CN104151419B - 重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在大肠杆菌以包涵体形式表达重组人骨形态发生蛋白‑2(recombinant human bone morphogenetic protein‑2,rhBMP‑2)的制备方法，其包括如下主要步骤：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节不同pH值、尿素变性溶解所述包涵体蛋白、所述包涵体蛋白质的控速复性、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品等步骤。本发明的制备方法利用在漂洗过程中通过数次调节不同pH值和控制尿素浓度改变速度进行复性、并且通过超滤膜技术即可制备纯度高、活性高的rhBMP‑2。同时可以省略层析步骤，通过现代超滤膜技术即可满足产品质量要求，大大缩短了工时、降低了生产成本。本发明可高效、简便、低成本地获得rhBMP‑2纯品。
Description
技术领域
本发明涉及从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人骨形态发生-2的方法，属于蛋白质生物化学工程领域。
背景技术
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)为Urist于1963年发现(Marshall R.Urist m R.Bone formation by autoinduction.Science,1965,150:893)，能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。BMP最初被认为是软骨和骨形成的蛋白质调节剂(Marshall R.Urist m.The substratum for bone morphogenesis.Dev Biol(Suppl),1971,4:125)，但他们随后表现出与各种组织和器官的胚胎发育和形态发生有关的性质。同时BMP也表现出调节各种细胞的生长、分化和趋药性的作用，包括间充质细胞、上皮细胞、造血细胞和神经细胞。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是转化生长因子β超家族成员之一，具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损的修复。研究表明，BMP-2主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到募集和分化作用(Riley e A,Lane J M,Urist M R,et al.Bone morphogenetic protein-2:Biology and application.Clinic Orthop,1996,324:39)。在骨形成早期，BMP-2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心募集，并分化为骨系细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基细胞逆转分化为骨系细胞。其主要过程是：增加或抑制这些细胞内的某些特异性蛋白的分泌，使成纤维细胞分化为成骨细胞，成肌细胞快速分化为肥大的软骨细胞，并促进基质钙化。对于成骨细胞，BMP-2则可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质钙化。在骨形成后期，BMP-2还作为一种破骨细胞分化因子与其它支持破骨细胞分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建(Kaffagiri t,Yamaguch A,et al.
Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblast into theosteoblast lineage.J-Cell-Biol,1994,127:1755；Kanatani t,Yamaguch A,Ikeda T,et al.The non-osteogenic mouse pluripotent cell line,c3H10Ti/2,is induce todifferentiate into osteoblastic cell by recombinant human bone morphogenetic protein-2.Biochem-Biophys-Res-Commun,1990,192(1):295；Long m W,Robinson J A,Ashcraft E A,et al.Regulation of human bone marrow-deriyedosteogenitor ceels by osteogenic growth factors.J Clin Invest,1995,95:881)。BMP-2在体内以前体形式合成，经蛋白酶切去除信号肽和前肽，得到由114个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽通过7对二硫键将其保守结构正确折叠。成熟的BMP-2以二聚体形式才具有生物活性。
目前，人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组BMP-2(rh BMP-2)，并且在常位和异位成功地诱导出新骨(胡蕴玉.骨诱导及BMP的研究现状与展望.中华骨科杂志，1996，34(10)：579)。BMP-2在临床中的应用展示广阔的前景(金岩，司晓辉，杨连甲等.骨形态形成蛋白在下颌骨骨折中的表达及mRNA水平分析.中华创伤，1996，12(6)：353)。本重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)单体含全部114个氨基酸残基，单体分子量12.9KD，它的同二聚体具有与天然骨形态发生蛋白-2相当的生物活性。
目前，利用大肠杆菌表达重组人BMP-2，有两种不同的技术途径，一种是生产分泌型的重组人生长激素，一种则是生产胞内型。经无数次实践验证，生产分泌型的重组人生长激素，虽然步骤简单，但其表达量很低，成本也极其高，不能满足市场的需要。重组胞内型的人生长激素蛋白，其表达量非常大，但复性效果往往不好，复性后的蛋白质折叠不好，稳定性差，蛋白活性低。
基于现有技术存在的问题，本发明提供了一种改良的重组人生长激素的制备的方法，较容易获得大量的高纯度和活性高的蛋白。
发明内容
基于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种，从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，所述方法包括：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节不同pH值、变性溶解所述包涵体蛋白、所述包涵体蛋白控速复性、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品步骤。
在本发明的一个方面，所述漂洗包涵体和调节不同pH值步骤是用含有0.1-5％的去污剂的去离子水和调节pH至2-10，漂洗包涵体3-5次；所述去污剂为曲拉通X-100。
在本发明的又一个方面，所述包涵体蛋白尿素控速复性步骤为：添加水或缓冲液降低尿素浓度来实施的。所述尿素复性该包涵体蛋白步骤是通过控制添加水或缓冲液的流速来实现的；所述控制添加水或缓冲液的流速为1-100mL/分钟，优选为2-20mL/分钟，最优选为5mL/分钟。
在本发明的再一个方面，所述超滤膜浓缩的步骤是用截留分子量为10000道尔顿-35000道尔顿的超滤膜进行反复超滤浓缩。
在本发明的一个具体方面，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为8.5-10.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.0-8.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为2.0-6.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为2-20mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为10000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；
11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为26000-35000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为10000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
在本发明的进一步具体方面，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心45分钟，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为9.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.5-7.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心30分钟，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为2-20mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；
11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
在本发明的更进一步具体方面，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心45分钟，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入20倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为9.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心30分钟，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为5mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
本发明的方法在去除杂蛋白和杂质方面，不需要使用传统除杂用的氯仿、丙酮、乙醇等对人有害的溶剂，同时省略了高温加热法除杂蛋白的步骤，不尽节约了能源也避免了高温对重组人BMP-2破坏。本发明的方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了低成本生产重组人BMP-2的工艺方法。离心和过滤所得到的滤液由于不含有任何有害物质，不会污染环境。本工艺几乎不产生固形废弃物，没有固型垃圾。复性过程所产生尿素，可以回收，用于植物肥料。
附图说明
图1是制备重组人骨形态发生蛋白-2工艺路线图。
图2是自制多孔喷头示意图。图中的A、B、C、D、E、F代表它们的尺寸，可根据蛋白复性罐体的尺寸设计。
图3是重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达情况。1、诱导前；2、IPTG诱导后；3、破菌后离心上清；4、破菌后离心沉淀。
图4是重组人骨形态发生蛋白-2包涵体蛋白洗杂后沉淀的电泳图。
图5是纯化后冷冻干燥粉产品电泳图。
图6是纯化后冷冻干燥粉产品用分子筛方法检测纯度的层析图谱。
具体实施方式
为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方式、变型和特征。
在实施本发明的过程中，使用了生物化学、蛋白质生物化学、蛋白质生物化学工程等很多传统技术。这些技术是熟知的。
在本发明的一个实施方式中，提供了从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人MBP-2的方法，所述方法包括：高压匀浆破碎菌体细胞、调节pH洗涤包涵体，该包涵体变性溶解、包涵体蛋白控速复性、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品等步骤(图1)。
首先，对细菌体表达的重组人生长激素进行破碎，为了能够保证重组人MBP-2在菌体破碎过程中不发生热变性或降解，通常情况下在≦10℃条件下进行破菌，例如在10℃、8℃、6℃，比较适合在4℃左右。在本发明的一些实施方式中，使用了高速离心步骤，以去除产物中不需要的杂质，用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，可以是10000-20000转/分，例如12000-20000转/分，合适为14000-20000转/分，例如在一些具体实施例中采用15000转/分钟离心离心时间通常控制在2个小时以内，例如1.5小时、1小时、45分钟或30分钟。
本发明中的漂洗包涵体实施方式中，在去离子水中加入了去污剂，。去污剂可以是曲拉通X-100、吐温20(20-80的分子个数)、NP-40、OB-2、脂肪酸钠等阳离子型去污剂、阴离子型去污剂或中性去污剂，可以是单一去污剂，也 可以是这些去污剂的按比例的混合物，优选为曲拉通X-100。去污剂使用浓度为0.001-20％，优选0.05-2％，更优选为0.05-1％。在一些的具体实施例中，加入去离子水搅拌后，调节了pH值，所述的pH值可以在2-10之间，pH值过高会使目标蛋白溶解丢失，优选地，选择pH值3、pH值7和pH值9三个不同pH值洗除杂蛋白，有益于除去酸性、中性和碱性杂蛋白，使纯化蛋白纯度更高。重复洗涤蛋白是非常必要的，是为了去除杂蛋白，提高产品纯度。可以重复洗涤多次，合适地2-6次，例如3-5次。
通常地，选择尿素、盐酸胍及其衍生物等作为蛋白质变性剂。本发明中的一些具体优选实施例中使用了8M尿素是蛋白质变性剂，为了溶解目标蛋白，使目标蛋白变性，打开它们的错误折叠的二维和三维构象。尿素的使用量可以是6-9M，优选7M-9M，最优选为8M。所加变性剂的量一般在沉淀量的10-100倍(重量体积比：W/V)，例如15-100倍，优选在50倍。
本发明一些具体实施例中，向所述的蛋白质变性溶解液体中添加了还原剂，所述还原剂可以使蛋白质分子间和分子内的二硫键断裂，有利于蛋白质的变性和复性。还原剂可以是还原性谷胱甘肽、Beta-巯基乙醇、维生素C及其衍生物、四氢化碳等有机还原剂和无机还原剂，优选还原剂为Beta-巯基乙醇。
在本发明的一些实施方式中，进行了纯化蛋白质的复性过程，一般先使蛋白多肽形成二级结构，再折叠形成三级结构。这个过程需要逐渐降低蛋白质变性剂的浓度，如果过于快速，会使变性蛋白相互缠绕，不利于复性。可以缓慢加入去离子水。每个出水点的流速可以在1mL-100mL/分钟，优选2-20mL/分钟，最优选5mL/分钟。
为了更好地控制所述流速，本发明中设计和使用了自动多孔喷头。其形式酷似淋浴喷头，由多个出水口，自制多孔喷头，目的是使每个反应体系表面，在单位时间里流下的复性剂(超纯水)不至于使其局部尿素浓度降得太快，以防蛋白折叠不好，多个出水点既可防止局部尿素浓度降得太快，又能保证复性时间缩短，大大降低生产工时。每个出水口流速在1-100mL/分钟，孔的直径可以在0.01-10cm，例如0.5mm，1mm，5mm，1cm等。孔间间距为0.01-10cm，例如0.5mm，1mm，5mm，1cm等(见图2)。以防局部流量过快，影响蛋白复性效 率。通过该装置，每个出水点的流速可以在1mL-100mL/分钟，合适为2-75 mL/分钟，优选2-20mL/分钟，更优选5-20mL/分钟，最优选5mL/分钟。
术语“所述包涵体蛋白控速复性”是指变性后，对变性剂通过控制流速进行稀释过程，通过控制流速和复性时间，达到包涵体蛋白的完全复性和保持其结构稳定性。复性时间不受限制，但过长的复性时间也不是所期望的，这是基于蛋白质性质和能量消耗所决定的。
添加的复性液体可以是水，例如清水、纯净水、超纯水、去离子水，也可以是也可以是缓冲液，如Tris-HCl、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等有机或无机缓冲液。同时也可以是相应的低浓度的变形剂。
在本发明的一个具体实施方式中，用超纯水，使用自制多孔喷头，在连续浓度梯度条件下复性，直至反应体系中尿素浓度下降到2M以下为止。2M以下浓度尿素已经能够使rhMBP-2蛋白完全复性和保持其结构稳定性。
本发明一些具体实施例中，进行了过滤浓缩步骤。首先，用超滤装置除尿素的过程，一般来说，重复次数越多，除尿素越干净，但到尿素含量达到0.01mM以下时，就可以满足产品要求，次数越多工时就越长，所以本工艺选用6次，第六次为0.0067mM。
接着用截留分子量较大的蛋白杂质及其复性时缠绕在一起的折叠不好的目标蛋白，因为一个折叠好的重组人BMP-2分子量在26000道尔顿左右，不容易通过20000道尔顿的超滤柱微孔，而被截流。相反，由于折叠好的重组人BMP-2分子量在26000道尔顿左右，可通过30000道尔顿的超滤柱微孔，有利于去除多个分子缠绕在一起的不正确装配的大型BMP-2蛋白和大分子量杂蛋白，可保证产品的质量。
然后进行产品浓缩步骤，一切小于26000道尔顿的超滤装置都可用于浓缩，但截流分子量太大的超滤装置会丢失一些目标蛋白，我们选用截流分子量在1000-22000道尔顿的超滤装置，优选8000-22000道尔顿的超滤装置，最优选截流分子量在20000道尔顿超滤装置。
同时，对制备的重组人BMP-2用法玛西亚Phamarcia)蛋白质纯度分析仪AKTA Purifier的分子筛Superdex75检验产品的纯度，经过分析测定得到重组 人生长激素均在95％以上，例如96％，97％，98％，99％，有的甚至接近100％，例如99.5％，99.8或99.9％。
在本发明的一些实施例中，采用碱性磷酸酶(ALP)活性的方法对重组人BMP-2的生物学活性进行了检测。一般依据试剂盒提供的说明书进行ALP活性检测。这些方法都是本领域技术人员所熟知的。本发明的重组人BMP-2比活性均在7500U/mg以上，例如8000U/mg、8500U/mg、9000U/mg以上，有的甚至超过10000U/mg。
经过计算得出，蛋白质可回收率在65％以上，例如70、80％、85％以上，在一些本发明优选实施方式中，蛋白质可回收率在80％以上，例如85％以上，例如90％、92％、95、97％、99％。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为8.5-10.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.0-8.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为2.0-6.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为2-20mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为10000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；
11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为26000-35000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为10000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
在本发明的进一步具体实施方式中，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心45分钟，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为9.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.5-7.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心30分钟，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为2-20mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；
11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
在本发明的更进一步具体实施方式中，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人BMP-2的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心45分钟，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入20倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为9.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心30分钟，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为5mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
结合附图1，对本发明的从包涵体形式的重组蛋白到通过一系列蛋白纯化方法，实现了人骨形成蛋白2工业生产的目的，以下对本技术方案作进一步说明。
通过如下实施例描述，更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于所记载的实施例。
实施例
实施例1
1)新鲜发酵获得的重组BMP-2大肠杆菌细胞1公斤，加入80升去离子水，搅拌均匀，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀约0.6公斤(图3和图4)和；
3)将沉淀转移至搅拌罐中。加入30升的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)加入50倍的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时，用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入50倍的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时，用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀，得沉淀约0.4公斤；
6)步骤5)的沉淀加20升的8M尿素(含1mMBeta-巯基乙醇)溶液，搅拌2小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，用自制多孔喷头边搅拌边加入60升去离子水，每孔流速为5mL/分；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩到8升；
11)加入80升去离子水，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到80升；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到4升；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品约200克。所得制品的纯度为98.9％，活性为9980U/mg,回收率为90.7％(图6)。
实施例2
1)新鲜发酵获得的重组人BMP-2大肠杆菌细胞5公斤，加入400升去离子水，搅拌均匀，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀约0.6公斤；
3)将沉淀转移至搅拌罐中。加入150升的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)加入50倍的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时，用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入50倍的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时，用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀，得沉淀约2公斤；
6)步骤5)的沉淀加100升的8M尿素(含1mMBeta-巯基乙醇)溶液，搅拌2小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，用自制多孔喷头边搅拌边加入300升去离子水，每孔流速为5mL/分；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩到40升；
11)加入400升去离子水，重复步骤10)6次以上，再加入去离子水到400升；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到20升；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品约1000克。
实施例3
1)新鲜发酵获得的重组人BMP-2大肠杆菌细胞10公斤，加入800升去离子水，搅拌均匀，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀约0.6公斤；
3)将沉淀转移至搅拌罐中。加入300升的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)加入50倍的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时，用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入50倍的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时，用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀，得沉淀约4公斤；
6)步骤5)的沉淀加200升的8M尿素(含1mMBeta-巯基乙醇)溶液，搅拌2小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，用自制多孔喷头边搅拌边加入600升去离子水，每孔流速为5mL/分；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩到80升；
11)加入800升去离子水，重复步骤10)6次以上，再加入去离子水到800升；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到20升；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品约2000克。
本发明的方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了低成本生产重组人生长激素的工艺方法。离心和过滤所得到的滤液由于不含有任何有害物质，不会污染环境。本工艺几乎不产生固形废弃物，没有固型垃圾。复性过程所产生尿素，可以回收，用于植物肥料。
本发明不局限在本申请中描述的特定实施方式，用作本发明的单独的方面的单一说明。本领域技术人员将理解，可以不脱离本申请的精神和范围的情况下进行各种修改和改动。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于生物化学和生物工程或相关领域的技术人员来说都是显而易见的，均应落入本发明权利要求书的范围。
根据以上描述，除了本文中列举的以外，本公开的范围内的功能上等同的用途对于本领域的本领域技术人员而言是明显的。这样的改动和修改意欲落在所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求以及与这样的权利要求的的范围所等同的全部范围限制。应当理解，本公开不局限于特定的方法、试剂、组合物和生物系统，当然，所述方法、试剂、组合物和生物系统可以变化。还可理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式，不用来是限制性的。
本文所参考的或引用的所有专利、专利申请、在先申请和出版物通过引用而全文并入本文，包括所有的附图和表格，使得它们不与本说明书的明确教导相矛盾。在权利要求范围内提出其他的实施方式。
Claims (3)
1.一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人骨形态发生蛋白-2的制备方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：
1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为8.5-10.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.0-8.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为2.0-6.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为2-20mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为1000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；
11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为26000-35000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为1000-26000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心45分钟，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为9.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为6.5-7.5，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心30分钟，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为2-20mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：1)新发酵获得的重组人骨形态发生蛋白-2大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心45分钟，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中,加入20倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为9.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
5)加入10-100倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为3.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
6)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
7)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心30分钟，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
8)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入3倍体积的去离子水，添加去离子水的流速为5mL/分钟，最后尿素浓度降为2M；
9)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，收集澄清液体；
10)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
11)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
12)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
13)用截留分子量为20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
14)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
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| WO2011083099A1 (en) * | 2010-01-06 | 2011-07-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Crystals of mutant bace - 1 |
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|---|---|---|---|---|
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| WO2011083099A1 (en) * | 2010-01-06 | 2011-07-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Crystals of mutant bace - 1 |
| WO2013025844A3 (en) * | 2011-08-16 | 2013-05-02 | Medtronic, Inc. | Modular hemodialysis system |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 重组人骨形态发生蛋白-2 原核表达及单克隆抗体制备;王婧 等;《中国医学科学院学报》;20111030;第33卷(第5期);第544页、摘要部分 * |
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