CN1796550A - 重组链激酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产链激酶(r－SK)的方法，包括步骤：(a)在适合的表达条件下，培养大肠杆菌工程菌，该工程细胞携带选自下组的表达载体：含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体，且在所述表达载体中插入了链激酶的编码序列，从而表达出可溶性、高活性的r－SK；(b)分离纯化出步骤(a)中表达的r－SK。本发明方法不仅表达量高，而且分离纯化工艺简便。本发明还提供了相应的表达载体和工程菌。

Description

重组链激酶的生产方法

技术领域

本发明涉及重组链激酶(Recombinant Streptokinase)的生产方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。

背景技术

在正常生理状态下，血液中的凝血系统和抗凝系统以及纤维蛋白溶解系统保持着一种动态平衡，既保证了血液有潜在的可凝固性又始终保证了血液的流体状态。但在某些病理条件下，上述平衡会被打破。机体某些部位会出现血管内皮受损，这些部位可能在血小板聚集成团的基础上发生凝血过程，形成小血栓。

在抗凝功能中发挥重要作用的是血液中的抗凝因子，主要有三个体系：凝血酶III、蛋白C系统和组织因子途径抑制物(TFPI)。在纤溶系统中起重要作用的是血液中的纤溶酶原激活物、活化的XIIa和激肽释放酶，这些激活剂及激活剂样物质能是纤溶酶原活化成为纤溶酶，使纤溶蛋白水解，因此如果纤溶系统受到抑制，势必加重血栓栓塞。

血管栓塞性疾病(Thromboembolic disease)是引起人类死亡的最主要原因之一，如心肌梗塞、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞、肺栓塞等。这类疾病一般没有早期症兆，发病急且发病率高，若不及时抢救，致死率和致残率极高。随着人们物质生活水平的提高，这类疾病的发病率有逐渐增加的趋势。治疗这类疾病的有效手段是及时消除血管内的血栓，以便有效地控制疾病的进展。自1979年Peter Rentrop博士及其同事发现链激酶(Streptokinase，SK)的溶栓作用以来，各种溶栓剂不断被发现并在治疗血管栓塞性疾病中起到越来越重要的作用。

溶栓剂是一类蛋白激酶或类似物，它可以激活人血液中处于无活性状态的纤维蛋白酶原，使之成为有活性的纤维蛋白酶，纤维蛋白酶再作用于血凝块中的主要物质纤维蛋白使之溶解，从而起到溶解血栓的作用。

重组链激酶是一种溶栓药物，主要用于治疗急性心肌梗塞，肺栓塞，眼底栓塞和股骨头坏死等病症，具有溶血栓速度快，毒副作用小，生产成本低等优点，在世界卫生组织(WHO)目前推荐的六种用于大规模临床研究和临床应用的救治急性心机梗塞和脑卒中病人的溶血栓药物中，重组链激酶是其中优选的一种。

目前，上市的重组链激酶采用大肠杆菌表达体系，表达产物为不溶性的包涵体，因此需要通过变性和复性才能得到有活性的产物，生产工艺复杂、产率低，产品成本相对较高。因此，本领域迫切需要开发高效和/或简便的生产r-SK的方法。

本发明系统通过密码子优化，采用改造的大肠杆菌表达体系，使表达产物以可溶、有活性形式存在于细菌体的胞内及细菌的胞间质内，并通过发酵工艺的改进，同时简便纯化工艺，获得高表达、高得率、极具产业化价值得一种r-SK生产方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产r-SK的方法。

本发明的另一目的是提供用于该方法的表达载体和宿主细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种生产重组链激酶的方法，该方法包括步骤：

(a)在适合的表达条件下，培养大肠杆菌工程菌，该工程细胞携带选自下组的表达载体：含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体，且在所述表达载体中插入了链激酶的编码序列，从而表达出可溶性、高活性的链激酶；

(b)分离纯化出步骤(a)中表达的链激酶。

本方面的一优选例中，所述的表达载体是含有阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体。

在本发明的另一优选例中，在含有阿拉伯糖诱导的启动子的载体中插入了链激酶的编码序列。

本方面的另一优选例中，所述的表达载体既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能。

在本发明的另一优选例中，在所述载体------既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体中插入了链激酶的编码序列。

在本发明的另一优选例中，所述的载体的编码序列编码氨基酸序列SEQ IDNO：2所示的蛋白质，更佳地具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤：

(i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式取出发酵上清液，获得菌体；

(ii)破细胞，获得破菌液；

(iii)对破菌液进行离心以去除菌体碎片，获得破菌上清液；

(iv)层析纯化，所述的层析选自：阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合。

在本发明的另一优选例中，在步骤(iii)和(iv)之间，还包括步骤：通过盐析和/或超滤对破菌液上清进行初步纯化。

在本发明的另一优选例中，所述的培养条件是：培养温度为30-40℃，更佳地34-38℃；pH在6～8之间，更佳地在6.5～7.5之间；葡萄糖或甘油浓度为0.1～5％，更佳地在0.3～3％；诱导剂为L-阿拉伯糖，浓度在0.00002～0.2％，更佳地在0.002～0.2％；；诱导前OD₆₀₀在0.1～20之间，更佳地在1～10之间；诱导时间0.5～10小时，更佳地1～5小时。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，它是选自下组的表达载体：含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体，且在所述表达载体中插入了链激酶的编码序列。

在本发明的一种优选所述的表达载体中，所述的链激酶的编码序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：2所示的蛋白质，更佳地所述的编码序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种大肠杆菌宿主细胞，该工程细胞携带选自下组的表达载体：含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体，且在所述表达载体中插入了链激酶的编码序列。

附图说明

图1.pXSY-1/rSK质粒构建路线图

图2.pXSY-2/rSK质粒构建路线图

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，选择出适合r-SK表达的载体，该载体有助于r-SK真核基因在原核中的正确折叠，并以可溶性形式存在，从而不仅提高了r-SK表达量，而且简化了分离纯化工艺，在此基础上完成了本发明。

r-SK cDNA序列是已知的，如SEQ ID NO：1所示，编码一个全长436个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)。

r-SK的编码序列可以来源于基因文库，或根据文献报道的r-SK cDNA序列，全基因合成。还可以设计引物，通过PCR与相应的链球菌基因DNA反应获得。

适用于本发明的载体包括表达质粒：含阿拉伯糖诱导的启动子的质粒载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的质粒载体，且在所述表达载体中插入了链激酶的编码序列。

适用于本发明的宿主菌是大肠杆菌(E.coli)。

通常，在r-SK cDNA 5′端与3′端分别加起始密码子和终止密码子，并引入特异性酶切位点，然后克隆入含阿拉伯糖诱导的启动子和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达质粒中，转化为与表达载体相容的大肠杆菌宿主菌，经筛选鉴定后获得工程菌。本发明的工程菌属于L-阿拉伯糖化学诱导型。

在本发明中，工程菌表达r-SK的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。通常，工程菌在以蛋白胨、酵母粉、NH₄Cl或(NH₄)₂SO₄等为氮源，甘油、葡萄糖、乳糖等为碳源，维生素B1作为补充维生素的基础培养基中，摇瓶内或发酵罐中进行培养、表达。

此外，通过控制添加各营养成分，控制培养、诱导阶段溶氧(DO)、pH、温度、时间、菌密度、比生长速率等因素，可以进一步提高表达量。

对于培养基的选择，通常包括氮源、碳源、无机盐、维生素、微量元素等的选择。

(a)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，总浓度0.1-3％；无机氮源如氨水或NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄等铵盐，浓度0-1.5％。

(b)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg²⁺盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg²⁺盐0-5mM。

(c)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。

(d)根据M₉培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。

(e)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳地，碳源选自下组：甘油浓度为0.1-3％；乳糖浓度为0.1-3％；葡萄糖浓度为0.1-1.5％。

对于诱导剂而言，可以单独使用L-阿拉伯糖做诱导剂；对于诱导温度而言，诱导温度30-40℃，较佳地34-38℃，更佳地约35℃。

对于溶氧(DO)的控制而言，通常培养阶段在30％以上，诱导阶段在50％以上。

在发酵表达r-SK后，对表达的r-SK进行分离。

通常，发酵样品先以离心、过滤等方式去除发酵液上清，获得菌体。缓冲溶液悬浮菌体后，以超声波破碎、高压机械破碎等方式进行完全破菌，获得破菌液。然后对破菌液进行离心以去除菌体碎片，获得破菌液上清液。破菌液上清含目的蛋白质r-SK。破菌液上清可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。

适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

(a)凝胶过滤层析：样品超滤浓缩后，可以用凝胶过滤层析去盐及纯化。

(b)离子交换层析(阳离子交换层析、阴离子交换层析)：

样品的缓冲系统以稀释、超滤、沉淀后复溶、透稀或凝胶过滤层析等手段进行更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，且电导率小于4000uS/cm，直接上样，盐浓度梯度或pH梯度梯度洗脱。

(c)亲和层析：

选择肝素亲和凝胶介质，盐梯度或肝素梯度洗脱。

经过2-3步纯化，可得到r-SK纯品，纯化得率60％以上，纯度95％以上，纯品得率约600mg/L发酵液，每升发酵液可制备6×10⁷IU r-SK活性蛋白。

纯化后r-SK可用常规技术制成各种剂型。

在本发明的一个实例中，选择了有助于真核基因在原核细胞中正确翻译的质粒载体：含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体，且在所述表达载体中插入了链激酶的编码序列，构建高效、稳定表达的r-SK工程菌(大肠杆菌)。经高密度发酵培养，L-阿拉伯糖诱导，r-SK以可溶形式存在于胞内及胞间质；表达水平高，占菌体总蛋白50％左右，r-SK表达量达1000mg/L发酵液，样品蛋白活性大于8×10⁷IU/L发酵液。由于表达水平较高，r-SK又具有天然活性，避免了复杂的复性过程，通过简便、快速的二步纯化方法，即获得高质量的r-SK纯品，每升发酵液可得r-SK纯品600mg，产品纯度95％以上。

纯化后原液加入适当辅料，制成r-SK的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明，该粉针剂稳定。

中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得r-SK纯品600mg，每升发酵液可制备6×10⁷IU r-SK活性蛋白。适合产业化生产。

本发明的优点在于：

(1)表达工艺简单。

(2)表达量高。通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平达到1000mg/L。

(3)纯化工艺简便，回收率高。由于分泌蛋白不是以包含体形式表达，因此简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使大规模生产r-SK成为可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

r-SK分泌表达系统的构建

1.目的基因的获得

表达质粒为pXSY表达载体(该表达载体既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能)，宿主菌为大肠杆菌。

根据文献报道r-SK的天然氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，人工合成重组链激酶(r-SK)基因的全序列，同时在该基因的5’端引入与新生源表达载体上一致的NcoI位点及在3’端引入EcoR I位点，基因的人工合成由上海生工生物工程技术有限公司完成。

2.表达质粒---pXSY/SK的构建与转化宿主菌

用EcoRI和NcoI双酶切分别处理基因r-SK和新生源表达载体的质粒DNA，37℃酶切3小时回收相应的片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。连接产物转化进入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定：抽提的质粒DNA用限制性内切酶EcoRI和NcoI在37℃反应3小时，得到在新生源表达载体中插入了r-SK基因的重组质粒p新生源/SK。用通用引物进行正、逆向序列分析，证实克隆序列与设计序列完全一致。

摇瓶试验，该工程菌培养后，经L-阿拉伯糖诱导2小时后，目的蛋白表达量占总蛋白50％左右，取离心上清测活，活性约为8×10⁷IU/L发酵液。

实施例2

培养基选择

在该实施例中，对几种培养基组分进行选择(g/L)：

成分	1	2	3	4	5	6
							胰蛋白胨	5	10	10	5	10	10
酵母提取物	5	10	5	10	10	5
							K2HPO4	0.1	0.2	0.5	0.5	0.2	0.1
KH2PO4	0.2	0.1	0.2	0.5	0.2	0.5
							Na2HPO4	0.25	0.25			0.5	0.5
(NH4)2SO4	0.1	0.05	0.1	0.05
							MgSO4·7H2O	0.2			0.2	0.1	0.1
甘油	10	5	10	5	10	5
							NH4Cl	0.2	0.1				0.1
NaCl	5	5	1	5	1	1
							柠檬酸钠	1.7		1.7		1.7
pH	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0

结果：甘油的量对表达量没有大的影响，但磷酸盐太少对菌体生长不利，1和2号培养基菌体都生长缓慢。所有培养基中，4号效果最好。

实施例3

上罐表达(5L)

一.菌种：

将含有p新生源/SK表达质粒的大肠杆菌在LBA中培养20hr，OD₆₀₀达2.7。

二、基础培养基：实施例2中的培养基4

三、发酵培养阶段：

温度：37℃

pH：7.0

诱导时OD₆₀₀：3.0

共培养5.5小时

四、发酵诱导阶段：

温度：35℃

PH：6.8

L-阿拉伯糖：乳糖加入量：3∶1(量比，其中L-阿拉伯糖浓度为0.2％)

诱导结束OD₆₀₀：8.8

共诱导2小时

五、实验结果：

诱导2hr后，r-SK表达量占发酵上清液总蛋白50％左右，表达量达1000mg/L发酵液(用改良Lowry法测)，蛋白活性约为8×10⁷IU/L发酵液。

实施例4

温度对诱导水平的影响

在实施例3的基础上，比较以下二种方法：

方法一：

诱导阶段温度为：30℃

方法二：

诱导阶段温度为：35℃

方法三：

诱导阶段温度为：38℃

结果：

方法一

方法二

方法三

r-SK表达水平(占全菌蛋白比例)

35.8％

51.2％

18.3％

实施例5

r-SK的纯化

1.发酵液4℃下5000rpm离心10min，得菌体。

2.菌体高压破菌，8000rpm离心30min，得上清。

3.超滤浓缩及更换缓冲液：使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为10KD，超滤时留取浓缩液(作用是去除小分子杂质和盐类)。发酵液上清超滤至体积剩下500ml左右，加入PBS(PH7.4，20mM)，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水平和PBS(PH7.4，20mM)缓冲液的电导水平接近。

4.层析1(阴离子交换层析)：

层析介质：Q Sepharose FF

缓冲液：溶液A：PBS(PH7.4，20mM)

溶液B：PBS(PH7.4，20mM)+1M NaCl

上样：将超滤浓缩的r-SK溶液上样。

清洗：上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。

收集：收集r-SK样品峰。

5.层析2(分子筛层析)：

层析介质：G-25 Sepharose FF

缓冲液：PBS(PH7.4，20mM)

上样：层析1收集的样品组分。

样品经过此三步纯化，即超滤、阴离子交换层析、分子筛层析以后，纯度提高至95％以上，蛋白活性约为6×10⁷IU/L发酵液。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                              序列表

                            SEQ ID NO：1

重组人链激酶核苷酸序列

ATG AAA AAC TAC CTG TCT TTC GGT ATG TTC GCA CTG ACC TTC GGT ACC GTT AAC

TCT GTT CAG GCT ATC GCT GGT CCG GAA TGG CTG CTG GAC CGT CCG TCT GTT AAC

AAC AGC CAG CTG GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT GTT GAA GGT ACT AAC CAG GAC

ATC AGC CTG AAA TTC TTC GAA ATC GAC CTG ACC TCT CAG CCG GCT CAC GGT GGT

AAA ACC GAA CAG GGC CTG TCT CCG AAA TCT AAA CCG TTC GCT ACT GAC AGC GGC

GCC ATG CCG CAC AAA CTG GAA AAA GCT GAC CTG CTG AAA GCT ATC CAG GAA CAG

CTG ATC GCT AAC GTT CAC TCT AAC GAC GAC TAC TTC GAA GTT ATC GAC TTC GCT

TCT GAC GCA ACC ATC ACT GAC CGT AAC GGC AAA GTT TAC TTC GCT GAC AAA GAC

GGT TCT GTT ACC CTG CCG ACC CAG CCG GTT CAG GAA TTC CTG CTG AAA GGT CAC

GTT CGT GTT CGT CCG TAC AAA GAA AAA CCG GTT CAG AAC CAG GCT AAA TCT GTT

GAC GTT GAA TAC ACT GTT CAG TTC ACT CCG CTG AAC CCG GAC GAC GAC TTC CGT

CCG GGT CTG AAA GAC ACT AAA CTG CTG AAA ACC CTG GCT ATC GGT GAC ACC ATC

ACC TCT CAG GAA CTG CTG GCT CAG GCT CAG AGC ATC CTG AAC AAA ACC CAC CCG

GGT TAC ACC ATC TAC GAA CGT GAC TCC TCT ATC GTT ACT CAC GAC AAA GAC ATC

TTC CGT ACC ATC CTG CCG ATG GAC CAG GAA TTC ACT TAC CAC GTT AAA AAC CGT

GAA CAG GCT TAC GAA ATC AAC AAA AAA TCT GGT CTG AAC GAA GAA ATC AAC AAC

ACT GAC CTG ATC TCT GAA AAA TAC TAC GTT CTG AAA AAA GGT GAA AAA CCG TAC

GAC CCG TTC GAC CGT AGC CAC CTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAC GTT

AAC ACC AAC GAA CTG CTG AAA AGC GAA CAG CTG CTG ACC GCT AGC GAA CGT AAC

CTG GAC TTC CGT GAC CTG TAC GAC CCG CGT GAC AAA GCT AAA CTG CTG TAC AAC

AAC CTG GAC GCT TTC GGT ATC ATG GAC TAC ACC CTG ACT GGT AAA GTT GAA GAC

AAC CAC GAC GAC ACC AAC CGT ATC ATC ACC GTT TAC ATG GGT AAA CGT CCG GAA

GGT GAG AAC GCT AGC TAC CAC CTG GCT TAC GAC AAA GAC CGT TAC ACC GAA GAA

GAA CGT GAA GTT TAC AGC TAC CTG CGT TAC ACC GGT ACC CCG ATC CCG GAC AAC

CCG AAC GAC AAA TAA

                              SEQ ID NO：2

重组人链激酶氨基酸序列

MKNYLSFGMFALTFGTVNSVQAIAGPEWLLDRPSVNNSQLVVSVAGTVEGTNQDISLKFFEIDLT

SQPAHGGKTEQGLSPKSKPFATDSGAMPHKLEKADLLKAIQEQLIANVHSNDDYFEVIDFASDAT

ITDRNGKVYFADKDGSVTLPTQPVQEFLLKGHVRVRPYKEKPVQNQAKSVDVEYTVQFTPLNPDD

DFRPGLKDTKLLKTLAIGDTITSQELLAQAQSILNKTHPGYTIYERDSSIVTHDKDIFRTILPMD

QEFTYHVKNREQAYEINKKSGLNEEINNTDLISEKYYVLKKGEKPYDPFDRSHLKLFTIKYVDVN

TNELLKSEQLLTASERNLDFRDLYDPRDKAKLLYNNLDAFGIMDYTLTGKVEDNHDDTNRIITVY

MGKRPEGENASYHLAYDKDRYTEEEREVYSYLRYTGTPIPDNPNDK

                            SEQ ID NO：3

pXSY-1质粒核苷酸序列

AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTA

AAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCAGGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATT

TGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTT

CTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGGGAATTCGAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGA

TACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACT

CAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAG

TCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCG

AAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTT

GCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATA

TTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGA

AACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAG

TTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCA

ACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGA

ATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTT

GCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCC

TGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGA

TAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTAT

CATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACA

GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTT

TTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCC

CGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGT

TTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCC

GTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAA

GTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT

GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGCGGGACAGGTATCC

GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCT

CTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTT

TTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCG

CCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTAT

TTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTC

ATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTC

TCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCA

TAATGTGCCTGTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTACCAATTATGAC

AACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAA

TAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGG

TCCTCGCGCCAGCTTAAGACGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGCTG

GCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCATCGGTGGATGGAGCGACTCGTTA

ATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCAGCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATT

TGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCTGGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCA

TGCCAGTAGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAATCTCTCCTGGCGGG

AACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCCCCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCT

TTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGATAACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTAT

CCCGGCAGCAGGGGATCATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAG

                                   SEQ ID NO：4

pXSY-2质粒核苷酸序列

AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGC

TTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCC

ACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTAT

CGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAACAGGAGGAATTAAATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGT

GGTGCCGTTCTATAGCCATAGCACCCCATGGGAATTCGAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGA

TTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACT

CAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAG

GCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGAT

TTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATC

CTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATA

ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGC

ATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT

CGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCT

ATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA

CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGC

GGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGA

TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAA

ACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT

GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGG

GCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGA

GATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTA

ATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGA

CCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACC

AGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGT

CCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGT

GGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAAC

GGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCAC

GCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA

CGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCT

ATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCC

TGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAG

CGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTAC

AATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCA

ACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGT

CAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCTGT

CAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTACCAATTATGACAACTTG

ACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAA

TAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATA

CGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGACGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGC

TGTGCGACGCTGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCATCGGT

GGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCAGCAGCTCCGAATAGCGCCCT

TCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCTGGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTG

GCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGTAGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCC

GGATGACGACCGTAGTGATGAATCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTC

ACCACCCCCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGATAACCGTTG

GCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGATCATTTTGCGCTTCAGCCATACTT

TTCATACTCCCGCCATTCAGAG

Claims (11)

1.一种生产链激酶的方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(a)在适合的表达条件下，培养大肠杆菌工程菌，该工程细胞携带选自下组的表达载体：含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体，且在所述表达载体中插入了链激酶的编码序列，从而表达出可溶性、高活性的链激酶；

(b)分离纯化出步骤(a)中表达的重组链激酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在权利要求1所述的载体中插入了重组链激酶的编码序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在权利要求4所述的载体中插入了重组链激酶的编码序列。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组链激酶的编码序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：2所示的蛋白质。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括步骤：

(i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除发酵清液，获得菌体；

(ii)破细胞，获得破菌液；

(iii)对破菌液进行离心以去除菌体碎片，获得破菌液上清液；

(iv)层析纯化，所述的层析纯化选自：阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(iii)和(iv)之间，还包括步骤：通过盐析和/或超滤对破菌液上清液进行初步纯化。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养条件是：培养温度为30-40℃，更佳地34-38℃；pH在6～8之间，更佳地在6.5～7.5之间；葡萄糖或甘油浓度为0.1～5％，更佳地在0.3～3％；诱导剂为L-阿拉伯糖，浓度在0.00002～0.2％，更佳地在0.002～0.2％；诱导前OD₆₀₀在0.1～20之间，更佳地在1～10之间；诱导时间0.5～10小时，更佳地1～5小时。

10.一种表达载体，其特征在于，它是选自下组的表达载体：含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体，且在所述表达载体中插入了重组链激酶的编码序列。

11.一种大肠杆菌宿主细胞，其特征在于，该工程细胞携带选自下组的表达载体：含阿拉伯糖诱导的启动子的表达载体和既含有阿拉伯糖诱导的启动子又有能把目的蛋白引导到细胞间质的功能的表达载体，且在所述表达载体中插入了重组链激酶的编码序列。

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