CN107076739A - 可逆表面官能化 - Google Patents

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Abstract

本文中所述的一些实施方案涉及包含用于可逆地固定感兴趣的生物分子，如寡核苷酸，多核苷酸或蛋白质的硅烷官能化表面的基底。还公开了用于固定生物分子的方法和在DNA测序和其它诊断应用中的用途。

Description

可逆表面官能化
通过引用并入任何优先权申请
本申请要求于2014年8月21日提交的美国临时专利申请No.62/040,323的优先权的权益，其全部内容通过引用明确并入本文。
发明领域
一般而言，本申请涉及化学，生物学和材料科学领域。更具体地，本申请涉及包含用于可逆地固定感兴趣的生物分子的硅烷官能化表面的基底。还公开了用于固定生物分子的方法和在DNA测序和其它诊断应用中的用途。
发明背景
经聚合物或水凝胶包被的基底用于许多技术应用中。例如，经聚合物或水凝胶包被的基底用于生物分子的制备和/或分析。分子分析，如某些核酸测序方法，利用核酸链对基底的经聚合物或水凝胶包被的表面的附着。然后可以通过本领域中公知的多种不同方法测定附着的核酸链的序列。
合成测序(sequencing-by-synthesis，SBS)通常利用模板DNA链对经聚合物包被的流动池表面的附着。制备用于SBS的流动池的玻璃表面的示例性程序包括：(1)通过化学气相沉积(chemical vapor deposition，CVD)用反应性硅烷官能化表面；(2)通过热反应将预成型的聚酰胺聚合物共价附着到流动池表面；和(3)使用交联化学将测序引物附着到聚合物的反应性模块(moiety)。在制备表面后，将DNA附着到表面上的引物，扩增以产生簇，然后对所述簇进行合成测序以读出序列中的单个碱基。制备流动池表面或涂层材料(coating)的每个步骤都适合于使用微流体(microfluidics)在溶液中进行，因此可以在仪器机载上进行(can be performed on-board the instrument)。也可以通过旋涂(spincoating)或喷涂(spray coating)来进行聚合物层的沉积。一个典型的例外是官能化硅烷的CVD，其在高温真空炉中进行。
虽然已知可以使用强碱来有效地除去硅烷层，但是该方法将创建对CVD炉的需要以更新流动池。目前的现有技术是在进行测序之后，不再次重复使用流动池，而是将其处置掉。没有有效的更新流通池的方法是商品化可用的。因此，期望设计测序方法，其中可以再生或再循环流动池以降低与SBS相关的成本。
发明概述
本申请涉及使用可逆相互作用(如非共价相互作用)将感兴趣的生物分子(如DNA)固定或锚定在流动池表面上的新方法。这些方法将使得能够多次使用流动池，并且整个过程可以使用单独的试剂板或具有更多试剂的常规试剂板在仪器机载上进行。例如，一种方法使用主体(host)/客体(guest)或包合络合物(inclusion complex)化学来将特定SBS引物可逆地附着到玻璃表面上。本文针对核酸和其它生物分子示例的系统和方法可以扩展到多种生物成分，如细胞，病毒，细胞器或颗粒。例如，可以将这些生物成分表面上的生物分子固定和操作以实现本文中对生物分子列出的若干优点并还实现其它优点。类似地，本文中列出的系统和方法可以通过用非生物分子替换本文例示的生物分子而扩展至非生物分子。
官能化表面与补合的(complimentary)官能化聚合物和/或自组装单层之间的识别事件可通过共价或非共价的多种可逆吸引分子间相互作用发生。通过可逆非共价相互作用的官能化表面的其它非限制性实例包括范德华相互作用(如氢键键合，例如羧酸的分子识别)，π-π相互作用(如芳香族化合物的π堆积)，金属-金属相互作用，电荷转移相互作用，如金属与配体的相互作用(即金属离子络合到配体袋中)。
另一种方法涉及在基底表面和聚合物之间插入可逆的共价键键合。可逆键在测序期间是稳定的，但可以使用某组条件除去。例如，可逆键可以包括官能化硅烷层和聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide-co-acrylamide)，PAZAM)层之间的铜-亚胺络合物。此铜亚胺连接是可逆的，并且可以在特定的环境组下切割。共价可逆相互作用的其它非限制性实例包括二硫键形成，与二醇和/或其它亲核体/路易斯碱的硼酸相互作用，醛与胺或醇之间的相互作用(导致亚胺的形成或半缩醛(hemiacetal)和乙缩醛(acetal)的形成)，半缩醛和乙缩醛可以通过与不同氧化态的金属离子,如铜，铁，钴，镍，锌和镉的相互作用而进一步稳定。
本文中所述的一些实施方案涉及用于将生物分子可逆地固定到基底表面的方法，所述方法包括：
提供与主体分子共价键合的生物分子，所述主体分子包含亲水部分和疏水部分；
提供具有包含与其共价附着的官能化硅烷的表面的基底，其中所述官能化硅烷包含可与所述主体分子形成主体-客体络合物的客体模块(guest moiety)；
使生物分子与官能化硅烷接触，使得生物分子通过官能化硅烷和主体分子之间的主体-客体可逆相互作用固定于表面，所述主体-客体相互作用任选是非共价的。
本文中所述的一些实施方案涉及基底，其包含固定于所述基底的表面的生物分子，其中，
所述生物分子与包含疏水部分和亲水部分的主体分子共价键合；
基底的所述表面包含与其共价附着的官能化硅烷，并且所述官能化硅烷包含可与所述主体分子形成主体-客体络合物的客体模块；
其中所述生物分子通过所述官能化硅烷和所述主体分子之间的主体-客体相互作用固定，所述主体-客体相互作用任选是非共价的。
在一些实施方案中，官能化硅烷的客体模块包含疏水模块。在一些此类实施方案中，主体-客体相互作用是官能化硅烷的疏水模块和主体分子的疏水部分之间的非共价相互作用。
在一些实施方案中，生物分子包含氨基酸，肽，核苷，核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸，蛋白质，糖，多糖或其组合。在一些此类实施方案中，生物分子包含寡核苷酸或多核苷酸。在一些进一步的实施方案中，寡核苷酸是引物。在一些此类实施方案中，生物分子与主体分子的亲水部分共价键合。在一些此类实施方案中，生物分子不是小有机分子。在一些实施方案中，生物分子包含寡核苷酸。在一个实施方案中，生物分子是单链DNA。
在本文中所述的方法的一些实施方案中，所述方法还包括从所述寡核苷酸产生多核苷酸的聚簇阵列。例如，寡核苷酸可以作为引物发挥功能，用于扩增与寡核苷酸杂交的模板核酸。
在一些实施方案中，主体分子是任选取代的环糊精或其衍生物。在一些此类实施方案中，主体分子是β-环糊精。在一些此类实施方案中，主体分子是α-环糊精。在一些其它此类实施方案中，主体分子是γ-环糊精。也可以使用具有更大环尺寸的其它环糊精，这取决于疏水客体部分的尺寸。
在本文中所述的方法的一些实施方案中，所述方法还包括从所述基底的表面解离所述主体分子。在一些此类实施方案中，通过添加比所述官能化硅烷的客体模块对所述主体分子更大的亲和力的分子来实现所述解离。在一些此类实施方案中，通过添加比所述官能化硅烷的疏水模块对所述主体分子的疏水部分更大的亲和力的分子来实现所述解离。在一些此类实施方案中，对所述主体分子的疏水部分更大的亲和力的所述分子是1,8-辛二醇。
在本文中所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括清洗步骤以再循环(recycle)所述基底。
在本文中所述的任何实施方案中，官能化硅烷的客体模块可包括芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，环炔基或金刚烷基(adamantyl)或其任选取代的变体。在一些此类实施方案中，用一个或多个氟基团取代官能化硅烷的疏水部分。在一些此类实施方案中，所述客体模块包括任选取代的芳基。在一些此类实施方案中，客体模块是任选取代的芳基。在一些其它实施方案中，客体模块包括任选取代的环烯基。在一些其它实施方案中，客体模块是任选取代的环烯基。在一些此类实施方案中，环烯基是降冰片烯。
在本文中所述的任何实施方案中，可以通过化学气相沉积(CVD)将官能化硅烷应用到基底的表面上。在一些其它实施方案中，可以使用Yield Engineering Systems(YES)牌炉(Livermore，CA)通过化学气相沉积将硅烷或硅烷衍生物应用到第一表面上。在另一些实施方案中，根据需要，可以通过浸涂(dip coating)，旋涂或喷涂以液体状态应用硅烷或硅烷衍生物。
在本文中所述的任何实施方案中，基底可包括选自下组的材料：玻璃，二氧化硅(silica)，石英，塑料，金属，金属氧化物，图案化(patterned)或非图案化或其组合。在一个实施方案中，基底的表面包括玻璃。在一些实施方案中，基底的表面可以包括官能化的硅烷包被区域和惰性区域两者。在一些实施方案中，惰性区域选自玻璃区域，金属区域，掩模区域(mask region)和间隙区域(interstitial region)或其组合。在一个实施方案中，惰性区域包括玻璃。
附图简述
图1显示α，β和γ-环糊精和相应的锥形结构模拟物。
图2显示将寡核苷酸可逆地附着到硅烷官能化表面的工作流程。
图3A显示固定在基底的降冰片烯-硅烷衍生物[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷([(5-bicyclo[2.2.1]hept-2-enyl)ethyl]trimethoxysilane)官能化表面上的引物官能化环糊精的TET扫描Typhoon图像。
图3B显示环糊精引物接枝表面的中值Typhoon强度的相关图。
发明详述
本申请涉及使用可逆相互作用(例如非共价相互作用)将感兴趣的生物分子(如DNA)固定或锚定在表面上的方法。在一个实施方案中，该方法用作系统，如来自Illumina(San Diego,CA)的或系统上的合成测序(SBS)反应的一部分。在这些反应中，一组扩增引物通常结合到玻璃表面。将待测序的一组靶DNA分子与结合的引物杂交，然后通过桥式扩增方法扩增。进行测序反应，并且在本发明的实施方案中，然后将扩增引物(和扩增子，包括在扩增步骤期间延伸以包括靶DNA的拷贝的引物)从玻璃表面释放，使得表面在将来的测序反应中可重复使用。因此，可以重复将扩增引物附着到玻璃表面，将靶DNA分子杂交到引物，桥式扩增，测序靶DNA，和除去扩增引物和扩增子的一个或多个步骤。可以进行一次或多次重复。
在一个实施方案中，使用主体/客体或包合络合物化学将SBS引物附着到玻璃表面上。在一个实施方案中，引物可以是P5或P7引物，如下详述。P5和P7引物在由Illumina Inc.出售的商业流动池的表面上使用，用于在 和Genome平台上测序。引物序列描述于美国专利公开No.2011/0059865A1，其通过引用整体并入本文。
P5和P7引物序列包含以下：
配对末端组：
P5：配对末端5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC
P7：配对末端5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT
单一读段组：
P5：单一读段：5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGA
P7：单一读段5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGA
在此实施方案中，目标是能够再生流动池表面，同时使官能化硅烷尽可能完整。在一些实施方案中，环糊精用作主体分子以与官能化硅烷形成非共价主体/客体络合物。环糊精可以通过例如改变热力学平衡而容易地从硅烷模块解络(de-complex)。这可以通过使用对环糊精的内部腔具有更高亲和力或结合常数的客体并使其以较大浓度流动来实现。在一些实施方案中，选择1,8-辛二醇作为对于β-环糊精具有非常强的亲和力的客体。也可以使用其它客体化合物。Wickstrom等人已经报道了用于β-环糊精的57种不同客体分子及其相对结合亲和力的半经验计算，包括脂族醇或二醇(如2-丙醇，2-丁醇，环丁醇，3-溴-1-丙醇，环己醇和R-1-苯基-1,2-乙二醇)；脂族或芳烷基质子化胺(如2-甲氧基苯乙基铵，3-4-二羟基苯乙基铵)；酚类(如间苯二酚)；酯(例如R-1-苯基-1,2-乙二醇)；酰胺(例如δ-戊内酰胺)；大的且名义上刚性的客体(large and nominally rigid guest)和强粘合剂(如环庚醇和环辛醇)；萘丁美酮(nabumetone)和萘普生(naproxen)。参见Wickstrom等人，“LargeScale Affinity Calculations of Cyclodextrin Host-GuestComplexes:Understandingthe Role of Reorganization in the Molecular Recognition Process,”J.Chem.Theory Comput.2013,9,3136-3150。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，本文引用的所有专利，申请，公开的申请和其它出版物通过引用整体并入。在本文中的术语存在多个定义的情况下，除非另有说明，以本部分中的定义为准。除非上下文另有明确说明，否则在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。除非另有说明，使用质谱，NMR，HPLC，蛋白质化学，生物化学，重组DNA技术和药理学的常规方法。除非另有说明，“或”或“和”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式的使用不是限制性的。如本说明书中所使用的，不管在权利要求的过渡短语中还是在主体中，术语“包括”和“包含”都应被解释为具有开放式含义。也就是说，术语应被解释为与短语“至少具有”或“至少包括”同义。当在方法的上下文中使用时，术语“包括”是指该方法至少包括所述的步骤，但可以包括附加步骤。当在化合物，组合物或装置的上下文中使用时，术语“包含”是指化合物，组合物或装置至少包含所述的特征或组分，但也可包括另外的特征或组分。
本文中使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
如本文所使用的，常见的有机缩写定义如下：
Ac 乙酰基
Ac2O 乙酸酐
APTS 氨基丙基硅烷
APTES (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷
APTMS (3-氨基丙基)三甲氧基硅烷
aq. 水溶液
Azapa N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺
(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide)
BCN 双环[6.1.0]壬-4-炔(Bicyclo[6.1.0]non-4-yne)
Bn 苄基
Brapa或BRAPA N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺
Bz 苯甲酰基
BOC或Boc 叔丁氧基羰基
Bu 正丁基
cat. 催化
CVD 化学气相沉积
℃ 以摄氏度计的温度
dATP 脱氧腺苷三磷酸
dCTP 脱氧胞苷三磷酸
dGTP 脱氧鸟苷三磷酸
dTTP 脱氧胸苷三磷酸
DBU 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)
DCM 二氯甲烷
DIEA 二异丙基乙胺
DIPEA 二异丙基乙胺
DMF N,N’-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
DPPA 二苯基磷酰基叠氮化物
Et 乙基
EtOAc 乙酸乙酯
g 克
GPC 凝胶渗透层析
h或hr 小时
iPr 异丙基
KPi 10mM磷酸钾缓冲液，pH7.0
KPS 过硫酸钾
IPA 异丙醇
LCMS 液相层析-质谱
LDA 二异丙基酰胺锂
m或min 分钟
MeOH 甲醇
MeCN 乙腈
mL 毫升
NaN3 叠氮化钠
NHS N-羟基琥珀酰亚胺
NHS-AA 丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯
PAZAM 任何丙烯酰胺与Azapa比率的聚(N-(5-叠氮基乙酰胺
基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)
PG 保护基
Ph 苯基
ppt 沉淀物
rt 室温
SBS 合成测序
SFA 无硅烷的丙烯酰胺(Silane free acrylamide)
Sulfo-HSAB或SHSAB N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸
(N-Hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenoate)
TEA 三乙胺
TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基
Tert，t 叔(tertiary)
TFA 三氟乙酸
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如本文中使用，术语“阵列”是指附着到一个或多个基底的不同探针分子的群体，使得不同的探针分子可根据相对位置彼此区分。阵列可以包括不同的探针分子，它们各自位于基底上不同的可寻址位置。或者或另外，阵列可包括各自携带不同探针分子的分开的基底，其中可根据附着基底的表面上的基底位置或根据基底在液体中的位置鉴定不同的探针分子。分开的基底位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中包含珠的，如记载于例如美国专利No.6,355,431B1、US 2002/0102578和PCT公开No.WO 00/63437。可以在本申请中用于区分液体阵列中的珠的示例性形式(例如使用微流体装置，如荧光激活细胞分选仪(FACS))描述于例如美国专利No.6,524,793。可用于本申请的阵列的其它实例包括但不限于美国专利No.5,429,807；5,436,327；5,561,071；5,583,211；5,658,734；5,837,858；5,874,219；5,919,523；6,136,269；6,287,768；6,287,776；6,288,220；6,297,006；6,291,193；6,346,413；6,416,949；6,482,591；6,514,751和6,610,482；和WO 93/17126；WO 95/11995；WO 95/35505；EP 742 287；和EP 799 897中描述的那些。
如本文中使用，术语“共价附着”或“共价键合”是指形成化学键键合，其特征在于原子之间共享电子对。例如，共价附着的聚合物涂层材料是指与通过其它手段(例如粘附或静电相互作用)附着到表面相比，与基底的官能化表面形成化学键的聚合物涂层材料。应当理解，共价附着到表面的聚合物也可以通过除共价附着之外的手段，例如物理吸附键合。
如本文中使用，术语“可逆相互作用”是指分子的缔合，其中与不可逆缔合相反，可以逆转此类缔合。例如，可以通过对主体更大的亲和力的分子的干预逆转主体和客体之间的非共价相互作用。其它非限制性实例牵涉使用可逆交联剂，如甲醛，亚胺键形成(参见Stoddart于Chem.Soc.Rev.,2012,41,pp.2003-2024；Chem.Soc.Rev.2007,36(11),pp.1705-1723)，金属定向的亚胺键形成(参见Nitschke于Acc.Chem.Res.,2007,40(2),pp.103–112)，二硫键(参见Black等人，于Chem.Soc.Rev.,2014,43,pp.1861-1872)，硼酸交换(参见Wilson等人，于Chem.Soc.Rev.,2014,43,pp.1948-1962)，氢键键合(参见Seto,etal于J.Am.Chem.Soc.,1993,115(4),pp.1321–1329)，π-堆积(参见Schenning等人，于Chem.Commun.2005,14；(26):3245-58)。在一些其它实例中，分子的缔合可以是热可逆的。参见例如Liu等人，Macromolecular Chemistry and Physics,2007,208(2),pp.224-232。
如本文中使用，非共价相互作用不同于共价键，因为其不涉及电子共享，而是涉及分子之间或分子内的电磁相互作用的更分散的变化。非共价相互作用通常可以分为四类，静电，π效应，范德华力和疏水效应。静电相互作用的非限制性实例包括离子相互作用，氢键键合(特定类型的偶极-偶极相互作用)，卤素键合等。范德华力是涉及永久或诱导的偶极或多极的静电相互作用的子集。π效应可以分为许多类别，包括(但不限于)π-π相互作用，阳离子-π和阴离子-π相互作用和极性-π相互作用。通常，π效应与分子与分子系统(如苯)的π轨道的相互作用相关。疏水效应是非极性物质在水溶液中聚集并排除水分子的趋势。非共价相互作用可以既是分子间的又是分子内的。
如本文所使用的，术语“表面剩余百分比(percent surface remaining)”是指使用TET QC测量的对表面引物(如P5和P7引物)进行染色的强度。P5和P7引物可以在由Illumina Inc.出售的商业流动池的表面上使用，用于在 Genome和平台上测序。引物序列描述于美国专利公开No.2011/0059865A1，其通过引用并入本文。TET是具有与P5/P7引物互补的序列的染料标记的寡核苷酸。TET可以与表面上的P5/P7引物杂交；可以洗掉过量的TET，并且可以使用诸如TyphoonScanner(General Electric)的扫描仪器通过荧光检测来测量附着的染料浓度。
如本文所使用的，其中“a”和“b”是整数的“Ca至Cb”或“Ca-b”是指规定基团中的碳原子数。也就是说，该基团可以含有“a”至“b”个(包括端点)碳原子。因此，例如，“C1至C4烷基”或“C1-4烷基”基团是指具有1至4个碳的所有烷基基团，即CH3-，CH3CH2-，CH3CH2CH2-，(CH3)2CH-，CH3CH2CH2CH2-，CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。
术语“芳香族”是指具有共轭π电子系统的环或环系统，并且包括碳环芳香族(例如苯基)和杂环芳香族基团(例如吡啶)二者。该术语包括单环或稠环多环(即，共享相邻原子对的环)基团，条件是整个环系统是芳香族的。
如本文中使用的，“芳基”是指在环主链中仅含有碳的芳香族环或环系统(即，两个或多个共享两个相邻碳原子的稠环)。当芳基是环系统时，系统中的每个环是芳香族的。芳基基团可以具有6至18个碳原子，尽管本定义还涵盖没有指定数值范围的术语“芳基”的出现。在一些实施方案中，芳基具有6至10个碳原子。芳基可以称为“C6-10芳基”，“C6或C10芳基”或类似的名称。芳基的实例包括但不限于苯基，萘基，薁基(azulenyl)和蒽基(anthracenyl)。
如本文中使用的，“亚芳基(arylene)”是指仅含有碳和氢的芳香族环或环系统，其通过两个附着点附着至分子的其余部分。
如本文中使用的，“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子(即除碳以外的元素，包括但不限于氮，氧和硫)的芳香族环或环系统(即，共享两个相邻原子的两个或多个稠环)。当杂芳基是环系统时，系统中的每个环是芳香族的。杂芳基基团可以具有5-18个环成员(即构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)，尽管本定义还涵盖没有指定数字范围的术语“杂芳基”的出现。在一些实施方案中，杂芳基具有5至10个环成员或5至7个环成员。杂芳基基团可以称为“5-7元杂芳基”，“5-10元杂芳基”或类似的名称。杂芳基环的实例包括但不限于呋喃基(furyl)，噻吩基(thienyl)，酞嗪基(phthalazinyl)，吡咯基(pyrrolyl)，恶唑基(oxazolyl)，噻唑基(thiazolyl)，咪唑基(imidazolyl)，吡唑基(pyrazolyl)，异恶唑基(isoxazolyl)，异噻唑基(isothiazolyl)，三唑基(triazolyl)，噻二唑基(thiadiazolyl)，吡啶基(pyridinyl)，哒嗪基(pyridazinyl)，嘧啶基(pyrimidinyl)，吡嗪基(pyrazinyl)，三嗪基(triazinyl)，喹啉基(quinolinyl)，异喹啉基(isoquinlinyl)，苯并咪唑基(benzimidazolyl)，苯并恶唑基(benzoxazolyl)，苯并噻唑基(benzothiazolyl)，吲哚基(indolyl)，异吲哚基(isoindolyl)和苯并噻吩基(benzothienyl)。
如本文中使用的，“杂亚芳基(heteroarylene)”是指在环主链中含有一个或多个杂原子的芳香族环或环系统，其通过两个附着点附着到分子的其余部分。
如本文中使用的，“碳环基(carbocyclyl)”是指在环系统主链中仅含有碳原子的非芳香族环或环系统。当碳环基是环系统时，两个或更多个环可以以稠合，桥接或螺环连接的方式连接在一起。碳环基可以具有任何饱和度，条件是环系统中的至少一个环不是芳香族的。因此，碳环基包括环烷基，环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3至20个碳原子，尽管本定义还涵盖没有指定数字范围的术语“碳环基”的出现。碳环基基团还可以是具有3至10个碳原子的中等尺寸的碳环基。碳环基还可以是具有3至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可以称为“C3-6碳环基”或类似的名称。碳环基环的实例包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环己烯基(cyclohexenyl)，2,3-二氢-茚，双环[2.2.2]辛基，金刚烷基和螺[4.4]壬基(spiro[4.4]nonanyl)。
如本文中使用的，“环烷基”是指完全饱和的碳环基环或环系统。实例包括环丙基，环丁基，环戊基和环己基。
如本文中使用的，“环亚烷基(cycloalkylene)”是指通过两个附着点与分子的其余部分附着的完全饱和的碳环基环或环系统。
如本文中使用的，“环烯基”或“环烯烃(cycloalkene)”是指具有至少一个双键的碳环基环或环系统，其中环系统中没有环是芳香族的。一个实例是环己烯基或环己烯。另一个实例是降冰片烯或降冰片烯基(norbornenyl)。
如本文中使用的，“杂环烯基”或“杂环烯烃”是指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个双键的碳环基环或环系统，其中环系统中没有环是芳香族的。
如本文中使用的，“环炔基”或“环炔(cycloalkyne)”是指具有至少一个三键的碳环基环或环系统，其中环系统中没有环是芳香族的。一个实例是环辛炔。另一个实例是双环壬烯(bicyclononyne)。
如本文中使用的，“杂环炔基(heterocycloalkynyl)”或“杂环炔烃(heterocycloalkyne)”是指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个三键的碳环基环或环系统，其中环系统中没有环是芳香族的。
如本文中使用的，“杂环基”是指在环主链中含有至少一个杂原子的非芳香族环状环或环系统。杂环基可以以稠合，桥接或螺环连接的方式连接在一起。杂环基可以具有任何饱和度，条件是环系统中的至少一个环不是芳香族的。杂原子可以存在于环系统中的非芳香族或芳香族环中。杂环基可具有3至20个环成员(即，构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)，尽管本定义还涵盖没有指定数字范围的术语“杂环基”的出现。杂环基基团还可以是具有3至10个环成员的中等大小的杂环基。杂环基还可以是具有3至6个环成员的杂环基。杂环基可以称为“3-6元杂环基”或类似的名称。在优选的六元单环杂环基中，杂原子选自O，N或S中的1个多至3个，并且在优选的五元单环杂环基中，杂原子选自一个或两个选自O，N或S的杂原子。杂环基环的实例包括但不限于氮杂卓基(azepinyl)，吖啶基(acridinyl)，咔唑基(carbazolyl)，噌啉基(cinnolinyl)，二氧戊环基(dioxolanyl)，咪唑啉基(imidazolinyl)，咪唑烷基(imidazolidinyl)，吗啉基(morpholinyl)，环氧乙烷基(oxiranyl)，oxepanyl，thiepanyl，哌啶基(piperidinyl)，哌嗪基(piperazinyl)，二氧代哌嗪基(dioxopiperazinyl)，吡咯烷基(pyrrolidinyl)，吡咯烷酮基(pyrrolidonyl)，pyrrolidionyl，4-哌啶酮基(4-piperidonyl)，吡唑啉基(pyrazolinyl)，吡唑烷基(pyrazolidinyl)，1,3-dioxinyl，1,3-二恶烷基(1,3-dioxanyl)，1,4-dioxinyl，1,4-二恶烷基(1,4-dioxanyl)，1,3-oxathianyl，1,4-oxathiinyl，1,4-oxathianyl，2H-1,2-恶嗪基(2H-1,2-oxazinyl)，三恶烷基(trioxanyl)，六氢-1,3,5-三嗪基(hexahydro-1,3,5-triazinyl)，1,3-dioxolyl，1,3-二氧戊环基(1,3-dioxolanyl)，1,3-二硫杂环戊二烯基(1,3-dithiolyl)，1,3-二硫戊环基(1,3-dithiolanyl)，异恶唑啉基(isoxazolinyl)，异恶唑烷基(isoxazolidinyl)，恶唑啉基(oxazolinyl)，恶唑烷基(oxazolidinyl)，恶唑烷酮基(oxazolidinonyl)，噻唑啉基(thiazolinyl)，噻唑烷基(thiazolidinyl)，1,3-氧硫杂环戊烷基(1,3-oxathiolanyl)，二氢吲哚基(indolinyl)，异二氢吲哚基(isoindolinyl)，四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl)，四氢吡喃基(tetrahydropyranyl)，四氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)，四氢硫代吡喃基(tetrahydrothiopyranyl)，四氢-1,4-噻嗪基(tetrahydro-1,4-thiazinyl)，硫吗啉基(thiamorpholinyl)，二氢苯并呋喃基(dihydrobenzofuranyl)，苯并咪唑烷基(benzimidazolidinyl)和四氢喹啉(tetrahydroquinoline)。
如本文中使用的，“杂亚环基”是指含有至少一个通过两个附着点与分子的其余部分附着的杂原子的非芳香族环状环或环系统。
如本文中使用的，“氨基”基团是指“-NRARB”基团，其中RA和RB各自独立地选自氢，C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基，C3-7碳环基，C6-10芳基，和5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文中定义的。非限制性实例包括游离氨基(即-NH2)。
如本文中使用的，术语“腙”或“腙基”是指基团。
如本文中使用的，术语“环氧(epoxy)”是指
如本文中使用的，术语“缩水甘油醚(glycidyl ether)”是指
如本文中使用的，术语“羧酸”或“羧基”是指-C(O)OH。
如本文中使用的，术语“四嗪”或“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可以是任选取代的。
如本文中使用的，“核苷酸”包括含氮的杂环碱基，糖和一个或多个磷酸基团。它们是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中是脱氧核糖，即缺少存在于核糖中2’位的羟基基团的糖。含氮的杂环碱基可以是嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。
如本文中使用的，“核苷”在结构上与核苷酸相似，但在5’位置缺乏任何磷酸模块。术语“核苷”在本文中以其普通意义使用，如本领域技术人员所理解的。实例包括但不限于包含核糖模块的核糖核苷和包含脱氧核糖模块的脱氧核糖核苷。修饰的戊糖模块是其中氧原子已经被碳替代和/或碳已经被硫或氧原子替代的戊糖部分。“核苷”是可以具有取代的碱基和/或糖模块的单体。另外，可以将核苷掺入较大的DNA和/或RNA聚合物和寡聚体。
如本文中使用的，术语“多核苷酸”是指通常指核酸，包括DNA(例如基因组DNAcDNA)，RNA(例如mRNA)，合成的寡核苷酸和合成的核酸类似物。多核苷酸可以包括天然或非天然碱基，或其组合和天然或非天然主链连接，例如，硫代磷酸酯，PNA或2’-O-甲基-RNA或其组合。
如本文中使用的，术语“引物”定义为具有游离3’OH基团和在5’末端的修饰以允许偶联反应的单链DNA(ssDNA)分子。“BCN引物”或“BCN修饰引物”是指在5’端包含共价附着的双环[6.1.0]壬-4-炔的引物。
如本文中使用的，术语“硅烷”是指含有一个或多个硅原子的有机或无机化合物。无机硅烷化合物的非限制性实例为SiH4或卤化SiH4，其中氢由一个或多个卤素原子替代。有机硅烷化合物的非限制性实例是X-RC-Si(ORD)3，其中X是不可水解的有机基团，如氨基，乙烯基，环氧基，甲基丙烯酸酯(methacrylate)，硫，烷基，烯基，炔基；RC为间隔物，例如-(CH2)n-，其中n为0至1000；RD选自氢，任选取代的烷基，任选取代的烯基，任选取代的炔基，任选取代的碳环基，任选取代的芳基，任选取代的5-10元杂芳基和任选取代的5-10元杂环基，如本文中定义的。如本文中使用，术语“硅烷”可以包括不同硅烷化合物的混合物。
如本文中使用的，术语“Yes方法”是指由Yield Engineering Systems(“YES”)(Livermore，CA)提供的化学气相沉积工具及由Illumina，Inc.开发的化学气相沉积工艺。它包括三种不同的气相沉积系统。自动化的YES-VertaCoat硅烷蒸气系统设计用于批量生产(volume production)，具有可容纳200或300mm晶片的柔性晶片处理模块。手动加载YES-1224P硅烷蒸气系统设计用于多功能批量生产，具有其可配置的大容量腔室。Yes-LabKote是一种低成本的桌面版本，其对于可行性研究和R&D是理想的。
如本文中使用的，取代的基团衍生自未取代的母体基团，其中已经有用一个或多个氢原子对另一个原子或基团的交换。除非另有说明，当基团被认为是“取代的”时，是指基团被一个或多个独立地选自下组的取代基取代：C1-C6烷基，C1-C6烯基，C1-C6炔基，C1-C6杂烷基，C3-C7碳环基(任选被卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)，C3-C7-碳环基-C1-C6烷基(任选被卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)，5-10元杂环基(任选被卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)，5-10元杂环基-C1-C6烷基(任选被卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)，芳基(任选被卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)，芳基(C1-C6)烷基(任选被卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)，5-10元杂芳基(任选被卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)，5-10元杂芳基(C1-C6)烷基(任选被卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)，卤素，氰基，羟基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即醚)，芳氧基，氢硫基(巯基)，卤代(C1-C6)烷基(例如–CF3)，卤代(C1-C6)烷氧基(例如–OCF3)，C1-C6烷基硫代(alkylthio)，芳基硫代(arylthio)，氨基，氨基(C1-C6)烷基，硝基，O-氨甲酰基，N-氨甲酰基，O-硫代氨甲酰基(O-thiocarbamyl)，N-硫代氨甲酰基，C-酰氨基(C-amido)，N-酰氨基，S-磺酰氨基(S-sulfonamido)，N-磺酰氨基，C-羧基，O-羧基，酰基，氰基，异氰氧基(isocyanato)，氰硫基(thiocyanato)，异氰硫基(isothiocyanato)，亚硫酰基(sulfinyl)，磺酰基(sulfonyl)和氧代(oxo)(＝O)。无论在何处将基团描述为“任选取代的”，该基团可以被上述取代基取代。
应当理解，取决于上下文，某些基(radical)命名约定可以包括单基(mono-radical)或二基(di-radical)。例如，当取代基需要与分子的其余部分的两个附着点时，应理解该取代基是二基。例如，鉴定为需要两个附着点的烷基的取代基包括二基，例如–CH2–，–CH2CH2–，–CH2CH(CH3)CH2–等。其它基命名约定清楚地表明该基是二基，如“亚烷基”或“亚烯基”。
无论何处取代基被描述为二基(即，具有与分子的其余部分的两个附着点)，应当理解，除非另有说明，该取代基可以以任何方向构型附着。
当本文中公开的化合物具有至少一个立体中心时，它们可以作为单独的对映异构体和非对映异构体或作为此类异构体的混合物(包括外消旋体)存在。单个异构体的分离或单个异构体的选择性合成是通过应用本领域技术人员公知的各种方法来完成的。除非另有说明，所有此类异构体及其混合物都包括在本文中公开的化合物的范围内。此外，本文中公开的化合物可以以一种或多种结晶或无定形形式存在。除非另有说明，所有此类形式包括在本文中公开的化合物的范围内，包括任何多晶形式。此外，本文中公开的一些化合物可与水(即水合物)或常见的有机溶剂形成溶剂合物。除非另有说明，此类溶剂合物包括在本文中公开的化合物的范围内。
本领域技术人员将认识到，本文中所述的一些结构可以是可以由其它化学结构完全表示的化合物的共振形式或互变异构体；技术人员认识到此类结构可以仅代表此类化合物的样品的非常小的一部分。此类化合物被认为在所示结构的范围内，尽管在本文中没有表示此类共振形式或互变异构体。
主体分子
本文中所述的一些实施方案涉及主体分子通过非共价相互作用形成主体/客体包合络合物的用途。主体/客体化学描述了由两个或更多个分子或离子组成的络合物，所述分子或离子通过除共价键之外的形式以独特的结构关系保持在一起。在未结合状态(其中主体和客体彼此分离)和结合状态(其中存在结构上定义的主体-客体复合物)之间存在热力学平衡。在一些实施方案中，主体分子包含亲水部分和疏水部分。
常见的主体分子是环糊精，杯芳烃(calixarenes)，pillararenes，瓜环(cucurbiturils)，卟啉，金属冠醚(metallacrowns)，冠醚(crown ether)，沸石，cyclotriveratrylenes，cryptophanes，carcerands和foldamers。在一些实施方案中，主体分子是任选取代的环糊精或其衍生物。
主体分子可以包含一个或多个用于与感兴趣的生物分子反应以形成共价键的官能团。在一些实施方案中，生物分子是寡核苷酸，如引物，或更长的分子，如多核苷酸。在一些实施方案中，主体分子包含一个或多个与炔或BCN官能化引物反应的叠氮基基团。
环糊精
如本文中使用的，术语“环糊精”包括任何已知的环糊精，如含有6至12个吡喃葡萄糖单元的任选取代的环糊精，特别是α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精和/或其衍生物和/或其混合物。α-环糊精由六个葡萄糖单元组成，β-环糊精由七个葡萄糖单元组成，而γ-环糊精由八个葡萄糖单元组成。环糊精可以在拓扑学上表示为圆环面(toroids)(即环形(donut)或圆锥形环(cone-shaped ring))，其中圆环面的较大的和较小的开口分别暴露于仲和伯羟基基团。葡萄糖单元的特定偶联和构象对环糊精给予刚性的、具有特定体积的中空内部的圆锥形分子结构。由于这种排列，环糊精的内部腔的“衬里(lining)”由氢原子和糖苷桥接氧原子形成；因此，该表面是相当疏水的，因此能够容纳其它疏水性分子。相反，外部是足够亲水的以对环糊精(或它们的复合物)赋予水溶性。图1示出了α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精及其相应的圆环面结构的结构。
环糊精与客体分子形成包合络合物的能力是两个因素的函数。第一个是空间的，并且取决于与客体分子或客体内的某些关键官能团的尺寸相比的环糊精的相对尺寸。如果客体是错误的尺寸，则其不能适当地配合到环糊精腔中。第二个因素是系统的不同组分(环糊精，客体，溶剂)之间的热力学相互作用。包囊的驱动力是亲水/疏水性质的，客体使其与极性溶剂的相互作用最小化，使得在环糊精的亲脂性腔内部掩蔽(taking shelter)。
用于环糊精内分子包囊的潜在客体分子是相当不同的，并且包括化合物，如直链或支链脂肪族，醛，酮，醇，有机酸，脂肪酸，芳香族化合物和极性化合物，如卤素，含氧酸和胺。
环糊精可以任选被一个或多个选自下组的取代基取代：C1-6烷基，氨基，C1-6卤代烷基，卤素，羟基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基，氰基，磺酰基或氧代。环糊精的衍生物包括其中一些OH基团转化为OR基团的分子。环糊精衍生物包括例如具有短链烷基基团的那些，如甲基化的环糊精和乙基化的环糊精，其中R是甲基或乙基基团；具有羟基烷基取代的基团的那些，如羟基丙基环糊精和/或羟基乙基环糊精，其中R是-CH2-CH(OH)-CH3或-CH2CH2-OH基团；支链环糊精，如麦芽糖键合的环糊精；阳离子环糊精，如含有2-羟基-3-(二甲基氨基)丙基醚的那些，其中R是CH2-CH(OH)-CH2-N(CH3)2；季铵，例如2-羟基-3-(三甲基铵基)丙基醚氯化物基团，其中R是CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3CI；阴离子环糊精如羧甲基环糊精，环糊精硫酸酯(cyclodextrin sulfate)和环糊精琥珀酸酯(cyclodextrin succinylate)；两性环糊精如羧甲基/季铵环糊精；其中至少一个吡喃葡萄糖单元具有3-6-脱水环麦芽糖(3-6-anhydro-cyclomalto)结构的环糊精，例如单-3-6-脱水环糊精。
在一些情况下，环糊精衍生物可包括基于环糊精的或环糊精官能化的聚合物或水凝胶材料。
本文中所述的环糊精或环糊精衍生物还可以包含一个或多个能与感兴趣的生物分子形成共价键键合的反应性官能团。在一些实施方案中，环糊精主体分子包含一个或多个可用于与一个或多个官能化生物分子如引物反应的叠氮基基团。
生物分子
如本文中使用，感兴趣的生物分子的非限制性实例包括氨基酸，肽，核苷酸(例如单磷酸酯，二磷酸酯或三磷酸酯形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，寡核苷酸，多核苷酸，蛋白质，糖，多糖或它们的组合。生物分子可以包含一个或多个能够与主体分子形成共价键键合的官能团。在一些实施方案中，生物分子包含可以与主体分子的一个或多个官能团反应的官能化寡核苷酸或引物。在一些实施方案中，生物分子是能够与主体分子的一个或多个官能团反应的官能化寡核苷酸或引物。在一些实施方案中，主体分子是环糊精或任选取代的其变体和衍生物。在一些此类实施方案中，将生物分子附着到环糊精的亲水部分，即环糊精的环形面结构的外壁。
官能化寡核苷酸或引物的非限制性实例包括炔或双环[6.1.0]壬炔(“BCN”)官能化寡核苷酸，或任何其它包含应变环系统(strained ring system)的官能化寡核苷酸，所述应变环系统能够经受应变促进性叠氮化物-炔环加成，如叠氮化物环辛炔反应，如本领域普通技术人员所理解的。关于应变促进的叠氮化物-烯烃或叠氮化物-炔烃环加成的另外的信息可以参见美国系列号14/316,478，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，将官能化寡核苷酸预缀合(pre-conjugated)到聚合物，并且聚合物包含可与主体分子形成共价键键合的一个或多个官能团。可用于本文中所述的实施方案的聚合物的非限制性实例可以参见美国系列号13/784,368和美国专利公开号2011/0059865，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文中所述的聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)聚合物由式(Ia)或(Ib)表示：
其中n为1-20,000范围内的整数，并且m为1-100,000范围内的整数。可与PAZAM反应的寡核苷酸或引物的非限制性实例包括炔或双环[6.1.0]壬炔(“BCN”)官能化寡核苷酸，或任何其它包含应变环系统的官能化寡核苷酸，所述应变环系统能够经受应变促进性叠氮化物-炔环加成。在一些此类实施方案中，主体分子包含一个或多个可与PAZAM的叠氮基基团反应的炔基基团。
其它预缀合的寡核苷酸可以包含一个或多个官能团，如氨基，叠氮基，羧酸，酸酐，四嗪，环氧基，缩水甘油醚，乙烯基，丙烯酰基(acryloyl)，烯基，环烯基，杂环烯基，炔基，环炔基，杂环炔基，氮宾(nitrene)，醛，肼基(hydrazinyl)或马来酰亚胺基团，其可以与主体分子的一个或多个官能团反应。在一个实施方案中，预缀合的寡核苷酸可以包含一个或多个与主体分子的一个或多个应变环烯烃基团(如反式环辛烯)反应的四嗪基团。在另一个实施方案中，预缀合的寡核苷酸可以包含与主体分子的一个或多个氨基反应的一个或多个环氧基，羧酸，酸酐或缩水甘油醚基团。在另一个实施方案中，预缀合的寡核苷酸可以包含一个或多个与主体分子的一个或多个环氧基或缩水甘油醚基团反应的氨基基团。
官能化硅烷
本文中公开的一些实施方案涉及包含可与主体分子形成主体-客体复合物的模块的官能化硅烷。在一些实施方案中，官能化硅烷包括疏水模块。在一些实施方案中，疏水模块包括芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，环炔基或金刚烷基，或任选取代的变体。在一些此类实施方案中，芳基可以是苯基。在这些实施方案的一些中，每个杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基或环炔基基团可以选自5、6、7、8、9或10元环系统。
在一些实施方案中，环烯选自降冰片烯或降冰片烯衍生物，例如(杂)降冰片烯，其中降冰片烯分子中的一个或多个碳原子被一个或多个杂原子取代。其它环烯烃的非限制性实例包括任选取代的环辛烯，任选取代的环戊烯，任选取代的环己烯，任选取代的环庚烯，任选取代的环壬烯，任选取代的双环[3.3.1]壬-1-烯，任选取代的双环[4.3.1]癸-1(9)-烯，任选取代的双环[4.2.1]壬-1(8)-烯和任选取代的双环[4.2.1]-壬-1-烯。
在一些实施方案中，环炔是环辛炔或环辛炔衍生物。环辛炔衍生物的非限制性实例包括以下结构：
在一些其它实施方案中，官能化硅烷的疏水部分包括环烷基，如环己基，或其任选取代的变体。
在一些其它实施方案中，疏水模块包含脂族基团，如直链或支链烷基。
在本文中所述的任何实施方案中，疏水模块可以任选被一个或多个选自下组的取代基取代：C1-6烷基，氨基，C1-6卤代烷基，卤素，羟基，羧基，C1-6烷氧基，C1-6卤代烷氧基，氰基，磺酰基，硫醇或氧代。在一些此类实施方案中，疏水模块可以任选地被羟基取代。
基底
在一些实施方案中，本申请中使用的基底包括基于二氧化硅(silica)的基底，如玻璃，融合的二氧化硅和其它含二氧化硅的材料。在一些实施方案中，基于二氧化硅(silica)的基底也可以是硅，二氧化硅(silicon dioxide)，氮化硅，硅酮氢化物(siliconehydride)。在一些实施方案中，本申请中使用的基底包括塑料材料，如聚乙烯，聚苯乙烯，聚(氯乙烯)，聚丙烯，尼龙，聚酯，聚碳酸酯和聚(甲基丙烯酸甲酯)。优选的塑料材料是聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚苯乙烯和环烯烃聚合物基底(cyclic olefin polymer substrate)。在一些实施方案中，基底是基于二氧化硅(silica)的材料或塑料材料。在一个实施方案中，基底具有至少一个包含玻璃的表面。
在一些其它实施方案中，基底可以是金属，如金，或金属氧化物，如氧化钽。
丙烯酰胺，烯酮(enone)或丙烯酸酯(acrylate)也可以用作基底材料。其它基底材料可包括但不限于砷化镓(gallium arsenide)，磷化铟(indium phosphide)，铝，陶瓷，聚酰亚胺(polyimide)，石英，树脂，聚合物和共聚物。前述列表旨在说明但不受限于本申请。
基底可包括单一材料或多种不同材料。基底可以是复合材料(composites)或层压材料(laminates)。基底可以是平的，圆形，有织纹的和有图案的(patterned)。图案(pattern)可以例如通过在非金属表面上形成特征的金属垫(metal pad)形成，例如，如记载于美国专利No.8,778,849，其通过引用并入本文。另一有用的有图案的表面是具有在表面上形成的孔特征的表面，例如，记载于美国系列号13/787,396，美国专利申请公开号2011/0172118A1或美国专利号7,622,294，其各自通过引用并入本文。对于使用有图案的基底的实施方案，可以将凝胶选择性附着到图案特征(例如可以将凝胶附着到金属垫或可以将凝胶附着到孔的内部)，或者备选地可以在图案特征和间隙区域两者间均匀地附着凝胶。
在一些实施方案中，基底的表面包含功能性分子包被的区域和没有涂层材料的惰性区域二者。在一些此类实施方案中，官能化分子涂层材料是水凝胶或聚合物涂层材料。功能性分子包被的区域可以包含反应性位点，因此可以用于通过化学键键合或其它分子相互作用附着分子。在一些实施方案中，功能性分子包被的区域(例如反应性特征，垫，珠或孔)和惰性区域(称为间隙区域)可交替以形成图案或网格。此类图案可以是一维或二维的。在一些实施方案中，惰性区域可以选自玻璃区域，金属区域，掩模区域(mask region)或间隙区域或其组合。或者，这些材料可形成反应性区域。惰性或反应性将取决于在基底上使用的化学和过程。在一个实施方案中，表面包括玻璃区域。在另一个实施方案中，表面包括金属区域。在又一个实施方案中，表面包括掩模区域。在本文中所述的组合物的一些实施方案中，基底可以是珠。可以用本公开的聚合物包被或者可以在其它情况下在本文中列出的组合物或方法中使用的非限制性示例性基底材料描述于美国专利号8,778,848和8,778,849中，其各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文中所述的基底形成流动池的至少一部分，或位于流动池中。在一些此类实施方案中，流动池还包含通过功能性分子涂层材料(例如聚合物涂层材料)附着于基底表面的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸存在于多核苷酸簇中的流动池中，其中经由聚合物涂层材料将多核苷酸簇的多核苷酸附着到流动池的表面。在此类实施方案中，附着有多核苷酸的流动池体的表面被认为是基底。在其它实施方案中，将具有聚合物包被的表面的单独基底插入流动池的主体中。在一些实施方案中，流动池是被分成多个道(lane)或多个部分(sector)的流动室，其中多个道或多个部分中的一个或多个包括用本文中描述的共价附着的聚合物涂层材料包被的表面。在本文中所述的流动池的一些实施方案中，单个多核苷酸簇内的附着的多核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列。在本文中所述的流动池的一些实施方案中，不同多核苷酸簇的附着的多核苷酸具有不同或非相似的核苷酸序列。用于制造可用于本文中列出的方法或组合物的流动池的示例性流动池和基底包括但不限于可从Illumina，Inc.(San Diego，CA)商业获得或在US 2010/0111768 A1或US2012/0270305(其各自通过引用整体并入本文)中描述的那些。
测序应用
本文中阐述的方法可使用多种扩增技术中的任一种。可以使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，滚环扩增(RCA)，多重置换扩增(MDA)或随机引发扩增(random prime amplification，RPA)。在具体实施方案中，可以将用于扩增的一种或多种引物附着到聚合物涂层材料。在PCR实施方案中，可以将用于扩增的一种或两种引物附着到聚合物涂层材料。利用两种附着引物的形式通常被称为桥式扩增，因为双链扩增子在已被复制的模板序列侧翼的两个附着引物之间形成桥样结构。可用于桥式扩增的示例性试剂和条件描述于例如美国专利号5,641,658；美国专利公开号2002/0055100；美国专利号7,115,400；美国专利公开号2004/0096853；美国专利公开号2004/0002090；美国专利公开号2007/0128624；和美国专利公开号2008/0009420，其全部内容各自以引用的方式并入本文中。
也可以使用附着到聚合物涂层材料的扩增引物之一和溶液中的第二引物进行PCR扩增。使用一种附着的引物和可溶性引物的组合的示例性形式是乳液PCR，如例如Dressman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)，WO 05/010145，或美国专利公开号2005/0130173或2005/0064460中描述的，其各自通过引用并入本文。乳液PCR例示了所述形式，并且应当理解，为了本文中列出的方法的目的，乳液的使用是任选的，并且实际上对于几个实施方案，不使用乳液。此外，引物不需要如ePCR参考文献中所述直接附着到基底或固体支持物上，而是可以附着到如本文中列出的聚合物涂层材料。
可以修改RCA技术以用于本公开的方法中。可用于RCA反应的示例性组分和RCA产生扩增子的原理描述于例如Lizardi等人,Nat.Genet.19:225-232(1998)和US 2007/0099208 A1，其各自通过引用并入本文。用于RCA的引物可以在溶液中或附着到聚合物涂层材料。
可以修改MDA技术以用于本公开的方法中。MDA的一些基本原理和有用的条件描述于例如Dean等人,Proc Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)；Lage等人,GenomeResearch 13:294-307(2003)；Walker等人,Molecular Methods for Virus Detection,Academic Press,Inc.,1995；Walker等人,Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)；US 5,455,166；US 5,130,238；以及US 6,214,587，其各自通过引用并入本文。用于MDA的引物可以在溶液中或附着到聚合物涂层材料。
在具体实施方案中，可以使用上述例举的扩增技术的组合。例如，可以组合使用RCA和MDA，其中RCA用于在溶液中产生连环体扩增子(concatameric amplicon)(例如使用溶液相引物)。然后，可以使用附着到聚合物涂层材料的引物将扩增子用作MDA的模板。在该实例中，将在组合的RCA和MDA步骤之后产生的扩增子附着到聚合物涂层材料。
在一些实施方案中，本文中所述的官能化水凝胶或聚合物包被的基底可用于测定多核苷酸的核苷酸序列。在此类实施方案中，所述方法可以包括以下步骤：(a)使多核苷酸聚合酶与通过本文中所述的聚合物或水凝胶涂层材料中的任一种附着到基底表面的多核苷酸簇接触；(b)向所述基底的聚合物包被的表面提供核苷酸，使得当所述多核苷酸聚合酶利用一个或多个核苷酸时产生可检测的信号；(c)检测一个或多个多核苷酸簇处的信号；并且(d)重复步骤(b)和(c)，从而确定存在于一个或多个多核苷酸簇处的多核苷酸的核苷酸序列。
核酸测序可以用于通过本领域已知的各种方法确定多核苷酸的核苷酸序列。在优选的方法中，利用合成测序(SBS)来测定通过本文中所述的任何一种聚合物涂层材料附着到基底表面的多核苷酸的核苷酸序列。在此类方法中，向与多核苷酸聚合酶缔合的模板多核苷酸提供一个或多个核苷酸。多核苷酸聚合酶将一个或多个核苷酸掺入新合成的与多核苷酸模板互补的核酸链中。从寡核苷酸引物启动合成，所述寡核苷酸引物与模板多核苷酸的一部分或与在模板多核苷酸的一端共价结合的通用或非可变核酸的一部分互补。当针对模板多核苷酸掺入核苷酸时，产生可检测的信号，其允许测定在测序过程的每个步骤期间掺入了哪种核苷酸。以这种方式，可以产生与模板多核苷酸的至少一部分互补的核酸序列，从而允许测定模板多核苷酸的至少一部分的核苷酸序列。流动池提供用于容纳由本公开的方法产生并经历合成测序(SBS)或其它检测技术的阵列的方便的形式，所述检测技术牵涉循环中重复递送试剂。例如，为了启动第一SBS循环，可以使一种或多种标记的核苷酸，DNA聚合酶等流入/通过容纳通过本文中列出的方法制备的核酸阵列的流动池。可以检测引物延伸引起标记的核苷酸被掺入的阵列的那些位点。任选地，核苷酸还可以包括一旦已经将核苷酸添加到引物就终止进一步引物延伸的可逆终止性质。例如，可以将具有可逆终止剂模块的核苷酸类似物添加到引物，使得不能发生随后的延伸，直到递送去封闭剂以除去该模块。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将去封闭剂递送到流动池(在检测发生之前或之后)。可以在各个递送步骤之间进行清洗。然后可以将该循环重复n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可容易地适于与由本公开的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序，流体系统和检测平台描述于例如Bentley等人,Nature 456:53-59(2008)，WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281，及US 2008/0108082，其各自通过引用整体并入本文。
可以使用使用循环反应的其它测序程序，如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测在将特定核苷酸掺入新生核酸链时无机焦磷酸(PPi)的释放(Ronaghi等人,AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi等人Science 281(5375),363(1998)；US 6,210,891；US 6,258,568和US 6,274,320，其各自通过引用整体并入本文)。在焦磷酸测序中，可以通过ATP硫酸化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测释放的PPi，并且可以通过萤光素酶产生的光子检测产生的ATP的水平。因此，可以通过发光检测系统监测测序反应。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源对于焦磷酸测序程序不是必需的。可用于将焦磷酸测序应用于本公开的阵列的有用的流体系统，检测器和程序描述于例如WO 12/058096 A1，US 2005/0191698 A1，US 7,595,883，和US 7,244,559中，其各自通过引用整体并入本文。
连接测序反应(sequencing-by-ligation)也是有用的，包括例如Shendure等人Science 309:1728-1732(2005)；US 5,599,675；和US 5,750,341，其各自通过引用整体并入本文。一些实施方案可以包括杂交测序(sequencing-by-hybridization)方法，如描述于例如Bains等人,Journal of Theoretical Biology 135(3),303-7(1988)；Drmanac等人,Nature Biotechnology 16,54-58(1998)；Fodor等人,Science 251(4995),767-773(1995)；和WO 1989/10977的，其各自通过引用整体并入本文。在连接测序和杂交测序过程中，存在于阵列位点的核酸经历寡核苷酸递送和检测的重复循环。本文中或本文中引用的参考文献中列出的用于SBS方法的流体系统可以容易地适用于递送用于连接测序或杂交测序程序的试剂。通常，寡核苷酸是荧光标记的，并且可以使用与关于本文中或本文中引用的参考文献中的SBS程序描述的荧光检测器类似的荧光检测器来检测。
一些实施方案可以利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如，可以通过带荧光团的聚合酶和γ-磷酸盐标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用或者用Zeromode波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。用于基于FRET的测序的技术和试剂描述于例如Levene等人Science 299,682–686(2003)；Lundquist等人Opt.Lett.33,1026–1028(2008)；Korlach等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176–1181(2008)，其公开内容通过引用整体并入本文。
一些SBS实施方案包括检测在将核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子。例如，基于检测释放的质子的测序可以使用可从Ion Torrent(Guilford,CT,a Life Technologies子公司)购得的电检测器和相关技术或US 2009/0026082A1；US 2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1；或US 2010/0282617 A1(其各自通过引用整体并入本文)中描述的测序方法和系统。
本公开的阵列的另一个有用的应用(例如已经通过本文中列出的方法产生)是基因表达分析。可以使用RNA测序技术(如称为数字RNA测序的那些技术)检测或量化基因表达。RNA测序技术可以使用本领域已知的测序方法(如上文列出的那些)进行。还可以使用通过与阵列的直接杂交或使用多重测定进行的杂交技术来检测或量化基因表达，所述杂交技术的产物在阵列上检测。本公开的阵列(例如已经通过本文中列出的方法产生)也可以用于确定来自一个或多个个体的基因组DNA样品的基因型。可以在本公开的阵列上进行的用于基于阵列的表达和基因分型分析的示例性方法描述于美国专利号7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或美国专利公开号2005/0053980 A1；2009/0186349 A1或US 2005/0181440 A1，其各自通过引用整体并入本文。
在采用流动池的上述方法的一些实施方案中，在单个流动步骤期间在流动池中仅存在单一类型的核苷酸。在此类实施方案中，核苷酸可以选自下组：dATP，dCTP，dGTP，dTTP及其类似物。在采用流动池的上述方法的其它实施方案中，在单个流动步骤期间，在流动池中存在多种不同类型的核苷酸。在此类方法中，核苷酸可以选自下组：dATP，dCTP，dGTP，dTTP及其类似物。
在用于一个或多个多核苷酸的每个流动步骤期间掺入的一个或多个核苷酸的测定通过检测在多核苷酸模板处或附近产生的信号来实现，所述多核苷酸附着于流动池中存在的基底表面上的聚合物涂层材料。在上述方法的一些实施方案中，可检测信号包括光信号。在其它实施方案中，可检测信号包括非光信号。在此类实施方案中，非光学信号包括在一个或多个多核苷酸模板处或附近的pH变化。
实施例
在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例不以任何方式意图限制权利要求的范围。
实施例1
图2示出了将生物分子可逆地附着到硅烷官能化表面的方法的实施方案。首先，通过化学气相沉积(CVD)用包含疏水部分的官能化硅烷处理包含玻璃表面的基底。使用环糊精作为主体分子，并且通过与环糊精的一个或多个叠氮基基团反应将官能化引物接枝到环糊精上。然后，使硅烷化表面与环糊精键合的引物接触，使得硅烷的疏水头部经由可逆相互作用与环糊精的内腔形成主体-客体包含络合物。结果，将引物固定于基底的表面。在标准聚簇和测序过程之后，通过添加1,8-辛二醇(比官能化硅烷的疏水头部对环糊精内腔更大的亲和力的分子)将环糊精从表面解离，并且清洗和再生硅烷化玻璃表面。在下文下述实施例中更详细地讨论该过程。
实施例2
在第一项实验中，将异硫氰酸荧光素(FITC)官能化的环糊精与降冰片烯硅烷官能化的表面在50℃反应30分钟，然后用不同的溶剂漂洗。用于制备此类降冰片烯硅烷官能化表面的方法详细描述于美国专利申请系列号14/316,478，其通过引用整体并入本文。
在该实验中，使用标准的降冰片烯硅烷[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷硅烷化和流动池。降冰片烯模块是亲脂性的，并且可以作为环糊精的客体起作用。根据从文献获得的分子机械预测(molecular mechanic prediction)，仅来自降冰片烯的桥接亚甲基将适配到环糊精的内腔中(约-2kcal/mol的结合自由能)。也可以使用具有更稳定的主体-客体络合物的其它可能的客体，例如包含平面芳香族环如苯基或萘基的客体更适合β-环糊精。参见Wickstrom等人，“Large Scale AffinityCalculations of Cyclodextrin Host–Guest Complexes:Understanding the Role ofReorganization in the Molecular Recognition Process,”J.Chem.Theory Comput.,2013,9(7),pp.3136–3150。
在将流动池硅烷化后，将其在先前已用P5和P7寡聚物的混合物接枝的环糊精存在下温育。通过经由铜定向的环加成使叠氮基官能化的环糊精与炔封端(terminated)的P5和P7寡聚物的混合物反应制备预接枝的环糊精，如下面描述的方案所示。
或者，引物也可在其锚定到硅烷官能化表面之后附着到环糊精上。孵育后，清洗流动池并在表面上进行TET QC。下面讨论了对于HiSeq流动池获得的结果。
获得的荧光计数为约1000。相比之下，在非硅烷化流动池上进行的实验没有观察到信号，表明在环糊精和表面降冰片烯之间存在分子识别，并且这允许在表面上固定引物形式的DNA。如图3A中表明，固定于降冰片烯硅烷官能化表面的引物缀合的环糊精聚合物的Typhoon图像证明环糊精是附着于表面的。如图3B中显示的中值Typhoon强度图提示环糊精不是共价附着到表面的。
因此，发现可以通过涉及疏水性硅烷和环糊精的主体-客体包合络合物将DNA附着到玻璃表面。此外，由此形成在表面上的少量包合络合物对于TET QC，清洗和聚集必需的流动是稳定的。
可以通过使用不同的疏水性硅烷，或通过调节(tweaking)此硅烷的表面覆盖度或通过选择不同的环糊精或聚合环糊精(附着在一起的多个环糊精以增加层的尺寸及其稳定性)以获得更稳定的包合络合物，或通过寻找环糊精锚定在表面上的正确条件来进一步改进该系统。

Claims (38)

1.用于将生物分子可逆地固定到基底表面的方法，所述方法包括：
提供与主体分子共价键合的生物分子，所述主体分子包含亲水部分和疏水部分；
提供具有表面的基底，所述表面包含与其共价附着的官能化硅烷，其中所述官能化硅烷包含能与所述主体分子形成主体-客体络合物的客体模块；
使所述生物分子与所述官能化硅烷接触，使得通过所述官能化硅烷和所述主体分子之间的主体-客体可逆相互作用将所述生物分子固定于所述表面。
2.权利要求1的方法，其中所述主体-客体相互作用是所述官能化硅烷的所述客体模块和所述主体分子之间的非共价相互作用。
3.权利要求1或2的方法，其中所述官能化硅烷的所述客体模块包含疏水模块。
4.权利要求3的方法，其中所述主体-客体非共价相互作用在所述官能化硅烷的疏水模块和所述主体分子的疏水部分之间。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述生物分子包含氨基酸，肽，核苷，核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸，蛋白质，糖，多糖或其组合。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述生物分子存在于细胞，病毒或颗粒上，从而通过所述官能化硅烷和所述主体分子之间的主体-客体相互作用固定所述细胞，病毒或颗粒。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述生物分子包含寡核苷酸。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中将所述生物分子与所述主体分子的亲水部分共价键合。
9.权利要求7或8的方法，所述方法还包括从所述寡核苷酸产生多核苷酸的聚簇阵列。
10.权利要求1至9中任一项的方法，所述方法还包括从所述基底的表面解离所述主体分子。
11.权利要求10的方法，其中通过添加比所述官能化硅烷的客体模块对所述主体分子更大的亲和力的分子来实现所述解离。
12.权利要求11的方法，其中通过添加比所述官能化硅烷的疏水模块对所述主体分子的疏水部分更大的亲和力的分子来实现所述解离。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述主体分子是任选取代的环糊精或其衍生物。
14.权利要求13的方法，其中所述主体分子是β-环糊精。
15.权利要求12至14中任一项的方法，其中对所述主体分子的疏水部分更大的亲和力的所述分子是1,8-辛二醇。
16.权利要求1至15中任一项的方法，还包括清洗步骤以再循环所述基底。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述基底的表面包括玻璃。
18.权利要求1至17中任一项的方法，其中所述官能化硅烷的客体模块包括芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，环炔基或金刚烷基(adamantyl)或其任选取代的变体。
19.权利要求1至18中任一项的方法，其中用一个或多个氟基团取代所述客体模块。
20.权利要求18的方法，其中所述客体模块包含芳基。
21.权利要求18的方法，其中所述客体模块包括环烯基。
22.权利要求21的方法，其中所述环烯基是降冰片烯。
23.基底，所述基底包含固定到所述基底的表面的生物分子，
其中所述生物分子与包含疏水部分和亲水部分的主体分子共价键合；
其中所述基底的所述表面包含与其共价附着的官能化硅烷，并且所述官能化硅烷包含能与所述主体分子形成主体-客体络合物的客体模块；且
其中所述生物分子通过所述官能化硅烷和所述主体分子之间的主体-客体相互作用固定。
24.权利要求23的基底，其中所述主体-客体相互作用是所述官能化硅烷的客体模块和所述主体分子之间的非共价相互作用。
25.权利要求23或24的基底，其中所述官能化硅烷的客体模块包含疏水模块。
26.权利要求25的基底，其中所述主体-客体非共价相互作用在所述主体分子的疏水部分和所述官能化硅烷的疏水模块之间。
27.权利要求23至26中任一项的基底，其中所述生物分子包含氨基酸，肽，核苷，核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸，蛋白质，糖，多糖或其组合。
28.权利要求23至27中任一项的基底，其中所述生物分子存在于细胞，病毒或颗粒上，从而通过所述官能化硅烷和所述主体分子之间的主体-客体相互作用固定所述细胞，病毒或颗粒。
29.权利要求23至28中任一项的基底，其中所述生物分子包含寡核苷酸或多核苷酸。
30.权利要求23至29中任一项的基底，其中所述生物分子与所述主体分子的亲水部分共价键合。
31.权利要求23至30中任一项的基底，其中所述主体分子是任选取代的环糊精或其衍生物。
32.权利要求31的基底，其中所述主体分子是β-环糊精。
33.权利要求23至32中任一项的基底，其中所述基底的表面包括玻璃。
34.权利要求23至33中任一项的基底，其中所述官能化硅烷的客体模块包括芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基或金刚烷基，或其任选取代的变体。
35.权利要求23至34中任一项的基底，其中用一个或多个氟基团取代所述客体模块。
36.权利要求34的基底，其中所述疏水模块包括芳基。
37.权利要求34的基底，其中所述疏水模块包括环烯基。
38.权利要求37的基底，其中所述环烯基是降冰片烯。
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