CN104583232A

CN104583232A - 展现gip受体活性的胰高血糖素类似物

Info

Publication number: CN104583232A
Application number: CN201380040322.2A
Authority: CN
Inventors: R.D.迪马基
Original assignee: Indiana University Research and Technology Corp
Current assignee: Indiana University Research and Technology Corp
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: TWI599575B; KR20150023013A; US9340600B2; CN104583232B; JP6311708B2; TW201402598A; JP2015521622A; CA2877358A1; EP2864351A1; RU2015101697A; HK1209764A1; MX2014015558A; ES2602486T3; WO2013192129A1; US20140011738A1; EP2864351B1; AR091477A1

Abstract

本文提供展现针对GIP受体的有效活性的胰高血糖素类似物，且因而预期用于治疗糖尿病和肥胖症。在示例性实施方案中，本公开的胰高血糖素类似物展现在纳摩尔或皮摩尔范围内的针对GIP受体的EC50。

Description

展现GIP受体活性的胰高血糖素类似物

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年6月21日申请的美国临时专利申请号61/662,868和2012年10月22日申请的美国临时专利申请号61/716,878的优先权；各申请的内容以其整体通过引用并入本申请中。

通过引用并入电子提交的材料

以其整体通过引用并入与本申请同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表且标识如下：命名为”224956 SeqListing.txt”的428千字节ACII(Text)文件，创建于2013年6月11日。

背景

根据来自美国糖尿病协会(American Diabetes Association)的国家糖尿病情况说明书(National Diabetes Fact Sheet)的最新数据，在美国有23.6百万名儿童和成人患有糖尿病。在年龄为20岁或20岁以上的人群中，每年新诊断出1.6百万例糖尿病。根据 Journal of the American Medical Association 中最近公开的研究，美国超过三分之二的成人为超重的或肥胖的(Flegal等人，JAMA 303(3)：235-241(2010))且该群体中超过三分之一为肥胖的。

肠促胰岛素激素(胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP))为天然存在的肽激素。GLP-1与GIP两者都以葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素合成和分泌且不产生低血糖(参见例如Nauck等人， J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:912-917 (1993)和Irwin等人, Regul. Pept. 153:70-76 (2009))。

已显示GLP-1可有效作为糖尿病的辅助治疗且伴随着体重减轻。然而，关于GIP靶向治疗仍然不清楚的是，经由拮抗该激素的作用(例如经由GIP受体拮抗作用)或经由模拟或增强GIP的作用是否将实现糖尿病和肥胖症的成功治疗。

概述

本文提供作为预期用于治疗有需要的主体(例如患有糖尿病和肥胖症)的GIP激动剂肽的肽。

天然胰高血糖素不活化GIP受体，且通常具有天然GLP-1针对GLP-1受体的活性的约1%。在一些实施方案中，所述肽为包含基于天然人胰高血糖素的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的结构但与SEQ ID NO：1相比在一个或多个位置不同的胰高血糖素类似物，其中所述差异或修饰增强该类似物针对GIP受体的激动剂活性。此类胰高血糖素类似物针对GIP受体的激动剂活性将大于天然胰高血糖素的活性且在一些方面大于天然GIP的活性。在一些或任何实施方案中，GIP激动剂具有至少0.1%的GIP效价百分比。在本公开的一些或任何方面，胰高血糖素类似物另外展现针对胰高血糖素受体和GLP-1受体中的一者或两者的激动剂活性。因此，本文提供GIP激动剂、GIP-GLP-1共激动剂、GIP-胰高血糖素共激动剂和GIP-GLP-1-胰高血糖素三重激动剂。

在示例性实施方案中，本公开的GIP激动剂肽针对人GLP-1受体相比于GIP受体的选择性小于100倍。在一些或任何实施方案中，GIP激动剂肽的GIP效价百分比与胰高血糖素效价百分比和/或GLP-1效价百分比相差20倍或10倍以内(更高或更低)。

在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含：(i)位置1的包含咪唑侧链的氨基酸(例如His)；(ii)位置2的DPP-IV保护性氨基酸，任选地，氨基异丁酸；(iii)任选地在位置9、10、12、16、20或37-43中的任何位置包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选地其中非天然酰基或烷基经由间隔基连接至此氨基酸；(iv)位置20的α,α双取代氨基酸或包含咪唑侧链的氨基酸；和(v)相对于SEQ ID NO：1的多至10个(例如，多至1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)额外氨基酸修饰。

在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含：(i)类似物的位置3的选自以下的氨基酸：Ala、Leu、Ile、Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met和甲硫氨酸砜；(iv)位置9、10、12、16、20或37-43中的任何位置的酰化或烷基化氨基酸，任选地其中非天然酰基或烷基经由间隔基连接至此氨基酸；(iii)位置16-21中的一个或多个位置的α螺旋稳定性氨基酸；和(v)相对于SEQ ID NO：1的多至10个(例如，多至1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)额外氨基酸修饰。在示例性实施方案中，当胰高血糖素类似物缺乏亲水性部分时，胰高血糖素类似物展现至少0.1%(例如，至少1%、至少10%、至少20%)的GIP效价百分比。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物针对人GLP-1受体相比于GIP受体的选择性小于100倍(例如，小于50倍、小于25倍、小于10倍)。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物展现针对GLP-1受体的EC50为其针对GIP受体的EC50的100倍以内(例如，50倍以内、25倍以内、10倍以内)。

在整个本申请中，所有由数字对特定氨基酸位置的提及(例如，位置28)是指天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)中的该位置或其任何类似物中的相应氨基酸位置的氨基酸。例如，本文提及“位置28”将意指SEQ ID NO：1的第一氨基酸已缺失的胰高血糖素类似物的相应位置27。类似地，本文提及“位置28”将意指在SEQ ID NO：1的N末端之前已添加一个氨基酸的胰高血糖素类似物的相应位置29。

本发明还提供肽，其包含：

(a)序列：

其中：

X₂为AIB；

X₃为Gln或包含如本文所述的结构I、II或III的侧链结构的氨基酸；

X₁₀为Tyr或共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅为酸性氨基酸，任选地为Glu或Asp；

X₁₆为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；例如，Glu、Ala、α,α-双取代氨基酸(例如AIB)、His、Lys；

X₁₇为Arg、His、Gln；

X₁₈为Arg或Ala；

X₁₉为Ala或α,α双取代氨基酸；

X₂₀选自：α,α-双取代氨基酸(例如AIB)或Gln或His、Lys或Ala；

X₂₁为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；

X₂₇为Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；

X₂₉为脂肪族的，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀为小脂肪族氨基酸，例如，Ala或Gly；

X₃₅为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；

其中，当X₂₈为酸性氨基酸时，X₃₅为碱性氨基酸；

任选地，其中，当X₂₈为Asp时，则X₂₉不是Gly；

其中，当X₁₀为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，该肽在位置41包含Gly；

其中该肽的C末端氨基酸被酰胺化；

或

(b)相对于SEQ ID NO：66具有多至3个(例如，1个、2个或3个)氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66，其中该肽展现针对人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。

本发明还提供肽，其包含：

(a)序列：

其中：

X₁为包含侧链咪唑的氨基酸，任选地为His或His衍生物；

X₂为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸(例如AIB)；

X₃选自：Glu、Ala、Leu、Ile、Nle、Val、NorVal、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸、乙酰基-Lys；

X₁₀为共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅为酸性氨基酸，任选地为Glu或Asp；

X₁₆为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；(例如，Glu、Ala、α,α-双取代氨基酸(例如AIB)、His、Lys)；

X₁₇为Arg、His、Gln；

X₁₈为Arg或Ala；

X₁₉为Ala或α,α双取代氨基酸；

X₂₀选自：α,α-双取代氨基酸(例如AIB)或Gln或His、Lys或Ala；

X₂₁为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；

X₂₇为Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；

X₂₉为脂肪族的，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀为小脂肪族氨基酸，例如，Ala或Gly；

X₃₅为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；

其中，当X₂₈为酸性氨基酸时，X₃₅为碱性氨基酸；

任选地，其中，当X₂₈为Asp时，则X₂₉不是Gly；

其中该肽的C末端氨基酸被酰胺化；

或

(b)相对于SEQ ID NO：67具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67，其中该肽展现针对人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。

在包含具有多至3个(例如，1个、2个或3个)氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67的肽的示例性方面，当X₂₈为Asp时，X₂₉不是Gly。在包含相对于SEQ ID NO：66具有多至3个(例如，1个、2个或3个)氨基酸的序列SEQ ID NO：66的肽的示例性方面，(i)X₁为包含侧链咪唑的氨基酸；(ii)X₂为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸；(iii)该肽的C末端氨基酸被酰胺化；和(iv)当X₁₀为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。

在示例性实施方案中，GIP激动剂肽包含SEQ ID NO：19、21-26、28、287、289-294、296、520、522-527和529中的任一种或SEQ ID NO：30、31、32、33、35、37、38和41中的任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，GIP激动剂肽包含基于包含SEQ ID NO：30、31、32、33、35、37、38、41、298、299、300、301、303、305、306、309、531、532、533、534、536、538、539和542中的任一种的亲本序列但在一个或多个位置与该亲本序列不同的结构，如本文进一步描述。在包含基于包含SEQ ID NO：30、31、32、33、35、37、38、41、298、299、300、301、303、305、306、309、531、532、533、534、536、538、539和542中的任一种的亲本序列但在一个或多个位置与该亲本序列不同的结构的肽的示例性方面，当位置28的氨基酸为Asp时，位置29的氨基酸不是Gly。在包含基于包含SEQ ID NO：30、31、32、33、35、37、38、41、298、299、300、301、303、305、306、309、531、532、533、534、536、538、539和542中的任一种的亲本序列但在一个或多个位置与该亲本序列不同的结构的肽的示例性方面，(i)位置1的氨基酸为包含侧链咪唑的氨基酸；(ii)位置2的氨基酸为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸；(iii)该肽的C末端氨基酸被酰胺化；和(iv)当位置10的氨基酸为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。

本发明因此提供包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的肽：序列SEQ ID NO：18。还提供包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的肽：序列SEQ ID NO：43。

本发明还提供包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的肽：SEQ ID NO：100-282、SEQ ID NO：333-515中的任一种。

本发明还提供包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的肽：SEQ ID NO：15-28、34、36、39、42、43、44、52、53、63-65、283-296、302、304、307、310、311、312、320、321、330-332、516-529、535、537、540、543、544、545、553、554和563-565中的任一种。

本发明还提供包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的肽：SEQ ID NO：29-42、297-310和530-543中的任一种。

本文提供其他包含具有多至三个(例如，一个、两个、三个)氨基酸修饰的上述SEQ ID NO：的氨基酸序列中的一种的肽。在示例性方面，当位置28的氨基酸为Asp时，位置29的氨基酸不是Gly。在示例性方面，(i)位置1的氨基酸为包含侧链咪唑的氨基酸；(ii)位置2的氨基酸为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸；(iii)该肽的C末端氨基酸被酰胺化；和(iv)当位置10的氨基酸为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。

本文还提供包含两个或更多个的本公开GIP激动剂肽的二聚体和多聚体。本文另外提供包含本公开GIP激动剂肽和缀合物部分的缀合物。在一些方面，缀合物为包含融合至异源肽的本公开GIP激动剂肽的融合多肽。本公开还提供包含本公开的GIP激动剂肽、二聚体、多聚体或缀合物(或其组合)的试剂盒。

本公开进一步提供包含本公开的GIP激动剂肽、二聚体、多聚体或缀合物中的任一种(或其组合)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物优选为无菌的且适于肠胃外施用。所述药物组合物预期用于治疗或预防糖尿病或肥胖症、或与糖尿病或肥胖症相关的医学病况的方法中。因此，在示例性实施方案中，本公开提供减少体重增加或诱导体重减轻的方法、治疗或预防糖尿病或肥胖症的方法、和诱导肠道的暂时麻痹的方法。在以下说明书中提供肽类似物和包含其的药物组合物的其他应用。

附图简述

图1表示经皮下注射媒介物对照、SEQ ID NO：18的肽、SEQ ID NO：29的肽或SEQ ID NO：10的肽的DIO小鼠的作为时间函数的体重变化(%)的图。

图2表示经皮下注射媒介物对照、SEQ ID NO：10的肽、SEQ ID NO：18的肽、SEQ ID NO：43的肽、SEQ ID NO：44的肽、SEQ ID NO：45的肽、SEQ ID NO：46的肽、SEQ ID NO：47的肽或SEQ ID NO：48的肽的DIO小鼠的总体重变化(如在第14天所测量)的图。

图3表示经皮下注射媒介物对照、SEQ ID NO：10的肽、SEQ ID NO：18的肽、SEQ ID NO：43的肽、SEQ ID NO：44的肽、SEQ ID NO：45的肽、SEQ ID NO：46的肽、SEQ ID NO：47的肽或SEQ ID NO：48的肽的DIO小鼠的总食物摄入(如在第14天所测量)的图。

图4表示经皮下注射媒介物对照、SEQ ID NO：10的肽、SEQ ID NO：18的肽、SEQ ID NO：43的肽、SEQ ID NO：44的肽、SEQ ID NO：45的肽、SEQ ID NO：46的肽、SEQ ID NO：47的肽或SEQ ID NO：48的肽的DIO小鼠的血糖水平变化(mg/dL；第14天的水平-第0天的水平)的图。

图5表示经皮下注射媒介物对照、SEQ ID NO：10的肽、SEQ ID NO：18的肽、SEQ ID NO：43的肽、SEQ ID NO：44的肽、SEQ ID NO：45的肽、SEQ ID NO：46的肽、SEQ ID NO：47的肽或SEQ ID NO：48的肽的DIO小鼠的脂肪质量变化(g；第14天的水平-第0天的水平)的图。

详述

本公开提供展现针对GIP受体的激动剂活性的GIP激动剂肽(例如，天然人胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物(也称为“胰高血糖素类似物”)、SEQ ID NO：19-22、24-26和28中的任一种或SEQ ID NO：23、27和29-42中的任一种的类似物)。如本文所用的术语“肽”涵盖具有2个或更多个氨基酸且通常小于100个或小于50个氨基酸的序列。所述氨基酸可以是天然存在或编码或非天然存在或非编码的。非天然存在的氨基酸是指不天然存在于体内但可并入本文所述的肽结构中的氨基酸。如本文所用的“非编码的”是指不是以下20种氨基酸Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr中的任一种的L-异构体的氨基酸。术语“GIP激动剂肽”是指结合至GIP受体且活化GIP受体的下游信号传导的化合物。GIP激动剂肽可具有本文所述的针对GIP受体的活性水平(例如，绝对活性水平或相对活性水平)、对于GIP受体的选择性或GIP效价百分比中的任一种。参见例如标题为GIP 受体活性的部分。然而，此术语不应理解为限制化合物仅具有针对GIP受体的活性。反而，本公开的GIP激动剂肽可展现针对其他受体的额外活性，如本文进一步所讨论。例如，GIP激动剂肽可展现针对GLP-1受体和/或胰高血糖素受体的激动剂活性。

本公开的肽的活性

GIP 受体活性

在一些或任何实施方案中，本公开的肽展现的针对GIP受体活化的EC50在纳摩尔浓度范围内。在示例性实施方案中，肽针对GIP受体的EC50小于1000nM、小于900nM、小于800nM、小于700nM、小于600nM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于200nM。在一些实施方案中，肽针对GIP受体的EC50为约100nM或更小，例如，约75nM或更小、约50nM或更小、约25nM或更小、约10nM或更小、约5nM或更小、或约1nM或更小。在一些或任何实施方案中，本公开的肽展现针对GIP受体活化的EC50在皮摩尔浓度范围内。在示例性实施方案中，GIP激动剂肽针对GIP受体的EC50小于1000pM、小于900pM、小于800pM、小于700pM、小于600pM、小于500pM、小于400pM、小于300pM、小于200pM。在一些实施方案中，肽针对GIP受体的EC50为约100pM或更小，例如，约75pM或更小、约50pM或更小、约25pM或更小、约10pM或更小、约5pM或更小、或约1pM或更小。如本文所用的术语“约”意指比所述值或值范围大或小10%，但不欲将任何值或值范围指定为仅该较宽定义。前面有术语“约”的各值或值范围还意欲涵盖所述绝对值或值范围的实施方案。

本领域中已知适于测定肽针对受体(例如GIP受体)活化的EC50的方法。一种示例性体外测定法在本文描述于实施例2中，其中如由荧光素酶活性表示的cAMP诱导作用在过表达GIP受体的HEK293细胞中测量。

在一些或任何实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本公开的肽展现针对GIP受体的增强活性。天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)不活化GIP受体；天然胰高血糖素展现天然GIP针对GIP受体的活性的基本上0%(例如，小于0.001%、小于0.0001%)。肽相对于天然胰高血糖素针对GIP受体的相对活性以(本公开肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50) X 100%的反比来计算。

肽相比于天然GIP针对GIP受体的相对活性以(本公开肽的EC50/天然GIP的EC50) X 100%的反比(本文也称为“GIP效价百分比”的值)来计算。

在本公开的一些或任何实施方案中，本公开的肽展现至少或约0.1%的GIP效价百分比。在示例性实施方案中，所述肽展现天然GIP针对GIP受体的活性的至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、或至少或约100%。

在本公开的一些实施方案中，本公开的肽展现针对GIP受体的活性大于天然GIP针对GIP受体的活性。在示例性实施方案中，GIP激动剂肽展现至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%、至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%、或至少或约1000%的GIP效价百分比。在一些实施方案中，本文所述的GIP激动剂肽展现不大于1000%或不大于10,000%的GIP效价百分比。

在一些方面，本公开的肽展现GIP效价百分比在约0.001%至约10,000%、或约0.01%至约10,000%、或约0.1%至约10,000%、或约1%至约10,000%、或约0.001%至约5000%、或约0.01%至约5000%、或约0.1%至约5000%、或约0.1%至约1000%的范围内。

共激动剂

在一些或任何实施方案中，本公开的肽只要活化GIP受体和不同于GIP受体的第二受体即为共激动剂肽。

GIP/GLP-1 共激动剂

例如，在一些方面中本公开的肽展现针对GIP受体与GLP-1受体两者的活性(“GLP-1/GIP受体共激动剂”)。在一些方面，所述肽展现针对GLP-1和GIP受体的活性，但胰高血糖素活性已例如由于位置3的氨基酸修饰而显著降低或破坏。例如，在该位置被酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)取代降低胰高血糖素活性。在一些或任何实施方案中，GIP激动剂肽为展现天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体的活性的约10%或更小(例如，约5%或更小、或约1%或更小、或约0.1%或更小)的肽。

在一些或任何实施方案中，本公开的肽针对GIP受体的EC50与其针对GLP-1受体的EC50相差在约50倍或更小、约40倍或更小、约30倍或更小、约20倍或更小、或约10倍或更小、或约5倍或更小以内(更高或更低)。例如，针对GIP受体的EC50可比针对GLP-1受体的EC50高10倍或低10倍。在一些或任何实施方案中，本公开的肽的GIP效价百分比与其GLP-1效价百分比相差小于或约50倍、40倍、30倍、20倍、10倍或5倍(更高或更低)。

因此，本公开的肽针对人GLP-1受体相比于GIP受体的选择性小于100倍。如本文所用的术语分子针对第一受体相比于第二受体的“选择性”是指以下比率：分子针对第二受体的EC50除以分子针对第一受体的EC50。例如，针对第一受体的EC50为1nM且针对第二受体的EC50为100nM的分子针对第一受体相比于第二受体的选择性为100倍。在示例性实施方案中，本公开的肽针对人GLP-1受体相比于GIP受体的选择性小于100倍(例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约10倍、小于或约5倍)。

在一些或任何实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本公开的肽展现针对GLP-1受体的增强活性。天然胰高血糖素针对GLP-1受体的活性为天然GLP-1针对GLP-1受体的活性的约1%。肽相比于天然胰高血糖素针对GLP-1受体的相对活性以(本公开肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50) X 100%的反比来计算。

肽相比于天然GLP-1针对GLP-1受体的相对活性以(本公开肽的EC50/天然GLP-1的EC50) X 100%的反比(本文也称为“GLP-1效价百分比”的值)来计算。

在本公开的一些或任何实施方案中，本公开的肽展现至少或约0.1%的GLP-1效价百分比。在示例性实施方案中，所述肽展现至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、或至少或约100%的GLP-1效价百分比。

在本公开的一些实施方案中，本公开的肽展现针对GLP-1受体的活性大于天然GLP-1针对GLP-1受体的活性。在示例性实施方案中，本公开的肽展现至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%、至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%、或至少或约1000%的GLP-1效价百分比。在一些实施方案中，本公开的肽展现不大于1000%或不大于10,000%的GLP-1效价百分比。

GIP/ 胰高血糖素共激动剂

作为另一实例，在一些方面中本公开的肽展现针对GIP受体与胰高血糖素受体两者的活性(“胰高血糖素/GIP受体共激动剂”)。在一些实施方案中，GLP-1活性已例如由于位置7的氨基酸修饰(例如，被Ile取代)、C末端至位置27或28的氨基酸的一个或多个氨基酸缺失(得到27或28个氨基酸的肽)、或其组合而显著降低或破坏。在一些实施方案中，本公开的肽为展现天然GLP-1针对GLP-1受体的活性的约10%或更小(例如，约5%或更小、或约1%或更小、或约0.1%或更小)的肽。

在一些或任何实施方案中，本公开的肽针对GIP受体的EC50与其针对胰高血糖素受体的EC50相差在约50倍或更小、约40倍或更小、约30倍或更小、约20倍或更小、或约10倍或更小、或约5倍或更小以内(更高或更低)。在一些或任何实施方案中，本公开的肽的GIP效价百分比与其胰高血糖素效价百分比相差小于或约50倍、40倍、30倍、20倍、10倍或5倍(更高或更低)。

在一些实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本公开的肽展现针对胰高血糖素受体的增强活性。肽相比于天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体的相对活性以(本公开肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50) X 100%的反比(本文也称为”胰高血糖素效价百分比”的值)来计算。

在本公开的一些实施方案中，本公开的肽展现至少或约0.1%的胰高血糖素效价百分比。在示例性实施方案中，所述肽展现至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、或至少或约100%的胰高血糖素效价百分比。

在本公开的一些实施方案中，本公开的肽展现针对胰高血糖素受体的活性大于天然胰高血糖素。在示例性实施方案中，本公开的肽展现至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%、至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%、或至少或约1000%的胰高血糖素效价百分比。在一些实施方案中，本公开的肽展现不大于1000%或不大于10,000%的胰高血糖素效价百分比。

三重激动剂

在一些实施方案中，本公开的肽展现针对除GIP受体以外的两种或更多种受体的活性。因此，本发明在一些方面中提供GIP三重激动剂肽。在一些方面，本公开的肽展现针对胰高血糖素、GIP和GLP-1受体中的每一种的活性(“胰高血糖素/GIP/GLP-1三重激动剂”)。

在一些实施方案中，本公开的肽针对GIP受体的EC50与本公开的肽针对(a)GLP-1受体、(b)胰高血糖素受体或两者的EC50相差在50倍或更小、20倍或更小、或10倍或更小以内(更高或更低)。在一些实施方案中，本公开的肽针对GIP受体的EC50与其针对GLP-1受体的EC50相差约40倍、约30倍、约20倍以内(更高或更低)，且任选地与其针对胰高血糖素受体的EC50相差约50倍以内。在一些实施方案中，本公开的肽的GIP效价百分比与(a)其GLP-1效价百分比、(b)其胰高血糖素效价百分比或两者相差小于或约50倍、20倍或10倍(更高或更低)。在一些实施方案中，本公开的肽的GIP效价百分比与其GLP-1效价百分比相差在约40倍、约30倍、约20倍以内(更高或更低)，且任选地与其胰高血糖素效价百分比相差在约50倍以内。在一些实施方案中，本公开的肽针对人GLP-1受体相比于GIP受体的选择性不具有至少100倍。在示例性实施方案中，本公开的肽针对人GLP-1受体相比于GIP受体的选择性小于100倍(例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约10倍、小于或约5倍)。

不存在 GLP-1 激动作用和胰高血糖素激动作用情况下的 GIP 激动作用

在一些实施方案中，本公开的肽展现仅针对GIP受体且不针对任何其他受体(例如，GLP-1受体、胰高血糖素受体)的活性。在示例性实施方案中，本公开的肽展现针对GIP受体的活性，且胰高血糖素和GLP-1活性已例如由于位置3和位置7的氨基酸修饰而显著降低或破坏。在一些实施方案中，本公开的肽为展现约10%或10%以下(例如，约5%或5%以下、或约1%或1%以下、或约0.1%或0.1%以下)的GLP-1效价百分比的肽。在一些实施方案中，本公开的肽为展现约10%或更小(例如，约5%或更小、或约1%或更小、或约0.1%或更小)的胰高血糖素效价百分比的肽。

缀合物的活性

在一些或任何实施方案中，如本文进一步描述，当本公开的肽缀合至异源部分(例如，亲水性部分(例如聚乙二醇))时，本公开的肽与呈游离或未缀合形式的本公开的肽相比展现降低的活性(例如，更低效价百分比或更高EC50)。因此，预期当上述绝对活性水平(例如GIP效价百分比、GLP-1效价百分比或胰高血糖素效价百分比，但非相对比率)中的任一种应用于呈缀合形式(例如聚乙二醇化)的肽时，此类绝对活性水平降低约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍，且此类活性水平降低倍数预期在本发明的范围内。相反，本公开的肽在未缀合时展现的GIP效价百分比为本公开的肽在缀合至异源部分(例如，亲水性部分(例如聚乙二醇))时的效价的约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍或更高。

本公开的肽的结构

胰高血糖素类似物

在一些实施方案中，本公开的肽在结构上类似于天然人胰高血糖素(SEQ ID NO：1)，例如，为天然人胰高血糖素的类似物(本文中也称为“胰高血糖素类似物”或“胰高血糖素的肽类似物”)。如本文所用的术语“胰高血糖素类似物”和“胰高血糖素的肽类似物”等是指在结构上类似于天然人胰高血糖素的肽且这些术语未必暗示所述肽活化胰高血糖素受体。

在一些或任何实施方案中，本公开的肽为天然人胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物，其包含基于氨基酸序列SEQ ID NO：1但不同于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，因为该胰高血糖素类似物的氨基酸序列包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个，和在一些情况下16个或更多个(例如，17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个等))指定或任选的氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，相对于天然人胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)，本公开的肽包含总共1个、多至2个、多至3个、多至4个、多至5个、多至6个、多至7个、多至8个、多至9个或多至10个额外氨基酸修饰(例如，除指定氨基酸修饰以外)。在一些或任何实施方案中，所述修饰为本文所述修饰中的任一种，例如，酰化、烷基化、聚乙二醇化、C末端截短、在位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28和29中的一个或多个位置进行氨基酸取代。

如本文所用的“氨基酸修饰”是指(i)SEQ ID NO：1的氨基酸被不同氨基酸(天然存在或编码或非编码或非天然存在的氨基酸)取代；(ii)向SEQ ID NO：1添加氨基酸(天然存在或编码或非编码或非天然存在的氨基酸)；或(iii)SEQ ID NO：1的一个或多个氨基酸缺失。

在一些或任何实施方案中，氨基酸取代为保守氨基酸取代，例如，位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中的一个或多个位置的保守氨基酸取代。如本文所用的术语“保守氨基酸取代”在本文定义为一个氨基酸被另一具有类似性质(例如，大小、电荷、疏水性、亲水性和/或芳香性)的氨基酸取代，且包括以下五组中的一组内的交换：

I. 小脂肪族、非极性或微极性残基：

Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；

II. 极性、带负电荷残基和其酰胺和酯：

Asp、Asn、Glu、Gln、半胱磺酸和高半胱磺酸；

III. 极性、带正电荷残基：

His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)

IV. 大的、脂肪族、非极性残基：

Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸

V. 大的、芳族残基：Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸

在替代实施方案中，氨基酸取代不是保守氨基酸取代，例如，是非保守氨基酸取代。

如本文所用的术语“带电荷氨基酸”是指包含在水溶液中在生理pH下带负电荷(即，去质子化)或带正电荷(即，质子化)的侧链的氨基酸。例如，带负电荷氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸，而带正电荷氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷氨基酸包括20种编码氨基酸中的带电荷氨基酸，以及非典型或非天然存在或非编码氨基酸。如本文所用的术语“酸性氨基酸”是指包含包括例如侧链羧酸或磺酸基团的第二酸性部分(除氨基酸的α羧酸以外)的氨基酸。

在一些实施方案中，本公开的肽包含与天然人胰高血糖素的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)具有至少25%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的肽包含与SEQ ID NO：1具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或大于90%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上文提及的%序列同一性的本公开的肽的氨基酸序列是本公开的肽的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上文提及的%序列同一性的本公开的肽的氨基酸序列仅为本公开的肽的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，本公开的肽包含与SEQ ID NO：1的至少5个连续氨基酸(例如，至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸)的参考氨基酸序列具有约A%或更大序列同一性的氨基酸序列，其中该参考氨基酸序列开始于SEQ ID NO：1位置C的氨基酸且结束于SEQ ID NO：1位置D的氨基酸，其中A为

或28且D为或29。预期前述参数的任何和所有可能的组合，包括但不限于例如其中A为90%且C和D为1和27、或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。

本文所述的天然人胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物可包含具有任何数目的氨基酸的肽骨架，即可以是任何肽长度。在一些实施方案中，本文所述的肽与SEQ ID NO：1具有相同长度，即长度为29个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽的长度长于29个氨基酸，例如，本公开的肽包含1-21个氨基酸的C末端延伸，如本文进一步描述。因此，在一些实施方案中，本公开的肽的长度为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽的长度为多至50个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽的长度由于与另一肽融合而长于29个氨基酸(例如，长度大于50个氨基酸(例如，至少或约60个、至少或约70个、至少或约80个、至少或约90个、至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、至少或约400个、至少或约450个、至少或约500个氨基酸))。在其他实施方案中，本公开的肽的长度少于29个氨基酸，例如，28、27、26、25、24、23个氨基酸。

根据上述，在一些方面，本公开的肽为天然人胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物，其包含基于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，该序列包含一个或多个氨基酸修饰，其影响GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性；增强稳定性，例如通过减少肽的降解(例如，通过改善DPP-IV蛋白酶抗性)；增强溶解性；增加半衰期；延迟作用起始；延长针对GIP、胰高血糖素或GLP-1受体的作用的持续时间；或任何前述作用的组合。下文进一步描述除其他修饰以外的此类氨基酸修饰，且任何这些修饰可个别或组合应用。

包含非天然酰基的氨基酸

根据一些或任何实施方案，作为胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物的GIP激动剂肽包含包括非天然酰基的氨基酸(本文中称为“酰化氨基酸”，而不考虑其如何制备，例如，通过将先前酰化的氨基酸并入肽中，或在合成后对肽进行酰化)。在一些或任何方面，酰化氨基酸位于胰高血糖素类似物的位置9、10、12、13、14、16、17、20、37、38、39、40、41、42或43中的任何位置。在示例性方面，酰化氨基酸位于胰高血糖素类似物的位置9、10、12、16、20或40中的任何位置或胰高血糖素类似物的位置10、13、14、16、17或40中的任何位置。在示例性方面，酰化氨基酸位于位置10、14和40中的任何一个或多个位置。在示例性方面，酰化氨基酸位于肽类似物的位置10、12或16中的任何位置。

在一些实施方案中，酰化氨基酸引起GIP激动剂肽具有以下中的一种或多种：(i)循环中的半衰期延长；(ii)作用起始延迟；(iii)作用持续时间延长；(iv)蛋白酶(诸如DPP-IV)抗性改善；和(v)针对GIP受体、GLP-1受体和胰高血糖素受体中的任何一种或多种的效价增加。

直接酰化

在一些实施方案中，酰基直接连接至GIP激动剂肽的氨基酸。根据一个实施方案，GIP激动剂肽包含经由酯、硫酯或酰胺键连接至肽的酰基。

在特定方面，对GIP激动剂肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基(thiol)直接酰化之后，GIP激动剂肽包含酰基。在一些实施方案中，酰化处于GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20或40(例如，位置10、14和40中的任一位置)。在这方面，GIP激动剂肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或其包含一个或多个本文所述的氨基酸修饰的修饰氨基酸序列，其中GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20和40(例如，位置10、14和40中的任一位置)的氨基酸中的至少一个是包含侧链胺、羟基或巯基(thiol)的氨基酸。

在一些实施方案中，包含侧链胺的氨基酸为式I氨基酸：

其中n=1至4

[式I]。

在一些实施方案中，式I氨基酸为其中n为4(Lys)或n为3(Orn)的氨基酸。在一些实施方案中，包含侧链胺的氨基酸为包含侧链胺的芳族氨基酸。在示例性方面，包含侧链胺的芳族氨基酸为4-氨基-苯丙氨酸(4-氨基Phe)、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。在示例性方面，包含侧链胺的芳族氨基酸为4-氨基-Phe。

在其他实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为式II氨基酸：

其中n=1至4

[式II]。

在一些示例性实施方案中，式II氨基酸为其中n为1(Ser)的氨基酸。在示例性方面，式II氨基酸为其中n为2(高丝氨酸)的氨基酸。在类似示例性实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为Thr或高苏氨酸。在类似示例性实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为包含侧链羟基的芳族氨基酸。在示例性方面，包含侧链羟基的芳族氨基酸为酪氨酸、高酪氨酸、甲基-酪氨酸或3-氨基酪氨酸。

在仍其他实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸为式III氨基酸：

其中n=1至4

[式III]。

在一些示例性实施方案中，式III氨基酸为其中n为1(Cys)的氨基酸。

在仍其他实施方案中，包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸为包含式I、式II或式III的相同结构的双取代氨基酸，除了键合至式I、式II或式III的氨基酸的α碳的氢被第二侧链置换。

酰化间隔基

在替代实施方案中，酰基经由间隔基连接至GIP激动剂肽的氨基酸，其中该间隔基位于GIP激动剂肽的氨基酸与该酰基之间。在一些实施方案中，GIP激动剂肽包含在肽与酰基之间的间隔基。在一些实施方案中，GIP激动剂肽共价结合至间隔基，该间隔基共价结合至酰基。

在一些实施方案中，间隔基为包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或包含包括侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。间隔基所连接的氨基酸可以是包含允许连接至间隔基的部分的任何氨基酸(例如，单或双α-取代氨基酸)。例如，包含侧链NH₂、-OH或-COOH的氨基酸(例如，Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是合适的。在这方面，在一些方面中GIP激动剂肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或其包含一个或多个本文所述的氨基酸修饰的修饰氨基酸序列，其中位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43(例如，位置10、14或40)的氨基酸中的至少一个为包含侧链胺、羟基或羧酸酯的氨基酸。

在一些实施方案中，间隔基为包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或包含包括侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。

当经由间隔基的氨基连接酰基时，酰基在一些方面中经由间隔基氨基酸的α胺或经由侧链胺连接。在经由α胺连接酰基的情况下，间隔基的氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔基的氨基酸可以是疏水性氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸。或者，在一些方面，间隔基的氨基酸为酸性残基，例如Asp、Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸、半胱磺酸、γ-谷氨酸。

在经由氨基酸间隔基的侧链胺连接酰基的情况下，间隔基为包含侧链胺的氨基酸，例如，式I氨基酸(例如，Lys或Orn)。在这种情况下，间隔基的氨基酸的α胺与侧链胺两者可能都连接至酰基，使得GIP激动剂肽被二酰化。本发明的实施方案包括此类二酰化分子。在一些实施方案中，酰基连接至4-氨基-Phe、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。

当经由间隔基的羟基连接酰基时，氨基酸或者二肽或三肽的一个氨基酸可以是式II氨基酸。在一个特定示例性实施方案中，氨基酸为Ser。在类似示例性实施方案中，酰基连接至Thr或高苏氨酸。在类似示例性实施方案中，酰基经由包含侧链羟基的芳族氨基酸(例如，酪氨酸、高酪氨酸、甲基-酪氨酸或3-氨基酪氨酸)的羟基连接。

当酰基经由间隔基的巯基连接时，氨基酸或者二肽或三肽的一个氨基酸可以是式III氨基酸。在一个特定示例性实施方案中，氨基酸为Cys。

在一些实施方案中，间隔基为亲水性双官能间隔基。在示例性实施方案中，亲水性双官能间隔基包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在示例性实施方案中，亲水性双官能间隔基包含羟基和羧酸酯。在其他实施方案中，亲水性双官能间隔基包含氨基和羧酸酯。在其他实施方案中，亲水性双官能间隔基包含巯基和羧酸酯。在一个特定实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷基氧基)羧酸酯。在这方面，间隔基可包含例如NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH，其中m为1至6的任何整数且n为2至12的任何整数，诸如，8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可商购自Peptides International, Inc. (Louisville, KY)。

在示例性实施方案中，间隔基包含小的聚乙二醇部分(PEG)，其包含结构[-O-CH₂-CH₂-]_n，其中n为在2与16之间的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)。此类小的PEG在本文中称为“微型PEG”。在示例性方面，微型PEG为包含一个或多个官能团的官能化微型PEG。合适的官能团包括但不限于胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在示例性方面，微型PEG为包含结构{[-O-CH₂-CH₂-]_n-COO-}的微型PEG酸，其中n如上文所定义。在示例性方面，微型PEG为包含结构{-N-CH₂-CH₂-[-O-CH₂-CH₂-]_n}的酰胺基微型PEG，其中n如上文所定义。在示例性方面，微型PEG为包含结构{-N-CH₂-CH₂-[-O-CH₂-CH₂-]_n-COO-}的酰胺基微型PEG酸，其中n如上文所定义。适用于酰化具有微型PEG的氨基酸的试剂可购自供应商，诸如Peptides International (Louisville, KY)。此外，本文中描述适用于酰化具有微型PEG的氨基酸的技术(参见实施例l)。

在一些实施方案中，间隔基为疏水性双官能间隔基。疏水性双官能间隔基在本领域中已知。参见例如Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)，其以其整体通过引用并入。在示例性实施方案中，疏水性双官能间隔基包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在示例性实施方案中，疏水性双官能间隔基包含羟基和羧酸酯。在其他实施方案中，疏水性双官能间隔基包含胺基和羧酸酯。在其他实施方案中，疏水性双官能间隔基包含巯基和羧酸酯。包含羧酸酯和羟基或巯基的合适疏水性双官能间隔基在本领域中已知且包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。

在一些实施方案中，双官能间隔基不是在羧酸酯基团之间包含1-7个碳原子的未分支亚甲基的二羧酸。在一些实施方案中，双官能间隔基为在羧酸酯基团之间包含1-7个碳原子的未分支亚甲基的二羧酸。

在特定实施方案中，间隔基(例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔基或疏水性双官能间隔基)长度为3至10个原子(例如，6至10个原子(例如，6、7、8、9或10个原子))。在更特定实施方案中，间隔基长度为约3至10个原子(例如，6至10个原子)且酰基为C12至C18脂肪酰基，例如C14脂肪酰基、C16脂肪酰基，使得间隔基与酰基的总长度为14至28个原子，例如，约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在一些实施方案中，间隔基与酰基的长度为17至28个(例如，19至26个、19至21个)原子。

根据一些或任何前述实施方案，双官能间隔基可以是包含长度为3至10个原子的氨基酸骨架的合成或天然存在的氨基酸(包括但不限于本文所述的任何那些氨基酸)(例如，6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔基可以是具有长度为3至10个原子(例如，6至10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔基。二肽或三肽间隔基的各氨基酸可与二肽或三肽的其他氨基酸相同或不同且可独立地选自：天然存在或编码和/或非编码或非天然存在的氨基酸，包括例如天然存在的氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)的任何D或L异构体，或选自以下的非天然存在或非编码氨基酸的任何D或L异构体：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯甲酸、氨基哌啶甲酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-甲酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷甲酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸、Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰胺基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟基脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、异哌啶甲酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲酰基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O)₂)、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO₂))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-甲酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、硫酸酪氨酸四丁基胺、甲基-缬氨酸(MeVal)和烷基化3-巯基丙酸。在示例性方面，间隔基为Cys残基或Lys残基。

在一些实施方案中，间隔基包含总体负电荷，例如，包含一个或两个带负电荷氨基酸。在一些实施方案中，二肽不是通用结构A-B的任何二肽，其中A选自Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe和Pro，其中B选自Lys、His、Trp。在一些实施方案中，二肽间隔基的氨基酸选自Ala、β-Ala、Leu、Pro、γ-氨基丁酸、Glu和γ-Glu。

在一些示例性实施方案中，在间隔基的胺、羟基或巯基的酰化之后，GIP激动剂肽包含酰基，该间隔基在GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43(例如，在位置10、14和40中的任何一个或多个位置)或在C末端氨基酸处连接至氨基酸的侧链。

在更特定实施方案中，酰基在肽类似物的位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任何位置(例如，在位置10、14和40中的任何一个或多个位置)连接至氨基酸且间隔基与酰基的长度为14至28个原子。在一些方面，位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任何位置(例如，在位置10、14和40中的任何一个或多个位置)的氨基酸为式I氨基酸，例如，Lys或式I所述的双取代氨基酸。在更特定实施方案中，肽类似物缺乏分子内桥键(bridge)，例如，共价分子内桥键。胰高血糖素类似物例如可以是包含一个或多个用于稳定类似物的α螺旋的α,α-双取代氨基酸(例如AIB)的胰高血糖素类似物。

酰基

酰化氨基酸的酰基可以是任何大小(例如，任何长度碳链)，且可以是直链或支链。在一些特定实施方案中，酰基为C4至C30脂肪酸。例如，酰基可以是C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸中的任一种。在一些实施方案中，酰基为C8至C20脂肪酸，例如，C12至C18脂肪酸、C14脂肪酸或C16脂肪酸。在示例性实施方案中，酰基为C16至C30脂肪酸，例如，C20至C28脂肪酸、C16至C22脂肪酸。

在一个替代实施方案中，酰基为胆汁酸(bile acid)。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸(cholic acid)、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。

在示例性实施方案中，酰基为琥珀酸或琥珀酸衍生物。如本文所用的“琥珀酸衍生物”意指包含经取代的琥珀酸或经取代的环状琥珀酸(即琥珀酸酐)或经取代的扩展环琥珀酸酐(即包含-C(O)-O-C(O)-部分和3至5个额外碳的6-8元环)的化合物，其中经取代的琥珀酸、经取代的环状琥珀酸(即琥珀酸酐)或经取代的扩展环琥珀酸酐被一个或多个烷基链或一个或多个官能化碳链取代。

在示例性方面，琥珀酸衍生物包含式V的结构：

[式V]

其中R和R'各自独立地为H、直链或支链C4-C30碳链或直链或支链C4-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R'为包含C4至C30烷基链的碳链。例如，烷基可以是C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任一种。在一些实施方案中，烷基为C8至C20烷基，例如，C12至C18烷基、C14烷基或C16烷基。在示例性实施方案中，烷基为C16至C30烷基，例如，C20至C28烷基、C16至C22烷基。在示例性方面，官能化碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基(sulfhydryl)、胺、羰游基、亚磺酰基(sulfoxyl)或酰胺基(amido)。

在示例性方面，琥珀酸衍生物包含包括式VI结构的琥珀酸酐：

[式VI]

其中R和R'各自独立地为H、直链或支链C4-C30碳链或直链或支链C4-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R'为包含C4至C30烷基链的碳链。例如，烷基可以是C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任一种。在一些实施方案中，烷基为C8至C20烷基，例如，C12至C18烷基、C14烷基或C16烷基。在示例性实施方案中，烷基为C16至C30烷基，例如，C20至C28烷基、C16至C22烷基。在示例性方面，官能化碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚磺酰基或酰胺基。

在示例性方面，琥珀酸衍生物为琥珀酸酐衍生物，其包括式VII的琥珀酸酐衍生物：

[式VII]

其中n为1-4，且

当式V-VI的R和R'中仅一种为H时，酰化氨基酸被称为“Cx琥珀酰基(Succinoyl)”。如本文所用的术语“Cx琥珀酰基”(其中x为整数)是指一种结构，其中R为y个碳的烷基链且y=x-1，且y不包括琥珀酰基部分的碳。例如，其中R为C15烷基且R'为H的式VI结构被称为C16琥珀酰基。例如，图3A描述C16琥珀酰基Lys，其中Lys已在ε胺处被琥珀酰化。当式V-VI的R与R'都不是H时，则酰化氨基酸被称为“Cx,Cx'琥珀酰基”。如本文所用的术语“Cx,Cx'琥珀酰基”(其中x和x'为整数)是指一种结构，其中R为y个碳的烷基链且R'为y'个碳的烷基链，且y'=x'-1。例如，其中R为C15烷基且R'为C13烷基的式VI结构也称为C16,C14琥珀酰基。当琥珀酸衍生物为经取代的扩展环琥珀酸酐且式VII的R与R'都不是H时，则酰化氨基酸被称为“Cx,Cx'-n-琥珀酰基”。如本文所用的术语“Cx,Cx'-n-琥珀酰基”(其中x、x'和n为整数)是指一种结构，其中R为y个碳的烷基链，R'为y'个碳的烷基链，且琥珀酸酐环延伸n个碳。例如，其中R和R'为C15烷基且n=2的式VII结构被称为C16,C16-2-琥珀酰基。

在示例性实施方案中，酰基为马来酸或马来酸衍生物。如本文所用的“马来酸衍生物”意指包含经取代的马来酸或经取代的环状马来酸(即马来酸酐)或经取代的扩展环马来酸酐(即包含-C(O)-O-C(O)-部分和3至5个额外碳的6-8元环)的化合物，其中经取代的马来酸、经取代的环状马来酸(即马来酸酐)或经取代的扩展环马来酸酐被一个或多个烷基链或一个或多个官能化碳链取代。

在示例性方面，马来酸衍生物包含式VIII的结构：

[式VIII]

在示例性方面，马来酸衍生物包含马来酸酐，其包含式IX的结构：

[式IX]

在示例性方面，马来酸衍生物为马来酸酐衍生物，其包括式X的马来酸酐衍生物：

[式X]

其中n为1-4，在两个非羰基碳之间存在至少一个C=C双键，且

当式VIII-IX的R和R'中仅一种为H时，酰化氨基酸被称为“Cx马来酰基”。如本文所用的术语“Cx马来酰基”(其中x为整数)是指一种结构，其中R为y个碳的烷基链且y=x-1，且y不包括马来酰基部分的碳。例如，其中R为C15烷基且R'为H的式IX结构被称为C16马来酰基。当式VIII-IX的R与R'都不是H时，则酰化氨基酸被称为“Cx,Cx'马来酰基”。如本文所用的术语“Cx,Cx'马来酰基”(其中x和x'为整数)是指一种结构，其中R为y个碳的烷基链且R'为y'个碳的烷基链且y'=x'-1。例如，其中R为C15烷基且R'为C13烷基的式IX结构被称为C16,C14马来酰基。当马来酸衍生物为经取代的扩展环马来酸酐且式X的R与R'都不是H时，则酰化氨基酸被称为“Cx,Cx'-n-马来酰基”。如本文所用的术语“Cx,Cx'-n-马来酰基”(其中x、x'和n为整数)是指一种结构，其中R为y个碳的烷基链，R'为y'个碳的烷基链，且马来酸酐环延伸n个碳。例如，其中R和R'为C15烷基且n=2的式X结构被称为C16,C16-2-马来酰基。

连接酰基的方法

经由肽的胺、羟基和巯基将酰基连接至肽的合适方法在本领域中已知。参见例如实施例1(关于经由胺进行酰化的方法)；Miller, Biochem　Biophys　Res　Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi和Stammer, Int　J　Pept　Protein　Res　19: 54-62 (1982)；和Previero等人, Biochim　Biophys　Acta　263: 7-13 (1972)(关于经由羟基进行酰化的方法)；和San和Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)(关于经由巯基进行酰化的方法)；Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History和Applications" 第1、2-12液 (1990)；Hashimoto等人, Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin和their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)。

在一些实施方案中，通过GIP激动剂肽对长链烷烃的酰化而使GIP激动剂肽包含酰化氨基酸。在特定方面，长链烷烃包含胺、羟基或巯基(例如，十八烷基胺、十四醇和十六烷硫醇)，其与GIP激动剂肽的羧基或其活化形式反应。GIP激动剂肽的羧基或其活化形式可以是GIP激动剂肽的氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸)的侧链的部分或可以是肽骨架的部分。

在示例性实施方案中，通过连接至GIP激动剂肽的间隔基对长链烷烃的酰化而使GIP激动剂肽包含酰基。在特定方面，长链烷烃包含胺、羟基或巯基，其与间隔基的羧基或其活化形式反应。包含羧基或其活化形式的合适间隔基描述于本文中且包括例如双官能间隔基，例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔基和疏水性双官能间隔基。

如本文所用的术语“羧基的活化形式”是指具有通式R(C=O)X的羧基，其中X为离去基团且R为胰高血糖素类似物或间隔基。例如，羧基的活化形式可包括但不限于酰基氯化物、酐和酯。在一些实施方案中，活化羧基为具有N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)离去基团的酯。

关于长链烷烃由胰高血糖素类似物或间隔基酰化的这些方面，长链烷烃可以是任何大小且可包含任何长度的碳链。长链烷烃可以是直链或支链。在示例性方面，长链烷烃为C4至C30烷烃。例如，长链烷烃可以是C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃中的任一种。在一些实施方案中，长链烷烃包含C8至C20烷烃，例如，C12至C18烷烃、C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。在示例性实施方案中，长链烷烃为C16至C30烷烃，例如，C20至C28烷烃、C16至C22烷烃。

此外，在一些实施方案中，GIP激动剂肽的胺、羟基或巯基被胆固醇酸酰化。在一个特定实施方案中，GIP激动剂肽经由烷基化脱氨基Cys间隔基(即，烷基化3-巯基丙酸间隔基)连接至胆固醇酸。

当酰基为琥珀酸、琥珀酸衍生物、马来酸或马来酸衍生物时，肽通过GIP激动剂肽或间隔基的胺、羟基或巯基与式V、式VI、式VII、式VIII、式IX或式X的琥珀酸、琥珀酸衍生物、马来酸或马来酸衍生物反应而被琥珀酰化/马来酰化。琥珀酰化方法描述于本文中。

额外酰基

在一些或任何实施方案中，肽在除位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43(例如，在位置10、14和40中的任何一个或多个位置)以外的位置包含酰化氨基酸。酰化氨基酸的位置可以是GIP激动剂肽内的任何位置，包括位置1-29中的任何位置、C末端至第29个氨基酸的位置(例如，位置30、31、32、33、34、35、36、44、45、46、47等、C末端延伸内的位置或C末端的氨基酸)，任选地连同位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任何位置(例如，位置10、14和40中的任何一个或多个位置)的第二酰化氨基酸，条件是肽类似物的GIP激动剂活性得以保留(如果未增强的话)。非限制性实例包括位置5、7、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28或29。

与前述一致，在示例性方面，当存在两个酰基时，胰高血糖素类似物包含两个(或更多个)酰化氨基酸，且可视为双重酰化肽或二酰化肽。在示例性方面，所有酰化氨基酸都位于位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的两个位置(例如，位置10、14和40中的任何一个或多个位置)。在示例性方面，酰化发生在位置10、14和40中的两个位置。在示例性方面，肽包含位置10的第一酰化氨基酸和位置40的第二酰化氨基酸。

在仍其他示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含连接至肽骨架的单一氨基酸的两个(或更多个)酰基。当存在两个酰基时，肽可视为双重酰化肽或二酰化肽。两个(或更多个)酰基可以是以分支或线性形式排列的相同酰基或不同酰基。例如，为实现分支形式，胰高血糖素类似物可包含连接至间隔基的一个酰化氨基酸(其为肽骨架的一部分)，该间隔基包含至少三个官能团，其中至少两个各自共价连接至酰基且其中一个连接至肽骨架的酰化氨基酸。在示例性方面，可经由例如包含两个氨基(侧链胺和α胺)用于直接连接至脂肪酰基或经由间隔基间接连接至脂肪酰基的Lys残基来实现分支形式。在示例性方面，额外间隔基可位于肽骨架的氨基酸与包含至少三个官能团的间隔基之间。例如，肽骨架的氨基酸可连接(例如，经由其侧链)至第一间隔基，该第一间隔基进而连接至第二间隔基，其中该第二间隔基包含至少三个官能团，其中至少两个各自共价连接至烷基且其中一个连接至第一间隔基。

在烷基以线性形式排列的示例性方面，胰高血糖素类似物包含直接连接至第一酰基的一个酰化氨基酸(其为肽骨架的一部分)，该第一酰基进而连接至间隔基，该间隔基进而连接至第二酰基。

双重酰化化合物的示例性结构描述于图5A中。

亲水性部分和酰基

包含酰化氨基酸的GIP激动剂肽任选地进一步包含亲水性部分。在一些或任何实施方案中，亲水性部分包含聚乙二醇(PEG)链。亲水性部分的并入经由任何合适方法来实现，诸如本文所述方法中的任一种。在这方面，GIP激动剂肽可包含SEQ ID NO：1，其包括本文所述修饰中的任一种，其中在位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43中的任何位置(例如，位置10、14和40中的一个或多个位置)的氨基酸的至少一种为酰化氨基酸，且位置16、17、21、24或29、C末端延伸内的位置的氨基酸或C末端氨基酸中的至少一个为Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，其中侧链共价键合至亲水性部分(例如PEG)。在一些实施方案中，GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43中的任何位置(例如，位置10、14和40中的一个或多个位置)的氨基酸连接(任选地经由间隔基)至酰基且氨基酸进一步连接至亲水性部分或进一步连接至Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，该Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe连接至亲水性部分。

或者，酰化胰高血糖素类似物可包含间隔基，其中该间隔基被酰化且修饰以包含亲水性部分。合适间隔基的非限制性实例包括包含一个或多个选自Cys、Lys、Orn、高Cys和Ac-Phe的氨基酸的间隔基。

在一些方面，GIP激动剂肽在一些实施方案中在相同氨基酸位置(其中连接亲水性部分)或在不同氨基酸位置被酰化。非限制性实例包括在胰高血糖素类似物的位置9、10、12、13、14、16、17、20或40(例如，在位置10、14和40中的一个或多个位置)的酰化和在C末端部分中的一个或多个位置(例如，位置24、28或29、C末端延伸内(例如，37-43)或C末端(例如，经由添加C末端Cys))的聚乙二醇化。

在一些特定实施方案中，包含酰化氨基酸的GIP激动剂肽缺乏分子内桥键，例如，共价分子内桥键(例如，内酰胺桥键)。

包含非天然烷基的氨基酸

根据一些或任何实施方案，作为胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物的GIP激动剂肽包含包括非天然烷基的氨基酸(本文中称为“烷基化氨基酸”，而不考虑其如何制备，例如，通过将先前烷基化的氨基酸并入肽中，或在合成后对肽进行烷基化)。在一些或任何方面，烷基化氨基酸位于位置9、10、12、13、14、16、17、20、37、38、39、40、41、42或43中的任何位置(例如，位置10、14和40中的一个或多个位置)。在示例性方面，烷基化氨基酸位于位置9、10、12、16、20或40中的任何位置或位置10、13、14、16、17或40中的任何位置。在示例性方面，烷基化氨基酸位于位置10、12、16或40中的任何位置或位置10、12或16中的任何位置。在示例性方面，烷基化氨基酸位于位置10、14和40中的任何一个或多个位置。

在一些实施方案中，烷基化氨基酸引起GIP激动剂肽具有以下中的一种或多种：(i)循环中的半衰期延长；(ii)作用起始延迟；(iii)作用持续时间延长；(iv)蛋白酶(诸如DPP-IV)抗性改善；和(v)针对GIP受体、GLP-1受体和胰高血糖素受体中的任何一种或多种的效价增加。

直接烷基化

在一些实施方案中，烷基直接连接至GIP激动剂肽的氨基酸。根据一个实施方案，GIP激动剂肽包含经由醚、硫醚或胺键连接至肽的烷基。

在特定方面，通过GIP激动剂肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基的直接烷基化而使GIP激动剂肽包含烷基。在一些或任何实施方案中，通过使胺、羟基或巯基与活化烷基反应而将烷基连接至GIP激动剂肽的氨基酸。在一些方面，烷基被离去基团例如卤素、磺酸酯、吡啶基巯基、铵盐或苯氧基活化。

在一些或任何实施方案中，烷基化氨基酸位于位置9、10、12、13、14、16、17、20或40中的一个位置(例如，位置10、14和40中的任一位置)或位置10、12或16中的一个位置。在这方面，GIP激动剂肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或其包含一个或多个本文所述氨基酸修饰的修饰氨基酸序列，其中位置9、10、12、13、14、16、17、20和40(例如，位置10、14和40中的任一位置)的氨基酸中的至少一个为包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸。

在一些实施方案中，包含侧链胺的氨基酸为式I氨基酸。在一些实施方案中，式I氨基酸为其中n为4(Lys)或n为3(Orn)的氨基酸。在一些实施方案中，包含侧链胺的氨基酸为包含侧链胺的芳族氨基酸。在示例性方面，包含侧链胺的芳族氨基酸为4-氨基-苯丙氨酸(4-氨基Phe)、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。在示例性方面，包含侧链胺的芳族氨基酸为4-氨基-Phe。

在其他实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为式II氨基酸。在一些示例性实施方案中，式II氨基酸为其中n为1(Ser)的氨基酸。在示例性方面，式II氨基酸为其中n为2(高丝氨酸)的氨基酸。在类似示例性实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为Thr或高苏氨酸。在类似示例性实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为包含侧链羟基的芳族氨基酸。在示例性方面，包含侧链羟基的芳族氨基酸为酪氨酸、高酪氨酸、甲基-酪氨酸或3-氨基酪氨酸。

在仍其他实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸为式III氨基酸。在一些示例性实施方案中，式III氨基酸为其中n为1(Cys)的氨基酸。在一些或任何示例性实施方案中，式III氨基酸共价连接至烷基，例如，非官能化或官能化碳链。在示例性方面，氨基酸被S-棕榈基-烷基化(即S-棕榈酸酯-烷基化)，其中Cys残基的硫原子共价结合至棕榈酸酯的β碳。在其他实施方案中，式III氨基酸经由Cys残基的硫原子共价结合至Cn乙酸酯的β碳，其中n为4至30的整数。进行S-棕榈基烷基化的不同方式的实例显示于图6和图7中。

烷基化间隔基

在替代实施方案中，非天然烷基经由间隔基连接至GIP激动剂肽的氨基酸，其中该间隔基位于GIP激动剂肽的氨基酸与非天然烷基之间。在一些实施方案中，GIP激动剂肽共价结合至间隔基，该间隔基共价结合至非天然烷基。

在示例性实施方案中，通过间隔基的胺、羟基或巯基的烷基化而使胰高血糖素类似物经修饰以包含非天然烷基，该间隔基在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的一个位置(例如，位置10、14和40中的任一位置)连接至氨基酸的侧链。在示例性实施方案中，通过使间隔基的胺、羟基或巯基与具有离去基团(例如，卤素、磺酸酯、吡啶基巯基、铵盐、苯氧基)的烷基反应而将烷基连接至间隔基。

连接间隔基的氨基酸可以是包含允许连接至间隔基的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链NH₂、-OH或-COOH(例如，Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)的氨基酸是合适的。在这方面，烷基化胰高血糖素类似物可包含SEQ ID NO：1的修饰氨基酸序列，其包含一个或多个本文所述的氨基酸修饰，其中位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43(例如，位置10、14和40中的任何一个或多个位置)的氨基酸中的至少一个经修饰为任何包含侧链胺、羟基或羧酸酯的氨基酸。

在一些实施方案中，间隔基为包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或包含包括侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。间隔基所连接的氨基酸可以是包含允许连接至间隔基的部分的任何氨基酸(例如，单或双α-取代氨基酸)。例如，包含侧链NH₂、-OH或-COOH的氨基酸(例如，Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是合适的。在这方面，在一些方面中GIP激动剂肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或其包含一个或多个本文所述的氨基酸修饰的修饰氨基酸序列，其中位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43(例如，位置10、14和40中的任一位置)的氨基酸中的至少一个为包含侧链胺、羟基或羧酸酯的氨基酸。

当经由间隔基的氨基连接烷基时，烷基在一些方面中经由间隔基氨基酸的α胺或经由间隔基氨基酸的侧链胺连接。在经由α胺连接烷基的情况下，间隔基的氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔基的氨基酸可以是疏水性氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸。或者，在一些方面，间隔基的氨基酸为酸性残基，例如Asp、Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸、半胱磺酸、γ-谷氨酸。

在经由氨基酸间隔基的侧链胺连接烷基的情况下，间隔基为包含侧链胺的氨基酸，例如，式I氨基酸(例如，Lys或Orn)。在这种情况下，间隔基的氨基酸的α胺与侧链胺两者可能都连接至烷基，使得GIP激动剂肽被二烷基化。本发明的实施方案包括此类二烷基化分子。在一些实施方案中，烷基连接至4-氨基-Phe、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。

当经由间隔基的羟基连接烷基时，氨基酸或者二肽或三肽的一个氨基酸可以是式II氨基酸。在一个特定示例性实施方案中，氨基酸为Ser。在类似示例性实施方案中，烷基连接至Thr或高苏氨酸。在类似示例性实施方案中，烷基经由包含侧链羟基的芳族氨基酸(例如，酪氨酸、高酪氨酸、甲基-酪氨酸或3-氨基酪氨酸)的羟基连接。

当烷基经由间隔基的巯基连接时，氨基酸或者二肽或三肽的一个氨基酸可以是式III氨基酸。在一个特定示例性实施方案中，氨基酸为Cys。当经由间隔基的巯基连接烷基时，氨基酸或者二肽或三肽的一个氨基酸可以是式III氨基酸。在一个特定示例性实施方案中，氨基酸为Cys。在示例性实施方案中，间隔基为Cys残基，其共价连接至烷基，例如，非官能化或官能化碳链。在示例性方面，Cys残基被S-棕榈基烷基化(即S-棕榈酸酯烷基化)，任选地，其中Cys残基连接至作为肽骨架的部分的Lys残基。在替代实施方案中，间隔基为包含Cys残基的二肽，该Cys残基共价连接至烷基。在示例性方面，Cys被S-棕榈基烷基化，且Cys连接至间隔基的另一氨基酸，该另一氨基酸进而连接至例如作为肽骨架的部分的Lys残基。S-棕榈基烷基化的其他示例提供于本文实施例20中。

在其他示例性实施方案中，间隔基为双官能间隔基，其包含(i)包含与包含胺、羟基或巯基的烷基反应的离去基团的第一末端；和(ii)包含与胰高血糖素类似物的氨基酸的侧链反应的官能团的第二末端。在示例性方面，胰高血糖素类似物的氨基酸为式I氨基酸(例如Lys)或式II氨基酸(例如Ser)，且氨基酸被羧酸或羧酸衍生物官能化。在替代示例性方面，胰高血糖素类似物的氨基酸为式III氨基酸，且氨基酸被卤乙酰胺、马来酰亚氨基或二硫化物官能化。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物的氨基酸为包含侧链羧酸酯的氨基酸，例如，被胺、羟基或巯基官能化的Glu、Asp。

在一些或任何实施方案中，间隔基为亲水性双官能间隔基。在示例性实施方案中，亲水性双官能间隔基包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在示例性实施方案中，亲水性双官能间隔基包含羟基和羧酸酯。在其他实施方案中，亲水性双官能间隔基包含氨基和羧酸酯。在其他实施方案中，亲水性双官能间隔基包含巯基和羧酸酯。在一个特定实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷基氧基)羧酸酯。在这方面，间隔基可包含例如NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH，其中m为1至6的任何整数且n为2至12的任何整数，诸如，例如，8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其购自Peptides International, Inc. (Louisville, KY)。

在示例性实施方案中，间隔基包含小的聚乙二醇部分(PEG)，其包含结构[-O-CH₂-CH₂-]_n，其中n为在2与16之间的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)。此类小的PEG在本文中称为”微型PEG”。在示例性方面，微型PEG为包含一个或多个官能团的官能化微型PEG。合适的官能团包括但不限于胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在示例性方面，微型PEG为包含结构{[-O-CH₂-CH₂-]_n-COO-}的微型PEG酸，其中n如上文所定义。在示例性方面，微型PEG为包含结构{-N-CH₂-CH₂-[-O-CH₂-CH₂-]_n}的酰胺基微型PEG，其中n如上文所定义。在示例性方面，微型PEG为包含结构{-N-CH₂-CH₂-[-O-CH₂-CH₂-]_n-COO-}的酰胺基微型PEG酸，其中n如上文所定义。适用于烷基化具有微型PEG的氨基酸的试剂可购自供应商，诸如Peptides International (Louisville, KY)。

在一些实施方案中，间隔基为疏水性双官能间隔基。疏水性双官能间隔基在本领域中已知。参见例如Bioconjugate　Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)，其以其整体通过引用并入。在示例性实施方案中，疏水性双官能间隔基包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在示例性实施方案中，疏水性双官能间隔基包含羟基和羧酸酯。在其他实施方案中，疏水性双官能间隔基包含氨基和羧酸酯。在其他实施方案中，疏水性双官能间隔基包含巯基和羧酸酯。包含羧酸酯和羟基或巯基的合适疏水性双官能间隔基在本领域中已知且包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。

在一些实施方案中，双官能间隔基不是在羧酸酯之间包含1-7个碳原子的未分支亚甲基的二羧酸。在一些实施方案中，双官能间隔基为在羧酸酯之间包含1-7个碳原子的未分支亚甲基的二羧酸。

在特定实施方案中，间隔基(例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔基或疏水性双官能间隔基)长度为3至10个原子(例如，6至10个原子(例如，6、7、8、9或10个原子))。在更特定实施方案中，间隔基长度为约3至10个原子(例如，6至10个原子)，且非天然烷基为C12至C18烷基，例如C14烷基、C16烷基，使得间隔基与烷基的总长度为14至28个原子，例如，约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在一些实施方案中，间隔基与烷基的长度为17至28个(例如，19至26个、19至21个)原子。

根据一些或任何前述实施方案，双官能间隔基可以是包含长度为3至10个原子的氨基酸骨架的合成或天然存在的氨基酸(包括但不限于本文所述的任何那些氨基酸)(例如，6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔基可以是具有长度为3至10个原子(例如，6至10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔基。二肽或三肽间隔基的各氨基酸可与二肽或三肽的其他氨基酸相同或不同，且可独立地选自：天然存在或编码和/或非编码或非天然存在的氨基酸，包括例如天然存在的氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)的任何D或L异构体，或选自以下的非天然存在或非编码氨基酸的任何D或L异构体：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯甲酸、氨基哌啶甲酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-甲酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷甲酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸，Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰胺基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟基脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、异哌啶甲酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲酰基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O)₂)、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO₂))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-甲酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、硫酸酪氨酸四丁基胺、甲基-缬氨酸(MeVal)和烷基化3-巯基丙酸。在示例性方面，间隔基为Cys残基。

在一些示例性实施方案中，在间隔基的胺、羟基或巯基的烷基化之后，GIP激动剂肽包含烷基，该间隔基在GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43(例如，在位置10、14和40中的任何一个或多个位置)或在C末端氨基酸处连接至氨基酸的侧链。

在仍更特定实施方案中，烷基在肽类似物的位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任何位置(例如，在位置10、14和40中的任何一个或多个位置)连接至氨基酸且间隔基与烷基的长度为14至28个原子。在一些方面，位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任何位置(例如，在位置10、14和40中的任何一个或多个位置)的氨基酸为式I氨基酸，例如，Lys或式I所述的双取代氨基酸。在更特定实施方案中，肽类似物缺乏分子内桥键，例如，共价分子内桥键。胰高血糖素类似物例如可以是包含一个或多个用于稳定类似物的α螺旋的α,α-双取代氨基酸(例如AIB)的胰高血糖素类似物。

烷基

烷基化氨基酸的非天然烷基可以是任何大小(例如，任何长度碳链)，且可以是直链或支链。在一些特定实施方案中，烷基为C4至C30烷基。例如，烷基可以是C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任一种。在一些实施方案中，烷基为C8至C20烷基，例如，C12至C18烷基、C14烷基或C16烷基。在示例性实施方案中，烷基为C16至C30烷基，例如，C20至C28烷基、C16至C22烷基。

在示例性实施方案中，烷基化氨基酸的非天然烷基为任何长度的官能化直链或支链碳链。在一些特定实施方案中，碳链为C4至C30烷基。例如，烷基可以是C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中的任一种。在一些实施方案中，烷基为C8至C20烷基，例如，C12至C18烷基、C14烷基或C16烷基。在示例性实施方案中，烷基为C16至C30烷基，例如，C20至C28烷基、C16至C22烷基。在示例性方面，官能化碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚磺酰基或酰胺基。

在示例性实施方案中，非天然烷基为结构-Cx-COOH的羧基官能化碳链，其中x为整数，任选地为4-30之间的整数(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)，其中羧基碳为α碳且Cx的碳各自指定为β、γ、δ、ε等，其中β碳连接至α碳。例如，其中，当x为4时，非天然烷基将指定如下：C_ε-C_δ-C_ɣ-C_β-C_αOOH。在示例性实施方案中，羧基官能化碳链经由除羧基碳以外的碳(即，Cx的一个碳)连接。在示例性方面，羧基官能化碳链经由羧基官能化碳链的β、γ、δ或ε碳连接至烷基化氨基酸的侧链。在替代实施方案中，羧基官能化碳链经由羧基官能化碳链的β、γ、δ或ε碳连接至间隔基的侧链，该间隔基连接至烷基化氨基酸。在示例性方面，羧基官能化碳链经由羧基官能化碳链的β碳连接至烷基化氨基酸的侧链。在替代实施方案中，羧基官能化碳链经由羧基官能化碳链的β碳连接至间隔基的侧链，该间隔基连接至烷基化氨基酸。

连接烷基的方法

连接烷基至氨基酸的方法为本领域中已知。例如，被离去基团活化的烷基可与包含亲核侧链(例如，包含胺、羟基或巯基的侧链)的氨基酸反应。离去基团在示例性方面中为卤素、磺酸酯、吡啶基巯基、铵盐或苯氧基。

在示例性实施方案中，待连接至烷基的氨基酸为Cys残基且硫原子被烷基化，例如，“S-烷基化”。在示例性实施方案中，Cys的硫与包含结构-Cx-COOH的羧基官能化碳链的烷基的离去基团反应，其中x为整数，任选地为4-30之间的整数(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)，其中羧基碳为α碳且Cx的碳各自指定为β、γ、δ、ε等，其中β碳连接至α碳。例如，其中，当x为4时，非天然烷基将指定如下：C_ε-C_δ-C_ɣ-C_β-C_αOOH。在示例性实施方案中，羧基官能化碳链经由除羧基碳以外的碳(即，Cx的一个碳)连接。在示例性方面，羧基官能化碳链经由羧基官能化碳链的β、γ、δ或ε碳连接至烷基化氨基酸的侧链。在替代实施方案中，羧基官能化碳链经由羧基官能化碳链的β、γ、δ或ε碳连接至间隔基的侧链，该间隔基连接至烷基化氨基酸。在示例性方面，羧基官能化碳链经由羧基官能化碳链的β碳连接至烷基化氨基酸的侧链。在替代实施方案中，羧基官能化碳链经由羧基官能化碳链的β碳连接至间隔基的侧链，该间隔基连接至烷基化氨基酸。

在示例性方面，离去基团为卤素(诸如碘、溴、氯或氟)、磺酸酯(诸如甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯或氟磺酸酯)、吡啶基巯基(pyridylthiol)、铵盐、重氮盐、硝酸盐、磷酸盐或苯氧基。

在特定方面，烷基包含碘离去基团和包含总共16个碳的羧基官能化碳链(包括羧酸酯的碳)。被碘-羧酸烷基化可称为“S-棕榈基烷基化”，其与“S-棕榈酸酯烷基化”同义。S-棕榈基烷基化的其他示例提供于本文实施例1和20中。

额外烷基

肽在一些方面在除位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43(例如，位置10、14和40中的任何一个或多个位置)以外的位置处包含烷基化氨基酸。烷基化氨基酸的位置可以是GIP激动剂肽内的任何位置，包括位置1-29中的任何位置、C末端至第29个氨基酸的位置(例如，位置30、31、32、33、34、35、36、44、45、46、47等、C末端延伸内的位置或C末端的氨基酸)，任选地连同位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任何位置(例如，位置10、14和40中的任何一个或多个位置)的第二烷基化氨基酸，条件是肽类似物的GIP激动剂活性得以保留(如果未增强的话)。非限制性实例包括位置5、7、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28或29。

与前述一致，在示例性方面，胰高血糖素类似物包含两个(或更多个)烷基化氨基酸。在示例性方面，所有烷基化氨基酸都位于位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的两个位置(例如，位置10、14和40中的任何一个或多个位置)。在示例性方面，肽包含位置10的第一烷基化氨基酸和位置40的第二烷基化氨基酸。

在仍其他示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含连接至肽骨架的一个氨基酸的额外烷基。两个(或更多个)烷基可以是以分支或线性形式排列的相同烷基或不同烷基。例如，为实现分支形式，胰高血糖素类似物可包含连接至间隔基的一个烷基化氨基酸(其为肽骨架的一部分)，该间隔基包含至少三个官能团，其中至少两个各自共价连接至烷基且其中一个连接至肽骨架的烷基化氨基酸。在示例性方面，可经由例如包含两个胺基(侧链胺和α胺)用于直接连接至脂肪烷基或经由间隔基间接连接至脂肪烷基的Lys残基来实现分支形式。在示例性方面，额外间隔基可位于肽骨架的氨基酸与包含至少三个官能团的间隔基之间。例如，肽骨架的氨基酸可连接(例如，经由其侧链)至第一间隔基，该第一间隔基进而连接至第二间隔基，其中该第二间隔基包含至少三个官能团，其中至少两个各自共价连接至烷基且其中一个连接至第一间隔基。

在烷基以线性形式排列的示例性方面，胰高血糖素类似物包含直接连接至第一烷基的一个烷基化氨基酸(其为肽骨架的部分)，该第一烷基进而连接至间隔基，该间隔基进而连接至第二烷基。

双重烷基化化合物的示例性结构可衍生自图5A中所描述的双重酰化化合物。

亲水性部分和烷基

包含烷基化氨基酸的GIP激动剂肽任选地进一步包含亲水性部分。在一些特定实施方案中，亲水性部分包含聚乙二醇(PEG)链。在一些方面，亲水性部分的并入经由任何合适方法来实现，诸如本文所述方法中的任一种。在这方面，GIP激动剂肽可包含SEQ ID NO：1，其包括本文所述修饰中的任一种，其中在GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43中的任何位置(例如，位置10、14和40中的一个或多个位置)的氨基酸的至少一个包含烷基且位置16、17、21、24或29、C末端延伸内的位置的氨基酸或C末端氨基酸中的至少一个为Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，其中侧链共价键合至亲水性部分(例如PEG)。在一些实施方案中，GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43中的任何位置(例如，位置10、14和40中的一个或多个位置)的氨基酸连接(任选地经由间隔基)至烷基且氨基酸进一步连接至亲水性部分或进一步连接至Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，该Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe连接至亲水性部分。

或者，烷基化胰高血糖素类似物可包含间隔基，其中该间隔基被烷基化且修饰以包含亲水性部分。合适间隔基的非限制性实例包括包含一个或多个选自Cys、Lys、Orn、高Cys和Ac-Phe的氨基酸的间隔基。

在一些方面，GIP激动剂肽在一些实施方案中在相同氨基酸位置(其中连接亲水性部分)或在不同氨基酸位置被烷基化。非限制性实例包括在胰高血糖素类似物的位置9、10、12、13、14、16、17、20或40(例如，在位置10、14和40中的一个或多个位置)的烷基化和在C末端部分中的一个或多个位置(例如，位置24、28或29、C末端延伸内(例如，37-43)或C末端(例如，经由添加C末端Cys))的聚乙二醇化。

额外烷基实施方案

在特定实施方案中，包含烷基化氨基酸的GIP激动剂肽缺乏分子内桥键，例如，共价分子内桥键(例如，内酰胺桥键)。

α螺旋的稳定化和α螺旋稳定化氨基酸

不受任何特定理论束缚，作为胰高血糖素类似物的GIP激动剂肽包含螺旋状结构，例如，α螺旋。在一些或任何实施方案中，GIP激动剂肽包含稳定α螺旋状结构的氨基酸。因此，在一些方面，GIP激动剂肽包含一个或多个α螺旋稳定化氨基酸。如本文所用的术语“α螺旋促进氨基酸”可与术语“α螺旋稳定化氨基酸”互换使用，且是指使GIP激动剂肽的α螺旋的稳定性增加且作为GIP激动剂肽的一部分的氨基酸。α螺旋促进氨基酸在本领域中已知。参见例如Lyu等人， Proc　Natl　Acad　Sci　U.S.A. 88：5317-5320(1991)；Branden和Tooze, Introduction　to　Protein　Structure, Garland Publishing, New York, NY, 1991；Fasman, Prediction　of　Protein　Structure 和 the　Principles　of　Protein　Conformation, Fasman编，Plenum, NY, 1989。适于本文目的的α螺旋促进氨基酸包括但不限于：丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、α氨基丁酸、α-氨基异丁酸(AIB)、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。在一些实施方案中，α螺旋促进氨基酸是作为天然存在蛋白中存在的α螺旋的部分的任何氨基酸，例如，Leu、Phe、Ala、Met、Gly、Ile、Ser、Asn、Glu、Asp、Lys、Arg。

在示例性实施方案中，α螺旋促进氨基酸与甘氨酸或丙氨酸相比为α螺旋提供更大稳定性。在示例性实施方案中，α螺旋促进氨基酸为α,α双取代氨基酸，例如AIB。

α螺旋：α螺旋促进氨基酸的位置

在本公开的一些或任何实施方案中，GIP激动剂肽包含与天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)类似的氨基酸序列且GIP激动剂肽在肽类似物的位置16-21中的一个或多个位置(例如，位置16、17、18、19、20、21的一个或多个位置)包含至少一个α螺旋促进氨基酸。在一些或任何实施方案中，肽类似物在位置16、17、20和21中的一个、两个、三个或所有位置包含α螺旋促进氨基酸。

α螺旋：α , α双取代氨基酸

在一些或任何实施方案中，α螺旋促进氨基酸为α,α双取代氨基酸。在特定实施方案中，α,α双取代氨基酸包含R¹和R²，其各自键合至α碳，其中R¹和R²各自独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R¹和R²与其所连接的α碳一起形成环(例如，C3-C8环)。在示例性实施方案中，R¹和R²各自选自甲基、乙基、丙基和正丁基，或R¹和R²一起形成环辛烷或环庚烷(例如，1-氨基环辛烷-1-甲酸)。在示例性实施方案中，R¹和R²相同。在其他实施方案中，R¹和R²不同。在示例性方面，R¹和R²各为C1-C4烷基。在一些方面，R¹和R²各为C1或C2烷基。在示例性实施方案中，R¹和R²各为甲基，使得α,α双取代氨基酸为α-氨基异丁酸(AIB)。在其他示例性实施方案中，α,α双取代氨基酸为ACPC。

在一些方面，本文所述的GIP激动剂肽包含一个或多个α,α双取代氨基酸且GIP激动剂肽特定地缺乏共价分子内桥键(例如，内酰胺)，因为α,α双取代氨基酸能够在不存在共价桥键的情况下稳定α螺旋。在一些方面，GIP激动剂肽在C末端(位置12-29周围)包含一个或多个α,α双取代氨基酸。在一些或任何实施方案中，GIP激动剂肽的位置16、17、18、19、20、21、24或29中的一个、两个、三个、四个或更多个位置或位置16、17、18、19、20或21中的一个、两个、三个、四个、五个或所有位置被α,α-双取代氨基酸(例如，氨基异丁酸(AIB)、被选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团或被环辛烷或环庚烷双取代的氨基酸(例如，1-氨基环辛烷-1-甲酸))取代。例如，在不存在分子内桥键(例如，非共价分子内桥键(例如，盐桥键)或共价分子内桥键(例如，内酰胺))的情况下，位置20被AIB取代增强GIP活性。在一些或任何实施方案中，位置16、20、21或24中的一个、两个、三个或更多个位置被AIB取代。在示例性实施方案中，天然人胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的对应于位置2、16和20的一个、两个或所有氨基酸被α,α双取代氨基酸诸如AIB取代。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置2与16或位置2与20的AIB。在其他示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置2的D-Ser和位置16或位置20的AIB。

α螺旋：分子内桥键

在一些示例性实施方案中，α螺旋促进氨基酸为经由分子内桥键连接至GIP激动剂肽的另一氨基酸的氨基酸。在此类实施方案中，经由分子内桥键连接的这两种氨基酸各自视为α螺旋促进氨基酸。在示例性实施方案中，GIP激动剂肽包含一个或两个分子内桥键。在示例性实施方案中，GIP激动剂肽包含一个分子内桥键以及至少一个其他α螺旋促进氨基酸(例如，α,α-双取代氨基酸)。

在一些实施方案中，分子内桥键为经由非共价键(包括例如范德华(van der Waals)相互作用、氢键、离子键、疏水相互作用、偶极-偶极相互作用等)连接GIP激动剂肽的两个部分的桥键。在这方面，胰高血糖素类似物包含非共价分子内桥键。在一些实施方案中，非共价分子内桥键为盐桥键。

在一些实施方案中，分子内桥键为经由共价键连接GIP激动剂肽的两个部分的桥键。在这方面，GIP激动剂肽包含共价分子内桥键。

在一些实施方案中，在间隔3个氨基酸的两个氨基酸(例如，位置i和i+4的氨基酸，其中i为12与25之间的任何整数(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25))之间形成分子内桥键(例如，非共价分子内桥键、共价分子内桥键)。更具体而言，氨基酸对12与16、16与20、20与24或24与28(i=12、16、20或24的氨基酸对)的侧链彼此连接且因此稳定α螺旋。或者，i可以是17。在一些特定实施方案中，GIP激动剂肽在氨基酸17与21之间包含分子内桥键。在一些特定实施方案中，GIP激动剂肽在位置16与20或12与16的氨基酸之间包含分子内桥键，且在位置17与21的氨基酸之间包含第二分子内桥键。本文涵盖包含一个或多个分子内桥键的GIP激动剂肽。在位置i和i+4的氨基酸通过分子内桥键接合的特定实施方案中，接头的大小为约8个原子，或约7-9个原子。

在其他实施方案中，在间隔2个氨基酸的两个氨基酸(例如，位置j和j+3的氨基酸，其中j为12与26之间的任何整数(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26))之间形成分子内桥键。在一些特定实施方案中，j为17。在位置j和j+3的氨基酸通过分子内桥键接合的特定实施方案中，接头的大小为约6个原子，或约5至7个原子。

在仍其他实施方案中，在间隔6个氨基酸的两个氨基酸(例如，位置k和k+7的氨基酸，其中k为12与22之间的任何整数(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22))之间形成分子内桥键。在一些特定实施方案中，k为12、13或17。在一个示例性实施方案中，k为17。

α螺旋：分子内桥键中所涉及的氨基酸

能够键合(共价地或非共价地)形成六原子连接桥键的氨基酸配对的实例包括Orn与Asp、Glu与式I氨基酸(其中n为2)，和高谷氨酸与式I氨基酸(其中n为1)，其中式I为：

其中n=1至4

[式I]。

能够键合形成七原子连接桥键的氨基酸配对的实例包括Orn-Glu(内酰胺环)；Lys-Asp(内酰胺)；或高ser-高glu(内酯)。可形成八原子接头的氨基酸配对的实例包括Lys-Glu(内酰胺)；高lys-Asp(内酰胺)；Orn-高glu(内酰胺)；4-氨基Phe-Asp(内酰胺)；或Tyr-Asp(内酯)。可形成九原子接头的氨基酸配对的实例包括高lys-Glu(内酰胺)；Lys-高glu(内酰胺)；4-氨基Phe-Glu(内酰胺)；或Tyr-Glu(内酯)。这些氨基酸上的任何侧链可另外被其他化学基团取代，只要不破坏α-螺旋的三维结构。本领域普通技术人员可预期将产生类似大小的稳定化结构和所需作用的替代配对或替代氨基酸类似物，包括化学修饰衍生物。例如，高半胱氨酸-高半胱氨酸二硫桥键长度为6个原子且可进一步经修饰以提供所需作用。

甚至无共价键，上述氨基酸配对(或本领域普通技术人员可预期的类似配对)也可经由非共价键(例如，经由形成盐桥键或氢键相互作用)为α-螺旋提供额外稳定性。因此，可在以下之间形成盐桥键：Orn与Glu；Lys与Asp；高丝氨酸与高谷氨酸；Lys与Glu；Asp与Arg；高Lys与Asp；Orn与高谷氨酸；4-氨基Phe与Asp；Tyr与Asp；高Lys与Glu；Lys与高Glu；4-氨基Phe与Glu；或Tyr与Glu。在一些实施方案中，类似物在任何以下氨基酸对之间包含盐桥键：Orn与Glu；Lys与Asp；Lys与Glu；Asp与Arg；高Lys与Asp；Orn与高谷氨酸；高Lys与Glu；和Lys与高Glu。可在其他对带相反电荷侧链之间形成盐桥键。参见例如Kallenbach等人， Role　of　the　Peptide　Bond　in　Protein　Structure and Folding, The Amide Linkage：Structural Significance in Chemistry,Biochemistry,and Materials Science, John Wiley & Sons, Inc.(2000)。

在一些实施方案中，非共价分子内桥键为疏水性桥键。根据一个实施方案，经由在位置j和j+3或i和i+4处并入疏水性氨基酸使类似物的α螺旋稳定化。例如，i可以是Tyr且i+4可以是Val或Leu；i可以是Phe且i+4可以是Met；或i可以是Phe且i+4可以是Ile。应理解，对于本文的目的，上述氨基酸配对可颠倒，使得位置i的所示氨基酸另外可位于i+4，而i+4氨基酸可位于i位置。还应理解，对于j和j+3可形成合适的氨基酸配对。

α螺旋：共价分子内桥键

在一些实施方案中，共价分子内桥键为内酰胺环或内酰胺桥键。内酰胺环的大小可根据氨基酸侧链的长度而改变，且在一个实施方案中，通过将鸟氨酸的侧链连接至天冬氨酸侧链而形成内酰胺。内酰胺桥键和其制备方法在本领域中已知。参见例如Houston, Jr.等人， J　Peptide　Sci 1：274-282(2004)，和本文的实施例1。在一些实施方案中，类似物包含SEQ ID NO：1的经修饰序列和i与i+4(其中i如上文所定义)之间的内酰胺桥键。在一些实施方案中，GIP激动剂肽包含两个内酰胺桥键：一个在位置16与20的氨基酸之间且另一个在位置17与21的氨基酸之间。在一些实施方案中，GIP激动剂肽包含一个内酰胺桥键和一个盐桥键。本文在标题为“实施例”的部分中描述其他示例性实施方案。其他示例性实施方案包括以下配对，任选地具有内酰胺桥键：位置12的Glu与位置16的Lys；位置12的天然Lys与位置16的Glu；位置16的Glu与位置20的Lys；位置16的Lys与位置20的Glu；位置20的Glu与位置24的Lys；位置20的Lys与位置24的Glu；位置24的Glu与位置28的Lys；位置24的Lys与位置28的Glu。

在一些实施方案中，共价分子内桥键为内酯。制备内酯桥键的合适方法在本领域中已知。参见例如Sheehan等人，J　Am　Chem　Soc 95：875-879 (1973)。

在一些方面，使用全烃交联系统利用烯烃复分解来交联类似物的α螺旋的一个或两个转角。在这种情况下GIP激动剂肽包含带有不同长度的烯烃侧链且在j与j+3或i与i+4位置经配置为R或S立体化学的α-甲基化氨基酸。在一些实施方案中，烯烃侧包含(CH₂)n，其中n为1至6之间的任何整数。在一些实施方案中，对于8个原子的交联长度，n为3。在一些实施方案中，对于6个原子的交联长度，n为2。本领域中描述了形成此类分子内桥键的合适方法。参见例如Schafmeister等人， J.　Am.　Chem.　Soc. 122：5891-5892 (2000)；和Walensky等人， Science 305：1466-1470 (2004)。在替代实施方案中，类似物包含位于相邻螺旋状转角上的O-烯丙基Ser残基，所述残基经由钌催化的闭环复分解(ring closing metathesis)桥接在一起。此类交联程序描述于例如Blackwell等人，Angew,　Chem.,　Int.　Ed.　37: 3281-3284 (1998)。

在特定方面，使用非天然硫代-二丙氨酸氨基酸(羊毛硫氨酸(lanthionine)，其已广泛用作胱氨酸的肽模拟物)用于交联α螺旋的一个转角。基于羊毛硫氨酸的环化的合适方法在本领域中已知。参见例如Matteucci等人，Matteucci等人, Tetrahedron　Letters　45: 1399-1401 (2004); Mayer等人, J.　Peptide　Res.　51: 432-436 (1998); Polinsky等人, J.　Med.　Chem.　35: 4185-4194 (1992); Osapay等人, J.　Med.　Chem.　40: 2241-2251 (1997); Fukase等人, Bull.　Chem.　Soc.　Jpn.　65: 2227-2240 (1992); Harpp等人, J.　Org.　Chem.　36: 73-80 (1971); Goodman和Shao, Pure　Appl.　Chem.　68: 1303-1308 (1996); 和Osapay和Goodman, J.　Chem.　Soc.　Chem.　Commun.　1599-1600 (1993)。

在一些实施方案中，使用位置i和i+7的两个Glu残基之间的α,ω-二氨基烷烃系栓(tether)(例如，1,4-二氨基丙烷和1,5-二氨基戊烷)来稳定类似物的α螺旋。根据二氨基烷烃系栓的长度，此类系栓导致形成长度为9个原子或更多个原子的桥键。本领域中描述用此类系栓交联的肽的合适制备方法。参见例如Phelan等人，J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997)。

在仍其他实施方案中，使用二硫桥键来交联类似物的α螺旋的一个或两个转角。或者，使用经修饰二硫桥键(其中一个或两个硫原子被亚甲基置换，导致等排大环化)来稳定类似物的α螺旋。用二硫桥键或基于硫的环化来修饰肽的合适方法描述于例如Jackson等人，J.　Am.　Chem.　Soc.　113: 9391-9392 (1991)和Rudinger和Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)。

在仍其他实施方案中，经由位于j与j+3或i与i+4的两个His残基或His与Cys对结合金属原子来稳定类似物的α螺旋。该金属原子可以是例如Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)或Cd(II)。此类基于金属结合的α螺旋稳定化方法在本领域中已知。参见例如Andrews和Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999)；Ghadiri等人, J.　Am.　Chem.　Soc. 112: 1630-1632 (1990)；和Ghadiri等人, J.　Am.　Chem.　Soc. 119: 9063-9064 (1997)。

GIP激动剂肽的α螺旋另外可经由其他方式的肽环化来稳定，所述方式综述于Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)。可经由形成酰胺桥键、硫醚桥键、硫酯桥键、脲桥键、氨基甲酸酯桥键、磺酰胺桥键等来稳定α螺旋。例如，可在C末端与Cys残基的侧链之间形成硫酯桥键。或者，可经由具有巯基的氨基酸(Cys)的侧链和具有羧酸的氨基酸(例如，Asp、Glu)的侧链形成硫酯。在另一方法中，交联剂，诸如二羧酸(例如，软木酸(辛二酸)等)可在氨基酸侧链的两个官能团(诸如游离氨基、羟基、巯基和其组合)之间引入连接。

额外描述

下文提供本公开的胰高血糖素类似物的额外描述。如本文所讨论，下文描述中的氨基酸位置关于SEQ ID NO：1的氨基酸编号进行提及。此外，尽管下文描述涉及天然人胰高血糖素(SEQ ID NO：1)讨论，例如，SEQ ID NO：1的修饰，但这些描述未必暗示：(i)此类修饰存在于所有本公开的肽中；和(ii)本公开的肽的唯一制备方法以天然人胰高血糖素起始且修饰该序列。反而，提供所述描述以描述本公开胰高血糖素类似物的一些实施方案，且本公开的肽可在不利用天然人胰高血糖素作为起始物质的情况下重新制备，如标题为“制备肽的方法”的部分中进一步描述。

位置 1

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置1包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置1包含不是His的氨基酸。在示例性方面，胰高血糖素类似物在位置1包含大型芳族氨基酸。在示例性实施方案中，大型芳族氨基酸为Tyr、Phe、Trp、氨基-Phe(例如，4-氨基-Phe)、氯-Phe、磺基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr或3-氨基Tyr。

在其他示例性实施方案中，胰高血糖素类似物在位置1包含包括咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，位置1的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R1和R2各自独立地选自H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基，其中至少一个H被F置换。

在示例性方面，位置1的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO：1)L-组氨酸(His)的天然残基，或为His的衍生物(His衍生物)，例如，α原子被修饰的His衍生物。在示例性方面，His衍生物为D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。

在示例性方面，位置1的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在仍其他方面，位置1的氨基酸为如本文所述的DPP-IV保护性氨基酸。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为His的衍生物。

位置 2

在一些实施方案中，本公开的肽包含位置2的DPP-IV保护性氨基酸。如本文所用的术语“DPP-IV保护性氨基酸”是指实现本公开的肽针对二肽基肽酶IV(DPP IV)裂解的实质抗性的氨基酸。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或α氨基异丁酸(AIB)之一。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为α,α-双取代氨基酸。在一些方面，α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，其各自键合至α碳，其中R1和R2各自独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1和R2与其所连接的α碳一起形成环。在一些方面，α,α-双取代氨基酸为AIB或1-氨基环丙烷-1-甲酸酯(ACPC)。

如本文所用的术语“C₁-C_n烷基”(其中n可以是1至6)表示具有一个至指定数目碳原子的支链或直链烷基。典型C₁-C₆烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。

在示例性实施方案中，DPP-IV保护性氨基酸为Ser的D-异构体(D-Ser)或其保守氨基酸取代。例如，DPP-IV保护性氨基酸可包含-(C1-C4烷基)OH的侧链结构。任选地，当侧链结构包含-(C3烷基)OH或-(C4烷基)OH时，碳链可以是直链或支链。

在示例性方面，当DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser且位置1的氨基酸为His时，GIP激动剂肽未缀合至异源部分，例如，亲水性部分(例如PEG)。在本公开的其他方面，DPP-IV保护性氨基酸不是D-丝氨酸。

位置 3

在一些实施方案中，与在位置3具有天然胰高血糖素残基(Gln)的匹配对照肽相比，胰高血糖素类似物在位置3包含为胰高血糖素类似物赋予针对胰高血糖素受体的降低活性的氨基酸。在一些方面，在位置3具有该类型氨基酸的胰高血糖素类似物具有天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体的活性的约10%或更小，例如，约1-10%、或约0.1-10%、或大于约0.1%但小于约10%。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物展现天然胰高血糖素活性的约0.5%、约1%或约7%。在示例性方面，位置3的氨基酸为酸性、碱性或疏水性氨基酸残基，例如，谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸。在一些方面，位置3的氨基酸为Ile或Leu。

在一些实施方案中，胰高血糖素类似物在位置3包含SEQ ID NO：1的天然氨基酸，例如谷氨酰胺，或包含谷氨酰胺类似物。不受特定理论束缚，此类包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素类似物不展现针对胰高血糖素受体的活性的实质损失，且在一些情况下，包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素类似物增强胰高血糖素受体活性。在一些实施方案中，谷氨酰胺类似物在位置3包含包括结构I、II或III的侧链的氨基酸：

结构I

结构II

结构III

其中R¹为C_0-3烷基或C_0-3杂烷基；R²为NHR⁴或C_1-3烷基；R³为C_1-3烷基；R⁴为H或C_1-3烷基；X为NH、O或S；且Y为NHR⁴、SR³、或OR³。在一些实施方案中，X为NH或Y为NHR⁴。在一些实施方案中，R¹为C_0-2烷基或C₁杂烷基。在一些实施方案中，R²为NHR⁴或C₁烷基。在一些实施方案中，R⁴为H或C¹烷基。在示例性实施方案中，提供包含结构I的侧链的氨基酸，其中R¹为CH₂-S，X为NH，且R²为CH₃ (乙酰胺基甲基-半胱氨酸，C(Acm))；R¹为CH₂，X为NH，且R²为CH₃ (乙酰基二氨基丁酸，Dab(Ac))；R¹为C₀烷基，X为NH，R²为NHR⁴，且R⁴为H(氨基甲酰基二氨基丙酸，Dap(脲))；R¹为CH₂-CH₂，X为NH，且R²为CH₃ (乙酰基鸟氨酸，Orn(Ac))；或R¹为(CH₂)₃，X为NH，且R²为CH₃ (乙酰基赖氨酸(Ac Lys))。在示例性实施方案中，提供包含结构II的侧链的氨基酸，其中R¹为CH₂，Y为NHR⁴，且R⁴为CH₃ (甲基谷氨酰胺，Q(Me))；在示例性实施方案中，提供包含结构III的侧链的氨基酸，其中R¹为CH₂且R⁴为H(甲硫氨酸-亚砜，M(O))；在特定实施方案中，位置3的氨基酸被Dab(Ac)取代。

在一些实施方案中，胰高血糖素类似物在位置3包含：

(i)脂肪族氨基酸，例如，Ala、Val、正亮氨酸(Nle)或正缬氨酸(NorVal)；

(ii)具有结构S1的侧链的氨基酸：

[结构S1]

其中n为1至4的整数；且

其中X为SCH₃、S(O)CH₃;或S(O)₂；或

(iii)具有结构S2的侧链的氨基酸：

[结构S2]

其中n为1至4的整数。

在示例性方面，具有结构S1的侧链的氨基酸为Met、甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜。在示例性方面，具有结构S2的侧链的氨基酸为高丝氨酸。不受特定理论束缚，此类胰高血糖素类似物维持一些胰高血糖素活性。

位置 7

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置7包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置7包含除Thr以外的氨基酸。在一些方面，位置7的氨基酸为大型脂肪族氨基酸，例如，Ile、Leu、Ala等。不受特定理论束缚，在位置7包含此类氨基酸的胰高血糖素类似物据信展现针对GLP-1受体的活性急剧降低。

位置 9

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置9包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置9包含除Asp以外的氨基酸。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含除Asp以外的带负电荷氨基酸，例如，Glu、高谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸。在一些方面，位置9的氨基酸为如本文所讨论的酰化氨基酸或烷基化氨基酸。

位置 10

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置10包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置10包含除Tyr以外的氨基酸。在一些方面，位置10的氨基酸为Trp。不受特定理论束缚，在位置10包含此类氨基酸的胰高血糖素类似物据信展现针对GIP受体、GLP-1受体和/或胰高血糖素受体的活性，其与在位置10具有Tyr的相应肽相比未降低。

在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含如本文所讨论的酰化氨基酸或烷基化氨基酸。

位置 11

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置11包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置11包含除Ser以外的氨基酸。在一些方面，位置11的氨基酸为小脂肪族氨基酸，例如，Gly或Ala。不受特定理论束缚，在位置10包含此类氨基酸的胰高血糖素类似物据信展现针对胰高血糖素受体的降低活性。

位置 12

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置12包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置10包含除Lys以外的氨基酸。在一些方面，位置12的氨基酸为大型脂肪族非极性氨基酸，任选地为异亮氨酸。在一些方面，位置12的氨基酸为Arg。不受特定理论束缚，包含大型脂肪族非极性氨基酸(例如Ile)的胰高血糖素类似物展现针对GIP受体的增强活性。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含如本文所讨论的酰化氨基酸或烷基化氨基酸。

位置 15

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置15包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置15包含除Asp以外的氨基酸。在一些方面，位置15的氨基酸缺失或为谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸。不受特定理论束缚，此类胰高血糖素类似物展现改善的稳定性，例如，通过降低类似物随时间的降解或裂解，尤其在酸性或碱性缓冲液中，例如pH在5.5至8范围内的缓冲液。在一些实施方案中，包含该修饰的胰高血糖素类似物在25℃下24小时后保持原始类似物的至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。

位置 16

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置16包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置16包含除Ser以外的氨基酸。在一些方面，位置16的氨基酸为谷氨酸或可选地具有另一带负电荷氨基酸(具有长度为4个原子的侧链)、或者可选地具有谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸、或具有含有至少一个杂原子(例如N、O、S、P)的侧链的带电荷氨基酸中的任一种并且侧链长度为约4个(或3-5个)原子。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物在位置16包含选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、高半胱磺酸、苏氨酸或甘氨酸的氨基酸或为选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸。

不受特定理论束缚，此类胰高血糖素类似物展现增强的稳定性，例如，通过降低肽随时间的降解，尤其在酸性或碱性缓冲液中，例如pH在5.5至8范围内的缓冲液。此类胰高血糖素类似物不易经受Asp15-Ser16肽键的裂解。

在一些实施方案中，位置16的氨基酸为带负电荷氨基酸，任选地组合位置20的α螺旋促进氨基酸(例如，α,α双取代氨基酸或AIB)。此类胰高血糖素类似物展现GIP活性。

在替代实施方案中，胰高血糖素类似物在位置16包含Thr或如上文所述的α螺旋促进氨基酸。在一些实施方案中，α螺旋促进氨基酸为AIB或Glu。

在一些方面，位置16的氨基酸为带正电荷氨基酸，例如，式IV：

[式IV]，

其中n为1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6、或2或3或4或5，R₁和R₂各自独立地选自：H、C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)NH₂、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)，其中R₇为H或OH。在示例性方面，胰高血糖素类似物的位置16的氨基酸为Lys。

在一些实施方案中，胰高血糖素类似物在位置16包含如本文所讨论的酰化氨基酸或烷基化氨基酸。

在仍额外实施方案中，位置16的氨基酸为包含缀合至异源部分的侧链的氨基酸，如本文在标题为“缀合物”的部分下所描述。

在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含位置16的脂肪族氨基酸。例如，胰高血糖素类似物在胰高血糖素类似物的位置16可具有Gly、Ala、Val、Leu或Ile。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含小脂肪族残基，例如，Gly、Ala。

在示例性方面，胰高血糖素类似物包含包括咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，位置16的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R1和R2各自独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基，其中至少一个H被F置换。在示例性方面，位置16的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在示例性方面，位置16的氨基酸为L-组氨酸(His)。在其他方面，位置16的氨基酸为His的衍生物(His衍生物)，其中一些描述于本文中。参见例如“ 位置 1 ”下的教导。

位置 17 和 18

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置17和18中的任一个或两个位置包含氨基酸修饰，使得位置17和18的二元(dibasic) Arg-Arg位点得以消除。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物在位置17和18中的一个或两个位置包含除Arg以外的氨基酸。不受任何特定理论束缚，据信二元位点的消除改善胰高血糖素类似物的体内功效。在一些方面，位置17的氨基酸不是碱性氨基酸。在一些方面，位置17的氨基酸为脂肪族氨基酸。在一些实施方案中，位置17的氨基酸被如本文所述的另一氨基酸(例如，包含亲水性部分的氨基酸、α螺旋促进氨基酸)取代。在一些实施方案中，α螺旋促进氨基酸与j+3或i+4的氨基酸形成非共价分子内桥键。在一些方面，位置17的氨基酸为Gln。

在其他方面，本公开的胰高血糖素类似物在位置17包含包括咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，位置17的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R1和R2各自独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基，其中至少一个H被F置换。在示例性方面，位置17的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在示例性方面，位置17的氨基酸为L-组氨酸(His)。在其他方面，位置17的氨基酸为His的衍生物(His衍生物)，其中一些描述于本文中。参见例如“ 位置 1 ”下的教导。

在一些方面，位置18的氨基酸不是碱性氨基酸。在一些方面，位置18的氨基酸为脂肪族氨基酸。在一些实施方案中，位置18的氨基酸为小脂肪族氨基酸，例如Ala。

在一些特定方面，位置18的氨基酸为小脂肪族氨基酸，例如Ala，且位置17的氨基酸为Arg。在其他方面，位置18的氨基酸为小脂肪族氨基酸，例如Ala，且位置17的氨基酸为Gln。

在一些方面，位置17的氨基酸为包含缀合至异源部分的侧链的氨基酸，如本文在标题为“缀合物”的部分下所述。

位置 19

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置19包含氨基酸修饰，例如，胰高血糖素类似物在位置19包含除Ala以外的氨基酸。在一些方面，位置19的氨基酸为α螺旋促进氨基酸(例如，α,α双取代氨基酸或AIB)。不受任何特定理论束缚，与其中位置19的氨基酸为天然氨基酸残基Ala的匹配对照肽相比，包含α,α双取代氨基酸(例如AIB)的胰高血糖素类似物展现降低的胰高血糖素激动剂活性。

位置 20

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置20包含氨基酸修饰，例如，位置20的氨基酸为除Gln以外的氨基酸。在一些方面，位置20的氨基酸为α螺旋促进氨基酸，例如如上文所述。在一些方面，位置20的氨基酸为α,α双取代氨基酸，例如，AIB、ACPC。在一些实施方案中，α螺旋促进氨基酸与j-3或i-4的氨基酸形成非共价分子内桥键。

在一些特定实施方案中，氨基酸为具有带电荷或具有氢键键合能力的侧链的亲水性氨基酸，且长度为至少约5个(或约4-6个)原子，例如，赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸。在其他方面，位置20的氨基酸为Ser、Thr、Ala或AIB。

在一些方面，位置20的氨基酸为如本文所讨论的酰化氨基酸或烷基化氨基酸。

在一些方面，位置20的氨基酸为包含缀合至异源部分的侧链的氨基酸，如本文在标题为“缀合物”的部分下所述。

在一些方面，胰高血糖素类似物的位置20的氨基酸包含咪唑侧链。在示例性方面，位置20的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R1和R2各自独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基，其中至少一个H被F置换。在示例性方面，位置20的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在示例性方面，位置20的氨基酸为L-组氨酸(His)。在其他方面，位置20的氨基酸为His的衍生物(His衍生物)，其中一些描述于本文中。参见例如“ 位置 1 ”下的教导。

在一些方面，位置20的氨基酸为带正电荷氨基酸，例如，式IV：

[式IV]，

其中n为1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6、或2或3或4或5，R₁和R₂各自独立地选自：H、C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)NH₂、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)，其中R₇为H或OH。在示例性方面，胰高血糖素类似物的位置20的氨基酸为Lys。

不受特定理论束缚，此类胰高血糖素类似物展现针对GLP-1受体和/或GIP受体的活性增强或展现经由Gln的去酰胺化而发生的降解减少和/或展现增加的稳定性。

位置 21

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置21包含氨基酸修饰，例如，位置21的氨基酸为除Asp以外的氨基酸。在示例性方面，位置21的氨基酸为Ser、Thr、Ala或AIB。在其他方面，位置21的氨基酸为Lys、Arg、Orn或瓜氨酸。在一些方面，位置21的氨基酸为Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸。在一些方面，位置21的氨基酸为包含缀合至异源部分的侧链的氨基酸，如本文在标题为“缀合物”的部分下所述。

在一些实施方案中，位置21的氨基酸为α螺旋促进氨基酸。在一些实施方案中，α螺旋促进氨基酸与j-3或i-4的氨基酸形成非共价分子内桥键。

不受特定理论束缚，此类胰高血糖素类似物展现经由Asp脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体随后异构化为异天冬氨酸而降解所发生的降解减少和/或展现增加的稳定性。

位置 23

在一些方面，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置23包含氨基酸修饰。在一些方面，位置23的氨基酸为除Val以外的氨基酸，包括但不限于Ile。

位置 24

在一些方面，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置24包含氨基酸修饰。在一些方面，位置24的氨基酸为除Gln以外的氨基酸，例如，Ala、Asn、Cys。在一些方面，位置24的氨基酸为包含缀合至异源部分的侧链的氨基酸，如本文在标题为“缀合物”的部分下所述。

位置 27

在一些方面，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置27包含氨基酸修饰。在一些方面，位置27的氨基酸为除Met以外的氨基酸。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物在位置27包含防止肽氧化降解的氨基酸。在一些方面，位置27的氨基酸为甲硫氨酸亚砜、亮氨酸、异亮氨酸或正亮氨酸。在一些特定实施方案中，位置27的氨基酸为亮氨酸或正亮氨酸。

在其他方面，位置27的氨基酸为脂肪族氨基酸(例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile)或式IV氨基酸，如本文所述，例如Lys。在示例性实施方案中，位置27的氨基酸为Val或Lys。不受任何特定理论束缚，此类氨基酸修饰降低胰高血糖素活性。

位置 28 和 29

在一些方面，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置28包含氨基酸修饰。在一些方面，位置28的氨基酸为除Asn以外的氨基酸。在一些方面，位置28的氨基酸为Ala、Ser、Thr或AIB。在一些方面，位置28的氨基酸为带电荷氨基酸，例如，带负电荷氨基酸，如本文进一步所述。参见标题为“带电荷C末端”的部分。在一些方面，位置28的氨基酸为Asp。

在示例性方面，位置28的氨基酸为如本文所述的式IV氨基酸。在示例性实施方案中，氨基酸为Lys。不受任何特定理论束缚，此类氨基酸修饰降低胰高血糖素活性。

在一些方面，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在位置29包含氨基酸修饰。在一些方面，位置29的氨基酸为除Thr以外的氨基酸。在一些方面，位置29的氨基酸为脂肪族残基，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile。在一些方面，位置29的氨基酸为小脂肪族氨基酸。在一些方面，位置29的氨基酸为Ala或Gly。在一些方面，位置29的氨基酸为α,α-双取代氨基酸，诸如任何本文所述的这些α,α-双取代氨基酸。在示例性方面，位置29的氨基酸为AIB。

在一些方面，位置29的氨基酸为包含缀合至异源部分的侧链的氨基酸，如本文在标题为“缀合物”的部分下所述。

不受任何特定理论束缚，当位置28为Asp且位置29为Gly时，胰高血糖素类似物经受一定程度的化学不稳定性。因此，在示例性方面，胰高血糖素类似物不具有位置28的Asp和位置29的Gly两者，且可展现增强的化学稳定性。例如，在一些方面，胰高血糖素类似物包含位置28的Asp和位置29的除Gly以外的氨基酸。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置28的Asp和位置29的Gly、Ala、Val、Leu、Ile或AIB之一。在替代方面，胰高血糖素类似物包含位置29的Gly和位置28的除Asp以外的氨基酸。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置28的Ala、Ser、Thr、Lys、AIB或Glu和位置29的Gly。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置28的Glu和位置29的Gly。

带电荷 C 末端

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物包含一个或多个将带电荷氨基酸引入类似物的C末端部分中的氨基酸取代和/或添加。在一些实施方案中，此类修饰增强稳定性和溶解性。如本文所用的术语“带电荷氨基酸”或“带电荷残基”是指包含在水溶液中在生理pH下带正电荷或带负电荷(即，去质子化)或带正电荷(即，质子化)的侧链的氨基酸。在一些方面，引入带电荷氨基酸修饰的这些氨基酸取代和/或添加在SEQ ID NO：1的C末端位置至位置27。在一些实施方案中，一个、两个或三个(且在一些情况下，多于三个)带电荷氨基酸被引入C末端部分内(例如，C末端位置至位置27)。根据一些实施方案，位置28和/或29的天然氨基酸被带电荷氨基酸取代，和/或在另一个实施方案中，一个至三个带电荷氨基酸也添加至类似物的C末端。在示例性实施方案中，一个、两个或所有带电荷氨基酸带负电荷。在一些实施方案中，带负电荷氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸或高谷氨酸。在一些方面，这些修饰增加溶解性或稳定性。在一些实施方案中，位置30不是带电荷氨基酸。不受特定理论束缚，带电荷氨基酸(例如，带负电荷氨基酸，例如Glu)降低GIP活性。

C 末端截短

根据一些实施方案，本文所公开的胰高血糖素类似物通过截短C末端一个或两个氨基酸残基而修饰。此类经修饰的胰高血糖素肽保持类似的针对胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性和效价。在这方面，胰高血糖素肽可包含天然胰高血糖素类似物(SEQ ID NO：1)的氨基酸1-27或1-28，任选地具有任何本文所述的额外修饰。

电荷中性 C 末端

在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，胰高血糖素类似物在C末端包含电荷中性基团，诸如酰胺或酯，以替代α羧酸酯。不受任何特定理论束缚，在示例性方面，此类修饰增加胰高血糖素类似物针对GLP-1受体的活性。因此，在一些实施方案中，胰高血糖素类似物为酰胺化肽，使得C末端残基包含酰胺以替代氨基酸的α羧酸酯。如本文所用，一般提及肽或类似物意欲涵盖具有经修饰氨基末端、羧基末端或氨基与羧基末端两者的肽。例如，包含酰胺基以替代末端羧酸的氨基酸链意欲由表示标准氨基酸的氨基酸序列所涵盖。

C 末端延伸

在本公开的一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含与位置29的氨基酸融合的1-21个氨基酸的C末端延伸。C末端延伸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸。在一些方面，C末端延伸为下文在部分“缀合物”中所述的任何异源肽。例如，胰高血糖素类似物在位置30包含脂肪族残基，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile。在示例性方面，胰高血糖素类似物在位置30包含小脂肪族残基，例如，Gly、Ala。

此外，例如，在一些方面，所述延伸包含形成Trp笼结构的氨基酸序列，例如，所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：5)或其保守取代序列。在替代方面，1至21个氨基酸的延伸包含至少一个带电荷氨基酸。在示例性方面，所述延伸包含氨基酸序列：X1-X2，其中X1为带电荷氨基酸且X2为小脂肪族氨基酸。在一些方面，X1为带正电荷氨基酸，例如，Arg。在一些方面，所述延伸包含Arg-Gly。

在一些实施方案中，所述延伸包含氨基酸序列SEQ ID NO：5(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：6(GGPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：7(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：8(KRNR)。在特定方面，氨基酸序列经由胰高血糖素类似物的C末端氨基酸(例如，位置29的氨基酸)连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO：5-8中的任一种的氨基酸序列经由肽键结合至胰高血糖素类似物的氨基酸29。在一些特定实施方案中，胰高血糖素类似物的位置29的氨基酸为Gly且该Gly融合至SEQ ID NO：5-8中的任一种的一个氨基酸序列。

在示例性方面，胰高血糖素类似物包含形成本领域中已知为Trp笼的结构的延伸(参见例如Paschek等人，Proc　Natl　Acad　Sci　USA 105 (46): 17754-17759 (2008)。在一些方面，所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：5)或GGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：6)或GPSSGRPPPS(SEQ ID NO：183)或具有1、2或3个保守氨基酸取代的前述序列之一的序列。在示例性方面，当所述延伸包含氨基酸序列SEQ ID NO：183时，位置28的氨基酸为带负电荷氨基酸，例如，Asp或Glu。

其他修饰

在本申请中通篇可见关于本公开胰高血糖素类似物的其他修饰(相对于SEQ ID NO：1)的描述。上述列表并非详尽的，而仅是示例性的。

在一些实施方案中，本文所述的胰高血糖素类似物被糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫桥键环化、或转化成盐(例如，酸加成盐、碱加成盐)，和/或任选地被二聚化、多聚化、或聚合、或缀合。

被排除的肽

本公开的胰高血糖素类似物在结构上不同于以下文献中所述的展现GIP受体激动剂活性的胰高血糖素类似物：国际专利申请号PCT US2009/47447(申请于2009年6月16日)；美国申请号61/073,274(申请于2008年6月17日)；美国申请号61/078,171(申请于2008年7月3日)；美国申请号61/090,448(申请于2008年8月20日)；美国申请号61/151,349(申请于2009年2月10日)；美国申请号61/187,578(申请于2009年6月16日)；国际专利申请号PCT/US2010-038825(申请于2010年6月16日)；美国临时专利申请号61/426,285(申请于2010年12月22日)；美国临时专利申请号61/514,609(申请于2011年8月3日)；和国际专利申请号PCT/US2011/066164(申请于2011年12月20日)；所述文献的内容以其整体通过引用并入本文中。因此，在任何或所有实施方案中，本公开的胰高血糖素类似物不是以下文献中所述的任何胰高血糖素类似物或肽：国际专利申请号PCT/US2009/47447(申请于2009年6月16日，且公开为WO 2010/011439)；美国申请号61/073,274(申请于2008年6月17日)；美国申请号61/078,171(申请于2008年7月3日)；美国申请号61/090,448(申请于2008年8月20日)；美国申请号61/151,349(申请于2009年2月10日)；美国申请号61/187,578(申请于2009年6月16日)；国际专利申请号PCT/US2010/038825(申请于2010年6月16日，且公开为WO 2010/148089)；美国申请号61/298,812(申请于2010年1月27日)；国际专利申请号PCT/US2011/022608(申请于2011年1月26日，且公开为WO 2011/094337)；美国临时专利申请号61/426,285(申请于2010年12月22日)；美国临时专利申请号61/514,609(申请于2011年8月3日)；或国际专利申请号PCT/US2011/066164(申请于2011年12月20日)。在示例性实施方案中，本公开的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)以下肽中的任何一种或所有：WO 2010/011439的SEQ ID NO：1-262；WO 2010/148089的SEQ ID NO：1-680；或PCT/US2011/022608(其于2011年8月4日公开为WO2011/094337)的SEQ ID NO：1-1318；或国际专利申请号PCT/US2011/066164(申请于2011年12月20日，其于2012年6月28日公开为国际专利申请公开号WO2012/088116)的SEQ ID NO：10-262。

在示例性实施方案中，本公开的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)国际专利申请公开号WO 2010/011439的以下肽中的任何一种或所有：SEQ ID NO：

和/或262。

在示例性实施方案中，本公开的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)国际专利申请公开号WO 2010/148089的以下肽中的任何一种或所有：SEQ ID NO：

679和/或680。在示例性实施方案中，本公开的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)国际专利申请公开号WO 2010/148089的以下肽中的任何一种或所有：SEQ ID NO：657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669，其在本文中分别呈现为SEQ ID NO：219-229。

在示例性实施方案中，本公开的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)国际申请公开号WO/2011/094337的以下肽中的任何一种或所有：SEQ ID NO：

和/或1318。

示例性实施方案

在示例性实施方案中，本公开的肽为胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物，其包含(i)位置1的包含咪唑侧链的氨基酸；(ii)位置2的DPP-IV保护性氨基酸；(iii)位置9、10、12、16、20或37-43中的任一个的酰化氨基酸或烷基化氨基酸，任选地，其中该酰基或烷基经由间隔基连接至氨基酸；(iv)位置20的选自以下的氨基酸：(i)α,α-双取代氨基酸；和(ii)包含咪唑侧链的氨基酸；和(v)相对于SEQ ID NO：1的多至10个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)额外氨基酸修饰，其中，当胰高血糖素类似物未缀合至异源部分(例如，亲水性部分(例如，PEG))时，该胰高血糖素类似物展现天然GIP针对GIP受体的活性的至少或约0.1%(例如，至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少约80%、至少或约100%、至少或约500%)。

本文所述的胰高血糖素类似物可包含本文所述的任何活性概况。参见例如标题为“本公开的肽的活性”的部分。在示例性方面，胰高血糖素类似物展现至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GIP效价百分比。在一些方面，胰高血糖素类似物还展现至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GLP-1效价百分比。在替代或额外方面，胰高血糖素类似物展现至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、或至少或约100%的胰高血糖素效价百分比。因此，尽管胰高血糖素类似物可视为GIP激动剂肽，但在一些方面，胰高血糖素类似物另外可视为GIP-GLP-1共激动剂、GIP-胰高血糖素共激动剂或GIP-GLP-1-胰高血糖素三重激动剂。例如，肽可展现针对人GIP受体、人GLP-1受体和任选地人胰高血糖素受体中的每一种的激动剂活性，其中该肽展现针对GIP受体的EC50为其针对GLP-1受体的EC50的100倍以内(例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍或更小)且任选地为其针对胰高血糖素受体的EC50的100倍以内(例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍或更小)。

在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物在位置1包含包括咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，位置1的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R1和R2各自独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基，其中至少一个H被F置换。在示例性方面，位置1的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在示例性方面，位置1的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO：1)L-组氨酸(His)的天然残基，或为His的衍生物(His衍生物)，例如，α原子被修饰的His衍生物。如本文所用的术语“His衍生物”是指包含连接至至少一个碳原子的咪唑(例如，包含式A的结构)或经取代的咪唑的化学部分。在示例性实施方案中，His衍生物包含类似于组氨酸结构的结构，除了α胺、α碳或α羧酸酯被另一化学部分置换。在示例性实施方案中，His衍生物为α取代组氨酸，其中连接至α碳的氢原子被另一化学部分例如甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、甲氧基、乙氧基等取代。在一些方面，His衍生物为D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。

在一些方面，位置2的DPP-IV保护性氨基酸为D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或α,氨基异丁酸(AIB)之一。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser、或其保守氨基酸取代、或α,α-双取代氨基酸。在一些方面，α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，其各自键合至α碳，其中R1和R2各自独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1和R2与其所连接的α碳一起形成环。在一些方面，α,α-双取代氨基酸为AIB。在示例性方面，当DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser时，GIP激动剂肽未缀合至异源部分，例如，亲水性部分(例如，PEG)。在本公开的其他方面，DPP-IV保护性氨基酸不是D-丝氨酸。

在示例性方面，本公开的胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物包含位置20的α,α-双取代氨基酸。在示例性方面，α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，其各自键合至α碳，其中R1和R2各自独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1和R2与其所连接的α碳一起形成环。在一些实施方案中，α,α-双取代氨基酸为1-氨基环丙烷-1-甲酸酯(ACPC)。在一些方面，位置20的α,α-双取代氨基酸为AIB。在示例性实施方案中，位置16的氨基酸为带电荷氨基酸，例如，带正电荷氨基酸、带负电荷氨基酸。在一些方面，当位置20的氨基酸为α,α双取代氨基酸时，位置16的氨基酸为式IV的带正电荷氨基酸，例如Lys，或为带负电荷氨基酸，例如Glu。在一些方面，当位置20的氨基酸为α,α双取代氨基酸时，位置16的氨基酸为电荷中性氨基酸，例如，Ser、Ala、Gly。在示例性方面，位置16的氨基酸为小脂肪族氨基酸(例如Ala)、α,α-双取代氨基酸(例如AIB)、或包含咪唑侧链的氨基酸(例如His)。在示例性方面，胰高血糖素类似物在胰高血糖素类似物的位置17包含Arg、Gln或包含咪唑侧链的氨基酸，任选地为His。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置18的Ala和位置19的Ala。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置21的Glu。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置27的Leu或Nle、位置28的Asp或Glu、和位置29的Gly。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的C末端延伸。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含C末端酰胺以替代C末端残基的α羧酸酯。

在示例性方面，本公开的胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物在位置20包含包括咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，包含咪唑侧链的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R1和R2各自独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基，其中至少一个H被F置换。合适的包含咪唑侧链的氨基酸描述于本文中。在示例性方面，位置20的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。在一些方面，位置20的氨基酸为His或His衍生物。在示例性方面，胰高血糖素类似物在位置16包含带负电荷氨基酸，例如Glu。在示例性方面，胰高血糖素类似物在胰高血糖素类似物的位置17包含Arg、Gln或包含咪唑侧链的氨基酸，任选地为His。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置18的Ala和位置19的Ala。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置27的Leu或Nle、位置28的Asp或Glu、和位置29的Gly。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的C末端延伸。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含C末端酰胺以替代C末端残基的α羧酸酯。

在示例性实施方案中，本公开的肽为胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物，其包含：(i)在位置3选自Ala、Leu、Ile、Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met和甲硫氨酸砜的氨基酸；(ii)在位置9、10、12、16、20或37-43中的任何位置的酰化氨基酸或烷基化氨基酸，任选地，其中该酰基或烷基经由间隔基连接至氨基酸；(iii)位置16-21中的一个或多个位置的α螺旋稳定化氨基酸；和(v)相对于SEQ ID NO：1的多至10个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)额外氨基酸修饰，其中，当胰高血糖素类似物未缀合至异源部分(例如，亲水性部分(例如，PEG))时，该胰高血糖素类似物展现天然GIP针对GIP受体的活性的至少或约0.1%(例如，至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少约80%、至少或约100%、至少或约500%)。

包含赋予针对胰高血糖素受体的活性降低的氨基酸修饰的胰高血糖素类似物可包含本文所述的任何活性概况。参见例如标题为“本公开的肽的活性”的部分。在示例性方面，胰高血糖素类似物展现至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GIP效价百分比。在一些方面，胰高血糖素类似物还展现至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GLP-1效价百分比。因此，尽管胰高血糖素类似物可视为GIP激动剂肽，但在一些方面，胰高血糖素类似物另外可视为GIP-GLP-1共激动剂。例如，肽可展现针对人GIP受体和人GLP-1受体的激动剂活性，其中该肽展现针对GIP受体的EC50为其针对GLP-1受体的EC50的100倍以内(例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍或更小)。

[式A]，

在示例性方面，位置1的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO：1)L-组氨酸(His)的天然残基，或为His的衍生物(His衍生物)，例如，α原子经修饰的His衍生物。如本文所用的术语“His衍生物”是指包含连接至至少一个碳原子的咪唑(例如，包含式A的结构)或经取代的咪唑的化学部分。在示例性实施方案中，His衍生物包含类似于组氨酸结构的结构，除了α胺、α碳或α羧酸酯被另一化学部分置换。在示例性实施方案中，His衍生物为α取代组氨酸，其中连接至α碳的氢原子被另一化学部分例如甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、甲氧基、乙氧基等取代。在一些方面，His衍生物为D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。

在一些方面，胰高血糖素类似物包含位置2的DPP-IV保护性氨基酸。在示例性方面，DPP-IV保护性氨基酸为D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或α，氨基异丁酸(AIB)之一。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser、或其保守氨基酸取代、或α,α-双取代氨基酸。在一些方面，α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，其各自键合至α碳，其中R1和R2各自独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1和R2与其所连接的α碳一起形成环。在一些方面，α,α-双取代氨基酸为AIB。在示例性方面，当DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser时，GIP激动剂肽未缀合至异源部分，例如，亲水性部分(例如，PEG)。在本公开的其他方面，DPP-IV保护性氨基酸不是D-丝氨酸。

在示例性方面，胰高血糖素类似物在位置16-21的一个或多个位置包含α螺旋稳定化氨基酸。在示例性方面，胰高血糖素类似物在位置16包含α螺旋稳定化氨基酸，任选地，带负电荷氨基酸(例如Glu)或α,α双取代氨基酸。在示例性方面，α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，其各自键合至α碳，其中R1和R2各自独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1和R2与其所连接的α碳一起形成环。在示例性方面，α,α-双取代氨基酸为AIB。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置17的Arg和位置18的小脂肪族氨基酸，任选地为Ala。在示例性方面，胰高血糖素类似物与SEQ ID NO：1相比在位置20未经修饰且位置20的氨基酸为Gln。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含位置16的Glu、位置17的Arg、位置18的Ala、位置19的Ala和位置20的Gln。

在前述的示例性方面，胰高血糖素类似物在位置9、10、12、16、20中的任一位置包含酰化或烷基化氨基酸。在示例性方面，胰高血糖素类似物在位置9、10、12、13、14、16、17和20中的任何一个或多个位置包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸。在示例性方面，胰高血糖素类似物在位置10包含酰化或烷基化氨基酸。在一些方面，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1至21个氨基酸的延伸且在位置37-43中的任何位置(例如，37、38、39、40、41、42、43)包含酰化或烷基化氨基酸。在一些方面，包含非天然酰基或烷基的氨基酸处于位置40。

在前述的示例性方面，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1至21个氨基酸的延伸，且在一些方面，所述延伸形成本领域中称为Trp笼的结构。在一些方面，所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：5)或GGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：6)或GPSSGRPPPS(SEQ ID NO：68)或具有1、2或3个保守氨基酸取代的前述序列之一的序列。在示例性方面，当胰高血糖素类似物包含1至21个氨基酸的延伸时，胰高血糖素类似物包含位置29的Gly。

在示例性方面，酰化氨基酸或烷基化氨基酸包含式I的结构(任选地Lys)、式II的结构(任选地Cys)或式III的结构(任选地Ser)。任选地，在一些方面，酰化氨基酸或烷基化氨基酸包含式I的结构，例如Lys。

在一些方面，酰化氨基酸或烷基化氨基酸经由间隔基连接至酰基或烷基。在一些方面，间隔基长度为3至10个原子。在一些方面，间隔基为氨基酸或二肽，且在一些方面，间隔基包含一个或两个酸性氨基酸残基，例如Glu。在一些方面，酰基或烷基经由间隔基连接至氨基酸，其中间隔基与酰基的总长度为长度约14至约28个原子。在一些方面，间隔基包含一个或两个γ-Glu。

关于酰化氨基酸，酰基在一些方面为C12至C18(例如，C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18)脂肪酰基。在一些方面，酰基为C14或C16脂肪酰基。

在前述实施方案的示例性方面，胰高血糖素类似物在位置15、位置21或位置28、或在位置15与21、在位置15与28、或在位置21与28、或在位置15、21和28包含Glu。

在本公开的一些方面，胰高血糖素类似物在C末端至位置27氨基酸之间包含至少一个带电荷氨基酸。例如，在一些方面，胰高血糖素类似物在位置28包含带电荷氨基酸(例如，带负电荷氨基酸)。带负电荷氨基酸在一些方面为Asp或Glu。带负电荷氨基酸在一些方面为Glu。在替代方面，位置28的氨基酸为带正电荷氨基酸，例如，带正电荷氨基酸为式I氨基酸，例如Lys。

在替代或额外方面，胰高血糖素类似物在位置27、在位置29、或在位置27与29两者处包含氨基酸修饰。例如，位置27的氨基酸在一些方面为Leu、Nle、Val或Lys和/或位置29的氨基酸在一些方面为Gly或Thr。

在一些方面，位置28的氨基酸为Asp且任选地，位置29的氨基酸为除Gly以外的氨基酸，例如，Val、Ala或AIB。

相对于SEQ ID NO：1，本文所述的胰高血糖素类似物可包含额外氨基酸修饰，例如，多至10个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)额外氨基酸修饰，如本文进一步讨论。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含以下一种或多种：

i.位置7的Ile；

ii.位置12的Ile或Arg；

iii.位置18的脂肪族氨基酸，任选地为Ala；

iv.位置21的酸性氨基酸，任选地为Glu；

v.位置24的Asn、Ala或AIB；

vi.位置27的脂肪族氨基酸，任选地为Ala或Leu或Nle；

vii.位置28的酸性氨基酸，任选地为Glu，或脂肪族氨基酸，任选地为Ala；

viii.位置29的脂肪族氨基酸，任选地为Ala；

ix.C末端酰胺化。

根据前述，胰高血糖素类似物在示例性方面包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO：19、21-26、28、287、289-294、296、520、522-527和529中的任一种或SEQ ID NO：30、31、32、33、35、37、38、41、298、299、300、301、303、305、306、309、531、532、533、534、536、538、539和542中的任一种的氨基酸序列。

本发明提供一种包含序列SEQ ID NO：66的肽，

其中：

X₂为AIB；

X₃为Gln或包含结构I、II或III的侧链结构的氨基酸；

X₁₀为Tyr或共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅为酸性氨基酸，任选地为Glu或Asp；

X₁₇为Arg、His、Gln；

X₁₈为Arg或Ala；

X₁₉为Ala或α,α双取代氨基酸(例如AIB)；

X₂₀ 选自：α,α-双取代氨基酸(例如AIB)或Gln或His、Lys或Ala；

X₂₁为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；

X₂₇为Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；

X₂₉为脂肪族的，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀为小脂肪族氨基酸，例如，Ala或Gly；

X₃₅为Ala或碱性氨基酸(任选地，Arg或Lys)；

其中，当X₂₈为酸性氨基酸时，X₃₅为碱性氨基酸；

任选地，其中，当X₂₈为Asp时，则X₂₉不是Gly；

其中，当X₁₀为Tyr时，肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，其中，任选地，肽在位置41包含Gly，且

其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。

在SEQ ID NO：66的肽的示例性方面，X₁₀为共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸。在示例性方面，X₂₈为Glu且任选地，X₁₅为Glu和/或X₂₁为Glu。在示例性方面，在位置15、21和28中的每一位置。在示例性方面，X₁₈为Ala且X₁₉为Ala且任选地，X₂₀为α,α-双取代氨基酸，例如AIB。在示例性方面，X₁₆为Glu、Ala、AIB、His或Lys；X₁₇为Arg、His或Gln，且X₂₁为Glu。在替代示例性方面，X₂₀为Lys或His且任选地X₁₆为Glu，X₁₇为Arg，且X₂₁为Asp。在替代方面，X₁₈为Ala且X₁₉为α,α-双取代氨基酸(例如AIB)且任选地，X₁₆为Glu，X₁₇为Arg，且X₂₁为Glu。此外，在示例性方面，X₂₀为Ala或Lys。在SEQ ID NO：66的肽的示例性方面，X₂₉为Ala、Gly、Val或α,α-双取代氨基酸，任选地为AIB。

在SEQ ID NO：66的肽的示例性方面，X₁₀为Tyr且共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸位于位置40。在示例性方面，肽在位置41包含Gly。在示例性方面，X₉或X₁₅为Glu。

在SEQ ID NO：66的肽的示例性方面，酰基或烷基连接至包含式I、式II或式III的结构的氨基酸。在示例性方面，式I氨基酸为Lys。此外，在示例性方面，酰基或烷基经由间隔基连接至肽的氨基酸，任选地间隔基为二肽的氨基酸。在示例性方面，间隔基为一个或两个酸性氨基酸残基。

在SEQ ID NO：66的肽的示例性方面，X₃为Gln或乙酰基二氨基丁酸或乙酰基Lys或乙酰基鸟氨酸或甲基亚砜。在示例性方面，肽包含位置27的Leu、位置29的Gly、和C末端至位置29的Gly的GPSSGAPPPS。

在示例性方面，肽包含SEQ ID NO：15-28、34、36、39、42、43、44、52、53、63-65、283-296、302、304、307、310、311、312、320、321、330-332、516-529、535、537、540、543、544、545、553、554和563-565中的任一种的序列。

本发明另外提供一种包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：66的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66的肽，其中该肽展现针对人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。所述氨基酸修饰可以是任何本文所述的氨基酸修饰。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：66的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66的肽的示例性方面，当X₂₈为Asp时，X₂₉不是Gly。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：66的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66的肽的其他示例性方面，X₁为包含侧链咪唑的氨基酸，X₂为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，肽的C末端氨基酸被酰胺化，且当X₁₀为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。

本发明还提供一种包含以下序列的肽：

(a)序列

其中：

X₁为包含侧链咪唑的氨基酸，任选地为His或His衍生物；

X₁₀为共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅为酸性氨基酸，任选地为Glu或Asp；

X₁₇为Arg、His、Gln；

X₁₈为Arg或Ala；

X₁₉为Ala或α,α双取代氨基酸；

X₂₀选自：α,α-双取代氨基酸(例如AIB)或Gln或His、Lys或Ala；

X₂₁为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；

X₂₇为Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；

X₂₉为脂肪族，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀为小脂肪族氨基酸，例如，Ala或Gly；

X₃₅为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；

其中，当X₂₈为酸性氨基酸时，X₃₅为碱性氨基酸；

任选地，其中，当X₂₈为Asp时，则X₂₉不是Gly；

其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。

在包含SEQ ID NO：67的肽的示例性方面，该肽包含：X₁为His；X₂为AIB；X₁₆为Glu；X₁₇为Arg；X₁₈为Ala；X₁₉为Ala；X₂₀为Gln；X₂₇为Leu；X₂₉为Gly；X₃₀为Gly；X₃₅为Ala；或其组合。在示例性方面，肽包含以下序列：SEQ ID NO：29-42、297-310和530-543。

本发明另外提供一种包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：67的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67的肽，其中该肽展现针对人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。所述氨基酸修饰可以是任何本文所述的氨基酸修饰。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：67的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67的肽的示例性方面，位置3的氨基酸选自：Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基Lys。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：67的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67的肽的示例性方面，当X₂₈为Asp时，X₂₉不是Gly。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：67的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67的肽的其他示例性方面，X₁为包含侧链咪唑的氨基酸，X₂为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，肽的C末端氨基酸被酰胺化，且当X₁₀为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。在包含具有多至3个相对于SEQ ID NO：67的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67的肽的示例性方面，(i) X₁为His；(ii) X₂为AIB；(iii) X₁₆为Glu；(iv) X₁₇为Arg；(v) X₁₈为Ala；(vi) X₁₉为Ala；(vii) X₂₀为Gln；(viii) X₂₇为Leu；(ix) X₂₉为Gly；(x) X₃₀为Gly；(xi) X₃₅为Ala；或(xii)其组合。

本发明进一步提供包含序列SEQ ID NO：18的肽。在示例性方面，该肽基本上由SEQ ID NO：18组成或由SEQ ID NO：18组成。

本发明还提供包含序列SEQ ID NO：43的肽。在示例性方面，该肽基本上由SEQ ID NO：43组成或由SEQ ID NQ：43组成。

本文还提供包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：18的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：18或具有多至3个(例如，1个、2个、3个)相对于SEQ ID NO：43的氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：43的肽，其中该肽展现针对人GIP受体和人GLP-1受体的激动剂活性。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：43的肽的示例性方面，当位置28的氨基酸为Asp时，位置29的氨基酸不是Gly。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：43的肽的其他示例性方面，位置1的氨基酸为包含侧链咪唑的氨基酸，位置2的氨基酸为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，肽的C末端氨基酸被酰胺化，且当位置10的氨基酸为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：18或具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQ ID NO：43的肽的示例性方面，(i)位置1的氨基酸为His；(ii)位置2的氨基酸为AIB；(iii)位置16的氨基酸为Glu；(iv)位置17的氨基酸为Arg；(v)位置18的氨基酸为Ala；(vi)位置19的氨基酸为Ala；(vii)位置20的氨基酸为Gln；(viii)位置27的氨基酸为Leu；(ix)位置29的氨基酸为Gly；(x)位置20的氨基酸为Gly；(xi)位置35的氨基酸为Ala；或(xii)其组合。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：18或具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQ ID NO：43的肽的示例性方面，位置3的氨基酸选自：Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基Lys。

本发明还提供一种包含SEQ ID NO：100-282、SEQ ID NO：333-515中的任一种的序列的肽。还提供包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQ ID NO：100-282、SEQ ID NO：333-515中的任一种的序列的肽，其中该肽展现针对人GIP受体和人GLP-1受体的激动剂活性。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQ ID NO：100-282和SEQ ID NO：333-515中的任一种的序列的肽的示例性方面，当位置28的氨基酸为Asp时，位置29的氨基酸不是Gly。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQ ID NO：100-282和SEQ ID NO：333-515中的任一种的序列的肽的其他示例性方面，位置1的氨基酸为包含侧链咪唑的氨基酸，位置2的氨基酸为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，该肽的C末端氨基酸被酰胺化，且当位置10的氨基酸为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQ ID NO：100-282和SEQ ID NO：333-515中的任一种的序列的肽的示例性方面，(i)位置1的氨基酸为His；(ii)位置2的氨基酸为AIB；(iii)位置16的氨基酸为Glu；(iv)位置17的氨基酸为Arg；(v)位置18的氨基酸为Ala；(vi)位置19的氨基酸为Ala；(vii)位置20的氨基酸为Gln；(viii)位置27的氨基酸为Leu；(ix)位置29的氨基酸为Gly；(x)位置20的氨基酸为Gly；(xi)位置35的氨基酸为Ala；或(xii)其组合。在包含具有多至3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQ ID NO：100-282和SEQ ID NO：333-515中的任一种的序列的肽的示例性方面，位置3的氨基酸选自：Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基Lys。

在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含基于包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列但在一个或多个位置与该亲本序列不同的结构。

在一些或任何实施方案中，本公开的肽为包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列的类似物，其包含基于亲本序列的氨基酸序列但不同于该亲本序列的氨基酸序列，因为该类似物的氨基酸序列包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个，和在一些情况下16个或更多个(例如，17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个等))指定或任选的氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，相对于包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列，本公开的肽包含总共1个、多至2个、多至3个、多至4个、多至5个、多至6个、多至7个、多至8个、多至9个或多至10个额外氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，所述修饰为本文关于胰高血糖素类似物所述的任何修饰，例如，酰化、烷基化、聚乙二醇化、C末端截短、在位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28和29中的一个或多个位置进行氨基酸取代。例如，肽为SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列的类似物，其包含相对于该亲本序列具有多至4个、多至5个、多至6个、多至7个、多至8个、多至9个或多至10个额外氨基酸修饰的亲本序列的氨基酸序列。在类似物的示例性实施方案中，当位置28的氨基酸为Asp时，位置29的氨基酸不是Gly。在类似物的其他示例性方面，位置1的氨基酸为包含侧链咪唑的氨基酸，位置2的氨基酸为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，该肽的C末端氨基酸被酰胺化，且当位置10的氨基酸为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。在类似物的示例性方面，(i)位置1的氨基酸为His；(ii)位置2的氨基酸为AIB；(iii)位置16的氨基酸为Glu；(iv)位置17的氨基酸为Arg；(v)位置18的氨基酸为Ala；(vi)位置19的氨基酸为Ala；(vii)位置20的氨基酸为Gln；(viii)位置27的氨基酸为Leu；(ix)位置29的氨基酸为Gly；(x)位置20的氨基酸为Gly；(xi)位置35的氨基酸为Ala；或(xii)其组合。在类似物的示例性方面，位置3的氨基酸选自：Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基Lys。

在一些或任何实施方案中，修饰为氨基酸取代或置换，例如，保守氨基酸取代。在一些方面，保守取代为位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中的一个或多个位置的氨基酸置换。在替代实施方案中，氨基酸取代不是保守氨基酸取代，例如，为非保守氨基酸取代。

在包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列的类似物(其包含基于该亲本序列的氨基酸序列但不同于该亲本序列的氨基酸序列)的示例性方面，当X₂₈为Asp时，X₂₉不是Gly。在此类类似物的其他示例性方面，X₁为包含侧链咪唑的氨基酸，X₂为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，肽的C末端氨基酸被酰胺化，且当X₁₀为Tyr时，该肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，该肽在位置41包含Gly。在包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列的类似物(其包含基于该亲本序列的氨基酸序列但不同于该亲本序列的氨基酸序列)的示例性方面，(i) X₁为His；(ii) X₂为AIB；(iii) X₁₆为Glu；(iv) X₁₇为Arg；(v) X₁₈为Ala；(vi) X₁₉为Ala；(vii) X₂₀为Gln；(viii) X₂₇为Leu；(ix) X₂₉为Gly；(x) X₃₀为Gly；(xi) X₃₅为Ala；或(xii)其组合。在包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列的类似物(其包含基于该亲本序列的氨基酸序列但不同于该亲本序列的氨基酸序列)的示例性方面，在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列的氨基酸序列具有至少25%序列同一性的氨基酸序列，该亲本序列包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种。在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或大于90%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上文提及的%序列同一性的本公开的肽的氨基酸序列为本公开的肽的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上文提及的%序列同一性的本公开的肽的氨基酸序列仅为本公开的肽的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列的至少5个连续氨基酸(例如，至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸)的参考氨基酸序列具有约A%或更大序列同一性的氨基酸序列，其中该参考氨基酸序列开始于SEQ ID NO：1位置C的氨基酸且结束于SEQ ID NO：1位置D的氨基酸，其中A为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28；且D为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。预期前述参数的任何和所有可能的组合，包括但不限于例如其中A为90%且C与D为1与27、或6与27、或8与27、或10与27、或12与27、或16与27。

本文所述的包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列的类似物可包含任何数目的氨基酸的肽骨架，即可以是任何肽长度。在一些实施方案中，本文所述的肽与SEQ ID NO：1具有相同长度，即长度为29个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽的长度长于29个氨基酸，例如，本公开的肽包含1-21个氨基酸的C末端延伸，如本文进一步描述。因此，在一些实施方案中，本公开的肽的长度为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽的长度为多至50个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽的长度由于与另一肽融合而长于29个氨基酸(例如，长度大于50个氨基酸(例如，至少或约60个、至少或约70个、至少或约80个、至少或约90个、至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、至少或约400个、至少或约450个、至少或约500个氨基酸))。在其他实施方案中，本公开的肽的长度少于29个氨基酸，例如，28、27、26、25、24、23个氨基酸。

根据上述，在一些方面，本公开的肽为包含SEQ ID NO：15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554和563-565中的任一种的亲本序列的类似物，该类似物的序列包含一个或多个氨基酸修饰，其影响GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性；增强稳定性，例如通过减少肽的降解(例如，通过改善DPP-IV蛋白酶抗性)；增强溶解性；增加半衰期；延迟作用起始；延长针对GIP、胰高血糖素或GLP-1受体的作用的持续时间；或任何前述作用的组合。本文关于胰高血糖素类似物进一步描述除其他修饰以外的此类氨基酸修饰，且任何这些修饰可个别或组合应用。

制备肽的方法

可通过本领域中已知的方法获得本公开的胰高血糖素类似物。重新合成肽的合适方法描述于例如Chan等人，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood等人, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000；和美国专利号5,449,752中。制备本公开肽的其他示例性方法描述于实施例1中。

在一些实施方案中，本文所述的肽可由公司诸如Synpep (Dublin, CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD)和Multiple Peptide Systems (San Diego, CA)商业合成。在这方面，所述肽可以是合成、重组、分离和/或纯化的。

此外，在本公开的类似物不包含任何非编码或非天然氨基酸的情况下，可使用标准重组方法使用编码类似物的氨基酸序列的核酸重组产生胰高血糖素类似物。参见例如Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第3版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001；和Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates和John Wiley & Sons, NY, 1994。

在一些实施方案中，本公开的胰高血糖素类似物是分离的。如本文所用的术语“分离的”意指已从其天然环境移除。在示例性实施方案中，类似物经由重组方法制备且类似物从宿主细胞分离。

在一些实施方案中，本公开的胰高血糖素类似物是纯化的。如本文所用的术语“纯化的”是指分子或化合物以实质上不含污染物(其在一些方面通常与分子或化合物在天然或自然环境中结合)的形式分离且意指已由于与原始组合物的其他组分分离而导致纯度增加。经纯化的肽或化合物包括例如实质上不含核酸分子、脂质和碳水化合物、或其他起始物质或在肽的化学合成期间使用或形成的中间体的肽。公认“纯度”为相对术语，且不必理解为绝对纯度或绝对富集或绝对选择。在一些方面，纯度为至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、或至少或约90%(例如，至少或约91%、至少或约92%、至少或约93%、至少或约94%、至少或约95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%、至少或约99%或约100%)。

缀合物

本发明进一步提供包含一个或多个本文所述的胰高血糖素类似物缀合至异源部分的缀合物。如本文所用的术语“异源部分”与术语”缀合物部分”同义，且是指与本文所述的胰高血糖素类似物不同的任何分子(化学或生物化学、天然存在或非编码的)。可连接至本文所述的任何类似物的示例性缀合物部分包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向剂、免疫球蛋白或其部分(例如，可变区、CDR或Fc区)、诊断标记(诸如放射性同位素、荧光团或酶标记)、聚合物(包括水溶性聚合物)，或其他治疗或诊断剂。在一些实施方案中，提供包含本发明的类似物和血浆蛋白的缀合物，其中该血浆蛋白选自白蛋白、转铁蛋白、血纤蛋白原和球蛋白。在一些实施方案中，缀合物的血浆蛋白部分为白蛋白或转铁蛋白。在一些实施方案中，缀合物包含一个或多个本文所述的胰高血糖素类似物和以下中的一种或多种：肽(其不同于本文所述的胰高血糖素和/或GLP-1受体活性胰高血糖素类似物)、多肽、核酸分子、抗体或其片段、聚合物、量子点、小分子、毒素、诊断剂、碳水化合物、氨基酸。

在一些实施方案中，异源部分为不同于本文所述的胰高血糖素类似物的肽且缀合物为融合肽或嵌合肽。在一些实施方案中，异源部分为1-21个氨基酸的肽延伸。在特定实施方案中，所述延伸连接至胰高血糖素类似物的C末端，例如，连接至位置29的氨基酸。

在一些特定方面，所述延伸为单一氨基酸或二肽。在特定实施方案中，所述延伸包含选自以下的氨基酸：带电荷氨基酸(例如，带负电荷氨基酸(例如Glu)、带正电荷氨基酸)、包含亲水性部分的氨基酸。在一些方面，所述延伸为Gly、Glu、Cys、Gly-Gly、Gly-Glu。

在一些实施方案中，所述延伸包含SEQ ID NO：5(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：6(GGPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：7(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：8(KRNR)的氨基酸序列。在特定方面，氨基酸序列经由胰高血糖素类似物的C末端氨基酸(例如，位置29的氨基酸)连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO：5-8任一种的氨基酸序列经由肽键结合至胰高血糖素类似物的氨基酸29。在一些特定实施方案中，胰高血糖素类似物的位置29的氨基酸为Gly且该Gly融合至SEQ ID NO：5-8中的任一种的氨基酸序列之一。

在一些实施方案中，异源部分为聚合物。在一些实施方案中，聚合物选自：聚酰胺；聚碳酸酯；聚亚烷基类(polyalkylenes)和其衍生物，包括聚亚烷基二醇、聚环氧烷烃、聚对苯二甲酸亚烷基酯；丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)；聚乙烯基聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮；聚乙交酯；聚硅氧烷；聚氨酯和其共聚物；纤维素，包括烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟基丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐；聚丙烯；聚乙烯，包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸亚乙酯)；和聚苯乙烯。

在一些方面，聚合物为生物可降解聚合物，包括合成生物可降解聚合物(例如，乳酸与乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(原)酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯))，和天然生物可降解聚合物(例如，海藻酸盐和其他多糖(包括葡聚糖和纤维素)、胶原蛋白、其化学衍生物(取代，添加化学基团例如烷基、亚烷基，羟基化，氧化和本领域技术人员通常进行的其他修饰)、白蛋白和其他亲水性蛋白(例如，玉米醇溶蛋白(zein)和其他醇溶谷蛋白(prolamine)和疏水性蛋白))，以及其任何共聚物或混合物。通常，这些材料在体内通过酶促水解或暴露于水、通过表面或本体侵蚀(bulk erosion)而降解。

在一些方面，聚合物为生物粘附聚合物，诸如生物可侵蚀性水凝胶(由H. S. Sawhney, C. P. Pathak和J. A. Hubbell描述于Macromolecules, 1993, 26, 581-587，其教导并入本文中)、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白(glutin)、聚酸酐、聚丙烯酸、海藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)。

在一些实施方案中，聚合物为水溶性聚合物或亲水性聚合物。本文在“亲水性部分”下进一步描述亲水性聚合物。合适水溶性聚合物在本领域中已知且包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟烷基纤维素、各种纤维素醚、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/丁烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸羟基烷酯、甲基丙烯酸羟基甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和聚丙烯酸钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亚甲基、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯醚-共-马来酸酐、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧基乙二醇、聚环氧乙烷，和其衍生物、盐和组合。

在特定实施方案中，聚合物为聚亚烷基二醇，包括例如聚乙二醇(PEG)。

在一些实施方案中，异源部分为碳水化合物。在一些实施方案中，碳水化合物为单糖(例如，葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如，棉子糖、水苏糖)或多糖(淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、壳多糖、愈创葡聚糖(callose)、昆布多糖(laminarin)、木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖(fucoidan)或半乳甘露聚糖)。

在一些实施方案中，异源部分为脂质。在一些实施方案中，脂质为脂肪酸、类二十烷酸(eicosanoid)、前列腺素、白三烯、血栓素、N-酰基乙醇胺、甘油脂质(例如，单取代甘油、双取代甘油、三取代甘油)、甘油磷脂(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(例如，鞘氨醇、神经酰胺)、固醇脂质(例如，类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂质(prenol lipid)、糖脂质、或聚酮化合物(polyketide)、油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、单酸甘油酯、二酸甘油酯、甘油三酯、磷脂。

在一些实施方案中，异源部分经由非共价或共价键合连接至本公开的类似物。在示例性方面，异源部分经由接头连接至本公开的类似物。可通过共价化学键、物理力(诸如静电相互作用、氢键相互作用、离子相互作用、范德华相互作用、或疏水性或亲水性相互作用)来实现连接。可使用多种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子伴侣；或彼此具有亲和力的任何结合伴侣或其片段。

在一些实施方案中，通过使类似物的目标氨基酸残基与能够与这些目标氨基酸的所选侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应而经由直接共价键将胰高血糖素类似物连接至缀合物部分。类似物或缀合物部分上的反应性基团包括例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤乙酰基、马来酰亚氨基或肼基。衍生剂包括例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(经由半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(经由赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域中已知的其他试剂。或者，缀合物部分可经由中间载体诸如多糖或多肽载体间接连接至类似物。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物，和这些氨基酸与其他氨基酸(例如丝氨酸)的混合聚合物，以赋予所得负载载体所需溶解性质。

最通常使半胱氨酰基残基与α-卤代乙酸酯(和相应胺)(诸如氯乙酸、氯乙酰胺)反应以得到羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基残基还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应而衍生化。

组氨酰基残基通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应而衍生化，因为该试剂对组氨酰基侧链是相对特异性的。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；反应优选在pH 6.0的0.1M二甲胂酸钠中进行。

赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些试剂进行衍生化具有逆转赖氨酰基残基的电荷的作用。用于衍生化含α-氨基的残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯(诸如吡啶甲酰亚氨酸甲酯)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2,4-戊二酮，和与乙醛酸酯的转氨酶催化反应。

精氨酰基残基通过与一种或几种常规试剂(其中有苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮)反应而进行修饰。因为胍官能团具有高pKa，所以精氨酸残基的衍生化需要反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。

可进行酪氨酰基残基的特定修饰，其中尤其关注通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应而将光谱标记引入酪氨酰基残基中。最通常，分别使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。

羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳化二亚胺(R-N=C=N-R')反应而选择性地修饰，其中R和R'为不同烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓(azonia)-4,4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应而转化成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。

其他修饰包括：脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))；天冬酰胺或谷氨酰胺的去酰胺化；N末端胺的乙酰化；和/或C末端羧酸基团的酰胺化或酯化。

另一类型的共价修饰涉及使糖苷化学或酶促偶联至类似物。糖可连接至：(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的游离巯基；(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的游离羟基；(e)芳族残基，诸如酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO87/05330；和Aplin和Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)。

在一些实施方案中，胰高血糖素类似物经由胰高血糖素类似物的氨基酸侧链与异源部分之间的共价键缀合至异源部分。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物经由位置16、17、21、24或29的氨基酸的侧链、C末端延伸内的位置、或C末端氨基酸、或这些位置的组合缀合至异源部分。在一些方面，共价连接至异源部分的氨基酸(例如，包含异源部分的氨基酸)为Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，且氨基酸的侧链共价键合至异源部分。

在一些实施方案中，缀合物包含将胰高血糖素类似物接合至异源部分的接头。在一些方面，接头包含长度为1至约60个原子、或1至30个原子或更长、2至5个原子、2至10个原子、5至10个原子、或10至20个原子的链。在一些实施方案中，链原子均为碳原子。在一些实施方案中，接头的骨架中的链原子选自C、O、N和S。可根据预期溶解性(亲水性)选择链原子和接头以提供更可溶的缀合物。在一些实施方案中，接头提供由于酶或其他催化剂或目标组织或器官或细胞中存在的水解条件而进行裂解的官能团。在一些实施方案中，接头的长度足够长以降低位阻的可能。如果接头为共价键或肽键且缀合物为多肽，则整个缀合物可以是融合蛋白。此类肽基接头可以是任何长度。示例性接头长度为约1至50个氨基酸，长度为5至50、3至5、5至10、5至15或10至30个氨基酸。或者可通过本领域普通技术人员已知的重组基因工程改造方法制备此类融合蛋白。

缀合物： Fc 融合体

如上文所述，在一些实施方案中，类似物缀合(例如融合)至免疫球蛋白或其部分(例如，可变区、CDR或Fc区)。已知类型的免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区为Ig重链的C末端区，其负责与实施活动诸如再循环(其导致半衰期延长)、抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的Fc受体结合。

例如，根据一些定义，人IgG重链Fc区从Cys226伸展至重链的C末端。人IgG1的“铰链区”通常从Glu216延伸至Pro230(通过比对半胱氨酸键合中所涉及的半胱氨酸可将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对)。IgG的Fc区包括两个恒定结构域CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸至氨基酸447。提及免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号均基于Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md。在一个相关实施方案中，Fc区可包含一个或多个来自免疫球蛋白重链的天然或修饰恒定区(除CH1以外)，例如，IgG和IgA的CH2和CH3区，或IgE的CH3和CH4区。

合适的缀合物部分包括包含FcRn结合位点的免疫球蛋白序列的部分。FcRn(拯救受体)负责使免疫球蛋白再循环且使其回至血液中循环。已基于X射线结晶学(Burmeister等人，1994, Nature 372：379)描述与FcRn受体结合的IgG的Fc部分的区域。Fc与FcRn的主要接触面接近CH2与CH3结构域的接合处。Fc-FcRn接触均在单一Ig重链内。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314，和CH3结构域结构的氨基酸残基385-387、428和433-436。

一些缀合物部分可能包括或可能不包括FcγR结合位点。FcγR负责ADCC和CDC。与FcγR直接接触的Fc区内位置的实例为氨基酸234-239(下端铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C'/E环)和氨基酸327-332(F/G)环(Sondermann等人，Nature 406：267-273, 2000)。IgE的下端铰链区也已涉及FcRI结合(Henry等人，Biochemistry 36, 15568-15578, 1997)。涉及IgA受体结合的残基描述于Lewis等人(J Immunol.175：6694-701, 2005)中。涉及IgE受体结合的氨基酸残基描述于Sayers等人(J Biol Chem.279(34)：35320-5, 2004)中。

可对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。此类可变Fc区包含在Fc区的CH3结构域(残基342-447)中的至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2结构域(残基231-341)中的至少一个氨基酸修饰。据信赋予FcRn增加的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人，2001, J. Biol. Chem. 276： 6591)。其他突变可减少Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合而不显著降低对FcRn的亲和力。例如，Fc区的位置297的Asn被Ala或另一氨基酸取代去除高保守的N-糖基化位点且可导致免疫原性降低同时伴随着Fc区的半衰期延长，以及与FcγR的结合减少(Routledge等人，1995, Transplantation 60：847；Friend等人，1999,Transplantation 68：1632；Shields等人，1995, J. Biol. Chem. 276：6591)。已进行IgG1的位置233-236的氨基酸修饰，其减少与FcγR的结合(Ward和Ghetie, 1995, Therapeutic Immunology 2：77和Armour等人，1999, Eur. J. Immunol. 29：2613)。一些示例性氨基酸取代描述于美国专利7,355,008和7,381,408中，其各自以其整体通过引用并入本文中。

缀合物：亲水性部分

本文所述的胰高血糖素类似物可进一步修饰以改善其在水溶液中在生理pH下的溶解性和稳定性，同时保持相对于天然胰高血糖素的高生物活性。可在用于使蛋白与活化聚合物分子反应的任何合适条件下将亲水性部分诸如PEG基团连接至类似物。可使用本领域中已知的任何方式，包括经由酰化、还原性烷基化、迈克尔加成(Michael addition)、巯基烷基化或其他化学选择性缀合/连接方法经由PEG部分上的反应性基团(例如，醛、氨基、酯、巯基、α-卤乙酰基、马来酰亚氨基或肼基)至目标化合物上的反应性基团(例如，醛、氨基、酯、巯基、α-卤乙酰基、马来酰亚氨基或肼基)。可用于将水溶性聚合物连接至一种或多种蛋白的活化基团包括但不限于砜、马来酰亚胺、巯基(sulfhydryl)、硫醇(thiol)、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、氮丙啶、环氧乙烷、5-吡啶基和α-卤化酰基(例如，α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。如果通过还原性烷基化连接至类似物，则所选聚合物应具有单一反应性醛以便控制聚合度。参见例如Kinstler等人，Adv.　Drug.　Delivery　Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts等人, Adv.　Drug　Delivery　Rev. 54: 459-476 (2002);和Zalipsky等人, Adv.　Drug　Delivery　Rev.　16: 157-182 (1995)。

在特定方面，具有巯基的类似物的氨基酸残基被亲水性部分诸如PEG修饰。在一些实施方案中，巯基在迈克尔加成反应中被马来酰亚胺活化的PEG修饰以导致产生包含下文所示的硫醚键的聚乙二醇化类似物：

。

在一些实施方案中，巯基在亲核取代反应中被卤乙酰基活化的PEG修饰以导致产生包含硫醚键的聚乙二醇化类似物。

合适的亲水性部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(例如POG)、聚氧乙基化山梨糖醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)、聚环氧烷、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、单-(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或单-(C1-C10)芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)和其他聚环氧烷、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、结肠酸(colonic acid)或其他多糖聚合物、Ficoll或葡聚糖和其混合物。葡聚糖为主要由α1-6键连接的葡萄糖亚单元的多糖聚合物。葡聚糖可以多种分子量范围获得，例如，约1kD至约100kD，或约5、10、15或20kD至约20、30、40、50、60、70、80或90kD。涵盖线性或支化聚合物。所得缀合物制剂基本上可以是单分散或多分散的，且每个类似物可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。

在一些或任何实施方案中，胰高血糖素类似物经由胰高血糖素类似物的氨基酸侧链与亲水性部分之间的共价连接缀合至该亲水性部分。在一些或任何实施方案中，胰高血糖素类似物经由位置16、17、21、24或29的氨基酸侧链、C末端延伸内的位置、或C末端氨基酸、或这些位置的组合缀合至亲水性部分。在一些方面，共价连接至亲水性部分(例如，包含亲水性部分的氨基酸)的氨基酸为Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，且氨基酸的侧链共价键合至亲水性部分(例如，PEG)。

缀合物： rPEG

在一些或任何实施方案中，本公开的缀合物包含与辅助类似物融合的具有GIP受体激动剂活性的胰高血糖素类似物，其能够形成与化学PEG类似的延伸构型(例如，重组PEG(rPEG)分子)，诸如国际专利申请公开号WO2009/023270和美国专利申请公开号US20080286808中所述的那些。在一些方面，rPEG分子为包含甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的一种或多种的多肽。在一些方面，rPEG为均聚物，例如，聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙氨酸或聚脯氨酸。在其他实施方案中，rPEG包含两种类型的重复氨基酸，例如，聚(Gly-Ser)、聚(Gly-Glu)、聚(Gly-Ala)、聚(Gly-Asp)、聚(Gly-Pro)、聚(Ser-Glu)等。在一些方面，rPEG包含三种不同类型的氨基酸，例如，聚(Gly-Ser-Glu)。在特定方面，rPEG增加胰高血糖素和/或GLP-1激动剂类似物的半衰期。在一些方面，rPEG包含净正电荷或净负电荷。在一些方面，rPEG缺乏二级结构。在一些实施方案中，rPEG的长度大于或等于10个氨基酸且在一些实施方案中长度为约40至约50个氨基酸。在一些方面，辅助肽经由肽键或蛋白酶裂解位点与本公开类似物的N末端或C末端融合，或插入本公开类似物的环中。在一些方面，rPEG包含亲和力标签或连接至大于5kDa的PEG。在一些实施方案中，rPEG赋予本公开类似物增加的流体动力学半径、血清半衰期、蛋白酶抗性或溶解性且在一些方面赋予类似物降低的免疫原性。

缀合物：多聚体

本发明进一步提供本文所公开类似物的多聚体或二聚体，包括均-或杂-多聚体或均-或杂-二聚体。两个或更多个类似物可使用本领域技术人员已知的标准连接剂和程序连接在一起。例如，可经由使用双官能巯基交联剂和双官能胺交联剂在两个肽之间形成二聚体，尤其对于已被半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基取代的类似物。二聚体可以是均二聚体或者可选地可以是杂二聚体。在示例性实施方案中，连接两个(或更多个)类似物的接头为PEG，例如，5kDa PEG、20kDa PEG。在一些实施方案中，接头为二硫键。例如，二聚体的各单体可包含Cys残基(例如，末端或内部位置的Cys)且各Cys残基的硫原子参与形成二硫键。在示例性方面，二聚体的各单体经由硫醚键连接。在示例性方面，一个单体的Lys残基的ε胺键合至Cys残基，该Cys残基进而经由化学部分连接至另一单体的Lys残基的ε胺。本文进一步描述制备此类硫醚键合的二聚体的方法。在一些方面，单体经由末端氨基酸(例如，N末端或C末端)，经由内部氨基酸，或经由至少一个单体的末端氨基酸和至少另一单体的内部氨基酸连接。在特定方面，单体并非经由N末端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的单体以各单体的C末端氨基酸连接在一起的“尾-尾”定向连接在一起。

前药

本发明进一步提供本文所述的肽和类似物的前药。如本文所用的术语“前药”被定义为在展现其完全药理学作用之前经历化学修饰的任何化合物。

在示例性实施方案中，前药为基于酰胺的肽前药，与公开于2010年6月24日的国际专利申请公开号WO/2010/071807中所述的那些类似。此类前药意欲延迟作用起始且延长药物的半衰期。延迟作用起始是有利的，因为其允许前药在其活化前的全身性分布。因此，施用前药可消除施用后由峰值活性引起的并发症且增加母体药物的治疗指数。

在示例性方面，前药包含结构：A-B-Q；其中Q为本文所述的肽或类似物；A为氨基酸或羟基酸；B为经由A-B与Q的胺之间的酰胺键连接至Q的N-烷基化氨基酸；其中A、B或与A-B连接的Q的氨基酸为非编码氨基酸，此外其中在生理条件下在PBS中A-B与Q化学裂解的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。如本文所用的术语“羟基酸”是指已经修饰以便用羟基置换α碳氨基的氨基酸。

在一些实施方案中，二肽前药要素具有式I的通用结构：

其中

R₁、R₂、R₄和R₈独立地选自：H、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂ ⁺)NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆ 环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇、(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)和C₁-C₁₂烷基(A)(W₁)C₁-C₁₂烷基，其中W₁为选自N、S和O的杂原子，或R₁和R₂与其所连接的原子一起形成C₃-C₁₂ 环烷基或芳基；或R₄和R₈与其所连接的原子一起形成C₃-C₆ 环烷基；

R₃选自：C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)NH₂ _、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)，或R₄和R₃与其所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；

R₅为NHR₆或OH；

R₆为H、C₁-C₈烷基或R₆和R₂与其所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

R₇选自H和OH。

在其他实施方案中，二肽前药要素具有式I的通用结构：

其中

R₁、R₂、R₄和R₈ 独立地选自：H、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂ ⁺)NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆ 环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇、(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)和C₁-C₁₂烷基(W₁)C₁-C₁₂烷基，其中W₁为选自N、S和O的杂原子，或R₁和R₂与其所连接的原子一起形成C₃-C₁₂ 环烷基；或R₄和R₈与其所连接的原子一起形成C₃-C₆环烷基；

R₅为NHR₆或OH；

R₆为H、C₁-C₈烷基或R₆和R₁与其所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

R₇选自：氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH₂、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤素。

在一些实施方案中，R₈为H和R₅为NHR₆。

在一些实施方案中，二肽前药要素具有式I的结构，其中

R₁和R₈独立地为H或C₁-C₈烷基；

R₂和R₄ 独立地选自：H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂+) NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆ 环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和CH₂(C₃-C₉杂芳基)，或R₁和R₂与其所连接的原子一起形成C₃-C₁₂环烷基或芳基；

R₅为NHR₆；且

R₆为H或C₁-C₈烷基。

在其他实施方案中，二肽前药要素具有式I的结构，其中

R₁和R₈独立地为H或C₁-C₈烷基；

R₂和R₄独立地选自：H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂+) NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆ 环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和CH₂(C₃-C₉杂芳基)，或R₁和R₂与其所连接的原子一起形成C₃-C₁₂环烷基；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₅为NHR₆；

R₆为H或C₁-C₈烷基；且

根据本公开形成的前药的半衰期由二肽前药要素的取代基、其位置和其所连接的氨基酸决定。例如，前药可包含本文所述的肽或类似物，其中该二肽前药要素经由本文所述的肽或类似物的N末端氨基酸的α氨基连接。在该实施方案中，具有例如约1小时的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药要素：

其中

R₁和R₂独立地为C₁-C₁₈烷基或芳基；或R₁和R₂经由-(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自为氢；且

R₅为胺。

在其他实施方案中，具有例如约1小时的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药要素：

其中

R₁和R₂独立地为C₁-C₁₈烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；或R₁和R₂经由-(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自为氢；

R₅为NH₂；且

R₇选自：氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH₂ _、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤素。

此外，具有连接至本文所述肽或类似物的N末端α氨基酸的二肽前药要素且具有例如约6小时至约24小时的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药要素：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基，或R₁和R₂经由(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₃为C₁-C₁₈烷基或R₃和R₄与其所连接的原子一起形成4-12杂环；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₈烷基和芳基；且R₅为胺；

条件是R₁和R₂都不是氢且条件是R₄或R₈之一为氢。

在一些实施方案中，具有连接至本文所述肽或类似物的N末端α氨基酸的二肽前药要素且具有例如约12小时至约72小时或在一些实施方案中约12小时至约48小时的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药要素：

其中R₁和R₂独立地选自：氢、C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₄烷基)NH₂和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，或R₁和R₂经由(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇ ；

R₅为NH₂；且

R₇选自：H、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH₂ _、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤素；

条件是R₁和R₂都不是氢且条件是R₄或R₈中的至少一个为氢。

在一些实施方案中，具有连接至本文所述肽或类似物的N末端氨基酸的二肽前药要素且具有例如约12小时至约72小时或在一些实施方案中约12小时至约48小时的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药要素：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和(C₁-C₄烷基)NH₂，或R₁和R₂经由(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₃为C₁-C₈烷基或R₃和R₄与其所连接的原子一起形成4-6杂环；

R₄选自氢和C₁-C₈烷基；且

R₅为NH₂；条件是R₁和R₂都不是氢。

在其他实施方案中，具有连接至本文所述肽或类似物的N末端氨基酸的二肽前药要素且具有例如约12小时至约72小时或在一些实施方案中约12小时至约48小时的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药要素：

其中

R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和(C₁-C₄烷基)NH₂；

R₃为C₁-C₆烷基；

R₄为氢；且

R₅为NH₂；

条件是R₁和R₂都不是氢。

其中

R₁和R₂独立地选自氢和C₁-C₈烷基、(C₁-C₄烷基)NH₂，或R₁和R₂经由(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₃为C₁-C₈烷基；

R₄为(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅为NH₂；且

R₇选自氢、C₁-C₈烷基和(C₀-C₄烷基)OH；

条件是R₁和R₂都不是氢。

此外提供具有连接至本文所述肽和类似物的N末端α氨基酸的二肽前药要素且具有例如约72小时至约168小时的t_1/2的前药，其中该二肽前药要素具有结构：

其中R₁选自氢、C₁-C₈烷基和芳基；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自为氢；且

R₅为胺或N取代的胺或羟基；

条件是，如果R₁为烷基或芳基，则R₁和R₅与其所连接的原子一起形成4-11杂环。

在一些实施方案中，二肽前药要素具有结构：

其中R₁选自氢、C₁-C₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自为氢；

R₅为NHR₆或OH；

R₆为H、C₁-C₈烷基，或R₆和R₁与其所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

R₇选自：氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH₂、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤素；

条件是，如果R₁为烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，则R₁和R₅与其所连接的原子一起形成4-11杂环。

在一些实施方案中，二肽前药要素连接至本文所述肽或类似物的内部氨基酸的侧链胺。在该实施方案中，具有例如约1小时的t_1/2的前药具有结构：

其中

R₁和R₂独立地为C₁-C₈烷基或芳基；或R₁和R₂经由(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自为氢；且R₅为胺。

在一些实施方案中，具有例如约1小时的t_1/2的前药具有结构：

其中

R₁和R₂独立地为C₁-C₈烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；或R₁和R₂经由-(CH₂)_p-连接，其中p为2-9；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自为氢；

R₅为NH₂；且

此外，具有例如约6小时至约24小时的t_1/2且具有连接至内部氨基酸侧链的二肽前药要素的前药包含具有以下结构的二肽前药要素：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和芳基，或R₁和R₂经由-(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₄和R₈独立地为C₁-C₁₈烷基或芳基；且

R₅为胺或N取代的胺；

条件是R₁和R₂都不是氢且条件是R₄或R₈之一为氢。

在一些实施方案中，具有例如约12小时至约72小时或在一些实施方案中约12小时至约48小时的t_1/2且具有连接至内部氨基酸侧链的二肽前药要素的前药包含具有以下结构的二肽前药要素：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，或R₁和R₂经由-(CH₂)_p-连接，其中p为2-9；

R₄和R₈独立地为氢、C₁-C₁₈烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅为NHR₆；

R₆为H或C₁-C₈烷基，或R₆和R₂与其所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

R₇选自：氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH₂ _、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤素；

此外提供具有例如约72小时至约168小时的t_1/2且具有连接至本文所述肽或类似物的内部氨基酸侧链的二肽前药要素的前药，其中该二肽前药要素具有结构：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自为氢；且

R₅为胺或N取代的胺或羟基；

条件是，如果R₁和R₂都独立地为烷基或芳基，则R₁或R₂经由(CH2)_p连接至R₅，其中p为2-9。

在一些实施方案中，提供具有例如约72小时至约168小时的t_1/2且具有连接至本文所述肽或类似物的内部氨基酸侧链的二肽前药要素的前药，其中该二肽前药要素具有结构：

其中R₁选自氢、C₁-C₁₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₃为C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自为氢；

R₅为NHR₆或OH；

R₆为H或C₁-C₈烷基，或R₆和R₁与其所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

条件是，如果R₁和R₂都独立地为烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，则R₁或R₂经由(CH₂)_p连接至R₅，其中p为2-9。

在一些实施方案中，二肽前药要素连接至本文所述肽或类似物的内部氨基酸的侧链胺，其中该内部氨基酸包含式II的结构：

其中n为选自1至4的整数。在一些实施方案中n为3或4且在一些实施方案中内部氨基酸为赖氨酸。在一些实施方案中，二肽前药要素连接至位于本文所述肽或类似物的位置12、16、17、18、20、28或29的氨基酸侧链上的伯胺。在一些实施方案中，位置12、16、17、18、20、28或29的氨基酸包含式II的结构：

其中n为选自1至4的整数且二肽前药要素经由酰胺键连接至氨基酸侧链。在一些实施方案中n为4且氨基酸位于位置20。

在其他实施方案中，二肽前药要素经由芳族氨基酸的芳基上存在的胺连接至其肽或类似物。在一些实施方案中，芳族氨基酸为本文所述肽或类似物的内部氨基酸，然而，芳族氨基酸也可以是N末端氨基酸。在一些实施方案中，芳族氨基酸选自：氨基-Phe、氨基-萘基丙氨酸、氨基色氨酸、氨基-苯基-甘氨酸、氨基-高Phe和氨基酪氨酸。在一些实施方案中，与二肽前药要素形成酰胺键的伯胺在芳基上的对位中。在一些实施方案中，芳族胺包含式III的结构：

其中m为1至3的整数。

对于二肽前药要素经由芳族氨基酸上的芳基上存在的胺连接至本文所述肽或类似物的那些实施方案，具有例如约1小时的t_1/2的前药具有以下二肽结构：

其中R₁和R₂独立地为C₁-C₁₈烷基或芳基；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基；且R₅为胺或羟基。

在一些实施方案中，二肽前药要素经由芳族氨基酸上的芳基上存在的胺连接至本文所述肽或类似物，具有例如约1小时的t_1/2的前药具有以下二肽结构：

其中R₁和R₂独立地为C₁-C₁₈烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₄和R₈独立地选自：氢、C₁-C₁₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅为NH₂或OH；且

此外，提供具有经由芳族氨基酸连接的二肽前药要素且具有例如约6小时至约24小时的t_1/2 的前药，其中该二肽包含以下结构：

其中

R₁选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基，或R₁和R₂经由-(CH₂)_p连接，其中p为2-9；

R₃为C₁-C₁₈烷基或R₃和R₄与其所连接的原子一起形成4-6杂环；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基；且R₅为胺或N取代的胺。

在一些实施方案中，提供具有经由芳族氨基酸连接的二肽前药要素且具有例如约6小时至约24小时的t_1/2的前药，其中该二肽包含以下结构：

其中

R₁选自：氢、C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₄烷基)NH₂和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅为NHR₆；

此外，提供具有经由芳族氨基酸连接的二肽前药要素且具有例如约72小时至约168小时的t_1/2的前药，其中该二肽包含以下结构：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和芳基；

R₄和R₈各自为氢；且

R₅选自胺、N取代的胺和羟基。

在一些实施方案中，提供具有经由芳族氨基酸连接的二肽前药要素且具有例如约72小时至约168小时的t_1/2的前药，其中该二肽包含以下结构：

其中R₁和R₂独立地选自：氢、C₁-C₈烷基、(C₁-C₄烷基)COOH、和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，或R₁和R₅与其所连接的原子一起形成4-11杂环；

R₄为氢或与R₃一起形成4-6杂环；

R₈为氢；

R₅为NHR₆或OH；

在一些实施方案中，二肽前药要素经由作为芳族氨基酸的芳基取代基存在的伯胺连接至芳族氨基酸，其中该芳族氨基酸位于本文所述肽或类似物的位置10、13、22或25(基于天然胰高血糖素的编号，参见例如，SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，二肽前药要素连接的芳族氨基酸位于本文所述肽或类似物的位置22。

根据一些实施方案，二肽前药要素连接于本文所述肽或类似物(包括例如胰高血糖素相关肽或骨钙蛋白，以及前述的类似物、衍生物和缀合物)的N末端胺，其中该二肽前药要素包含结构：

其中R₁选自H和C₁-C₈烷基；

R₂和R₄独立地选自：H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂ ⁺) NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆ 环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇、CH₂(C₅-C₉杂芳基)，或R₁和R₂与其所连接的原子一起形成C₃-C₆ 环烷基；

R₃选自C₁-C₈烷基、(C₃-C₆)环烷基，或R₄和R₃与其所连接的原子一起形成5或6元杂环；

R₅为NHR₆或OH；

R₆为H，或R₆和R₂与其所连接的原子一起形成5或6元杂环；且

R₇选自H和OH。在一些实施方案中，R₁为H或C₁-C₈烷基，R₂选自H、C₁-C₆烷基、CH₂OH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₃-C₆ 环烷基)和CH₂(C₆芳基)R₇，或R₆和R₂与其所连接的原子一起形成5元杂环，R₃为C₁-C₆烷基，且R₄选自H、C₁-C₄烷基、(C₃-C₆)环烷基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH和(C₀-C₄烷基)(C₆芳基)R₇，或R₃和R₄与其所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，R₃为CH₃，R₅为NHR₆，且在一个替代实施方案中，R₃和R₄与其所连接的原子一起形成5元杂环且R₅为NHR₆。

根据另一个实施方案，二肽前药要素连接于本文所述肽或类似物的N末端胺，其中该二肽前药要素包含结构：

其中R₁选自H和C₁-C₈烷基；

R₂和R₄独立地选自：H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂ ⁺) NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆ 环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇、CH₂(C₅-C₉杂芳基)，或R₁和R₂与其所连接的原子一起形成C₃-C₆环烷基；

R₅为NHR₆或OH；

R₇选自：氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH₂、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤素。在一些实施方案中，R₁为H或C₁-C₈烷基，R₂选自H、C₁-C₆烷基、CH₂OH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₃-C₆ 环烷基)和CH₂(C₆芳基)R₇，或R₆和R₂与其所连接的原子一起形成5元杂环，R₃为C₁-C₆烷基，且R₄选自H、C₁-C₄烷基、(C₃-C₆)环烷基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH和(C₀-C₄烷基)(C₆芳基)R₇，或R₃和R₄与其所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，R₃为CH₃，R₅为NHR₆，且在另一个替代实施方案中，R₃和R₄与其所连接的原子一起形成5元杂环且R₅为NHR₆。

药物组合物、用途和试剂盒

盐

在一些实施方案中，胰高血糖素类似物呈盐形式，例如，药学上可接受的盐。如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的生物活性且不是在生物学上或其他方面不合需要的化合物的盐。此类盐可通过在类似物的最终分离和纯化期间原位制备，或通过使游离碱官能团与合适的酸反应而独立制备。许多本文所公开的化合物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团而能够形成酸性盐和/或碱性盐。

药学上可接受的酸加成盐可由无机酸和有机酸制备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(isothionate)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括例如无机酸，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸；和有机酸，例如，草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。

也可在水杨酸源的最终分离和纯化期间原位制备，或通过使含羧酸部分与合适的碱(诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备碱加成盐。药学上可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子，诸如锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等；和无毒季胺和胺阳离子，尤其包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、二乙基铵和乙基铵。可用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括例如乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。

此外，碱性含氮基团可经本公开的类似物季铵化，如低碳烷基卤化物，诸如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；长链卤化物，诸如癸基、月桂基、十四烷基和十八烷酰基氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物，如苄基和苯乙基溴化物等。由此获得水溶性或油溶性或分散性产物。

制剂

根据一些实施方案，提供药物组合物，其中该组合物包含本公开的胰高血糖素类似物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(诸如油/水或水/油乳剂)，和各种类型的湿润剂。该术语还涵盖由美国联邦政府管理机构(regulatory agency of the US Federal government)批准或美国药典(US Pharmacopeia)中列出动物(包括人)中使用的任何试剂。

药物组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶推进剂、空气置换剂(air displacement agent)、碱化剂、抗结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、杀菌剂、基料、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、包衣剂(coating agent)、着色剂、干燥剂、去污剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、增溶剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳剂稳定剂、填充剂、薄膜形成剂、气味增强剂、矫味剂、流动增强剂、胶凝剂、粒化剂、保湿剂、润滑剂、粘膜粘着剂、软膏基料、软膏、油性溶媒、有机碱、软锭剂基料、色素、增塑剂、抛光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基料、表面活性剂、表面活性剂、助悬剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、粘度增加剂、吸水剂、水混溶的助溶剂、水软化剂或湿润剂。

在一些实施方案中，药物组合物包含以下组分的任一种或组合：阿拉伯胶、乙酰氨基磺酸钾、乙酰柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、琼脂、白蛋白、乙醇、无水乙醇、变性酒精、稀释酒精、油桐酸、海藻酸、脂肪族聚酯、氧化铝、氢氧化铝、硬脂酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、阿司帕坦、注射用抑菌水、皂土、皂土糊、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苄酯、溴硝丙二醇、丁基羟基茴香醚、丁羟甲苯、对羟基苯甲酸丁酯、丁基对羟基苯甲酸钠、藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己氨基磺酸钙、无水磷酸氢钙、脱水磷酸氢钙、磷酸三钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、硬脂酸钙、硫酸钙、硫酸钙半水合物、芥花籽油(canola oil)、卡波姆(carbomer)、二氧化碳、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、β-胡萝卜素、角叉菜胶、蓖麻油、氢化蓖麻油、阳离子乳化蜡、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、十六醇十八醇混合物(cetostearyl alcohol)、西曲溴铵、鲸蜡醇、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、胆固醇、乙酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、盐酸氯己定、一氯二氟乙烷(HCFC)、一氯二氟甲烷、含氯氟烃(CFC)、氯苯氧基乙醇、氯二甲苯酚、玉米糖浆固体、无水柠檬酸、柠檬酸一水合物、可可脂、着色剂、玉米油、棉籽油、甲酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、交联甲羧纤维素钠、交聚维酮、环拉酸、环糊精、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、无水右旋糖、重氮烷基咪唑脲(diazolidinyl urea)、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精型化合物例如Captisol®、二甲基醚、邻苯二甲酸二甲酯、依地酸二钾、依地酸二钠、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、没食子酸十二酯、十二烷基三甲基溴化铵、依地酸钙二钠、乙二胺四乙酸、乙葡胺、乙醇、乙基纤维素、没食子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麦芽酚、油酸乙酯、对羟甲基苯甲酸乙酯、对羟甲基苯甲酸乙酯钾、对羟甲基苯甲酸乙酯钠、乙基香草醛、果糖、果糖液体、磨碎的果糖、无热原果糖、粉状果糖、富马酸、明胶、葡萄糖、液体葡萄糖、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、甘氨酸、乙二醇、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、瓜尔胶、七氟丙烷(HFC)、十六基三甲基溴化铵、高果糖糖浆、人血清白蛋白、烃(HC)、稀盐酸、II型氢化植物油、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、咪脲、靛蓝、离子交换剂、氧化铁、异丙醇、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等渗盐水、高岭土、乳酸、拉克替醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、正常碳酸镁、无水碳酸镁、碱式碳酸镁、氢氧化镁、月桂基硫酸镁、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、麦芽糊精、麦芽酚、麦芽糖、甘露醇、中链甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、对羟甲基苯甲酸甲酯、对羟甲基苯甲酸甲酯钾、对羟甲基苯甲酸甲酯钠、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠、矿物油、轻质矿物油、矿物油和羊毛脂醇、油、橄榄油、单乙醇胺、蒙脱石、没食子酸辛酯、油酸、棕榈酸、石蜡、花生油、矿脂、矿脂和羊毛脂醇、药用釉料、苯酚、液化苯酚、苯氧基乙醇、苯氧基丙醇、苯基乙醇、乙酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林(polacrilin)、波拉克林钾、泊洛沙姆(poloxamer)、聚右旋糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、偏亚硫酸氢钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚维酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯、丙二醇、丙二醇藻酸酯、没食子酸丙酯、对羟甲基苯甲酸丙酯、对羟甲基苯甲酸丙酯钾、对羟甲基苯甲酸丙酯钠、硫酸精蛋白、油菜籽油、Ringer氏溶液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、硅胶、胶态二氧化硅、藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、脱水柠檬酸钠、氯化钠、环己氨基磺酸钠、依地酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、偏亚硫酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、淀粉乙醇酸钠、硬脂酰醇富马酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、山梨坦酯(山梨坦脂肪酯)、山梨醇、山梨醇溶液70%、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶化淀粉、灭菌玉米淀粉、硬脂酸、纯化的硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可压缩糖、糖果用糖、糖球、转化糖、蔗糖-转化糖聚合物(Sugartab)、日落黄FCF、合成石蜡、滑石粉、酒石酸、酒石黄、四氟乙烷(HFC)、可可油(theobroma oil)、硫柳汞、二氧化钛、α生育酚、乙酸生育酚、α生育酚琥珀酸酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、西黄蓍胶、三醋精、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、三甲基十四烷基溴化铵、tris缓冲液、依地酸三钠、香草醛、I型氢化植物油、水、软水、硬水、无二氧化碳水、无热原水、注射用水、吸入用无菌水、注射用无菌水、冲洗用无菌水、蜡、阴离子乳化蜡、巴西棕榈蜡、阳离子乳化蜡、鲸蜡酯蜡、微晶蜡、非离子乳化蜡、栓剂蜡、白蜡、黄蜡、白矿脂、羊毛脂、黄原胶、木糖醇、玉米蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌、或Handbook　of　Pharmaceutical　Excipients, 第3版, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000) (其以其整体通过引用并入)中的任何赋形剂。Remington ’ s　Pharmaceutical　Sciences, 第16版, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) (其以其整体通过引用并入)公开了配制药学上可接受的组合物中所用的各种组分和其已知制备技术。除了任何常规药剂与药物组合物不相容外，涵盖其在药物组合物中的使用。补充活性成分也可并入组合物中。

在一些实施方案中，一种或多种前述组分可以任何浓度存在于药物组合物中，诸如，例如，至少A，其中A为0.0001% w/v、0.001% w/v、0.01% w/v、0.1% w/v、1% w/v、2% w/v、5% w/v、10% w/v、20% w/v、30% w/v、40% w/v、50% w/v、60% w/v、70% w/v、80% w/v或90% w/v。在一些实施方案中，一种或多种前述组分可以任何浓度存在于药物组合物中，诸如，例如，至多B，其中B为90% w/v、80% w/v、70% w/v、60% w/v、50% w/v、40% w/v、30% w/v、20% w/v、10% w/v、5% w/v、2% w/v、1% w/v、0.1% w/v、0.001% w/v或0.0001%。在其他实施方案中，一种或多种前述组分可以任何浓度范围存在于药物组合物中，诸如，例如，约A至约B。在一些实施方案中，A为0.0001%且B为90%。

在一些实施方案中，药学上可接受的成分选自：糖(例如，葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、葡聚糖、甘油、葡聚糖、蜜二糖(mellibiose)、松三糖(melezitose)、棉子糖、甘露三糖、水苏糖(stachyose)、麦芽糖、乳酮糖(lactulose)、麦芽酮糖(maltulose)或异麦芽酮糖，或这些糖的组合)、糖醇(例如，乙二醇、甘油、赤藻糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、卫矛醇、艾杜糖醇、异麦芽糖、麦芽糖醇、乳糖醇或葡萄糖醇，或这些糖醇的组合)、盐(例如，氯化钠)、乳化剂或表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如聚氧乙烯20脱水山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与环氧丙烷的其他嵌段共聚物)、冻干保护剂，以及其混合物。例如，赋形剂诸如糖或糖醇例如以约20 mg/mL至约40 mg/mL、或25 mg/mL至45 mg/mL、诸如35 mg/mL的浓度存在。

药物组合物可配制以达到生理上相容的pH。在一些实施方案中，根据制剂和施用途径，药物组合物的pH可以是至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5直至且包括pH 11，例如在4与7之间，或在4.5与5.5之间。在示例性实施方案中，药物组合物可包含缓冲剂以达到生理上相容的pH。缓冲剂可包括能够在所需pH下缓冲的任何化合物，诸如，磷酸盐缓冲液(例如PBS)、三乙醇胺、Tris、二羟乙基甘氨酸(bicine)、TAPS、三羟甲基甘氨酸(tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基胂酸盐(cacodylate)、MES、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或其他药学上可接受的缓冲剂。在示例性实施方案中，缓冲液的强度为至少0.5 mM、至少1 mM、至少5 mM、至少10 mM、至少20 mM、至少30 mM、至少40 mM、至少50 mM、至少60 mM、至少70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少100 mM、至少120 mM、至少150 mM或至少200 mM。在一些实施方案中，缓冲液的强度为不大于300 mM(例如，至多200 mM、至多100 mM、至多90 mM、至多80 mM、至多70 mM、至多60 mM、至多50 mM、至多40 mM、至多30 mM、至多20 mM、至多10 mM、至多5 mM、至多1 mM)。例如，缓冲液浓度可以是约2 mM至约100 mM，或约10 mM至约50 mM。

施用途径

以下关于施用途径的讨论仅提供以说明示例性实施方案且不应理解为以任何方式限制范围。

适于口服施用的制剂可由以下组成：(a)液体溶液，诸如有效量的溶于稀释剂诸如水、盐水或橙汁的本公开类似物；(b) 胶囊剂、小药囊、片剂、锭剂和糖锭剂，各自含有预定量的活性成分，作为固体或颗粒；(c)散剂；(d)在适当液体中的悬浮液；和(e)合适的乳剂。液体制剂可包括稀释剂，诸如水和醇类(例如，乙醇、苄醇和聚乙二醇)，其中添加或未添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可以是含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂(诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉)的普通硬壳或软壳明胶类型。片剂形式可包括以下的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂和其他药理学相容的赋形剂。锭剂形式可包含在矫味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中本公开的类似物，以及包含在惰性基质(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中本公开的类似物的软锭剂，除了本公开的类似物外含有本领域已知的这类赋形剂的乳剂、凝胶剂等。

可将本公开的类似物，单独或与其他合适的组分组合，经由肺部施用而递送并且可将其制成经由吸入施用的气溶胶制剂。可将这些气溶胶制剂置于加压的可接受的推进剂诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。也可将它们配制成用于非加压制剂的药物，例如在喷雾器或雾化器中。此类喷雾制剂也可用于喷雾粘膜。在一些实施方案中，将类似物配制成粉末共混物或配制成微粒或纳米粒。合适的肺部制剂是本领域已知的。参见例如Qian等人, Int J Pharm 366: 218-220 (2009)；Adjei和Garren, Pharmaceutical Research, 7(6): 565-569 (1990)；Kawashima等人, J Controlled Release 62(1-2): 279-287 (1999)；Liu等人, Pharm Res 10(2): 228-232 (1993)；国际专利申请公布号WO 2007/133747和WO 2007/141411。

适于肠胃外施用的制剂包括含水和非含水等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受体的血液等张的溶质；和含水和非含水无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。术语“肠胃外”意指不经由消化道而通过一些其他途径诸如皮下、肌肉内、脊椎内或静脉内。本公开的类似物可在药物载体中与生理学上可接受的稀释剂一起施用，该药物载体诸如无菌液体或液体混合物，包括水、生理盐水、右旋糖水溶液和相关糖溶液、醇(诸如乙醇或十六醇)、二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮(诸如2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-甲醇)、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰化脂肪酸甘油酯，其中添加或未添加药学上可接受的表面活性剂(诸如皂或去垢剂)、悬浮剂(诸如果胶)、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素、或乳化剂和其他药物佐剂。

可用于肠胃外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的特定实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、石蜡油和矿物油。适用于肠胃外制剂中的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和十四烷酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。

适用于肠胃外制剂中的皂包括脂肪碱金属、铵和四乙醇胺盐，且合适的去垢剂包括：(a)阳离子去垢剂，诸如，例如，二甲基二烷基卤化铵，和卤化烷基吡啶鎓，(b)阴离子去垢剂，诸如，例如，烷基、芳基和烯烃的磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘酯的硫酸盐、和磺化琥珀酸盐，(c)非离子去垢剂，诸如，例如，脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去垢剂，例如，烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)其混合物。

肠胃外制剂通常将含有约0.5重量%至约25重量%的溶液中的本公开类似物。可使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，此类组合物可含有一种或多种非离子型表面活性剂，其具有约12至约17的亲水-亲脂平衡值(HLB)。此类制剂中表面活性剂的量通常将在约5重量%至约15重量%的范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯(诸如脱水山梨糖醇单油酸酯)和环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水性基质的高分子量加合物。肠胃外制剂可呈现于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中，且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临使用之前添加注射用无菌液体赋形剂，诸如水。可从先前所述种类的无菌散剂、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。

可注射制剂根据本发明。本领域普通技术人员众所周知用于可注射组合物的有效药物载体的要求(参见例如 Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker和Chalmers编，第238-250页(1982)；和 ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 第4版，第622-630页(1986))。

另外，本公开的类似物可通过与多种基质诸如乳化基质或水溶性基质的混合而制成用于直肠施用的栓剂。适于阴道施用的制剂可作为阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂呈现，除了含有活性成分以外，还含有如本领域中已知适当的此类载体。

本领域技术人员应理解，除了上述药物组合物以外，本公开的类似物也可配制成包合复合物，诸如环糊精包合复合物，或脂质体。

剂量

据信本公开的类似物可用于治疗GIP受体激动作用、GIP/GLP-1受体共激动作用、GIP/胰高血糖素受体共激动作用、或GIP/GLP-1/胰高血糖素受体三重激动作用发挥作用的疾病或医学病况的方法中。出于本公开的目的，所施用本公开类似物的量或剂量应足以在合理时间范围内在主体或动物中实现例如治疗或预防反应。例如，本公开类似物的剂量应从施用时起在约1分钟至4分钟、1小时至4小时或1周至4周或更长(例如，5周至20周或更多周)的时间段内足以刺激cAMP从如本文所述的细胞中分泌或足以降低哺乳动物的血糖水平、脂肪水平、食物摄入水平或体重。在示例性实施方案中，时间段可能甚至更长。应通过特定本公开类似物的功效和动物(例如人)的状况，以及待治疗动物(例如人)的体重来确定剂量。

本领域中已知用于确定施用剂量的许多测定法。出于本文的目的，可使用一种测定法来确定待施用至哺乳动物的起始剂量，该测定法包括在向哺乳动物(该哺乳动物所属的一组哺乳动物各自被给予不同剂量的类似物)施用给定剂量的本公开类似物之后比较血糖水平降低的程度。可通过本领域中已知的方法(包括例如本文实施例11所述的方法)测定施用特定剂量之后血糖水平降低的程度。

还将通过施用特定本公开类似物可能伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定本公开类似物的剂量。通常，主治医师将考虑到多种因素诸如年龄、体重、总体健康、饮食、性别、待施用的本公开类似物、施用途径和待治疗病况的严重性，决定用于治疗各个别患者的本公开类似物的剂量。通过实例的方式且并不意欲限制本发明，本公开类似物的剂量可以是约0.0001至约1g/kg所治疗主体的体重/天、约0.0001至约0.001 g/kg体重/天、或约0.01 mg至约1 g/kg体重/天。在示例性实施方案中，剂量可以是约1mg至约40mg、或约4mg至约30mg、或约4至约20mg、或约10至约20mg、或约12mg至约30mg的总每周剂量。

在一些实施方案中，药物组合物包含适于施用至患者的纯度水平的任何本文公开的类似物。在一些实施方案中，类似物具有至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的纯度水平，和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一些方面，药物组合物包含浓度为至少A的本公开类似物，其中A为约0.001 mg/ml、约0.01 mg/ml、约0.1 mg/ml、约0.5 mg/ml、约1 mg/ml、约2 mg/ml、约3 mg/ml、约4 mg/ml、约5 mg/ml、约6 mg/ml、约7 mg/ml、约8 mg/ml、约9 mg/ml、约10 mg/ml、约11 mg/ml、约12 mg/ml、约13 mg/ml、约14 mg/ml、约15 mg/ml、约16 mg/ml、约17 mg/ml、约18 mg/ml、约19 mg/ml、约20 mg/ml、约21 mg/ml、约22 mg/ml、约23 mg/ml、约24 mg/ml、约25 mg/ml或25 mg/ml以上。在一些实施方案中，药物组合物包含浓度为至多B的类似物，其中B为约30 mg/ml、约25 mg/ml、约24 mg/ml、约23 mg/ml、约22 mg/ml、约21 mg/ml、约20 mg/ml、约19 mg/ml、约18 mg/ml、约17 mg/ml、约16 mg/ml、约15 mg/ml、约14 mg/ml、约13 mg/ml、约12 mg/ml、约11 mg/ml、约10 mg/ml、约9 mg/ml、约8 mg/ml、约7 mg/ml、约6 mg/ml、约5 mg/ml、约4 mg/ml、约3 mg/ml、约2 mg/ml、约1 mg/ml或约0.1 mg/ml。在一些实施方案中，组合物可含有浓度范围为A至B mg/ml(例如，约0.001 mg/ml至约30.0 mg/ml)的类似物。

靶向形式

本领域普通技术人员将容易地理解，本公开的类似物可以任何多种方式经修饰，使得本公开类似物的治疗或预防功效经由修饰增加。例如，本公开类似物可直接或间接地经由接头缀合至靶向部分。本领域中已知将例如本文所述的胰高血糖素类似物的化合物缀合至靶向部分的操作。参见例如Wadhwa等人, J　Drug　Targeting, 3, 111-127 (1995)和美国专利号5,087,616。如本文所用的术语“靶向部分”是指特异性识别且结合至细胞表面受体以使得靶向部分引导本公开类似物递送至表面上表达受体(胰高血糖素受体、GLP-1受体)的细胞群体的任何分子或试剂。靶向部分包括但不限于结合至细胞表面受体(例如，上皮生长因子受体(EGFR)、T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、CD28、血小板衍生生长因子受体(PDGF)、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)的抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子，和任何其他天然或非天然配体。如本文所用的“接头”为将两个独立实体彼此结合在一起的键、分子或分子群。接头可提供两个实体的最佳间隔或可进一步供应允许两个实体彼此分离的不稳定连接。不稳定连接包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可裂解基团。在一些实施方案中，术语“接头”是指将本公开类似物桥接至靶向部分的任何试剂或分子。本领域普通技术人员认识到本公开类似物上的位点(其对于本公开类似物的功能并非必需的)为连接接头和/或靶向部分的理想位点，条件是接头和/或靶向部分，一旦连接至本公开类似物，就不会干扰本公开类似物的功能，即，刺激cAMP从细胞分泌以治疗糖尿病或肥胖症的能力。

控制释放制剂

或者，本文所述的胰高血糖素类似物可改变成贮库制剂形式，使得本发明类似物释放到所施用的机体的方式在时间和体内位置上受到控制(参见例如，美国专利号4,450,150)。本公开类似物的贮库制剂形式可以是例如，包含本公开类似物和多孔或非多孔材料诸如聚合物的可植入组合物，其中通过将本公开类似物包入材料中或使其扩散到整个材料中和/或非多孔材料的降解。再将贮库制剂植入体内所需位置，并且本公开类似物以预定速率从该植入物中释放。

在示例性方面，药物组合物被改变以具有任何类型的体内释放概况。在一些方面，药物组合物为立即释放、控制释放、持续释放、延长释放、延迟释放或两相释放制剂。本领域中已知配制肽以进行控制释放的方法。参见例如Qian等人，Qian等人, J　Pharm 374: 46-52 (2009)和国际专利申请公开号WO 2008/130158；WO2004/033036；WO2000/032218；和WO 1999/040942。

本组合物可进一步包含例如，胶束或脂质体，或某种其他包封形式，或可以以延长释放形式施用以提供延长储存和/或递送效果。可根据任何方案施用所公开的药物制剂，包括例如每日(每日1次、每日2次、每日3次、每日4次、每日5次、每日6次)、每周三次、每周两次、每两日、每三日、每四日、每五日、每六日、每周、每两周、每三周、每月或每两月。

组合

本文所述的胰高血糖素类似物可单独或组合其他治疗剂施用，其旨在治疗或预防本文所述的任何疾病或医学病况。例如，本文所述的胰高血糖素类似物可与抗糖尿病或抗肥胖症药剂(同时或依次)共同施用。本领域中已知或正在研究的抗糖尿病药剂包括胰岛素、瘦素(leptin)、肽YY (PYY)、胰肽(PP)、成纤维细胞生长因子21 (FGF21)、Y2Y4受体激动剂、磺酰脲诸如甲苯磺丁脲(Orinase)、醋磺己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta, Micronase, Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；美格列奈，诸如瑞格列奈(Prandin)或那格列奈(Starlix)；双胍类诸如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮诸如罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)，或其他PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制剂，诸如米格列醇(Glyset)，阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(exenatide)(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4 (DPP-4)抑制剂，诸如维格列汀(vildagliptin)或西他列汀(sitagliptin)；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；葡糖激酶活化剂(GKA)；胰高血糖素受体拮抗剂(GRA)；或FBPase (果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。

本领域中已知或正在研究的抗肥胖症药剂包括食欲抑制剂，包括苯乙胺型刺激剂、芬特明(任选与芬氟拉明或右芬氟拉明)、二乙胺苯丙酮(Terumte®)、苯二甲吗啉(Prelu-2®、Bontril®))、苄非他明(benzphetamine) (Didrex®)、西布曲明(sibutramine) (Meridia®、Reductil®)；利莫那班(rimonabant) (Acomplia®)、其他大麻素受体拮抗剂；胃泌酸调节素；盐酸氟西汀(fluoxetine hydrochloride) (Prozac)；Qnexa(托吡酯(topiramate)和芬特明)、Excalia(安非拉酮和唑尼沙胺)或Contrave (安非拉酮和纳曲酮(naltrexone))；或脂肪酶抑制剂，类似于赛尼可(XENICAL)(奥利司他(Orlistat))或赛利司他(Cetilistat)(也称为ATL-962)或GT389-255。

在一些实施方案中，本文所述的肽与用于治疗非酒精性脂肪肝病或NASH的药剂一起共同施用。用于治疗非酒精性脂肪肝病的药剂包括熊去氧胆酸(又称为Actigall、URSO和Ursodiol)、二甲双胍(Glucophage)、罗格列酮(Avandia)、氯贝丁酯、吉非贝齐、多粘菌素B和甜菜碱。

在一些实施方案中，本文所述的肽与用于治疗神经退化性疾病(例如，帕金森氏病(Parkinson's Disease))的药剂一起共同施用。此外，抗帕金森氏病药剂在本领域中已知且包括但不限于左旋多巴(levodopa)、卡比多巴(carbidopa)、抗胆碱剂(anticholinergics)、溴隐亭(bromocriptine)、普拉克索(pramipexole)和罗匹尼洛(ropinirole)、金刚烷胺(amantadine)和雷沙吉兰(rasagiline)。

鉴于前述，本发明进一步提供另外包含这些其他治疗剂之一的药物组合物和试剂盒。所述额外治疗剂可与本公开类似物同时或依次施用。在一些方面，类似物在额外治疗剂之前施用，而在其他方面，类似物在额外治疗剂之后施用。

用途

基于本文首次提供的信息，涵盖本公开的组合物(例如，相关药物组合物)可用于治疗疾病或医学病况，其中例如缺乏针对GIP受体、GLP-1受体或针对两种受体的活性是该疾病或医学病况的发作和/或进展的因素。因此，本公开提供治疗或预防患者的疾病或医学病况的方法，其中该疾病或医学病况是其中缺乏GIP受体活化和/或GLP-1受体活化与疾病或医学病况的发作和/或进展相关的疾病或医学病况。该方法包含向该患者提供有效治疗或预防该疾病或医学病况的量的根据任何本文所述那些的组合物或缀合物。

在一些实施方案中，疾病或医学病况为代谢综合征。代谢综合征(也称为代谢综合征X、胰岛素抗性综合征或雷文氏综合征(Reaven's syndrome))为一种影响超过5千万美国人的病症。代谢综合征的特征通常在于成簇出现至少三种或更多种的以下风险因素：(1)腹部肥胖(腹部中和周围过多脂肪组织)；(2)致动脉粥样硬化血脂异常(血脂异常，包括高甘油三酯、低HDL胆固醇和高LDL胆固醇，其增强斑块在动脉壁中的积聚)；(3)高血压；(4)胰岛素抗性或葡萄糖不耐受；(5)栓塞前状态(例如，血液中的高血纤蛋白原或纤溶酶原激活物抑制剂-1)；和(6)促炎性状态(例如，血液中C-反应性蛋白升高)。其他风险因素可包括老化、激素失衡和遗传倾向性。

代谢综合征与冠状动脉心脏病和与血管斑块积聚相关的其他病症(诸如中风和周边血管疾病(称为动脉粥样硬化心血管疾病(ASCVD)))的风险增加有关。患有代谢综合征的患者可从早期阶段的胰岛素抗性状态进展至发育完全的II型糖尿病，ASCVD的风险进一步增加。不欲受任何特定理论束缚，胰岛素抗性、代谢综合征与血管疾病之间的关系可涉及一个或多个并发致病机制，包括胰岛素刺激的血管扩张受损、由于氧化应激增强而导致的胰岛素抗性相关的NO可用性降低，和脂肪细胞衍生的激素(诸如脂联素(adiponectin))异常(Lteif和Mather, Can. J. Cardiol. 20(增刊B): 66B-76B(2004))。

根据2001年美国国家胆固醇教育计划成人治疗实验对象组(2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel (ATP III))，相同个体中以下特性中的任何三种符合代谢综合征的标准：(a)腹部肥胖(男性腰围大于102 cm且女性腰围大于88 cm)；(b)血清甘油三酯(150 mg/dl或以上)；(c)HDL胆固醇(男性为40 mg/dl或以下且女性为50 mg/dl或以下)；(d)血压(130/85或以上)；和(e)空腹血糖(110 mg/dl或以上)。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)，具有以下标准中的至少两个的具有高胰岛素水平(单独的高空腹血糖或高餐后葡萄糖)的个体符合代谢综合征的标准：(a)腹部肥胖(腰臀比大于0.9，身体质量指数为至少30kg/m2，或腰部测量值大于37英寸)；(b)显示至少150 mg/dl的甘油三酯水平或低于35mg/dl的HDL胆固醇的胆固醇实验对象组；(c)血压为140/90或以上，或正在治疗高血压。(Mathur, Ruchi, “Metabolic Syndrome,”, Shiel, Jr., William C.编, MedicineNet.com, 2009年5月11日)。

出于本文的目的，如果个体符合2001年美国国家胆固醇教育计划成人治疗实验对象组或WHO所提出的标准中的任一个或两个，则该个体被视为患有代谢综合征。

不受任何特定理论束缚，本文所述的组合物和缀合物可用于治疗代谢综合征。因此，本发明提供预防或治疗主体的代谢综合征或减少主体的一个、两个、三个或更多个代谢综合征风险因素的方法，其包括向该主体提供有效预防或治疗代谢综合征或其风险因素的量的本文所述的组合物。

在一些实施方案中，该方法治疗高血糖医学病况。在示例性方面，该高血糖医学病况为糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病(胰岛素依赖性或非胰岛素依赖性)。在一些方面，该方法通过减少糖尿病的一种或多种并发症(包括肾病变、视网膜病变和血管疾病)来治疗高血糖医学病况。

在一些方面，疾病或医学病况为肥胖症。在一些方面，肥胖症为药物诱导性肥胖症。在一些方面，该方法通过预防或降低患者的体重增加或增加患者的体重损失来治疗肥胖症。在一些方面，该方法通过降低食欲、减少食物摄入、降低患者的脂肪水平或降低食物经由胃肠系统的移动速率来治疗肥胖症。

因为肥胖症与其他疾病的发作或进展有关，所以治疗肥胖症的方法进一步可用于减少与肥胖症有关的并发症(包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、周边血管疾病、缺血再灌注等)、高血压、II型糖尿病发作、高脂质血症和肌肉骨骼疾病)的方法中。本公开因此提供治疗或预防与这些肥胖症有关的并发症的方法。

在一些实施方案中，疾病或医学病况为非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。NAFLD是指多种肝脏疾病，范围为从单纯脂肪肝(脂肪变性)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)到肝硬化(不可逆的晚期肝瘢痕化)。所有阶段的NAFLD共同具有脂肪(脂肪浸润)在肝脏细胞(肝细胞)中积聚。单纯脂肪肝为特定类型的脂肪(甘油三酯)在肝脏细胞中异常积聚而无炎症或瘢痕形成。在NASH中，脂肪积聚与肝脏的炎症(肝炎)和瘢痕形成(纤维化)的不同水平有关。炎性细胞可破坏肝脏细胞(肝细胞坏死)。在术语“脂肪性肝炎”和“脂肪坏死”中，脂肪(steato)是指脂肪浸润，肝炎是指肝脏炎症，坏死是指肝脏细胞受破坏。NASH最终可导致肝脏瘢痕形成(纤维化)和随然后不可逆的晚期瘢痕形成(肝硬化)。由NASH引起的肝硬化为NAFLD范围中的最终且最严重的阶段。(Mendler，Michel, "Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis(NASH), " Schoenfield, Leslie J.编，MedicineNet.com, 2005年8月29日)。

酒精性肝脏疾病或酒精诱导性肝脏疾病涵盖与酒精过多消耗相关或由酒精过多消耗引起的三种病理学不同的肝脏疾病：脂肪肝(脂肪变性)、慢性或急性肝炎，和肝硬化。酒精性肝炎的范围可为温和的肝炎(异常实验室检测为疾病的唯一指征)到严重的肝功能障碍并有并发症例如黄疸病(由胆红素留滞(bilirubin retention)引起的黄皮肤)、肝性脑病(由肝脏衰竭引起的神经功能障碍)、腹水(腹部的流体聚积)、出血性食管曲张(食管的静脉曲张)、异常血液凝结和昏迷。酒精性肝炎在组织学上具有肝细胞气球样变性、嗜中性粒细胞炎症及有时马洛里小体(细胞中间丝蛋白异常聚集)的特征性外观。肝硬化的解剖特征在于肝脏上广泛的节结以及纤维化。(Worman, Howard J., “Alcoholic Liver Disease”, Columbia University Medical Center website)。

不受任何特定理论束缚，本文所述的组合物和缀合物可用于治疗酒精性肝脏疾病、NAFLD或其任何阶段，包括例如脂肪变性、脂肪性肝炎、肝炎、肝脏炎症、NASH、肝硬化或并其发症。因此，本公开提供预防或治疗主体的酒精性肝脏疾病、NAFLD或其任何阶段的方法，其包括向主体提供有效预防或治疗酒精性肝脏疾病、NAFLD或其任何阶段的量的本文所述的组合物。此类治疗方法包括降低以下中的一种、两种、三种或更多种：肝脏脂肪含量、肝硬化的发生或进展、肝细胞癌的发生率、炎症病征例如异常肝酶水平(例如天冬氨酸氨基转移酶AST和/或丙氨酸氨基转移酶ALT或LDH)、升高的血清铁蛋白、升高的血清胆红素和/或纤维化病征例如升高的TGF-β水平。在示例性实施方案中，所述组合物用于治疗已进展至超过单纯脂肪肝(脂肪变性)且展现炎症或肝炎的病征的患者。此类方法可导致例如AST和/或ALT水平降低。

GLP-1和毒蜥外泌肽-4已显示具有一些神经保护作用。本公开还提供本文所述的组合物在治疗神经退化性疾病中的用途，所述疾病包括但不限于：阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(Amylotrophic Lateral Sclerosis)、其他脱髓鞘相关病症、老年痴呆、皮质下痴呆、动脉硬化性痴呆、AIDS-相关的痴呆或其他痴呆、中枢神经系统癌症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、中风或脑缺血、脑血管炎、癫痫、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease)、图雷特综合征(Tourette's syndrome)、格林巴利综合征(Guillain Barre syndrome)、威尔逊病(Wilson disease)、皮克病(Pick's disease )、神经炎性病症、脑炎、脑脊髓炎或病毒性、真菌性或细菌性起源的脑膜炎、或其他中枢神经系统感染、朊蛋白病、小脑共济失调、小脑变性、脊髓小脑变性综合征、弗里德赖希共济失调(Friedreichs ataxia)、共济失调毛细血管扩张、脊柱肌营养不良(spinal dysmyotrophy)、进行性核上性麻痹、张力障碍、肌肉痉挛、震颤、视网膜色素变性、纹状体黑质变性、线粒体脑-肌病、神经元腊样脂褐质症、肝性脑病、肾性脑病、代谢性脑病、毒素诱导的脑病和辐射诱导的脑损伤。

在一些实施方案中，组合物结合营养素的肠胃外施用用于医院环境中的非糖尿病患者，例如，用于接受肠胃外营养或总肠胃外营养的患者。非限制性实例包括手术患者；昏迷中的患者；具有以下疾病的患者：消化道疾病、或无功能胃肠道(例如因为手术切除、闭塞或吸收能力受损)、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、胃肠道阻塞、胃肠道瘘管、急性胰腺炎、肠缺血、胃肠道大手术、某些先天性胃肠道异常、延长的腹泻或因手术所导致的短肠综合征；休克中的患者，和正经历治愈过程，经常接受胃肠外施用碳水化合物以及脂质、电解质、矿物质、维生素和氨基酸的多种组合的患者。包含如本文所述的GIP激动剂肽和胰高血糖素拮抗剂肽的组合物和肠胃外营养组合物可同时、在不同时、彼此先后施用，条件是该组合物在肠胃外营养组合物进行消化时发挥所需生物作用。例如，肠胃外营养可每天1次、2次或3次施用，而该组合物每隔一天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次或每个月一次施用。

如本文所用的术语“治疗”包括预防特定病症或病况，或减轻与特定病症或病况相关的症状，和/或预防或消除所述症状。例如，如本文所用的术语“治疗糖尿病”将通常是指以正常水平方向改变血糖水平且可包括根据给定情形增加或降低血糖水平。

如本文所用的胰高血糖素肽的“有效”量或“治疗有效量”是指提供所需作用的无毒但足够量的肽。例如，一种所需作用将是预防或治疗低血糖症，如例如通过血糖水平增加所测量。本公开胰高血糖素肽的替代所需作用将包括治疗高血糖症，例如如通过血糖水平更接近正常水平的改变所测量；或诱导体重减轻/预防体重增加，例如如通过体重减轻所测量；或预防或减少体重增加；或使体脂肪分布正常化。取决于个体的年龄和总体状况、施用模式等，主体之间“有效”量将不同。因此，并非总可能指定确切“有效量”。然而，在任何个别情况下适当的“有效”量可由本领域普通技术人员使用常规实验方法来确定。

主体

关于上述治疗方法，患者为任何宿主。在一些实施方案中，宿主为哺乳动物。如本文所用的术语“哺乳动物”是指哺乳类的任何脊椎动物，包括但不限于任何单孔类、有袋类和胎盘类动物。在一些实施方案中，哺乳动物是啮齿目(Rodentia)哺乳动物之一(诸如小鼠和仓鼠)，和兔形目(Logomorpha)哺乳动物(诸如兔)。在示例性实施方案中，哺乳动物来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。在示例性实施方案中，哺乳动物来自偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛科动物(牛)和猪类(猪)，或来自奇蹄目(Perssodactyla)，包括马科动物(马)。在某些情况下，哺乳动物是灵长目(Primates)、Ceboids或Simoids (猴)或类人猿目(Anthropoids) (人和猿)。在特定的实施方案中，哺乳动物是人。

试剂盒

可根据一个实施方案提供本公开的胰高血糖素类似物作为试剂盒的一部分。因此，在一些实施方案中，提供用于向有需要的患者施用胰高血糖素类似物的试剂盒，其中该试剂盒包含如本文所述的胰高血糖素类似物。

在一个实施方案中，提供具有用于向主体施用胰高血糖素类似物的装置的试剂盒。该装置在一些方面为注射器针头、笔装置、喷射注射器或其他无针头注射器。试剂盒可以可选地或另外包括一种或多种容器，例如，小瓶、管、瓶、单室或多室预充式注射器、药筒、输液泵(外置式或植入式)、喷射注射器、预充式笔装置等，任选地含有冻干形式或水溶液形式的胰高血糖素类似物。在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书。根据一个实施方案，试剂盒的装置为气溶胶分配装置，其中将组合物预包装在气溶胶装置中。在另一个实施方案中，试剂盒包含注射器和针头，且在一个实施方案中将无菌胰高血糖素组合物预包装在注射器中。

在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书。在一些方面，所述说明书包括根据本文所述方法中的任一种的使用说明书。所述说明书可另外包括关于维持健康饮食和/或体育锻炼程序的说明书。所述说明书可为纸质小册子形式或电子形式，例如，包含说明书的计算机可读储存装置。

给出以下实施例仅为说明本发明且其不以任何方式限制其范围。

实施例

实施例1

以下提供合成本公开的肽类似物的示例性方法。

胰高血糖素的肽片段的合成

材料：

除非另外说明，否则实施例中所有本文所述的肽均被酰胺化。

MBHA树脂(在肽合成期间使用4-甲基二苯甲基胺聚苯乙烯树脂。MBHA树脂，100-180目，1% DVB交联聚苯乙烯；负载量为0.7-1.0 mmol/g)、经Boc保护的氨基酸和经Fmoc保护的氨基酸购自Midwest Biotech。在Applied Biosystem 430A肽合成仪上进行使用经Boc保护的氨基酸的固相肽合成。使用Applied Biosystems 433型肽合成仪进行经Fmoc保护的氨基酸合成。

肽合成 (Boc 氨基酸 /HF 裂解 ) ：

在Applied Biosystem 430A型肽合成仪进行这些类似物的合成。通过向含有2 mmol经Boc保护的氨基酸的药筒中依次添加氨基酸来构建合成肽。具体而言，使用Boc DEPBT活化的单偶联来实施合成。在偶联步骤结束时，用TFA处理肽基树脂以去除N末端Boc保护基团。将其用二甲基甲酰胺(DMF)反复洗涤且对于所需数目的偶联步骤重复该重复性循环。装配之后，通过20%哌啶处理去除侧链保护Fmoc且使用DIC进行酰化。在整个合成结束时通过使用二氯甲烷(DCM)来干燥肽基树脂，且使用无水HF使肽从树脂裂解。

对于内酰胺化，针对Glu和Lys选择正交保护基团(例如，Glu(Fm)、Lys(Fmoc))。在去除保护基团之后且在HF裂解之前，如先前所述进行环化(参见例如国际专利申请公开号WO2008/101017)。

肽基树脂的 HF 处理

用无水氟化氢(HF)处理肽基树脂，且这通常得到约350mg(~50%产率)的粗脱除保护的肽。具体而言，将肽基树脂(30mg至200mg)置于HF反应容器中用于裂解。将500μL对甲酚添加至容器中作为阳碳离子清除剂(carbonium ion scavenger)。将该容器连接至HF系统且浸入甲醇/干冰混合物中。用真空泵排空容器且将10ml HF蒸馏至反应容器中。在0℃下将肽基树脂与HF的该反应混合物搅拌一小时，其后建立真空且快速排空HF(10-15 min)。小心地取出容器且填充约35ml乙醚以使肽沉淀且萃取对甲酚和由HF处理导致产生的小分子有机保护基团。利用铁氟龙(teflon)过滤器过滤该混合物且重复两次以去除所有过量甲酚。弃去该滤液。将沉淀的肽溶解于约20ml 10%乙酸(水溶液)中。收集含有所需肽的该滤液且冻干。

在以下条件[4.6 X 30 mm Xterra C8, 1.50 mL/min, 220 nm，A缓冲液0.1%三氟乙酸(TFA)/10%丙烯腈(ACN)，B缓冲液0.1% TFA/100% ACN，梯度5-95% B，经15分钟]下进行粗溶解肽的分析型HPLC分析。用水将萃取物稀释两倍且上样于2.2 X 25 cm Vydac C4制备型反相柱上且在Waters HPLC系统上使用乙腈梯度进行洗脱(A缓冲液为0.1% TFA/10% ACN，B缓冲液为0.1% TFA/10% ACN且梯度为0-100% B，经120分钟，流速为15.00 ml/min)。纯化肽的HPLC分析显示纯度大于95%且使用电喷雾电离质谱分析来确认肽的身份。

肽酰化

如下制备酰化肽。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems 430A肽合成仪在固体支持树脂上合成肽。如Schnolzer等人, Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)所述使用原位中和化学。对于酰化肽，待酰化的目标氨基酸残基(例如，位置10，相对于SEQ ID NO：3的氨基酸位置编号)被N ε-FMOC赖氨酸残基取代。用DMF中的20%哌啶处理完全N末端BOC保护的肽30分钟去除FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的经FMOC保护的间隔基氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH₃(CH₂)₁₄-COOH)与DMF/N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中的PyBOP或DEPBT偶联试剂偶联来实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。随后去除间隔基氨基酸的FMOC基团，随后重复与酰基链的偶联。用100% TFA最终处理导致去除任何侧链保护基团和N末端BOC基团。将肽树脂用5% DIEA/DMF中和，干燥，然后在0℃下使用95:5的HF/对甲酚从支持物裂解一小时。在乙醚萃取后，使用5%乙酸(HOAc)溶液将粗肽溶剂化。然后通过ESI-MS证实溶液样品含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC使用10%乙腈(CH3CN)/0.1% TFA至100% CH3CN中的0.1% TFA的线性梯度纯化正确的肽。使用Vydac C18 22mm x 250mm蛋白柱用于纯化。通过20：80的缓冲液比率，酰化肽类似物通常完成洗脱。将各部分合并在一起且在分析型RP-HPLC上检查纯度。将纯级分冻干，得到白色固体肽。

以下为示例性酰化Lys残基，其中酰基经由γ-Glu-γ-Glu二肽间隔基连接。

其中n为1至29。

如果肽包含内酰胺桥键和待酰化的目标残基，则在向肽骨架添加该氨基酸之后如上所述实施酰化。

如下制备双重酰化或二酰化。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems 430A肽合成仪在固体支持树脂上合成肽。如Schnolzer等人，Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)所述使用原位中和化学。对于两个位点双重酰化肽，待酰化的目标氨基酸残基(例如，位置10和40，相对于SEQ ID NO：3的氨基酸位置编号)被N ε-FMOC赖氨酸残基取代。用DMF中的20%哌啶处理完全N末端BOC保护的肽30分钟以去除FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的经FMOC保护的间隔基氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH₃(CH₂)₁₄-COOH)与DMF/DIEA中的PyBOP或DEPBT偶联试剂偶联来实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。随后去除间隔基氨基酸的FMOC基团，随后重复与酰基链的偶联。用100% TFA最终处理导致去除任何侧链保护基团和N末端BOC基团。将肽树脂用5% DIEA/DMF中和，干燥，然后在0℃下使用95:5的HF/对甲酚从支持物裂解一小时。在乙醚萃取后，使用5% HOAc溶液将粗肽溶剂化。然后通过ESI-MS证实溶液样品含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC使用10% CH3CN/0.1% TFA至100% CH3CN中的0.1% TFA的线性梯度纯化正确的肽。使用Vydac C18 22mm x 250mm蛋白柱用于纯化。通过20：80的缓冲液比率，酰化肽类似物通常完成洗脱。将各部分合并在一起且在分析型RP-HPLC上检查纯度。将纯级分冻干，得到白色固体肽。

如下制备一个位点分支双重酰化。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems 430A肽合成仪在固体支持树脂上合成肽。如Schnolzer等人，Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)所述使用原位中和化学。对于酰化肽，待酰化的目标氨基酸残基(例如，位置10，相对于SEQ ID NO：3的氨基酸位置编号)被N ε-FMOC赖氨酸残基取代。用DMF中的20%哌啶处理完全N末端BOC保护的肽30分钟以去除FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的经ε-氨基和α-氨基FMOC保护的间隔基氨基酸(例如FMOC-Lys(FMOC)-OH)与DMF/DIEA中的PyBOP或DEPBT偶联试剂偶联来实现经由C末端与Lys残基的偶联。随后去除间隔基氨基酸的FMOC基团，随后使ε-氨基和α-氨基各自与酰基链偶联。用100% TFA最终处理导致去除任何侧链保护基团和N末端BOC基团。将肽树脂用5% DIEA/DMF中和，干燥，然后在0℃下使用95:5的HF/对甲酚从支持物裂解一小时。在乙醚萃取后，使用5% HOAc溶液将粗肽溶剂化。然后通过ESI-MS证实溶液样品含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC使用10% CH3CN/0.1% TFA至100% CH3CN中的0.1% TFA的线性梯度纯化正确的肽。使用Vydac C18 22mm x 250mm蛋白柱用于纯化。通过20：80的缓冲液比率，酰化肽类似物通常完成洗脱。将各部分合并在一起且在分析型RP-HPLC上检查纯度。将纯级分冻干，得到白色固体肽。

如下制备一个位点线性双重酰化。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems 430A肽合成仪在固体支持树脂上合成肽。如Schnolzer等人，Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)所述使用原位中和化学。对于酰化肽，待酰化的目标氨基酸残基(例如，位置10，相对于SEQ ID NO：3的氨基酸位置编号)被N ε-FMOC赖氨酸残基取代。用DMF中的20%哌啶处理完全N末端BOC保护的肽30分钟以去除FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的经FMOC保护的间隔基氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH₃(CH₂)₁₄-COOH)与DMF/DIEA中的PyBOP或DEPBT偶联试剂偶联来实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。随后去除间隔基氨基酸的FMOC基团，随后与在脂肪酸尾末端用保护性氨基酸诸如FmocNH-(CH₂)₁₁-COOH官能化的酰基链偶联。用DMF中的20%哌啶处理所得单酰化氨基酸以去除FMOC保护基团，随后与酰基链偶联。用100% TFA最终处理导致去除任何侧链保护基团和N末端BOC基团。将肽树脂用5% DIEA/DMF中和，干燥，然后在0℃下使用95:5的HF/对甲酚从支持物裂解一小时。在乙醚萃取后，使用5% HOAc溶液将粗肽溶剂化。然后通过ESI-MS证实溶液样品含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC使用10% CH3CN/0.1% TFA至100% CH3CN中的0.1% TFA的线性梯度纯化正确的肽。使用Vydac C18 22mm x 250mm蛋白柱用于纯化。通过20：80的缓冲液比率，酰化肽类似物通常完成洗脱。将各部分合并在一起且在分析型RP-HPLC上检查纯度。将纯级分冻干，得到白色固体肽。

在两个位点或一个位点双重酰化的情况下，待偶联至肽的两个酰基链可相同或不同。在两个不同酰基链的情况下，待酰化的目标氨基酸被两个不同保护基团取代。例如，N ε-FMOC赖氨酸残基和N ε-ivDde赖氨酸残基(两个位点双重酰化)或FMOC Lys(ivDde)-OH(单一位点双重酰化，852082 Novabiochem)。用DMF中的20%哌啶处理完全N末端BOC保护的肽30分钟以去除FMOC/甲酰基。使游离ε-氨基Lys残基与酰基或间隔基氨基酸偶联，随后偶联至酰基。用2%肼/DMF处理所得单酰化肽以去除(ivDde)保护基团。使游离氨基Lys残基与酰基或间隔基氨基酸偶联，随后偶联至酰基。如上所述分离双重酰化肽。

双重酰化肽(胰高血糖素Aib2 E16 A18 L27 D28 Cex K40(C16γE-K-γEC12)G41-酰胺，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：211)的实例合成显示于图5B中且进一步描述于下文：

将0.28克(0.2毫摩尔)mbha树脂(Midwest Biotech)置于反应容器中且使用DEPBT/DIEA活化的Boc氨基酸的单一偶联在CSBio336合成仪上装配以下序列。

树脂

将Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器且在室温下用20%哌啶/DMF处理10分钟。过滤树脂，用DMF洗涤3次，且添加Fmoc Lys(ivDde)-OH的活化溶液(EMD-Novabiochem)(先前通过将2毫摩尔Fmoc Lys(ivDde)溶解于4.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.35ml(2毫摩尔)DIEA来制备)。

肽树脂在室温下混合16小时，然后过滤，用DMF洗涤且用20%哌啶/DMF处理10分钟。过滤树脂，用DMF洗涤几次，且添加Fmoc Glu-OBzl的活化溶液(先前通过将2毫摩尔Fmoc Glu-OBzl溶解于4.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.35ml DIEA来制备)。反应物在室温下混合1小时，然后过滤且用DMF洗涤树脂。再次用20%哌啶/DMF处理后，用DMF洗涤树脂几次，且添加棕榈酸的活化溶液以完成位置40的侧链Lys的α-胺的酰化(先前通过将2毫摩尔棕榈酸溶解于4.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.35ml DIEA来制备)。将反应物混合1小时。

将肽树脂过滤，用DMF洗涤且在室温下用2%肼/DMF处理15分钟，然后过滤且用DMF洗涤几次。添加Fmoc Glu-OBzl的活化溶液(与上文相同)且反应物在室温下混合1小时。将树脂分成三部分以对ε-赖氨酸胺进行最终酰化。在这种情况下，向一部分中添加十二烷酸的活化溶液。其先前通过将1毫摩尔十二烷酸(Aldrich)溶解于2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.175ml DIEA来制备。将反应物混合1小时，过滤，用DMF洗涤，然后用二氯甲烷洗涤。在用50% TFA/DCM处理后去除N末端Boc基团，且在用5% DIEA/DCM中和后，使用对甲酚作为清除剂在冰浴中进行HF裂解持续1小时。在HF蒸发后，将残余物悬浮于乙醚中且过滤肽/树脂混合物并用乙醚洗涤。将肽萃取入乙酸水溶液中且在HPLC(4.6x50mm Zorbax SB-C8，1ml/min，45℃，214nm(0.5A)A=0.1% TFA，B=0.1% TFA/90% ACN)上分析。将剩余裂解萃取物上样于21.2x250mm Amberchrom XT20柱上且在Pharmacia FPLC上运行0.1% TFA/乙腈梯度用于纯化。

将级分83-86合并，冷冻且冻干，得到22.3mg的SEQ ID NO：211的肽，纯度为90%+。理论分子量=5202.9，ESI观察质量=5202.0。

经由琥珀酰化的肽酰化

如下制备琥珀酰化肽。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems 430A肽合成仪在固体支持树脂上合成肽。如Schnolzer等人，Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)所述使用原位中和化学。对于琥珀酰化肽，待酰化的目标氨基酸残基(例如，位置10，相对于SEQ ID NO：3的氨基酸位置编号)被N ε-FMOC赖氨酸残基取代。用DMF中的20%哌啶处理完全N末端BOC保护的肽10分钟以去除FMOC/甲酰基。过滤树脂，用DMF/DCM洗涤且再次悬浮于DCM中。通过使10倍摩尔过量的正十六烷基琥珀酸酐(TCl)与4-二甲基氨基吡啶一起偶联来实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。将树脂混合过夜，过滤，用DCM洗涤且用50% TFA/DCM处理以去除任何侧链保护基团和N末端BOC。将肽树脂用5% DIEA/DMF中和，干燥，然后在0℃下使用95:5的HF/对甲酚从支持物裂解一小时。在乙醚萃取后，使用5% HOAc溶液将粗肽溶剂化。然后通过HPLC分析证实溶液样品。将剩余乙酸溶液上样于10x250mm Amberchrom XT20柱上用于纯化。运行含水TFA/ACN梯度，同时收集级分且监测214nm下的UV。冻干纯级分，得到固体肽。

琥珀酰化肽(胰高血糖素Aib2 E16 A18 L27 D28 Cex K40(C16琥珀酰基)G41-酰胺，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：156)的实例合成显示于图3C中且进一步描述于下文：

将0.28克(0.2毫摩尔)mbha树脂(Midwest Biotech)置于反应容器中且使用DEPBT/DIEA活化的单一偶联在CSBio336合成仪上装配以下序列。

树脂

将约三分之一的Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器且在室温下用20%哌啶/DMF处理10分钟。过滤树脂，用DMF洗涤3次，用二氯甲烷洗涤两次且再次悬浮于10ml DCM中。添加324mg(1毫摩尔)正十六烷基琥珀酸酐(TCI)以及2-3mg的4-二甲基氨基吡啶(Aldrich)。

将树脂在室温下混合过夜，然后过滤，用DCM洗涤两次，且用50% TFA/DCM处理1-2分钟。过滤树脂，用DCM洗涤几次，通过用5% DIEA/DCM洗涤中和且转移至HF反应容器。使用5ml液态氟化氢和0.5ml对甲酚清除剂进行HF裂解。在冰浴中搅拌1小时后，在真空中去除HF且将残余物悬浮于乙醚中。使用烧结玻璃漏斗过滤悬浮液，用乙醚洗涤固体，且将肽萃取入15ml 50%乙酸水溶液中。在HPLC(4.6x50mm Zorbax SB-C8，1ml/min，45℃，214nm，A=0.1% TFA，B=0.1% TFA/90% ACN，梯度=30% B至90% B，经10分钟)上分析后，将裂解萃取物上样于21.2x250mm Amberchrom XT20柱上用于纯化。运行含水TFA/乙腈梯度，同时收集级分且监测UV吸光度。级分55-56经鉴定为单一组分且冷冻并冻干。回收到32.5mg，其纯度为90%+(DLS-027-68B)。理论分子量=4720.3，ESI观察质量=4717.0。

肽烷基化 ( 例如 S- 烷基化 )

烷基化(例如S-烷基化)肽(胰高血糖素Aib2 E16 A18 L27 D29 Cex Cys40(S-2棕榈基)酰胺，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：164)的实例合成显示于图6中且进一步描述于下文：

将0.28克0.2毫摩尔mbha树脂(Midwest Biotech)置于CSBio反应容器中且使用Boc氨基酸和DEPBT/DIEA活化的单一偶联在CSBio336合成仪上装配以下序列。

酰胺

将肽树脂转移至HF反应容器且使用10ml液态氟化氢和1ml对甲酚清除剂在冰浴中进行HF裂解持续1小时。蒸发HF之后，将残余物悬浮于乙醚中且将肽和树脂过滤至烧结玻璃漏斗中。用乙醚洗涤且快速风干之后，将肽萃取至50%乙酸水溶液中。经由HPLC(4.6x50mm Zorbax SB-C8，1ml/min，45℃，214nm，A=0.1% TFA，B=0.1% TFA/90% ACN，30%至90% B，经10分钟)分析后，裂解萃取物以水稀释3-4倍且上样于22.2x250mm Amberchrom XT20柱上用于使用含水TFA/ACN梯度进行纯化。初始合并物经同一柱再次纯化，得到79mg(纯度95%)。理论分子量=4313.7，ESI观察质量=4312.0。

将16mg(3.7微摩尔)上述游离巯基肽悬浮于1ml甲醇中且在搅拌下在氮气流下添加1ml甲醇(MeOH)中的1.5μl四甲基胍，随后添加0.5mg四氢呋喃(THF)中的3mg(7.8微摩尔)2-碘十六烷酸(2-碘棕榈酸)。2-碘十六烷酸先前通过用丙酮中的碘化钾(DLS-027-52)处理2-溴十六烷酸来制备。烷基化反应物在浴槽中升温10分钟，在此期间大部分溶剂蒸发。将残余物溶解于乙酸水溶液中，通过HPLC分析且发现比起始肽疏水性更大。将剩余乙酸溶液上样于10x250mm Amberchrom XT20柱上用于纯化。运行含水TFA/ACN梯度，同时收集级分且监测214nm下的UV。将级分64-68合并，冷冻且冻干，得到6.1mg物质(SEQ ID NO：164的肽)，其纯度为90%+。理论分子量=4568.1，MALDI观察质量=4568.79。

当肽在C末端包含Lys残基以替代Cys残基时，肽可首先制备具有骨架Lys。待N-烷基化的目标氨基酸残基被N ε-FMOC赖氨酸残基取代。用DMF中的20%哌啶处理完全N末端BOC保护的肽30分钟可从Lys残基去除FMOC/甲酰基。使Cys残基与游离ε-氨基Lys残基偶联。然后通过与如上所述的2-碘棕榈酸反应将Cys残基烷基化。

用“微型 PEG ”间隔基的肽酰化

经由微型PEG间隔基合成酰化肽(具有氨基酸序列SEQ ID NO：89的肽)的实例描述于下文：

将0.28克(0.2毫摩尔)4-甲基二苯甲基胺(mbha)树脂(Midwest Biotech, Inc., Fishers,IN)置于反应容器中且使用Boc氨基酸和3-(二乙氧基磷酰氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮/N,N-二异丙基乙胺(DEPBT/DIEA)活化的单一偶联在CSBio336合成仪上装配以下序列。

将约三分之一的Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器且在室温下用20%哌啶/二甲基甲酰胺处理10分钟。过滤树脂，用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤几次且添加Fmoc酰胺基PEG4的活化溶液(先前通过将487.5mg 1.0毫摩尔N-Fmoc酰胺基dPEG4酸(Peptides International, Louisville, KY)溶解于2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.175ml 1毫摩尔二异丙基乙胺来制备)。反应物在室温下混合约1小时。

将肽树脂过滤，用DMF洗涤，且再次用20%哌啶/DMF处理10分钟。过滤树脂，用DMF洗涤几次，且添加Fmoc Glu-OBzl的活化溶液(先前通过将470mg 1毫摩尔的Fmoc Glu-γ-OBzl(Aapptec, Louisville, KY)溶解于2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.175ml 1毫摩尔DIEA来制备)。反应物在室温下混合1小时。

再次过滤肽树脂，用DMF洗涤，且在室温下用20%哌啶/DMF处理10分钟。过滤树脂，用DMF洗涤几次，且添加棕榈酸的活化溶液(先前通过将256mg 1毫摩尔棕榈酸(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)溶解于2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.175ml DIEA来制备)。反应物在室温下混合1小时。

最后，过滤肽树脂，用DMF洗涤，随后用二氯甲烷洗涤且用50% TFA/DCM处理以去除N末端Boc基团。1-2分钟后，过滤树脂，用DCM洗涤几次，随后用5% DIEA/DCM溶液洗涤。将风干的肽树脂转移至HF反应容器且使用5ml液态氟化氢和0.5ml对甲酚清除剂进行HF裂解。在冰浴中混合1小时之后，在真空中去除HF且将残余物悬浮于乙醚中。在烧结玻璃漏斗中过滤肽/树脂混合物，用乙醚洗涤，且快速风干。将肽萃取至10ml 50%乙酸水溶液中，通过HPLC(4.6x50mm Zorbax SB-C8，1ml/min，214nm，A=0.1% TFA，B=0.1% TFA/90% ACN，梯度=30% B至90% B，经10分钟)分析。剩余粗萃取物以水稀释3倍且上样于22.2x250mm Amberchrom XT20柱上用于使用含水TFA/ACN梯度进行纯化。初始纯化合并物经同一柱再次纯化，得到19mg产物，其纯度为90%+。理论质量=5010.6，ESI观察质量为5008.0。

使用不同的N-Fmoc酰胺基dPEG酸重复相同程序。在一种情况下使用N-Fmoc酰胺基dPEG8酸(Peptides International, Louisville, KY)且在另一情况下使用N-Fmoc酰胺基dPEG2酸(Peptides International, Louisville, KY)。酰化肽的结构显示于图12A-12C中。

肽二聚合 - 二硫化物二聚合

二硫化物二聚体肽的实例合成描述于下文：

将0.28克(0.2毫摩尔)mbha树脂(Midwest Biotech)置于CSBio反应容器中且使用Boc氨基酸和DEPBT/DIEA活化的单一偶联在CSBio336合成仪上装配以下序列。

酰胺

将Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器且在室温下用20%哌啶/DMF处理10分钟。过滤树脂，用DMF充分洗涤，然后用Fmoc Cys(Trt)活化溶液(先前通过将1.17克2毫摩尔Fmoc Cys(Trt)-OH(Aapptec)溶解于4.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.35ml 2毫摩尔二异丙基乙胺来制备)酰化。反应物在室温下混合2小时，然后过滤，用DMF洗涤且使用相同程序添加Fmoc Glu-OBzl和随后的棕榈酸。

最后，过滤树脂，用DMF洗涤，用二氯甲烷洗涤，且用50% TFA/DCM处理1-2分钟。用5% DIEA/DCM中和之后，将肽树脂转移至HF反应容器且使用10ml液态氟化氢和1ml对甲酚清除剂在冰浴中进行HF裂解持续1小时。蒸发HF之后，将残余物悬浮于乙醚中且将肽和树脂过滤至烧结玻璃漏斗中。用乙醚洗涤且快速风干之后，将肽萃取至50%乙酸水溶液中。经由HPLC(4.6x50mm Zorbax SB-C8，1ml/min，45℃，214nm，A=0.1% TFA，B=0.1% TFA/90% ACN，30%至90% B，经10分钟)分析后，裂解萃取物以水稀释3-4倍且上样于21.2x250mm Amberchrom XT20柱上用于使用含水TFA/乙腈梯度进行纯化。将纯化级分64-67合并，冷冻且冻干，得到58.7mg物质，HPLC纯度为90%+。

DLS-027-97A 理论分子量=4866.48，ESI观察质量=4864.0。

酰胺

将18.6mg(3.8微摩尔)上述肽溶解于2.0ml 3M胍/0.05M tris(pH 8.5)中且添加1ml二甲亚砜。在室温下在暴露于空气下搅拌反应物。6小时后，与起始肽相比的分析型HPLC显示存在疏水性更大的峰。

反应混合物以20ml 0.1% TFA稀释且上样于10x250mm Amberchrom XT20柱上。使用0.1% TFA/乙腈梯度进行纯化，同时监测220nm下的UV吸光度。将级分68-72合并并冻干，得到5.5mg经纯化的二聚体。

HPLC纯度为90%+。理论分子量=9743.99，MALDI观察质量=9745.1。DLS-027-98B。所得二聚体的结构显示于图9A中。

肽二聚合 - 硫醚二聚合

硫醚二聚体的实例合成描述于下文：

将三分之一的Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器且在室温下用20%哌啶/DMF处理10分钟。用DMF洗涤几次之后，添加Boc Dap(Fmoc)活化溶液(先前通过将426mg 1毫摩尔Boc Dap(Fmoc)-OH(Chem-Impex)溶解于2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.175ml 1毫摩尔DIEA来制备)。反应物在室温下混合2小时，过滤，用DMF洗涤且如上文用20%哌啶/DMF再次处理。用DMF洗涤之后，用溴乙酸活化溶液(先前通过将139mg 1毫摩尔溴乙酸(Aldrich)溶解于2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中且添加0.175ml DIEA来制备)酰化树脂。反应物在室温下混合1-2小时，然后过滤且用DMF和随后的DCM洗涤树脂。在室温下用50% TFA/DCM处理肽树脂2分钟，然后过滤，用DCM洗涤且用5% DIEA/DCM中和。将完成的肽树脂转移至HF反应容器且使用5ml液态氟化氢/0.5ml对甲酚进行HF裂解。在冰浴中搅拌1小时后，蒸发HF且将残余物悬浮于乙醚中。将树脂/肽混合物过滤至烧结玻璃漏斗中且用乙醚洗涤。将肽萃取至50%乙酸水溶液中且经由HPLC分析粗产物：4.6x50mm Zorbax SB-C8，1ml/min，45℃，214nm，A=0.1% TFA，B=0.1% TFA/90% ACN，梯度=30% B至90% B，经10分钟。将裂解萃取物上样于21.2x250mm Amberchrom XT20柱上且使用含水TFA/乙腈梯度进行纯化，同时监测220nm下的UV吸光度。将级分48-53合并，冷冻且冻干，得到18mg具有K40(Dap-Br乙酰基)的SEQ ID NO：89的肽，纯度=90%+。理论分子量=4602.8，ESI观察质量=4616.0。

乙酰基)G-酰胺

将15mg(3.2微摩尔)的上述K40(Dap-Br乙酰基)肽和15mg SEQ ID NO：89的肽K40(Cys γE-C16)溶解于3.0ml 7M脲/0.05M tris(pH 8.6)中且在室温下混合，同时监测反应进程的HPLC。30分钟后，大部分起始物质的峰高降低，同时新峰为主要组分。反应混合物以25ml 0.1% TFA稀释且上样于10x250mm Amberchrom XT20柱上用于纯化。运行含水TFA/乙腈梯度，同时监测220nm下的UV吸光度。将级分57-61合并，冷冻且冻干，得到7.1mg硫醚二聚体。HPLC纯度=90%+，理论分子量=9401.4，MALDI观察质量=9402.8。二聚体的结构显示于图9B中。

肽聚乙二醇化

对于肽聚乙二醇化，使用将肽与PEG两者溶解成澄清溶液所需的最少量的溶剂(对于使用2-3mg肽的反应，通常小于2mL)，使40kDa甲氧基聚(乙二醇)碘乙酰胺(NOF)与一摩尔当量的肽在7M脲、50mM Tris-HCl缓冲液中反应。在室温下开始剧烈搅拌持续4-6小时且通过分析型RP-HPLC分析反应。随着保留时间减少，聚乙二醇化产物显得与起始物质显著不同。在Vydac C4柱上在与初始肽纯化所用条件类似的条件下进行纯化。在缓冲液比率为50：50附近进行洗脱。发现纯聚乙二醇化肽的级分且将其冻干。产率高于50%，对于每个反应有所不同。

使用质谱法的分析

使用具有标准ESI离子源的Sciex API-III电喷雾四极质谱仪获得质谱。所用电离条件如下：ESI为正离子模式；离子喷雾电压，3.9kV；孔电位，60V。所用喷雾和气帘气体为氮气，流速为.9L/min。在每步0.5 Th和2msec停留时间下从600-1800汤普森(Thompsons)记录质谱。将样品(约1mg/mL)溶解于含1%乙酸的50%乙腈水溶液中且通过外部注射泵以5μL/min的速率引入。

当通过ESI MS在PBS溶液中分析肽时，根据制造商(Millipore Corporation, Billerica, MA，参见万维网(world wide web)上Millipore网站的millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737)所提供的说明书，首先使用含0.6μL C4树脂的ZipTip固相萃取尖端将肽脱盐。

高效液相层析 (HPLC) 分析：

使用高效液相层析(HPLC)和MALDI分析，使用这些粗肽进行初步分析以得到其在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.2)中的相对转化率的近似值。将粗肽样品以1mg/ml的浓度溶解于PBS缓冲液中。将1ml所得溶液储存在1.5ml HPLC小瓶中，然后将该小瓶密封且在37℃下孵育。以各种时间间隔取出100μl等分试样，冷却至室温且通过HPLC分析。

使用Beckman System Gold层析系统使用UV检测器在214nm下进行HPLC分析。在150mmx4.6mm C18 Vydac柱上进行HPLC分析。流速为1ml/min。溶剂A含蒸馏水中的0.1% TFA，且溶剂B含90% CH3CN中的0.1% TFA。采用线性梯度(15分钟内40%至70% B)。收集数据且使用Peak Simple Chromatography软件分析。

使用初始水解速率来测量各前药的解离速率常数。分别根据其峰面积估算前药和药物的浓度。通过绘制在各种时间间隔下前药浓度的对数来测定前药的一级解离速率常数。该曲线的斜率给出速率常数‘k’。然后通过使用式t1/2=.693/k来计算各种前药的降解半衰期。

实施例2

本实施例描述测试本公开肽的生物活性的示例性方法，该方法涉及测定cAMP合成。

在基于萤火虫荧光素酶的报道分子测定法中测量胰高血糖素类似物诱导cAMP的能力。通过在补充有0.25%牛生长血清(Bovine Growth Serum)(HyClone, Logan, UT)的DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)中培养16小时将用受体(胰高血糖素受体、GLP-1受体或GIP受体)与连接至cAMP反应元件的荧光素酶基因共转染的HEK293细胞进行血清耗尽且随后在37℃、5% CO₂下在聚-D-赖氨酸包被的96孔“Biocoat”板(BD Biosciences, San Jose, CA)中与胰高血糖素、GLP-1、GIP或新颖胰高血糖素类似物的连续稀释液一起孵育5小时。在孵育结束时，将100微升LucLite发光底物试剂(Perkin Elmer, Wellesley, MA)添加至各孔中。短暂震荡该板，在黑暗中孵育10分钟，且在MicroBeta-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)上测量光输出。通过使用Origin软件(OriginLab, Northampton, MA)来计算有效50%浓度。

实施例3

本实施例描述测定本公开肽的稳定性的示例性方法。

将各胰高血糖素类似物溶解于水或PBS中且进行初始HPLC分析。调节pH(4、5、6、7)之后，在37℃下经指定时间段孵育样品且通过HPLC再次分析以测定肽的完整性。测定特定目标肽的浓度且计算相对于初始分析的剩余完整性百分比。

实施例4

本实施例描述测定肽的溶解性的示例性方法。

在0.01N HCl中制备胰高血糖素(或类似物)的溶液(1mg/ml或3mg/ml)。用0.01N HCl将100μl储备溶液稀释至1ml且测定UV吸光度(276nm)。使用200-250ul 0.1M Na₂HPO₄ (pH9.2)将剩余储备溶液的pH调节至pH 7。使溶液在4℃下静置过夜，然后离心。然后用0.01N HCl将100μl上清液稀释至1ml，且测定UV吸光度(一式两份)。

针对体积增加补偿初始吸光度读数且使用以下计算来确定溶解百分比：

。

实施例5

本实施例描述测定肽与受体的结合的示例性方法。

利用闪烁接近测定技术在竞争结合测定法中测量肽与胰高血糖素受体的亲和力。将在闪烁接近分析缓冲液(0.05M Tris-HCl(pH 7.5)、0.15M NaCl、0.1% w/v牛血清白蛋白)中制备的肽的连续3倍稀释液与0.05 nM (3-[¹²⁵I]-碘酪氨酰基)Tyr10胰高血糖素(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)、每孔1-6微克由过表达人胰高血糖素受体的细胞制备的质膜片段和1 mg/孔聚乙二亚胺处理的麦胚芽凝集素A型闪烁接近测定珠粒(Amersham Biosciences Piscataway, NJ)一起混合于96孔白色/透明底板(Corning Inc., Acton, MA)中。在旋转震荡器上在800 rpm下震荡5分钟之后，将板在室温下孵育12小时且然后在MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)上读取。在具有浓度为测试样品中最高浓度的4倍的“冷”天然配体的孔中测量非特异性结合(NSB)放射性，且在不具有竞争剂的孔中检测总结合放射性。特异性结合百分比计算如下：%特异性结合=((结合-NSB)/(总结合-NSB)) X 100。通过使用Origin软件(OriginLab, Northampton, MA)测定IC₅₀值。

实施例6

对SEQ ID NO：10的肽和SEQ ID NO：11的肽中的每一种分析化学不稳定性点。设计各肽的类似物以增强化学稳定性，合成且基本上如实施例2中所述体外测试其针对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体各自的激动剂活性。

针对GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GR)和GIP受体(GIPR)的EC50提供于表1中。

实施例7

基本上如实施例1中所述制备SEQ ID NO：18的类似物且基本上如实施例2中所述体外测试其针对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体各自的激动剂活性：针对GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GR)和GIP受体(GIPR)的EC50提供于表2中。

实施例8

基本上如实施例1中所述制备位置3变化的SEQ ID NO：18的类似物且基本上如实施例2中所述体外测试其针对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体各自的激动剂活性：针对GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GR)和GIP受体(GIPR)的EC50提供于表3中。

Hse=高丝氨酸；NorVal=正缬氨酸；Met(O)=甲硫氨酸亚砜；乙酰基Orn=N-乙酰基鸟氨酸，其中侧链氮被乙酰化；乙酰基Dab=N-乙酰基二氨基丁酸，其中侧链氮被乙酰化；乙酰基Lys=N-乙酰基赖氨酸，其中侧链氮被乙酰化；Met(O)₂=甲硫氨酸砜。

实施例9

基本上如实施例1中所述制备位置3变化的SEQ ID NO：43的类似物且基本上如实施例2中所述体外测试其针对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体各自的激动剂活性：针对GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GR)和GIP受体(GIPR)的EC50提供于表4中。

实施例10

通过向已敲除或未敲除编码GLP-1受体的基因的DIO小鼠皮下施用10nmol/kg肽或媒介物对照来评估表3的所选肽的体内作用。每周三次(周一、周三和周五)施用肽，持续2周。向小鼠给予高脂肪饮食且各组小鼠每组含有8只动物。平均体重为~52 g且小鼠为~ 8个月龄雄性。

在向小鼠施用肽或媒介物对照当天测量体重和食物摄入。每周一次在第0天、第7天和第14天测量空腹血糖水平(6小时空腹期)。一些结果显示于图1中。

如图1中所示，所测试的肽(SEQ ID NO：10的肽、SEQ ID NO：29的肽和SEQ ID NO：18的肽)至第10天在未敲除GLP-1受体基因的DIO小鼠中各引起至少10%体重降低且体重减轻持续至第14天。

实施例11

通过向DIO小鼠皮下施用10 nmol/kg肽或媒介物对照来评估表3和4的所选肽的体内作用。每周三次(周一、周三和周五)施用肽，持续2周。向小鼠给予致糖尿病饮食且各组小鼠每组含有8只动物。平均体重为~50 g且小鼠为~ 6个月龄雄性。

在向小鼠施用肽或媒介物对照当天测量体重和食物摄入。在第0天和第14天分析身体组成。每周一次在第0天、第7天和第14天测量空腹血糖水平。来自该研究的数据显示于图2-5中。

实施例12

基本上如实施例1中所述制备SEQ ID NO：10的类似物且基本上如实施例2中所述体外测试其针对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体各自的激动剂活性：针对GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GR)和GIP受体(GIPR)的EC50提供于表2中。

本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)通过引用并入本文，其程度如同各参考文献单独地和明确地通过引用并入且全文描述于本文一样。

除非本文另外指出或明确与上下文有矛盾，否则在阐述本发明上下文(尤其是在所附权利要求书的上下文)中术语“一个”和“一种”和“该”及类似涉及对象的使用，应理解为既包括单数又包括复数。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放性术语(即意味着“包括但不限于”)。

除非本文另外指出，否则本文数值范围的列举仅意图作为对单独提及每一个落入所述范围的单独值及每一个端点的速记方法，并且本说明书包括每一个单独值及每一个端点，如同其在本文被单独列举一样。

除非本文另外指出或另外明确与上下文有矛盾，否则可以以任何合适的次序来实施本文所述的所有方法。除非另外声明，否则本文提供的任何及所有实施例或示例性语言(例如“例如”)的应用仅意图更好地阐明本发明，并非对本发明的范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应该理解为表明任何未要求保护的要素对实施本发明是必要的。

本发明的优选实施方案如本文所述，包括本发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读了前述说明后，本领域普通技术人员可明确这些优选实施方案的变化。本发明人预期技术人员恰当利用所述变化，并且本发明人预期本发明除了如本文所明确阐述那样实施外还能另外实施。因此，如适用法律所允许那样，本发明包括所附权利要求书所列举主题的所有修改及等同方案。此外，除非本文另外指出或另外明确与上下文有矛盾，否则本发明包括上述要素以其所有可能变化的任何组合。

Claims

1.肽，其包含：

(a) 序列

HX₂X₃GTFTSDX₁₀SKYLX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁FVQWLX₂₇X₂₈X₂₉X₃₀PSSGX₃₅PPPS

(SEQ ID NO: 66)

其中，当X₂₈为Asp时，则X₂₉不是Gly；

其中：

X₂为AIB；

X₃为Gln或结构I、II或III的氨基酸；

X₁₀为Tyr或共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅为酸性氨基酸，任选地为Glu或Asp；

X₁₆为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；例如，Glu、Ala、α,α-双取代氨基酸(例如AIB)、His、Lys、Glu，

X₁₇为Arg、His、Gln；

X₁₈为Arg或Ala；

X₁₉为Ala或α,α双取代氨基酸；

X₂₀选自：α,α-双取代氨基酸(例如AIB)或Gln或His、Lys或Ala；

X₂₁为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；

X₂₇为Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；

X₂₉为脂肪族的，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀为小脂肪族氨基酸，例如，Ala或Gly

X₃₅为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；

其中，当X₂₈为酸性氨基酸时，X₃₅为碱性氨基酸；

其中，当X₁₀为Tyr时，所述肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，所述肽在位置41包含Gly，

其中所述肽的C末端氨基酸被酰胺化；

或

(b) 相对于SEQ ID NO：66具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66，其中所述肽展现针对人GIP受体、人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。

2.权利要求1的肽，其中X₁₀为共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸。

3.权利要求1或2的肽，其中X₂₈为Glu。

4.权利要求3的肽，其中X₁₅为Glu和/或X₂₁为Glu。

5.权利要求4的肽，其在位置15、21和28中的每一位置包含Glu。

6.权利要求1至5中任一项的肽，其中X₁₈为Ala且X₁₉为Ala。

7.权利要求1至6中任一项的肽，其中X₂₀为α,α-双取代氨基酸。

8.权利要求7的肽，其中所述α,α-双取代氨基酸为AIB。

9.权利要求1至8中任一项的肽，其中X₁₆为Glu、Ala、AIB、His或Lys；X₁₇为Arg、His或Gln，且X₂₁为Glu。

10.权利要求1至6和9中任一项的肽，其中X₂₀为Lys或His。

11.权利要求1至4、6至8和10中任一项的肽，其中X₁₆为Glu，X₁₇为Arg，且X₂₁为Asp。

12.权利要求1至5和7至11中任一项的肽，其中X₁₈为Ala且X₁₉为α,α-双取代氨基酸。

13.权利要求12的肽，其中所述α,α-双取代氨基酸为AIB。

14.权利要求12或13的肽，其中X₁₆为Glu，X₁₇为Arg，且X₂₁为Glu。

15.权利要求14的肽，其中X₂₀为Ala或Lys。

16.权利要求1至15中任一项的肽，其中X₂₉为Ala、Gly、Val或α,α-双取代氨基酸，任选地为AIB。

17.权利要求1的肽，其在位置10包含Tyr且在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸。

18.权利要求17的肽，其在位置41包含Gly。

19.权利要求17或18的肽，其中X₉或X₁₅为Glu。

20.权利要求1至19中任一项的肽，其中所述酰基或烷基连接至包含式I、式II或式III的结构的氨基酸。

21.权利要求20的肽，其中所述式I的氨基酸为Lys。

22.权利要求1至21中任一项的肽，其中所述酰基或烷基经由间隔基连接至所述肽的氨基酸。

23.权利要求22的肽，其中所述间隔基为二肽的氨基酸。

24.权利要求23的肽，其中所述间隔基为一个或两个酸性氨基酸残基。

25.权利要求1至24中任一项的肽，其中X₃为Gln或乙酰基二氨基丁酸或乙酰基Lys或乙酰基鸟氨酸或甲硫氨酸亚砜。

26.权利要求1至25中任一项的肽，其包含位置27的Leu、位置29的Gly和C末端至位置29的Gly的GPSSGAPPPS。

27.权利要求1至26中任一项的肽，其包含以下中的任一种的序列：SEQ ID NO: 15-28、34、36、39、42、43、44、52、53、63-65、283-296、302、304、307、310、311、312、320、321、330-332、516-529、535、537、540、543、544、545、553、554、和563-565。

28.权利要求1至27中任一项的肽，其包含相对于SEQ ID NO：66具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66，其中当X₂₈为Asp时，X₂₉不是Gly。

29.权利要求1至28中任一项的肽，其包含相对于SEQ ID NO：66具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66，其中(i) X₁为包含侧链咪唑的氨基酸，(ii) X₂为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，(iii)所述肽的C末端氨基酸被酰胺化，和(iv)当X₁₀为Tyr时，所述肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，所述肽在位置41包含Gly。

30.肽，其包含：

(a) 序列

X₁X₂X₃GTFTSDX₁₀SKYLX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁FVQWLX₂₇X₂₈X₂₉X₃₀PSSGX₃₅PPPS

(SEQ ID NO: 67)

其中：

X₁为包含侧链咪唑的氨基酸，任选地为His或His衍生物；

X₃选自：Glu、Ala、Leu、Ile、Nle、Val、NorVal、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基-Lys；

X₁₀为共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅为酸性氨基酸，任选地为Glu或Asp；

X₁₆为任何氨基酸，任选地为除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；(例如，Glu、Ala、α,α-双取代氨基酸(例如AIB)、His、Lys)

X₁₇为Arg、His或Gln；

X₁₈为Arg或Ala；

X₁₉为Ala或α,α双取代氨基酸；

X₂₀选自：α,α-双取代氨基酸(例如AIB)或Gln或His、Lys或Ala；

X₂₁为酸性氨基酸，任选地为Asp或Glu；

X₂₇为Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈为Ala或酸性氨基酸(任选地为Asp或Glu)；

X₂₉为脂肪族的，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀为小脂肪族氨基酸，例如，Ala或Gly

X₃₅为Ala或碱性氨基酸(任选地为Arg或Lys)；

其中，当X₂₈为酸性氨基酸时，X₃₅为碱性氨基酸；

任选地，其中，当X₂₈为Asp时，则X₂₉不是Gly

其中所述肽的C末端氨基酸被酰胺化；

或

(b) 相对于SEQ ID NO：67具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67，其中所述肽展现针对人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。

31.权利要求30的肽，其中：

a. X₁为His；

b. X₂为AIB；

c. X₁₆为Glu；

d. X₁₇为Arg；

e. X₁₈为Ala；

f. X₁₉为Ala；

g. X₂₀为Gln；

h. X₂₇为Leu；

i. X₂₉为Gly；

j. X₃₀为Gly；

k. X₃₅为Ala；或

l. 其组合。

32.权利要求30或31的肽，其包含SEQ ID NO：29-42、297-310和530-543中的任一种的序列。

33.权利要求30至32中任一项的肽，其包含相对于SEQ ID NO：67具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67，其在位置3包含选自以下的氨基酸：Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基Lys。

34.权利要求30至33中任一项的肽，其包含相对于SEQ ID NO：67具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：67，其中当X₂₈为Asp时，X₂₉不是Gly。

35.权利要求30至34中任一项的肽，其包含相对于SEQ ID NO：67具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：66，其中(i)X₁为包含侧链咪唑的氨基酸，(ii) X₂为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，(iii)所述肽的C末端氨基酸被酰胺化，和(iv)当X₁₀为Tyr时，所述肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，所述肽在位置41包含Gly。

36.权利要求30至35中任一项的肽，其中：

a. X₁为His；

b. X₂为AIB；

c. X₁₆为Glu；

d. X₁₇为Arg；

e. X₁₈为Ala；

f. X₁₉为Ala；

g. X₂₀为Gln；

h. X₂₇为Leu；

i. X₂₉为Gly；

j. X₃₀为Gly；

k. X₃₅为Ala；或

l. 其组合。

37.肽，其包含序列SEQ ID NO：18。

38.肽，其基本上由序列SEQ ID NO：18组成或由序列SEQ ID NO：18组成。

39.肽，其包含序列SEQ ID NO：43。

40.肽，其基本上由序列SEQ ID NO：43组成或由序列SEQ ID NO：43组成。

41.肽，其包含相对于SEQ ID NO：18具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：18或相对于SEQ ID NO：43具有多至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO：43，其中所述肽展现针对人GIP受体和人GLP-1受体的激动剂活性。

42.权利要求41的肽，其在位置3包含选自以下的氨基酸：Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基Lys。

43.权利要求41或42的肽，其中当X₂₈为Asp时，X₂₉不是Gly。

44.权利要求41至43中任一项的肽，其中(i)位置1的氨基酸为包含侧链咪唑的氨基酸，(ii)位置2的氨基酸为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，(iii)所述肽的C末端氨基酸被酰胺化，和(iv)当位置10的氨基酸为Tyr时，所述肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，所述肽在位置41包含Gly。

45.权利要求41至44中任一项的肽，其中：

a.位置1的氨基酸为His；

b.位置2的氨基酸为AIB；

c.位置16的氨基酸为Glu；

d.位置17的氨基酸为Arg；

e.位置18的氨基酸为Ala；

f.位置19的氨基酸为Ala；

g.位置20的氨基酸为Gln；

h.位置27的氨基酸为Leu；

i.位置29的氨基酸为Gly；

j.位置30的氨基酸为Gly；

k.位置35的氨基酸为Ala；或

l.其组合。

46.肽，其包含SEQ ID NO：100-282和333-515中的任一种的序列。

47.肽，其包含具有一个、两个或三个氨基酸修饰的SEQ ID NO：100-282和333-515中的任一种的序列，其中所述肽展现针对人GIP受体、人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。

48.权利要求47的肽，其在位置3包含选自以下的氨基酸：Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基Lys。

49.权利要求47或48的肽，其中当X₂₈为Asp时，X₂₉不是Gly。

50.权利要求47至49中任一项的肽，其中(i)位置1的氨基酸为包含侧链咪唑的氨基酸，(ii)位置2的氨基酸为DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸，(iii)所述肽的C末端氨基酸被酰胺化，和(iv)当位置10的氨基酸为Tyr时，所述肽在位置40包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且任选地，所述肽在位置41包含Gly。

51.权利要求47至50中任一项的肽，其中：

a.位置1的氨基酸为His；

b.位置2的氨基酸为AIB；

c.位置16的氨基酸为Glu；

d.位置17的氨基酸为Arg；

e.位置18的氨基酸为Ala；

f.位置19的氨基酸为Ala；

g.位置20的氨基酸为Gln；

h.位置27的氨基酸为Leu；

i.位置29的氨基酸为Gly；

j.位置30的氨基酸为Gly；

k.位置35的氨基酸为Ala；或

l.其组合。

52.胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物，其包含：

a.位置1的包含咪唑侧链的氨基酸，任选地为His；

b.位置2的DPP-IV保护性氨基酸，任选地为AIB；

c.位置9、10、12、20或37-43中的任何位置的酰化氨基酸或烷基化氨基酸，任选地其中酰基或烷基经由间隔基连接至氨基酸；

d.位置20的选自以下的氨基酸：

(i)α,α-双取代氨基酸；和

(ii)包含咪唑侧链的氨基酸；

和

e.相对于SEQ ID NO：1的多至10个额外氨基酸修饰；

其中，当所述胰高血糖素类似物缺乏亲水性部分时，所述胰高血糖素类似物展现至少0.1%的GIP效价百分比，其中所述胰高血糖素类似物针对人GLP-1受体相比于GIP受体的选择性小于100倍。

53.权利要求52的胰高血糖素类似物，其在位置20包含含有R1和R2的α,α-双取代氨基酸，R1和R2各自键合至α碳，其中R1和R2各自独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1和R2与其所连接的α碳一起形成环。

54.权利要求53的胰高血糖素类似物，其中位置20的所述α,α-双取代氨基酸为AIB。

55.权利要求54的胰高血糖素类似物，其在位置16包含带电荷氨基酸。

56.权利要求55的胰高血糖素类似物，其中所述带电荷氨基酸为带负电荷氨基酸，任选地为Glu。

57.权利要求55的胰高血糖素类似物，其中所述带电荷氨基酸为带正电荷氨基酸，任选地为Lys。

58.权利要求54的胰高血糖素类似物，其在位置16包含小脂肪族氨基酸，任选地为Ala；α,α-双取代氨基酸，任选地为AIB；或含有咪唑侧链的氨基酸，任选地为His。

59.权利要求52的胰高血糖素类似物，其在位置20包含含有咪唑侧链的氨基酸，任选地为His。

60.权利要求59的胰高血糖素类似物，其在位置16包含带负电荷氨基酸，任选地为Glu。

61.权利要求52至60中任一项的胰高血糖素类似物，其在所述胰高血糖素类似物的位置17包含Arg、Gln或含有咪唑侧链的氨基酸，任选地为His。

62.权利要求61的胰高血糖素类似物，其包含位置16的带电荷氨基酸、位置17的His或Gln和位置20的AIB。

63.胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的类似物，其包含：

a.位置3的选自以下的氨基酸：Ala、Leu、Ile、Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met和甲硫氨酸砜；

b.位置9、10、12、16、20或37-43中的任何位置的酰化氨基酸或烷基化氨基酸，任选地其中酰基或烷基经由间隔基连接至氨基酸；

c.位置16-21中的一个或多个位置的α螺旋稳定化氨基酸，和

d.相对于SEQ ID NO：1的多至10个额外氨基酸修饰；

64.权利要求63的胰高血糖素类似物，其在位置1包含含有咪唑侧链的氨基酸。

65.权利要求63或64的胰高血糖素类似物，其在位置2包含DPP-IV保护性氨基酸，任选地为α,α-双取代氨基酸。

66.权利要求63至65中任一项的胰高血糖素类似物，其在位置16包含α螺旋稳定化氨基酸，任选地，其中所述α螺旋稳定化氨基酸为带负电荷氨基酸或α,α双取代氨基酸。

67.权利要求66的胰高血糖素类似物，其中所述带负电荷氨基酸为Glu。

68.权利要求63至67中任一项的胰高血糖素类似物，其在位置17包含Arg且在位置18包含小脂肪族氨基酸，任选地为Ala。

69.权利要求63至68中任一项的胰高血糖素类似物，其中所述类似物相比于SEQ ID NO：1在位置20未经修饰。

70.权利要求63至69中任一项的胰高血糖素类似物，其包含位置16的Glu、位置17的Arg、位置18的Ala、位置19的Ala和位置20的Gln。

71.权利要求52至70中任一项的胰高血糖素类似物，其在位置15、位置21或位置28或其组合包含Glu。

72.权利要求52至62和64至71中任一项的胰高血糖素类似物，其在位置1包含His或His衍生物。

73.权利要求52至62和65至72中任一项的胰高血糖素类似物，其在位置2包含α,α双取代氨基酸。

74.权利要求73的胰高血糖素类似物，其中所述α,α-双取代氨基酸包含R1和R2，其各自键合至α碳，其中R1和R2各自独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤素取代的C1-C4烷基，或R1和R2与其所连接的α碳一起形成环。

75.权利要求74的胰高血糖素类似物，其中位置2的所述α,α-双取代氨基酸为AIB。

76.权利要求52至75中任一项的胰高血糖素类似物，其包含C末端至位置29的氨基酸的1至21个氨基酸的延伸。

77.权利要求76的胰高血糖素类似物，其中位置29的所述氨基酸为Gly。

78.权利要求76或77的胰高血糖素类似物，其中所述延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS (SEQ ID NO：5)或其保守取代序列。

79.权利要求52至78中任一项的胰高血糖素类似物，其中(i)所述酰化或烷基化氨基酸位于位置10或(ii)所述胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1至21个氨基酸的延伸且所述酰化氨基酸或烷基化氨基酸位于位置37-43中的任何位置，任选地位置40。

80.权利要求52至79中任一项的胰高血糖素类似物，其中所述酰化氨基酸的酰基或所述烷基化氨基酸的烷基连接至包含式I的结构的氨基酸(任选地为Lys)、包含式II的结构的氨基酸(任选地Cys)或包含式III的结构的氨基酸(任选地为Ser)，其中式I、II和III各自为：

其中n=1至4

[式I]；

其中n=1至4

[式II]；和

其中n=1至4

[式III]。

81.权利要求52至80中任一项的胰高血糖素类似物，其中所述酰基或烷基经由间隔基连接至所述胰高血糖素类似物的氨基酸。

82.权利要求81的胰高血糖素类似物，其中所述间隔基为一个氨基酸或二肽。

83.权利要求82的胰高血糖素类似物，其中所述间隔基包含一个或两个酸性氨基酸残基。

84.权利要求52至83中任一项的胰高血糖素类似物，其中所述酰化氨基酸或烷基化氨基酸连接至C12至C18脂肪酰基。

85.权利要求84的胰高血糖素类似物，其中所述酰基为C14或C16脂肪酰基。

86.权利要求52至85中任一项的胰高血糖素类似物，其中位置27的所述氨基酸为Leu、Nle、Val或Lys。

87.权利要求52至86中任一项的胰高血糖素类似物，其包含位置28的Glu。

88.权利要求52至86中任一项的胰高血糖素类似物，其包含位置28的Asp，任选地，其中位置29的所述氨基酸为除Gly以外的氨基酸。

89.权利要求88的胰高血糖素类似物，其中位置29的所述氨基酸为Val、Ala或AIB。

90.权利要求52至89中任一项的胰高血糖素类似物，其包含以下一种或多种：

i.位置7的Ile；

ii.位置12的Ile或Arg；

vi.位置18的脂肪族氨基酸，任选地为Ala；

vii.位置21的酸性氨基酸，任选地为Glu；

viii.位置24的Asn、Ala或AIB；

ix.位置27的脂肪族氨基酸，任选地为Ala或Leu或Nle；

x.位置28的酸性氨基酸，任选地为Glu，或脂肪族氨基酸，任选地为Ala；

xi.位置29的脂肪族氨基酸，任选地为Ala；

xii. C末端的酰胺化。

91.权利要求52至62中任一项的胰高血糖素类似物，其包含SEQ ID NO：19、21-26、28、287、289-294、296、520、522-527和529中的任一种的氨基酸序列。

92.权利要求63至71中任一项的胰高血糖素类似物，其包含SEQ ID NO：30、31、32、33、35、37、38、41、298、299、300、301、303、305、306、309、531、532、533、534、536、538、539和542中的任一种的氨基酸序列。

93.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物针对人GLP-1受体相比于GIP受体的选择性小于100倍。

94.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物针对GIP受体的EC50在其针对GLP-1受体的EC50的约50倍以内。

95.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物针对GIP受体的EC50在其针对GLP-1受体的EC50的约40倍以内。

96.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物针对GIP受体的EC50在其针对GLP-1受体的EC50的约30倍以内。

97.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物针对GIP受体的EC50在其针对GLP-1受体的EC50的约20倍以内。

98.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物针对GIP受体的EC50在其针对GLP-1受体的EC50的约10倍以内。

99.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物针对GIP受体的EC50在其针对GLP-1受体的EC50的约5倍以内。

100.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物展现至少1%的GIP效价百分比。

101.权利要求100的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP效价百分比为至少10%。

102.权利要求101的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP效价百分比为大于15%或大于20%。

103.权利要求102的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP效价百分比为至少50%。

104.权利要求103的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP效价百分比为大于或约100%。

105.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素类似物展现至少1%的GLP-1效价百分比。

106.权利要求105的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GLP-1效价百分比为至少10%。

107.权利要求106的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GLP-1效价百分比为至少50%。

108.权利要求107的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GLP-1效价百分比为大于或约100%。

109.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP效价百分比相比所述GLP-1效价百分比高或低10倍以内。

110.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素效价百分比为至少1%。

111.权利要求110的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素效价百分比为至少10%。

112.权利要求111的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素效价百分比为至少50%。

113.权利要求112的胰高血糖素类似物或肽，其中所述胰高血糖素效价百分比为大于或约100%。

114.前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽，其中所述GIP效价百分比相比所述胰高血糖素效价百分比高或低10倍以内。

115.二聚体或多聚体，其包含两个或更多个前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽。

116.缀合物，其包含前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽和缀合物部分。

117.权利要求116的缀合物，其中所述胰高血糖素类似物与异源肽类似物融合。

118.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的胰高血糖素类似物或肽、权利要求115的二聚体或多聚体、权利要求116或117的缀合物、或其组合，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

119.在有需要的主体中降低体重增加或诱导体重减轻的方法，其包括以有效降低体重增加或诱导体重减轻的量向有需要的患者施用权利要求118的药物组合物。

120.权利要求119的方法，其中所述量有效治疗有需要的主体的肥胖症。

121.治疗糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用权利要求118的药物组合物。