发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明的目的在于设计提供一种头花蓼提取物及其制备方法和应用的技术方案。
所述的一种头花蓼提取物,其特征在于通过以下步骤制得:
1)取干燥后的头花蓼加入55~65%乙醇,浸泡,回流提取,过滤浓缩,得到醇提浓缩液;
2)醇提后药渣进行水煎煮,煎液过滤浓缩,得到水提浓缩液;
3)合并醇提浓缩液和水提浓缩液,再进行浓缩,得到头花蓼提取物。
所述的一种头花蓼提取物,其特征在于所述的步骤1)中头花蓼通过以下步骤干燥制得:鲜头花蓼在温度-55~-45℃、压强15~25Pa下连续干燥18小时以上得到;或鲜头花蓼在温度40~50℃下连续干燥36小时以上得到。
所述的一种头花蓼提取物,其特征在于所述的步骤1)中干燥后的头花蓼加入22~26倍量的55~65%乙醇,浸泡20~40分钟,提取3次,每次1~2小时,合并提取液,过滤浓缩,得到醇提浓缩液;所述的步骤2)中醇提后药渣进行两次水煎煮,第一次加入10~14倍量水,提取1~2小时,第二次加入8~12倍量水,提取0.5~1小时,合并两次煎液,过滤浓缩,得到水提浓缩液。
所述的一种头花蓼提取物,其特征在于所述的步骤1)中浓缩至相当于生药0.8~1.2g/ml,所述的步骤2)中浓缩至相当于生药0.8~1.2g /ml,所述的步骤3)中浓缩至相当于生药0.8~1.2g/ml。
所述的一种头花蓼提取物在制备降糖药物中的应用。
所述的一种头花蓼提取物的制备方法,其特征在于包括以下工艺步骤:
1)取干燥后的头花蓼加入55~65%乙醇,浸泡,回流提取,过滤浓缩,得到醇提浓缩液;
2)醇提后药渣进行水煎煮,煎液过滤浓缩,得到水提浓缩液;
3)合并醇提浓缩液和水提浓缩液,再进行浓缩,得到头花蓼提取物。
所述的一种头花蓼提取物的制备方法,其特征在于所述的步骤1)中头花蓼通过以下步骤干燥制得:鲜头花蓼在温度-55~-45℃、压强15~25Pa下连续干燥18小时以上得到;或鲜头花蓼在温度40~50℃下连续干燥36小时以上得到。
所述的一种头花蓼提取物的制备方法,其特征在于所述的步骤1)中干燥后的头花蓼加入22~26倍量的55~65%乙醇,浸泡20~40分钟,提取3次,每次1~2小时,合并提取液,过滤浓缩,得到醇提浓缩液;所述的步骤2)中醇提后药渣进行两次水煎煮,第一次加入10~14倍量水,提取1~2小时,第二次加入8~12倍量水,提取0.5~1小时,合并两次煎液,过滤浓缩,得到水提浓缩液。
所述的一种头花蓼提取物的制备方法,其特征在于所述的步骤1)中浓缩至相当于生药0.8~1.2g/ml,所述的步骤2)中浓缩至相当于生药0.8~1.2g /ml,所述的步骤3)中浓缩至相当于生药0.8~1.2g/ml。
上述的一种头花蓼提取物的制备方法,设计合理,通过对头花蓼干燥、醇提加水提等步骤得到了头花蓼提取物,该头花蓼提取物中含有大量的总黄酮和总鞣质,并且该头花蓼提取物具有改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗, 增强脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力,具有降糖功效。
实施例4:头花蓼提取物的制备
1)干燥后的头花蓼加入26倍量的55%乙醇,浸泡40分钟,提取3次,每次1.5小时,合并提取液,过滤浓缩至相当于生药1.2g/ml,得到醇提浓缩液;
2)醇提后药渣进行两次水煎煮,第一次加入14倍量水,提取1.5小时,第二次加入8倍量水,提取0.8小时,合并两次煎液,过滤浓缩至相当于生药1.2g/ml,得到水提浓缩液;
3)合并醇提浓缩液和水提浓缩液,再进行浓缩至相当于生药1.2g/ml,得到头花蓼提取物。
步骤1)中头花蓼通过以下步骤干燥制得:鲜头花蓼在温度-55℃、压强15Pa下连续干燥36小时得到,或鲜头花蓼在温度50℃下连续干燥50小时得到。
对比实施例1:鲜、干头花蓼提取物的醇提制备
干燥后的头花蓼在24倍60%乙醇中浸泡30min,水浴回流提取3次,每次2小时,合并滤液,浓缩至所需浓度。该方法中头花蓼通过以下步骤干燥制得:鲜头花蓼在温度-50℃、压强20Pa下连续干燥18小时得到,或鲜头花蓼在温度45℃下连续干燥36小时得到。
对比实施例2:鲜、干头花蓼提取物的水提制备
干燥后的头花蓼在水中浸泡30min,加水煎煮两次,第一次为药材量的12倍,微沸1.5小时,第二次为药材量的10倍,微沸1小时,合并滤液,浓缩至所需浓度。该方法中头花蓼通过以下步骤干燥制得:鲜头花蓼在温度-50℃、压强20Pa下连续干燥18小时得到,或鲜头花蓼在温度45℃下连续干燥36小时得到。
试验例1:鲜GCP冷冻干燥工艺及GCP干燥工艺
GCP冷冻干燥工艺主要影响因素为冷冻干燥时间,冷冻干燥后物料含水量约为3-5%,本实验以冷冻后药物水分含量不超过4%为指标,采用单因素考察冷冻干燥时间。
精密称取GCP100g置于冷冻干燥仪中(温度:-50±5℃,压强:20±5Pa),分别干燥6h、12h、18h、24h测定药物水分含量。考察结果见表1。
表1
实验结果:GCP在冷冻干燥仪中(温度:-50±5℃,压强:20±5Pa)连续干燥18h后含水量符合要求,冷冻干燥后GCP下称鲜GCP。
2、GCP烘干干燥工艺
GCP烘干工艺主要影响因素为烘干时间和烘干温度,为最大程度保持药材性状不被破坏,本实验选择45℃为烘干温度,以干燥后药物水分含量不超过4%为指标,采用单因素考察烘干时间。考察结果见表2。
表2
实验结果:GCP在电热鼓风干燥箱中(温度:45±5℃)连续干燥36h后含水量符合要求,烘干干燥后GCP下称干GCP。
试验例2:鲜GCP和干GCP总黄酮含量对比研究
1方法与结果
1.1 方法
1.1.1样品制备及处理: 取 3gGCP药材(10目),加入90ml水,水浴回流1h过滤(避光),取续滤液,即得供试液。
1.1.2 没食子酸对照品溶液配制:精密称取没食子酸对照品5.0 mg,置于10 ml 棕色容量瓶中,蒸馏水稀释至刻度,超声溶解,从中移取2.5ml至50ml棕色容量瓶中,即得0.025mg/ml 没食子酸对照品溶液。
1.1.3测定波长的选择:精密移取没食子酸对照品溶液3.3ml,置于25 ml棕色容量瓶中,加1ml磷钼钨酸钠(实验室自配,参照2010版药典)加蒸馏水至13ml,加29%碳酸钠溶液至刻度,摇匀,静置30min,置1 cm 比色皿中,随行试剂作空白对照,在400~900 nm扫描,在波长758nm处有最大吸收
1.1.4标准曲线的绘制:精密移取没食子酸对照品溶液1.5、2.5、3.5、4 .5、5.5、6.5ml 置于25ml棕色容量瓶中,在最大吸收波长处按“1.1.3”项下操作。以浓度(C) 与吸光值(A) 进行直线回归,得线性回归方程及相关系数,得回归方程Y = 102.57X +0.0286 (r=0.9995) ,结果表明没食子酸在0.0015~0.0065mg/ml 与吸光度线性良好。
1.1.5总酚的测定:精密取供试液1.5ml至50ml棕色容量瓶中,从中精密移取2ml至25ml棕色容量瓶中。按“1.1.3”项下制备,测定吸光度,代入线性回归方程,计算即得。
1.1.6不被吸收多酚的测定:精密移取供试品溶液2ml,置盛有0.6g干酪素的50 ml具塞锥形瓶中,加水至10ml,密塞,置30℃水浴保温1h,时时震摇,过滤,精密移取续滤液2 ml,置25 ml 棕色容量瓶中,按“1.1.4”线性关系考察项下的方法配制,测定吸光度值,代入线性回归方程,计算即得。
1.1.7 总鞣质的测定:总鞣质的含量=总酚量-不被吸收多酚量。
1.1.8精密度试验:精确吸取没食子酸对照品溶液4 mL 置于25 mL棕色容量瓶中,按1.1.3项下方法测定吸光度,RSD 0.89%。
1.1.9稳定性试验:精密取供试液1.5ml至50ml棕色容量瓶中,从中精密取供试液2ml至25ml棕色容量瓶中,按“1.1.3”项下方法测定吸光度,10min内稳定,RSD 1.24%。
1.1.10重复性试验:按“1.1.1’项下提取,精密取供试液1.5ml至50ml棕色容量瓶中,从中精密取供试液2ml至25ml棕色容量瓶中,按“1.1.3”,项下方法测定吸光度,测定总酚含量,按“ 1.1.6” 项下方法测定吸光度,测定不被吸收多酚含量,其RSD 1.75%(n=6) ,说明测定总鞣质的重复性较好。
1.1.11回收率试验:精密移取同批已知总鞣质含量的GCP样品6 份,至25ml棕色容量瓶中,分别精密加入没食子酸对照品0.041mg,按“1.1.3”项下方法,测定总酚含量,RSD 2.26%,结果见表3。
表3:GCP提取液总酚加样回收实验
按“1.1.10”项下制备方法,对鲜、干GCP总鞣质含量进行测定、比较(n=6)。结果见表4。
表4:鲜GCP、干GCP总鞣质含量(n=6)
从表4即得鲜GCP总鞣质含量高于干GCP,是其1.11倍。
试验例3:基于3T3-L1细胞的鲜、干GCP降糖药效比较
1实验方法
1.1 细胞培养
3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞,来源于中国科学院生命科学研究院。将3T3-L1前脂肪细胞种入25cm2细胞培养板,加入正常培养液6ml,置37℃,5%CO2条件下培养,隔天换液。细胞融合80%后进行传代或冻存。
1.2 细胞诱导分化
将3T3-L1前脂肪细胞以5×103的密度接种于24孔培养板,待细胞生长至接触抑制,将细胞培养液换成诱导分化液A(0.5mmol/L IBMX, 0.1umol/L DEX, 10mg/L INS)培养48h,换以诱导分化液B(10mg/L)培养48h,换正常培养液继续培养,2天换液一次,诱导分化6-8天的细胞90%以上呈成熟细胞表形。
1.3 IR模型的制备
取对数生长期的3T3-L1细胞计数后以每孔5×103的密度接种于24孔培养板将培养板移入CO2培养箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养至生长抑制,诱导分化至成熟脂肪细胞。加入以下处理因素:
对照组继续给予正常培养液(含10%FBS的DMEM高糖培养液)培养
模型组给予1umolDEX正常培养液培养
其他细胞用于各个给药组实验
1.4 对3T3-L1前脂肪细胞的增殖的影响(MTT 法)
收集对数生长期3T3-L1前脂肪细胞,调整细胞悬液浓度,以每孔5×103的密度接种于96孔培养板,每孔加入100ul。将细胞置于37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱内培养至80%细胞融合,加入高中低三个浓度的药物每孔100ul,设4个复孔,同时设置空白对照与正常对照,平行3块版。继续培养48h后,倒置显微镜下观察。每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml),继续孵育4h。终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150ulDMSO,置于摇床上低俗震荡10min,使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm波长处测定各孔吸光度OD值。计算3T3-L1前脂肪细胞增殖变化率。
细胞存活率=(OD测试组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。当存活率的值大于80%时,表明药物对细胞的增殖不存在抑制作用
1.5对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗( IR )模型葡萄糖利用的影响
取对数生长期的3T3-L1细胞计数后以每孔5×103个细胞密度接种于24孔培养板中。按照2.3中IR模型的制备方法,将诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,分正常培养组和模型组,模型组又分为模型对照组和各个给药组。模型组给予1umolDEX作用48h。造好模后,按实验分组和给药浓度给药,平行3块板。分别于24h、48h观察细胞形态并取上清液与半自动生化仪检测,按试剂盒说明书测定培养液中葡萄糖(GLU)含量。
2实验结果
2.1 对3T3-L1前脂肪细胞的增殖的影响,见表5。该试验例中干GCP水提取液、鲜GCP水提取液通过对比实施例2的方法制得,干GCP醇提取液、鲜GCP水提取液通过对比实施例1的方法制得,干GCP醇加水提取液通过实施例2的方法制得,鲜GCP醇加水提取液通过实施例1的方法制得。
表5:对3T3-L1细胞增值影响
由表5可知细胞存活率基本都在80%以上,说明各浓度药物对细胞的增殖没有显著地抑制作用。100ug/ml, 25ug/ml, 6.25ug/ml可分别作为高中低浓度进一步考察不同组分降糖作用。
2.2对3T3-L1脂肪细胞IR 模型葡萄糖利用的影响,见表6。
表6:对脂肪细胞IR模型葡萄糖利用的影响
由表6可知,对鲜GCP、干GCP药材水提、醇提、醇加水提提取物降糖作用进行比较,相同提取方法下,鲜GCP降糖作用高于干GCP。同时,醇水提部位糖作用优于醇提部位,醇提部位降糖作用优于水提部位。
试验例4:基于动物和细胞的醇、水、醇加水GCP降糖药效比较
1实验方法
基于动物和细胞的醇、水、醇加水GCP降糖药效比较
1.1药物提取
醇提:参见对比实施例1
干燥后的头花蓼在24倍60%乙醇中浸泡30min,水浴回流提取3次,每次2小时,合并滤液,浓缩至所需高剂量浓度(1g/ml)。
水提:参见对比实施例2
干燥后的头花蓼在水中浸泡30min,加水煎煮两次,第一次为药材量的12倍,微沸1.5小时,第二次为药材量的10倍,微沸1小时,合并滤液,浓缩至所需高剂量浓度(1g/ml)。
醇加水提:参见实施例1
1)干燥后的头花蓼加入24倍量的60%乙醇,浸泡30分钟,提取3次,每次2小时,合并提取液,过滤浓缩至相当于生药1g/ml,得到醇提浓缩液;
2)醇提后药渣进行两次水煎煮,第一次加入12倍量水,提取1.5小时,第二次加入10倍量水,提取1小时,合并两次煎液,过滤浓缩至相当于生药1g/ml,得到水提浓缩液;
3)合并醇提浓缩液和水提浓缩液,再进行浓缩至相当于生药1g/ml,得到头花蓼提取物。
1.2.动物实验
1.2.1建模
取体重(20±2)g KM小鼠,460只,雌雄各半,适应环境7天,随机抽取雌雄性各6只做为空白对照组,禁食不禁水18h,用生理盐水配制1.1%四氧嘧啶,保存在冰水浴中,按110 mg /kg腹腔注射,对照组注射等剂量生理盐水,1h后恢复饮食,第二天以同法第二次建模。3天后(72h,正常饮食),禁食12h,断尾取血数滴,用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖,血糖值大于11.1mmol/L者为造模成功的小鼠。
1.2.2造模结果
460只KM小鼠其中12只为空白组,其余小鼠进行造模,造模结束后测得血糖值大于11.1mmol/L的小鼠模型小鼠,实验设计过程中每组为12只,实验造模结果中雌性小鼠数量较多,故若干剂量雌性小鼠设计为6-8只(8只具有统计学意义),个别模型小鼠尾巴受损,不利于下次取血,故未设于本实验分组中。实际造模成功率为48.03%,死亡率1.75%。
1.2.3实验分组
取模型小鼠,随机分成16组,即水提(高、中、低)剂量组、醇提(高、中、低)剂量组、醇加水提(高、中、低)剂量组、模型组,阳性组、空白组(正常小鼠),见表一。
1.2.4测血糖
用手术剪剪去小鼠尾端2-3mm,压迫取数滴血置于EP管中,先加15g/L的乙二胺四乙酸二钾溶液12μL,高速离心(10000r/min)5min,待血液分层后取上层血清10μL,加30μL生理盐水,摇匀;从稀释的血清中取10μL于EP管中,加1mL葡萄糖(Glu)氧化酶,摇匀,37℃恒温15min,样品(u)待测。另取生理盐水和校准品(c)10μL,分别加1mL葡萄糖氧化酶,摇匀,37℃恒温15min,用505nm波长以空白对照管调零后测定吸光度(A)。
样品Glu(mmol/L)=Au/Ac×Cc
1.2.5实验结果与讨论
造模成功后分别测定给药7d、14d、21d、28d的空腹血糖值(禁食不禁水12h)。表一为饮片各组分对高血糖模型小鼠血糖浓度的影响。
四氧嘧啶对胰岛β细胞具有特殊的破坏作用,造成胰岛素分泌低下,而引起动物实验性四氧嘧啶糖尿病。本实验采用GOD-POD法检测血清葡萄糖浓度,该方法的原理为血清中的POD葡萄糖在GOD的作用下被氧化成D-葡萄糖酸,并生成H2O2;后者与4-氨基安替比林和苯酚在过氧化物酶(POD)的作用下生成红色的苯酮亚胺, 生成的酮类化合物颜色的深浅与葡萄糖的含量成正比,分别测定标准管和样本管的吸光度值,计算葡萄糖的含量。
由表7可知,水提、醇提、醇加水提、阳性组均表现出降血糖作用,且醇加水提效果显著优于其它GCP提取方法。
表7: 饮片各组分对高血糖模型小鼠血糖浓度影响
并且由图1可知,给药18天后,醇加水提取液(中、低)给药小鼠体重高于模型组,阳性组体重高于模型组。
由图2可知,醇提后饮片与模型组相比具有一定的降血糖作用,给药21天,醇提组与模型组相比具有显著的降糖作用,且醇提中剂量组降糖作用优于高剂量组和低剂量组。
由图3可知,水提后饮片与模型组相比具有一定的降血糖作用,但疗效弱于阳性药,给药28天后,水提各剂量组血糖接近,未表现出显著性趋势。
由图4可知,醇加水提取液与模型组相比具有显著的降血糖作用,且给药21天后更为明显,此时,各剂量组疗效高于阳性药,且各剂量组间亦未表现出显著性趋势。
由图5可知,不同提取方法对饮片降糖作用具有显著性影响,随着给药时间的延长,醇加水提降糖作用显著高于水提和醇提。醇提降糖作用次之,水提最差,但两者无显著差异。
由图6可知,不同提取液,作用细胞24h后,三种提取方法均能降低血糖,其中醇加水提和醇提降糖效果优于水提。
由图7可知,不同提取液,作用细胞48h后,三种提取方法均能降低血糖,其中醇加水提和水提高剂量效果降糖作用显著优于水提高剂量,且随着给药剂量的增加,降糖作用升高。