CN103561757B

CN103561757B - 高纯度含pth冷冻干燥制剂及其制造方法

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Publication number: CN103561757B
Application number: CN201280026213.0A
Authority: CN
Inventors: 西尾文秀; 前岛卓治; 三留佳郎
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2011-06-07
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: EP3170493A1; US20140088014A1; KR20150116468A; EP2719393A4; EP3020409B1; CN108195965B; EP2719393A1; JP2017019865A; EP2719393B1; EP3020409A1; EP3170493B1; JP6057492B1; US20160145316A1; JP5922833B2; KR101891673B1; JP6153237B2; JP2017008099A; HK1190304A1; KR20140001255A; CN104645318A

Abstract

本发明提供了高纯度含PTH肽冷冻干燥制剂及其制造方法。还提供了用于确认含PTH肽冷冻干燥制剂的纯度等的PTH类似物的检査方法。本发明中确认了在含PTH肽冷冻干燥制剂的制造工序中生成的PTH类似物的存在。进一步发现，该PTH类似物的生成可通过抑制含PTH肽溶液等暴露在医药品制造设施内空气环境中而显著得到防止·降低。

Description

高纯度含PTH冷冻干燥制剂及其制造方法

技术领域

本发明涉及含有PTH(甲状旁腺激素)或其生理学活性同等物(下文中总称为“PTH肽”。)作为有效成分的冷冻干燥制剂。本发明还涉及含PTH肽冷冻干燥制剂的制造方法。本发明进一步涉及含PTH肽冷冻干燥制剂的检査或品质的保证方法。

背景技术

甲状旁腺激素与降钙素类、维生素D类一起为残余血中钙浓度调节的激素。因而，PTH肽被用作甲状旁腺功能减退症的诊断药。此外还已知甲状旁腺激素具有通过在生物体内增加肾脏中活性型维生素D3生成而促进肠管内的钙吸收的作用(非专利文献1)。此外有人公开了下述骨质疏松症的治疗方法：通过对骨质疏松症患者以1周1次的频率在26周给药期间内进行每次为100或200单位PTH的皮下给药，可使该骨质疏松症患者海绵骨的骨密度增加、且不会减少皮质骨的骨密度(专利文献7)。

通常，在将微量的PTH肽作为用时溶解型冷冻干燥制剂进行制剂化的情况下，采用配合甘露醇等糖类或者明胶等高分子物质作为稳定化剂的方法(专利文献1、专利文献2)。此外还已知有一种以含有单糖类或二糖类和氯化钠为特征的冷冻干燥医药组合物(专利文献3)。

此外，在无菌制造上述那样的冷冻干燥制剂来制成医药品的情况下通常的医药品制造设施中利用的是通过在HEPA过滤器中流通的、具有一定风速的无菌空气流而实现无菌环境的区域。即，在该无菌环境下的医药品制造设施内，代表性地实施下述制造过程，该制造过程由下述工序构成：含有有效成分的溶液的制备工序；接下来进行的该溶液的无菌过滤～向容器中填充的工序；填充容器向冷冻干燥库中的搬入工序；以及冷冻干燥工序后的容器(小药瓶等)的密封工序。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭63-60940号公报

专利文献2：日本特开平2-111号公报

专利文献3：日本特开平5-306235号公报

专利文献4：日本特开昭64-16799号公报

专利文献5：WO02/002136

专利文献6：日本特开2003-095974号公报

专利文献7：日本特开平8-73376号公报

专利文献8：WO00/10596

专利文献9：WO10/30670

非专利文献

非专利文献1：CurrentOsteoporosisReports、Vol.6、12-16、2008

非专利文献2：Journalofpharmaceuticalsciences、vol.98、no.12、p4485-4500,2009

非专利文献3：ADVANCESINENZYMOLOGY、32、221-296、1969

非专利文献4：J.Biol.Chem.、vol.266、2831-2835、1991

非专利文献5：M.Takeietal.、PeptideChemistry1980、187-192、1981

发明内容

发明所要解决的课题

医药品的有效成分通过由原料物质的化学合成、生物来源物质的分离·精制、或基因工程的生产与生成物的分离·精制等来获取。一般来说，在包括基因重组法在内的任意制法的情况下，由于原料本身的纯度、反应的不完全性、分离·精制过程中的分解等，多数情况下，作为所制造的医药有效成分，均难以得到100%的纯度。另一方面，由于在诊断药或治疗药含有容许量以上的杂质的情况下无法否定对于诊断或治疗带来不利影响的可能性，因而用于安全地制造有效的医药的重要因素之一依然是得到高纯度生成物，这一点没有改变。特别是在为了骨质疏松症的治疗/预防而给予含有PTH肽的制剂的情况下，由于其给药期间要长期延续，因而可以说含有PTH肽的制剂特别需要高纯度。

但是，已知，在通过如上所述的典型制造过程来工业制造本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂时，会制造出含有该有效成分(PTH肽)的化学结构发生变化的物质(下文中称为“PTH类似物”。)的制剂。特别是在扩大制造规模时，要面临下述问题：即，随着生产数量的增加，担心上述PTH类似物的生成量会增加至实质不能容许的程度。进一步地，该PTH类似物的生成量并不总是恒定的，随着制造场所、时期、时间等的差异也会发生变化，生成该PTH类似物的原因也不确定，因而还要面临其生成量无法管理这一现实上的重大问题。

于是，本发明的课题在于提供一种高纯度、即PTH类似物的含量降低至可容许的低水平的含PTH肽冷冻干燥制剂。进一步地，本发明的课题在于提供该高纯度的含PTH肽冷冻干燥制剂的制造方法。此外，本发明的另一课题在于提供一种PTH类似物的检査方法，该检査方法用于确认含PTH肽冷冻干燥制剂的纯度等。

解决课题的手段

本发明人担心随着制造规模增大、生产数量增加，PTH类似物的生成量会增加到实质上不能容许的程度，从而成功进行了该PTH类似物的分离、鉴定。进一步发现，通过抑制含PTH肽溶液等在医药品制造设施内空气环境中的暴露，可显著地防止·降低该PTH类似物的生成。

此外，尽管不受理论约束，但根据上述鉴定的PTH类似物的结构特征、和通过抑制在医药品制造设施内空气环境中的暴露来防止·降低该类似物的生成的事实，可推测出这些PTH类似物的生成是起因于医药品制造设施内空气环境内所存在的具有氧化能力的物质。确实，对于医药品制造设施的空气环境来说，除了为高洁净度(等级A等)以外，经常会含有具有氧化能力的气体性物质。即，对于医药品制造设施，为了实现更为彻底的无菌环境，要利用甲醛、臭氧等灭菌剂进行熏蒸消毒。从而可以想到，会作为该熏蒸消毒残留物含有甲醛或臭氧等具有氧化能力的气体。进一步而言，不管有无熏蒸消毒，臭氧在大气中也以0.001ppm～0.02ppm存在，根据场所或时间、季节，以约0.02ppm～0.1ppm的浓度存在。

另外，本发明人还确认到，本发明中所说明的PTH类似物的生成可通过使PTH肽与含有臭氧的空气接触而再现。

因而，本发明包括以下方面和适宜的实施方式。

[1]一种含PTH肽冷冻干燥制剂，其为含有高纯度的PTH肽作为有效成分的冷冻干燥制剂，其中，该高纯度至少意味着至少1种PTH类似物的量相对于该制剂中的PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0%以下、和/或全部PTH类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下；该冷冻干燥制剂是通过下述方法制造出的：该方法的特征在于，抑制冷冻干燥前的含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[2]如[1]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，上述PTH类似物为下述类似物中的至少一种以上：

1)类似物1：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大64Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(1-a)～(1-c)的片段对应的消化物，

(1-a)Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys(序列编号：1)的质量数+16Da、

(1-b)His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg(序列编号：2)的质量数+16Da以及

(1-c)Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)的质量数+4Da；

2)类似物2：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大36Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(2-a)～(2-c)的片段对应的消化物，

(2-a)Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys(序列编号：1)的质量数+16Da、

(2-b)His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg(序列编号：2)的质量数+16Da以及

(2-c)Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)的质量数+4Da；

3)类似物3：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大32Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(3-a)～(3-b)的片段对应的消化物，

(3-a)Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys(序列编号：1)的质量数+16Da以及

(3-b)His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg(序列编号：2)的质量数+16Da；

4)类似物4：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大48Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(4-a)～(4-b)的片段对应的消化物，

(4-a)Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys(序列编号：1)的质量数+16Da以及

(4-b)Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)的质量数+4Da；

5)类似物5：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大48Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(5-a)～(5-b)的片段对应的消化物，

(5-a)His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg(序列编号：2)的质量数+16Da以及

(5-b)Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)的质量数+4Da；

6)类似物6：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大20Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(6-a)～(6-b)的片段对应的消化物，

(6-a)His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg(序列编号：2)的质量数+16Da以及

(6-b)Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)的质量数+4Da；

7)类似物7：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大16Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(7-a)的片段对应的消化物，

(7-a)Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys(序列编号：1)的质量数+16Da；

8)类似物8：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大16Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(8-a)的片段对应的消化物，

(8-a)His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg(序列编号：2)的质量数+16Da；

9)类似物9：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大32Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(9-a)的片段对应的消化物，

(9-a)Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)的质量数+4Da；

10)类似物10：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大16Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(10-a)的片段对应的消化物，

(10-a)Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)的质量数+16Da；或

11)类似物11：

上述PTH肽的氧化物，其具有比制剂中含有的PTH肽的质量数大4Da的质量数，且对该类似物进行胰岛素消化时生成与下述(11-a)的片段对应的消化物，

(11-a)Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)的质量数+4Da。

[3]如[1]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，上述PTH类似物为下述类似物中的至少1种以上：

1)类似物1’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位和18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为下述结构式(a)所表示的残基；

[化1]

2)类似物2’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位和18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为下述结构式(b)所表示的残基；

[化2]

3)类似物3’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位和18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基；

4)类似物4’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为上述结构式(a)所表示的残基；

5)类似物5’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为上述结构式(a)所表示的残基；

6)类似物6’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为上述结构(b)所表示的残基；

7)类似物7’

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基；

8)类似物8’

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基；

9)类似物9’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基变化为上述结构式(a)所表示的残基；

10)类似物10’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基变化为下述结构式(c-1)或(c-2)所表示的色氨酸单氧化物残基；

[化3]

或者

11)类似物11’：

上述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基变化为上述结构式(b)所表示的残基。

[4]如[2]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，上述高纯度意味着制剂中至少1种以上的上述类似物1～11的量相对于该制剂中的PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0%以下、和/或上述类似物量1～11的总量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下。

[5]如[3]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，上述高纯度意味着制剂中至少1种以上的上述类似物1’～11’的量相对于该制剂中的PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0%以下、和/或上述类似物量1’～11’的总量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下。

[6]如[1]～[5]的任意一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中上述PTH肽为人PTH(1-34)。

[7]如[1]～[6]的任意一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，含PTH肽冷冻干燥制剂为被收纳在玻璃制小药瓶中的制剂。

[8]如[1]～[7]的任意一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，抑制冷冻干燥前的含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中是在含PTH肽溶液的制备工序、无菌过滤工序、试剂填充工序以及向冷冻干燥单元中搬入的搬入工序中的任意1个以上的工序中进行的。

[9]如[8]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，该冷冻干燥制剂是通过下述方法制造出的，该方法进一步包括在冷冻干燥后的小药瓶密封工序中也抑制冷冻干燥物暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[10]如[1]～[9]任一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，抑制冷冻干燥前的含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境是在向冷冻干燥单元中搬入的搬入工序中进行的。

[11]如[10]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，上述暴露的抑制是通过使用冷冻干燥库来进行的，该冷冻干燥库采取了抑制医药品制造设施内空气流入到冷冻干燥单元内的手段。

[12]如[11]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，上述冷冻干燥单元为具有能够容易地开闭的副门的冷冻干燥库，该副门装备在小门部分出现的开口部，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬出/搬入该单元时打开该小门部分；由此，在上述搬入工序中，该副门仅在容器搬入时打开且在搬入后迅速关闭，从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[13]如[11]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，上述冷冻干燥单元为具有开口部的冷冻干燥库，该开口部在小门部分出现，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬入/搬出该单元时打开该小门部分；抑制医药品制造设施内空气流入到冷冻干燥单元内的单元为整风罩，该整风罩使流动空气的流向改变到不从该开口部朝向库内的方向。

[14]如[10]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，上述搬入工序通过将冷冻干燥单元内利用惰性气体置换而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[15]如[10]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，

上述冷冻干燥单元为具有能够容易地开闭的副门的冷冻干燥库，该副门装备在小门部分出现的开口部，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬入/搬出该单元时打开该小门部分，由此，在上述搬入工序中，该副门仅在容器搬入时打开，在搬入后迅速关闭；并且将冷冻干燥单元内利用惰性气体置换；从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[16]如[10]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，上述冷冻干燥单元为具有开口部、进而在该开口部具备整风罩的冷冻干燥库，该开口部在小门部分出现，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬入/搬出该单元时打开该小门部分，由此，在上述搬入工序中，该整风罩使流动空气的流向改变到不朝向库内的方向；并且将冷冻干燥单元内利用惰性气体置换；从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[17]如[10]～[16]的任意一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，上述搬入工序为经过了3小时以上的该工序。

[18]如[8]～[17]的任意一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，其通过下述方法制造：从含PTH肽溶液的制备工序开始直到搬入到冷冻干燥单元中的搬入工序结束为止经过了3小时以上，在其间的1个以上的工序中抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[19]如[14]～[18]的任意一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，上述惰性气体为氮气。

[20]一种含PTH肽冷冻干燥制剂，其为含有高纯度的PTH肽作为有效成分的冷冻干燥制剂，该冷冻干燥制剂是通过下述方法制造的，该方法的特征在于，在冷冻干燥前将含PTH肽溶液搬入到冷冻干燥单元中时抑制其暴露在医药品制造设施内空气环境中；其中，上述高纯度至少意味着至少1种PTH类似物的量相对于该制剂中的PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0%以下、和/或全部PTH类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下；上述搬入工序为经过了3小时以上的工序；且上述空气环境为通过了HEPA过滤器的洁净空气以从上方向下方的单方向气流的形式被维持着的环境；该HEPA过滤器正下方20cm位置的气流为0.2m/s～1.0m/s的流速气流。

[21]一种含PTH肽冷冻干燥制剂的制造方法，其特征在于，在从含PTH肽溶液的制备工序开始到搬入到冷冻干燥单元中的搬入工序结束的期间的1个以上的工序中抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[22]如[21]所述的方法，该方法进一步包括：在冷冻干燥后的小药瓶密封工序中也抑制冷冻干燥物暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[23]如[21]或[22]所述的方法，其特征在于，在搬入到冷冻干燥单元中的搬入工序中抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[24]如[23]所述的方法，其特征在于，上述暴露的抑制使用冷冻干燥库，该冷冻干燥库采取了抑制医药品制造设施内空气流入到冷冻干燥单元内的手段。

[25]如[23]或[24]所述的方法，其中，搬入到冷冻干燥单元中的搬入工序为经过了3小时以上的该工序。

[26]如[24]或[25]所述的方法，其中，上述冷冻干燥单元为具有能够容易地开闭的副门的冷冻干燥库，该副门装备在小门部分出现的开口部，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬出/搬入时打开该小门部分；由此，在上述搬入工序中，该副门仅在容器搬入时打开，在搬入后迅速关闭，从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[27]如[24]或[25]所述的方法，其中，上述冷冻干燥单元为具有开口部的冷冻干燥库，该开口部在小门部分出现，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬入/搬出该单元时打开该小门部分；抑制医药品制造设施内空气流入到冷冻干燥单元内的单元为整风罩，该整风罩使流动空气的流向改变到不从该开口部朝向库内的方向。

[28]如[23]或[25]所述的方法，其特征在于，将冷冻干燥单元内利用惰性气体进行置换，从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[29]如[23]或[25]所述的方法，其特征在于，上述冷冻干燥单元为具有能够容易地开闭的副门的冷冻干燥库，该副门装备在小门部分出现的开口部，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬出/搬入时打开该小门部分，由此，在上述搬入工序中，该副门仅在溶液容器搬入时打开，在搬入后迅速关闭；并且将冷冻干燥单元内利用惰性气体置换；从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[30]如[23]或[25]所述的方法，其特征在于，上述冷冻干燥单元为具有开口部、进而在该开口部具备整风罩的冷冻干燥库，该开口部在小门部分出现，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬入/搬出该单元时打开该小门部分，由此，在上述搬入工序中，该整风罩使流动空气的流向改变到不朝向库内的方向；并且将冷冻干燥单元内利用惰性气体置换；从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

[31]如[28]～[30]的任一项所述的方法，其中，上述惰性气体为氮气。

[32]如[21]～[31]的任一项所述的方法，其中，上述收纳含PTH肽溶液的容器为玻璃制小药瓶。

[33]如[21]～[32]的任一项所述的方法，其中，上述PTH为人PTH(1-34)。

[34]如[21]～[33]的任一项所述的方法，其中，医药品制造设施内空气环境为：1)等级A的空气；2)通过了HEPA过滤器的洁净空气以从上方向下方的单方向气流的形式被维持着，该HEPA过滤器具有以99.97%以上的效率捕捉粒径为0.3μm的颗粒的性能；并且3)含有臭氧浓度为0.001ppm～0.1ppm的空气环境。

[35]如[21]～[34]的任一项所述的方法，其中，医药品制造设施内空气环境为甲醛含有浓度0.1ppm以下的空气环境。

[36]如[21]～[35]的任一项所述的方法，该方法用于使含PTH肽冷冻干燥制剂中的至少1种PTH类似物的量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0%以下、和/或使全部PTH类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下。

[37]如[21]～[36]的任一项所述的方法，其用于抑制上述[2]中所述的PTH类似物1～11的生成。

[38]如[21]～[36]的任一项所述的方法，其用于抑制上述[3]中所述的PTH类似物1’～11’的生成。

[39]一种含PTH肽冷冻干燥制剂，其通过上述[21]～[38]的任一项所述的方法制造。

[40]一种含有高纯度的PTH肽作为有效成分的冷冻干燥制剂的制造方法，该制造方法的特征在于，在冷冻干燥前将含PTH肽溶液搬入到冷冻干燥单元中时抑制其暴露在医药品制造设施内空气环境中；其中，上述高纯度至少意味着至少1种PTH类似物的量相对于该制剂中的PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0%以下、和/或全部PTH类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下；上述搬入工序为经过了3小时以上的工序；且上述空气环境为通过了HEPA过滤器的洁净空气以从上方向下方的单方向气流的形式被维持着的环境；该HEPA过滤器正下方20cm位置的气流为0.2m/s～1.0m/s的流速气流。

本发明进一步涉及一种检査方法，该检查方法对于含PTH肽冷冻干燥制剂作为医药品的适合性的保证和法规的遵守为重要的。该检査方法的特征在于，对于上述PTH类似物的任意1种以上或其全部的存在进行确认、和/或对存在量进行定量。作为该方面和适宜的实施方式包括以下内容。

[41]一种含PTH肽冷冻干燥制剂的检査方法，该方法的特征在于，对于该含PTH肽冷冻干燥制剂中的[2]中所述的PTH类似物1～11的至少1种以上的存在进行确认、和/或对存在量进行定量。

[42]一种含PTH肽冷冻干燥制剂的检査方法，该方法的特征在于，对于该含PTH肽冷冻干燥制剂中的[3]中所述的PTH类似物1’～11’的至少1种以上的存在进行确认、和/或对存在量进行定量。

[43]如[41]或[42]所述的方法，其中，上述PTH类似物的定量包括：对来自含PTH肽冷冻干燥制剂的试样进行高效液相色谱，计算出测定紫外部吸收时的色谱图上的相当于所述PTH类似物的峰面积。

[44]如[43]所述的方法，其包括：对于来自含PTH肽冷冻干燥制剂的试样，利用高效液相色谱测定紫外部吸收，通过对此时色谱图上的相当于所述PTH类似物的峰面积、与同一色谱图上的相当于PTH肽的峰面积或PTH肽的峰面积与除此以外检测出的全部PTH类似物的峰面积之和进行比较，从而计算出该含PTH肽冷冻干燥制剂中的PTH肽的纯度。

[45]如[44]所述的方法，其中，在上述色谱图上应用以1个或2个以上的单一峰的形式检测出上述PTH类似物的任意2种以上的层析条件的情况下，通过将该峰的面积、与同一色谱图上相当于PTH肽的峰面积或PTH肽的峰面积与除此以外检测出的全部PTH类似物的峰面积之和进行比较，从而计算出该含PTH肽冷冻干燥制剂中的PTH肽的纯度。

[46]如[41]～[45]的任一项所述的方法，其用于保证含PTH肽冷冻干燥制剂中的至少1种PTH类似物的量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0%以下、和/或全部PTH类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下。

[47]如[41]～[46]的任一项所述的方法，其进一步包括：使用高效液相色谱质量分析仪对所述PTH类似物的质量数进行检测。

[48]如[41]～[47]的任一项所述的方法，其进一步包括：分取在上述色谱图上产生单一峰的物质，对该物质进行胰岛素消化，鉴定所生成的片段的质量数。

[49]一种包含含PTH肽冷冻干燥制剂的医药品的制造方法，该制造方法包括实施上述[41]～[48]的任一项所述的检査方法的工序。

还进一步涉及作为本发明适宜的含PTH肽冷冻干燥制剂的下述方面。

[50]一种含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，至少1种以上的PTH类似物相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0%以下、和/或全部PTH类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下。

[51]一种含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，各PTH类似物相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和均为1.0%以下、和/或全部PTH类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0%以下。

[52]如[50]或[51]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，PTH类似物为上述[2]中所述的类似物。

[53]如[50]或[51]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，PTH类似物为上述[3]中所述的类似物。

[54]如[52]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和至少为下述关系：

类似物1量为0.04%以下；

类似物3与类似物4的总量为0.11%以下；

类似物5的量为0.26%以下；

类似物7的量为0.33%以下；

类似物8的量为选自0.21%～1.00%中的任意百分数以下；和

类似物9的量为0.68%以下。

[55]如[53]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和至少为下述关系：

类似物1’量为0.04%以下；

类似物3’与类似物4’的总量为0.11%以下；

类似物5’的量为0.26%以下；

类似物7’的量为0.33%以下；

类似物8’的量为选自0.21%～1.00%中的任意百分数以下；和

类似物9’的量为0.68%以下。

[56]如[52]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，类似物1的量、类似物2的量、类似物3与类似物4的总量、类似物5的量、类似物6的量、类似物7的量、类似物8的量、类似物9的量、类似物10和类似物11的总量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和均为1.0%以下。

[57]如[53]中所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，类似物1’的量、类似物2’的量、类似物3’与类似物4’的总量、类似物5’的量、类似物6’的量、类似物7’的量、类似物8’的量、类似物9’的量、类似物10’和类似物11’的总量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和均为1.0%以下。

[58]如[50]～[57]的任意一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，含PTH肽冷冻干燥制剂为填充在具有塞的玻璃容器中的制剂。

[59]如[50]～[58]的任意一项所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，含PTH肽冷冻干燥制剂为玻璃制小药瓶制剂。

[60]如[50]～[59]的任意一项所述的含PTH冷冻干燥制剂，其中，PTH肽为人PTH(1-34)。

发明的效果

本发明提供高纯度含PTH冷冻干燥制剂。即，本发明中防止·降低PTH类似物在医药品制造时不期望的生成，该PTH类似物确认在含PTH冷冻干燥制剂中生成且被鉴定出。此外，通过对该PTH类似物定量，能够简便、迅速且确实地对含PTH冷冻干燥制剂的品质进行确认·验证，同时能够制造出作为医药品合格的该制剂。

附图说明

图1示出了将PTH肽作为试样进行高效液相色谱(HPLC)并测定紫外部(214nm)吸收时的色谱图，该PTH肽是作为PTH肽冷冻干燥制剂的原料使用的，该PTH肽冷冻干燥制剂是作为实施例和比较例制造出的。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示吸收强度。约20～21分钟左右出现的大峰为人PTH(1-34)。“6(圈起的数字)”对应于类似物7(类似物7’)、“7(圈起的数字)”对应于类似物8(类似物8’)。

图2表示以作为实施例1制造出的PTH肽冷冻干燥制剂为试样进行高效液相色谱(HPLC)并测定紫外部(214nm)吸收时的色谱图。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示吸收强度。在21.157分钟(保留时间)出现的大峰为人PTH(1-34)。“1(圈起的数字)”对应于类似物1(类似物1’)、“2(圈起的数字)”对应于类似物2(类似物2’)、“3(圈起的数字)”对应于类似物3与类似物4’的混合物(类似物3’与类似物4’的混合物)、“4(圈起的数字)”对应于类似物5(类似物5’)、“6(圈起的数字)”对应于类似物7(类似物7’)、“7(圈起的数字)”对应于类似物8(类似物8’)、“8(圈起的数字)”对应于类似物9(类似物9’)、“9(圈起的数字)”对应于类似物10与类似物11的混合物(类似物10’与混合物11’的混合物)。

图3表示以作为比较例1制造出的PTH肽冷冻干燥制剂为试样进行高效液相色谱(HPLC)并测定紫外部(214nm)吸收时的色谱图。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示吸收强度。在20.279分钟(保留时间)出现的大峰为人PTH(1-34)。“5(圈起的数字)”相当于类似物6(类似物6’)，其它圈起的数字与图2含义相同。

图4表示以作为试验例2暴露于臭氧中的PTH肽冷冻干燥制剂为试样进行高效液相色谱(HPLC)并测定紫外部(214nm)吸收时的色谱图。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示吸收强度。在22.670分钟(保留时间)出现的大峰为人PTH(1-34)。圈起的数字与图2含义相同。

图5表示甲硫氨酸氧化物的结构。

图6表示色氨酸变体（tryptophanvariant）的结构。

图7表示类似物1的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图8表示类似物2的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图9表示类似物3与类似物4的混合物的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图10表示类似物5的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图11表示类似物6的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图12表示类似物7的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图13表示类似物8的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图14表示类似物9的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图15表示类似物10与11的混合物的高效液相色谱-质量分析(LC/MS)的结果。横轴表示时间(分钟)、纵轴表示检出强度。

图16为示出本发明适宜的冷冻干燥单元的一例的示意图。

图17为示出本发明适宜的冷冻干燥单元的一例的示意图。

具体实施方式

对本发明进行具体说明。

(1)PTH肽

本发明中的“PTH肽”这一术语作为天然型PTH及其生理学活性同等物的总称来使用。PTH的生理学活性的特征在于具有血清钙上升作用。适宜的PTH肽包括天然型PTH或其部分肽类，可以为分子量约4,000至10,000的肽类。只是，PTH肽的全部构成氨基酸残基与天然体相比并未进行化学修饰，不包括后述的(2)PTH类似物。作为部分肽的具体例，可以举出，人PTH(1-34)、人PTH(1-35)、人PTH(1-36)、人PTH(1-37)、人PTH(1-38)、人PTH(1-84)等，它们均具有34～84个氨基酸序列。即，人PTH(1-34)为与天然型的人PTH氨基酸编号1～34对应的该天然型序列的部分肽。适宜优选为人PTH(1-34)、人PTH(1-84)，特别优选为人PTH(1-34)。人-PTH(1-34)的氨基酸序列如下：

[化4]

此外，本发明的PTH肽可以与1种或2种以上的挥发性有机酸形成盐，以该盐的形式存在。作为挥发性有机酸，可示例出三氟乙酸、甲酸、醋酸等，优选可以举出醋酸，但并不限定于此。游离体的PTH肽与挥发性有机酸形成盐时两者的比例也没有特别限定，只要能形成盐即可。例如，人-PTH(1-34)在其分子中具有9分子的碱性氨基酸残基与4分子的酸性氨基酸残基，若考虑到它们在分子内的成盐，则可将碱性氨基酸5个残基当作醋酸的化学当量。例如，若使用以醋酸重量×100(%)/人-PTH(1-34)的肽重量表示的醋酸含量作为醋酸量，作为一个理论，相对于作为游离体的人-PTH(1-34)的醋酸化学当量为约7.3%(重量%)。在本申请说明书中，作为游离体的人-PTH(1-34)被称为“特立帕肽(teriparatide)”，并且还将特立帕肽的醋酸盐称为“特立帕肽醋酸盐”。特立帕肽醋酸盐中的醋酸含量没有特别限定，只要特立帕肽与醋酸形成盐即可，例如，可以是上述理论化学当量——7.3%以上，根据情况，只要超过0%，也可以小于1%。代表性地，作为特立帕肽醋酸盐中的醋酸含量，可示例出1%～7%、优选示例出2%～6%。

其中，不管本发明的PTH肽为游离体还是为其盐，本发明的制剂中的PTH肽量、各PTH类似物量、PTH类似物混合物量和全部PTH类似物均可利用HPLC试验进行定量，并且需要留意的是这种情况下的PTH肽和PTH类似物全部以游离体量的形式进行定量。

(2)PTH类似物

本发明中的“PTH类似物”被广义定义为，对含PTH肽冷冻干燥制剂来源的试样进行HPLC时，在该色谱图上作为与属于有效成分的PTH肽不同的峰被检测出的物质。因而，如果在该色谱图上以与原来的PTH肽不同的1个峰的形式检测出，则即使在该峰内混合存在有2种以上的不同化学物质的情况下，也将该峰所包括的全部化学物质一起看作1种“PTH类似物”。即，出于通常的冷冻干燥制剂的纯度确认或测定的目的，在HPLC的色谱图上能够以单一峰的形式检测出的2种以上的化学物质的混合物也概括性地被称为“类似物”，且简便起见，广泛地将由这样的混合物形成的单一峰看作1种“类似物”进行纯度确认或纯度计算等，因而在本发明中，将在给定条件下的HPLC中以单一峰的形式检测出的2种以上化学物质的混合物概括性地看作1种“PTH类似物”也是无妨的。

本发明中，已发现在含PTH肽冷冻干燥制剂的制造中生成的PTH类似物按下述表1进行鉴定。

[表1]

表1：PTH类似物的鉴定

上述表1中，T1～T3为将各类似物进行胰岛素消化时所生成的代表性的片段，基于人PTH(1-34)序列的氨基酸编号的记载如下。

[化5]

T1：(与人PTH(1-34)的1位～13位对应)

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys(序列编号：1)

T2：(与人PTH(1-34)的14位～20位对应)

His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg(序列编号：2)

T3(与人PTH(1-34)的21位～25位对应)

Val-Glu-Trp-Leu-Arg(序列编号：3)

此外，表1中发生了变化的氨基酸的编号被表示为对应的人PTH(1-34)序列的氨基酸编号，在本说明书中，在没有特别指出的情况下，为同样的标记。

进一步地，在表1的推测结构中，人PTH(1-34)-Met8[O]-Met18[O]-Trp23[二氧化](类似物1’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的8位和18位甲硫氨酸对应的残基分别为甲硫氨酸亚砜残基，与23位色氨酸对应的残基为下述结构(a)所表示的残基(Trp23氧化(a)残基)，其它结构与原来的PTH肽相同。

[化6]

此外，人PTH(1-34)-Met8[O]-Met18[O]-Trp23[二氧化-甲酸脱离](类似物2’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的8位和18位甲硫氨酸对应的残基分别为甲硫氨酸亚砜残基，与23位色氨酸对应的残基为下述结构(b)所表示的残基(Trp23氧化(b)残基)，其它结构与原来的PTH肽相同。

[化7]

同样地，人PTH(1-34)-Met8[O]-Met18[O](类似物3’)意味着人PTH(1-34)中的与8位和18位甲硫氨酸对应的残基分别为甲硫氨酸亚砜残基、其它结构与原来的PTH肽相同的PTH类似物。此外，人PTH(1-34)-Met8[O]-Trp23[二氧化](类似物4’)意味着人PTH(1-34)中的与8位甲硫氨酸对应的残基为甲硫氨酸亚砜残基、与23位色氨酸对应的残基为Trp23氧化(a)残基、其它结构与原来的PTH肽相同的PTH类似物。需要说明的是，根据HPLC条件的不同，类似物3’与类似物4’容易以单一峰的形式检测出，这种情况下，如上所述，PTH类似物也可被定义为该类似物3’与类似物4’的混合物。

人PTH(1-34)-Met18[O]-Trp23[二氧化](类似物5’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基为甲硫氨酸亚砜残基，与23位色氨酸对应的残基为Trp23氧化(a)残基，其它结构与原来的PTH肽相同。

人PTH(1-34)-Met18[O]-Trp23[二氧化-甲酸脱离](类似物6’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基为甲硫氨酸亚砜残基，与23位色氨酸对应的残基为Trp23氧化(b)残基，其它结构与原来的PTH肽相同。

人PTH(1-34)-Met8[O](类似物7’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的8位甲硫氨酸对应的残基为甲硫氨酸亚砜残基，其它结构与原来的PTH肽相同。

人PTH(1-34)-Met18[O](类似物8’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基为甲硫氨酸亚砜残基，其它结构与原来的PTH肽相同。

人PTH(1-34)-Trp23[二氧化](类似物9’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基为Trp23氧化(a)残基，其它结构与原来的PTH肽相同。

人PTH(1-34)-Trp23[单氧化](类似物10’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基为下述结构(c)-1或(c)-2所表示的残基(Trp23氧化(c)残基)，其它结构与原来的PTH肽相同。

[化8]

人PTH(1-34)-Trp23[二氧化-甲酸脱离](类似物11’)意味着下述PTH类似物：与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基为Trp23氧化(b)残基，其它结构与原来的PTH肽相同。需要说明的是，根据HPLC条件的不同，类似物10’与类似物11’容易以单一峰的形式检测出，这种情况下，如上所述，PTH类似物也可被定义为该类似物10’与类似物11’的混合物。

上述类似物1’～11’中，按照导入各甲硫氨酸、色氨酸氧化而生成的改性氨基酸残基的方式，PTH肽发生变化。因而可推断本发明的PTH类似物的生成是通过具有氧化能力的物质与PTH肽的接触而开始的，该推断被认为是合理的。即，本说明书中的“具有氧化能力的物质”意味着具有对PTH肽的构成氨基酸、特别是甲硫氨酸或色氨酸进行氧化的能力的物质。特别是，如上所述，医药品制造设施内的空气可能会存在臭氧、甲醛等氧化性气体分子，鉴于此，这样的医药品制造设施内空气所含有的、能够氧化甲硫氨酸或色氨酸的物质作为本说明书中的“具有氧化能力的物质”受到关注。

需要说明的是，如上述所明确，在作为有效成分含有的PTH肽为人PTH(1-34)以外的情况下，也可应用上述那样的PTH类似物的定义。例如，在使用人PTH(1-84)作为有效成分的情况下，所对应的类似物1’也可被表示为人PTH(1-84)-Met8[O]-Met18[O]-Trp23[二氧化]，这种情况下，其可被指定为下述PTH类似物：人PTH(1-84)的8位和18位甲硫氨酸残基分别为甲硫氨酸亚砜残基，23位色氨酸残基为Trp23氧化(a)残基，其它结构与人PTH(1-84)相同。

(3)PTH类似物的检测与定量

含PTH冷冻干燥制剂中的PTH类似物可如下检测或定量：将该制剂在适当的溶剂(含有苯扎氯铵的磷酸缓冲液等)中制成溶液来制作试样，在例如下述条件下对该试样进行HPLC，由此来进行检测或定量。

<HPLC的条件>

a)检测器：紫外吸光光度计(测定波长：214nm)

b)柱：在内径4.6mm、长度150mm的不锈钢管中填充3.5μm的液相色谱法用十八烷基甲硅烷基化硅胶(AgilentTechnologies社制造的Zorbax300SB-C18、或者同等品)

c)柱温度：40℃附近的恒温

d)移动相：

移动相A：将无水硫酸钠28.4g溶于水900mL中，加入磷酸调整为pH2.3，之后加入水制成1000mL。向该溶液900mL中加入乙腈100mL。

移动相B：将无水硫酸钠28.4g溶于水900mL中，加入磷酸调整为pH2.3，之后加入水制成1000mL。向该溶液500mL中加入乙腈500mL。

e)移动相的送液：将移动相A和移动相B的混合比按表2所示变化，进行浓度梯度控制。

[表2]

表2：浓度梯度控制

试样注入后的时间(分钟)	移动相A(vol%)	移动相B(vol%)
			0～5	100→65	0→35
5～35	65→60	35→40
			35～45	60→0	40→100

f)流量：每分钟1.0mL

g)检出时间：试样溶液注入后45分钟。但其自溶剂峰之后。

本发明的PTH肽和PTH类似物在紫外部区域实质上具有吸光度，因此在其检测和定量中监视紫外部吸收是有利的。对于测定波长，只要能够检测出PTH肽和PTH类似物就没有特别限定，例如可选择210nm～360nm、优选210nm～280nm、更优选210nm～254nm范围的1个以上的波长。适宜波长的一例为214nm。可基于该紫外吸收的测定值来制作色谱图。

基于实施上述HPLC而得到的色谱图的各PTH的类似物量和PTH肽量，可通过计算出该色谱图上的各峰面积(例如，通过自动积分法)来求得。然后，基于该计算值，通过下述式1和2，可分别对各PTH类似物量(%)和全部PTH类似物量(%)进行定量和比较。需要说明的是，式中的“总峰面积”是通过将上述色谱图上的PTH肽的峰面积与除此以外检出的全部PTH类似物的峰面积相加而求得的值。因而，该“总峰面积”相当于“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”。此外，在本发明中，除非特别声明，“%”具有下式的含义。

<式1>

各PTH类似物量(%)=(各类似物的峰面积/总峰面积)×100

<式2>

全部PTH类似物量(%)=(各类似物的峰面积的总和/总峰面积)×100

需要说明的是，在上述条件下实施HPLC的情况下，如上所述，由人-PTH(1-34)生成的类似物3与4(类似物3’与4’)以单一峰的形式洗脱，这种情况下，即使将该单一峰看作1种类似物，在用于制剂的纯度确认或测定时也不会对结果带来影响，因而可将该类似物3与4(类似物3’与4’)的混合峰看作1种类似物。对于类似物10与11(类似物10’与11’)也是同样的。

下述表3示出了上述条件下对于来源于含有人PTH(1-34)的冷冻干燥制剂在实施HPLC的情况下的代表性测定例。需要说明的是，关于表中记载为“大致的相对保留时间”，由于相对保留时间有时也会根据所使用的柱或移动相流量的变化而变化，但这种情况下，也可以该相对保留时间为基准，同时基于色谱图的图案对各类似物进行鉴定、定量。

[表3]

表3：HPLC测定例

(4)含PTH肽冷冻干燥制剂

本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂意味着含有PTH肽作为有效成分的冷冻干燥制剂。

本发明的含PTH冷冻干燥制剂的一个方式为下述的含PTH肽冷冻干燥制剂：其中，该制剂中所具有的PTH类似物量相对于“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”为1.0%以下、和/或该制剂中的全部PTH类似物量相对于“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”也为5.0%以下。

此外，本发明含PTH冷冻干燥制剂的其它方式为下述的含PTH肽冷冻干燥制剂：其中，该制剂中的各PTH类似物量相对于“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”均为1.0%以下、和/或该制剂中的全部PTH类似物量相对于“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”也为5.0%以下。需要说明的是，“1.0%以下”和“5.0%以下”意味着PTH类似物在本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂中完全不含有的情况、或者含有该%以下的情况。

优选的是，在本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂中，不包括至少1种以上的PTH类似物相对于“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”超过1.0%，更优选不包括全部PTH类似物相对于“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”超过1.0%。此外，如上所述，在2种以上的类似物在色谱图上产生单一峰的情况下，将该单一峰看作1种类似物，更优选不包括被这样看作的类似物相对于“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”超过1.0%。此外，该制剂中的各PTH类似物量优选为“1.0%以下”，也优选为0.9%以下、0.8%以下、0.7%以下、0.6%以下。进一步地，全部PTH类似物量优选为“5.0%以下”，也优选为4.5%以下、4.0%以下、3.5%以下、3.0%以下。

此外，还可以作为下述表4示例出本发明的适宜的含PTH肽冷冻干燥制剂。(需要说明的是，表中的“PTH类总量”意味着“PTH肽量与全部PTH类似物量之和”。)

[表4]

表4：本发明的适宜的含PTH肽冷冻干燥制剂

若对本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂进一步说明，则本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂可以含有各种添加剂。作为添加剂，可以举出例如糖类、氨基酸、或者氯化钠等。作为添加剂使用糖类的情况下，作为糖类，优选添加相对于PTH肽1重量为1重量以上(优选50重量～1000重量)的甘露醇、葡萄糖、山梨糖醇、肌醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖。在使用糖类和氯化钠作为添加剂的情况下，优选相对于糖类1重量添加1/1000～1/5重量(优选1/100～1/10重量)的氯化钠。

(5)含PTH肽冷冻干燥制剂的容器

用于本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂的容器没有特别限定，优选该制剂为填充在具有塞的玻璃容器中的含PTH肽冷冻干燥制剂。塞的材质没有特别限定，优选橡胶制。塞优选进行清洗、灭菌、和/或干燥。

本发明的填充在具有塞的玻璃容器中的含PTH肽冷冻干燥制剂例如为：填充在具有橡胶塞的玻璃制小药瓶中的含PTH肽冷冻干燥制剂(玻璃制小药瓶制剂)；包括填充在具有橡胶塞的玻璃制小药瓶中的含PTH肽冷冻干燥制剂与无菌填充有溶解用水溶液的安瓿的试剂盒制剂；包括含PTH肽冷冻干燥制剂与无菌填充有溶解用水溶液的预填充式注射器的试剂盒制剂；玻璃制复室制剂(在1个注射器中存在2室，1室中含有含PTH冷冻干燥品、另一室中含有溶解用水溶液)。作为本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂，最优选玻璃制小药瓶制剂。作为橡胶塞的材料，可以举出氯化丁基橡胶、正丁基橡胶、聚丁橡胶、异戊二烯橡胶、硅酮橡胶、弹性体等。作为玻璃，优选硼硅酸盐玻璃。

(6)含PTH肽冷冻干燥制剂的制造

对于冷冻干燥制剂，根据其用途，代表性地可通过包括下述工序的全部或任意之一的工艺来制造。只要没有特别声明，本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂也可按照以下工序来制造。即，本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂的制造方案至少包括以下说明的含有有效成分的溶液制备工序与冷冻干燥工序，通常包括含有有效成分的溶液制备工序、搬入工序、和冷冻干燥工序，优选包括含有有效成分的溶液制备工序、无菌过滤·试剂填充工序、搬入工序、冷冻干燥工序、和包装工序。

1)有效成分溶液制备工序

本工序为将有效成分的原药与必要时的各种添加剂溶解在溶剂(例如注射用水)中的工序。并且可根据需要进行溶解液的pH调整或溶解液的液量调整等。对于该工序所需要的时间，只要为工业生产所容许的时间内就没有特别限定，根据情况为0.5小时～5小时、通常为1小时～3小时左右。

以本发明的PTH肽为有效成分的情况下，优选预先溶解PTH肽的原药，将其加入到溶解有各种添加剂的溶剂中。作为各种添加剂，可示例出赋形剂、稳定化剂、溶解辅助剂、抗氧化剂、无痛化剂、等渗剂、pH调节剂、防腐剂。

2)无菌过滤·试剂填充工序

本工序包括：将上述工序中制备的含有有效成分的溶液无菌过滤、以及将该无菌过滤后的溶液(试剂)填充在适于实施以下说明的冷冻干燥工序的容器中。

本工序中的代表性的无菌过滤使用过滤器来进行。无菌过滤用的过滤器可利用各种市售品。过滤器的孔径优选为0.2μm以下或0.22μm以下。此外，实施无菌过滤的具体装置等也为本领域技术人员公知的。通过这样来实施无菌过滤，能够制备出用于制造作为医药品利用的冷冻干燥制剂的试剂。

本工序中的代表性的试剂填充也是本领域技术人员公知的。将有效成分的溶解液无菌过滤后的试剂通常直接填充到各容器中。或者可暂且将大量溶解液一次性无菌过滤，此后分注到适于下述工序中使用的容器中。作为这些容器，可示例出能够利用橡胶塞等进行栓塞的玻璃制小药瓶。使用这样的玻璃制小药瓶时，在装入玻璃制小药瓶的制剂的制造中是有利的。

对于本工序所需要的时间，只要为工业生产上容许的时间内就没有特别限定，根据情况，作为过滤工序为0.5小时～2小时、通常为0.5小时～1小时，作为填充工序为3小时～10小时、通常为6小时～10小时。

需要说明的是，将本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂制成装入玻璃制小药瓶的制剂的情况下，对于1个玻璃制小药瓶，例如可填充1g(优选0.3g～3g、进一步优选为0.5g～0.6g)左右的含有PTH肽的无菌过滤后的溶液。

3)搬入工序

此处所说的搬入工序意味着将如上所述准备的填充后的容器运输(传送)至下述工序中利用的冷冻干燥单元、搬入·配置于该单元内的一系列工序。

进一步地，在冷冻干燥制剂的制造中，为了使在后续工序中冷冻的填充液真空干燥，通常将该填充容器的塞子打开或半开。即，“打开”意味着塞子全开，“半开”意味着塞自未打开但也未塞住的状态，这样可使容器中的试剂在冷冻后真空干燥。例如，在所制造的制剂为装入玻璃制小药瓶的制剂的情况下，在玻璃制小药瓶中填充无菌过滤液(试剂)后，利用橡胶塞半塞住填充后的小药瓶，可得到如上所述的半开的状态。从而，在将本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂制造成装入玻璃制小药瓶的制剂等的情况下，这样地用于进行半塞的工序也包含在该搬入工序中。

冷冻干燥单元为可在真空下将冷冻的溶液干燥的单元。用于工业生产的该单元优选还具备对于溶液的冷冻充分的冷却功能，此外为了促进冷冻干燥，优选具备在该处理中对被冷冻干燥物进行适度加热的功能。并且，适于工业生产的代表性的冷冻干燥单元具有用于将被冷冻干燥物搬入到库内的、与该单元的大致整个前表面对应的大门(下文中也称为“大门”。)。代表性的冷冻干燥单元为冷冻干燥库(也称为“冷冻干燥机”。)，其多种型式被市售。

若对本工序进行示例性说明，则在例如要制造的制剂为装入玻璃制小药瓶的制剂的情况下，将上述“2)”的工序中得到的试剂填充玻璃制小药瓶半塞，将其传送至冷冻干燥单元，将该小药瓶分别依次搬入到冷冻干燥库中、或以一定数量单位一次性一起搬入到冷冻干燥库中，配置的过程与本工序对应。需要说明的是，对此处小药瓶分别“依次搬入”的情况说明如下：根据医药品制造工厂的布局(レイアウト)，有时通过上述的试剂填充工序将试剂依次连续填充到各个小药瓶中，其后将各小药瓶依次半塞，运输(传送)至冷冻干燥单元中。但是，通常由于要等待将该冷冻干燥单元一次能够处理的数量的小药瓶全部搬入到冷冻干燥单元内之后，再转移至接下来的冷冻干燥工序中，因而多数情况下将如上所述被传送的各小药瓶依次传入到冷冻干燥单元内，直至达到该一次能够处理的数量(即“依次搬入”)，并且配置在该单元内。但是，这样进行“依次搬入”的本发明的“搬入工序”意味着如下工序：在某一(最前头的)小药瓶完成试剂填充工序后开始，然后直到与该(最前头的)小药瓶一起(即，一次)进行冷冻干燥的最后的小药瓶被搬入·配置在冷冻干燥单元内为止的工序。

此外，将小药瓶“以一定数量单位一次性一起”搬入是指，例如在配置于冷冻干燥库内时，冷冻干燥库内具有2个以上的托架(棚)，可将2个以上的试剂填充小药瓶一起放在各托架上，并且根据情况，为了便于试剂填充小药瓶的搬入，该托架可上下移动，此外，根据情况，本发明的“搬入工序”还意味着如下工序：在某一(最前头的)小药瓶完成试剂填充工序后开始、并且直到与该(最前头的)小药瓶一起进行冷冻干燥的最后的小药瓶被搬入·配置在冷冻干燥单元内的工序。在任一情况下，在该工序中，均将试剂填充小药瓶以半塞状态放置至直到后面的冷冻干燥工序开始前，并且可暴露在以下说明的医药品制造设施内空气环境中。

本工序所需要的时间只要为工业生产所容许的时间内就没有特别限定，根据情况为3小时～10小时、通常为6小时～10小时左右。

4)冷冻干燥工序

该工序为利用上述冷冻干燥单元在减压下使水由冷冻状态的被干燥物中升华的工序。在制造装入玻璃制小药瓶的冷冻干燥制剂的情况下，减压中使该小药瓶为打开或半开状态(例如，使小药瓶半开)，在冷冻干燥终止时将小药瓶空隙氮气置换，之后进行密封。

本工序所需要的时间根据冷冻干燥单元的能力或被冷冻干燥物的量等而变化，但只要为工业生产所容许的时间内即可，通常为24小时～72小时左右。

5)封口(卷き締め)工序

该工序为在制造装入玻璃制小药瓶的冷冻干燥制剂的情况下可以包含的工序。具体地说，例如为将上述“4)”的工序中得到的冷冻干燥处理后的玻璃制小药瓶利用冲压式封盖机等以铝盖封口的工序。

6)包装工序

该工序为对制剂赋添上标签并包装在纸箱等中的工序。

将冷冻干燥制剂作为医药品制造的情况下，必须要求该制造设施为适于医药品GMP的设施。为了实施上述说明的工序，该设施可以具有试剂制备设备、无菌过滤设备和冷冻干燥设备(单元)，并且此外还可具有注射用水制造设备、小药瓶填充·栓塞设备、封盖机、贴标签机(ラベラー)等。

此外，将冷冻干燥制剂作为医药品制造的情况下，上述的工序1)～6)的全部、或者至少无菌过滤工序的终止～冷冻干燥工序的开始为止期间应该在医药品制造设施内空气环境下进行。即，医药品制造设施的空气环境与仅仅外气环境是不同的。具体地说，在无菌注射剂的(医药品)制造设施内空气环境中，要求为“洁净度高的重要区域(在作业时和非作业时，每1m³空气所含有的粒径为0.5μm以上的浮游微粒均为3,520个以下)”。该空气品质相当于依据现行通用的日本国内和国际空气品质相关基准的等级A(被称为等级100或ISO5。)。

制造本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂的设施内的空气环境也应该至少与上述无菌注射剂制造设施内的空气环境同等，或者更优选应该为具有以99.97%以上的效率捕捉粒径为0.3μm的颗粒的性能的、通过了HEPA过滤器的洁净空气以从上方向下方的单方向气流的形式被维持着的环境。作为气流的风速，优选在HEPA过滤器正下方20cm的位置具有0.2m/s～1.0m/s、在进行制造作业的位置具有0.1m/s～0.8m/s的流速，更优选在HEPA过滤器正下方20cm的位置具有0.4m/s～0.7m/s、在进行制造作业的位置具有0.3m/s～0.5m/s的流速。

进一步地，在医药品制造设施内，为了实现进一步的无菌空气环境，通常使用作为杀菌剂的臭氧或甲醛、或者过氧化氢、过醋酸、二氧化氯、戊二醛等具有氧化能力的化学物质对空气中的浮游细菌或附着于机械·壁·地板等设备的细菌进行灭菌。其中，通过甲醛熏蒸灭菌后的残留甲醛浓度应该被保持在通常0.1ppm以下、优选0.08ppm以下。另外，对于臭氧而言，在外气中，以一天的平均值计，也通常以0.001ppm～0.02ppm的浓度存在。并且，根据场所或时间、季节的不同，有时也暂时性地以约0.02ppm～0.1ppm的浓度存在。

作为本发明的方式之一的含PTH肽冷冻干燥制剂的制造方法的特征在于，在上述的医药品制造设施内的空气环境下，在含PTH肽(有效成分)溶液制备工序开始时、特别是在从试剂填充工序终止时起到该溶液的冷冻干燥工序开始为止(即搬入工序)要求实质性的时间经过的情况下，在该经过过程中抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

本发明中的“抑制...暴露在医药品制造设施内空气环境”和“对于暴露在医药品制造设施内空气环境中的抑制”意味着PTH肽原药、含PTH肽溶液、PTH肽冷冻干燥制剂中的至少1种以上完全未与医药品制造设施内空气环境接触、以及该接触实质上(例如时间或接触量)受到限制。例如，在上述的通过了HEPA过滤器的洁净空气以从上方向下方的单方向气流的形式来维持(下文中称为“流动空气”。)的环境下的情况下，包括采取对于与该流动空气接触的时间和接触的气流量进行抑制的手段。具体可示例出以下手段。

(A)抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段

如上所述，本发明人发现，通过采取抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段，也能够抑制含PTH肽溶液中的杂质(PTH类似物)的发生。如上所述，由于在通常的医药品制造设施内维持该设施内空气的气流，因而可推论出，作为该气流灌入的大量空气与含PTH肽溶液接触，并且该气流内所含有的具有氧化能力的气体性物质(臭氧等)与该溶液中的PTH肽反应，由于该原因等，溶液中的PTH类似物增多。

然而，本发明中的对于含PTH肽溶液与流动空气接触进行抑制的手段没有特别限定，例如可示例出对含PTH肽溶液周边空气的流动性或流动量进行抑制的手段、将含PTH肽溶液周边利用惰性化气体置换的手段。

此外还发现，在向冷冻干燥库中搬入的搬入工序中采取抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段是有利的。

基于非限定的具体例对上述的方式进行如下说明：通常的冷冻干燥库在前表面具有门，该门用于将填充有要冷冻干燥的溶液的容器搬入，该门多为可整个覆盖冷冻干燥库前表面的门(大门)；而在本发明的情况下，优选为下述的冷冻干燥库：在该大门的一部分进一步具备小门，该小门的尺寸与配置在冷冻干燥库内的一个托架(棚)(在其上载置有被冷冻干燥物填充容器)大致对应，将该容器搬出搬入时，小门能够容易地开闭。

可进一步适宜地示例出下述手段：上述具有小门的冷冻干燥库具有能够容易地开闭的副门，该副门装备在小门部分出现的、用于该搬入的开口部(下文中也称为“小门开口部”。)，在将被冷冻干燥物填充容器搬出搬入冷冻干燥库内时打开该小门部分；该副门平常不开放，仅在该容器搬入时打开且在搬入后迅速关闭。此外，该副门在与小门开口部相当的区域之中分割成2片～5片而被装备，以使仅打开上述搬入所需要的部分。优选在该容器搬入时可仅打开必要位置的该副门，优选被分割成2片～3片。作为能够容易地开闭的副门的例子，可以举出在副门的上部设置铰链(蝶番)且装备在小门开口部的副门、向左右滑动的副门、向上下滑动的副门等。

进一步地，作为抑制含PTH肽溶液等与流动空气的接触的手段，优选可示例出：在含PTH肽溶液的制备工序中，在将PTH肽溶解在溶剂中之后，将该制备用设备(罐或者容器等)封闭；或者在该制备时将该制备用器内置换为惰性气体。

或者，作为抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段，可优选示例出：在无菌过滤·试剂填充工序中，在对制备的含PTH肽溶液进行过滤灭菌时，有时对制备设备(罐或者容器等)内加压，使其通过无菌过滤器，送液到填充用的容器或罐中，在这样的情况下可使加压用的气体为惰性气体。

进一步地，作为抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段，可优选示例出：在无菌过滤·试剂填充工序中，将试剂填充设备(罐或者容器等)内的空气预先置换为惰性气体；将填充含PTH肽溶液的玻璃制容器预先置换为惰性气体。

或者，作为抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段，可优选示例出：在无菌过滤·试剂填充工序中，将填充有含PTH肽溶液的玻璃制容器内的空隙部(无试剂的空气部分)利用惰性气体置换。

进一步可优选示例出下述手段：在无菌过滤·试剂填充工序终止后，在将填充在打开或半开的玻璃容器中的含PTH肽溶液搬入到冷冻干燥单元为止的期间，有时要将填充有含PTH肽溶液的玻璃制容器从无菌过滤·试剂填充设施运输到冷冻干燥库附近，在这样的情况下，使该运输中的环境为惰性气体的气流下等，也可作为抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段。

或者，作为抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段，为了抑制流动空气从冷冻干燥库的小门开口部流入到冷冻干燥库内，可以设置使流动空气的流向改变到不从该开口部朝向库内的方向的折板(フラップ)或整风罩(图17)。该折板或整风罩的形状可根据冷冻干燥机和小门开口部的尺寸来适宜选择，并且其材质可以为乙烯树脂(ビニル)制片材或金属、树脂制等。需要说明的是，抑制流动空气从冷冻干燥库的小门开口部流入到冷冻干燥库内意味着将该流动空气的流入控制在实质上抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的程度，可以控制为该流动空气从小门开口部的流入速度优选为0.2m/s以下、进一步优选为0.1m/s以下、特别优选为0.0m/s以下。该控制优选可通过在上述小门附近适当地配置折板或整风罩等来进行。

将含PTH肽溶液周边利用惰性化气体置换的手段可以为上述的利用惰性化气体进行置换的手段、以及将冷冻干燥工序中使用的冷冻干燥库内的空气利用惰性化气体置换的手段，或者可以为在将含PTH肽溶液容器搬入到冷冻干燥工序中使用的冷冻干燥库内时使惰性化气体从搬入口流入到冷冻干燥库内的手段。流入时的惰性气体的流量优选为0.1Nm³/min～5Nm³/min、更优选为0.2Nm³/min～3Nm³/min、特别优选为0.3Nm³/min～1Nm³/min。作为上述利用惰性化气体置换时的惰性化气体，可示例出氮或氩，优选可示例出氮。

(B)采取抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段的工序

上述(A)的“抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段”能够在从含PTH肽溶液的制备工序开始时到该溶液的冷冻干燥工序开始为止所包括的全部或部分工序中采取，也可以从含PTH肽溶液的制备工序开始时采取。本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂作为医药品的制造方法包括含PTH肽溶液的制备工序、填充在打开或半开的玻璃容器中的该溶液向冷冻干燥库中搬入的搬入工序、和冷冻干燥工序的情况下，上述(A)的手段可以在将填充在打开或半开的玻璃容器中的该溶液向冷冻干燥库中搬入的搬入工序的一部分或全部中采取。

(C)采取抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段的工序时间

作为采取上述(A)的“抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段”的工序时间，作为下限可示例出1小时以上、优选为3小时以上、进一步优选为6小时以上，作为上限为20小时以下、优选为12小时以下、进一步优选为10小时以下、最优选为9小时以下。作为采取上述(A)的手段的工序时间，可以举出例如1小时～20小时、优选为3小时～12小时、进一步优选为6小时～10小时、最优选为6小时～9小时。

(7)含PTH肽冷冻干燥制剂的使用

本发明的含PTH肽冷冻干燥制剂可以含有医药有效量的PTH肽，例如可以在使用时将该冷冻干燥制剂利用适当的溶剂溶解制成注射剂，用于骨质疏松症治疗。

(8)抑制含PTH肽溶液中的PTH类似物的生成的方法

本发明的抑制PTH类似物的生成的方法为采取下述手段的方法，该手段为对于PTH肽原药、含PTH肽溶液、PTH肽冷冻干燥制剂中的至少1种以上与具有氧化能力的物质、特别是含有该物质的空气的接触进行抑制的手段。优选可示例出以将与含PTH肽溶液接触的空气置换为惰性化气体(优选氮)为手段的、抑制PTH类似物的生成的方法。进一步优选可示例出利用下述手段来抑制至少上述类似物1～11或类似物1’～11’中任意1种以上的PTH类似物的生成的方法，该手段为抑制含PTH肽溶液与流动空气接触的手段、或将与含PTH肽溶液接触的空气置换为惰性化气体(优选氮)的手段。

这些生成抑制方法可在上述那样的医药品制造设施内空气环境下的冷冻干燥制剂制造设施中实施。例如，在从含PTH肽溶液的制备工序开始时到该溶液的冷冻干燥工序开始为止的经过时间为预定时间以上的该经过过程中，通过利用抑制该溶液与流动空气接触的手段，能够抑制它们在该溶液中的生成。本手段的优选方式与相应的本发明含PTH肽冷冻干燥制剂的制造方法的优选具体方式相同。

实施例

下面通过实施例、参考例以及试验例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不限定于此。

[实施例1]

在50L不锈钢容器中装入约25℃的注射用水约18kg，向其中加入经称量的精制白糖540g和氯化钠27g进行溶解，接下来加入以醋酸盐计为3541mg(批次(lot)A；860mg、批次B；2591mg、批次C；90mg)的人PTH(1-34)进行溶解，其后加入注射用水，进行重量校正至27kg，得到含PTH肽水溶液。在氮加压下使用过滤器对所得到的含PTH肽水溶液进行无菌过滤，送液到预先充满氮的不锈钢制造的50L填充用罐中。在医药品制造设施内的具有等级A(风速为约0.2m/s～0.4m/s)的环境的区域，将该无菌过滤后的含PTH肽水溶液在清洗·干燥后的小药瓶中填充0.56g，使用清洗·干燥后的橡胶塞得到半开小药瓶，将其以每约1000个排列在不锈钢制造的盘中，将排列后的盘在等级A的区域中输送至预先充满氮气的ULVAC制(型号：DFB托架面积：24m²)冷冻干燥库前。利用氮气对冷冻干燥库内持续进行吹扫，同时将副门(将参照图16的副门的部件自行安装于市售的上述冷冻干燥库。)打开，该副门设置在上述冷冻干燥库的小门打开时的开口部，与盘的宽度匹配；将盘搬入到冷冻干燥库中之后，迅速关闭副门。反复进行同样的工序，利用约9小时将半开小药瓶搬入到冷冻干燥库内。将含PTH溶液冷冻，在减压下使水升华，进行真空冷冻干燥，干燥终止后利用氮气对玻璃小药瓶中进行置换，之后利用橡胶塞密封，利用铝盖封口，得到含PTH肽冷冻干燥制剂。

[实施例2]

在20L不锈钢容器中装入约25℃的注射用水约10kg，向其中加入经称量的精制白糖280g和氯化钠14g进行溶解，接下来加入注射用水，进行重量校正至14kg，制备添加剂溶液。量取按醋酸盐计为1780mg(批次D)的人PTH(1-34)溶解在上述的添加剂溶液13kg中，得到含PTH肽水溶液。在氮气加压下使用过滤器对所得到的含PTH肽水溶液进行无菌过滤，送液到预先充满氮的50L填充用罐中。在医药品制造设施内的具有等级A(风速为约0.2m/s～0.4m/s)的环境的区域，将该含PTH肽水溶液在清洗·干燥后的玻璃小药瓶中填充0.56g，使用清洗·干燥后的橡胶塞得到半开小药瓶，将其以每约1000个排列在不锈钢制造的盘中，将排列后的盘在等级A的区域中输送至预先充满氮气的ULVAC制(型号：DFB托架面积：24m²)冷冻干燥库前。利用氮气对冷冻干燥库内持续进行吹扫，同时将副门(将参照图16的副门的部件自行安装于市售的上述冷冻干燥库。)打开，该副门设置在上述冷冻干燥库的小门打开时的开口部，与盘的宽度匹配；将盘搬入到冷冻干燥库中之后，迅速关闭副门。反复进行同样的工序，利用约6小时将半开小药瓶搬入到冷冻干燥库内。将含PTH溶液冷冻，在减压下使水升华，进行真空冷冻干燥，干燥终止后将玻璃小药瓶中利用氮气置换，之后利用橡胶塞密封，利用铝盖封口，得到含PTH肽冷冻干燥制剂。

[实施例3]

在30L不锈钢容器中装入约25℃的注射用水约19kg，向其中加入经称量的精制白糖460g和氯化钠23g进行溶解，接下来加入注射用水，进行重量校正至23kg，制备空白对照(プラセボ)溶液。量取按醋酸盐计为2979mg(批次D)的人PTH(1-34)，溶解在上述的空白对照溶液22kg中，得到含PTH肽水溶液。在氮气加压下使用过滤器对所得到的含PTH肽水溶液进行无菌过滤，送液到预先充满氮的不锈钢制造的填充用罐中。在医药品制造设施内的具有等级A(风速为约0.2m/s～0.4m/s)的环境的区域将该含PTH肽水溶液在清洗·干燥后的小药瓶中填充0.56g，使用清洗·干燥后的橡胶塞得到半开小药瓶。将半开小药瓶在等级A的区域进行输送，利用6小时的时间将全部的小药瓶搬入到冷冻干燥库内，该冷冻干燥库为预先利用氮气充满的冷冻干燥库(ULVAC制(型号：DFB托架面积：22m²))，且使用乙烯树脂制片材(将参照图17的整风罩的部件自行安装于市售的冷冻干燥库。)使气体不会从小门的开口部进入到冷冻干燥库内，该乙烯树脂制片材使得流动空气的流向改变到与冷冻干燥库小门开口部相反的方向。另外，该使流动空气的流向改变的乙烯树脂制片材也被自行安装于市售的上述冷冻干燥库，乙烯树脂片材从小门开口部的上部倾斜地向下方伸展，改变从上向下流经的流动空气的方向，防止其从开口部流入。将含PTH溶液冷冻，在减压下使水升华，进行真空冷冻干燥，干燥终止后将小药瓶中利用氮气置换，之后利用橡胶塞密封，利用铝盖封口，得到含PTH冷冻干燥制剂。

[实施例4]

在50L不锈钢容器中装入约25℃的注射用水约18kg，向其中加入经称量的精制白糖540g和氯化钠27g进行溶解，接下来加入按醋酸盐计为3525mg(批次C；1880mg、批次E；1645mg)的人PTH(1-34)进行溶解，其后加入注射用水，进行重量校正至27kg，得到含PTH肽水溶液。在氮气加压下使用过滤器对所得到的含PTH肽水溶液进行无菌过滤，送液到预先充满氮的不锈钢制造的50L填充用罐中。在医药品制造设施内的具有等级A(风速为约0.2m/s～0.4m/s)的环境、甲醛的浓度为0.08ppm以下的区域，将该含PTH肽水溶液在清洗·干燥后的小药瓶中填充0.56g，使用清洗·干燥后的橡胶塞得到半开小药瓶，将其以每约1000个排列在不锈钢制造的盘中，将排列后的盘在等级A的区域输送至预先充满氮气的ULVAC制(型号：DFB托架面积：24m²)冷冻干燥库前。利用氮气对冷冻干燥库内持续进行吹扫，同时将副门(将参照图16的副门的部件自行安装于市售的上述冷冻干燥库。)打开，该副门设置在上述冷冻干燥库的小门打开时的开口部，与盘的宽度匹配；将盘搬入到冷冻干燥库中之后，迅速关闭副门。反复进行同样的工序，利用约8小时时间将半开小药瓶搬入到冷冻干燥库内。将含PTH溶液冷冻，在减压下使水升华，进行真空冷冻干燥，干燥终止后将玻璃小药瓶中利用氮气置换，之后利用橡胶塞密封，利用铝盖封口，得到含PTH冷冻干燥制剂。

[实施例5]

在50L不锈钢容器中装入约25℃的注射用水约18kg，向其中加入经称量的精制白糖540g和氯化钠27g进行溶解，接下来加入按醋酸盐计为3566mg(批次H)的人PTH(1-34)进行溶解，其后加入注射用水，进行重量校正至27kg，得到含PTH肽水溶液。在氮气加压下使用过滤器对所得到的含PTH肽水溶液进行无菌过滤，送液到预先充满氮的不锈钢制造的50L填充用罐中。在医药品制造设施内的具有等级A(风速为约0.2m/s～0.4m/s)的环境、甲醛的浓度为0.08ppm以下的区域，将该含PTH肽水溶液在清洗·干燥后的小药瓶中填充0.56g，使用清洗·干燥后的橡胶塞得到半开小药瓶，将其以每约1000个排列在不锈钢制造的盘中，将排列后的盘在等级A的区域中输送至预先利用氮气充满的ULVAC制(型号：DFB托架面积：24m²)冷冻干燥库前。利用氮气对冷冻干燥库内持续进行吹扫，同时将副门(将参照图16的副门的部件自行安装于市售的上述冷冻干燥库。)打开，该副门设置在上述冷冻干燥库的小门打开时的开口部，与盘的宽度匹配；将盘搬入到冷冻干燥库中之后，迅速关闭副门。反复进行同样的工序，利用约7小时的时间将半开小药瓶搬入到冷冻干燥库内。将含PTH溶液冷冻，在减压下使水升华，进行真空冷冻干燥，干燥终止后将玻璃小药瓶中利用氮气置换，之后利用橡胶塞密封，利用铝盖封口，得到含PTH冷冻干燥制剂。

[比较例1]

在10L不锈钢容器中装入约25℃的注射用水约5000g，向其中加入经称量的精制白糖120g和氯化钠6g进行溶解，接下来加入按醋酸盐计为909mg(批次F；335mg、批次G；574mg)的人PTH(1-34)进行溶解，其后加入注射用水，进行重量校正至6000g，得到含PTH肽水溶液。在氮气加压下使用过滤器对所得到的含PTH肽水溶液进行无菌过滤，送液到不锈钢制造的填充用罐中。在医药品制造设施内的具有等级A(风速为约0.2m/s～0.4m/s)的环境的区域，将该含PTH肽水溶液在清洗·干燥后的小药瓶中填充0.56g，使用清洗·干燥后的橡胶塞得到半开小药瓶。将半开小药瓶在等级A的区域中进行输送，利用约4小时的时间将其全体依次搬入到具有小门的冷冻干燥机(ULVAC制(型号：DFB托架面积：22m²))中。将含PTH溶液冷冻，在减压下使水升华，进行真空冷冻干燥，干燥终止后将小药瓶中利用氮气置换，之后利用橡胶塞密封，利用铝盖封口，得到含PTH肽冷冻干燥制剂。

[比较例2]

在10L不锈钢容器中加入约25℃的注射用水约2000g，向其中加入经称量的精制白糖100g和氯化钠5g使其溶解，接下来加入按醋酸盐计为515mg(批次D)的人PTH(1-34)进行溶解，其后加入注射用水，进行重量校正至4000g，得到含PTH肽水溶液。在氮气加压下使用过滤器对所得到的含PTH肽水溶液进行无菌过滤，送液到不锈钢制造的5L填充用罐中。在医药品制造设施内的具有等级A(风速为约0.2m/s～0.4m/s)的环境的区域，将该含PTH肽水溶液在清洗·干燥后的小药瓶中填充0.56g，使用清洗·干燥后的橡胶塞得到半开小药瓶。将半开小药瓶在等级A的区域中进行输送，利用约3小时的时间将其全体依次搬入到具有小门的冷冻干燥机(共和真空技术制(型号：RL托架面积：9m²))中。将含PTH溶液冷冻，在减压下使水升华，进行真空冷冻干燥，干燥终止后将小药瓶中利用氮气置换，之后利用橡胶塞密封，利用铝盖封口，得到含PTH肽冷冻干燥制剂。

[试验例1]

作为对含PTH肽冷冻干燥制剂的纯度和类似物量进行评价的方法，HPLC法中的面积百分数法是简便的。称量苯扎氯铵0.25g，加入50mM硫酸缓冲液(pH2.3)制成50mL，将该溶液作为添加液。将实施例和比较例的各制剂利用生理食盐液1mL溶解，进一步将该溶解液与添加液按9：1的比例混合，将混合液作为试样溶液。对于试样溶液100μL在以下所示条件下通过HPLC进行试验。需要说明的是，苯扎氯铵是为了防止测定对象——肽在分析操作中吸附于器具等的目的而使用的。

<试验条件>

检测器：紫外吸光光度计(测定波长：214nm)

柱：在内径4.6mm、长度150mm的不锈钢管中填充3.5μm的十八烷基甲硅烷基化硅胶。

柱温度：40℃附近的恒温

移动相：移动相A：将无水硫酸钠28.4g溶解在水900mL中，加入磷酸调整为pH2.3，之后加水制成1000mL。向该溶液900mL中加入乙腈100mL

移动相B：将无水硫酸钠28.4g溶解在水900mL中，加入磷酸调整为pH2.3，之后加水制成1000mL。向该溶液500mL中加入乙腈500mL

移动相的送液：如下改变移动相A和移动相B的混合比进行浓度梯度控制注入后的时间：

[表5]

表5：浓度梯度控制

流量：每分钟1.0mL

试样温度：5℃附近的恒温

检出时间：试样溶液注入后45分钟。但其自溶剂峰之后。

计算方法：对于各PTH类似物量和它们的总量，在上述条件下实施液相色谱法试验，通过自动积分法测定出各自的峰面积，使用式1和式2进行计算，由此来对各PTH类似物量和它们的总量进行定量。另外，总峰面积为在上述条件下实施液相色谱法试验而检出的全部峰的面积总和。即，总峰面积表示制剂中的PTH肽与全部PTH类似物量的总和。

式1：各PTH类似物量(%)=(各类似物的峰面积/总峰面积)×100

式2：全部PTH类似物量(%)=(各类似物的峰面积的总和/总峰面积)×100

<结果>

将实施例中所用的人-PTH(1-34)的类似物量(原药)的评价结果列于表6，HPLC图如图1所示。另外，试验例中实施的含PTH肽冷冻干燥制剂的纯度和类似物量的评价结果列于表7。此外，实施例1的HPLC图如图2所示、比较例1的HPLC图如图3所示。表6中各类似物的结构通过利用下述试验例2推断而得到。

[表6]

表6：作为原药使用的人-PTH(1-34)的各类似物量(%)

[表7]

表7：全部类似物量(总量)以及各类似物量(%)

[试验例2]

出于对试验例1中得到的各类似物的结构进行推断的目的，生成、分取人PTH(1-34)类似物，再实施分取物(fractions)的分析试验。

(1)各类似物的制备及其分取(fractionation)

量取精制白糖4.00g与氯化钠0.20g，加入注射用水进行溶解，制成空白对照溶液。精密量取人PTH(1-34)，加入空白对照液100mL进行溶解，制成反应原液。在带有长40cm×宽90cm×高100cm的玻璃门的托架中，使用臭氧发生装置和使臭氧循环以使浓度均匀的送风机(初期风速为约7.2m/s)，制作经臭氧浓度计测得的臭氧浓度为约0.08ppm的环境。将反应原液按每份约15mL分注到容量20mL的小药瓶中，在小药瓶中加入搅拌子，一边利用搅拌器进行搅拌一边曝露(约20小时)在约0.08ppm的臭氧气氛下进行劣化，直至纯度为约20%(即，人PTH(1-34)类似物总量为80%)。需要说明的是，纯度的确认按照试验例1的试验条件进行。将劣化后的溶液冷冻干燥，利用适当量的注射用水溶解，将所得到的溶液作为强制劣化溶液。使用该溶液，按以下所示条件进行类似物的分取。

<试验条件>

除下述的条件以外，与试验例1的试验条件相同。

<与试验例1不同的条件>

柱：在内径9.4mm、长度250mm的不锈钢管中填充5μm的十八烷基甲硅烷基化硅胶。

流量：每分钟6.0mL

需要说明的是，尽管上述条件与试验例1不同，但在色谱图图谱上未观察到较大差异。

在上述的层析条件下分取9种类似物，对其进行脱盐·浓缩，进一步进行冷冻干燥，对冷冻干燥物进行蒸馏水溶解，得到各类似物(未消化品)。在试验例1的试验条件下，对各类似物(未消化品)与强制劣化溶液进行HPLC分析，将强制劣化溶液的人PTH(1-34)的保留时间设为1，计算出各类似物(未消化品)的相对保留时间。

<结果>

确认到与强制劣化溶液中的各类似物的相对保留时间大致完全一致。相对保留时间的结果见表8，强制劣化溶液的色谱图见图4。图3与图4中，由于带电(チャージ)溶液的组成不同，因而人PTH(1-34)峰的洗脱时间稍有不同，但由于各图中各类似物的洗脱图形和重量比率(量率)相同，因而可推测图3与图4所对应的类似物相同。根据这些结果，可认为此处的臭氧曝露试验为实质上再现了在医药品制造设施内的空气环境中制造含PTH肽溶液时所诱发的PTH类似物的生成反应的试验。

[表8]

表8：类似物(未消化品)与强制劣化溶液的该峰的相对保留时间的比较

	类似物(未消化品)	强制劣化溶液
			人PTH(1-34)	--	1.00
类似物(1)	0.43	0.42
			类似物(2)	0.44	0.43
类似物(3)	0.46	0.46
			类似物(4)	0.49	0.49
类似物(5)	0.51	0.51
			类似物(6)	0.55	0.55
类似物(7)	0.62	0.62
			类似物(8)	0.65	0.65
类似物(9)	0.70	0.70

(2)各类似物的结构推定分析

将上述各类似物(未消化品)和人PTH(1-34)标准物质利用胰岛素消化，制成类似物(消化品)和标准溶液(消化品)。将这10个试样在以下所示条件下利用LC/MS/MS进行解析。

检测器：紫外吸光光度计(测定波长：210nm)

柱：在内径1.5mm、长度150mm的不锈钢管中填充5μm的十八烷基甲硅烷基化硅胶。

柱温度：40℃附近的恒温

移动相：移动相A:含有三氟乙酸的水混合液(1:1000)

移动相B：乙腈

[表9]

表9：浓度梯度控制

流量：每分钟0.1mL

试样温度：5℃附近的恒温

检出时间：试样溶液注入后45分钟。但其自溶剂峰之后。

离子化模式：ES+

将各类似物(未消化品)在以下所示条件下利用LC/MS进行解析。

除下述条件以外，与LC/MS/MS的试验条件相同。

移动相的送液：如下变更移动相A和移动相B的混合比，进行浓度梯度控制。

注入后的时间：

[表10]

表10：浓度梯度控制

<结果>

对试验例2中的9种类似物进行结构解析，结果如下所示。

<人PTH(1-34)>

表11示出了通过胰岛素消化产生的人PTH(1-34)的预计片段。

[表11]

表11：人PTH(1-34)的预计片段

标准溶液(消化品)的LC/MS/MS中确认的各片段的质量测定结果示于表12。将标准溶液(消化品)各片段的实测值与理论质量比较，确认到在人PTH(1-34)中得到了推测结构的5个片段。

[表12]

表12：标准溶液(消化品)的质量测定结果

<类似物1>

将表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.43的类似物作为类似物1，表13示出了类似物1(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物1(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，确认到了在T2中为+16Da、T3中为+4Da、T1中为+16Da的质量变化。

[表13]

表13：类似物1(消化品)的质量测定结果

保留时间

类似物1

标准溶液

质量差

(分钟)	Mass(mono.)	Frag.No.	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
					9.578	901.4622	T2	885.4984	+16Da
18.409	871.4731	T6	871.5030	0
					18.409	999.5720	T5-6	999.6100	0
19.096	705.4228	T3	701.4508	+4Da
					19.323	1470.8297	T1	1454.8715	+16Da

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果如表14所示。与标准溶液(消化品)进行比较，结果确认到了在T2的Met18中为+16Da、在T3的Trp23中为+4Da、在T1的Met8中为+16Da的质量变化。

[表14]

表14：类似物1(消化品)的MS/MS解析结果

此外，将类似物1(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表15。在类似物1(未消化品)中，与理论质量比较，确认到了+64Da和+36Da的峰，根据如图7所示的峰尺寸，认为+64Da为主峰。未消化品的分子量为约4000Da，但由于在LC/MS中以实测值的形式得到了多价离子的质量，因而预计在由多价离子的质量计算未消化品的质量的过程中会产生±1Da左右的误差。若在结构解析上产生误差，则对于推测的质量差，在()内记载出校正值。下面的结构解析中也同样地进行记载。

[表15]

表15：类似物1(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
19.749	4179.3280	4115.1309	+64Da
				20.130	4151.3674	4115.1309	+36Da

由MS/MS解析的结果推测出，人PTH(1-34)+36Da=(Met18+16Da)+(Trp23+4Da)+(Met8+16Da)。并且，Trp中的+4Da变化体的结构为图6的b)，推测其前体a)的质量变化为+32Da。推测在胰岛素消化等操作过程中Trp23有a)→b)的变化，推测类似物1(未消化品)的主峰为人PTH(1-34)+64Da=(Met18+16Da)+(Trp23+32Da)+(Met8+16Da)。即，推测类似物1为人-PTH(1-34)-Met8[O]-Met18[O]-Trp23[二氧化]。

<类似物2>

将表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.44的类似物作为类似物2，表16示出了类似物2(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物2(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，确认到了在T2中为+16Da、T3中为+4Da、T1中为+16Da的质量变化。

[表16]

表16：类似物2(消化品)的质量测定结果

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果与类似物1相同地，确认到了在T2的Met18中为+16Da、在T3的Trp23中为+4Da、在T1的Met8中为+16Da的质量变化。并且将类似物2(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表17。在类似物2(未消化品)中，与理论质量比较，确认到了+24Da和+92Da的峰，但如图8所示几乎未形成峰形状，并且未得到可支持MS/MS解析结果的质量，因而认为所确认的这些质量的可靠性低。

[表17]

表17：类似物2(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
20.092	4139.2866	4115.1309	+24Da
				20.632	4207.3668	4115.1309	+92Da

由MS/MS解析的结果推测出，类似物2至少进行了人PTH(1-34)+36Da=(Met18+16Da)+(Trp23+4Da)+(Met8+16Da)的质量变化。即，推测类似物2为人-PTH(1-34)-Met8[O]-Met18[O]-Trp23[二氧化-甲酸脱离]。

<类似物3和4>

如下文所说明，表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.46的峰为来自类似物3和4的混合物的峰。表18示出了类似物3和4的混合物(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物3和4的混合物(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，确认到了在T2中为+16Da、T3中为+4Da、T1中为+16Da的质量变化。并且还确认到了未伴有质量变化的T2和T3片段。

[表18]

表18：类似物3和4的混合物(消化品)的质量测定结果

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果与类似物1相同地，确认到了在T2的Met18中为+16Da、在T3的Trp23中为+4Da、在T1的Met8中为+16Da的质量变化。并且将类似物3和4的混合物(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表19。在类似物3和4的混合物(未消化品)中，与理论质量比较，确认到了+32Da、+48Da和+20Da的峰，如图9所示，根据峰的尺寸，认为+32Da和+48Da以约1:1的比例形成主峰。

[表19]

表19：类似物3和4的混合物(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
21.062	4147.3692	4115.1309	+32Da
				21.539	4163.3747	4115.1309	+48Da
21.843	4135.3897	4115.1309	+20Da

在类似物3和4的混合物(消化品)的LC/MS/MS色谱图中，T2+16Da:T2与T3+4Da:T3以分别约1:1的比例存在，T2+16Da:T3+4Da:T1+16Da以约1:1:2的比例存在。因而，根据MS/MS解析的结果，推测人PTH(1-34)+32Da=(Met18+16Da)+(Met8+16Da)、人PTH(1-34)+20Da=(Trp23+4Da)+(Met8+16Da)，关于后者，推测在与类似物1相同的胰岛素消化等操作过程中Trp23产生了a)→b)的变化，推测人PTH(1-34)+48Da=(Trp23+32Da)+(Met8+16Da)。推测类似物3和4分别为人PTH(1-34)+32Da和人PTH(1-34)+48Da。即，推测表8的相对保留时间=0.46的峰为含有人-PTH(1-34)-Met8[O]-Met18[O]与人-PTH(1-34)-Met8[O]-Trp23[二氧化]的混合物的峰。

<类似物5>

将表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.49的类似物作为类似物5，表20示出了类似物5(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物5(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，确认到了在T2中为+16Da、T3中为+4Da的质量变化。

[表20]

表20：类似物5(消化品)的质量测定结果

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果与类似物1相同地，确认到了在T2的Met18中为+16Da、在T3的Trp23中为+4Da的质量变化。并且将类似物5(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表21。在类似物5(未消化品)中，与理论质量相比较，确认到了+48Da和+20Da的峰，如图10所示，根据峰的尺寸，认为+48Da为主峰。

[表21]

表21：类似物5(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
22.081	4163.3763	4115.1309	+48Da
				22.514	4135.3902	4115.1309	+20Da

由MS/MS解析的结果推测出，人PTH(1-34)+20Da=(Met18+16Da)+(Trp23+4Da)。推测在与类似物1相同的胰岛素消化等操作过程中Trp23产生了a)→b)的变化，推测类似物5(未消化品)的主峰为人PTH(1-34)+48Da=(Met18+16Da)+(Trp23+32Da)。即，推测类似物5为人-PTH(1-34)-Met18[O]-Trp23[二氧化]。

<类似物6>

将表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.51的类似物作为类似物6，在表22示出了类似物6(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物6(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，确认到了在T2中为+16Da、T3中为+4Da的质量变化。并且还确认到了未伴有质量变化的T1片段。

[表22]

表22：类似物6(消化品)的质量测定结果

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果与类似物1相同地，确认到了在T2的Met18中为+16Da、在T3的Trp23中为+4Da的质量变化。并且将类似物6(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表23。类似物6(未消化品)中，与理论质量相比较，确认到了+20Da的峰。

[表23]

表23：类似物6(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
22.580	4135.6585	4115.1309	+21Da(+20Da)

由MS/MS解析的结果推测出，推测类似物6为人PTH(1-34)+20Da=(Met18+16Da)+(Trp23+4Da)。即，推测类似物6为人-PTH(1-34)-Met18[O]-Trp23[二氧化-甲酸脱离]。

<类似物7>

将表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.55的类似物作为类似物7，表24示出了类似物7(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物7(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，确认到了在T1中为+16Da的质量变化。

[表24]

表24：类似物7(消化品)的质量测定结果

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果与类似物1相同地，确认到了在T1的Met8中为+16Da的质量变化。并且将类似物7(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表25。如图12所示，类似物7(未消化品)中，与理论质量相比较，确认到了+16Da的峰。

[表25]

表25：类似物7(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
22.353	4131.7101	4115.1309	+17Da(+16Da)

由MS/MS解析的结果推测出，类似物7为人PTH(1-34)+16Da=(Met8+16Da)。即，推测类似物7为人-PTH(1-34)-Met8[O]。

<类似物8>

将表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.62的类似物作为类似物8，在表26示出了类似物8(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物8(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，确认到了在T2中为+16Da的质量变化。

[表26]

表26：类似物8(消化品)的质量测定结果

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果与类似物1相同地，确认到了在T2的Met18中为+16Da的质量变化。并且将类似物8(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表27。如图13所示，在类似物8(未消化品)中，与理论质量相比较，确认到了+16Da的峰。

[表27]

表27：类似物8(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
23.129	4131.7286	4115.1309	+17Da(+16Da)

由MS/MS解析的结果推测出，类似物8为人PTH(1-34)+16Da=(Met18+16Da)。即，推测类似物8为人-PTH(1-34)-Met18[O]。

<类似物9>

将表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.65的类似物作为类似物9，表28示出了类似物9(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物9(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，确认到了在T3中为+4Da的质量变化。

[表28]

表28：类似物9(消化品)的质量测定结果

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果与类似物1相同地，确认到了在T3的Trp23中为+4Da的质量变化。并且将类似物9(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表29。在类似物9(未消化品)中，与理论质量相比较，观察到了+32Da、+4Da的峰，如图14所示，根据峰的尺寸，认为+32Da为主峰。

[表29]

表29：类似物9(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
23.729	4147.8250	4115.1309	+33Da(+32Da)
				24.087	4119.8303	4115.1309	+5Da(+4Da)

由MS/MS解析的结果推测出人PTH(1-34)+4Da=(Trp23+4Da)。推测在与类似物1相同的胰岛素消化等操作过程中Trp23产生了a)→b)的变化，推测类似物9(未消化品)的主峰为人PTH(1-34)+32Da=(Trp23+32Da)。即，类似物9为人-PTH(1-34)-Trp23[二氧化]。

<类似物10和11>

如下文所说明，表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.70的峰为来自类似物10和11的混合物的峰。表30示出了类似物10和11的混合物(消化品)的LC/MS/MS质量测定结果。在类似物10和11的混合物(消化品)中，与标准溶液(消化品)中该片段的实测值相比较，作为独立的片段确认到了在T3中+16Da和+4Da的质量变化。

[表30]

表30：类似物10和11的混合物(消化品)的质量测定结果

对于确认了质量变化的片段进行MS/MS解析，结果列于表31。与标准溶液(消化品)进行比较，结果在一个T3的Trp23中确认到了+16Da的质量变化。预计Trp中的+16Da变化体的结构为图6的c)。在另一T3中未得到可确定变化氨基酸的数据，但由类似物1～8的解析结果可推测出Trp23中产生了+4Da的质量变化。

[表31]

表31：类似物10和11的混合物(消化品)的MS/MS解析结果

并且将类似物10和11的混合物(未消化品)通过LC/MS得到的质量与人PTH(1-34)的理论质量4115.1309相比较，结果列于表32。如图15所示，在类似物10和11的混合物(未消化品)中，与理论质量相比较，观察到了+16Da、+4Da的峰。

[表32]

表32：类似物10和11的混合物(未消化品)的质量测定结果

保留时间	实测质量	理论质量	质量差
				(分钟)	Mass(mono.)	Mass(mono.)	(F=0,4/5)
22.956	4131.7912	4115.1309	+17Da(+16Da)
				24.151	4119.8118	4115.1309	+5Da(+4Da)

由MS/MS解析的结果推测出，归属于人PTH(1-34)+16Da=(Trp23+16Da)、人PTH(1-34)+4Da=(Trp23+4Da)且在表8的“类似物(未消化品)”一列中示出相对保留时间=0.70的峰为类似物10和11的混合物。即，推测类似物10为人-PTH(1-34)-Trp23[单氧化]、类似物11为人-PTH(1-34)-Trp23[二氧化-甲酸脱离]。

<结构解析概括>

各类似物的相对保留时间和推测结构结果如表33所示。表中的甲硫氨酸残基的氧化示于图5，表中的a)、b)、c)示于图6。对于表中各类似物的相对保留时间，示出了将人PTH(1-34)的保留时间设为1的情况下的相对保留时间。

[表33]

表33：各类似物质的相对保留时间及推测结构

工业实用性

根据本发明，由于提供了高纯度含PTH肽冷冻干燥制剂，因而本发明可用于医药品制造业中。

符号的说明

1：大门

2：小门

3：副门(打开状态)

4：副门(关闭状态)

5：整风罩

Claims

1.一种含PTH肽冷冻干燥制剂，其为在经杀菌剂灭菌的医药品制造设施内制造出的、含有高纯度的PTH肽作为有效成分的冷冻干燥制剂，其中，该含PTH肽冷冻干燥制剂含有选自由下述1)～9)组成的组中的1种以上的PTH类似物、以及下述10)～11)的PTH类似物，

1)类似物1’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位和18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为下述结构式(a)所表示的残基；

2)类似物2’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位和18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为下述结构式(b)所表示的残基；

3)类似物3’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位和18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基；

4)类似物4’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为所述结构式(a)所表示的残基；

5)类似物5’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为所述结构式(a)所表示的残基；

6)类似物6’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基、并且与23位色氨酸对应的残基变化为所述结构(b)所表示的残基；

7类似物9’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基变化为所述结构式(a)所表示的残基；

8)类似物10’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基变化为下述结构式(c-1)或(c-2)所表示的色氨酸单氧化物残基；

9)类似物11’：

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的23位色氨酸对应的残基变化为所述结构式(b)所表示的残基；

10)类似物7’

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的8位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基；

11)类似物8’

所述PTH肽的氧化物，其中，与人PTH(1-34)的18位甲硫氨酸对应的残基变化为甲硫氨酸亚砜残基；

该高纯度的冷冻干燥制剂至少意味着至少1种PTH类似物的量相对于该制剂中的PTH肽量与全部PTH类似物量之和为1.0％以下、和/或全部PTH类似物量相对于PTH肽量与全部PTH类似物量之和为5.0％以下；该冷冻干燥制剂是通过下述方法制造出的，该方法的特征在于，抑制冷冻干燥前的含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

2.如权利要求1所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，所述PTH肽为人PTH(1-34)。

3.如权利要求1所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，含PTH肽冷冻干燥制剂为被收纳在玻璃制小药瓶中的制剂。

4.如权利要求1所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，抑制冷冻干燥前的含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中是在含PTH肽溶液的制备工序、无菌过滤工序、试剂填充工序以及向冷冻干燥单元中搬入的搬入工序中的任意1个以上的工序中进行的。

5.如权利要求4所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，该冷冻干燥制剂是通过下述方法制造出的，该方法进一步包括在冷冻干燥后的小药瓶密封工序中也抑制冷冻干燥物暴露在医药品制造设施内空气环境中。

6.如权利要求1所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，抑制冷冻干燥前的含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境是在向冷冻干燥单元中搬入的搬入工序中进行的。

7.如权利要求6所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，所述暴露的抑制是通过使用冷冻干燥库来进行的，该冷冻干燥库采取了抑制医药品制造设施内空气流入到冷冻干燥单元内的手段。

8.如权利要求7所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，所述冷冻干燥单元为具有能够容易地开闭的副门的冷冻干燥库，该副门装备在小门部分出现的开口部，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬出/搬入该单元时打开该小门部分；由此，在所述搬入工序中，该副门仅在容器搬入时打开且在搬入后迅速关闭，从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

9.如权利要求7所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，所述冷冻干燥单元为具有开口部的冷冻干燥库，该开口部在小门部分出现，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬入/搬出该单元时打开该小门部分；抑制医药品制造设施内空气流入到冷冻干燥单元内的单元为整风罩，该整风罩使流动空气的流向改变到不从该开口部朝向库内的方向。

10.如权利要求6所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，所述搬入工序通过将冷冻干燥单元内利用惰性气体进行置换而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

11.如权利要求6所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，所述冷冻干燥单元为具有能够容易地开闭的副门的冷冻干燥库，该副门装备在小门部分出现的开口部，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬入/搬出该单元时打开该小门部分，由此，在所述搬入工序中，该副门仅在容器搬入时打开，在搬入后迅速关闭；并且将冷冻干燥单元内利用惰性气体置换；从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

12.如权利要求6所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，所述冷冻干燥单元为具有开口部、进而在该开口部具备整风罩的冷冻干燥库，该开口部在小门部分出现，在冷冻干燥前将收纳含PTH肽溶液的容器搬入/搬出该单元时打开该小门部分，由此，在所述搬入工序中，该整风罩使流动空气的流向改变到不朝向库内的方向；并且将冷冻干燥单元内利用惰性气体置换；从而在冷冻干燥前抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

13.如权利要求6所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，所述搬入工序为经过了3小时以上的该工序。

14.如权利要求4所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其特征在于，其通过下述方法制造：从含PTH肽溶液制备工序开始直到搬入到冷冻干燥单元中的搬入工序结束为止经过了3小时以上，在其间的1个以上的工序中抑制含PTH肽溶液暴露在医药品制造设施内空气环境中。

15.如权利要求10所述的含PTH肽冷冻干燥制剂，其中，所述惰性气体为氮气。