CN103476951A - 用于可检测的标记的靶标定位锚定的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测分子靶标和其它目标分析物的高反应性的官能化的基底和接头分子，还提供了利用它们的试剂盒、反应混合物和方法。

Description

用于可检测的标记的靶标定位锚定的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年2月16日提交的美国临时专利申请号61／443,560的优先权，其通过引用整体并入本文和用于所有目的。
背景技术
许多用于检测生物分子的流行方法依赖于荧光染料的应用，所述荧光染料作为生物分子的标记来使用。在不使用具有大台面面积的高成本仪器的情况下，检测通常需要至少数千个荧光染料分子。其它技术利用磁性传感器阵列来检测具有用作标记的磁性颗粒的生物分子。这些方案利用与在计算机硬盘驱动器中的那些类似的敏感的磁性传感器。但是，存在限制目前可得到的方法用于以高灵敏度检测生物分子的能力的技术问题。例如，在生物分子的大小和质量相对于用于检测的标记之间可能存在大差异，这使得难以将标记锚定在基底表面上进行检测。本公开内容解决了这些问题并提供了有关的优点。
发明内容
提供了用于检测分子靶标和其它目标分析物的高反应性的官能化的基底和接头分子，还提供了利用它们的试剂盒、反应混合物和方法。
在第一方面，本公开内容提供了一种官能化的基底，其包括：支持材料；一个或多个靶标特异性的捕获探针，其结合至所述支持材料的表面；和多个合成的非天然存在的分子，其结合至所述支持材料的表面；其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括芳族的形成共价键的反应基团，所述反应基团的存在浓度大于在天然存在的蛋白或核酸中存在的浓度。
在第一方面的一个实施方案中，所述芳族的形成共价键的反应基团中的一个芳族的形成共价键的反应基团位于所述合成的非天然存在的分子之一的暴露末端处。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子既不含有酪氨酸，也不含有胸腺嘧啶。
在第一方面的一个实施方案中，所述官能化的基底每单位面积包括的形成共价键的反应基团的数目比在天然存在的蛋白或组织中存在的数目大。
在第一方面的一个实施方案中，与天然存在的蛋白或核酸的形成共价键的反应基团相比，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括具有更大反应性的形成共价键的反应基团。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括具有比胸腺嘧啶和酪氨酸更大反应性的形成共价键的反应基团。
在第一方面的一个实施方案中，所述支持材料包括硅。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括树枝状聚体(dendrimer)结构。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括酪氨酸氨基酸。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括酚-甲酸共聚物。
在第一方面的一个实施方案中，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括酚和氨基基团。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括赖氨酸和酪氨酸氨基酸。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括酪胺或酪胺衍生物。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括胸腺嘧啶或胸腺嘧啶衍生物。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子是包含形成共价键的反应基团的多肽，所述反应基团的存在浓度大于在天然存在的蛋白中存在的浓度。
在第一方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子是包含形成共价键的反应基团的寡核苷酸，所述反应基团的存在浓度大于在天然存在的寡核苷酸中存在的浓度。
在第一方面的一个实施方案中，所述官能化的基底包括多个靶标特异性的捕获探针，其中所述靶标特异性的捕获探针是寡核苷酸。
在第一方面的一个实施方案中，所述官能化的基底包括多个靶标特异性的捕获探针，其中所述靶标特异性的捕获探针是多肽。在一个这样的实施方案中，所述多肽是抗体或其片段。
在第二方面，本公开内容提供了一种可检测的标记颗粒，其包括：用多个合成的非天然存在的分子官能化的表面，所述分子结合至所述支持材料的表面；其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括芳族的形成共价键的反应基团，所述反应基团的存在浓度大于在天然存在的蛋白或核酸中存在的浓度。
在第二方面的一个实施方案中，所述芳族的形成共价键的反应基团中的一个芳族的形成共价键的反应基团位于所述合成的非天然存在的分子之一的暴露末端处。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子既不含有酪氨酸，也不含有胸腺嘧啶。
在第二方面的一个实施方案中，所述官能化的基底每单位面积包括的形成共价键的反应基团的数目比在天然存在的蛋白或组织中存在的数目大。
在第二方面的一个实施方案中，与天然存在的蛋白或核酸的形成共价键的反应基团相比，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括具有更大反应性的形成共价键的反应基团。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括具有比胸腺嘧啶和酪氨酸更大反应性的形成共价键的反应基团。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括树枝状聚体结构。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括酪氨酸氨基酸。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括酚-甲酸共聚物。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括酚和氨基基团。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括赖氨酸和酪氨酸氨基酸。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括酪胺或酪胺衍生物。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括胸腺嘧啶或胸腺嘧啶衍生物。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子是包含形成共价键的反应基团的多肽，所述反应基团的存在浓度大于在天然存在的蛋白中存在的浓度。
在第二方面的一个实施方案中，所述合成的非天然存在的分子是包含形成共价键的反应基团的寡核苷酸，所述反应基团的存在浓度大于在天然存在的寡核苷酸中存在的浓度。
在第二方面的一个实施方案中，所述颗粒包括磁性材料。
在第三方面，本公开内容提供了一种试剂盒，其包括与其使用说明书成套组合的上述实施方案中的任一个的官能化的基底。
在第三方面的一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括多个可检测的标记颗粒，其中所述多个中的每一个可检测的标记颗粒用多个结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子官能化，以提供官能化的可检测的标记颗粒，其中所述多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子中的每一个包括形成共价键的反应基团。
在第三方面的一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括多个接头分子，其中所述多个接头分子中的每一个接头分子包括形成共价键的反应基团。在一个这样的实施方案中，所述试剂盒进一步包括多个可检测的标记颗粒，其中所述多个中的每一个可检测的标记颗粒用多个结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子官能化，以提供官能化的可检测的标记颗粒，其中每一个结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子包括结合部分，所述结合部分被构造成结合接头分子中的一个或多个。所述结合部分可以被构造成非共价地结合接头分子中的一个或多个。在一个实施方案中，所述结合部分是生物素或抗生蛋白链菌素。在一个实施方案中，在所述结合部分是抗生蛋白链菌素的情况下，所述接头分子包括生物素。在一个替代实施方案中，在所述结合部分是生物素的情况下，所述接头分子包括抗生蛋白链菌素。
在第三方面的一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括多个可检测的标记颗粒，其中所述多个中的每一个可检测的标记颗粒用多个结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子官能化，以提供官能化的可检测的标记颗粒，其中每一个结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子包括结合部分，所述结合部分被构造成结合接头分子中的一个或多个，且其中所述官能化的可检测的标记颗粒是官能化的磁珠。在一个这样的实施方案中，所述官能化的磁珠具有约100nm至约1μm的直径。在另一个实施方案中，所述官能化的磁珠具有约1μm或更大的直径。
在第四方面，本公开内容提供了一种反应混合物，其包括：(a)官能化的基底，其包括支持材料、结合至所述支持材料的表面的一个或多个靶标特异性的捕获探针、和结合至所述支持材料的表面的多个合成的非天然存在的分子，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括第一形成共价键的反应基团；和(b)多个官能化的可检测的标记颗粒，其中所述官能化的可检测的标记颗粒中的每一个包括多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子，以提供官能化的可检测的标记颗粒，且其中所述多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子中的每一个包括第二形成共价键的反应基团。
在第四方面的一个实施方案中，所述反应混合物进一步包括靶分子，所述靶分子特异性地结合所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一。在一个这样的实施方案中，所述反应混合物进一步包括标记探针，所述标记探针特异性地结合所述靶分子。在一个这样的实施方案中，所述反应混合物进一步包括酶缀合物，所述酶缀合物特异性地结合所述标记探针。在一个这样的实施方案中，所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的一个官能化的可检测的标记颗粒通过第一形成共价键的反应基团与第二形成共价键的反应基团的相互作用，经由多个共价键连接至所述支持材料的表面，在特异性地结合所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一的靶分子附近。在一个这样的实施方案中，所述反应混合物包括多个空间上分离的、可单独检测的靶位点。
在一个实施方案中，其中所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的一个官能化可检测的标记颗粒通过第一形成共价键的反应基团与第二形成共价键的反应基团的相互作用，经由多个共价键连接至所述支持材料的表面，在特异性地结合所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一的靶分子附近，所述靶分子以小于约100fM的浓度存在于所述反应混合物中。
在另一个实施方案中，其中所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的一个官能化可检测的标记颗粒通过第一形成共价键的反应基团与第二形成共价键的反应基团的相互作用，经由多个共价键连接至所述支持材料的表面，在特异性地结合所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一的靶分子附近，所述靶分子以约0.1fM至约100fM的浓度存在于所述反应混合物中。
在第五方面，本公开内容提供了一种反应混合物，其包括：(a)官能化的基底，其包括支持材料、结合至所述支持材料的表面的一个或多个靶标特异性的捕获探针、和结合至所述支持材料的表面的多个合成的非天然存在的分子，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括第一形成共价键的反应基团；(b)多个官能化的可检测的标记颗粒，其中所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的每一个包括多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子，以提供官能化的可检测的标记颗粒，且其中所述多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子中的每一个包括特异性结合对的一个成员；和(c)多个接头分子，其中所述多个接头分子中的每一个接头分子被构造成结合所述多个结合至官能化的可检测的标记的表面的分子之一，且其中每个接头分子包括多个第二形成共价键的反应基团。
在第五方面的一个实施方案中，所述反应混合物进一步包括靶分子，所述靶分子特异性地结合所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一。在一个这样的实施方案中，所述反应混合物进一步包括标记探针，所述标记探针特异性地结合所述靶分子。在一个这样的实施方案中，所述反应混合物进一步包括酶缀合物，所述酶缀合物特异性地结合所述标记探针。在一个这样的实施方案中，所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的一个官能化的可检测的标记颗粒结合至所述多个接头分子中的多重接头分子，所述接头分子经由第一形成共价键的反应基团和第二形成共价键的反应基团之间的共价键结合至所述支持材料的表面，在结合的靶分子附近。在一个这样的实施方案中，所述反应混合物包括多个空间上分离的、可单独检测的靶位点。
在一个实施方案中，其中所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的一个官能化可检测的标记颗粒通过第一形成共价键的反应基团与第二形成共价键的反应基团的相互作用，经由多个共价键连接至所述支持材料的表面，在特异性地结合所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一的靶分子附近；所述靶分子以小于约100fM的浓度存在于所述反应混合物中。
在另一个实施方案中，其中所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的一个官能化可检测的标记颗粒通过第一形成共价键的反应基团与第二形成共价键的反应基团的相互作用，经由多个共价键连接至所述支持材料的表面，在特异性地结合所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一的靶分子附近；所述靶分子以约0.1fM至约100fM的浓度存在于所述反应混合物中。
在上面关于第四方面和第五方面描述的任一种反应混合物中，所述官能化的可检测的标记颗粒可以是官能化的磁珠。在这样的实施方案中，所述官能化的磁珠可以具有约100nm至约1μm的直径。在某些实施方案中，所述官能化的磁珠具有约1μm或更大的直径。
在上面关于第四方面和第五方面描述的任一种反应混合物中，所述支持材料可以包括硅。
在上面关于第四方面和第五方面描述的任一种反应混合物中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个可以包括树枝状聚体结构。
在上面关于第四方面和第五方面描述的任一种反应混合物中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个可以包括酪氨酸氨基酸。
在上面关于第四方面和第五方面描述的任一种反应混合物中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个可以包括酚-酸共聚物。
在上面关于第四方面和第五方面描述的任一种反应混合物中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个可以包括赖氨酸和酪氨酸氨基酸。
在上面关于第四方面和第五方面描述的任一种反应混合物中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个可以包括酪胺或酪胺衍生物。
在上面关于第四方面和第五方面描述的任一种反应混合物中，所述合成的非天然存在的分子中的每一个可以包括胸腺嘧啶或胸腺嘧啶衍生物。
在第六方面，本公开内容提供了一种间接地检测固定化在基底表面上的靶分子的方法，其包括：在反应混合物中组合(a)官能化的基底，其包括支持材料、结合至所述支持材料的表面的一个或多个靶标特异性的捕获探针、和结合至所述支持材料的表面的多个合成的非天然存在的分子，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括第一形成共价键的反应基团，(b)多个官能化的可检测的标记颗粒，所述多个中的每一个成员包括多个第二形成共价键的反应基团，(c)疑似含有靶分子的样品，(d)靶标特异性的标记探针，和(e)酶缀合物，其被构造成特异性地结合所述靶标特异性的标记探针，并催化第一形成共价键的反应基团和第二形成共价键的反应基团之间的共价键形成；和检测与官能化的表面结合的官能化的可检测的标记颗粒是否存在，其中所述官能化的可检测的标记颗粒的存在指示被固定化在官能化的基底上的靶分子的存在。
在第六方面的一个实施方案中，所述疑似含有靶分子的样品含有小于约100fM的浓度的靶分子。
在第六方面的一个实施方案中，所述疑似含有靶分子的样品含有约0.1fM至约100fM的浓度的靶分子。
在第七方面，本公开内容提供了一种间接地检测固定化在基底表面上的靶分子的方法，其包括：在反应混合物中组合(a)官能化的基底，其包括支持材料、结合至所述支持材料的表面的一个或多个靶标特异性的捕获探针、和结合至所述支持材料的表面的多个合成的非天然存在的分子，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包括第一形成共价键的反应基团，(b)多个官能化的可检测的标记颗粒，所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的每一个成员包括第一结合部分，(c)多个连接分子，所述多个连接分子中的每一个成员包括第二结合部分和多个第二形成共价键的反应基团，所述第二结合部分被构造成特异性地结合所述第一结合部分，(d)疑似含有靶分子的样品，(e)靶标特异性的标记探针，和(f)酶缀合物，其被构造成特异性地结合所述靶标特异性的标记探针，并催化第一形成共价键的反应基团和第二形成共价键的反应基团之间的共价键形成；和检测与官能化的表面结合的官能化的可检测的标记颗粒是否存在，其中所述官能化的可检测的标记颗粒的存在指示被固定化在官能化的基底上的靶分子的存在。
在第七方面的一个实施方案中，所述疑似含有靶分子的样品含有小于约100fM的浓度的靶分子。
在第七方面的一个实施方案中，所述疑似含有靶分子的样品含有约0.1fM至约100fM的浓度的靶分子。
应当指出，可以组合本文中描述的2个或更多个实施方案，以产生一个或多个额外的包括各个实施方案的组合特征的实施方案。
附图说明
图1解释了在如下的根据本公开内容的靶标检测方法中形成的结合复合物：(a)提供基底，所述基底被一个或多个靶标特异性的捕获探针和多个分子官能化，所述分子包括第1形成共价键的反应基团。包括靶分子、标记探针、能产生(或释放)活化剂的实体和官能化的基底的反应混合物导致基底固定化的复合物的形成，所述复合物包括基底结合的靶标特异性的捕获探针、靶分子、标记探针和能产生(或释放)活化剂的实体。(b)在有产生(或释放)的活化剂存在下，包括第2形成共价键的反应基团的接头分子与基底结合的第1形成共价键的反应基团以靶标定位的方式形成共价键，从而导致接头分子结合部分的靶标定位沉积。(c)官能化的可检测的标记向所述反应混合物中的添加会导致所述可检测的标记经由所述接头分子的接头分子结合部分向基底表面的靶标定位锚定，所述接头分子又经由包括第1形成共价键的反应基团的分子共价地键合至基底表面。
图2解释了在如下的根据本公开内容的一种替代性靶标检测方法中形成的结合复合物：在(a)中，在基底的表面上形成复合物，所述复合物包括基底结合的靶标特异性的捕获探针、靶分子、标记探针和能产生(或释放)活化剂的实体，所述基底包括具有第1形成共价键的反应基团的分子。在有产生(或释放)的活化剂存在下，被第2形成共价键的反应基团官能化的可检测的标记与基底结合的第1基团形成共价键，由此以(b)中所示的靶标定位方式将官能化的可检测的标记锚定至基底表面。
图3解释了在图1中描绘的一般方案的一个实施方案，其中所述包括第1形成共价键的反应基团的分子包括酪胺衍生物，所述标记探针是生物素化的标记探针，所述能产生(或释放)活化剂的实体是抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(HRP)酶缀合物，所述包括第2形成共价键的反应基团的接头分子是生物素-酪胺缀合物，且所述官能化的可检测的标记是用抗生蛋白链菌素分子官能化的磁珠。在(c)中，经由抗生蛋白链菌素和生物素部分之间的多重结合相互作用，将磁珠锚定至基底表面，其中所述生物素部分共价地连接至基底表面。
图4解释了在图2中描绘的一般方案的一个实施方案，其中所述包括第1形成共价键的反应基团的分子包括酪胺衍生物，所述标记探针是生物素化的标记探针，所述能产生(或释放)活化剂的实体是抗生蛋白链菌素-HRP酶缀合物，且所述被第2形成共价键的反应基团官能化的可检测的标记是酪胺-官能化的珠子。在(b)中，经由第1和第2酪胺部分之间的HRP活化的共价键形成，将所述珠子锚定至基底表面。
图5显示了含有巯基和酚基的化合物的合成方案的一个例子，所述化合物可以用于官能化基底表面。为了实现描绘的化合物与基底表面的共价连接，可以首先用马来酰亚胺基团衍生化所述基底表面，所述马来酰亚胺基团可以与巯基容易地反应。
图6显示了接头分子的合成方案的一个例子，所述接头分子能够实现多个生物素部分在固定化的靶分子附近的HRP介导的沉积。所述接头分子包括被间隔物隔开的生物素部分和酚基。描绘的生物素化试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，其可容易地与酪胺反应以产生所述接头分子。
图7显示了接头分子的合成方案的一个例子，所述接头分子能够实现多个生物素部分在固定化的靶分子附近的HRP介导的沉积。所述接头分子包括被间隔物隔开的生物素部分和酚基，所述间隔物比图6中所示的间隔物更长。描绘的生物素化试剂包括NHS酯，其可容易地与酪胺反应以产生所述接头分子。
图8显示了根据本公开内容的不同方面的不同珠子表面酚基官能化方案的例子，所述方案可以用于提供官能化的可检测的标记。提供了在珠子表面和酪氨酸衍生物之间具有不同距离的官能化方案的例子。
图9显示了用于产生图8间隔物所示的最长分子的试剂部分的合成方案。
图10显示了得自在实施例1中详述的实验的结果的图像，其对比了靶分子在使用磁珠作为可检测的标记的2种不同基底上的捕获。
图11显示了得自在实施例2中详述的实验的结果的图像，其对比了接头分子在使用磁珠作为可检测的标记的2种不同基底上的酶介导的靶标定位沉积。
图12显示了实施例3的图像结果，其中使用磁珠作为标记进行SA-8-T官能化的基底表面的试验以确定检测限。
图13显示了2种接头分子，所述接头分子包括被不同长度的间隔物隔开的生物素部分和芳族基团。
图14显示了18种接头分子的芳族环部分的化学结构。
定义
本文中使用的术语“可检测的标记”表示能够被检测到的分子或颗粒，包括、但不限于，荧光颗粒、化学发光颗粒、磁性颗粒(例如，磁珠)等。
术语“接头分子”在本文中用于表示这样的分子：其包括至少一个如本文中定义的形成共价键的反应基团和至少一个作为特异性结合对的一个成员或能够随后形成共价键的官能团的基团。
术语“靶标特异性的捕获探针”在本文中用于表示这样的基底固定化的分子：其当在合适的反应条件下与目标靶分子或其它分析物接触时，能够特异性地结合所述目标靶分子或其它分析物。
术语“形成共价键的反应基团”在本文中用于表示这样的第1分子的第1基团：其在有特异性活化剂存在下，能够参与与第2分子的第2基团的特异性共价键形成。在没有特异性活化剂存在下，所述第1和第2基团之间的形成共价键的反应不发生或以轻微的速率发生。也就是说，在第1和第2基团之间形成共价键的可能性显著减少。例如，在其它方面相同的条件下，在没有特异性活化剂存在下在第1和第2基团之间形成共价键的可能性可以是小于20％，例如，小于10％、小于5％或小于1％。
术语“靶标特异性的标记探针”和“标记探针”在本文中用于表示具有第1特异性结合部分和第2特异性结合部分的双功能分子，所述第1特异性结合部分当在合适的反应条件下与目标靶分子或其它分析物接触时能够特异性地结合所述目标靶分子或其它分析物的至少一部分，所述第2特异性结合部分当在合适的反应条件下与能产生(或释放)活化剂的实体接触时能够特异性地结合能产生(或释放)活化剂的实体。
本文中使用的术语“能产生(或释放)活化剂的实体”表示这样的分子实体，例如酶缀合物：其能够直接地或间接地特异性地结合目标靶分子或其它分析物，和启动或催化第1形成共价键的反应基团和第2形成共价键的反应基团之间的共价键形成，和／或在有活化剂存在下活化所述第1和／或第2形成共价键的反应基团中的一个或多个。
术语“多肽”和“蛋白”在本文中互换使用，表示任意长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括天然的和非天然的氨基酸、化学地或生化地修饰的或衍生化的氨基酸、和具有修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括、但不限于，含有异源氨基酸序列的融合蛋白，含有异源和天然前导序列且具有或没有N-端蛋氨酸残基的融合体；免疫学上标记的蛋白；含有可检测的融合配偶体的融合蛋白，例如，包括荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶体的融合蛋白；等。
术语“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互换使用，并表示任意长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合形式，或这样的合成地产生的化合物：其可以以序列特异性的方式与天然存在的核酸杂交，所述方式类似于2个天然存在的核酸的杂交方式，即，可以参与沃森-克里克碱基配对相互作用。多核苷酸可以具有任意三维结构，且可以执行已知或未知的任意功能。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、控制区、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。
术语“序列”可以表示特定碱基序列，和／或也可以表示具有特定碱基序列的多核苷酸。因而，序列可以是信息，或可以表示分子实体，如使用的上下文所指示。
术语“部分”用于表示实体或分子的一部分，其通常具有特定的功能、结构或结构特征。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”和它们的复数指示物包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白、保持与抗原特异性结合的抗体片段(包括、但不限于，Fab、Fv、scFv和Fd片段)、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可与能实现它们的检测的实体结合，所述实体例如放射性同位素、生成可检测产物的酶、荧光蛋白等。抗体可进一步共价地或非共价地缀合其它部分，诸如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白／抗生蛋白链菌素特异性结合对的成员)等。抗体也可以结合固体支持物，包括、但不限于，聚苯乙烯平板或珠子等。所述术语还涵盖Fab’、Fv、F(ab’)2和／或保持与抗原特异性结合的其它抗体片段。
抗体可以以多种其它形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab′)2以及双功能的(即双特异性的)杂交抗体(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))，以及以单链形式存在(例如，Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85,5879-5883(1988)；Bird等人，Science，242,423-426(1988)；参见Hood等人，Immunology，Benjamin，N.Y.，第2版(1984)，和Hunkapiller和Hood，Nature，323,15-16(1986))。
本文中使用的术语“能够杂交”和“杂交”表示互补的或部分互补的分子之间的结合，例如双链DNA的有义和反义链之间的结合。这样的结合通常是非共价结合，且具有足够的特异性，使得结合可以用于区分高度互补的分子和互补性更低的其它分子。高度互补的分子的例子包括互补的寡核苷酸、DNA、RNA等，其包括排列成核苷酸序列的核苷酸区域，所述核苷酸序列与第二个核酸序列精确互补；互补性更低的寡核苷酸的例子包括具有这样的核苷酸序列的寡核苷酸：所述核苷酸序列包括一个或多个不在与第二个寡核苷酸精确互补的序列中的核苷酸。
术语“互补的”是指基于多核苷酸的序列而在所述多核苷酸之间的特异性结合的性质。本文中使用的多核苷酸如果在严谨条件下在杂交测定中彼此结合，那么它们是互补的。多核苷酸的部分如果遵循常规碱基配对规则(例如A与T(或U)配对，G与C配对)，那么它们是彼此互补的。“互补的”包括其中存在绝对序列互补性的实施方案，以及其中存在实质序列互补性的实施方案。
“绝对序列互补性”是指，在第一多核苷酸和第二多核苷酸之间存在100％序列互补性，即所述第一和第二多核苷酸中的任一个相对于另一个多核苷酸(在互补区内)而言不存在插入、缺失或置换。换句话说，互补区的每个碱基按照正常碱基配对规则与它的互补碱基配对。
“实质序列互补性”允许第一和／或第二多核苷酸相对于另一个多核苷酸(在互补区内)而言存在一个或多个相对较小的(小于10个碱基，例如小于5个碱基，典型地小于3个碱基，更典型地单个碱基)插入、缺失或置换。互补区是在第一多核苷酸和第二多核苷酸之间互补的区域(例如核酸靶分子和靶标特异性的捕获探针的独特序列)。互补序列通常嵌入在更大的多核苷酸内，因而2个相对较长的多核苷酸可以仅在它们的总长度的一部分上是互补的。互补区通常是至少约10个碱基长，更典型地至少约12个碱基长，更典型地至少约15个碱基长，更典型地至少约20个碱基长，或可以是至少约25个碱基长。
术语“特异性地杂交，，、“特异性杂交”、“选择性地杂交”等在本文中用于表示，核酸分子在“严谨条件”下优先与特定核苷酸序列结合、双链化或杂交。
术语“严谨条件”表示这样的条件：在该条件下，第一分子(例如，第一核酸)优先结合第二分子(例如，第二核酸)，且与其它序列以更低的程度结合或者根本不结合。换句话说，本文中使用的术语“严谨的杂交条件”表示适合产生双链体的条件，所述双链体是在互补的结合成员之间，例如，在靶标特异性的捕获探针的序列和靶核酸的互补序列之间。
在核酸杂交的背景下，“严谨的杂交条件”和“严谨的杂交洗涤条件”是序列依赖性的，且在不同的环境参数下是不同的。严谨的杂交条件可以包括，例如，在包含50％甲酰胺、5X柠檬酸钠盐水(SSC)和1％十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液中在42℃杂交，或在包含5XSSC和1％SDS的缓冲液中在65℃杂交，二者都用0.2X SSC和0.1％SDS在65℃洗涤。示例性的严谨的杂交条件还可以包括：在40％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS的缓冲液中在37℃杂交，并在1X SSC中在45℃洗涤。其它严谨的杂交条件包括在60℃或更高和3X SSC(450mM NaCl／45mM柠檬酸钠)杂交，或在42℃在含有30％甲酰胺、1M NaCl、0.5％肌氨酸钠、50mM2-(N-吗啉代)乙磺酸的溶液(pH6.5)中温育。普通技术人员会容易地认识到，可以使用替代性的、但是可比较的杂交和洗涤条件来提供类似严谨性的条件。
在某些实施方案中，洗涤条件的严谨性可以影响核酸分子特异性杂交的程度。合适的洗涤条件可以包括，例如：约0.02Mat的盐浓度(pH7)和至少约50℃、或约55℃至约60℃的温度；或者，约0.15M NaCl的盐浓度在72℃保持约15min；或者，约0.2X SSC的盐浓度在至少约50℃、或约55℃至约60℃的温度保持约1至约20min；或者，多次用具有约0.1XSSC盐浓度的含有0.1％SDS的溶液在20-50℃洗涤1-15min；或者，等效条件。洗涤的严谨条件还可以是，例如，0.2XSSC／0.1％SDS在42℃。在其中核酸分子是寡脱氧核苷酸(即由脱氧核糖核苷酸亚基组成的寡核苷酸)的情况下，严谨条件可以包括：在6X SSC／0.05％焦磷酸钠中在37℃(对于14-碱基寡物)、48℃(对于17-碱基寡物)、55℃(对于20-碱基寡物)和60℃(对于23-碱基寡物)洗涤。关于等效杂交和洗涤条件的详细描述，以及关于试剂和缓冲液，例如，SSC缓冲液和等效试剂和条件，参见Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold SpringHarbor，N.Y.)。
严谨的杂交条件还可以包括，用于抑制重复序列的水相核酸与降低复杂性的核酸的“预杂交”。例如，某些严谨的杂交条件包括，在与表面结合的多核苷酸的任何杂交之前，与Cot-1DNA或与随机序列合成寡核苷酸(例如25-聚体)等杂交。
严谨的杂交条件是至少与上述代表性条件一样严谨的杂交条件，其中在下述情况下认为条件是至少一样严谨：与上述的特定严谨条件至少约80％一样严谨，通常至少约90％一样严谨。其它严谨的杂交条件是本领域已知的，且也可以在适当时使用。
本文中使用的术语“结合”表示2个或更多个实体之间的结合相互作用。在2个实体(例如，分子)彼此结合的情况下，它们可以直接地结合，即，直接地彼此结合，或者它们可以间接地结合，即，通过使用中间连接部分或实体而结合。在任一种情况下，所述结合可以是共价的；例如，通过共价键；或非共价的，例如，通过离子键、氢键、静电相互作用、疏水相互作用、范德华力或它们的组合。
术语“特异性结合”、“特异性地结合”等表示，与反应混合物中的其它分子或部分相比，第一结合分子或部分(例如，靶标特异性的结合部分)优先直接结合第二结合分子或部分(例如，靶分子)的能力。在某些实施方案中，当第一结合分子或部分和第二结合分子或部分彼此特异性地结合时，它们之间的亲和力的特征在于小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M、小于10-12M、小于10-13M、小于10q4M或小于10-15M的KD(解离常数)。
本文中使用的“特异性结合对的成员”是参与特异性结合相互作用的一对分子或实体的成员。在鉴别出特异性结合对的第一成员的情况下，可容易地鉴别特异性结合对的第二成员的身份。应当指出，当结合对的任一个成员被称作第一成员时，剩余的成员被理解为第二成员，反之亦然。特异性结合对相互作用的例子包括：免疫相互作用诸如抗原／抗体和半抗原／抗体，以及非免疫相互作用诸如互补的核酸结合、糖和对其特异性的凝集素、酶和对其特异性的抑制剂、脱辅酶和辅因子、激素和对其特异性的受体、生物素／抗生物素蛋白和生物素／抗生蛋白链菌素。
本文中使用的术语“烷基”表示1至约50个碳原子的支链、直链或环状饱和烃基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。在本文中优选的烷基可以含有1至约36个、更典型地1-10个碳原子。术语“低级烷基”是指1-6个碳原子、优选地1-4个碳原子的烷基。存在于本文所述的聚合物上的烷基可以是未被取代的，或它们可以被一个或多个取代基取代，所述取代基包括官能团(例如，胺、羟基、烯族基团诸如乙烯基或烯丙基)等。“被取代的烷基”表示被一个或多个取代基取代的烷基，且这包括这样的情况：其中来自烷基取代基中的同一个碳原子的2个氢原子被替换，诸如在羰基中(即，被取代的烷基可以包括-C(=O)-部分)。其它取代基包括如在下面更详细地定义的卤素、醚、羟基、胺官能团等。术语“含有杂原子的烷基”和“杂烷基”表示这样的烷基取代基：其中至少一个碳原子被杂原子(诸如O、S、P或N)替代，如在下面更详细地描述。如果没有另外指出，术语“烷基”和“低级烷基”分别包括直链、支链、环状、未被取代的、被取代的和／或含有杂原子的烷基或低级烷基。
本文中使用的术语“亚烷基”表示含有1-50个碳原子的双功能的饱和支链或直链烃链。“低级亚烷基”表示含有1-12个碳原子的亚烷基连接，且包括，例如，亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、2-甲基亚丙基(-CH2-CH(CH3)-CH2-)、亚己基(-(CH2)6-)等。与烷基一样，且除非另外指出，亚烷基包括直链、支链、环状、未被取代的、被取代的和含有杂原子的亚烷基。类似地，术语“亚烯基”、“亚炔基”、“亚芳基”、“亚烷芳基”和“亚芳烷基”分别表示双功能的(即，连接)烯基、炔基、芳基、烷芳基和芳烷基。
本文中使用的术语“烯基”表示含有至少一个双键的、2至约50个碳原子的直链、支链或环状烃基，诸如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四烯基、十六烯基、二十烯基、二十四烯基等。通常，尽管还是不一定，在本文中的烯基可以含有2至约36个碳原子，例如可以含有2-12个碳原子。术语“低级烯基”是指2-6个碳原子的烯基。术语“被取代的烯基”表示被一个或多个取代基取代的烯基，且术语“含有杂原子的烯基”和“杂烯基”表示其中至少一个碳原子被杂原子替换的烯基。如果没有另外指出，术语“烯基”和“低级烯基”分别包括直链、支链、环状、未被取代的、被取代的和／或含有杂原子的烯基和低级烯基。类似地，本文中使用的术语“烯烃”(如在“烯族化合物”中)表示2-36个碳原子的单不饱和或二不饱和烃，其中在优选实施方案中，碳-碳双键位于末端的2个碳原子之间。在该类内的优选烯族基团在本文中有时被称作“低级烯族基团”，是指含有单个末端双键的、含有2-18个碳原子的烃。后一部分也可以被称作“低级烯基”。在某些情况下，它是含硅化合物的一部分。通常，但不一定，在用于本公开内容的方法中时，含有烯族基团的化合物呈液体形式。
本文中使用的术语“炔基”表示含有至少一个三键的2-50个碳原子的直链或支链烃基，诸如乙炔基、正丙炔基等。通常，尽管还是不一定，在本文中的炔基可以含有2至约18个碳原子，且这样的基团可以进一步含有2-12个碳原子。术语“低级炔基”是指2-6个碳原子的炔基。术语“被取代的炔基”表示被一个或多个取代基取代的炔基，且术语“含有杂原子的炔基”和“杂炔基”表示其中至少一个碳原子被杂原子替换的炔基。如果没有另外指出，术语“炔基”和“低级炔基”分别包括直链、支链、未被取代的、被取代的和／或含有杂原子的炔基和低级炔基。
本文中使用的术语“芳基”表示具有1-3个环的芳族物质，但是通常是指单环或二环部分，例如，苯基或1-萘基或2-萘基。任选地，这些基团被1-4个、更优选1-2个取代基取代，所述取代基例如本文描述的那些，包括低级烷基、低级烷氧基、羟基、氨基和／或硝基。芳基可以含有例如6-50个碳原子，且作为另一个例子，芳基可以含有6-12个碳原子。例如，芳基可以含有一个芳族环或2个稠合的或连接的芳族环，例如，苯基、萘基、联苯、二苯基醚、二苯胺、二苯甲酮等。“被取代的芳基”表示被一个或多个取代基取代的芳基部分，且术语“含有杂原子的芳基”和“杂芳基”表示其中至少一个碳原子被杂原子替换的芳基取代基，如在下文中更详细地描述的。如果没有另外指出，术语“芳基”包括未被取代的、被取代的和／或含有杂原子的芳族取代基。
术语“芳烷基”表示具有芳基取代基的烷基，且术语“烷芳基”表示具有烷基取代基的芳基，其中“烷基”和“芳基”如上面所定义。一般而言，在本文中的芳烷基和烷芳基含有6-50个碳原子。芳烷基和烷芳基可以含有例如6-20个碳原子，且作为另一个例子，这样的基团可以含有6-12个碳原子。
术语“烷氧基”和“芳氧基”分别表示通过氧键结合的烷基和芳基。在某些实施方案中，所述烷基或芳基通过氧键结合至非碳元素，诸如硅原子。“低级烷氧基”是指含有1-10个、更优选1-7个碳原子的烷氧基。术语“氧基亚烷基”和“氧基亚芳基”分别表示双功能的(即，连接)烷氧基和芳氧基。
术语“氨基”是指氨基-NR2，其中R是氢或替代性的取代基，通常是低级烷基。术语“氨基”因而意图包括伯氨基(即，NH2)、“烷基氨基”(即，含有单个烷基取代基的仲氨基)和“二烷基氨基”(即，含有2个烷基取代基的叔氨基)。
术语“含有杂原子的”，如在“含有杂原子的烷基”(也被称作“杂烷基”)或“含有杂原子的芳基”(也被称作“杂芳基”)中，表示其中一个或多个碳原子被除了碳以外的原子(例如，氮、氧、硫、磷或硅，通常是氮、氧或硫)替换的分子、键或取代基。类似地，术语“杂烷基”表示含有杂原子的烷基取代基，术语“杂环的”表示含有杂原子的环状取代基，术语“杂芳基”和杂芳族”分别表示含有杂原子的“芳基”和“芳族”取代基等。杂烷基的例子包括烷氧基芳基、烷基硫烷基取代的烷基、N-烷基化的氨基烷基等。杂芳基取代基的例子包括吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、喹啉基、吲哚基、呋喃基、嘧啶基、咪唑基、1，2，4-三唑基、四唑基等，且含有杂原子的脂环族基团的例子是吡咯烷子基、吗啉代、哌嗪子基、哌啶子基、四氢呋喃基等。
“烃基”表示这样的单价烃基残基：其含有1至约50个碳原子，包括1至约36个碳原子，进一步包括1至约18个碳原子，且进一步包括约1-12个碳原子，包括直链、支链、环状、饱和和不饱和种类，诸如烷基、烯基、芳基等。“被取代的烃基”表示被一个或多个取代基取代的烃基，且术语“含有杂原子的烃基”表示其中至少一个碳原子被杂原子(诸如O、N、P、Si或S)替换的烃基。被取代的烃基的例子包括烷芳基、芳烷基等；含有杂原子的烃基的例子包括烷氧基、烷基氨基等。除非另有说明，术语“烃基”应当解释为包括被取代的和／或含有杂原子的烃基部分。此外，术语“亚烃基”表示二价(即，连接)烃基，且除非另有说明，包括被取代的和／或含有杂原子的亚烃基部分。
术语“醚”包括单醚和聚醚，且表示具有含碳和氧的链的基团，并且这些单元中的每一个由2-6个碳(对于每个氧原子)组成。例子是二乙基醚和二丙基醚、聚氧化乙烯(polyethyleneoxide)、聚氧化丙烯(polyprolyleneoxide)、聚乙二醇(polyethelene glycol)、聚氧化丁烯(polybuteleneoxide)。
“卤代”或“卤素”表示氟、氯、溴或碘，且通常是指对有机化合物中的氢原子的卤代。
本文中使用的术语“全氟”(诸如全氟基团、全氟单体、全氟寡聚体或全氟聚合物)表示，其中氟原子完全地或几乎完全地取代氢原子的部分或化合物。在全氟基团的某些实施方案中，在1-3个位于末端处或位于末端键合点(即，该基团与基底或与其它化学部分连接的地方)处的碳上的氢原子没有被氟原子替换。全氟基团进一步包括具有被氟原子替换的氢原子的多碳或聚醚链。
术语“卤代烃基(halocarbyl)”和“卤代烃(halocarbon)”表示其中一个或多个氢残基被卤素残基替换的烃基(如上定义)。类似地，术语“全卤代烃基”表示其中所有氢残基被卤素残基替换的烃基。术语“卤代烃基”和“卤代烃”包括全卤代烃基，且进一步包括氟代烃基、全氟代烃基、氯代烃基、全氯代烃基、溴代烃基、全溴代烃基、碘代烃基和全碘代烃基。类似地，术语“卤代醚”表示其中一个或多个氢残基被卤素残基替换的醚基，且术语“全卤代醚”表示其中所有氢残基被卤素残基替换的醚基。除非另外指出，术语“卤代醚”包括全卤代醚。
术语“聚合部分”和“聚合的基团”表示含有2个或多个重复亚基的基团，所述亚基以直链、支链、超支化、树枝状或环状顺序或它们的任意组合进行连接。所述亚基本身可以进一步是直链、支链或环状。此外，所述亚基可以含有杂原子，使得所述聚合部分具有包含杂原子的主链。该术语也包括共聚部分，即由2个或多个亚基组成的聚合部分。除非另外指出，共聚物包括这样的体系结构，诸如随机、嵌段、梳形、和星形以及它们的组合。聚合部分包括合成的以及天然存在的部分或其片段。亚基的例子包括亚烷基、亚芳基、亚杂烷基、氨基酸、核酸、糖等。类似地，术语“聚合的接头”表示双功能的(即，连接)聚合部分。聚合部分的例子包括聚(乙二醇)、聚(亚乙胺)和聚(氨基酸)基团。
“被取代的”，如在“被取代的烃基”、“被取代的烷基”、“被取代的芳基”等中，如在某些前述定义中所提及，是指在烃基、烷基、芳基或其它部分中，至少一个与碳(或其它)原子结合的氢原子被一个或多个非氢取代基替换。这样的取代基的例子包括、但不限于，官能团和烃基部分C1-C24烷基(包括C1-C18烷基，进一步包括C1-C12烷基，且进一步包括C1-C6烷基)、C2-C24烯基(包括C2-C18烯基，进一步包括C2-C12烯基，且进一步包括C2-C6烯基)、C2-C24炔基(包括C2-C18炔基，进一步包括C2-C12炔基，且进一步包括C2-C6炔基)、C5-C30芳基(包括C5-C20芳基，且进一步包括C5-C12芳基)和C6-C30芳烷基(包括C6-C20芳烷基，且进一步包括C6-C12芳烷基)。“官能团”是指含有一个或多个反应部分的基团。官能团的例子包括卤代、羟基、巯基、C1-C24烷氧基、C2-C24烯氧基、C2-C24炔氧基、C5-C20芳氧基、酰基(包括C2-C24烷基羰基(-CO-烷基)和C6-C20芳基羰基(-CO-芳基))、酰氧基(-O-酰基)、C2-C24烷氧基羰基(-(CO)-O-烷基)、C6-C20芳氧基羰基(-(CO)-O-芳基)、卤代羰基(-CO)-X，其中X是卤代)、C2-C24烷基碳酸根(carbonato)(-O-(CO)-O-烷基)、C6-C20芳基碳酸根(carbonato)(-O-(CO)-O-芳基)、羧基(-COOH)、羧酸根(carboxylato)(-COO-)、氨甲酰基(-(CO)-NH2)、单取代的C1-C24烷基氨甲酰基(-(CO)-NH(C1-C24烷基))、二取代的烷基氨甲酰基(-(CO)-N(C1-C24烷基)2)、单取代的芳基氨甲酰基(-(CO)-NH-芳基)、硫代氨甲酰基(-(CS)-NH2)、脲基(-NH-(CO)-NH2)、氰基(-C≡N)、异氰基(-N+≡C-)、氰酰(-O-C≡N)、异氰酰(-O-N≡C-)、异硫氰基(-S-C≡N)、叠氮基(-N=N+=N-)、甲酰基(-(CO)-H)、硫代甲酰基(-(CS)-H)、氨基(-NH2)、单-和二-(C1-C24烷基)-取代的氨基、单-和二-(C5-C20芳基)-取代的氨基、C2-C24烷基酰氨基(-NH-(CO)-烷基)、C5-C20芳基酰氨基(-NH-(CO)-芳基)、亚氨基(-CR=NH，其中R=氢、C1-C24烷基、C5-C20芳基、C6-C20烷芳基、C6-C20芳烷基等)、烷基亚氨基(-CR=N(烷基)，其中R=氢、烷基、芳基、烷芳基等)、芳基亚氨基(-CR=N(芳基)，其中R=氢、烷基、芳基、烷芳基等)、硝基(-NO2)、亚硝基(-NO)、磺基(-SO2-OH)、磺酸根(sulfonato)(-SO2-O-)、C1-C24烷基硫烷基(-S-烷基；也被称作“烷硫基”)、芳基硫烷基(-S-芳基；也被称作“芳硫基”)、C1-C24烷基亚磺酰基(-(SO)-烷基)、C5-C20芳基亚磺酰基(-(SO)-芳基)、C厂C24烷基磺酰基(-SO2-烷基)、C5-C20芳基磺酰基(-SO2-芳基)、膦酰基(-P(O)(OH)2)、磷酸根(phosphonato)(-P(O)(O-)2)、次膦酸根(phosphinato)(-P(O)(O-))、二氧磷基(-PO2)和膦基(-PH2)、单-和二-(C1-C24烷基)-取代的膦基和单-和二-(C5-C20芳基)-取代的膦基。另外，如果具体基团允许，上述官能团可以进一步被一个或多个另外的官能团或被一个或多个烃基部分(诸如以上具体列举的那些)取代。类似地，上述烃基部分可以进一步被一个或多个官能团或另外的烃基部分(诸如具体列举的那些)取代。
当术语“被取代的”出现于可能被取代的基团列表之前时，该术语意图应用于该组中的每一个成员。例如，短语“被取代的烷基和芳基”应当解释为“被取代的烷基和被取代的芳基”。
除非另外指出，对原子的提及意图包括该原子的同位素。例如，对H的提及意图包括1H、2H(即，D)和3H(即，T)，且对C的提及意图包括12C和碳的所有同位素(诸如13C)。
本领域技术人员将理解，上面提供的定义中的许多定义在范围上是重叠的，并且无意相互排斥。因此，任何特定化学基团可能落入上面提供的定义中的超过一个定义内。
在进一步描述本发明前，应当理解，本发明不限于所述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应当理解，在本文中使用的术语仅仅用于描述具体实施方案的目的，无意成为限制性的，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
在提供了值的范围的情况下，应当理解，介于该范围的上限与下限之间的每个居间值(直至下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明)以及该所述范围内的任何其它所述值或居间值均被包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包含在所述较小范围内，并且也被包含在本发明内，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些被包括的端值中的任一个或两个端值的范围也被包括在本发明中。
除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明，但现在描述优选的方法和材料。在本文中提及的所有出版物都通过引用并入本文，以公开和描述与所述出版物引用的对象有关的方法和／或材料。
必须指出，如在本文中和在所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，对“一个接头分子”的提及包括多个这样的接头分子，且对“所述结合复合物”的提及包括对一种或多种结合复合物以及本领域技术人员已知的其等同物的提及，诸如此类。进一步指出，可以撰写权利要求以排除任何任选的要素。这样，该声明意图充当与权利要求要素的列举结合使用诸如“唯一”、“仅”等排它性术语的前提基础，或使用“否定”限制的前提基础。
在本文中讨论的出版物仅针对它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。在本文中的任何内容都不应解释为承认：本发明由于在前发明而丧失早于这样的出版物的资格。此外，提供的出版物的日期可能不同于实际的出版日期，后者可能需要独立地确认。
提出下述详细描述和实施例以便为本领域普通技术人员提供如何完成和使用本发明的完整公开内容与说明，它们不旨在限制发明人视为的发明范围，也不旨在表示下文的实验是所执行的全部或唯一实验。已努力确保关于所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度以摄氏度(℃)为单位，并且压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；μl，微升；pl，皮升；μm，微米；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；等。
具体实施方式
本公开内容涉及与空间上分散在基底表面上的靶分子和其它目标分析物的定性和／或定量检测结合使用的方法和组合物。在一个方面，提供了高反应性的官能化的基底，其可以与包括可检测的标记的靶标定位沉积的方法结合使用。还提供了包含形成共价键的反应基团的不同分子。这些分子可以用于官能化在靶标检测中使用的基底表面和／或可检测的标记。本公开内容也提供了接头分子，其可以与官能化的基底表面或可检测的标记一起用于包括可检测的标记的靶标定位锚定的方法中。最后，本公开内容提供了与包括可检测的标记的靶标定位沉积的方法结合使用的试剂盒和方法。
官能化的基底
在一个方面，本公开内容提供了具有用分子官能化的表面的基底，所述分子包括一个或多个形成共价键的反应基团。适合官能化的基底可以从多种材料制备，所述材料包括、但不限于，载玻片、熔化的二氧化硅、硅和塑料。
在本文公开的具体实施方案中，感兴趣的基底包括嵌有磁性传感器的基于硅的材料，所述磁性传感器能够检测固定化在基底表面上的磁性颗粒的存在。关于这样的传感器的描述，参见，例如，参见，例如，Baselt等人，Biosens.Bioelectron.，13,731-739(1998)；Edelstein等人，Biosens.Bioelectron.，14,805-813(2000)；Miller等人，J.Magn.Magn.Mater.，225,138-144(2001)；Graham等人.J.Appl.Phys.，91,7786-7788(2002)；Ferreira等人.J.Appl.Phys.，93,7281(2003)；Li等人.J.Appl.Phys.，93,7557-7559(2003)，May；Li等人.IEEE Trans.Magn.，40,3000(2004)；Wang等人，J.Magn.Magn.Mater.，293,731-736(2005)；Shen等人.Appl.Phys.Lett.，86,253901(2005)；Baselt等人.美国专利号5,981,297；Tondra，美国专利号6,743,639；和Tondra美国专利号6,875,621。
与本公开内容结合使用的基底可以具有多种形状和大小。例如，在某些实施方案中，合适的基底具有固体、基本上平面的结构。在其它实施方案中，合适的基底可以具有基本上球形的结构，例如，珠子。
所述基底材料会提供用于连接包含形成共价键的反应基团的分子的支持结构。这样的分子会通过提供用于沉积接头分子或锚定包含形成共价键的反应基团的可检测的标记的位置来提供官能化的表面，例如，如在图1和2中一般地描述。
多种单步或多步方法可以用于将包含形成共价键的反应基团的分子连接至基底表面。例如，在一个实施方案中，用氨基烷基硅烷衍生化的硅晶片基底可以与包含形成共价键的反应基团的分子中存在的羧酸基团的碳二亚胺活化联合使用，从而导致包含形成共价键的反应基团的分子缀合至基底表面。在另一个实施方案中，使用包含被聚乙二醇(PEG)间隔物隔开的酯和马来酰亚胺基团的双功能分子，可以将在基底表面上衍生化的氨基烷基硅烷的氨基转化成马来酰亚胺基团。然后通过与基底表面上的马来酰亚胺基团反应，可以将包含形成共价键的反应基团和巯基的分子缀合至基底上。
包含形成共价键的反应基团的分子可以具有多种结构，所述反应基团适合用于缀合至基底表面以提供官能化的基底表面。这些分子可以是具有多种合适结构中的任一种结构的双功能或多功能试剂。例如，适合用于官能化基底表面的分子可以是直链、支链或树枝状，且可以包括一个或多个间隔物，所述间隔物连接所述分子的功能部分。合适的间隔物可以具有多种结构，只要它们能够相对于基底表面有效地定位所述分子的各个功能部分(例如，形成共价键的反应基团)即可。合适的间隔物可以包括，例如，聚合物(例如，基于PEG的聚合物)；烷基等。考虑到捕获探针、靶分子或目标分析物、标记探针和能产生(或释放)活化剂的实体中的一个或多个的长度和／或大小，可以调节间隔物部分(或分子的其它合适部分)的长度，使得一个或多个形成共价键的反应基团位于离基底表面一定距离处，且在包括能产生(或释放)活化剂的实体、标记探针、靶分子或目标分析物和捕获探针的复合物的近端，其中所述复合物被固定化在基底表面上。这可以增加在官能化基底表面的分子与连接分子或适当地官能化的可检测的标记之间发生共价键形成反应的可能性。
形成共价键的反应基团在分子中的相对位置可以变化，只要它们会相对于基底表面和靶标结合复合物(当存在时)有效地定位，以提供可检测的标记(当存在时)的靶标定位沉积。例如，在某些实施方案中，包含形成共价键的反应基团的分子包括在相对于所述分子与基底表面的连接点的末端位置处的形成共价键的反应基团。这样的实施方案还可以包括一个或多个位于所述分子的末端端部和所述分子与基底表面的连接点之间的形成共价键的反应基团。
在其它实施方案中，所述包含形成共价键的反应基团的分子不包括位于末端的形成共价键的反应基团，而是包括一个或多个位于所述分子的末端端部和所述分子与基底表面的连接点之间的形成共价键的反应基团。
在某些实施方案中，所述包含形成共价键的反应基团的分子不具有天然存在的分子(例如，天然存在的核酸或蛋白分子)的结构。在某些实施方案中，所述形成共价键的反应基团本身不具有天然存在的核酸或蛋白分子的形成共价键的反应基团的结构。例如，在某些实施方案中，所述形成共价键的反应基团是除了酪氨酸和胸腺嘧啶以外的反应基团。
在某些实施方案中，所述包含形成共价键的反应基团的分子包括聚合的结构，例如，聚合间隔物结构。在某些这样的实施方案中，所述形成共价键的反应基团包括芳族环结构。在某些实施方案中，合适的包含形成共价键的反应基团的基底官能化分子包括：能键合至基底表面的部分、聚合间隔物结构、和一个或多个形成共价键的反应基团。在某些实施方案中，所述能够直接地或间接地键合至基底表面的部分是特异性结合部分，例如，如本文中定义的特异性结合对的一个成员。在其它实施方案中，所述能够直接地或间接地键合至基底表面的部分包括形成共价键的反应基团。
合适的形成共价键的反应基团可以包括芳族基团，例如，酚基。在某些实施方案中，所述芳族基团是酪胺或酪胺衍生物。在其它实施方案中，所述芳族基团是胸腺嘧啶或胸腺嘧啶衍生物。在所述一个或多个形成共价键的反应基团是芳族基团的情况下，在某些实施方案中，所述芳族基团可以包括多个在芳族环上的供电子的取代基(包括烷基和氧基烷基)和不饱和系统。
可以基于与其一起使用的能产生(或释放)活化剂的特定实体来选择形成共价键的反应基团，反之亦然。例如，在能产生(或释放)活化剂的实体是过氧化物酶缀合物(例如，HRP缀合物)或能够产生自由基(其导致在酚基和另一个形成共价键的反应基团之间的共价键形成)的其它实体的情况下，可以选择酚基。但是，能够产生(或释放)活化剂的实体和形成共价键的反应基团的其它组合是本领域已知的，且这可以与公开的方法和组合物结合使用。例如，一个或多个糖苷键可以与糖苷酶缀合物结合地用作形成共价键的反应基团，所述糖苷酶缀合物能够切割所述糖苷键以暴露醛基，所述醛基又可以与形成氨基或酰肼共价键的反应基团形成共价键。
包含形成共价键的反应基团的分子可以包括单个参与反应基团或多个参与反应基团。在包含形成共价键的反应基团的分子包括多个形成共价键的反应基团的情况下，所述分子中的形成共价键的反应基团的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
在某些实施方案中，所述包含形成共价键的反应基团的分子是共聚物，所述共聚物含有具有高浓度的形成共价键的反应基团的聚合物单元。例如，在某些实施方案中，使用这样的共聚物：其中含有形成共价键的反应基团的聚合物单元与不合有形成共价键的反应基团的聚合物单元之比是至少1：20、至少1：10、至少1：4、至少1：3、至少1：2、至少1：1、至少2：1、至少3：1、至少4：1、至少5：1、至少6：1、至少7：1、至少8：1、至少9：1或至少10：1。
在某些实施方案中，用多个聚合物官能化根据本公开内容的基底，所述聚合物包括酚亚基和羧酸亚基，例如，酪氨酸-谷氨酸共聚物或酪氨酸-天冬氨酸共聚物。
在某些实施方案中，用多个分子(例如，聚合物)官能化基底表面，所述分子包括多个第1形成共价键的反应基团(例如，酚基)，后者能够与本文所述的接头分子(或适当地官能化的可检测的标记)形成共价键。另外，所述分子可以包括多个第2基团，所述基团能够与本文所述的捕获探针缀合。这些第2基团可以是在化学缀合中常用的官能团的特异性对之一的成员，而捕获探针包括用于形成所述化学缀合的对的其它成员。这样的用于形成化学缀合的官能团的特异性对是本领域已知的。这样的对的一些例子是与NHS酯配对的氨基、与马来酰亚胺基团配对的巯基、与醛基配对的肼衍生物等。以此方式，可以如下用形成共价键的反应基团和捕获探针二者官能化基底表面，所述形成共价键的反应基团可用于与接头分子(或适当地官能化的可检测的标记)形成共价键：将所述捕获探针缀合至包含形成共价键的反应基团的分子上，例如，不同于经由合适的缀合化学将捕获探针直接缀合至基底表面上。
包含形成共价键的反应基团(其适合用于缀合至基底表面以提供官能化的基底表面)的分子可以具有下式(I)所示的结构：
其中：
波浪线代表与表面的连接点；
m和n是独立地选自0和1的整数；
p是等于0或更大的整数，前提条件是，当n是0时，那么p不是0；
q是选自0和1的整数；
L1选自未被取代的亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基、被取代的含有杂原子的亚烷基、未被取代的亚烯基、被取代的亚烯基、含有杂原子的亚烯基、被取代的含有杂原子的亚烯基、未被取代的亚芳基、被取代的亚芳基、亚杂芳基(heteroarylene)、被取代的亚杂芳基和聚合的接头；
M1和M2的每个实例独立地选自键、未被取代的亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基、被取代的含有杂原子的亚烷基、未被取代的亚烯基、被取代的亚烯基、含有杂原子的亚烯基、被取代的含有杂原子的亚烯基、未被取代的亚芳基、被取代的亚芳基、亚杂芳基和被取代的亚杂芳基；
W1的每个实例选自亚烷基、亚芳基、含有杂原子的亚烷基和亚杂芳基，前提条件是，W1被包括选自烯烃、芳基、叠氮化物和α，β-不饱和羰基的部分的基团取代；且
D是选自下述的末端基团：H、未被取代的烷基、被取代的烷基、含有杂原子的烷基、被取代的含有杂原子的烷基、未被取代的烯基、被取代的烯基、含有杂原子的烯基、被取代的含有杂原子的烯基、未被取代的芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基，其中D任选地被包括选自烯烃、芳基、叠氮化物和α，β-不饱和羰基的部分的基团取代。
例如，在式(I)的某些实施方案中，W1具有下述结构
Figure BDA0000390127220000291
其中：
X1是-CH-或-N-；
M3是选自下述的接头部分：亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基和被取代的含有杂原子的亚烷基；
L2是接头，其可以是键(即，直接键)，或可以选自亚烷基、亚烯基和亚芳基，其中的任一个可以是被取代的或未被取代的，且可以含有一个或多个杂原子；
Ar1是包括至少一个供电子的取代基的芳族部分，且其可以进一步被一个或多个取代基取代，可以包括一个或多个杂原子，且可以包括2个或更多个稠合的芳族环；且
R1是选自下述的不饱和部分：亚烷基、被取代的亚烷基、亚烯基、被取代的亚烯基，
Figure BDA0000390127220000301
其中：
R3选自OH和NH2；
n1选自0、1、2、3和4；
每个R4独立地选自H、烃基、被取代的烃基、含有杂原子的烃基、被取代的含有杂原子的烃基和官能团；
α、β和γ是任选的键，前提条件是，要么β存在，要么α和γ存在；
A和B独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯烃和官能团，或者A和B选自碳和氮且一起形成环；
Y是CRa或N(如果γ存在)和C(=O)、C(Ra)2、NRa、S和O(如果γ不存在)；
X是CRa或N；
Z是CRa或N，前提条件是，如果Z是N，那么B不存在；
R2是O、C(Ra)2或NRa(如果α存在)和C(Ra)3、N(Ra)2、SRa或ORa(如果α不存在)；
V选自CRa、N、S和O，前提条件是，如果V是S或O，那么A不存在；且
Ra选自H、烃基、被取代的烃基、含有杂原子的烃基和被取代的含有杂原子的烃基。
例如，在某些实施方案中，W1是氨基酸诸如酪氨酸(即，被芳烷基取代且具有羰基的亚杂烷基)。在某些实施方案中，M2是键或亚烷基接头。
例如，在式(I)的某些实施方案中，D是氨基酸诸如酪氨酸。还例如，D具有下述结构
其中M3、R1和Ar1如上面所定义。
例如，在式(I)的某些实施方案中，L1是聚合的接头部分。这类的例子包括聚(乙烯亚胺)和聚(烯基氧化物)接头部分，诸如聚(环氧甲烷)(即，(-OCH2-)n)、聚(环氧乙烷)(即，(-OCH2CH2-)n)、聚(环氧丙烷)(即，(-OCH2CH(CH3)-)n)等。聚合的连接部分的其它例子包括聚(氨基酸)、聚(糖)和聚(核酸)。在L1是聚合的连接部分的情况下，L1的分子量可以是在约100Da至约100,000Da之间，或在约100Da至10,000Da之间，或在约100Da至1,000Da之间。在某些实施方案中，L1具有块状特征。例如，L1可以包括2、3、4或更多块任意大小的上述实施例聚合部分。在其它实施方案中，L1不是聚合部分，也就是说，它不具有可鉴别的重复部分。这样的L1基团的例子包括氨基酸(例如，酪氨酸)。
例如，在式(I)的某些实施方案中，M1和M2是含有选自下述基团的部分的连接部分：烷基、酰胺基、醚基、酯基和它们的组合。例子包括：-(CH2)n-C(=O)-NH-、-(OCH2CH2)n-C(=O)-NH-、-C(=O)-NH-CH2CH2-(OCH2CH2)n-C(=O)-NH-、-C(=O)-NH-(CH2)n-C(=O)-NH-等，其中n是等于或大于0的整数。
还例如，在某些实施方案中，Ar1具有下述结构
Figure BDA0000390127220000311
其中
A、D、E、G和J选自C-R和N，其中每个R独立地选自H、烷基、烯基、芳基、含氧的取代基和含氮的取代基，
前提条件是，任意2个邻近的R基团可以一起形成环，所述环任选地进一步被取代且任选地进一步含有杂原子。在某些实施方案中，A、D、E、G和J中的不超过1个、或不超过2个、或不超过3个、或不超过4个是N。
还例如，在某些实施方案中，Ar1具有下述结构
Figure BDA0000390127220000321
其中R1-R5中的每一个独立地选自H、烷基、烯基、芳基、羟基、氨基、烷氧基、单烷基取代的氨基、二烷基取代的氨基和酰氨基。
在某些实施方案中，R3选自H、烷基、烯基、氨基、烷氧基、烷基取代的氨基、酰氨基和芳基；且R1、R2、R4和R5中的至少一个是羟基、氨基、烷氧基、烷基取代的氨基或酰氨基。在某些这样的实施方案中，R1、R2、R4和R5中的至少一个是羟基。
除了包含形成共价键的反应基团的分子以外，根据本公开内容的官能化的基底还可以包括一个或多个与其结合的靶标特异性的捕获探针。参见，例如，图1，它解释了用多个包含形成共价键的反应基团的分子和靶标特异性的捕获探针官能化的基底。这些靶标特异性的捕获探针可以具有多种结构，前提条件是，它们能够在合适的反应条件下特异性地结合目标靶分子或其它分析物。例如，在靶分子是核酸的情况下，合适的靶标特异性的捕获探针可以是这样的核酸分子：其具有与靶核酸分子的一个区域的序列互补性区域，例如，实质的或绝对的序列互补性区域。在靶分子是蛋白或其片段的情况下，合适的靶标特异性的捕获探针可以是能够特异性地结合靶分子的抗体。能够实现特异性相互作用的其它结合成员是本领域已知的，并且因此使用标准技术可以为特定靶分子或目标分析物容易地鉴别和制备合适的靶标特异性的捕获探针。
在根据本公开内容的官能化的基底包括靶标特异性的捕获探针和包含形成共价键的反应基团的分子的情况下，这两类分子可以分布在基底表面上，使得它们彼此靠近地定位。在某些实施方案中，每单位面积包含形成共价键的反应基团的分子与靶标特异性的捕获探针之比为至少1：20、至少1：10、至少1：5、至少1：1、至少2：1、至少3：1、至少4：1、至少5：1、至少6：1、至少7：1、至少8：1、至少9：1或至少10：1。
可检测的标记
存在多种本领域已知的可检测的标记，它们可以与公开的方法和组合物结合使用。这些包括、例如，荧光颗粒、化学发光颗粒和磁性颗粒。
在本文公开的方法和组合物的一个实施方案中，使用可检测的标记，其中所述可检测的标记是磁性颗粒，例如，磁性纳米颗粒或微米颗粒。磁性颗粒包括，例如，磁珠或由磁性材料造成的其它小物体，所述磁性材料例如铁磁性材料、亚铁磁性材料、顺磁性材料或超顺磁性材料。在某些实施方案中，所述磁性颗粒包括具有在约10nm至约100μm范围内的直径的氧化铁(Fe2O3和／或Fe3O4)。磁性纳米颗粒可从例如德国BergischGladbach的Miltenyi Biotec Corporation得到。这些是由包衣的单域氧化铁颗粒制成的相对较小的颗粒，直径通常在约10至约100nm的范围内。磁性颗粒还可以由嵌入聚合物基质(诸如聚苯乙烯)中的磁性纳米颗粒制成。这样的颗粒可以具有约1至约5μm的直径。这类颗粒可从InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA得到。磁性颗粒的其它例子包括在下述文献中描述的那些：Baselt等人，Biosens.Bioelectron.，13,731-739(1998)；Edelstein等人，Biosens.Bioelectron.，14,805-813(2000)；Miller等人，J.of Mag.Magn.Mater.，225,138-144(2001)；Graham等人，J.Appl.Phys.，91,7786-7788(2002)；Ferreira等人.J.Appl.Phys.，93,7281-7286(2003)；和美国专利申请公开号2005／0100930(2005年5月12日公开)。
在某些实施方案中，与本公开内容结合使用的可检测的标记(例如，磁性或非磁性颗粒)可以具有约100nm至约5μm(例如，约200nm至约4μm、约300nm至约3μm、约400nm至约2μm、或约500nm至约1μm)的直径。
合适的可检测的标记可以是使用显微术系统可检测的标记，所述显微术系统可以利用或不利用所述可检测的标记的特异性地可检测的特征，诸如荧光或磁场。例如，在某些实施方案中，合适的可检测的标记可以仅仅基于它的大小而通过光学显微术系统检测到。这可以是这样的情况：例如，其中使用具有0.1μm或更大(例如，0.5μm或更大)的直径的可检测的颗粒。
用于与公开的方法和组合物结合使用的可检测的标记颗粒包括用分子官能化的表面，所述分子与所述表面结合。在某些实施方案中，所述可检测的标记颗粒用本文所述的包含形成共价键的反应基团的分子官能化。参见，例如，图2、4、8和9。在其它实施方案中，所述可检测的标记颗粒用能够特异性地结合接头分子结合部分的分子官能化。参见，例如，图1(c)。本文所述的官能化的可检测的标记结合部分和接头分子结合部分可以包括前文定义的特异性结合对的成员。
在某些实施方案中，适合用于与公开的方法和组合物结合使用的可检测的标记颗粒包括用包含形成共价键的反应基团的分子官能化的表面，其中所述分子具有与上面在官能化的基底表面的背景下讨论的(例如，如式(I)所示的)那些类似或相同的结构。在这样的实施方案中，式(I)的波浪线代表与可检测的标记颗粒的共价连接。
在其它实施方案中，适合用于与公开的方法和组合物结合使用的可检测的标记颗粒包括用具有式(II)结构的分子官能化的表面：
Figure BDA0000390127220000341
其中
L1如上面关于式(I)所定义；
U1是特异性结合对的一个成员(例如，特异性结合对的第一个或第二个成员)或形成共价键的反应基团；且
波浪线代表与所述可检测的标记颗粒的共价连接。
在某些实施方案中，U1选自生物素部分、核酸序列、抗原、抗体、半抗原或抗原、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素部分、糖部分和凝集素部分。
在某些实施方案中，适合用于与公开的方法和组合物结合使用的可检测的标记颗粒包括用具有式(III)结构的分子官能化的表面：
其中
L1和
D如上面关于式(I)所定义，且
波浪线代表与所述可检测的标记颗粒的共价连接。
接头分子
本公开内容提供了用于与本文所述的组合物、方法和试剂盒结合使用的接头分子。这些接头分子(如例如图1所示)包括至少一个能够在以后形成共价键的特异性结合部分或官能团(其在本文中被称作“接头分子结合部分”，例如，如本文中定义的特异性结合对的一个成员)和至少一个如本文中定义的形成共价键的反应基团。根据本公开内容的接头分子被构造成与本文所述的官能化的基底和一种或多种可检测的标记一起使用。因此，所述接头分子的接头分子结合部分被构造成与本文所述的合适的官能化的可检测的标记特异性地结合或形成一个或多个共价键，且所述形成共价键的反应基团被构造成与连接至本文所述的基底表面上的分子的形成共价键的反应基团形成共价键。参见，例如，图1(c)，该图解释了一种结合复合物，其中所述接头分子的结合部分结合至可检测的标记，后者用所述可检测的标记的结合部分官能化。另外，所述接头分子的形成共价键的反应基团与固定化在基底表面上的分子的形成共价键的反应基团形成共价键。如证实的，这样的结合复合物可以导致可检测的标记经由多个锚定连接固定化在基底表面上。
类似于如前文所述的用于官能化基底表面或可检测的标记的分子，接头分子可以具有多种结构。所述接头分子可以是具有多种合适结构中的任一种的双功能或多功能试剂。例如，接头分子可以是直链或树枝状，且可以包括一个或多个与所述分子的功能部分连接的间隔物。合适的间隔物可以具有多种结构，只要它们能够相对于接头分子结合部分有效地定位所述分子的各个功能部分，例如，形成共价键的反应基团。合适的间隔物可以包括，例如，聚合物(例如，基于PEG的聚合物)；烷基等。可以调节间隔物部分(或所述接头分子的其它合适部分)的长度，例如，考虑到要使用的可检测的标记的大小和／或要形成的靶标结合复合物的长度和／或大小(例如，捕获探针、靶标或目标分析物、标记探针和能产生(或释放)活化剂的实体的长度和／或大小)。在一个实施方案中，例如，在所述接头分子包括被间隔物隔开的生物素和酪胺的情况下，所述间隔物包括大于10的原子数目。
形成共价键的反应基团在所述接头分子中的相对位置可以变化，只要它们会相对于接头分子结合部分有效地定位，以提供与官能化的可检测的标记的结合以及与官能化基底表面的分子的共价键形成。例如，在某些实施方案中，包含形成共价键的反应基团的接头分子包括相对于接头分子结合部分而言在末端位置处的形成共价键的反应基团，例如，如图1所示。这样的实施方案还可以包括一个或多个形成共价键的反应基团，所述反应基团位于所述分子的末端端部和接头分子结合部分之间。
在其它实施方案中，所述接头分子不包括位于末端的形成共价键的反应基团，而是包括一个或多个位于所述分子的末端端部和接头分子结合部分之间的形成共价键的反应基团。
在某些实施方案中，所述接头分子不具有天然存在的分子(例如，天然存在的核酸或蛋白分子)的结构。在某些实施方案中，所述接头分子的形成共价键的反应基团不具有天然存在的核酸或蛋白分子的形成共价键的反应基团的结构。例如，在某些实施方案中，所述形成共价键的反应基团是除了酪氨酸和胸腺嘧啶以外的反应基团。
在某些实施方案中，所述接头分子包括聚合的结构，例如，聚合间隔物结构。在某些这样的实施方案中，所述形成共价键的反应基团包括芳族环结构。在某些实施方案中，合适的接头分子包括接头分子结合部分、聚合间隔物结构、和一个或多个形成共价键的反应基团。形成共价键的反应基团可以包括芳族基团，例如，酚基。在某些实施方案中，所述芳族基团是酪胺或酪胺衍生物。在其它实施方案中，所述芳族基团是胸腺嘧啶或胸腺嘧啶衍生物。
在所述一个或多个形成共价键的反应基团是芳族基团的情况下，在某些实施方案中，所述芳族基团可以包括多个在芳族环上的供电子的取代基(包括烷基和氧基烷基)和不饱和系统。
与基底表面的官能化一样，可以基于与其一起使用的能产生(或释放)活化剂的特定实体来选择用于接头分子中的形成共价键的反应基团，反之亦然。例如，在能产生(或释放)活化剂的实体是过氧化物酶缀合物(例如，HRP缀合物)或能够产生自由基(其导致在酚基和另一个形成共价键的反应基团之间的共价键形成)的其它实体的情况下，可以选择酚基。能够产生(或释放)活化剂的实体和形成共价键的反应基团的其它组合是本领域已知的，且这可以与公开的方法和组合物结合使用。例如，一个或多个糖苷键可以与糖苷酶缀合物结合地用作形成共价键的反应基团，所述糖苷酶缀合物能够切割所述糖苷键以暴露醛基，所述醛基又可以与形成氨基或酰肼共价键的反应基团形成共价键。
所述接头分子可以包括单个参与反应基团或多个参与反应基团。在所述接头分子包括多个形成共价键的反应基团的情况下，所述分子中的形成共价键的反应基团的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
在某些实施方案中，所述接头分子是共聚物，所述共聚物含有具有高浓度的形成共价键的反应基团的聚合物单元。例如，在某些实施方案中，使用这样的共聚物：其中含有形成共价键的反应基团的聚合物单元与不含有形成共价键的反应基团的聚合物单元之比是至少1：4、至少1：3、至少1：2、至少1：1、至少2：1、至少3：1、至少4：1、至少5：1、至少6：1、至少7：1、至少8：1、至少9：1或至少10：1。合适的接头分子可以包括单个接头分子结合部分(例如，特异性结合对的单个第1成员)，或多个接头分子结合部分(例如特异性结合对的多个第1成员)。在所述接头分子包括多个特异性结合部分的情况下，所述接头分子中的特异性结合部分的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。在某些实施方案中，所述接头分子是共聚物，所述共聚物含有具有高浓度的接头分子结合部分。例如，在某些实施方案中，提供了这样的共聚物：其中含有接头分子结合部分的单体单元与缺少接头分子结合部分的单体单元之比是至少1：4、至少1：3或至少1：2、至少1：1、至少2：1、至少3：1、至少4：1、至少5：1、至少6：1、至少7：1、至少8：1、至少9：1或至少10：1。
因此，应当理解，特定接头分子可以包括单个形成共价键的反应基团和单个接头分子结合部分、单个形成共价键的反应基团和多个接头分子结合部分、多个形成共价键的反应基团和多个接头分子结合部分(例如，多个酪胺分子和多个生物素分子)、或多个形成共价键的反应基团和单个接头分子结合部分。
连接分子可以具有如下面式(IV)所示的结构：
其中：
L1、W1、M1、M2、D、n、p和q如在式(I)中所述；且
U1是特异性结合对的第一成员或如上面关于式(II)所定义的形成共价键的反应基团。
在某些实施方案中，L2的每个实例和L1的每个实例独立地选自C1-C24亚烷基、含有杂原子的C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、聚烯烃和聚(环氧烷烃)，其中的任一个可以是被取代的或未被取代的。
在某些实施方案中，U1选自生物素部分、核酸序列、抗原、抗体、半抗原、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素部分、糖部分、凝集素部分和酶或脱辅酶。
在某些实施方案中，U1是生物素部分，使得所述接头分子具有式(IVa)的结构：
Figure BDA0000390127220000382
例如，在某些实施方案中，在式(I)或(IV)中，D是＊-M3-Ar1，其中Ar1是4-羟基苯基，且M3是被取代的含有杂原子的亚烷基(即，-C(=O)NH-CH2-CH2-)。此外，p是0，且m和n二者都是1。此外，L1是-(CH2)5-，且M1是-(CH2)4-C(=O)NH-。可替换地，L1是-CH2CH2-(OCH2CH2)n1-，其中n1是1-30的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30，且其它变量如前所述。
还例如，在某些实施方案中，在式(I)或(IV)中，D是＊-M3-Ar1，其中Ar1是4-羟基苯基，且M3是被取代的含有杂原子的亚烷基(即，-C(=O)NH-CH(CO2H)-CH2-)。此外，p是0，且m和n二者都是0。可替换地，m和n二者都是1，L1是-NH-C(=O)-CH2CH2-，且M1是-C(=O)NH-(CH2CH2O)m1-CH2CH2-，其中m1是1-30的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30。
还例如，在某些实施方案中，M3含有杂环部分，诸如吡咯烷酮部分。例如，D是＊-M3-Ar1，其中Ar1是4-羟基苯基，且M3是
此外，p是0，且m和n二者都是1。此外，L1是-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-NH-C(=O)-，且M1是-C(=O)NH-(CH2CH2O)m1-CH2CH2-，其中n1和m1如上所述。
还例如，在某些实施方案中，M1是-NH-C(=O)-(CH2)3-O-(CH2)4-O-(CH2)3-，且其它变量如前所述。
在一个实施方案中，根据本公开内容的接头分子是通常如在图3中所示的生物素-酪胺缀合物，其中生物素是接头分子结合部分，且酪胺是形成共价键的反应基团。在一个实施方案中，根据本公开内容的生物素-酪胺缀合物具有如下面式(V)提供的结构：
在另一个实施方案中，根据本公开内容的生物素-酪胺缀合物具有如下面式(VI)提供的结构：
Figure BDA0000390127220000402
应当指出，可以调节上述分子的连接特异性结合部分(例如，生物素部分)和形成共价键的反应基团(例如，酪胺部分)的接头部分的长度，以提供在特异性结合部分和形成共价键的反应基团之间具有更大或更小距离的接头分子。
在某些实施方案中，根据本公开内容的接头分子包括一个或多个具有表4(在下文中提供)所示结构的形成酚共价键的反应基团。在某些实施方案中，接头分子包括一个或多个特异性结合部分(例如一个或多个生物素部分)。
靶分子和目标分析物
本公开内容的组合物、方法和试剂盒可以与多种靶分子或其它目标分析物中的任一种的定性和／或定量检测结合使用，所述其它目标分析物例如肽、蛋白、核酸、病毒、抗体或其片段(包括单链抗体、Fab等)、完整细胞、细胞组分、有机和无机小分子或它们的组合。感兴趣的蛋白靶标包括，例如，细胞表面受体、信号转导因子和激素。感兴趣的核酸靶标包括，例如，DNA和RNA靶标。感兴趣的细胞靶标包括，例如，哺乳动物细胞(特别是人细胞)、干细胞和细菌细胞。
可检测的标记和／或接头分子的靶标定位锚定
上述组分可以用于检测样品中的目标靶分子或其它分析物的存在、缺失和／或量的方法中。
使用接头分子检测官能化的可检测的标记
在图1中一般地描绘了根据本公开内容的检测方法的一个实施方案。在该实施方案中，在反应混合物中，将官能化的基底与疑似含有目标靶分子或其它分析物的样品相组合。所述官能化的基底包括至少一个靶标特异性的捕获探针和多个包括第1形成共价键的反应基团的分子。可以调节反应条件的严谨性，并且可以使用一个或多个洗涤步骤将目标靶分子或其它分析物的非特异性结合最小化。这可以如下实现：例如，调节洗涤条件的pH、温度和／或盐浓度。
向上述的反应混合物中，加入一个或多个标记探针。术语“标记探针”在本文中用于表示具有第1特异性结合部分和第2特异性结合部分的双功能分子，所述第1特异性结合部分当在合适的反应条件下与目标靶分子或其它分析物接触时能够特异性地结合所述目标靶分子或其它分析物的至少一部分，所述第2特异性结合部分当在合适的反应条件下与能产生(或释放)活化剂的实体接触时能够特异性地结合所述实体。可以调节反应条件的严谨性，并且可以使用一个或多个洗涤步骤将标记探针的非特异性结合最小化。
还将能产生(或释放)活化剂的实体加入所述反应混合物中。在某些实施方案中，所述能产生(或释放)活化剂的实体是酶缀合物。本文中使用的术语“酶缀合物”表示这样的酶：其能够催化第1形成共价键的反应基团和第2形成共价键的反应基团之间的共价键形成，和／或活化第1形成共价键的反应基团和第2形成共价键的反应基团中的一个或多个进行共价键形成，其中所述酶与如本文所述的能够特异性地结合标记探针的结合部分连接。可以基于第1和第2形成共价键的反应基团的化学身份和／或特征来选择适合用于酶缀合物的酶。类似地，可以基于所述酶的身份和／或特征来选择第1和第2形成共价键的反应基团。能够催化第1和第2形成共价键的反应基团之间的共价键形成和／或活化第1形成共价键的反应基团和第2形成共价键的反应基团中的一个或多个进行共价键形成的酶的非限制性例子包括，例如，过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)、糖苷酶和磷酸酶(例如，碱性磷酸酶)。
当靶分子存在于样品中时，在合适的反应条件下，通过如下形成的一系列连接而产生如图1(a)所示的结合复合物，其中能产生(或释放)活化剂的实体连接至基底表面：靶标特异性的捕获探针与靶分子或目标分析物结合，靶分子或目标分析物与标记探针结合，和标记探针与能产生(或释放)活化剂的实体结合。可以调节反应条件的严谨性，并且可以使用一个或多个洗涤步骤将能产生(或释放)活化剂的实体的非特异性结合最小化。
将如本文所述的多个接头分子加入所述反应混合物中，并提供合适的反应条件，使得能产生(或释放)活化剂的实体催化被固定化在基底表面上的分子的第1形成共价键的反应基团和所述接头分子的第2形成共价键的反应基团之间的共价键形成，和／或活化第1形成共价键的反应基团和第2形成共价键的反应基团中的一个或多个进行共价键形成。在某些实施方案中，合适的反应条件可能需要加入一种或多种缓冲液和／或酶底物。例如，在能产生(或释放)活化剂的实体是包括辣根过氧化物酶(HRP)的酶缀合物的情况下，将合适的含有过氧化物的缓冲液加入所述反应混合物中，以实现共价键形成反应。作为能产生(或释放)活化剂的实体的靶标定位作用的结果，所述接头分子以靶标定位方式共价地结合至基底表面，如例如在图1(b)和图3(b)中所示。这导致接头分子结合部分的靶标定位沉积，这会提供多个“钩”用于随后以靶标定位的方式结合适当地官能化的可检测的标记，并实现所述靶标结合的单个空间上分离的位点的鉴别。
可检测的标记(其用具有对接头分子结合部分特异性的结合部分的分子官能化)的加入会产生结合复合物，如例如在图1(c)和图3(c)中所示，即，这样的结合复合物：其中多个独立键连接用于将所述可检测的标记锚定至基底表面，在捕获于所述基底表面上的靶分子附近。可以调节反应条件的严谨性，并且可以使用一个或多个洗涤步骤将官能化的标记的非特异性结合最小化。
一旦将所述可检测的标记以靶标定位方式锚定至基底表面，可以利用一个或多个检测系统来检测和／或显现所述可检测的标记的位置和／或量，后者指示固定化的靶分子的位置和／或量。用于检测锚定的可检测的标记的特定方法取决于使用的可检测的标记的类型。例如，在所述可检测的标记是荧光颗粒的情况下，可以使用一种或多种基于荧光的检测系统。在所述可检测的标记是磁性颗粒的情况下，可以使用一种或多种磁性传感器。
在某些实施方案中，可以使用显微术系统检测锚定至基底表面的可检测的标记，所述显微术系统可以利用或不利用所述可检测的标记的特异性地可检测的特征，诸如荧光或磁场。例如，在某些实施方案中，锚定至基底表面的可检测的标记可以仅仅基于它的大小而通过光学显微术系统检测到。这可以是这样的情况：例如，其中使用具有0.5μm或更大的直径的可检测的颗粒。
不使用接头分子检测官能化的可检测的标记
在另一个实施方案中，可以使用一种替代性检测方法。该方法一般地描述在图2中，具体实施例提供在图4中。象在上述方法中一样，在反应混合物中将官能化的基底与疑似含有靶分子或目标分析物的样品相组合。所述官能化的基底包括至少一个靶标特异性的捕获探针和多个包括第1形成共价键的反应基团的分子。可以调节反应条件的严谨性，并且可以使用一个或多个洗涤步骤将靶分子或目标分析物的非特异性结合最小化。
如上所述，向上述的反应混合物中，加入一个或多个标记探针。可以调节反应条件的严谨性，并且可以使用一个或多个洗涤步骤将标记探针的非特异性结合最小化。
还如上所述，向所述反应混合物中加入能产生(或释放)活化剂的实体，例如，酶缀合物。当靶标存在于样品中时，在合适的反应条件下，通过如下形成的一系列连接而产生如图2(a)所示的结合复合物，其中能产生(或释放)活化剂的实体连接至基底表面：靶标特异性的捕获探针与靶分子或目标分析物结合，靶分子或目标分析物与标记探针结合，和标记探针与能产生(或释放)活化剂的实体结合。可以调节反应条件的严谨性，并且可以使用一个或多个洗涤步骤将能产生(或释放)活化剂的实体的非特异性结合最小化。
作为使用具有第2形成共价键的反应基团的接头分子的替代，使用被具有第2形成共价键的反应基团的分子官能化的可检测的标记，如图2所示。
如以上所讨论的，在某些实施方案中，合适的反应条件可能需要加入一种或多种缓冲液。例如，在能产生(或释放)活化剂的实体是包括HRP的酶缀合物的情况下，将合适的含有过氧化物的缓冲液加入所述反应混合物中，以促进共价键形成反应。作为所述酶的靶标定位作用的结果，所述可检测的标记以靶标定位方式共价地结合至基底表面，如例如在图2(b)和图4(b)中所示。
空间上分离的、可单独检测的靶分子位点
在某些实施方案中，调节一个或多个反应条件参数，从而促进空间上分离的、可单独检测的靶分子位点的沉积。换而言之，调节一个或多个反应条件参数，使得单个或非常小数目的靶分子(例如，小于约20个、小于约10个、或小于约5个)存在于基底表面上的位点处。如前文所述的，一种或多种可检测的标记以靶标定位方式结合在每个单独的靶分子位点处，以实现单个靶位点的检测。可以进行调节以实现空间上分离的单个靶位点的检测的参数包括：靶标特异性的捕获探针的靶标捕获效率；酶活性水平；所述官能化的基底表面、所述可检测的标记和所述接头分子中的一个或多个的形成共价键的反应基团的反应性水平；在官能化的可检测的标记上的特异性结合成员的数目；和在官能化的可检测的标记上的形成共价键的反应基团的数目。
在某些实施方案中，可以调节样品中的靶分子的浓度，或者可以以其它方式以促进空间上分离的、可单独检测的靶位点的形成的浓度提供靶分子。例如，在某些实施方案中，调节靶分子浓度，以在样品中提供这样的靶分子浓度：其导致以每0.2μm2基底表面不超过1个位点的密度形成靶位点。
在某些实施方案中，可以调节反应参数，使得单个可检测的标记(例如，单个磁性颗粒)结合在每个靶分子位点处。因此，在某些实施方案中，如上所述的靶分子位点可以包括不超过1个靶分子和不超过1个可检测的标记。
交联以强化和／或稳定化结合复合物
一旦已经在2个或多个本文所述的实体之间形成结合复合物，通过引入一种或多种交联剂，可以强化和／或稳定化结合复合物。可能合乎需要的是，例如，在引入标记探针之前，稳定化经由靶标特异性的捕获探针结合至基底表面上的靶分子或目标分析物。类似地，可能合乎需要的是，在官能化的可检测的标记已经经由一种或多种接头分子结合至基底表面以后，稳定化形成的结合复合物。
通过引入共价键进行交联
可以引入交联剂以促进结合复合物的成员之间的共价键形成。共价键能量通常在300-400kJ／mol的范围内。共价键比受体和它的配体、蛋白和蛋白、或杂交的双链核酸之间的非共价结合相互作用强许多倍。
适合用于在参与结合复合物的分子内的基团或部分之间形成共价键的多种共价键形成反应是本领域已知的，包括铜催化的叠氮化物／炔烃[3+2]环加成“点击化学”、叠氮化物／DIFO(二氟代环辛炔)或不含铜的点击化学、叠氮化物／膦“Staudinger反应”、叠氮化物／三芳基膦“改进的Staudinger反应”和烯烃置换反应。这些共价键形成反应可以用于引入共价键，以稳定化和／或强化如上所述的结合复合物。本领域技术人员会认识到，这些反应中的一些反应，例如，铜催化的叠氮化物／炔烃[3+2]环加成，需要加入催化剂以催化结合对相互作用，而其它反应(诸如叠氮化物／DIFO反应)则不需要。
本领域中有多种试剂可以用于在杂交的核酸链之间、在核酸和蛋白之间、和在不同的蛋白分子之间交联。具有不同长度和官能团组合的交联剂是商购可得的。可替换地，可以设计和合成交联剂，以配合特定交联情形的需要。
例如，可以与本文公开的方法和组合物结合使用戊二醛，即已经被广泛地用于交联蛋白分子的较小同型双功能交联剂。
在另一个实施例中，使用补骨脂素，即一类通过光化学加成形成共价核酸加合物的光致突变化合物。初级反应是在DNA的胸苷的5，6双键与补骨脂素分子的4′，5′或3，4双键之间的环丁烷环形成。在4′，5′双键处的反应会产生呋喃侧单加成化合物，后者可以进一步与相反链上的侧接嘧啶在该位点处反应，以产生链间交联。Spielmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92,2345-2349(1995)。也参见，Okamoto等人，Org.Lett.3,925-7(2001)，该文献描述了从8-甲氧基补骨脂素合成含有补骨脂素的肽核酸(PNA)。含有在链末端处的补骨脂素单元的PNA会与互补的DNA形成稳定的双链体。还已经合成了具有额外官能团(functionality)的补骨脂素衍生物。例如，Saffran等人，Nucleic Acids Res.，16,7221-31(1988)描述了生物素化的补骨脂素(BPsor)的合成。BPsor会与DNA光反应以形成链间交联，同时提供生物素部分形式的额外结合官能团，后者然后可以与抗生蛋白链菌素分子结合。
还可以如在美国专利号6,800,768(2004年10月5日授权)中所述，完成杂交的核酸分子的交联，其中将非核苷的光活性的香豆素衍生物掺入核酸中以实现链间交联。
如在Pendergrast等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89,10287-10291(1992)中所述，还可以利用光交联来稳定化蛋白和核酸之间的结合复合物。具体地，Pedergrast等人通过2步操作将光可活化的交联剂掺入在蛋白内的单个氨基酸位点处，所述2步操作由定位诱变和随后的半胱氨酸-特异性的化学修饰组成。首先，使用定位诱变将独特的溶剂可接近的半胱氨酸残基引入在目标位置处。然后，用半胱氨酸特异性地异型双功能光可活化的交联剂(例如，4-叠氮基苯酰基溴)衍生化得到的蛋白。在确定的条件下，4-叠氮基苯酰基溴与具有独特的溶剂可接近的半胱氨酸残基的蛋白的反应会导致半胱氨酸残基的完全且高度选择性的衍生化，以产生形式[(4-叠氮基苯酰基)-Cys]蛋白的缀合物。然后形成蛋白-DNA复合物，并紫外辐照在蛋白-DNA复合物中引入共价交联剂。
所述交联剂可以作为单独的和独立的试剂来应用。可替换地，可以将交联官能团直接缀合至接头分子、捕获探针、标记探针、基底、可检测的标记等。通过在指定的时间点施加的输入诸如光、pH变化或特定化学试剂，可以根据需要活化交联官能团。另外，可以设计本文中公开的结合部分和／或接头分子，以使它们适合于选择的交联剂的应用。例如，核酸分子与靶标特异性的结合部分(包括蛋白，例如，抗体)的缀合，使得将这些结合部分与最初仅可应用于核酸的交联剂交联成为可能。相反，将蛋白或其它化学实体与靶标特异性的结合部分(包括核酸)缀合，使得将交联剂的选择拓宽至最初不可应用于核酸的那些交联剂成为可能。
实施例
实施例1：用形成共价键的分子官能化的基底上的靶标捕获
制备了2种硅晶片基底。通过用氨基烷基硅烷衍生化氧化硅晶片表面以在氧化硅表面上赋予氨基，用寡核苷酸捕获探针官能化第一种基底表面(命名为寡核苷酸芯片(Oligo chip))。然后使用含有被PEG间隔物隔开的马来酰亚胺基团和NHS酯基的双功能试剂，将氨基转化成马来酰亚胺基团。然后，经由马来酰亚胺基团，将具有末端巯基的寡核苷酸缀合至所述晶片。最后，用短PEG-巯基衍生物将未反应的马来酰亚胺基团帽化。
对于第二种基底表面(命名为W1芯片)，用寡核苷酸捕获探针缀合经过氨基烷基硅烷衍生化的相同硅晶片。所述缀合方法不同于第一种基底所用的方法，但是导致类似的寡核苷酸探针缀合程度。在该情况下，制备了具有末端氨基的寡核苷酸。随后通过与琥珀酸酐反应，将所述氨基转化成羧酸基团。然后通过碳二亚胺活化寡核苷酸上的末端羧酸基团，并缀合至基底表面上的氨基。随后，经由未被寡核苷酸缀合占用的氨基将酪氨酸-谷氨酸共聚物缀合至基底表面上，以提供基底表面固定化的形成共价键的反应基团。经由共聚物中的羧酸基团的碳二亚胺活化，进行酪氨酸-谷氨酸共聚物的缀合。以大约1酪氨酸：4谷氨酸部分的比例，制备酪氨酸-谷氨酸共聚物，且其具有约5-20kD的平均分子量。
在图10中，检查了2种表面的捕获模型靶标的捕获能力。以所述的浓度施用模型靶分子，所述模型靶分子具有与缀合在基底表面上的捕获探针互补的序列段。所述模型靶分子还含有第二段，该段具有与以后施用的寡核苷酸标记探针互补的序列。在捕获探针将靶标捕获在基底表面上以后，施加具有末端生物素部分的寡核苷酸标记探针，以与模型靶分子上的第二段杂交。然后施加抗生蛋白链菌素化的珠子(InvitrogenTM，1μm)，以结合被结合在模型靶标上的生物素化的标记探针。
在没有酶介导的接头分子的靶标定位沉积或可检测的标记的锚定的情况下，进行该实验。相应地，检测水平直接地反映了基底表面捕获靶分子的程度。如图10所示，寡核苷酸芯片和W1芯片表现出类似的捕获模型靶分子的能力。
实施例2：在有酶产生的活化剂存在下用包含形成共价键的反应基团的分子官能化的基底上的靶标捕获和接头分子的靶标定位沉积
图11显示了具有HRP介导的接头分子的靶标定位沉积的两种基底(寡核苷酸芯片和W1芯片)的检测水平。通过以所述的浓度使用由模型靶标寡核苷酸、生物素化的标记探针和抗生蛋白链菌素-HRP缀合物构成的预形成的靶标复合物，进行所述实验。这允许所述复合物被捕获探针捕获在基底表面上。然后，通过利用HRP的产生自由基的活性，将具有图13的结构A的接头分子共价地连接至基底表面上的酪氨酸部分。所以，将多个生物素部分沉积在固定化于基底表面上的靶分子附近，由此为可检测的标记提供多个靶标定位的结合位置。将两种基底表面与直径为大约1μm的磁性的抗生蛋白链菌素化的珠子(InvitrogenTM)一起温育，并确定特异性珠子结合的程度。结果显示在图11中，该图表明，用酪氨酸部分修饰的W1芯片具有比寡核苷酸芯片增强的检测灵敏度。
实施例3：具有增强的接头分子沉积的表面
如下所述制备和试验了多种基底，所述基底被修饰成包括不同的包含形成共价键的反应基团的分子。基底表面命名约定和官能化方案如下面表1所示。为了分析基底表面，进行了2个实验。在这些实验中，基底G是不具有高于在捕获寡核苷酸中存在的那些基团和在其上面的形成共价键的反应基团的对照基底。第一个实验测量了经修饰的基底表面的捕获模型靶分子的能力。以表2指示的不同浓度，施用模型靶标。用生物素化的寡核苷酸标记捕获的靶标，所述寡核苷酸具有与靶分子的一部分互补的序列。随后用抗生蛋白链菌素化的碱性磷酸酶标记经由靶分子捕获到基底表面上的生物素化的寡核苷酸标记探针，并通过磷酸对硝基苯酯(PNPP)的去磷酸化来定量。
以1：1000稀释度(Pierce Part#21324，最初2.8mg／mL)，加入在PBS·1％吐温中的抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶，并将平板摇动15min。用PBS·1％吐温洗涤芯片4次，包括在第三次洗涤后移动芯片在平板中的位置，以确保没有碱性磷酸酶存在于测定的下一步中。
将第1步的PNPP基底(Pierce Part#37621)加入每个芯片中，并将平板摇动精确30min。30min以后，将50μL2N NaOH加入每个孔中，以终止反应。使用去离子水作为空白，确定在每个芯片上面的溶液在405nm的吸光度。
该第一个实验的结果(显示在表2中)指示，每种经修饰的基底都能够成功地捕获模型靶分子，但是具有不同的水平。
表1
Figure BDA0000390127220000491
Figure BDA0000390127220000501
a 在用氨基硅烷衍生物官能化氧化硅基底表面以后，将一系列分子以特定顺序共价地结合至基底表面
b SA：琥珀酸酐Sigma Part#239690
c Oligo：具有5′胺基团的50聚体寡核苷酸；Oligo-10T=50聚体+10个3′胸腺嘧啶残基=具有5′胺基团的60聚体寡核苷酸
d 4-HPAA：4-羟基苯基乙酸Sigma Part#H50004
e PAMAM：聚酰氨基胺
f N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-3-(4-羟基苯基)丙烯酰胺的结构如下式(VII)所示：
表2
在405nm的紫外吸光度
Figure BDA0000390127220000503
第二个实验测量了经修饰的基底与含有酚基的接头分子在有HRP存在下形成共价键的能力。通过以所述的浓度使用由模型靶标寡核苷酸、生物素化的标记探针和抗生蛋白链菌素-HRP缀合物构成的预形成的靶标复合物，进行该实验。这允许所述复合物被互补捕获探针捕获在基底表面上。然后，通过利用HRP的产生自由基的活性，将具有图13的结构A的接头分子共价地连接至基底表面上的酚基或胸腺嘧啶基团。在HRP反应以后，用抗生蛋白链菌素化的碱性磷酸酶标记作为基底表面上的接头沉积的结果而存在于表面上的生物素部分，并通过磷酸对硝基苯酯的去磷酸化进行定量。
对芯片进行的测定条件总结在下面表3中。将芯片沉积在96孔板中。除了指明之外，加给芯片的所有体积都为100μL。将芯片在PBS·NaCl·0.1％吐温·sDNA13(其中，NaCl表示将额外的0.5M NaCl加入PBS缓冲液中，sDNA13表示牺牲的(sacrificial)DNA(10nM的50聚体寡核苷酸))中润湿10min。
将给定浓度的靶标复合物加给芯片，并将平板摇动30min。然后洗涤芯片3次。
将在SPB·NaCl·0.05％吐温中的具有图13的结构A的接头分子加给芯片，并使平板保持静止15min(即不摇动)。(SPB表示稳定的过氧化物缓冲液(Pierce Part#34062，NaCl表示将额外的0.5M NaCl加入SPB缓冲液中，在该溶液中使用的吐温是低过氧化物、低羰基的吐温20，Sigma AldrichPart#P6585)
用PBS·1％SDS洗涤芯片1次。然后将芯片在PBS·1％SDS中静置10min。
用PBS·1％吐温洗涤芯片5次，包括在第四次洗涤后移动芯片在平板中的位置，以确保没有SDS存在于测定的下一步中。
以1：1000稀释度(Pierce Part#21324，最初2.8mg／mL)，加入在PBS·1％吐温中的抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶，并将平板摇动15min。用PBS·1％吐温洗涤芯片4次，包括在第三次洗涤后移动芯片在平板中的位置，以确保没有碱性磷酸酶存在于测定的下一步中。
将第1步的PNPP基底(Pierce Part#37621)加入每个芯片中，并将平板摇动精确30min。30min以后，将50μL2N NaOH加入每个孔中，以终止反应。使用去离子水作为空白，确定在每个芯片上面的溶液在405nm的吸光度。
表3
Figure BDA0000390127220000521
如表4所示，在基底G(oligo)是不具有高于在捕获寡核苷酸中存在的那些基团和在其上面的形成共价键的反应基团的对照基底的情况下，用高于在捕获寡核苷酸中存在的那些基团和在其上面的额外形成共价键的反应基团修饰的基底显示出增加的酶介导的生物素化的接头分子在基底表面上的沉积。
表4
在405nm的紫外吸光度
Figure BDA0000390127220000522
使用磁珠作为可检测的标记，进行了选择的经修饰的基底表面的进一步试验，以确定检测限。具体地，使用图13(结构A)所示的接头分子和1μm抗生蛋白链菌素化的磁珠(InvitrogenTM)，试验了SA-8-T修饰的基底。在图12中提供的结果证实了在10fM范围内的检测限，这指示超过基底G(寡核苷酸芯片)的检测限的改进，所述基底G不具有除了在oligo捕获探针中存在的那些基团以外的额外共价键形成基团。
实施例4：接头分子的制备和试验
合成了多种包含形成共价键的反应基团的分子的接头，并测试了它们在HRP介导的共价键形成反应中与能够参与基底表面上的共价键形成反应的其它基团的反应性。使用图13部分A和B中描绘的并分别在下面式(VIII)和(IX)中提供的2种生物素-PEG间隔物结构之一，制备了具有不同的形成共价键的反应基团的接头分子。
Figure BDA0000390127220000531
在图14中描绘了18种选择的接头分子的酚环部分的化学结构。在下面表5中提供了连接分子的完整化学名称。化合物1、2和5是基于图13(A)中所示的生物素-PEG间隔物结构。化合物6-14和16-18是基于图13(B)中所示的生物素-PEG间隔物结构。化合物3、4和5不是合成的，而是基于图13(B)所示的结构的预言实施例。
表5
Figure BDA0000390127220000532
Figure BDA0000390127220000541
化合物1提供了一种基础接头分子结构，其基于经由PEG间隔物连接的酪胺环和生物素部分。化合物2是基于酪氨酸结构，所述酪氨酸结构具有与芳族环紧密靠近的游离羧酸。为了研究所述接头分子在酶介导的共价键形成反应中的反应性／效率，设计并合成了一系列具有不同电子性能的接头分子。接头分子3、4和5不是合成的，而是基于图4(B)中所示的结构来设计。一般而言，通过向芳族环添加供电子的取代基(这会增加芳族环的电子密度，并从而增加反应中心(即酚基或苯胺基)处的电子密度)，似乎会增加所述接头分子的反应性。接头分子3-6是基于苯甲酸。接头分子7-9是基于苯乙酸，后者使潜在地吸电子的酰胺基远离环结构。接头分子10-13分别是基于香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和肉桂酸。不希望受任何具体理论约束，接头分子10-13中的不饱和系统可以给环贡献电子密度，由此增加在反应中心处的反应性。由于反应中心和其它环-取代基的相对环位置也可以影响反应性，将接头分子3-13制备成包括在相对于其它取代基的不同环位置处的反应性酚中心。接头分子10和14、以及1和15提供了作为反应中心的酚基相对于苯胺基的直接对比。连接分子16、17和18是用于对比的“通配符”电子富集系统。
用上述的命名为SA-8-T的基底和命名为GT8-T的基底，在酶介导的共价键形成反应中试验了几种上述的接头分子，其中SA-8-T和GT-8-T二者的基底表面官能化方案如表6所示。
表6
Figure BDA0000390127220000542
Figure BDA0000390127220000551
a 在用氨基硅烷衍生物官能化氧化硅基底表面以后，将一系列分子以特定顺序共价地结合至基底表面
b oligo：具有5′胺基团的50聚体寡核苷酸
对SA8-T和GT8-T芯片进行的测定条件如上面关于表3所述。在下表7中提供了接头分子7、10、11、12、13、15(图14和表5)和具有图13的结构A的接头分子(在表中命名为B-T)在SA-8-T基底上的结果。在下表8中显示了对比接头分子B-T和接头分子10在SA-8-T芯片和GT-8-T芯片上的结果。
表7
Figure BDA0000390127220000552
表8
在纳摩尔水平的靶标复合物，每种上述的接头分子提供了可测量水平的靶标复合物检测，并且接头分子10也表现出在皮摩尔水平的可测量的检测。
尽管已经参照其具体实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当理解，可以做出多种变化且可以替换等同物，而不脱离本发明的真实精神和范围。另外，可以做出许多改进，以使特定情形、材料、物质组合物、方法、方法步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这样的改进意图在本文所附的权利要求的范围内。

Claims (99)

1.一种官能化的基底，其包括：
支持材料；
一个或多个靶标特异性的捕获探针，所述捕获探针结合至所述支持材料的表面；和
多个合成的非天然存在的分子，所述分子结合至所述支持材料的表面；
其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含芳族的形成共价键的反应基团，所述反应基团的存在浓度大于在天然存在的蛋白或核酸中存在的浓度。
2.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述芳族的形成共价键的反应基团中的一个芳族的形成共价键的反应基团位于所述合成的非天然存在的分子之一的暴露末端处。
3.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子既不含有酪氨酸，也不含有胸腺嘧啶。
4.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述官能化的基底每单位面积包含的形成共价键的反应基团的数目比在天然存在的蛋白或组织中存在的数目大。
5.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中与天然存在的蛋白或核酸的形成共价键的反应基团相比，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含具有更大反应性的形成共价键的反应基团。
6.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含具有比胸腺嘧啶和酪氨酸更大反应性的形成共价键的反应基团。
7.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述支持材料包含硅。
8.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含树枝状聚体结构。
9.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酪氨酸氨基酸。
10.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酚-甲酸共聚物。
11.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酚和氨基基团。
12.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含赖氨酸和酪氨酸氨基酸。
13.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酪胺或酪胺衍生物。
14.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含胸腺嘧啶或胸腺嘧啶衍生物。
15.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子是多肽，所述多肽包含的形成共价键的反应基团的存在浓度大于在天然存在的蛋白中存在的浓度。
16.根据权利要求1所述的官能化的基底，其中所述合成的非天然存在的分子是寡核苷酸，所述寡核苷酸包含的形成共价键的反应基团的存在浓度大于在天然存在的寡核苷酸中存在的浓度。
17.根据权利要求1所述的官能化的基底，所述基底包含多个靶标特异性的捕获探针，其中所述靶标特异性的捕获探针是寡核苷酸。
18.根据权利要求1所述的官能化的基底，所述基底包含多个靶标特异性的捕获探针，其中所述靶标特异性的捕获探针是多肽。
19.根据权利要求18所述的官能化的基底，其中所述多肽是抗体或其片段。
20.一种官能化的基底表面，其包含多个结合至基底表面的合成的非天然存在的分子，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个具有式(I)的结构：
Figure FDA0000390127210000021
波浪线代表与所述表面的连接点；
m和n是独立地选自0和1的整数；
p是等于0或更大的整数，前提条件是，当n是0时，那么p不是0；
q是选自0和1的整数；
L1选自未被取代的亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基、被取代的含有杂原子的亚烷基、未被取代的亚烯基、被取代的亚烯基、含有杂原子的亚烯基、被取代的含有杂原子的亚烯基、未被取代的亚芳基、被取代的亚芳基、亚杂芳基、被取代的亚杂芳基和聚合的接头；
M1和M2的每个实例独立地选自键、未被取代的亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基、被取代的含有杂原子的亚烷基、未被取代的亚烯基、被取代的亚烯基、含有杂原子的亚烯基、被取代的含有杂原子的亚烯基、未被取代的亚芳基、被取代的亚芳基、亚杂芳基和被取代的亚杂芳基；
W1的每个实例选自亚烷基、亚芳基、含有杂原子的亚烷基和亚杂芳基，前提条件是，W1被包含选自烯烃、芳基、叠氮化物和α，β-不饱和羰基的部分的基团取代；且
D是选自下述的末端基团：H、未被取代的烷基、被取代的烷基、含有杂原子的烷基、被取代的含有杂原子的烷基、未被取代的烯基、被取代的烯基、含有杂原子的烯基、被取代的含有杂原子的烯基、未被取代的芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基，其中D任选地被包含选自烯烃、芳基、叠氮化物和α，β-不饱和羰基的部分的基团取代。
21.根据权利要求20所述的官能化的基底表面，其中：
D具有下述结构
且
W1具有下述结构
Figure FDA0000390127210000032
其中：
X1是-CH-或-N-；
M3是选自下述的接头部分：亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基和被取代的含有杂原子的亚烷基；
L2是接头，其可以是键，或可以选自亚烷基、亚烯基和亚芳基，其中的任一个可以是被取代的或未被取代的，且可以含有一个或多个杂原子；
Ar1是包含至少一个供电子的取代基的芳族部分，且其可以进一步被一个或多个取代基取代，可以包括一个或多个杂原子，且可以包括2个或更多个稠合的芳族环；且
R1是选自下述的不饱和部分：亚烷基、被取代的亚烷基、亚烯基、被取代的亚烯基，
Figure FDA0000390127210000041
其中：
R3选自OH和NH2；
n1选自0、1、2、3和4；
每个R4独立地选自H、烃基、被取代的烃基、含有杂原子的烃基、被取代的含有杂原子的烃基和官能团；
α、β和γ是任选的键，前提条件是，要么β存在，要么α和γ存在；
A和B独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯烃和官能团，或者A和B选自碳和氮且一起形成环；
如果γ存在，Y是CRa或N，如果γ不存在，Y是C(=O)、C(Ra)2、NRa、S和O；
X是CRa或N；
Z是CRa或N，前提条件是，如果Z是N，那么B不存在；
如果α存在，R2是O、C(Ra)2或NRa，如果α不存在，R2是C(Ra)3、N(Ra)2、SRa或ORa；
V选自CRa、N、S和O，前提条件是，如果V是S或O，那么A不存在；且
Ra选自H、烃基、被取代的烃基、含有杂原子的烃基和被取代的含有杂原子的烃基。
22.根据权利要求21所述的官能化的基底表面，其中Ar1具有下述结构
Figure FDA0000390127210000051
其中
A、D、E、G和J选自C-R和N，其中每个R独立地选自H、烷基、烯基、芳基、含氧的取代基和含氮的取代基，前提条件是，任意2个邻近的R基团可以一起形成环，所述环任选地进一步被取代且任选地进一步含有杂原子。
23.根据权利要求21所述的官能化的基底表面，其中Ar1具有下述结构
Figure FDA0000390127210000052
其中R1-R5中的每一个独立地选自H、烷基、烯基、芳基、羟基、氨基、烷氧基、单烷基取代的氨基、二烷基取代的氨基和酰氨基。
24.根据权利要求23所述的官能化的基底表面，其中R3选自H、烷基、烯基、氨基、烷氧基、烷基取代的氨基、酰氨基和芳基；且R1、R2、R4和R5中的至少一个是羟基、氨基、烷氧基、烷基取代的氨基或酰氨基。
25.根据权利要求24所述的官能化的基底表面，其中R1、R2、R4和R5中的至少一个是羟基。
26.根据权利要求21所述的官能化的基底表面，其中L2选自C1-C24亚烷基、含有杂原子的C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、聚烯烃和聚(环氧烷烃)，其中的任一个可以是被取代的或未被取代的。
27.一种可检测的标记颗粒，其包含：
用多个合成的非天然存在的分子官能化的表面，所述分子结合至支持材料的表面；
其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含芳族的形成共价键的反应基团，所述反应基团的存在浓度大于在天然存在的蛋白或核酸中存在的浓度。
28.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述芳族的形成共价键的反应基团中的一个芳族的形成共价键的反应基团位于所述合成的非天然存在的分子之一的暴露末端处。
29.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子既不含有酪氨酸，也不含有胸腺嘧啶。
30.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述官能化的基底每单位面积包含的形成共价键的反应基团的数目比在天然存在的蛋白或组织中存在的数目大。
31.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中与天然存在的蛋白或核酸的形成共价键的反应基团相比，所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含具有更大反应性的形成共价键的反应基团。
32.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含具有比胸腺嘧啶和酪氨酸更大反应性的形成共价键的反应基团。
33.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含树枝状聚体结构。
34.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酪氨酸氨基酸。
35.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酚-甲酸共聚物。
36.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酚和氨基基团。
37.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含赖氨酸和酪氨酸氨基酸。
38.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酪胺或酪胺衍生物。
39.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含胸腺嘧啶或胸腺嘧啶衍生物。
40.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子是多肽，所述多肽包含的形成共价键的反应基团的存在浓度大于在天然存在的蛋白中存在的浓度。
41.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述合成的非天然存在的分子是寡核苷酸，所述寡核苷酸包含的形成共价键的反应基团的存在浓度大于在天然存在的寡核苷酸中存在的浓度。
42.根据权利要求27所述的可检测的标记颗粒，其中所述颗粒包含磁性材料。
43.一种可检测的标记颗粒，其包含用具有式(III)结构的分子官能化的表面：
Figure FDA0000390127210000071
其中
L1选自未被取代的亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基、被取代的含有杂原子的亚烷基、未被取代的亚烯基、被取代的亚烯基、含有杂原子的亚烯基、被取代的含有杂原子的亚烯基、未被取代的亚芳基、被取代的亚芳基、亚杂芳基、被取代的亚杂芳基和聚合的接头；
D是选自下述的末端基团：H、未被取代的烷基、被取代的烷基、含有杂原子的烷基、被取代的含有杂原子的烷基、未被取代的烯基、被取代的烯基、含有杂原子的烯基、被取代的含有杂原子的烯基、未被取代的芳基、被取代的芳基、杂芳基和被取代的杂芳基，其中D任选地被包含选自烯烃、芳基、叠氮化物和α，β-不饱和羰基的部分的基团取代；且
波浪线代表与所述可检测的标记颗粒的共价连接。
44.根据权利要求43所述的可检测的标记颗粒，其中
D具有下述结构
其中：
M3是选自下述的接头部分：亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基和被取代的含有杂原子的亚烷基；
Ar1是包含至少一个供电子的取代基的芳族部分，且其可以进一步被一个或多个取代基取代，可以包括一个或多个杂原子，且可以包括2个或更多个稠合的芳族环；且
R1是选自下述的不饱和部分：亚烷基、被取代的亚烷基、亚烯基、被取代的亚烯基，
其中：
R3选自OH和NH2；
n1选自0、1、2、3和4；
每个R4独立地选自H、烃基、被取代的烃基、含有杂原子的烃基、被取代的含有杂原子的烃基和官能团；
α、β和γ是任选的键，前提条件是，要么β存在，要么α和γ存在；
A和B独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯烃和官能团，或者A和B选自碳和氮且一起形成环；
如果γ存在，Y是CRa或N，如果γ不存在，Y是C(=O)、C(Ra)2、NRa、S和O；
X是CRa或N；
Z是CRa或N，前提条件是，如果Z是N，那么B不存在；
如果α存在，R2是O、C(Ra)2或NRa，如果α不存在，R2是C(Ra)3、N(Ra)2、SRa或ORa；
V选自CRa、N、S和O，前提条件是，如果V是S或O，那么A不存在；且
Ra选自H、烃基、被取代的烃基、含有杂原子的烃基和被取代的含有杂原子的烃基。
45.根据权利要求44所述的可检测的标记颗粒，其中Ar1具有下述结构
其中
A、D、E、G和J选自C-R和N，其中每个R独立地选自H、烷基、烯基、芳基、含氧的取代基和含氮的取代基，前提条件是，任意2个邻近的R基团可以一起形成环，所述环任选地进一步被取代且任选地进一步含有杂原子。
46.根据权利要求44所述的可检测的标记颗粒，其中Ar1具有下述结构
Figure FDA0000390127210000092
其中R1-R5中的每一个独立地选自H、烷基、烯基、芳基、羟基、氨基、烷氧基、单烷基取代的氨基、二烷基取代的氨基和酰氨基。
47.根据权利要求46所述的可检测的标记颗粒，其中R3选自H、烷基、烯基、氨基、烷氧基、烷基取代的氨基、酰氨基和芳基；且R1、R2、R4和R5中的至少一个是羟基、氨基、烷氧基、烷基取代的氨基或酰氨基。
48.根据权利要求47所述的可检测的标记颗粒，其中R1、R2、R4和R5中的至少一个是羟基。
49.一种接头分子，其包含具有式(IV)结构的分子：
其中：
L1、W1、M1、M2、D、n、p和q如在式(I)中所述；且
U1是特异性结合对的第一成员或关于式(II)所定义的形成共价键的反应基团。
50.根据权利要求49所述的接头分子，其中：
D具有下述结构
Figure FDA0000390127210000102
且
W1具有下述结构
Figure FDA0000390127210000103
其中：
X1是-CH-或-N-；
M3是选自下述的接头部分：亚烷基、被取代的亚烷基、含有杂原子的亚烷基和被取代的含有杂原子的亚烷基；
L2是接头，其可以是键，或可以选自亚烷基、亚烯基和亚芳基，其中的任一个可以是被取代的或未被取代的，且可以含有一个或多个杂原子；
Ar1是包含至少一个供电子的取代基的芳族部分，且其可以进一步被一个或多个取代基取代，可以包括一个或多个杂原子，且可以包括2个或更多个稠合的芳族环；且
R1是选自下述的不饱和部分：亚烷基、被取代的亚烷基、亚烯基、被取代的亚烯基，
Figure FDA0000390127210000111
其中：
R3选自OH和NH2；
n1选自0、1、2、3和4；
每个R4独立地选自H、烃基、被取代的烃基、含有杂原子的烃基、被取代的含有杂原子的烃基和官能团；
α、β和γ是任选的键，前提条件是，要么β存在，要么α和γ存在；
A和B独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的烯烃和官能团，或者A和B选自碳和氮且一起形成环；
如果γ存在，Y是CRa或N，如果γ不存在，Y是C(=O)、C(Ra)2、NRa、S和O；
X是CRa或N；
Z是CRa或N，前提条件是，如果Z是N，那么B不存在；
如果α存在，R2是O、C(Ra)2或NRa，如果α不存在，R2是C(Ra)3、N(Ra)2、SRa或ORa；
V选自CRa、N、S和O，前提条件是，如果V是S或O，那么A不存在；且
Ra选自H、烃基、被取代的烃基、含有杂原子的烃基和被取代的含有杂原子的烃基。
51.根据权利要求50所述的接头分子，其中Ar1具有下述结构
其中
A、D、E、G和J选自C-R和N，其中每个R独立地选自H、烷基、烯基、芳基、含氧的取代基和含氮的取代基，前提条件是，任意2个邻近的R基团可以一起形成环，所述环任选地进一步被取代且任选地进一步含有杂原子。
52.根据权利要求50所述的接头分子，其中Ar1具有下述结构
Figure FDA0000390127210000121
其中R1-R5中的每一个独立地选自H、烷基、烯基、芳基、羟基、氨基、烷氧基、单烷基取代的氨基、二烷基取代的氨基和酰氨基。
53.根据权利要求52所述的接头分子，其中R3选自H、烷基、烯基、氨基、烷氧基、烷基取代的氨基、酰氨基和芳基；且R1、R2、R4和R5中的至少一个是羟基、氨基、烷氧基、烷基取代的氨基或酰氨基。
54.根据权利要求53所述的接头分子，其中R1、R2、R4和R5中的至少一个是羟基。
55.根据权利要求49所述的接头分子，其中U1选自生物素部分、核酸序列、抗原、抗体、半抗原、抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素部分、糖部分、凝集素部分和酶或脱辅酶。
56.根据权利要求55所述的接头分子，其中U1是生物素部分，使得所述接头分子具有式(IVa)的结构：
Figure FDA0000390127210000122
57.一种试剂盒，其包括与其使用说明书成套组合的根据权利要求1-26中任一项所述的官能化的基底。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括多个可检测的标记颗粒，其中所述多个中的每一个可检测的标记颗粒用多个结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子官能化，以提供官能化的可检测的标记颗粒，其中所述多个结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子中的每一个包含形成共价键的反应基团。
59.根据权利要求57所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括多个接头分子，其中所述多个接头分子中的每一个接头分子包含形成共价键的反应基团。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括多个可检测的标记颗粒，其中所述多个中的每一个可检测的标记颗粒用多个结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子官能化，以提供官能化的可检测的标记颗粒，其中结合至所述可检测的标记颗粒的表面的分子中的每一个包含结合部分，所述结合部分被构造成结合所述接头分子中的一个或多个。
61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述结合部分被构造成非共价地结合所述接头分子中的一个或多个。
62.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述结合部分是生物素或抗生蛋白链菌素。
63.根据权利要求62所述的试剂盒，其中所述结合部分是抗生蛋白链菌素，且所述接头分子包含生物素。
64.根据权利要求62所述的试剂盒，其中所述结合部分是生物素，且所述接头分子包含抗生蛋白链菌素。
65.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述官能化的可检测的标记颗粒是官能化的磁珠。
66.根据权利要求65所述的试剂盒，其中所述官能化的磁珠具有约100nm至约1μm的直径。
67.根据权利要求65所述的试剂盒，其中所述官能化的磁珠具有约1μm或更大的直径。
68.一种反应混合物，其包括：
官能化的基底，所述基底包括
支持材料，
一个或多个靶标特异性的捕获探针，所述捕获探针结合至所述支持材料的表面，和
多个合成的非天然存在的分子，所述分子结合至所述支持材料的表面，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含第一形成共价键的反应基团；和
多个官能化的可检测的标记颗粒，
其中所述官能化的可检测的标记颗粒中的每一个包括多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子，以提供所述官能化的可检测的标记颗粒，且其中所述多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子中的每一个包含第二形成共价键的反应基团。
69.根据权利要求68所述的反应混合物，所述反应混合物另外包括靶分子，所述靶分子特异性地结合至所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一。
70.根据权利要求69所述的反应混合物，所述反应混合物另外包括标记探针，所述标记探针特异性地结合至所述靶分子。
71.根据权利要求70所述的反应混合物，所述反应混合物另外包括酶缀合物，所述酶缀合物特异性地结合至所述标记探针。
72.根据权利要求71所述的反应混合物，其中所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的一个官能化的可检测的标记颗粒通过所述第一形成共价键的反应基团与所述第二形成共价键的反应基团的相互作用，经由多个共价键连接至所述支持材料的表面，在特异性地结合至所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一的靶分子附近。
73.根据权利要求72所述的反应混合物，所述反应混合物包括多个空间上分离的、可单独检测的靶位点。
74.根据权利要求72所述的反应混合物，其中所述靶分子以小于约100fM的浓度存在于所述反应混合物中。
75.根据权利要求72所述的反应混合物，其中所述靶分子以约0.1fM至约100fM的浓度存在于所述反应混合物中。
76.一种反应混合物，其包括：
官能化的基底，所述基底包括
支持材料，
一个或多个靶标特异性的捕获探针，所述捕获探针结合至所述支持材料的表面，和
多个合成的非天然存在的分子，所述分子结合至所述支持材料的表面，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含第一形成共价键的反应基团；
多个官能化的可检测的标记颗粒，
其中所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的每一个包含多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子，以提供官能化的可检测的标记颗粒，且其中所述多个结合至可检测的标记颗粒的表面的分子中的每一个包含特异性结合对的一个成员；和
多个接头分子，其中所述多个接头分子中的每一个接头分子被构造成结合所述多个结合至官能化的可检测的标记的表面的分子之一，且其中每一个接头分子包含多个第二形成共价键的反应基团。
77.根据权利要求76所述的反应混合物，所述反应混合物另外包括靶分子，所述靶分子特异性地结合至所述一个或多个靶标特异性的捕获探针之一。
78.根据权利要求77所述的反应混合物，所述反应混合物另外包括标记探针，所述标记探针特异性地结合至所述靶分子。
79.根据权利要求78所述的反应混合物，所述反应混合物另外包括酶缀合物，所述酶缀合物特异性地结合至所述标记探针。
80.根据权利要求79所述的反应混合物，其中所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的一个官能化的可检测的标记颗粒结合至所述多个接头分子中的多重接头分子，所述接头分子经由所述第一形成共价键的反应基团和所述第二形成共价键的反应基团之间的共价键结合至所述支持材料的表面，在结合的靶分子附近。
81.根据权利要求80所述的反应混合物，所述反应混合物包括多个空间上分离的、可单独检测的靶位点。
82.根据权利要求80所述的反应混合物，其中所述靶分子以小于约100fM的浓度存在于所述反应混合物中。
83.根据权利要求80所述的反应混合物，其中所述靶分子以约0.1fM至约100fM的浓度存在于所述反应混合物中。
84.根据权利要求68-83中的任一项所述的反应混合物，其中所述官能化的可检测的标记颗粒是官能化的磁珠。
85.根据权利要求84所述的反应混合物，其中所述官能化的磁珠具有约100nm至约1μm的直径。
86.根据权利要求84所述的反应混合物，其中所述官能化的磁珠具有约1μm或更大的直径。
87.根据权利要求68-83中的任一项所述的反应混合物，其中所述支持材料包含硅。
88.根据权利要求68-83所述的反应混合物，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含树枝状聚体结构。
89.根据权利要求68-83所述的反应混合物，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酪氨酸氨基酸。
90.根据权利要求68-83所述的反应混合物，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酚-酸共聚物。
91.根据权利要求68-83所述的反应混合物，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含赖氨酸和酪氨酸氨基酸。
92.根据权利要求68-83所述的反应混合物，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含酪胺或酪胺衍生物。
93.根据权利要求68-83所述的反应混合物，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含胸腺嘧啶或胸腺嘧啶衍生物。
94.一种间接地检测固定化在基底表面上的靶分子的方法，所述方法包括：
在反应混合物中组合
官能化的基底，所述基底包括支持材料、结合至所述支持材料的表面的一个或多个靶标特异性的捕获探针、和结合至所述支持材料的表面的多个合成的非天然存在的分子，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含第一形成共价键的反应基团，
多个官能化的可检测的标记颗粒，所述多个中的每一个成员包含多个第二形成共价键的反应基团，
疑似含有靶分子的样品，
靶标特异性的标记探针，和
酶缀合物，所述酶缀合物被构造成特异性地结合所述靶标特异性的标记探针，并催化所述第一形成共价键的反应基团和所述第二形成共价键的反应基团之间的共价键形成；和
检测结合至官能化的表面的官能化的可检测的标记颗粒是否存在，其中所述官能化的可检测的标记颗粒的存在指示被固定化在所述官能化的基底上的靶分子的存在。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述疑似含有靶分子的样品含有小于约100fM的浓度的靶分子。
96.根据权利要求94所述的方法，其中所述疑似含有靶分子的样品含有约0.1fM至约100fM的浓度的靶分子。
97.一种间接地检测固定化在基底表面上的靶分子的方法，所述方法包括：
在反应混合物中组合
官能化的基底，所述基底包括支持材料、结合至所述支持材料的表面的一个或多个靶标特异性的捕获探针、和结合至所述支持材料的表面的多个合成的非天然存在的分子，其中所述合成的非天然存在的分子中的每一个包含第一形成共价键的反应基团，
多个官能化的可检测的标记颗粒，所述多个官能化的可检测的标记颗粒中的每一个成员包含第一结合部分，
多个连接分子，所述多个连接分子中的每一个成员包含第二结合部分和多个第二形成共价键的反应基团，所述第二结合部分被构造成特异性地结合所述第一结合部分，
疑似含有靶分子的样品，
靶标特异性的标记探针，和
酶缀合物，所述酶缀合物被构造成特异性地结合所述靶标特异性的标记探针，并催化所述第一形成共价键的反应基团和所述第二形成共价键的反应基团之间的共价键形成；和
检测结合至官能化的表面的官能化的可检测的标记颗粒是否存在，其中所述官能化的可检测的标记颗粒的存在指示被固定化在所述官能化的基底上的靶分子的存在。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述疑似含有靶分子的样品含有小于约100fM的浓度的靶分子。
99.根据权利要求97所述的方法，其中所述疑似含有靶分子的样品含有约0.1fM至约100fM的浓度的靶分子。
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