CN103797124A

CN103797124A - 伯醇的氧化和胺化

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Publication number: CN103797124A
Application number: CN201280045779.8A
Authority: CN
Inventors: M.佩特; T.哈斯; J.C.普费弗; A.施克拉; W.克劳蒂尔; A.莱希纳; J.H.萨特勒; S.沙费尔; K.C.陶贝尔
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2012-07-17
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-07-17
Also published as: WO2013011018A1; JP6057994B2; US20140242646A1; HUE032045T2; ES2604335T3; EP2734631B1; EP2734631A1; US9580732B2; JP2014523743A; CA2842000A1; CN107217078A; BR112014000947A2; RU2014106109A; CN103797124B

Abstract

本发明涉及包括下述步骤的方法：提供下式的伯醇HO-(CH₂)_x-R¹，其中R¹选自–OH、-SH、-NH₂和–COOR²，x是至少3且R²选自H、烷基和芳基，b)通过与NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述伯醇，和c)使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触，其中所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶，涉及用于实行该方法的全细胞催化剂和这种全细胞催化剂用于氧化伯醇的用途。

Description

伯醇的氧化和胺化

本发明涉及包括下述步骤的方法：

a) 提供下式的伯醇

HO-(CH₂)_x-R¹,

其中R¹选自–OH、-SH、-NH₂ 和–COOR²，x是至少3且R²选自H、烷基和芳基，

b) 通过与NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述伯醇，和

c) 使步骤a) 的氧化产物与转氨酶接触，

其中所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶，

涉及用于施行所述方法的全细胞催化剂，和涉及这样的全细胞催化剂用于氧化伯醇的用途。

聚酰胺是以重复的酰胺基为特征的一类聚合物。与化学上有关的蛋白不同，术语“聚酰胺”通常涉及合成的、商购可得的热塑性塑料。聚酰胺衍生自伯胺或仲胺，其通常在烃裂解中得到。但是，也可以使用衍生物，更精确地讲，氨基羧酸、内酰胺和二胺，用于聚合物的生产。另外，短链气态烷烃作为原料是令人感兴趣的，其可以用生物技术方法从再生原料起始得到。

许多在商业上具有巨大需求的聚酰胺是从内酰胺起始制备。例如，“聚酰胺6”可以通过聚合ε-己内酰胺得到，而“聚酰胺12”可以通过聚合月桂内酰胺得到。其它商业上感兴趣的产物包括内酰胺的共聚物，例如ε-己内酰胺和月桂内酰胺的共聚物。

胺类的常规化学工业生产依赖于化石原料的供给，是低效的，且在该过程中产生大量不希望的副产物，在某些合成步骤中最高达80%。这样的方法的一个例子是月桂内酰胺的制备，其通常通过丁二烯的三聚化而得到。氢化该三聚化产物环十二碳三烯，并将由此产生的环十二烷氧化成环癸酮，其随后与羟胺反应生成环十二烷酮肟（Cyclododecanonoxin），其最后经由贝克曼重排转化成月桂内酰胺。

考虑到这些缺点，已经开发了使用生物催化剂从再生原料起始制备胺的方法。PCT/EP 2008/067447描述了使用细胞生产化学相关产物，更精确地讲ω-氨基羧酸的生物体系，所述细胞具有一系列合适的酶活性且能够将羧酸转化成相应的ω-氨基。但是，在该方法中使用的得自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1的AlkBGT-氧化酶体系的一个已知缺点是，它不能提供使脂族烷烃生成伯醇的选择性氧化。相反，产生多种氧化产物；尤其是，更高度氧化的产物（诸如相应的醛、酮或相应的羧酸）的比例随着反应时间增加而增加(C. Grant, J. M. Woodley和F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486)，这相应地降低了期望的胺的收率。

在该背景下，本发明的目的在于，提供使用生物催化剂氧化醇的改进方法。另一个目的是，如下改进所述方法，即增加收率和/或降低副产物浓度。最后，需要这样的方法，即其允许基于再生原料来生产聚酰胺或用于生产聚酰胺的原材料。

所述目的和其它目的通过本申请的主题和通过独立权利要求的主题得以实现，其中由从属权利要求得出实施方案。

根据本发明，所述目的在第一方面由包括下述步骤的方法实现：

a) 提供下式的伯醇

HO-(CH₂)_x-R¹,

b) 通过与NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述伯醇，和

c) 使步骤a) 的氧化产物与转氨酶接触，

其中所述NAD(P)⁺-醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶。

在所述第一方面的第一实施方案中，步骤a)通过下式的链烷

H-(CH₂)_x-R¹

通过单加氧酶的羟基化进行，所述单加氧酶优选是重组的或分离的。

在所述第一方面的第二实施方案（其也是第一实施方案的一个实施方案）中，所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶是具有至少一个锌原子作为辅因子的NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶。

在所述第一方面的第三实施方案（其是第二实施方案的一个实施方案）中，所述醇脱氢酶是得自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus ）的醇脱氢酶(数据库代码P42328)或其变体。

在所述第一方面的第四实施方案（其是第一至第三实施方案的一个实施方案）中，所述单加氧酶选自：恶臭假单胞菌的AlkBGT，得自热带假丝酵母（Candida tropicalis）或得自鹰嘴豆（Cicer arietinum）的细胞色素P450。

在所述第一方面的第五实施方案（其也是第一至第四实施方案的一个实施方案）中，所述转氨酶选自特征如下的转氨酶及其变体：在与青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Val224对应的氨基酸序列的位置处，其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Gly230对应的氨基酸序列的位置处，其具有除了苏氨酸以外的氨基酸，且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。

在所述第一方面的第六实施方案（其也是第一至第五实施方案的一个实施方案）中，在分离的或重组的丙氨酸脱氢酶和无机氮源存在下进行步骤b)和/或步骤c)。

在所述第一方面的第七实施方案（其也是第一至第七实施方案的一个实施方案）中，在包含NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶、单加氧酶和丙氨酸脱氢酶的组中的至少一种酶是重组的，且以具有相应酶的全细胞催化剂的形式提供。

在所述第一方面的第八实施方案（其也是第七实施方案的一个实施方案）中，所有酶以一种或多种全细胞催化剂的形式提供，其中，优选地，一种全细胞催化剂具有所有必需的酶。

在所述第一方面的第九实施方案（其也是第一至第八实施方案的一个实施方案）中，在步骤b)时，优选在步骤b)和c)时，存在有机共溶剂，其具有大于-1.38、优选0至1.2的logP。

在所述第一方面的第十实施方案（其也是第九实施方案的一个实施方案）中，所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，优选油酸。

在所述第四方面的第十一实施方案（其也是第九实施方案的一个优选实施方案）中，所述共溶剂是式R³-O–(CH₂)_x–O–R⁴的化合物，其中R³和R⁴各自且彼此独立地选自：甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中特别优选R³和R⁴各自是甲基且x是2。

在所述第一方面的第十二实施方案（其也是第九实施方案的一个优选实施方案）中，所述共溶剂选自二烷基醚，并且优选二甲醚。

根据本发明，所述目的在第二方面中通过全细胞催化剂得以实现，所述全细胞催化剂具有NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶（优选地，具有至少一个锌原子作为辅因子）、转氨酶、任选的单加氧酶和任选的丙氨酸脱氢酶，其中所述酶是重组酶。

根据本发明，所述目的在第三方面中通过根据本发明的第二方面的全细胞催化剂用于氧化和胺化式(HO)-(CH₂)_x-R¹的伯醇的用途得以实现，其中R¹选自-OH、-SH、-NH₂和-COOR²，x是至少3，且R²选自H、烷基和芳基。

在第三方面的第一实施方案（其是第一实施方案的一个实施方案）中，所述用途进一步包括有机共溶剂的存在，所述有机共溶剂具有大于-1.38、优选0至1.2的logP，且优选地为二甲醚。

在第三方面的第二实施方案（其是第二实施方案的一个实施方案）中，所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，且优选地是油酸。

所述第二和第三方面的其它实施方案包括本发明的第一方面的所有实施方案。

本发明的发明人已经惊讶地发现，存在一组醇脱氢酶，其可以用于实现形成少量副产物伯醇的氧化。

本发明的发明人此外已惊讶地发现，存在可以使用生物催化剂将醇胺化而不形成大量副产物的酶活性级联，其中不必添加或除去还原当量。

本发明的发明人此外已惊讶地发现了可以令人惊讶地使用全细胞催化剂并从再生原料出发生产聚酰胺的方法。

本发明的发明人此外已惊讶地发现，事先氧化后的伯醇的胺化可以特别有利地用以某些序列特性为特征的转氨酶集合来进行。

本发明的发明人此外已惊讶地发现，在包含醇脱氢酶、转氨酶和丙氨酸脱氢酶的氧化和胺化伯醇的体系中使用不同于AlkJ类型的醇脱氢酶，尤其是使用NAD(P)⁺-依赖性醇脱氢酶对该方法的产率是有利的，尤其是在使用全细胞催化剂进行时。

根据本发明的方法可以应用于大量的工业相关的醇。在一个优选的实施方案中，其涉及可氧化和胺化成ω-氨基羧酸的ω-羟基羧酸或酯，优选甲酯。在另一实施方案中，其涉及可氧化和胺化成二胺的二醇。在另一个优选的实施方案中，所述伯醇是羟基烷基胺。在此，碳链的长度是可变的，并且x为至少3。所述碳链优选具有多于3个的C-原子，即x = 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。示例性化合物包括ω-羟基月桂酸、ω-羟基月桂酸甲酯，和链烷二醇，尤其是1,8-辛二醇和1,10-癸二醇。

在一个特别优选的实施方案中，R¹选自–OH 和-COOR²，x 是至少11，且R² 选自H、甲基、乙基和丙基。在一个最优选的实施方案中，所述伯醇是ω-羟基脂肪酸甲酯。

根据本发明，在所述方法的步骤b)中，使用NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶用于氧化伯醇。在该情况下，与根据本发明使用的所有的酶活性多肽一样，其可以是包含酶活性多肽的细胞或其裂解物、或处于所有纯化阶段（从粗制的裂解物至纯的多肽）的多肽的制品。本领域技术人员已知大量可以在合适的细胞中过表达酶活性多肽并进行纯化和/或分离的方法。因而，为表达多肽，可以使用本领域技术人员可得到的所有表达体系。可以使用色谱方法用于纯化，例如提供了标记的重组蛋白的亲和色谱使用固定化的配体的纯化，所述固定化的配体为例如在组氨酸标记的情况中镍离子、在与靶蛋白融合的谷胱甘肽-S-转移酶的情况中使用固定化的谷胱甘肽或在包含麦芽糖结合蛋白的标签的情况中使用固定化的麦芽糖。

可以以可溶形式或固定化地使用经纯化的酶活性多肽。本领域技术人员已知可以将多肽共价地或非共价地固定至有机或无机固相上的合适方法，例如通过巯基偶联化学(例如得自Pierce的试剂盒)。

在一个优选的实施方案中，所述用作全细胞催化剂或用作表达体系的细胞是原核细胞，优选细菌细胞。在另一个优选的实施方案中，其是哺乳动物细胞。在另一个优选的实施方案中，其是低等真核细胞，优选是酵母细胞。示例性的原核细胞包括埃希氏菌属（Escherichia），特别是大肠杆菌（Escherichia coli），和假单胞菌属（Pseudomonas）和棒状杆菌属（Corynebacterium）的菌株。示例性的低等真核细胞包括酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、耶氏酵母属（Yarrowia）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）属，特别是热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerivisiae）菌株。

在一个特别优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是含锌的NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶，即所述催化活性酶包含至少一个锌原子作为辅因子，所述锌原子通过包含半胱氨酸残基的特征序列基序与所述多肽共价结合。在一个特别优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶(数据库代码P42328)或其变体。

本发明的教导不仅可以使用本文描述的生物大分子的精确氨基酸序列或核酸序列来完成，而且也可以使用这样的大分子的变体来完成，所述变体可以通过一个或多于一个氨基酸或核酸的缺失、添加或置换而得到。在一个优选的实施方案中，表述核酸序列或氨基酸序列的“变体”（其在下文中与本文中使用的表述“同源体”同义地和可互换地使用）是指另一个核酸-或氨基酸序列，考虑到相应的原始野生型-核酸-或-氨基酸序列，具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性（在这里与同一性同义使用），其中，优选地，除了形成催化活性中心的那些氨基酸或者结构或折叠必需的氨基酸以外的氨基酸被删除或置换，或者后者仅仅是保守置换，例如谷氨酸替代天冬氨酸、或亮氨酸替代缬氨酸。现有技术描述了可以用于计算2个序列的同源性程度的算法，例如Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第3版。在本发明的另一个优选的实施方案中，氨基酸序列或核酸序列的所述变体，优选地除了上述的序列同源性以外，基本上具有野生型分子或原始分子的相同的酶活性。例如，作为蛋白酶的酶活性多肽的变体具有与所述多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽键水解的能力。在一个特别的实施方案中，表述“基本上相同的酶活性”是指显著高于背景活性或/和与相对于相同底物的野生型多肽所具有的K_M-和/或k_cat-值相差小于3个、更优选2个、还更优选1个数量级的相对于野生型-多肽的底物的活性。在另一个优选的实施方案中，表述核酸序列或氨基酸序列的“变体”包含所述核酸-或氨基酸序列的至少一个活性部分/或片段。在另一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“活性部分”是指这样的氨基酸序列或核酸序列，其具有小于所述氨基酸序列的整个长度的长度，或者编码比所述氨基酸序列的全长更短的长度，其中具有比野生型氨基酸序列更短长度的氨基酸序列或编码的氨基酸序列基本上具有与所述野生型多肽或其变体相同的酶活性，例如作为醇脱氢酶、单加氧酶或转氨酶。在一个特殊的实施方案中，表述核酸的“变体”是这样的核酸，其互补链，优选地在严格的条件下，结合在野生型核酸上。杂交反应的严格性可由本领域技术人员容易地确定，并且通常取决于探针的长度、洗涤过程中的温度和盐浓度。通常，较长的探针需要较高的温度才能杂交，而较短的探针需要低温。杂交是否发生通常取决于变性DNA与存在于其环境中的互补链对合的能力，更精确地讲，在解链温度以下。杂交反应的严格性和相应的条件更详细地描述在Ausubel等人，1995中。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述核酸的“变体”是编码与原始核酸相同的氨基酸序列，或者在遗传密码的简并性范围内编码该氨基酸序列的变体的任意的核酸序列。

数十年来，醇脱氢酶是生物化学中与酿造发酵过程有关的受到强烈关注的且在生物技术上高度相关的生物化学酶类别，其包括多种异形体集合。因而，存在恶臭假单胞菌GPO1 AlkJ型的膜结合的、黄素依赖性的醇脱氢酶，其使用黄素辅因子替代NAD(P)⁺。另一组包括含铁的、对氧敏感的醇脱氢酶，其在细菌中且以无活性形式在酵母中被发现。另一组包括NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶，包括含锌的醇脱氢酶，其中活性中心具有半胱氨酸配位的锌原子，所述锌原子固定醇底物。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的表述“醇脱氢酶”理解为是指将醛或酮氧化为相应的伯醇或伯醇的酶。优选地，在根据本发明的方法中的醇脱氢酶是NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶，即使用NAD(P)⁺作为辅因子来氧化醇或使用NAD(P)H来还原相应的醛或酮的醇脱氢酶。在最优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是NAD(P)⁺依赖性的、含锌的醇脱氢酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶”表示NAD⁺-和/或NADP⁺依赖性的醇脱氢酶。

根据本发明，在步骤c)中，使用转氨酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“转氨酶”理解为催化α-氨基从供体（优选氨基酸）向受体分子（优选α-酮羧酸）转移的酶。在一个优选的实施方案中，所述转氨酶选自具有以下特征的转氨酶及其变体：在与青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472 的转氨酶(数据库代码NP_901695) 的Val224对应的氨基酸序列的位置处，其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在与青紫色素杆菌ATCC 12472 的转氨酶(数据库代码NP_901695) 的Gly230对应的氨基酸序列的位置处，其具有除了苏氨酸以外的氨基酸，且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，所述转氨酶选自：青紫色素杆菌DSM30191的ω-转氨酶，源自恶臭假单胞菌W619、铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）PA01、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）A3(2)和除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）MA 4680的转氨酶。

在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶的氨基酸序列的位置X对应的位置”是指，在所研究的分子的比对中，显得与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶的氨基酸序列的位置X同源的对应位置。本领域技术人员已知众多可以用于进行氨基酸序列比对的软件包和算法。示例性的软件包方法包括由EMBL提供的程序包ClustalW(Larkin et al., 2007; Goujon et al. 2010)，或者列出和描述在Arthur M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版中。

根据本发明使用的酶优选地是重组酶。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的表述“重组的”理解为相应的核酸分子在自然界中不存在，和/或它使用基因工程方法产生。在一个优选的实施方案中，当相应的多肽由重组核酸编码时，提及重组蛋白。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的重组细胞理解为具有至少一个重组核酸或重组多肽的细胞。本领域技术人员已知适合用于生产重组分子或细胞的方法，例如在Sambrook等人, 1989中描述的那些。

根据本发明的教导可以使用分离的酶和使用全细胞催化剂来实行。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的表述“全细胞催化剂”理解为提供所期望的酶活性的完整的、存活的且有代谢活性的细胞。所述全细胞催化剂可以将要代谢的底物（在本发明的情况中，醇）或由所述底物形成的氧化产物运输进细胞内部，在此处被细胞溶质酶代谢，或者其可以将目标酶呈递到它的表面上，在此处直接暴露给培养基中的底物。本领域技术人员已知众多用于生产全细胞催化剂的体系，例如从DE 60216245中已知。

就许多应用而言，推荐使用分离的酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“分离的”是指，所述酶以比它的天然来源更纯和/或更浓的形式存在。在一个优选的实施方案中，如果酶是多肽酶且占相应制品的质量蛋白分数多于60、70、80、90或优选95%，则认为所述酶是分离的。本领域技术人员已知众多用于测量溶液中的蛋白的质量的方法，例如借助SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的对应蛋白带的厚度的视觉估测、NMR光谱法或基于质量-光谱测定法的方法。

根据本发明的方法的酶催化反应通常在溶剂或具有高的水比例的溶剂混合物中进行，优选地在用于建立与酶活性相容的pH-值的合适缓冲体系的存在下进行。但是，在疏水性原料的情况中，特别是在具有包含多于3个碳原子的碳链的醇中，有机共溶剂的额外存在是有利的，所述有机共溶剂可以介导酶与底物的接触。一种或多于一种共溶剂以占溶剂混合物或低于溶剂混合物的95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5体积%的总比例存在。

共溶剂的疏水性在这里起重要作用。它可以由logP表示，所述logP是正辛醇-水-分配系数的以10为底的对数。优选的共溶剂具有大于-1.38、更优选-1至+2、还更优选0至1.5的logP。

正辛醇-水-分配系数K^ow或P是指示物质在1-辛醇和水的两相体系中的浓度的比例的无量纲分配系数(参见J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Wiley Series in Solution Chemistry的第2卷, John Wiley & Sons, Chichester, 1997)。更精确地讲，K^ow或P表示物质在富含辛醇的相中的浓度与其在富含水的相中的浓度之比。

K^ow值是物质的亲脂性(脂溶性)和亲水性(水溶性)之间的比例的模型指数（Modellma?）。预见到，使用物质在辛醇-水体系中的分配系数，也能够估测该物质在具有水相的其它体系中的分配系数。如果物质可更好地溶于脂性溶剂诸如正辛醇中，那么K^ow大于1，如果物质可更好地溶于水中，那么K^ow小于1。相应地，亲脂性物质的LogP为正值，亲水性物质的LogP为负值。由于不能测量所有化学试剂的K^OW，因此存在非常多样化的预测模型，例如通过定量构效关系(QSAR)或通过线性自由能关系(LFER)，例如描述于Eugene Kellogg G, Abraham DJ: Hydrophobicity: is LogP(o/w) more than the sum of its parts?. Eur J Med Chem. 2000年7-8月; 35(7-8):651-61或Gudrun Wienke, “Messung und Vorausberechnung von n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten”，博士论文, Oldenburg大学, 1-172, 1993。

在本申请范围内，根据Advanced Chemistry Development Inc., Toronto的方法，借助程序模块ACD/LogP DB确定log P。

优选的共溶剂具有大于-1.38，更优选-1至+2，还更优选-0.75至1.5、或-0.5至0.5、或-0.4至0.4、或-0.3至-0.1的logP。在一个优选的实施方案中，所述共溶剂是式Alk₁-O-Alk₂的二烷基醚，其具有大于-1.38、更优选-1至+2、还更优选0至1.5的logP，其中所述2个烷基取代基Alk₁和Alk₂各自彼此独立地选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基和叔丁基。在一个特别优选的实施方案中，所述共溶剂是甲基叔丁基醚(MTBE)。在最优选的实施方案中，所述共溶剂是二甲氧基乙烷(DME)。在另一优选的实施方案中，所述共溶剂是式R³-O-(CH₂)_x-O-R⁴的化合物，其中R³和R⁴各自且彼此独立地选自甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中优选R³和R⁴各自是甲基且x是2。

在另一个优选的实施方案中，所述共溶剂是羧酸或脂肪酸，优选具有至少6个碳原子的脂肪酸，更优选具有至少12个碳原子的脂肪酸。所述脂肪酸可以是饱和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸或山嵛酸，或不饱和脂肪酸，例如肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、岩芹酸、油酸、反油酸、异油酸、顺-9-二十碳烯酸、二十碳-11-烯酸或芥酸。不同脂肪酸的混合物同样是可能的，例如主要含有不饱和脂肪酸的蓝刺头油。由于并非所有的脂肪酸在室温时都是显著可溶的，可能需要求助于其它措施，例如升高温度，或者，更优选地，加入其它溶剂来使它可接近水相。在一个特别优选的实施方案中，使用脂肪酸或其酯、优选甲酯、最优选月桂酸甲酯作为这样的其它溶剂。

根据本发明的酶级联可以根据本发明在有丙氨酸脱氢酶存在下进行。本发明的一个特别的长处是，该构型能够实现还原当量中性的反应操作，即该反应在没有供给或除去还原当量形式的电子的情况下进行，因为在醇氧化过程中由醇脱氢酶产生的NADH在制备丙氨酸时被消耗，消耗无机氮供体，优选氨或氨源。

在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“丙氨酸脱氢酶”理解为这样的酶：其催化L-丙氨酸的转化，消耗水和NAD⁺，形成丙酮酸、氨和NADH。优选地，所述丙氨酸脱氢酶是细胞内的丙氨酸脱氢酶，还更优选地，细菌全细胞催化剂的重组细胞内的丙氨酸脱氢酶。

在一个优选的实施方案中，将具有所有需要的活性的全细胞催化剂用于根据本发明的方法中，即NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶和任选的单加氧酶和/或丙氨酸脱氢酶。这样的全细胞催化剂的应用具有以下优点：以单一试剂的形式使用所有活性，并且不必大规模地准备生物活性形式的酶。适合用于构建全细胞催化剂的方法是本领域技术人员已知的，尤其是用于表达一种或多种重组蛋白的质粒体系的构建，或编码所需重组蛋白的DNA向使用的宿主细胞的染色体DNA中的整合。

在先前的描述、权利要求书和附图中公开的本发明的特征单独地和以任意组合以本发明不同实施方案用于实现本发明可能是重要的。

图1显示了包含不同转氨酶、尤其是青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695, “TACV_co”)的示例性比对。在所有序列中，用下划线标记与后者的转氨酶的位置Val224和Gly230对应的氨基酸残基。使用ClustalW2进行所述比对。

实施例1：使用根据本发明的方法，与醇脱氢酶AlkJ相比，使用NAD⁺依赖性的醇脱氢酶的不同底物的胺化

底物：

使用的底物是环己烷-1,6-二醇(1)、6-氨基己烷-1-醇 (2)和乙基-6-羟基己酸酯(3)。

酶：

丙氨酸脱氢酶：

在大肠杆菌中表达枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶。首先，制备过夜培养物，然后将其用于接种主要培养物(LB-氨苄西林培养基)。将细胞在摇床上在30℃和120 Upm温育24小时。然后，在无菌条件下加入IPTG (0.5 mM, 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷, Sigma)进行诱导，并将培养物在20℃振摇另外24小时。

将细胞离心出(8000 Upm, 20 min 4℃)，洗涤，并抛弃上清液。然后使用超声(1 s脉冲, 4 s暂停，时间：10 min, 振幅: 40%)破碎细胞，将混合物离心(20 min, 18000 Upm, 4℃)，并使用His-prep柱纯化酶。

嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶 ( ADH-hT; P42328.1))

为了制备嗜热脂肪芽孢杆菌的NAD⁺依赖性的醇脱氢酶(Fiorentino G, Cannio R, Rossi M, Bartolucci S: Decreasing the stability and changing the substrate specificity of the Bacillus stearothermophilus alcohol dehydrogenase by single amino acid replacements. Protein Eng 1998, 11: 925-930)，首先制备过夜培养物(10 ml LB/氨苄西林培养基, 氨苄西林100μg/ml, 30℃, 120 Upm)，然后将其用于接种培养容器，再将其在37℃和120 Upm振摇约12小时。将细胞离心出(8000 Upm, 20分钟, 4℃)，洗涤，抛弃上清液，并将沉淀物冻干。最后，使用超声(1 s脉冲，4 s暂停，时间：10 min，振幅：40%)破碎细胞，并将混合物离心(20 min, 18000 Upm, 4℃)和用作粗提取物。借助SDS-PAGE估测蛋白浓度。

AlkJ-醇脱氢酶(得自食油假单胞菌（ Pseudomonas oleovirans ）Gpo1)：

除了使用质粒pTZE03_AlkJ (SEQ ID NO 20)和使用卡那霉素作为抗生素(50μg/ml)以外，在与嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶相同的条件下制备该酶。同样借助SDS-PAGE估测蛋白浓度。

得自青紫色素杆菌的转氨酶CV-ωTA：

为了从青紫色素杆菌制备CV-ωTA(U. Kaulmann, K. Smithies, M. E. B. Smith, H. C. Hailes, J. M. Ward, Enzyme Microb. Technol. 2007, 41, 628-637; b) M. S. Humble, K. E. Cassimjee, M. H?kansson, Y. R. Kimbung, B. Walse, V. Abedi, H.-J. Federsel, P. Berglund, D. T. Logan, FEBS Journal 2012, 279, 779-792; c) D. Koszelewski, M. G?ritzer, D. Clay, B. Seisser, W. Kroutil, ChemCatChem2010, 2, 73-77)，首先制备过夜培养物(LB/氨苄西林培养基, 30℃, 120 rpm)，然后将其用于接种含有相同培养基的培养瓶，将其在37℃和120 Upm下振摇约3小时，直到达到在600 nm为0.7的光密度。然后，加入IPTG储备溶液(0.5 mM)，在20℃和120 Upm诱导3小时。将细胞离心出，抛弃上清液，并在4℃储存细胞。最后，使用超声(1 s脉冲，4 s暂停，时间：10 min，振幅：40%)破碎细胞，将混合物离心(20 min, 18000 Upm, 4℃)，并将上清液用作粗提取物。

实验操作：

实验溶液描述在表1中。

表1: 实验溶液

实验溶液	ADH-hT (粗制物)	200 μl
			转氨酶	200 μl
	AlaDH	10 μl (250 U)
			L-丙氨酸	22.3 mg (250 μmol)
	NAD⁺	0.5 mg (0.75 μmol)
			NH₄Cl	21 mg (500 μmol)
	PLP	0.1 mg (0.35 μmol)
			NaOH 6 M	7.5 μl
	H₂O /共溶剂	400 μl
			底物	50 μmol

			最终pH	8.5
	总体积	1.22 mL

将底物溶解在适当量的共溶剂(见表2)中，并加入溶解在300μl水中的L-丙氨酸。在75μl水中，加入氯化铵。加入各自溶解在25μl水中的NAD⁺和PLP。通过加入7.5μl 6 M NaOH溶液，调节pH-值。加入转氨酶和丙氨酸脱氢酶。通过加入醇脱氢酶，开始反应。22小时以后，通过加入下述的衍生化试剂，停止反应。

胺的衍生化：

将200μl三乙胺和ESOF (琥珀酰亚胺基氧基甲酸乙酯) (80或40 mg)在乙腈(500μl)中的溶液加入到500μl样品中。然后将样品在45℃振摇1小时，然后用二氯甲烷萃取，经硫酸钠干燥，并使用GC-MS测量。如果不采用丙氨酸脱氢酶，则在pH 8.5(通过加入NaOH来调节)下向水溶液中加入L-丙氨酸(500 mM)、NAD⁺ (2 mM)和PLP (0.5 mM) 和在DME中的底物(120μl, 25 mM)。通过加入各200μl的醇脱氢酶(NAD⁺依赖性的)或AlkJ)和转氨酶，开始反应。将样品在25℃和300 Upm振摇24小时。将样品如上所述进行处理，并用GC-MS进行分析。

结果：

表2: 在不存在丙氨酸脱氢酶的情况下的胺化。底物是环己烷-1,6-二醇(1)、6-氨基己烷-1-醇 (2)和乙基-6-羟基己酸酯(3)。

表3: 在丙氨酸脱氢酶存在下的胺化。底物是环己烷-1,6-二醇(1)、6-氨基己烷-1-醇 (2)和乙基-6-羟基己酸酯(3)。

总结：

对于一系列在结构上不同的底物，即环己烷-1,6-二醇(1)、6-氨基己烷-1-醇 (2)和乙基-6-羟基己酸酯(3)，在每种情况下表明，与使用醇脱氢酶AlkJ相比，使用嗜热脂肪芽孢杆菌的NAD⁺依赖性的醇脱氢酶会显著更有效地进行反应。此外，存在和不存在丙氨酸脱氢酶均可展现出相同的令人惊讶的技术效果。

实施例2：不同醇底物的胺化

为了证实根据本发明的酶体系能转化结构各异的底物，使用合适的酶在体外将另外的链烷醇和链烷二醇转化成相应的胺和二胺。已发现，得自马肝的醇脱氢酶(HL-ADH, E-同工酶; NP_001075997.1)和得自嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶(ADH-hT; P42328.1)同样适合。使用两种不同的氨基酶，即得自青紫色素杆菌 ^[16] (CV-ωTA)的氨基酶和得自节杆菌（Arthrobacter citreus）的(S)-选择性ω-TA (ArS-ωTA)的变体 (A. R. Martin, R. DiSanto, I. Plotnikov, S. Kamat, D. Shonnard, S. Pannuri, Biochem. Eng. J. 2007, 37, 246-255) 。丙氨酸脱氢酶源自枯草杆菌（Bacillus subtilis）(F. G. Mutti, C. S. Fuchs, D. Pressnitz, J. H. Sattler, W. Kroutil, Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 3227–3233)。

用琥珀酰亚胺基氧基甲酸乙酯 (I. Edafiogho, K. R. Scott, J. A. Moore, V. A. Famar, J. M. Nicholson, J. Med. Chem. 1991, 34, 387-392) 衍生化产物并通过GC-MS使用Agilent J&W HP-5柱(30 m, 320 μm, 0.25 μm)检测。

表4: 伯醇的胺化

[a] 反应条件：底物 (50 mM), CV-ωTA (1 mg, 0.2 U)和ADH-hT (1 mg, 0.25 U), AlaDH (0.0.4 mg, 0.25 U), PLP (0.35 mM), NAD⁺ (0.75 mM), 氯化铵(275 mM), L-丙氨酸 (250 mM), pH 8.5, 24小时, 20℃. [b] 添加1,2-二甲氧基乙烷(10% v v^-1)作为共溶剂。

表5. 1,ω-二醇的胺化^[c]

[c] 通用反应条件：底物 (50 mM), CV-ωTA (1 mg, 0.25 U)和ADH-hT (1 mg, 0.2 U), AlaDH (0.1 mg, 0.7 U), PLP (0.35 mM), NAD⁺ (0.75 mM), 氯化铵(275 mM), L-丙氨酸(250 mM), pH 8.5. [d] 使用ArS-ωTA代替CV-ωTA。

序列表

<110> Evonik Degussa GmbH

<120> 醇的氧化

<130> 2011E00296DE

<160> "=

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 1

Val Val Ala Ala Arg Trp Leu Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala

1 5 10 15

Asp Lys Val Ala Ala Phe Val Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Val Ile Val Pro Pro Ala Thr Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys

35 40 45

Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu Val Ala

50 55

<210> 2

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 2

Ala His Cys Val Ala Glu Leu Glu Ala Leu Ile Glu Arg Glu Gly Ala

1 5 10 15

Asp Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly Glu Pro Ile Leu Gly Thr Gly Gly

20 25 30

Ile Val Pro Pro Pro Ala Gly Tyr Trp Glu Ala Ile Gln Thr Val Leu

35 40 45

Asn Lys His Asp Ile Leu Leu Val Ala

50 55

<210> 3

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 3

Gln His Cys Ala Asp Lys Leu Glu Glu Met Ile Leu Ala Glu Gly Pro

1 5 10 15

Glu Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly Glu Pro Ile Leu Gly Thr Gly Gly

20 25 30

Ile Val Pro Pro Pro Ala Gly Tyr Trp Glu Lys Ile Gln Ala Val Leu

35 40 45

Lys Lys Tyr Asp Val Leu Leu Val Ala

50 55

<210> 4

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 4

Asp Asp Leu Val Gln Glu Phe Glu Asp Arg Ile Glu Ser Leu Gly Pro

1 5 10 15

Asp Thr Ile Ala Ala Phe Leu Ala Glu Pro Ile Leu Ala Ser Gly Gly

20 25 30

Val Ile Ile Pro Pro Ala Gly Tyr His Ala Arg Phe Lys Ala Ile Cys

35 40 45

Glu Lys His Asp Ile Leu Tyr Ile Ser

50 55

<210> 5

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 5

Ala Glu Leu Ala Asn Glu Leu Glu Arg Ile Val Ala Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Val Ala Gly Ser Thr Gly

20 25 30

Val Ile Leu Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Gln Lys Leu Arg Glu Ile Cys

35 40 45

Thr Lys His Gly Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 6

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 6

Ala Glu Leu Ala Asn Glu Leu Glu Arg Ile Val Ala Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Val Ala Gly Ser Thr Gly

20 25 30

Val Ile Leu Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Gln Lys Leu Arg Glu Ile Cys

35 40 45

Thr Lys His Gly Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 7

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 7

Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Ile Ala Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Met Ala Gly Ser Thr Gly

20 25 30

Val Leu Val Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Glu Lys Leu Arg Glu Ile Thr

35 40 45

Ala Arg His Gly Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 8

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 8

Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Val Ala Leu His Asp Pro

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Leu Ala Gly Ser Ala Gly

20 25 30

Val Leu Val Pro Pro Val Gly Tyr Leu Asp Lys Leu Arg Glu Ile Thr

35 40 45

Thr Lys His Gly Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 9

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 9

Val Glu Leu Ala Asn Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Asn Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Met Ser Gly Ser Ala Gly

20 25 30

Val Leu Val Pro Pro Val Gly Tyr Leu Gln Arg Leu Arg Glu Ile Cys

35 40 45

Asp Gln His Asn Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 10

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 10

Ile Ala Leu Ala Asp Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Asn Ile Ala Ala Val Phe Val Glu Pro Leu Ala Gly Ser Ala Gly

20 25 30

Val Leu Val Pro Pro Glu Gly Tyr Leu Lys Arg Asn Arg Glu Ile Cys

35 40 45

Asn Gln His Asn Ile Leu Leu Val Phe

50 55

<210> 11

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 11

Pro Ala Tyr Ser Ala Ala Phe Glu Ala Gln Leu Ala Gln His Ala Gly

1 5 10 15

Glu Leu Ala Ala Val Val Val Glu Pro Val Val Gln Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Met Arg Phe His Asp Pro Arg Tyr Leu His Asp Leu Arg Asp Ile Cys

35 40 45

Arg Arg Tyr Glu Val Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 12

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 12

Glu Arg Asp Met Val Gly Phe Ala Arg Leu Met Ala Ala His Arg His

1 5 10 15

Glu Ile Ala Ala Val Ile Ile Glu Pro Ile Val Gln Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Met Arg Met Tyr His Pro Glu Trp Leu Lys Arg Ile Arg Lys Ile Cys

35 40 45

Asp Arg Glu Gly Ile Leu Leu Ile Ala

50 55

<210> 13

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 13

Asp Gln Cys Leu Arg Glu Leu Ala Gln Leu Leu Glu Glu His His Glu

1 5 10 15

Glu Ile Ala Ala Leu Ser Ile Glu Ser Met Val Gln Gly Ala Ser Gly

20 25 30

Met Ile Val Met Pro Glu Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu Cys

35 40 45

Thr Thr Tyr Asp Val Leu Met Ile Val

50 55

<210> 14

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 14

Ala Asn Glu Ile Asp Arg Ile Met Thr Trp Glu Leu Ser Glu Thr Ile

1 5 10 15

Ala Gly Val Ile Met Glu Pro Ile Ile Thr Gly Gly Gly Ile Leu Met

20 25 30

Pro Pro Asp Gly Tyr Met Lys Lys Val Glu Asp Ile Cys Arg Arg His

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Ile Cys

50

<210> 15

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 15

Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu Asn Tyr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln Gly Ala Gly Ser

20 25 30

Ala Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Ile Pro Gln Phe Arg Lys Met Thr Lys

35 40 45

Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Asn

50 55

<210> 16

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 16

Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu Asn Tyr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln Gly Ala Gly Ser

20 25 30

Ala Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Ile Pro Gln Ile Arg Lys Met Thr Lys

35 40 45

Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Asn

50 55

<210> 17

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 17

Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu Asn Tyr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln Gly Val Gly Ser

20 25 30

Thr Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Val Pro Gln Ile Arg Lys Met Thr Lys

35 40 45

Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Ser

50 55

<210> 18

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 18

Lys Tyr Ala Ser Asp Val His Asp Leu Ile Gln Phe Gly Thr Ser Gly

1 5 10 15

Gln Val Ala Gly Phe Ile Gly Glu Ser Ile Gln Gly Val Gly Gly Ile

20 25 30

Val Glu Leu Ala Pro Gly Tyr Leu Pro Ala Ala Tyr Asp Ile Val Arg

35 40 45

Lys Ala Gly Gly Val Cys Ile Ala

50 55

<210> 19

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 19

Leu Ala Glu Leu Asp Tyr Ala Phe Asp Leu Ile Asp Arg Gln Ser Ser

1 5 10 15

Gly Asn Leu Ala Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ile Leu Ser Ser Gly Gly

20 25 30

Ile Ile Glu Leu Pro Asp Gly Tyr Met Ala Ala Leu Lys Arg Lys Cys

35 40 45

Glu Ala Arg Gly Met Leu Leu Ile Leu

50 55

<210> 20

<211> 6949

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒ptZE03_aLKj

<400> 1

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacg atgtacgact atataatcgt tggtgctgga 5100

tctgcaggat gtgtgcttgc taatcgtctt tcggccgacc cctctaaaag agtttgttta 5160

cttgaagctg ggccgcgaga tacgaatccg ctaattcata tgccgttagg tattgctttg 5220

ctttcaaata gtaaaaagtt gaattgggct tttcaaactg cgccacagca aaatctcaac 5280

ggccggagcc ttttctggcc acgaggaaaa acgttaggtg gttcaagctc aatcaacgca 5340

atggtctata tccgagggca tgaagacgat taccacgcat gggagcaggc ggccggccgc 5400

tactggggtt ggtaccgggc tcttgagttg ttcaaaaggc ttgaatgcaa ccagcgattc 5460

gataagtccg agcaccatgg ggttgacgga gaattagctg ttagtgattt aaaatatatc 5520

aatccgctta gcaaagcatt cgtgcaagcc ggcatggagg ccaatattaa tttcaacgga 5580

gatttcaacg gcgagtacca ggacggcgta gggttctatc aagtaaccca aaaaaatgga 5640

caacgctgga gctcggcgcg tgcattcttg cacggtgtac tttccagacc aaatctagac 5700

atcattactg atgcgcatgc atcaaaaatt ctttttgaag accgtaaggc ggttggtgtt 5760

tcttatataa agaaaaatat gcaccatcaa gtcaagacaa cgagtggtgg tgaagtactt 5820

cttagtcttg gcgcagtcgg cacgcctcac cttctaatgc tttctggtgt tggggctgca 5880

gccgagctta aggaacatgg tgtttctcta gtccatgatc ttcctgaggt ggggaaaaat 5940

cttcaagatc atttggacat cacattgatg tgcgcagcaa attcgagaga gccgataggt 6000

gttgctcttt ctttcatccc tcgtggtgtc tcgggtttgt tttcatatgt gtttaagcgc 6060

gaggggtttc tcactagtaa cgtggcagag tcgggtggtt ttgtaaaaag ttctcctgat 6120

cgtgatcggc ccaatttgca gtttcatttc cttccaactt atcttaaaga tcacggtcga 6180

aaaatagcgg gtggttatgg ttatacgcta catatatgtg atcttttgcc taagagccga 6240

ggcagaattg gcctaaaaag cgccaatcca ttacagccgc ctttaattga cccgaactat 6300

cttagcgatc atgaagatat taaaaccatg attgcgggta ttaagatagg gcgcgctatt 6360

ttgcaggccc catcgatggc gaagcatttt aagcatgaag tagtaccggg ccaggctgtt 6420

aaaactgatg atgaaataat cgaagatatt cgtaggcgag ctgagactat ataccatccg 6480

gtaggtactt gtaggatggg taaagatcca gcgtcagttg ttgatccgtg cctgaagatc 6540

cgtgggttgg caaatattag agtcgttgat gcgtcaatta tgccgcactt ggtcgcgggt 6600

aacacaaacg ctccaactat tatgattgca gaaaatgcgg cagaaataat tatgcggaat 6660

cttgatgtgg aagcattaga ggctagcgct gagtttgctc gcgagggtgc agagctagag 6720

ttggcctggc gcgccctcga gggatcccac gtgctggtgc cgcgtggcag cgcggccgca 6780

ctggagcacc accaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag 6840

gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct 6900

aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 6949

Claims

1.包括下述步骤的方法：

a) 提供下式的伯醇

HO-(CH₂)_x-R¹,

b) 通过与NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述伯醇，和

c) 使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触，

其中所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤a)通过下式的链烷的羟基化

H-(CH₂)_x-R¹

通过单加氧酶进行，所述单加氧酶优选是重组的或分离的。

3.根据权利要求1-2之一的方法，其中所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶是具有至少一个锌原子作为辅因子的NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶。

4.根据权利要求3的方法，其中所述醇脱氢酶是得自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus ）的醇脱氢酶(数据库代码P42328)或其变体。

5.根据权利要求2-4之一的方法，其中所述选自恶臭假单胞菌的AlkBGT，得自热带假丝酵母或得自鹰嘴豆的细胞色素P450。

6.根据权利要求1-5之一的方法，其中所述转氨酶选自这样的转氨酶及其变体，其特征在于，在与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Val224对应的氨基酸序列的位置处，其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Gly230对应的氨基酸序列的位置处，其具有除了苏氨酸以外的氨基酸，且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。

7.根据权利要求1-6之一的方法，其中在分离的或重组的丙氨酸脱氢酶和无机氮源存在下进行步骤b)和/或步骤c)。

8.根据权利要求1-7之一的方法，其中由NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶、单加氧酶和丙氨酸脱氢酶组成的组中的至少一种酶是重组的，且以具有相应酶的全细胞催化剂的形式提供。

9.根据权利要求8的方法，其中所有酶以一种或多种全细胞催化剂的形式提供，且优选地，一种全细胞催化剂具有所有必要的酶。

10.根据权利要求1-9之一的方法，其中在步骤b)中，优选地在步骤b)和c)中，存在有机共溶剂，其具有大于-1.38、优选0至1.2的logP。

11.根据权利要求10的方法，其中所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，优选油酸。

12.根据权利要求10的方法，其中所述共溶剂是式R³-O-(CH₂)x-O-R⁴的化合物，其中R³和R⁴各自且彼此独立地选自甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中优选地R³和R⁴各自是甲基且x是2。

13.全细胞催化剂，其具有NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶、任选的单加氧酶和任选的丙氨酸脱氢酶，所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶优选地具有至少一个锌原子作为辅因子，其中所述酶是重组酶。

14.根据权利要求13的全细胞催化剂用于氧化和胺化下式的伯醇的用途

HO-(CH₂)_x-R¹，

其中R¹选自-OH、-SH、-NH₂和-COOR²，x是至少3，且R²选自H、烷基和芳基。

15.根据权利要求14的用途，进一步包括有机共溶剂的存在，所述有机共溶剂具有大于-1.38、优选0至1.2的logP。

16.根据权利要求15的用途，其中所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，优选油酸。