CN104069228A - 一种核壳结构的生物粘附微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种壳核双层结构的生物粘附微球及其制备方法，以左金丸总生物碱为模型药物，壳聚糖、海藻酸钠、明胶等天然高分子聚合物作为载体材料，构建具有生物黏附性的智能水凝胶药物释放系统。本发明的核壳结构的生物粘附微球延长了药物的胃内滞留时间，增加药物吸收，改善口服用药治疗胃溃疡的生物利用度。为古方赋予现代研究方法，开发出更合理有效的抗胃溃疡药物新剂型。本发明还阐明了此微球的体外药物释放性能及其体外生物粘附作用。

Description

一种核壳结构的生物粘附微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种壳核双层结构的左金丸总生物碱生物粘附微球，其制备方法、药物处方抗炎作用研究以及其药剂学研究。

背景技术

左金丸是出于朱丹溪《丹溪心法·火六》的名方，用于肝经火旺所致之胁肋胀痛，呕吐吞酸、嗳气口干，舌红苔黄，脉象弦数等症，有清泻肝火，降逆止呕之功。左金丸原方由黄连六两(用姜汁炒)和吴茱萸一两(或半两，用盐水泡)组成，共为末，做成水丸或蒸饼为丸，白汤服下。现代常取末，以水泛为丸，每次服3g；或按原比例入汤剂服用。

左金丸中的有效成分为生物碱，其中主要成分是盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、药根碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱。左金丸对于消化系统具有广泛的药理作用，并且可以抗炎、抑菌及镇痛，其制剂广泛应用于临床。消化性溃疡属中医“胃脘痛”、“腹胀”、“痞满”的范畴，这些正好符合左金丸的传统适应症；并且通过现代药理学研究表明左金丸能够通过抑制幽门螺杆菌、调节炎性细胞因子分泌、减少胃酸分泌、保护胃粘膜等途径有效地治疗消化性溃疡；还能通过调节神经内分泌系统对抗应激性溃疡。

左金丸古方以丸剂入药，“丸药以舒缓为治”，“丸者缓也”。丸剂服用后在胃肠道崩解缓慢，逐渐释放药物，作用持久，但是研究发现大多数口服药物主要在小肠中上部十二指肠至回肠远端的无菌部位吸收，药物通过无菌部位后，将被逐渐增多的细菌所分解，进行生物转化，只有代谢物和极少量药物被吸收。释放的药物以溶液状态到达无菌部位的量越大，吸收就越多，滞留时间越长，吸收时间也愈长。药物通过无菌部位的最短时间即药物吸收的最短时间，约为一小时。因此在消化性溃疡口服给药治疗中，常用的药物剂型遇到了挑战，片剂、胶囊剂等剂型给药对幽门螺杆菌的根灭率很低。为延长药物的胃内滞留时间，增加药物吸收，改善口服用药治疗胃溃疡的生物利用度，胃内滞留漂浮型给药系统和胃肠道生物黏附给药系统，是近年来治疗消化道系统疾病研究的热点。

胃肠道生物黏附给药系统是利用高分子辅料的生物黏附特性，紧密附着在胃、肠粘膜层/上皮细胞表面，延长药物制剂在胃肠道的停留时间，增加药物与胃肠粘膜的接触及对胃肠道上皮细胞的穿透力，从而促进药物吸收，提高药物的生物利用度。

壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，是甲壳素的脱乙酰化产物，又称脱乙酰甲壳素、甲壳胺，它的来源广泛，性质稳定。壳聚糖的结构中包含葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺，由甲壳质经脱乙酰反应得到。壳聚糖及其分解产物无毒性，具有生物相容性和生物可降解性，有抗菌消炎、促进伤口愈合、抗酸、抗溃疡、降血脂和降胆固醇等多种作用。水凝胶是具有亲水性但不溶于水的聚合物，它们在水中可溶胀至一平衡体积仍能保持聚合物的网络结构。壳聚糖基材料属于阳离子型pH-敏感性水凝胶，其pH敏感性主要来自于氨基的质子化，氨基越多，水凝胶水化作用越强；在pH值较低时，由于氨基(-NH₃ ⁺)的质子化作用，使得其分子结构中主要带阳离子，易粘附于胃粘膜表面。

选用壳聚糖等天然高分子聚合物作为载体材料，构建具有生物黏附性的智能水凝胶药物释放系统。为古方赋予现代研究方法，开发出更合理有效的抗胃溃疡药物新剂型奠定基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有药物左金丸的技术难题，提供一种壳核双层结构的左金丸生物粘附微球的制备方法及由该方法制备的左金丸生物粘附微球，本发明方法制备的左金丸生物粘附微球，延长药物左金丸在胃内滞留时间，增加药物吸收，提高了其生物利用度。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种核壳结构的生物粘附微球的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)制备载体微球核

1-A）：将明胶与海藻酸钠的水溶液加入到混合乳化液中，进行两次乳化处理，然后加入异丙醇，进行第三次乳化处理，制得第一载体乳化液；

1-B）：将第一载体乳化液滴加到第一交联液中，接着进行两次交联反应后进行静置沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥处理，制得载体微球核；

2)制备载药微球核

2-A）：将原料药黄连和吴茱萸加入到乙醇溶液中，加热回流提取，对提取液进行浓缩、干燥处理，制得总生物碱提取物；

2-B）：将总生物碱提取物加入到无水乙醇中，进行超声处理，制得总生物碱乙醇液；

2-C）：将载体微球核浸泡于总生物碱乙醇液中，加热回收乙醇，使总生物碱吸附于载体微球核上，得到载药微球核；

3)制备生物粘附微球

3-A）：首先将载药微球核浸泡于壳聚糖溶液中，搅拌，使载药微球核吸附壳聚糖，然后进行离心处理，得到壳聚糖-载药微球核；

3-B）：将壳聚糖-载药微球核浸泡于第二交联液中进行第三次交联处理，即得。

其中，步骤1-A）中所述第一次乳化处理温度高于第二次乳化处理温度；所述混合乳化液由Span80、Tween80和液体石蜡组成。

特别是，所述Span80与Tween80的体积之比为3-5:1；所述Span80和Tween80的总体积与所述液体石蜡的体积之比为1:90-110。

其中，步骤1-A）中所述明胶与海藻酸钠的水溶液与混合乳化液的体积之比为4-6：1。

特别是，将所述明胶与海藻酸钠的水溶液滴加到混合乳化液中，其中所述滴加的速率为5-10ml/min。

其中，所述第一次乳化处理的温度为35-55℃；所述第二次乳化处理的温度为0℃。所述第一次乳化处理的处理时间为10-30min；所述第二次乳化处理时间为10-30min。

特别是，在搅拌状态下进行所述的乳化处理。

尤其是，所述搅拌状态下的搅拌速率为300-500rpm。

其中，所述明胶与海藻酸钠的水溶液中明胶与海藻酸钠的重量之比为6-8:2-4；明胶与海藻酸钠的总重量与水的体积之比为2-10:100（g/ml），即每100ml水中含有明胶与海藻酸钠的总重量为2-10g。

其中，第三次乳化处理的温度为0℃，乳化时间为5-15min。

特别是，所述第三次乳化处理过程中加入的异丙醇与明胶与海藻酸钠的水溶液的体积之比为1:1-3。

其中，步骤1-B）中所述第一交联液由碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲液混合而成；

特别是，所述第一交联液中碳二亚胺（EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的重量之比为3-5:1。

特别是，所述第一交联液中所述碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的总重量与所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲液的体积之比为50-70:1（g/ml），即向每1ml所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲液中混合的碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的总重量是50-70g。

尤其是，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度为50mM，pH为5-7。

特别是，所述滴加的速率为5-10ml/min。

其中，步骤1-B）中所述第一次交联反应温度低于第二次交联反应温度。

特别是，所述第一次交联反应的温度为0℃；所述第二次交联反应的温度为10-30℃；所述第一次交联反应的时间为45-75min；所述第二次交联反应的时间为3-5h。

特别是，在搅拌状态下进行所述的交联反应，其中，所述搅拌的速率为300-500rpm。

其中，所述静置沉淀的温度为0-4℃，析出沉淀。

特别是，还包括将静置后的沉淀物依次进行离心处理、干燥处理、溶胀处理之后再进行所述冷冻干燥处理。

其中，所述的离心处理过程中离心的转速为3500-4500rpm，离心时间10-30min，优选为10min；所述干燥处理过程中干燥温度为50-60℃，干燥至含水率低于5%；所述溶胀处理是将干燥后含水率低于5%的沉淀浸泡在纯水中至少24h。

特别是，所述溶胀处理时间为24--48h。

特别是，所述冷冻干燥处理过程中温度为-45℃，绝对压力为13Pa。

特别是，还包括步骤1-C）：向第二次交联反应混合物中加入交联终止剂丙酮，终止交联反应，其中，丙酮与第一载体乳化液的体积之比为1:1-3。

其中，步骤2-A）中所述黄连与吴茱萸的重量份配比为4-8:1，优选为6：1；乙醇溶液的质量百分比浓度为60-75%；加热回流提取次数为3-5次，每次的提取时间为1.5-2h；每次提取时黄连、吴茱萸的总重量与乙醇溶液的体积之比为1:8-12（g/ml或kg/L），优选为1：10，即每1g黄连与吴茱萸混合原料药中加入乙醇溶液8-12ml或每1kg黄连与吴茱萸混合原料药中加入乙醇溶液8-12L；浓缩后的提取液的相对密度为1.10-1.30，优选为1.20；所述干燥为真空冷冻干燥，干燥过程中的温度为-45℃，绝对压力为13Pa。

其中，步骤2-B）中所述总生物碱提取物的重量与无水乙醇的体积之比为5-25：100(g/ml或kg/L)，优选为4-20：100，进一步优选为12：100；即每100ml的无水乙醇中加入5-25g左金丸总生物碱提取物或每100L的无水乙醇中加入5-25kg左金丸总生物碱提取物。

特别是，步骤2-B）中所述超声处理过程中超声处理时间为20-60min，超声处理温度为15-30℃。

尤其是，所述超声处理过程中超声波的频率为20-25kHz，优选为20kHz；所述超声波的脉冲时间为1～10s﹕1-10s（on/off），优选为1～5s﹕1～5s（on/off），进一步优选为2s﹕2s（on/off），即超声波持续发生时间为（on）1～10s，超声波停止发生时间（即间歇时间）（off）为1～10s。

其中，步骤2-C）中所述载体微球核的总重量与总生物碱乙醇液的体积之比为1:5-8（g/ml），即每1g载体微球核浸泡于5-8ml的总生物碱乙醇液中。

其中，步骤3-A）中所述搅拌处理的搅拌速率为100-200rpm，搅拌温度为40-50℃，搅拌时间为20-40min。

特别是，步骤3-A）中所述壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解于质量百分比浓度为0.1-1%的冰醋酸溶液制成的混合溶液，其中壳聚糖的重量与冰醋酸溶液的体积之比为1:20-200（g/ml），即每1g的壳聚糖溶解于20-200ml的冰醋酸溶液中。

其中，步骤3-B）中所述第三次交联处理的时间为2-4h，交联处理的温度为10-30℃。

特别是，步骤3-B）中所述第二交联液由碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液-无水乙醇的溶液（MES乙醇溶液）混合组成。

尤其是，所述MES乙醇溶液是将MES缓冲液中加入到无水乙醇中混合而成，其中MES缓冲液与无水乙醇的体积之比为1:1-4。

特别是，所述第二交联液中的碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的重量之比为3-5:1。

其中，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液-无水乙醇混合溶液中2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液与无水乙醇的体积之比为1:1-4。

特别是，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度为50mM，pH为5-7。

特别是，所述第二交联液中碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的总重量与所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液-无水乙醇混合溶液的体积之比为40-100:1（mg/ml），即每1ml2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液-无水乙醇混合溶液中混合的碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的总重量为40-100mg。

特别是，第三次交联处理过程中进行搅拌，搅拌速率为150-250rpm；

特别是，第三交联处理后对交联反应后的混合物进行离心处理，离心沉淀物干燥至恒重。

尤其是，所述离心处理过程中离心速率为3500-4500rpm，离心时间为5-10min；所述干燥温度为35-45℃。

本发明另一方面提供一种按照上述方法制备而成的左金丸核壳结构生物粘附微球。

本发明制备的左金丸生物粘附微球具有以下优点：

1、本发明制备的左金丸生物微球具有壳核双层结构，药物负载于内部核心球表面，药物载药量高，药物的外层包裹壳聚糖，将药物固定，减少药物损失。

2、本发明方法制备的左金丸生物粘附微球的外层壳为壳聚糖，具有良好的粘膜粘附性，能在胃液的酸性环境下很好的粘附于胃粘膜表面，能长时间定位停留在胃粘膜表面，即能在胃粘膜表面定位停留较长时间，持续释放药物，药效持久，突释效应减小，避免了短时间内药物浓度过大，增加了药物吸收，药物利用率高，改善口服用药治疗胃溃疡的生物利用度，体外释药表明，左金丸粘附微球能在8-10h内持续释放，药物累积释放率达到：盐酸药根碱61.34%，盐酸巴马汀72.00%，盐酸小檗碱72.39%，吴茱萸碱82.16%，吴茱萸次碱58.29%。

3、本发明方法制备左金丸生物粘附微球的过程中采用冷冻干燥微球核，微球核的表面布满褶皱与凹陷，利于药物分子的吸附，药物载药量大，左金丸粘附微球中5种主要生物碱的载药量分别为：盐酸药根碱的载药量为2.653-2.895mg/g；盐酸巴马汀的载药量为3.792-4.161mg/g；盐酸小檗碱的载药量为21.06-23.12mg/g；吴茱萸碱的载药量为1.401-1.510mg/g；吴茱萸次碱的载药量为0.9164-.09820mg/g。

4、本发明制备的左金丸粘附微球具有较好的胃粘附特性，平均胃粘附百分率为89.33%，因此在消化性溃疡口服给药治疗中，本发明的粘附微球粘附于胃溃疡患处，药物直接作用于患处，在固定部位长效释放药物，持续作用，促进溃疡面愈合。

5、本发明左金丸粘附微球的制备过程中采用“零长度交联剂”碳二亚胺(EDC)，在交联中并不构成药物的组成部分，制得的左金丸生物粘附微球中几乎不存在EDC成分，毒性小。

6、本发明制备的左金丸粘附微球的外层壳为壳聚糖，其为pH敏感型阳离子型水凝胶材料，具有良好的粘膜粘附性能、生物相容性和生物可降解性，并且其对于机体无毒，有抗菌消炎、促进伤口愈合、抗酸、抗溃疡等作用。

7、本发明的制备方法工艺条件容易控制，制备的产品质量可控，适宜工业化大生产。附图说明

图1为微球扫描电镜图：其中1a)实施例1制备的载体微球核；1b)实施例1制备的载药微球核；1c)实施例1制备的生物粘附微球；1d)实施例2制备的生物粘附微球；

图2为壳聚糖包裹前后微球的粒径分布图：其中2a)实施例1制备的载体微球核；2b)实施例1制备的生物粘附微球；

图3为傅里叶变换红外光谱图：3a)明胶-海藻酸钠物理共混物(7:3w/w)；3b)实施例1制备的载体微球核；3c)实施例1制备的生物粘附微球；

图4为差示扫描量热分析图谱：其中4a)载体微球核；4b)载药微球核；4c)实施例1制备的生物粘附微球；

图5左金丸生物粘附微球的体外的溶出曲线图。

具体实施方式

本发明实施例中使用的试剂如下：

MES缓冲液：精密称取2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)粉末9.76g，溶解于去离子水中，定容至1000mL，测定pH2.5左右，以1M的NaOH溶液调节溶液pH值为5.0-7.0，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得浓度为50mM的MES缓冲液，4°C保存，备用。实施例1

1、制备生物碱乙醇液

1)将原料药黄连、吴茱萸粉碎后加入质量百分比浓度为60-75%的乙醇溶液中，加热回流提取3-5次，每次1.5-2h，其中黄连与吴茱萸的重量之比为6:1，每次提取过程中黄连与吴茱萸的总重量与乙醇溶液的总体积之比为1:8-12(g/ml或kg/L)，即每1g黄连与吴茱萸混合原料药中加入乙醇溶液8-12ml或每1kg黄连与吴茱萸混合原料药中加入乙醇溶液8-12L；

2)合并回流提取液，浓缩成相对密度为1.10-1.30的浸膏，然后将浸膏置于冷冻干燥机(Savant Modulyo D型冷冻干燥机，Thermo公司，美国)中进行冷冻干燥至恒重，得总生物碱提取物。

本发明中黄连与吴茱萸的重量之比除了6:1之外，其重量之比还可以是4-8:1，即重量份配比为4-8:1的黄连与吴茱萸经过加热回流得到的提取液均适用于本发明。

本发明实施例中每次提取过程中黄连与吴茱萸的总重量与乙醇溶液的总体积之比为1:10，提取次数为3次，每次提取时间为1.5h；浓缩后的浸膏的相对密度为1.20。

3)制备总生物碱乙醇液

取左金丸总生物碱提取物加入到无水乙醇中后置于超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB-1000YDTD）中，在室温（15-30℃）下进行超声溶解20-60min，然后冷却至室温(15-30℃)，离心取上清液，即得到总生物碱乙醇液，过量未溶解的总生物碱提取物滤除以备后续使用，其中，左金丸总生物碱提取物的总重量与无水乙醇的体积之比为5-25：100(g/ml或kg/L)，即每100ml的无水乙醇中加入5-25g左金丸总生物碱提取物或每100L的无水乙醇中加入5-25kg左金丸总生物碱提取物；超声处理过程中超声波的频率为20-25kHz；所述超声波的脉冲时间为1～10s﹕1-10s（on/off），即超声波持续发生时间为（on）1～10s，超声波停止发生时间（即间歇时间）（off）为1～10s。

本发明实施例中以总生物碱提取物的总重量与无水乙醇的体积之比为12：100(g/ml或kg/L)为例，其他总生物碱提取物的总重量与无水乙醇的体积之比为5-25：100(g/ml或kg/L)均适用于本发明；超声波处理过程中超声波频率为20kHz，超声波的脉冲时间为2s﹕2s（on/off），即超声波持续发生时间为（on）2s，超声波停止发生时间（即间歇时间）（off）为2s。本发明实施例中超声溶解时间为20min。

采用HPLC测定左金丸生物碱乙醇液中5种生物碱的含量，色谱分析仪器、试剂和测定条件如下：

仪器：Waters600E型高效液相色谱仪，Waters公司，美国；

色谱柱：Kromasil C₁₈Column(250mm×4.6mm,5μm)，瑞典；

流动相：A(乙腈)；B(0.1%磷酸和0.05%三乙胺的水溶液)梯度洗脱，洗脱梯度见表1；

流速：1mL/min；柱温：室温；检测波长：225nm、265nm；进样量：10μL。

表1  HPLC梯度洗脱条件

测定结果如表2所示：

表2  左金丸乙醇提取液中5种生物碱含量

2、制备微球核

1)制备混合乳化液

将乳化剂Span80和Tween80一起加入到液体石蜡中，在45°C下，搅拌均匀，制得混合乳化液，备用，其中，乳化剂Span80和Tween80的体积之比为4:1；乳化剂Span80和Tween80的总体积与液体石蜡的体积之比为1：100，即100ml石蜡中加入乳化剂Span80和Tween80的总体积为1ml或1L石蜡中加入乳化剂Span80和Tween80的总体积为1L。

2)制备第一载体溶液

将明胶和海藻酸钠加入到水中，搅拌溶解，制成第一载体溶液(即明胶-海藻酸钠水溶液)，备用，其中，明胶与海藻酸钠的重量之比为7:3；明胶与海藻酸钠的总重量与水的体积之比为2:100(g/ml)，即每100ml水中加入的明胶与海藻酸钠的总重量为2g。

3)乳化处理

3-A）：在温度为45°C下，边搅拌边将第一载体溶液(即明胶-海藻酸钠水溶液)滴入到混合乳化液中，进行第一次乳化处理，其中，滴加速度为8ml/min，搅拌速度为400rpm，第一载体溶液与混合乳化液的体积之比为5：1，滴加完成后再搅拌乳化15min（即第一次乳化处理时间为15min），获得第一次乳化混合物。

3-B）：将第一乳化混合物转移至装满冰块的不锈钢容器中进行冰浴处理，即在温度为0℃的条件下，搅拌，进行第二次乳化处理，得到第二乳化混合物，其中，搅拌速率为400rpm，第二次乳化处理时间为15min。

第一次乳化处理使明胶和海藻酸钠分散到油相(混合乳化液)中，形成微小水相液滴，作为下一步交联成球的基础。第二次乳化处理使体系温度降低，水相中的明胶粘度增加，发生凝胶化变化，使微球的形貌固定，使得后续处理过程中微球不发生解体或压积。

3-C）：在0℃的冰浴条件下，边搅拌边向第二乳化混合物中加入异丙醇，进行第三次乳化处理，制得第三次乳化混合物（即第一载体乳化液，稳定的明胶-海藻酸钠W/O乳液)，其中，搅拌速率为400rpm，第三次乳化处理时间为10min，异丙醇与第一载体溶液的体积之比为1:2。

4)交联处理

4-A）：将交联剂碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到MES缓冲液（浓度为50mM，pH为5)中，搅拌溶解制得第一交联液，其中，交联剂EDC与NHS的重量之比为4:1，第一交联液中交联剂EDC与NHS的总重量与MES缓冲液的体积之比为60:1(mg/mL)，即每1毫升MES缓冲液中加入的交联剂EDC与NHS的总重量为60mg；

本发明中MES缓冲液的pH除了为5.0之外，pH为5.0-7.0的MES缓冲液均适用于本发明。

4-B）：在冰浴条件下，边搅拌边向第三次乳化混合物（即第一载体乳化液）中滴加第一交联液，第一交联液滴加完后继续搅拌，进行第一次交联反应，得到第一次交联反应混合物，其中继续搅拌60min（即第一次交联反应时间为60min），搅拌速率为400rpm，搅拌温度为0℃，即冰浴温度为0℃，滴加速度为8ml/min；

4-C）：去除冰浴，水浴升温并保持为20℃，在此条件下进行第二次交联反应，其中，第二次交联反应时间为4h，搅拌速率为400rpm；

交联剂EDC与NHS使来自于明胶的氨基和来自于明胶或海藻酸钠的羧基发生交联反应，生成肽键。第一次交联主要是表面交联，第二次是内部交联。第一次交联为低温轻度交联，使微球表面发生交联可以维持其基本形貌；然后升温进行第二次交联，温度升高后微球内部的传质阻力降低，可使交联剂容易渗入微球内部，保证微球内部可得到充分交联。两步交联反应确保微球在交联过程中形貌不发生过度皱缩甚至破裂。

4-D）：加入丙酮，搅拌，终止交联反应，并于0-4℃下静置存放，析出沉淀，其中，加入的丙酮与第一载体乳液（明胶-海藻酸钠W/O乳液）的体积之比为1:2。

5)清洗、干燥处理

5-A）：将沉淀依次加入丙酮、异丙醇中，混匀后再分别进行离心处理，去除上清液，收集底层沉淀，其中，离心处理过程中转速为4500rpm，离心时间10min，丙酮清洗除去残余油相，如液体石蜡；异丙醇清洗除去多余的水分；

5-B）：将异丙醇清洗后的沉淀于50-60℃下干燥至含水率低于5%，去除异丙醇，接着将沉淀浸泡在纯水中充分溶胀24h，使干燥后的沉淀充分吸收水分，然后将充分吸水后的沉淀置于冷冻干燥机（Savant Modulyo D型冷冻干燥机，Thermo公司，美国）中进行真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为-45℃，绝对压力为13Pa，经冷冻使得微球内部的水分与微球之间的水分都冻成冰，在低温与高真空状态下，瞬间使固态水(冰)升华，从而使得明胶-海藻酸钠沉淀的表面出现凹陷与孔道，利于药物吸附，制得载体微球核（即明胶-海藻酸钠微球核）。

将清洗后的沉淀进行干燥处理至含水率低于5%后，浸泡于纯水中溶胀至少24h，然后将溶胀后的沉淀进行冷冻干燥，制得所述的载体微球核。

制备的载体微球核的形貌特征采用扫描电镜法(SEM)进行检测，检测结果如图1(a)所示。

从图1(a)中可以看出本发明制备的载体微球核形态规则、基本呈圆球形，粒度分布均匀，表面布满褶皱与凹陷，利于药物的吸附。

采用激光散射粒度分析仪测定载体微球核的平均粒径与粒度分布曲线，测定结果如图2(a)所示，明胶-海藻酸钠微球的平均粒径为302.02μm。

3、制备载药微球核

将载体微球核加入到左金丸生物碱乙醇液中，然后进行水浴加热，回收乙醇，使载体微球核充分吸附生物碱，制得载药微球核，其中，载体微球核的重量与左金丸总生物碱乙醇液体积之比为1:6(g/ml)，即每1g载体微球核浸泡于6ml的左金丸生物碱乙醇液中。

制备的明胶-海藻酸钠载药微球核的形貌特征采用扫描电镜法(SEM)进行检测，检测结果如图1(b)所示。

由图1(b)中可以看出经冷冻干燥法制备的明胶-海藻酸钠微球形态规则、基本呈圆球形，粒度分布均匀，表面布满褶皱与凹陷，褶皱与凹陷中有吸附的生物碱的细小的针状物和小球状物。

4、制备左金丸生物粘附微球

1)制备第二载体溶液

将壳聚糖加入到体积百分比浓度为1%的冰醋酸纯水溶液中，搅拌溶解，制得第二载体溶液(即壳聚糖溶液)，其中，壳聚糖的重量与冰醋酸纯水溶液的体积之比为1:100(g/ml)，即每100ml的体积百分比浓度为1%的冰醋酸纯水溶液中溶解1g壳聚糖。

本发明中采用体积百分比浓度为1%的冰醋酸溶液溶解壳聚糖，体积百分比浓度为0.1-1%的冰醋酸溶液均适用于本发明，可用于溶解壳聚糖。

2)制备壳聚糖-载药微球核

将载药微球核浸泡于第二载体溶液(即壳聚糖溶液)中，在45℃下搅拌30min，搅拌速率为150rpm，使明胶-海藻酸钠载药微球核均匀分散于壳聚糖溶液中，使其均匀吸附壳聚糖，然后进行离心处理，去除上清液，离心沉淀物即为壳聚糖-载药微球核，其中离心速率为4500rpm，离心时间为5min。

离心处理过程中除去多余的壳聚糖溶液，避免了交联时壳聚糖层较厚，增加微球粒径，本发明方法制备的粘附微球的壳聚糖壳厚度薄，均匀。

3)配制第二交联液

A：向MES缓冲液（浓度为50mM，pH为5.0）中加入无水乙醇，制成乙醇-MES溶液，其中，MES缓冲液与无水乙醇的体积之比为1:1，即制得的乙醇-MES溶液中乙醇的体积百分比浓度为50%；

本发明实施例中MES缓冲液与无水乙醇的体积之比选择为1:1，其他MES缓冲液与无水乙醇的体积之比为1:1-4也适用于本发明。

B：向乙醇-MES溶液中加入交联剂EDC、NHS，搅拌溶解，制得第二交联液，其中，第二交联液中EDC与NHS的重量之比为4:1，EDC和NHS的总重量与乙醇-MES溶液的体积之比为50:1(mg/ml)，即每1ml乙醇-MES溶液中加入交联剂EDC和NHS的总重量为50mg。

4)第三次交联处理

A：将壳聚糖-载药微球核浸泡在第二交联液中，搅拌，进行第三次交联处理，得到第三次交联反应混合物，其中，第三次交联反应时间为3h，交联反应温度为10℃，搅拌转速为200rpm；包裹在微球外层的壳聚糖与微球内核的明胶之间发生交联反应，即壳聚糖的氨基和明胶的羧基发生反应，生成肽键。

B：对第三次交联反应混合物进行离心处理，得到的离心沉淀物用纯水洗涤3次，除去未发生交联反应的壳聚糖，交联剂EDC、NHS，然后将沉淀物在40℃下烘干至恒重，即得左金丸生物粘附微球，其中，离心速率为3700rpm，离心时间为8min。

制备的左金丸生物粘附微球采用扫描电镜法(SEM)检测微球的形貌特征，检测结果如图1(c)。

从图1(c)中可以看出本发明制备的左金丸生物粘附微球形态规则、基本呈圆球形，粒度分布均匀，表面布满褶皱与凹陷，与载体微球核相比，包裹壳聚糖后的微球表面较为光滑，褶皱与凹陷变浅，表明壳聚糖交联包裹前后微球的表面形态发生改变，反应出壳聚糖交联成功，包裹在明胶-海藻酸钠载药微球核的表面。

采用激光散射粒度分析仪测定左金丸生物粘附微球的平均粒径与粒度分布曲线，测定结果如图2(b)所示，当以壳聚糖包裹微球后，大分子量的壳聚糖材料增加微球粒径，其平均粒径为368.15μm，微球粒径增大，说明壳聚糖成功包裹在明胶-海藻酸钠载药微球核的表面。

实施例2

1、制备微球核过程中，除了如下所述不同之外，其余与实施例1相同，具体如下：

1)混合乳化液制备步骤中乳化剂Span80和Tween80的体积之比为3:1；乳化剂Span80和Tween80的总体积与液体石蜡的体积之比为1：90；搅拌温度为50℃；

2)第一载体溶液制备步骤中明胶与海藻酸钠的重量之比为6:4，明胶与海藻酸钠的总重量与水溶液的体积之比为10:100(g/ml)，即每100ml水中加入的明胶与海藻酸钠的总重量为10g；

3)乳化处理步骤中：

第一次乳化处理的温度为35℃，搅拌速度为500rpm，明胶-海藻酸钠水溶液滴入混合乳化液中的滴加速度为10ml/min，滴加完后再乳化处理时间为30min，第一载体溶液与混合乳化液的体积之比为4:1；

第二次乳化处理的温度为0℃，搅拌速度为300rpm，乳化处理时间为30min；

第三次乳化处理中加入的异丙醇与第一载体溶液的体积之比为1：3，搅拌速度为300rpm，乳化时间为15min，乳化温度为0℃；

4)交联处理步骤中第一交联液中EDC与NHS的重量之比为5:1，EDC与NHS的总重量与MES缓冲液的体积之比为50：1(mg/mL)，即每1毫升MES缓冲液中加入的交联剂EDC与NHS的总重量为50mg；第一次交联处理的温度为0℃，搅拌速度为300rpm，滴加完第一交联液后继续搅拌75min（即第一次交联反应时间为75min）；第一交联液的滴加速度为10ml/min；第二次交联处理的温度为10℃，搅拌速度为300rpm，交联反应时间为5h；终止交联处理时加入的丙酮与第一载体乳液的体积之比为1:3。

2、制备载药微球核过程中，除了载体微球核的重量与左金丸总生物碱乙醇液体积之比为1：8(g/ml)，即每1g载体微球核浸泡于8ml的左金丸总生物碱乙醇液中之外，其余与实施例1相同。

3、制备左金丸生物粘附微球过程中，除了下述不同之外，其余与实施例1相同，具体如下：

1)第二载体溶液(即壳聚糖溶液)制备步骤中壳聚糖的重量与冰醋酸纯水溶液的体积之比为1:20(g/ml)，即每100ml的体积百分比浓度为1%的冰醋酸纯水溶液中溶解5g壳聚糖；

2)壳聚糖-载药微球核制备步骤中搅拌处理温度为40℃，搅拌速率为200rpm，搅拌时间为40min；

3)第二交联液配制步骤中乙醇-MES溶液中MES缓冲液与无水乙醇的体积之比为1：4，即乙醇-MES溶液中乙醇的体积百分比浓度为80%；第二交联液中EDC与NHS的重量之比为5:1，EDC和NHS的总重量与乙醇-MES溶液的体积之比为100:1(mg/ml)，即每1ml乙醇-MES溶液中加入交联剂EDC和NHS的总重量为100mg；

4）交联处理步骤中第三次交联反应的时间为2h，搅拌转速为250rpm，交联反应温度为30℃；

5）第三次交联反应后离心处理过程中离心速率为4500rpm，离心时间为5min；离心沉淀物干燥温度为45℃。

制备的左金丸生物粘附微球采用扫描电镜法(SEM)检测微球的形貌特征，检测结果如图1(d)。

实施例3

1、制备微球核过程中，除了如下所述不同之外，其余与实施例1相同，具体如下：

1)混合乳化液制备步骤中乳化剂Span80和Tween80的体积之比为5:1；乳化剂Span80和Tween80的总体积与液体石蜡的体积之比为1：110；搅拌温度为40℃；

2)第一载体溶液制备步骤中明胶与海藻酸钠的重量之比为8:2，明胶与海藻酸钠的总重量与水溶液的体积之比为5:100(g/ml)，即每100ml水中加入的明胶与海藻酸钠的总重量为5g；

3)乳化处理步骤中

第一次乳化处理的温度为55℃，搅拌速度为300rpm，明胶-海藻酸钠水溶液滴

入混合乳化液中的滴加速度为5ml/min，乳化处理时间为10min，第一载体溶液与

混合乳化液的体积之比为6：1；

第二次乳化处理的温度为0℃，搅拌速度为500rpm，乳化处理时间为10min；

第三次乳化处理中加入的异丙醇与第一载体溶液的体积之比为1：1，搅拌速度为500rpm，搅拌时间为5min；

4)交联处理步骤中第一交联液中EDC与NHS的重量之比为3:1，EDC与NHS的总重量与MES缓冲液的体积之比为70:1(mg/mL)，即每1毫升MES缓冲液中加入的交联剂EDC与NHS的总重量为70mg；第一次交联处理的温度为0℃，搅拌速度为500rpm，交联反应时间为45min；第一载体溶液的滴加速度为5ml/min；第二次交联处理的温度为30℃，搅拌速度为500rpm，交联反应时间为3h；终止交联处理时加入的丙酮与第一载体溶液的体积之比为1:1。

2、制备载药微球核过程中，除了载体微球核的重量与左金丸总生物碱乙醇液体积之比为1：5(g/ml)，即即每1g载体微球核浸泡于5ml的左金丸总生物碱乙醇液中之外，其余与实施例1相同。

3、制备左金丸生物粘附微球过程中，除了下述不同之外，其余与实施例1相同，具体如下：

1)第二载体溶液制备步骤中壳聚糖的重量与冰醋酸纯水溶液的体积之比为1:200(g/ml)，即每200ml的体积百分比浓度为1%的冰醋酸纯水溶液中溶解1g壳聚糖；

2)壳聚糖-载药微球核制备步骤中搅拌处理温度为50℃，搅拌速率为100rpm，搅拌时间为20min，离心处理过程中离心速率为4000rpm，离心时间为7min；

3)第二交联液配制步骤中的乙醇-MES溶液中MES缓冲液与无水乙醇的体积之比为1：2，即乙醇-MES溶液中乙醇的体积百分比浓度为67%；第二交联液中EDC与NHS的重量之比为3:1，EDC和NHS的总重量与乙醇-MES溶液的体积之比为40:1(mg/ml)，即每1ml乙醇-MES溶液中加入交联剂EDC和NHS的总重量为40mg；

4）交联处理步骤中第三次交联反应的时间为4h，搅拌转速为150rpm，交联反应温度为20℃；

5）第三次交联反应后离心处理过程中离心速率为3500rpm，离心时间为10min；离心沉淀物干燥温度为35℃。

试验例1红外光谱分析(FT-IR)

将明胶-海藻酸钠(7:3w/w)物理共混物、实施例1制备的载体微球核（即明胶-海藻酸钠微球核）、左金丸生物粘附微球，分别与溴化钾粉末共同研磨均匀后压片，测定红外光谱，测定结果如图3所示。

图3a）是明胶-海藻酸钠(7:3w/w)物理共混物的红外光谱图，其中的酰胺键特征峰明显，2948.53cm^-1、1652.01cm^-1、1557.59cm^-1是酰胺基团的特征峰，1652.01cm^-1是酰胺谱带Ⅰ的特征峰，即C=O伸缩振动与N-H弯曲振动耦合产生的吸收峰；1557.59cm^-1是酰胺谱带Ⅱ的特征峰，即N-H弯曲振动与C-N弯曲振动耦合产生的吸收峰；3626cm^-1和3292cm^-1是酰胺基团的两个胺基N-H基团的伸缩振动产生的吸收峰；

而发生交联反应后制备得到的载体微球核的红外光谱图显示上述特征峰发生变化，如图3b）所示，其中1652.01cm^-1、3626cm^-1和3292cm^-1波数处吸收峰均发生明显的变化，表明明胶与海藻酸钠发生交联反应，明胶自身也发生了交联反应。

制备的左金丸生物粘附微球（图3c）的红外光谱显示：酰胺谱带Ⅱ的特征峰(1557.59cm^-1)强度的减弱，说明明胶与壳聚糖发生了分子间交联反应，形成了酰胺键，表明明胶、壳聚糖中的游离-NH₂基团转换成N-H基团；-NH₂基团吸收峰的强度强于-NH基团；图3c显示其含有酯键峰(1152.46cm^-1)，表明交联反应生成的酸酐与羟基反应生成酯键。

因此，红外光谱图说明载体微球核的明胶、海藻酸钠中的羧基与包裹在载体微球核外面的壳聚糖中的氨基及羟基发生了交联反应，生成了酰胺和酯键，制备的生物粘附微球物理性能稳定。

试验例2差示量热分析(DSC)

分别精密称取实施例1中的载体微球核、载药微球核、左金丸生物粘附微球样品各5mg，分别置于差示扫描量热仪(Differential Scanning Calorimeter，简称DSC)中，封闭在铝盘中，调节升温速度为5℃/min，升温范围为30～300℃，分别记录各样品的差示热扫描升温曲，差示热扫描升温曲线如图4所示，其中图4a表示载体微球核的差示热扫描升温曲线；图4b表示载药微球核的差示热扫描升温曲线；图4c表示制备的左金丸生物粘附微球产品的差示热扫描升温曲线。

由图4可知，载体微球核、载药微球核的玻璃化转变温度(T_g)分别为：222.33℃和222.65℃，说明药物的载入这一物理吸附过程并未改变微球的热性能；而左金丸生物粘附微球成品升温曲线中出现熔融峰，图4c中的熔融峰温度(T_Peak)为217.13℃，熔融热量ΔH的显著升高，说明微球发生了化学反应，壳聚糖与明胶、海藻酸钠发生交联作用，形成新的物相，使体系更加稳定。

试验例3生物粘附微球包封率和载药量的测定

将实施例1-3制备的左金丸生物粘附微球分别在研钵中研磨粉碎，分别精确称取20mg，接着加入甲醇提取药物，每次提取药物时甲醇的用量为200μL，超声提取10min，提取次数为5次，提取液离心后取上清液，采用HPLC法测定其中所含的5种生物碱的含量，HPLC测定的仪器、试剂和测定条件与实施例制备载药微球核过程中左金丸总生物碱乙醇溶液中5种生物碱的含量测定相同。

根据测定结果计算出粘附微球载药量与包封率，载药量和包封率计算结果如表3、4。

包封率=实际载药量/微球核吸附的乙醇提取液中活性成分的量×100%

表3  左金丸生物粘附微球中5种生物碱的载药量测定结果

检测结果表明：本发明制备的左金丸生物粘附微球的包封率高；药物的载药量大，左金丸粘附微球中5种主要生物碱盐酸药根碱的载药量为2.287-3.609mg/g；盐酸巴马汀的载药量为3.699-5.301mg/g；盐酸小檗碱的载药量为17.642-28.157mg/g；吴茱萸碱的载药量为1.129-1.797mg/g；吴茱萸次碱的载药量为0.7475-1.1955mg/g。

表4  左金丸生物粘附微球中5种生物碱的包封率测定结果

检测结果表明：本发明的载体微球核对药物左金丸乙醇提取液中的活性有效成分吸附效果好、包封效率高，左金丸粘附微球中5种主要生物碱盐酸药根碱的包封率为96.47-99.78%；盐酸巴马汀的包封率为84.95-99.43%；盐酸小檗碱的包封率为99.43-99.95%；吴茱萸碱的包封率为98.60-99.65%；吴茱萸次碱的包封率为99.17-99.27%。

试验例4左金丸生物粘附微球体外释放药物实验

按照《中国药典》2005版二部附录释放度测定第一法“转篮法”测定，分别以脱气的模拟胃液(含0.9%NaCl，0.1mol/L HCl，pH1.2±0.1)200mL为溶出介质，温度为37±0.5℃，转速为100r/min。精密称取实施例1中制备的左金丸生物粘附微球2g，共4份，投入4个干燥的转篮内，调节转篮转速100rpm，待其平稳后，将转篮降入恒温的含有200mL溶出介质的溶出杯中，自样品接触溶出介质起立即计时，于规定时间(0、15、25、35、45、55min、1、2、4、6、8、10、24h)直接取样0.5mL(每次取样后补充溶出介质0.5mL)，经0.45μm微孔滤膜过滤后加甲醇稀释至适当浓度用HPLC法测定其中5种生物碱的含量。

HPLC法测定的仪器、试剂和测定条件与实施例制备载药微球核步骤的相同，左金丸生物粘附微球的5种生物碱的溶出曲线如图5所示。

由图5可以看出5种生物碱的体外释放规律较为相似，并且药物在8h内持续释放。10h与24h取样点测定结果显示5种生物碱的含量只有少量增加，说明大部分药物在8～10h左右便可达到完全释放，药物累积释放率分别为：盐酸药根碱61.34%，盐酸巴马汀72.00%，盐酸小檗碱72.39%，吴茱萸碱82.16%，吴茱萸次碱58.29%。

试验例5左金丸生物粘附微球体外生物粘附性研究

采用组织存留量测定法测定本发明实施例1制备的左金丸生物粘附微球的生物粘附性能。

健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，体重140-160g，购自天津山川红实验科技有限公司，动物合格证号SCXK(津)2009-0001。动物饲养于天津中医药大学实验动物中心，环境温度为24±1℃，湿度为55±5%，实验前适应性喂养一周。

将3只禁食、供水饲养24h后的大鼠处死，取胃(于2h内使用)，以生理盐水冲洗干净内壁，自贲门打开后将胃粘膜平铺于载玻片上，接着将500mg实施例1制备的左金丸生物粘附微球均匀分撒在大鼠胃粘膜表面，置于饱和氯化钠溶液的密闭容器中，保湿20min，取出载玻片并将其固定于呈45°斜角放置的冲洗槽上。用盐酸氯化钠溶液(含0.9%NaCl，0.1mol/L HCl，pH1.2±0.1)作为冲洗液，调节蠕动泵流速，以10mL/100s的流速冲洗5min，收集冲洗液（共30ml），烘干称重，粘附力以粘附百分率表示，胃粘附百分率越大表示粘附力越大。平行制作3份，计算平均值，测定结果如表5所示。

胃粘附百分率（%）=M-(G-G₀-m)/M×100%

式中：M：加入粘附微球的重量；G₀:空烧杯重量；G:为烧杯与烘干后残渣总重量；m:冲洗液所含固体物质的总重量

表5  微球的体外生物粘附力测试

测定结果表明：左金丸生物粘附微球的平均胃粘附百分率为89.33%，表明壳聚糖交联的左金丸总生物碱微球具有较好的胃粘附特性。

Claims (10)

1.一种核壳结构的生物粘附微球的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)制备载体微球核

1-A）：将明胶与海藻酸钠的水溶液加入到混合乳化液中，进行两次乳化处理，然后加入异丙醇，进行第三次乳化处理，制得第一载体乳化液；

1-B）：将第一载体乳化液滴加到第一交联液中，接着进行两次交联反应后进行静置沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥处理，制得载体微球核；

2)制备载药微球核

2-A）：将原料药黄连和吴茱萸加入到乙醇溶液中，加热回流提取，对提取液进行浓缩、干燥处理，制得总生物碱提取物；

2-B）：将总生物碱提取物加入到无水乙醇中，进行超声处理，制得总生物碱乙醇液；

2-C）：将载体微球核浸泡于总生物碱乙醇液中，加热回收乙醇，使总生物碱吸附于载体微球核上，得到载药微球核；

3)制备生物粘附微球

3-A）：首先将载药微球核浸泡于壳聚糖溶液中，搅拌，使载药微球核吸附壳聚糖，然后进行离心处理，得到壳聚糖-载药微球核；

3-B）：将壳聚糖-载药微球核浸泡于第二交联液中进行第三次交联处理，即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤1-A）中所述第一次乳化处理温度高于第二次乳化处理温度。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤1-A）中所述异丙醇与明胶与海藻酸钠的水溶液的体积之比为1:1-3。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤1-B）中所述第一次交联反应温度低于第二次交联反应温度。

5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤1-B）中所述第一交联液由碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液混合而成。

6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤2-C）中所述载体微球核的总重量与总生物碱乙醇液的体积之比为1:5-8。

7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤3-A）中所述搅拌的速率为100-200rpm，搅拌温度为40-50℃，搅拌时间为20-40min。

8.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤3-B）中所述第三次交联处理的时间为2-4h，交联处理的温度为10-30℃。

9.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤3-B）中所述第二交联液由碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液-无水乙醇的溶液混合组成。

10.一种核壳结构的生物粘附微球，其特征是按照如权利要求1-9任一所述方法制备而成。