CN103478147A

CN103478147A - 越南伯克霍尔德氏菌p418杀线虫活性物质的颗粒剂及其制备

Info

Publication number: CN103478147A
Application number: CN201310466221.3A
Authority: CN
Inventors: 李纪顺; 王贻莲; 陈凯; 德米特里巴扎诺夫; 张新建; 杨合同; 李红梅; 周红姿
Original assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: ECOLOGY INSTITUTE OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES (THE SINO-JAPANESE FRIENDSHIP BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER, SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES); SHANDONG WFS ECO-ENGINEERING Co.,Ltd.
Priority date: 2013-10-09
Filing date: 2013-10-09
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-10-09
Also published as: CN103478147B

Abstract

越南伯克霍尔德氏菌P418杀线虫活性物质的颗粒剂及其制备。本发明提取并纯化了P418菌株发酵液中的两种活性物质，并经鉴定，分别为六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，分子式分别为C₁₁H₁₈N₂O₂和C₁₄H₁₆N₂O₂；分子量分别为211和244。并以此二种化合物为主要活性成分，按不同比例制备了用于杀线的颗粒剂，经比较，得到最高杀线活性的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的重量配比为1～2:1。

Description

越南伯克霍尔德氏菌P418杀线虫活性物质的颗粒剂及其制备

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及越南伯克氏菌P418杀线虫活性物质的提取与应用。

背景技术

线虫病是危害植物的重要病害，全世界已记载的植物线虫有200多属5000多种，一旦发生难于防治和根除。据统计，全世界主要农作物因寄生线虫造成的年均损失率为12.3 %，1992 年我国种植业因线虫造成的损失达233亿元。目前，植物线虫病在我国各地均有不同程度的发生，且危害呈逐年加重趋势（郭衍银，徐坤，生姜根结线虫病原鉴定及发生规律[J]，植物保护学报，2004，31（3）：241-246）。当前，生产上普遍应用的防治策略是化学防治，但由于化学杀线剂大多数是高毒、高残留农药，长期使用会造成环境污染，危害人类健康。因此，研究开发高效低毒的生物杀线剂成为农业可持续发展中的重要问题。

植物寄生线虫生防细菌的研究是近几年兴起的新的研究热点。目前主要研究的有植物根围促生细菌、穿刺巴氏杆菌、假单胞杆菌、苏云金芽孢杆菌等，它们在线虫生物防治中有着巨大的开发潜力，其价值也为人们逐渐认识（田宝玉，黄薇，植物寄生线虫生防细菌及其作用机制研究[J]，生物技术，2009 年19(4) ：90－93）。越南伯克霍尔德氏菌( Burkholderia vietnamiensis )P418是本申请人保存的一株生防细菌，在研究中，我们发现P418菌株能够有效防治根结线虫病。田间试验表明，其可湿性粉剂对番茄根结线虫病的防治效果达63.42%，连续施用P418菌株可湿性粉剂后，土壤根结线虫数量显著减少（李纪顺，陈凯，伯克霍尔德氏菌P418的生物学特性[J]，中国植物病理学会2004年学术年会论文集）。室内毒力测定结果显示，P418发酵液上清处理2龄根结线虫48h后校正死亡率达70%以上，可见，P418菌株能产生杀线活性物质，如果能将其中的杀线活性物质提取出来，有望进一步提高杀线效果。

发明内容

针对现有技术的不足，为进一步获取越南伯克霍尔德氏菌P418所产生的杀线虫活性物质，本发明人提取并纯化了越南伯克霍尔德氏菌P418菌株发酵液中的两种活性物质，经鉴定，两种活性物质分别为：

六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(2-methylpropyl)），下称化合物Ⅰ，和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(phenylmethyl)），下称化合物Ⅱ；分子式分别为C₁₁H₁₈N₂O₂和C₁₄H₁₆N₂O₂；分子量分别为211 和244；分子结构分别为：

和

。

并以此二种化合物为主要活性成分，按不同比例制备了用于杀线虫的颗粒剂，经比较，得到最高杀线活性的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的重量配比为（1～2） : 1。

具体由以下措施实现：

1、越南伯克霍尔德氏菌P418发酵液中活性组分的分离提取及纯化鉴定，步骤如下，

（1）用液体培养基（g/l）蛋白胨8～10g，酵母粉0.5～1g，氯化钙0.1～0.5g，氯化钠0.2～0.5g，pH7.0～7.5培养越南伯克霍尔德氏菌P418。

（2）将培养好的发酵液8000 r/min离心，上清液用2倍体积氯仿萃取2次，合并有机相，减压浓缩除去氯仿，得粗提物。

（3）将上述粗提物过真空减压－硅胶柱(5×100 cm)，以不同比例的二氯甲烷－甲醇进行洗脱，甲醇－二氯甲烷的体积比分别为0:100(A)、1:100(B)、3:100(C)、5:100(D)、10:90(E)、20:80(F)、30:70(G)、50:50(H)、0:100(I)，各1000 mL，洗脱液以体积比为单位进行收集，测定各单位的杀线虫活性。

（4）将高活性组分过Sephadex LH-20凝胶柱 (1.5×60cm)，用石油醚-甲醇-二氯甲烷（体积比为2：1：1）进行洗脱，洗脱液以5ml为一个单位进行收集，测定各单位的杀线虫活性。

（5）用制备型薄层层析硅胶板进行分离，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(体积比1∶1)，结合离体生测找出活性条带后，收集活性条带，用正己烷－乙酸乙酯（体积比1：1）淋洗过滤，减压浓缩得到粗品，测定杀线虫活性。

（6）用检测型HPLC检测D-6-3，确定化合物种类，若为单一化合物直接进行步骤（8）的操作，若为两种或者两种以上化合物，则进行步骤（7）的操作。

（7）用制备型HPLC对此粗品进一步纯化( CH₃OH /H₂O = 20%～40% , PhenomenexODS柱, 250×10mmid, 5mL /min)，得到活性组分。

（8）采用EI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR进行杀线活性化合物的结构确定，结合谱图分析确定活性化合物组成。

最终，由上述分离纯化得到六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，即化合物Ⅰ和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，即化合物Ⅱ，两种活性组分。

2、两种活性组分的应用

（1）杀线虫活性测定

为验证六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮是否具有杀线虫活性，我们对南方根结线虫和秀丽隐杆线虫进行了杀虫试验。

（2）剂型研究

本发明六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮在农业上的应用,以六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮为有效成分配制成杀线虫颗粒剂,组分如下: （均为重量比）

硅藻土 70%

六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（化合物Ⅰ）和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（重量比为1～2：1） 10%

4，4′-二羟基二苯甲酮 10%

糊精 9.9%

醋酸和氨水 0.1%

将上述组分置于适宜的搅拌混合器内混合均匀，加入蒸馏水制成“手捏成团，压之即散”的软材，再挤压通过l4～22目筛网（板），制成均匀的颗粒，并以番茄根结线虫为受试对象，对该颗粒剂进行防治效果检测。

上述组分中硅藻土为吸附剂, 4，4′-二羟基二苯甲酮为稳定剂，糊精为粘合剂，醋酸和氨水为pH调节剂，蒸馏水为润湿剂。

附图说明

附图1为D-6-3的检测型HPLC检测谱图；

附图2为越南伯克霍尔德氏菌P418发酵液氯仿萃取液总离子流图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。

实施例1. 越南伯克霍尔德氏菌P418的分离筛选

选取白俄罗斯明斯克市大麦根际土壤土样50 g，在超净工作台内加到450ml 的灭菌生理盐水中，充分搅拌混匀。取5ml 样液加入到50ml 灭菌LB液体培养基中，37℃过夜培养后，转接含有Azotobacter Medium的选择性平板上培养，至菌落长出后，挑取生长快的单菌落进行保存。

其中，Azotobacter Medium配方为：

K₂HPO₄ 0.5g

MgSO₄.7H₂O 0.2g

NaCl 0.02 g

CaCl₂ 0.2 g

NaMoO₄.2H₂O 0.002g

乙二胺四乙酸铁钠盐0.066g

谷氨酸钠 0.05g

葡萄糖 5g

琼脂 15g

蒸馏水 1000ml，调pH 至7.2。

经室内毒力测定和温室盆栽试验发现，该菌株具有防治根结线虫的作用。

该菌株已于2004年8月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，分类名称为越南伯克霍尔德氏菌( Burkholderia vietnamiensis )P418，保藏号为CGMCC NO.1212，保藏地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。

实施例2：越南伯克霍尔德氏菌P418液体发酵培养，以下均为重量比或重量百分比。

越南伯克霍尔德氏菌P418液体发酵培养，按以下步骤进行：

（1）斜面菌种：采用固体LB培养基，将越南伯克霍尔德氏菌P418接种在试管培养基上，30℃培养24小时。

（2）摇瓶菌种：采用液体LB培养基，将试管菌种接种在液体LB培养基中，置摇床上30℃ 振荡培养18小时。

（3）液体发酵：采用培养基（g/l），蛋白胨8～10g，酵母粉0.5～1g，氯化钙0.1～0.5g，氯化钠0.2～0.5g，pH7.0～7.5，121℃灭菌20分钟，将（2）的种子接种于50升的发酵罐内（接种量为5％wt），30℃培养，每分钟通气量与发酵罐容积比为1.2~1.5：1，搅拌速度为400r/min，培养时间为48~72小时。

实施例3.杀线虫活性物质的制备

（1）杀线虫活性物质的提取

将越南伯克霍尔德氏菌P418液体培养物（实施例1产物）8000 r/min离心20～30min，收集上清液，用2倍体积氯仿萃取2次，合并有机相，减压浓缩除去氯仿，得杀线虫活性浓缩物。

（2）杀线虫活性物质的分离纯化

用真空减压－硅胶柱(5×100 cm)分离纯化上述浓缩物。取30g硅胶2CXⅡ（200～300目）注入硅胶柱，抽真空2～3小时（间隔一段时间用洗耳球敲打柱体，目的使硅胶压实）。浓缩物与少量硅胶混匀，小心倒入柱中，然后将洁净的脱脂棉置于上层，继续抽真空1～2小时。加入洗脱液（甲醇－二氯甲烷：0:100(A)、1:100(B)、3:100(C)、5:100(D)、10:90(E)、20:80(F)、30:70(G)、50:50(H)、0:100(I)，各1000 mL，洗脱液以体积比为单位进行收集，测定各单位的杀线虫活性，其测定方法为：将分离纯化的活性物质加到滤纸片上，待有机溶剂挥干后，用灭菌水稀释成用不同浓度的溶液，加入2龄幼虫悬浮液 ( 100 头线虫·mL-1)，在相对湿度80% ~ 90%，温度24~26℃ 条件下培养，以灭菌水为对照, 每个处理6次重复。分别于24h或48h 后统计幼虫死亡数，按公式计算死亡率和校正死亡率。

线虫死亡率(% ) =死虫数/总虫数×100

线虫校正死亡率(% ) =（处理线虫死亡率- 对照线虫死亡率）/（1- 对照线虫死亡率）×100。

线虫死亡记数标准，即线虫僵直不动的为死虫，呈弯曲蠕动状态为活虫。

结果如下表：

表1硅胶柱层析组分对2龄根结线虫的毒力测定

。

由表1可知，硅胶柱层析组分中，C和D组分杀线虫活性高。其中两组分在稀释20倍时，处理24小时后，对线虫致死率分别为44.65%和84.18%。故需将C和D组分过凝胶柱，继续分离纯化杀线活性物质。

将高活性组分C和D，继续过Sephadex LH-20凝胶柱 (1.5×60cm)，用石油醚-甲醇-二氯甲烷（体积比为2：1：1）进行洗脱，洗脱液以5ml为一个单位进行收集，测定各单位的杀线虫活性，结果见下表：

表2凝胶柱层析组分对2龄根结线虫的毒力测定（样品稀释20×）

。

由表2可知，D-6组分杀线虫活性最高，在样品稀释20倍时，处理48小时后，对线虫致死率为44.74%。故将其用制备型薄层层析硅胶板进行分离纯化。

继续保留活性组分D-6，用制备型薄层层析硅胶板进行分离，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(体积比1∶1)，结合离体生测找出活性条带后，收集活性条带D-6-3，用正己烷－乙酸乙酯（体积比1：1）淋洗过滤，减压浓缩得到样品，测定杀线虫活性，结果见下表：

表3薄层层析硅胶板回收样品对2龄根结线虫和秀丽隐杆线虫的毒力测定

。

由表3可知，用制备型薄层层析硅胶板回收的3个样品中，D-6-3对线虫致死率最高，在使用浓度为20 mg·ml^-1时，处理线虫48小时后，对南方根结线虫和秀丽隐杆线虫的致死率分别高达92.45%和98.37%。

用检测型HPLC检测D-6-3，发现D-6-3不是单一化合物（见附图1）。

经过GC/MS分析，所得质谱经数据处理系统对其内存谱库nist库自动搜索，并结合人工谱图解析，按各色谱峰的质谱裂片图或与相关文献核对，分别对各色谱峰加以确定。各成分的相对面积用面积归一化法来计算。在越南伯克霍尔德氏菌P418发酵液氯仿萃取液中，化合物Ⅰ的相对含量为61.82%，化合物Ⅱ的相对含量为22.01%，即P418发酵液中化合物Ⅰ的含量是化合物Ⅱ的2.81倍，结果见附图2及表4。

表4越南伯克霍尔德氏菌P418发酵液中化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的含量

。

再用制备型HPLC对此样品进一步纯化( CH₃OH /H₂O = 20%～40% , PhenomenexODS柱, 250×10mmid, 5mL /m in)，分别得化合物Ⅰ(28.3mg)和化合物Ⅱ( 15.5mg )，测定杀线虫活性，结果见下表：

表5活性物质的杀线虫作用

。

由表5可知，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对南方根结线虫和秀丽隐杆线虫均具有杀虫作用。且两种化合物的联合作用优于单一化合物，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的重量比分别为1：1和3：2的杀虫致死率分别高达83%和90%以上。而P418发酵液中两化合物重量比约为2.81：1，其杀虫致死率接近70%，明显低于以上两比例。

（3）杀线活性物质的结构再确定

采用EI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR等进行结构测定，结合谱图分析确定活性化合物

化合物Ⅰ:无色针状结晶; EI-MS m /z: 211 [M]⁺ ,195, 167, 154, 124, 86, 70。1H-NMR (CDCl3) δ: 6.68(1H, br s), 4.12( 1H, m) , 4.00( 1H, m ), 3.60( 1H,m ), 3.52 ( 1H, m ) , 2.34 ( 1H, m ) , 2.03 ( 1H, m ) ,2.01( 1H, m ) , 2.00 ( 1H, m ) , 1.90 ( 1H, m ), 1.70( 1H, m) , 1.50( 1H, m) , 0.97( 3H, d, J = 6.3 Hz) ,0.94( 3H, d, J = 6.3 Hz) ; 13C-NMR ( CDCl3 ) δ: 170.0( C = O ) , 166.1 ( C = O ) , 59.0 ( CH ), 53.4 ( CH ) ,45.5( CH2 ), 38.7 ( CH2 ), 28.1 ( CH ) , 24.7 ( CH ) ,23.7( CH2 ) , 22.7 ( CH3 ) , 21.2 ( CH3 )。经计算机检索, 其EI-MS 数据与化合物Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(2-methylpropyl)- 标准质谱对照一致, 故鉴定化合物1 为六氢3-异丁基-吡咯并哌嗪-1, 4-二酮。该化合物密度为1.14g/cm³ ，沸点为427.6℃ at760mmHg，闪点为212.4℃。

化合物Ⅱ：白色粉末; E I-MS m /z: 244 [M]⁺ ,215, 201, 173, 153, 125, 91, 77。

¹H-NMR(CDCl₃) :7.24( 5H, m ) , 4.62 ( 1H, br s) , 4.31 ( 1H, t), 3.60( 1H, m ) , 3.32 ( 2H, m ), 2.14 ( 2H, m, 1.78 ( 2H,m) ; ¹³C-NMR ( CDCl₃ ) δ : 170.3 ( C ), 165.1 ( C ),136.0( C ) , 129.4 ( CH ) , 129.1 ( CH ) , 127.6( CH ),59.2( CH ) , 56.2 ( CH ) , 45.5 ( CH₂ ), 36.9 ( CH₂ ),28.4( CH₂ ) , 22.5( CH₂ )。经计算机检索, 其EI-MS 数据与化合物（Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(phenylmethyl)-）标准质谱对照一致, 故鉴定化合物2 为六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。该化合物密度为1.26g/cm³，沸点为509.5℃ at 760mmHg，闪点为262℃。

实施例4.六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的应用

（1）杀线剂的制备

以硅藻土作为载体，配以粘结剂，稳定剂，PH调节剂，按最佳比例，利用挤出式造粒法制成六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮杀线虫颗粒剂。

有效成分配制成杀线虫颗粒剂,组分如下,均为重量比:

硅藻土 70%

六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（化合物Ⅰ）和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（重量比为3 ：2） 10%

4，4′-二羟基二苯甲酮 10%

糊精 9.9%

醋酸和氨水 0.1%

将上述组分置适宜的搅拌混合器内混合均匀，加入蒸馏水制成“手捏成团，压之即散”的软材，再挤压通过l4～22目筛网（板），制成均匀的颗粒，并以番茄根结线虫为受试对象，对该颗粒剂进行防治效果检测。

（2）本制剂对番茄根结线虫的防治

供试线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)

供试作物为番茄（改良毛粉802F₁）

供试药剂为本制剂和0.5%阿维菌素颗粒剂。

采用拌土处理法。试验前去寿光稻田镇李营村蔬菜大棚取带线虫（经鉴定南方根结线虫为优势种）土样。将带线虫土与本制剂按重量比为1500：10，1500：20，1500：25，1500：30的比例混匀，分装于18×15cm的花盆中备用。种子于30℃保湿催芽2d，在种子露白后种于处理好的花盆中，每盆种植30粒种子，覆膜保湿。置于温室工作台上，待出苗后，每天用喷雾器喷水1次，每2周浇Hoagland培养液1次，保持土壤肥力和湿度。设0.5%阿维菌素颗粒剂（重量比1500：20）和空白对照，每处理水平设5次重复，观察各处理的生长情况。45 d 后，清洗番茄根，记录形成的根结数。

按下述标准进行病情分级；按公式计算病情指数及相对防效。

0 级为根系完整，无根结。

1 级为有少量根结，根坏死少于25% 。

2 级为根结数占根系数的26% ~ 50% 。

3 级为根结数占根系数的51% ~ 75% 。

4 级为根结特多且较大，占根系数的76% ~100%。

病级指数= ∑ ( 各级植株数×该级数值) /( 总株数×4) ×100。

防治效果(% ) =（对照病情指数- 处理病情指数）/对照病情指数×100

数据统计分析：统计分析用EXCEL2003 和SPSS19.0 软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。

表6 本制剂对番茄根结线虫的防治效果

。

由表6可知，本制剂对番茄根结线虫的防治效果随剂量的加大而增高，在使用剂量为30g/盆时，防效达94.90%。与0.5%阿维菌素颗粒剂相比，在相同使用剂量（20g/盆）时，本制剂防治效果高且差异显著。表明本制剂是效果很好的杀线剂。

Claims

1.一种越南伯克霍尔德氏菌P418杀线虫活性物质的颗粒剂，其特征在于其组分及重量比如下：

硅藻土 70%

六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮

和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮 10%

4，4′-二羟基二苯甲酮 10%

糊精 9.9%

醋酸和氨水 0.1%

其中，六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮与六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮重量比为（1～2）: 1。

2.根据权利要求1所述的越南伯克霍尔德氏菌P418杀线虫活性物质的颗粒剂，其特征在于所述的六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮与六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮重量比为3 : 2。

3.根据权利要求1所述的越南伯克霍尔德氏菌P418杀线虫活性物质的颗粒剂，其特征在于，该颗粒剂的制备方法为：将所有组分置于搅拌混合器内混合均匀，加入蒸馏水制成软材，再挤压通过l4～22目筛网，制成均匀的颗粒。

4.根据权利权利要求1所述的越南伯克霍尔德氏菌P418杀线虫活性物质的颗粒剂，其特征在于，所述的六氢-3-（异丙基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-（苯甲基）-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮提取于越南伯克霍尔德氏菌P418，并分离纯化，其具体步骤为：

（1）用液体培养基培养越南伯克霍尔德氏菌P418，培养基组成为：蛋白胨8～10g/L、酵母粉0.5～1 g/L、氯化钙0.1～0.5g/L、氯化钠0.2～0.5g/L、pH7.0～7.5培养越南伯克霍尔德氏菌P418；

（2）将培养好的发酵液于8000 r/min下离心，取上清液用2倍体积氯仿萃取2次，合并有机相，减压浓缩除去氯仿，得粗提物；

（3）将步骤（2）所得粗提物过真空减压－5×100 cm硅胶柱，以不同比例的甲醇－二氯甲烷进行洗脱，甲醇－二氯甲烷的体积比按如下梯度进行英文编号：0:100(A)、1:100(B)、3:100(C)、5:100(D)、10:90(E)、20:80(F)、30:70(G)、50:50(H)、0:100(I)，每个梯度取1000 mL进行洗脱，洗脱液以体积比为单位进行收集，测定各单位的杀线虫活性；

（4）将步骤（3）所得校正死亡率高的活性组分过Sephadex LH-20 1.5×60cm凝胶柱，用体积比为2：1：1的石油醚-甲醇-二氯甲烷进行洗脱，洗脱液以5ml为一个单位进行收集，测定各单位的杀线虫活性；

（5）用制备型薄层层析硅胶板进行分离，展开剂为石油醚-乙酸乙酯，二者体积比为1∶1，结合离体生测找出活性条带后，收集活性条带，用体积比为1:1的正己烷－乙酸乙酯淋洗过滤，减压浓缩得到粗品，测定杀线虫活性；

（6）用制备型HPLC对此粗品进一步纯化，条件为CH₃OH /H₂O = 20%～40% , PhenomenexODS柱, 250×10mmid, 5mL /m in，分别得杀线活性化合物Ⅰ和化合物Ⅱ。

5.根据权利权利要求1所述的越南伯克霍尔德氏菌P418杀线虫活性物质的颗粒剂，其特征在于，所述的越南伯克霍尔德氏菌P418于2004年8月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，分类名称为越南伯克霍尔德氏菌( Burkholderia vietnamiensis )P418，保藏号为CGMCC NO.1212。