성 염료 | |
| CN102276481B (zh) | 一种杯芳烃衍生物及其金属配合物以及它们的制备方法和应用 | |
| EP3464310B1 (en) | Tagged multi-nucleotides useful for nucleic acid sequencing | |
| CA3060690C (en) | Multisignal labeling reagents and processes and uses therefor | |
| AU1442101A (en) | Hybridization-triggered fluorescent detection of nucleic acids | |
| JP6297035B2 (ja) | 新規アゾ化合物、これの利用及びこれの製造方法 | |
| CN107254027B (zh) | 两亲性嵌段聚合物及其制备方法、嵌段聚合物囊泡及其制备方法与应用 | |
| Astakhova et al. | Highly Fluorescent Conjugated Pyrenes in Nucleic Acid Probes:(Phenylethynyl) pyrenecarbonyl‐Functionalized Locked Nucleic Acids | |
| CN105017288A (zh) | 一种蓝色荧光化合物及其制备方法 | |
| CN104945322A (zh) | 检测肿瘤乏氧的化合物及其制备方法 | |
| CN110240699A (zh) | 一类具有圆偏振发光性能的侧链型液晶聚合物及其制备方法 | |
| CN115260083A (zh) | 一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的制备方法及应用 | |
| CN103436620B (zh) | 八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用 | |
| Okamoto et al. | A nucleic acid probe labeled with desmethyl thiazole orange: a new type of hybridization-sensitive fluorescent oligonucleotide for live-cell RNA imaging | |
| WO2024114485A1 (zh) | 一种荧光开启型核苷及其制备方法和应用 | |
| CN107434814A (zh) | 改性共轭聚合物及其制备方法和应用 | |
| Pasternak et al. | Photoligation of self-assembled DNA constructs containing anthracene-functionalized 2′-amino-LNA monomers | |
| CN114621248B (zh) | 识别rna和具有光动力的荧光探针及其制备方法 | |
| CN109575240B (zh) | 一种高荧光量子效率的红光聚合物及量子点溶液及用途 | |
| CN107207480B (zh) | 香豆素基化合物及相关方法 | |
| CN112410404A (zh) | 一种开启型双光子核酸探针及其在fish中的应用 | |
| CN111138435A (zh) | 一种修饰过的甲氨蝶呤及其制备方法和应用 | |
| CN108732147A (zh) | 基于fret效应探测细胞凋亡过程的方法 | |
| RU2497825C1 (ru) | Конъюгат фолиевой кислоты и способ его получения |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150204 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |