CN104263712A - 复合木瓜蛋白酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合木瓜蛋白酶及其应用，所述复合木瓜蛋白酶，由下述重量份原料组成：木瓜蛋白酶50-70份，生姜蛋白酶20-40份，菠萝蛋白酶5-15份。本发明还提供了所述复合木瓜蛋白酶在医药、保健工业、食品工业、美容工业、日化品工业、饲料工业及皮革工业中的应用。

Description

复合木瓜蛋白酶及其应用
技术领域
本发明涉及酶制剂及其应用，具体涉及一种复合木瓜蛋白酶及其应用。
背景技术
木瓜蛋白酶，又称木瓜酶（Papain），是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。木瓜蛋白酶的EC号：3.4.22.2；CAS号：9001-73-4。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种复合木瓜蛋白酶，其包括木瓜蛋白酶。
优选的，所述复合木瓜蛋白酶由下述重量份原料组成：木瓜蛋白酶50-70份，生姜蛋白酶20-40份，菠萝蛋白酶5-15份。
本发明所要解决技术问题之二是提供了所述的复合木瓜蛋白酶在医药、保健工业、食品工业、美容工业、日化品工业、饲料工业及皮革工业中的应用，尤其是：
所述复合木瓜蛋白酶在啤酒澄清中的应用；
所述复合木瓜蛋白酶在肉类软化中的应用；
所述复合木瓜蛋白酶在饼干松化镇南关的应用；
所述复合木瓜蛋白酶在制备抗肿瘤、抗淋巴性白血病、抗病原菌和抗寄生虫药物；
所述复合木瓜蛋白酶在美白皮肤、抗衰老中的应用。
本发明还提供了一种啤酒澄清剂，包括下述重量份的组分：维生素C15-35份，所述复合木瓜蛋白酶20-40份，卡拉胶10-20份。
所述啤酒澄清剂的制备方法，包含以下步骤：按重量份称取各组分，搅拌混合均匀。
使用所述啤酒澄清剂进行啤酒澄清的方法，其包括如下步骤：
（1）在啤酒发酵后，将所述的啤酒澄清剂在0-10℃水中溶解后；
（2）在20-30℃熟化1-3h；
（3）加入到啤酒发酵液中，澄清后，过滤；澄清时间优选为48-72h。
所述啤酒澄清剂的使用量优选为0.2-4.0mg/L（即每升啤酒发酵液中加入0.2-4.0mg啤酒澄清剂）；进一步优选为0.8-1.2mg/L。
使用本发明的维生素C、卡拉胶和复合木瓜蛋白酶进行复配的啤酒澄清剂对啤酒的澄清度和色度具有理想的效果，且可以替代现有技术中的甲醛、硅胶、硅藻土等物质，使啤酒更加健康。本发明的复配啤酒澄清剂能有效减少酒体中大、中分子多酚、防止非生物浑浊、加速发酵液的澄清、提高啤酒非物稳定性、延缓酒老化、提高酒风味以及保鲜期。
本发明的复合木瓜蛋白酶是利用蛋白酶破坏肉类结缔组织中的胶原蛋白和弹性蛋白，使得肌肉柔软嫩化，无粗糙条纹，具有投入设备少，操作简单，效果明显等优点。对肉类蛋白水解率在88%以上。复合木瓜蛋白酶对肉类的软化效果大于单一使用总质量相同的其中任一种蛋白酶，因此极大的提高了效率，且可以降低成本，提高了产品的风味和价值。经感官评定实验证明，使用复合木瓜蛋白酶嫩化的肉类，比传统肉类软化方法，无论是风味口感，还是外观，都有明显的提高。
在烘焙食品中如饼干等，复合木瓜蛋白酶能够提高松化效果，使之更容易上色，且麦香浓郁，口感极佳，饼干松脆可口，蛋糕成品湿润爽口，面包面团均匀，口味改良。使用复合木瓜蛋白酶代替单纯的一种植物蛋白酶，效力更佳，可以降低成本。经多人感官实验评定，使用复合木瓜蛋白酶制成的烘焙食品，与传统使用单独的植物蛋白酶相比，各方面都有大大的改善。
使用本发明的复合木瓜蛋白酶制成的护肤品，除一般清洁肌肤的特性外，还可滋润皮肤，营养机体。可作用于人体皮肤上的老化角质层，促使其退化、分解、去除，促进皮肤新陈代谢，减少因日晒引起的皮肤色深现象，减缓衰老，使皮肤保养呈现良好白嫩状态。
本发明的木瓜蛋白酶可以采用市售的产品，或者采用下述方法制备。
本发明还提供了所述木瓜蛋白酶的制备方法，其包括如下步骤：
（1）提取番木瓜中的果浆，4℃，3000-4000r/min离心10-20min；
（2）取离心后的上清液加入酶保护剂；
（3）调节pH至中性，静置2-5h，过滤除杂、干燥。
步骤（2）所述的酶保护剂优选为EDTA、亚硫酸氢钠或氯化钠中的一种或几种的混合物，进一步优选为EDTA、亚硫酸氢钠和氯化钠的混合物。更优选的，步骤（2）离心后的上清液加入酶保护剂后，控制EDTA、亚硫酸氢钠和氯化钠的摩尔浓度分别为0.002mol/L、0.005mol/L和0.002mol/L。
步骤（3）的干燥可以采用热风干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等方式；热风干燥的温度优选为50-60℃。
具体的，在本发明中，
所述生姜蛋白酶，是从生姜中提取的一种新型的水解蛋白质的催化剂，属于丝氨酸家族蛋白酶，能特异水解由脯氨酸氨基组成的肽键。可以直接购买或制备，制备方法可以参见《中国酿造》2010年04期游庆红等的《生姜蛋白酶的分离纯化及其酶学性质初步研究》。
所述菠萝蛋白酶，Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素，是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000，等电点为9.55。品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工，采用超滤方法进行过滤浓缩，低温冷冻干燥而得的。产品已被广泛应用于食品、医药等行业。CAS号：9001-00-7。EINECS号：253-387-5。
所述卡拉胶，卡拉胶是一种从海洋红藻(主要是各种麒麟菜)中提取出的多糖，其化学结构为D-半乳糖和3,6-脱水-D-半乳糖残基所组成的线性多糖化合物，残基上带有酯式硫酸盐基团，CAS号：11114-20-8。
所述维生素C，又称抗坏血酸，英文名为VitaminC，是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，分子式为C6H8O6,分子量为176.1。CAS号为：50-81-7，EINECS号：200-066-2。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例和对比例中所使用的卡拉胶均为κ-型卡拉胶。啤酒发酵液使用的是小麦啤酒发酵液。实施例1-4和对比例1-6中使用的木瓜蛋白酶的制备方法为：（1）提取番木瓜中的果浆，4℃，4000r/min离心15min；（2）调节pH至7.0，静置3h，过滤。生姜蛋白酶是通过杭州瑞纳膜工程有限公司的分离生姜蛋白酶设备制成，制备流程参见该设备使用说明书。菠萝蛋白酶购买自上海佳和生物科技有限公司。
实施例1
按照表1中实施例1的数据称取各组分，搅拌混合均匀，制成本实施例的啤酒澄清剂。
表1：啤酒澄清剂的配方（单位：公斤）
  维生素C 卡拉胶 木瓜蛋白酶 生姜蛋白酶 菠萝蛋白酶
实施例1 25 15 18 9 3
对比例1 25 15 18 12 /
对比例2 25 15 18 / 12
对比例3 25 15 / 27 3
对比例4 25 15 30 / /
对比例5 25 15 / 30 /
对比例6 25 15 / / 30
实施例2-4
按照表2中实施例2-4的数据称取各组分，搅拌混合均匀，制成实施例2-4的复合木瓜蛋白酶。
表2：复合木瓜蛋白酶配方表（单位：克）
  木瓜蛋白酶 生姜蛋白酶 菠萝蛋白酶
实施例2 50 40 5
实施例3 70 20 15
实施例4 60 30 10
本发明实施例4的复合木瓜蛋白酶，可利用蛋白酶破坏肉类结缔组织中的胶原蛋白和弹性蛋白，使得肌肉柔软嫩化，无粗糙条纹，具有投入设备少，操作简单，效果明显等优点。对肉类蛋白水解率在88%以上。实施例4复合木瓜蛋白酶对肉类的软化效果大于单一使用总质量相同的其中任一种蛋白酶，因此极大的提高了效率，且可以降低成本，提高了产品的风味和价值。经感官评定实验证明，使用复合木瓜蛋白酶嫩化的肉类，比传统肉类软化方法，无论是风味口感，还是外观，都有明显的提高。
在烘焙食品中如饼干等，实施例4复合木瓜蛋白酶能够提高松化效果，使之更容易上色，且麦香浓郁，口感极佳，饼干松脆可口，蛋糕成品湿润爽口，面包面团均匀，口味改良。使用实施例4复合木瓜蛋白酶代替单纯的一种植物蛋白酶，效力更佳，可以降低成本。经多人感官实验评定，使用复合木瓜蛋白酶制成的烘焙食品，与传统使用单独的植物蛋白酶相比，各方面都有大大的改善。
使用本发明实施例4的复合木瓜蛋白酶制成的护肤品，除一般清洁肌肤的特性外，还可滋润皮肤，营养机体。可作用于人体皮肤上的老化角质层，促使其退化、分解、去除，促进皮肤新陈代谢，减少因日晒引起的皮肤色深现象，减缓衰老，使皮肤保养呈现良好白嫩状态。
对比例1
按照表1中对比例1的数据称取各组分，搅拌混合均匀，制成本对比例的啤酒澄清剂。
对比例2
按照表1中对比例2的数据称取各组分，搅拌混合均匀，制成本对比例的啤酒澄清剂。
对比例3
按照表1中对比例3的数据称取各组分，搅拌混合均匀，制成本对比例的啤酒澄清剂。
对比例4
按照表1中对比例4的数据称取各组分，搅拌混合均匀，制成本对比例的啤酒澄清剂。
对比例5
按照表1中对比例5的数据称取各组分，搅拌混合均匀，制成本对比例的啤酒澄清剂。
对比例6
按照表1中对比例6的数据称取各组分，搅拌混合均匀，制成本对比例的啤酒澄清剂。
实施例5
按照以下方法制备木瓜蛋白酶：
（1）提取番木瓜中的果浆，4℃，4000r/min离心15min；
（2）取离心后的上清液加入酶保护剂；
（3）调节pH至7.0，静置3h，过滤除杂，在55℃下热风干燥。
所述酶保护剂为EDTA0.002mol/L、亚硫酸氢钠0.005mol/L和氯化钠0.002mol/L的混合物，即步骤（2）离心后的上清液加入酶保护剂后，控制EDTA、亚硫酸氢钠和氯化钠的摩尔浓度分别为0.002mol/L、0.005mol/L和0.002mol/L。
实施例6
按照实施例5所述方法，制备木瓜蛋白酶，酶保护剂替换为EDTA0.004mol/L与亚硫酸氢钠0.005mol/L的混合物，即步骤（2）离心后的上清液加入酶保护剂后，控制EDTA、亚硫酸氢钠的摩尔浓度分别为0.004mol/L、0.005mol/L。
实施例7
按照实施例5所述方法，制备木瓜蛋白酶，酶保护剂替换为EDTA0.004mol/L与氯化钠0.005mol/L的混合物，即步骤（2）离心后的上清液加入酶保护剂后，控制EDTA和氯化钠的摩尔浓度分别为0.004mol/L和0.005mol/L。
实施例8
按照实施例5所述方法，制备木瓜蛋白酶，酶保护剂替换为亚硫酸氢钠0.004mol/L与氯化钠0.005mol/L的混合物，即步骤（2）离心后的上清液加入酶保护剂后，控制亚硫酸氢钠和氯化钠的摩尔浓度分别为0.004mol/L和0.005mol/L。
实施例9
按照表1中实施例1的方法，制备啤酒澄清剂，将实施例1中的木瓜蛋白酶替换成实施例5制成的木瓜蛋白酶。
实施例10
按照表1中实施例1的方法，制备啤酒澄清剂，将实施例1中的木瓜蛋白酶替换成实施例6制成的木瓜蛋白酶。
实施例11
按照表1中实施例1的方法，制备啤酒澄清剂，将实施例1中的木瓜蛋白酶替换成实施例7制成的木瓜蛋白酶。
实施例12
按照表1中实施例1的方法，制备啤酒澄清剂，将实施例1中的木瓜蛋白酶替换成实施例8制成的木瓜蛋白酶。
测试例
啤酒是人类最古老的酒精饮料，是水和茶之后世界上消耗量排名第三的饮料。啤酒于二十世纪初传入中国，属外来酒种。啤酒以大麦芽、酒花、水为主要原料，经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。现在国际上的啤酒大部分均添加辅助原料。
啤酒花含有蛋白质、维生素、挥发油、苦味素、树脂等，具有强心、健胃、利尿，镇痛等医疗效能，对高血压病、心脏病及结核病等均有较好的辅助疗效。产妇喝啤酒，以增加母体乳汁，使婴儿得到更充分的营养。
早在1977年7月2日在墨西哥举行的“第九届国际营养食品会议”上就被正式列为营养食品。适量饮用啤酒对心脏和高血压患者亦有一定疗效。
啤酒是夏秋季防暑降温解渴止汗的清凉饮料，据医学和饮料专家们研究，啤酒含有4%的酒精，能促进血液循环。过度饮用冰冻啤酒伤脾胃，加重体内湿气，影响健康。
啤酒的一般生产工艺包括：（1）麦芽的粉碎；（2）麦芽的糊化；（3）麦芽过滤得到麦芽汁；（4）麦芽汁煮沸并加入酒花、糖等配料；（5）回旋沉；（6）冷却；（7）发酵；（8）成熟；（9）过滤；（10）灌装。
啤酒是一种成分复杂、稳定性不强的胶体溶液，其含有丰富的蛋白质、多酚、糊精、醛、醇及金属离子等物质。随着时间的推移，这些物质之间会发生反应，其中常见的是蛋白质与多酚结合，产生蛋白质一多酚复合物沉淀，也就是所谓的非生物混浊，影响了啤酒的外观。影响酒液澄清的主要因素有酵母的凝聚性、贮藏的温度、啤酒的成分等。
啤酒的稳定性可分外观稳定性和风味稳定性。外观稳定性又分生物稳定性和非生物稳定性。除了已普遍得到解决的生物稳定性问题外，啤酒的风味稳定性和非生物稳定性一直是啤酒酿造者努力研究的课题，除工艺技术外，应用各种稳定剂、澄清剂是一种非常有效的方法。
二十世纪六十年代初，用甲醛提高非生物稳定性作为一项科技攻关成果开始应用于国内啤酒酿造业，这项技术的应用确实解决了困扰啤酒行业多年啤酒保质期短的难题。几十年过去了，时至今日国内啤酒企业在啤酒生产的糖化阶段仍然添加甲醛以增强啤酒的胶体稳定性。但是，现代科学探明甲醛同时也能将有益的小分子酚类物质去除使得多酚聚合指数升高。这是以牺牲啤酒的风味稳定的营养成分为代价的，这不能不说是啤酒酿造也的一大憾事。甲醛作为一种食品添加剂本身就违反了国家的有关规定，其浓度在一定范围内对人体的主要影响是刺激眼睛和粘膜，表现症状主要是流眼泪、头昏等。因此，越来越多的业内人士强调提倡无甲醛啤酒，使啤酒真正成为绿色营养啤酒。许多企业也正加紧寻找一合理工艺及绿色稳定剂应用于啤酒生产中，而甲醛由于其在减少酒体多酚、防止啤酒非生物浑浊方面能与麦汁中的多肽结合后与多酚形成不溶性络合物，在糖化醪过滤时除去等特性，目前在国内还广泛应用于啤酒生产过程中。
现有技术中还常用硅胶、膨润土或高岭土等作为啤酒澄清剂。硅胶作为澄清助滤剂，对高分子蛋白质吸附的选择性较好，可较好地保留啤酒的风味特性，但是吸附量较小，使用时添加量大；而膨润土或高岭土作为澄清助滤剂，虽吸附量大，添加量小，价廉，但是选择性差，对高、低分子蛋白质都具有同样的吸附作用，因而对啤酒的泡沫影响较大。
测试例1
对实施例1和对比例1-6制得的啤酒澄清剂分别进行澄清效果测试（啤酒澄清度和啤酒色度测试）。
具体测试方法为：将啤酒澄清剂取1mg，在50ml的1℃水中溶解后；在30℃熟化2h；加入到1L的啤酒发酵液中，澄清48h后，过滤；
用10ml比色杯在752型紫外分光光度计波长660nm下测定其透光度T660，即为啤酒的澄清度；
用10ml比色杯在在752型紫外分光光度计波长430nm下测定其吸光度，以蒸馏水做对照，按下列公式换算，即为啤酒色度（EBC单位）：
啤酒色度=10×1.27×OD430×2.56-1.2；
式中：
1.27为10mm比色杯换算成1/2寸比色杯的系数；
OD430为在波长430nm下测得的吸光度；
2.56为换算成EBC单位的系数；
1.2为校正值。
测试结果见表3。
表3：啤酒澄清度和啤酒色度测试结果
  澄清度T660 色度（EBC）
实施例1 92.0 10.5
对比例1 86.1 11.2
对比例2 83.5 11.7
对比例3 88.6 11.0
对比例4 80.4 11.4
对比例5 77.6 11.9
对比例6 74.0 11.7
由表3数据可见，使用本发明的维生素C、卡拉胶和复合木瓜蛋白酶进行复配的啤酒澄清剂对啤酒的澄清度和色度具有理想的效果。
本发明的复配啤酒澄清剂能有效减少酒体中大、中分子多酚、防止非生物浑浊、加速发酵液的澄清、提高啤酒非物稳定性、延缓酒老化、提高酒风味以及保鲜期。
测试例2
分别取实施例1的啤酒澄清剂0.2mg、0.4mg、0.8mg、1.2mg、1.6mg、2.0mg、4.0mg，按照测试例1的测试方法，测试其对啤酒澄清度和啤酒色度的影响，测试结果见表4。
表4：实施例1啤酒澄清剂不同加入量的测试结果
澄清剂用量（mg） 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 4.0
澄清度T660 90.0 90.8 91.4 92.2 91.0 90.5 90.1
色度（EBC） 11.2 11.1 10.9 10.5 10.8 11.0 11.3
由表4数据可见，本发明的啤酒澄清剂的加入量在0.2-4.0mg/L之间，均有较好的澄清效果，尤其是0.8-1.2mg/L，啤酒的澄清度和色度最佳。
测试例3
测试实施例1所使用的木瓜蛋白酶及实施例5-8制得的木瓜蛋白酶的酶活力，测试方法见海南大学万婧《番木瓜中木瓜蛋白酶的提取工艺研究》，测试结果见表5。
表5：实施例5-8木瓜蛋白酶酶活力测试
  实施例1 实施例5 实施例6 实施例7 实施例8
酶活力/（万单位·mg-1） 4.035 8.162 7.695 7.254 7.901
测试例4
对实施例9-12制得的啤酒澄清剂分别进行澄清效果测试（啤酒澄清度和啤酒色度测试）。测试结果见表6。
表6：啤酒澄清度和啤酒色度测试结果
  澄清度T660 色度（EBC）
实施例9 93.1 10.0
对比例10 88.0 10.8
对比例11 85.4 11.2
对比例12 89.1 11.0
上述实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

Claims (9)

1.一种复合木瓜蛋白酶，其特征在于，包括木瓜蛋白酶。
2.一种复合木瓜蛋白酶，其特征在于，由下述重量份原料组成：木瓜蛋白酶50-70份，生姜蛋白酶20-40份，菠萝蛋白酶5-15份。
3.权利要求2所述的复合木瓜蛋白酶在医药、保健工业、食品工业、美容工业、日化品工业、饲料工业及皮革工业中的应用。
4.权利要求2所述的复合木瓜蛋白酶在啤酒澄清中的应用。
5.权利要求2所述的复合木瓜蛋白酶在肉类软化、饼干松化、制备抗肿瘤、抗淋巴性白血病、抗病原菌和抗寄生虫药物、美白皮肤、抗衰老中的应用。
6.一种啤酒澄清剂，其特征在于，包括下述重量份的组分：维生素C 15-35份，权利要求2所述的复合木瓜蛋白酶20-40份，卡拉胶10-20份。
7.权利要求6所述的啤酒澄清剂在啤酒澄清中的应用。
8.权利要求1所述的复合木瓜蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）提取番木瓜中的果浆，4℃，3000-4000r/min离心10-20min；
（2）取离心后的上清液加入酶保护剂；
（3）调节pH至中性，静置2-5h，过滤除杂，干燥。
9.如权利要求8所述的复合木瓜蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述酶保护剂为EDTA0.002mol/L、亚硫酸氢钠0.005mol/L和氯化钠0.002mol/L的混合物。
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