JP2014506999A - 検出可能な標識の標的限局性の係留のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

分子標的及び他の当該分析物の検出で使用するための反応性が高い官能化された基材及びリンカー分子が、それを利用するキット、反応混合物及び方法のように提供される。
【選択図】図１

Description

関連出願との相互参照
本出願は、あらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１１年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／４４３，５６０号に対して優先権を主張する。

生体分子の検出のための現在の方法の多くは生体分子用の標識として適用される蛍光色素の使用に頼っている。大きな設置面積でコストの高い機器を使用しない場合、少なくとも数千の蛍光色素分子が一般に検出に必要とされる。他の技法は、標識として利用される磁気粒子によって生体分子を検出する磁気センサーアレイを利用する。これらのアプローチはコンピュータのハードディスク装置におけるものに類似する感度の高い磁気センサーを利用する。しかしながら、高い感度で生体分子を検出する現在利用可能な方法の能力を限定する技術的な課題が存在する。たとえば、検出に使用される標識に比べて生体分子のサイズと質量の間に大きな相違が存在する可能性があり、それによって検出のために基材表面に標識を係留するのが困難になっている。本開示はこれらの課題に対処し、関連する利点を提供する。

分子標的及び他の当該分析物の検出に使用するための反応性が高い官能化した基材及びリンカー分子が、それらを利用するキット、反応混合物及び方法のように提供される。

第１の態様では、本開示は、支持材と、支持材の表面に結合した１以上の標的特異的な捕捉プローブと、支持材の表面に結合した複数の合成の天然には存在しない分子を含む官能化した基材を提供し、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、天然に存在するタンパク質又は核酸に見られるものより高い濃度で存在する芳香族の共有結合形成性の反応基を含む。

第１の態様の一実施形態では、芳香族の共有結合形成性の反応基（複数）の芳香族の共有結合形成性の反応基（単数）は、合成の天然には存在しない分子の１つの露出した末端に位置付けられる。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子はチロシンもチミンも含有しない。

第１の態様の一実施形態では、官能化された基材は、天然に存在するタンパク質又は組織に見られるものより多くの数の、単位面積当たりの共有結合形成性の反応基を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、天然に存在するタンパク質又は核酸の共有結合形成性の反応基よりも高い反応性を有する共有結合形成性の反応基を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、チミン及びチロシンよりも高い反応性を有する共有結合形成性の反応基を含む。

第１の態様の一実施形態では、支持材は珪素を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、デンドリマー構造を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、チロシンアミノ酸を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、フェノール／カルボン酸コポリマーを含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、フェノール基及びアミノ基を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、リジン及びチロシンアミノ酸を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、チラミン又はチラミン誘導体を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、チミン又はチミン誘導体を含む。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子は、天然に存在するタンパク質で見られるものより高い濃度で存在する共有結合形成性の反応基を含むポリペプチドである。

第１の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子は、天然に存在するオリゴヌクレオチドで見られるものより高い濃度で存在する共有結合形成性の反応基を含むオリゴヌクレオチドである。

第１の態様の一実施形態では、官能化された基材は、複数の標的特異的な捕捉プローブを含み、標的特異的な捕捉プローブはオリゴヌクレオチドである。

第１の態様の一実施形態では、官能化された基材は、複数の標的特異的な捕捉プローブを含み、標的特異的な捕捉プローブはポリペプチドである。そのような一実施形態では、ポリペプチドは抗体又はその断片である。

第２の態様では、本開示は、支持材の表面に結合した複数の合成の天然には存在しない分子によって官能化された表面を含む検出可能な標識粒子を提供し、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、天然に存在するタンパク質又は核酸で見られるものよりも高い濃度で存在する芳香族の共有結合形成性の反応基を含む。

第２の態様の一実施形態では、芳香族の共有結合形成性の反応基（複数）の芳香族の共有結合形成性の反応基（単数）は、合成の天然には存在しない分子の１つの露出した末端に位置付けられる。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子はチロシンもチミンも含有しない。

第２の態様の一実施形態では、官能化された基材は、天然に存在するタンパク質又は組織に見られるものより多くの数の、単位面積当たりの共有結合形成性の反応基を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、天然に存在するタンパク質又は核酸の共有結合形成性の反応基よりも高い反応性を有する共有結合形成性の反応基を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、チミン及びチロシンよりも高い反応性を有する共有結合形成性の反応基を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、デンドリマー構造を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、チロシンアミノ酸を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、フェノール／カルボン酸コポリマーを含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、フェノール基及びアミノ基を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、リジン及びチロシンアミノ酸を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、チラミン又はチラミン誘導体を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子のそれぞれは、チミン又はチミン誘導体を含む。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子は、天然に存在するタンパク質で見られるものより高い濃度で存在する共有結合形成性の反応基を含むポリペプチドである。

第２の態様の一実施形態では、合成の天然には存在しない分子は、天然に存在するオリゴヌクレオチドで見られるものより高い濃度で存在する共有結合形成性の反応基を含むオリゴヌクレオチドである。

第２の態様の一実施形態では、粒子は磁気物質を含む。

第３の態様では、本開示は、その使用のための指示書と共に包装された組み合わせにて上述の実施形態のいずれか１つの官能化された基材を含むキットを提供する。

第３の態様の一実施形態では、キットはさらに、複数の検出可能な標識粒子を含み、複数の検出可能な標識粒子のそれぞれは、検出可能な標識粒子の表面に結合した複数の分子で官能化されて官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合した複数の分子のそれぞれは共有結合形成性の反応基を含む。

第３の態様の一実施形態では、キットはさらに、複数のリンカー分子を含み、複数のリンカー分子のそれぞれのリンカー分子は共有結合形成性の反応基を含む。そのような一実施形態では、キットはさらに、複数の検出可能な標識粒子を含み、複数の検出可能な標識粒子のそれぞれは、検出可能な標識粒子の表面に結合した複数の分子で官能化されて官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合した分子のそれぞれは１以上のリンカー分子を結合するように構成される結合部分を含む。結合部分はリンカー分子の１以上を非共有結合で結合するように構成され得る。一実施形態では、結合部分はビオチン又はストレプトアビジンである。一実施形態では、結合部分がストレプトアビジンである場合、リンカー分子はビオチンを含む。代替の実施形態では、結合部分がビオチンである場合、リンカー分子はストレプトアビジンを含む。

第３の態様の一実施形態では、キットはさらに複数の検出可能な標識粒子を含み、複数の検出可能な標識粒子のそれぞれは、検出可能な標識粒子の表面に結合した複数の分子で官能化されて官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合した分子のそれぞれは１以上のリンカー分子を結合するように構成される結合部分を含み、官能化された検出可能な標識粒子は官能化された磁気ビーズである。そのような一実施形態では、官能化された磁気ビーズは約１００ｎｍ〜約１μｍの直径を有する。別の実施形態では、官能化された磁気ビーズは約１μｍ以上の直径を有する。

第４の態様では、本開示は、（ａ）支持材と、支持材の表面に結合した１以上の標的特異的な捕捉プローブと、合成の天然には存在しない分子のそれぞれが第１の共有結合形成性の反応基を含む、支持材の表面に結合した複数の合成の天然には存在しない分子を含む官能化された基材、及び（ｂ）複数の官能化された検出可能な標識粒子を含む反応混合物を提供し、官能化された検出可能な標識粒子のそれぞれは、検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子を含んで官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子のそれぞれは第２の共有結合形成性の反応基を含む。

第４の態様の一実施形態では、反応混合物はさらに、１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子を含む。そのような一実施形態では、反応混合物はさらに、標的分子に特異的に結合する標識プローブを含む。そのような一実施形態では、反応混合物はさらに、標識プローブに特異的に結合する酵素抱合体を含む。そのような一実施形態では、複数の官能化された検出可能な標識粒子の官能化された検出可能な標識粒子（単数）は、第１の共有結合形成性の反応基の第２の共有結合形成性の反応基との相互作用を介して１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子の近傍にて、複数の共有結合を介して支持材の表面に連結される。そのような一実施形態では、反応混合物は、複数の空間的に離れた個々に検出可能な標的部位を含む。

一実施形態では、複数の官能化された検出可能な標識粒子の官能化された検出可能な標識粒子（単数）が、第１の共有結合形成性の反応基の第２の共有結合形成性の反応基との相互作用を介して１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子の近傍にて、複数の共有結合を介して支持材の表面に連結される場合、標的分子は約１００ｆＭ未満の濃度で反応混合物中に存在する。

別の実施形態では、複数の官能化された検出可能な標識粒子の官能化された検出可能な標識粒子（単数）が、第１の共有結合形成性の反応基の第２の共有結合形成性の反応基との相互作用を介して１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子の近傍にて、複数の共有結合を介して支持材の表面に連結される場合、標的分子は約０．１ｆＭ〜約１００ｆＭの濃度で反応混合物中に存在する。

第５の態様の一実施形態では、本開示は、（ａ）支持材と、支持材の表面に結合した１以上の標的特異的な捕捉プローブと、合成の天然には存在しない分子のそれぞれが第１の共有結合形成性の反応基を含む、支持材の表面に結合した複数の合成の天然には存在しない分子を含む官能化された基材；（ｂ）複数の官能化された検出可能な標識粒子のそれぞれが検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子を含んで官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子のそれぞれが特異的な結合対のメンバーを含む、複数の官能化された検出可能な標識粒子；及び（ｃ）複数のリンカー分子の各リンカー分子が、官能化された検出可能な標識の表面に結合した複数の分子の１つを結合するように構成され、各リンカー分子が複数の第２の共有結合形成性の反応基を含む、複数のリンカー分子を含む反応混合物を提供する。

第５の態様の一実施形態では、反応混合物はさらに、１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子を含む。そのような一実施形態では、反応混合物はさらに、標的分子に特異的に結合する標識プローブを含む。そのような一実施形態では、反応混合物はさらに、標識プローブに特異的に結合する酵素抱合体を含む。そのような一実施形態では、複数の官能化された検出可能な標識粒子の官能化された検出可能な標識粒子（単数）は、複数のリンカー分子の多様なリンカー分子に結合し、そのリンカー分子は、結合した標的分子の近傍にて、第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基との間の共有結合を介して支持材の表面に結合する。そのような一実施形態では、反応混合物は、複数の空間的に離れた個々に検出可能な標的部位を含む。

一実施形態では、複数の官能化された検出可能な標識粒子の官能化された検出可能な標識粒子が、第１の共有結合形成性の反応基の第２の共有結合形成性の反応基との相互作用を介して１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子の近傍にて、複数の共有結合を介して支持材の表面に連結される場合、標的分子は、約１００ｆＭ未満の濃度にて反応混合物中に存在する。

別の実施形態では、複数の官能化された検出可能な標識粒子の官能化された検出可能な標識粒子が、第１の共有結合形成性の反応基の第２の共有結合形成性の反応基との相互作用を介して１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子の近傍にて、複数の共有結合を介して支持材の表面に連結される場合、標的分子は、約０．１ｆＭ〜約１００ｆＭの濃度にて反応混合物中に存在する。

第４及び第５の態様について上述した反応混合物のいずれかにて、官能化された検出可能な標識粒子は官能化された磁気ビーズであり得る。そのような実施形態では、官能化された磁気ビーズは約１００ｎｍ〜約１μｍの直径を有し得る。一部の実施形態では、官能化された磁気ビーズは約１μｍ以上の直径を有する。

第４及び第５の態様について上述した反応混合物のいずれかにて、支持材は珪素を含み得る。

第４及び第５の態様について上述した反応混合物のいずれかにて、合成の天然には存在しない分子のそれぞれはデンドリマー構造を含み得る。

第４及び第５の態様について上述した反応混合物のいずれかにて、合成の天然には存在しない分子のそれぞれはチロシンアミノ酸を含み得る。

第４及び第５の態様について上述した反応混合物のいずれかにて、合成の天然には存在しない分子のそれぞれはフェノール／酸コポリマーを含み得る。

第４及び第５の態様について上述した反応混合物のいずれかにて、合成の天然には存在しない分子のそれぞれはリジン及びチロシンアミノ酸を含み得る。

第４及び第５の態様について上述した反応混合物のいずれかにて、合成の天然には存在しない分子のそれぞれはチラミン又はチラミン誘導体を含み得る。

第４及び第５の態様について上述した反応混合物のいずれかにて、合成の天然には存在しない分子のそれぞれはチミン又はチミン誘導体を含み得る。

第６の態様では、本開示は、反応混合物にて、（ａ）支持材と、支持材の表面に結合した１以上の標的特異的な捕捉プローブと、合成の天然には存在しない分子のそれぞれが第１の共有結合形成性の反応基を含む、支持材の表面に結合する複数の合成の天然には存在しない分子を含む官能化された基材と、（ｂ）複数の各メンバーが複数の第２の共有結合形成性の反応基を含む、複数の官能化された検出可能な標識粒子と、（ｃ）標的分子を含有することが疑われる試料と、（ｄ）標的特異的な標識プローブと、（ｅ）標的特異的な標識プローブを特異的に結合し、第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の間での共有結合の形成を触媒するように構成される酵素抱合体を混ぜ合わせること、及び官能化された表面に結合する官能化された検出可能な標識粒子の存在又は非存在を検出することを含み、官能化された検出可能な標識粒子の存在が官能化された基材上で不動化された標的分子の存在を指し示す、基材表面上で不動化された標的分子を間接的に検出する方法を提供する。

第６の態様の一実施形態では、標的分子を含有することが疑われる試料は約１００ｆＭ未満の濃度で標的分子を含有する。

第６の態様の一実施形態では、標的分子を含有することが疑われる試料は約０．１ｆＭ〜約１００ｆＭの濃度で標的分子を含有する。

第７の態様では、本開示は、反応混合物にて、（ａ）支持材と、支持材の表面に結合した１以上の標的特異的な捕捉プローブと、合成の天然には存在しない分子のそれぞれが第１の共有結合形成性の反応基を含む、支持材の表面に結合する複数の合成の天然には存在しない分子を含む官能化された基材と、（ｂ）複数の官能化された検出可能な標識粒子の各メンバーが第１の結合部分を含む、複数の官能化された検出可能な標識粒子と、（ｃ）複数の連結分子の各メンバーが第１の結合部分を特異的に結合するように構成される第２の結合部分及び複数の第２の共有結合形成性の反応基を含む複数の連結分子と、（ｄ）標的分子を含有することが疑われる試料と、（ｅ）標的特異的な標識プローブと、（ｆ）標的特異的な標識プローブを特異的に結合し、第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の間での共有結合の形成を触媒するように構成される酵素抱合体を混ぜ合わせること、及び官能化された表面に結合する官能化された検出可能な標識粒子の存在又は非存在を検出することを含み、官能化された検出可能な標識粒子の存在が官能化された基材上で不動化された標的分子の存在を指し示す、基材表面上で不動化された標的分子を間接的に検出する方法を提供する。

第７の態様の一実施形態では、標的分子を含有することが疑われる試料は約１００ｆＭ未満の濃度で標的分子を含有する。

第７の態様の一実施形態では、標的分子を含有することが疑われる試料は約０．１ｆＭ〜約１００ｆＭの濃度で標的分子を含有する。

本明細書で記載される２以上の実施形態を組み合わせて個々の実施形態の組み合わせた特徴を含む１以上の追加の実施形態を作出し得ることが留意されるべきである。

本開示に係る標的検出方法の間で形成される結合複合体を以下のように説明する図である。（ａ）１以上の標的特異的な捕捉プローブと第１の共有結合形成性の反応基を含む複数の分子とによって官能化された基材が提供される。標的分子と、標識プローブと、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体と、官能化された基材を含む反応混合物は、基材に結合した標的特異的な捕捉プローブと、標的分子と、標識プローブと活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体を含む基材に不動化された複合体を形成する。（ｂ）生成された（又は放出された）活性化剤の存在下で、第２の共有結合形成性の反応基を含むリンカー分子が、標的を限局した様態で基材に結合した第１の共有結合形成性の反応基と共に共有結合を形成してリンカー分子結合部分の標的限局性の堆積を生じる。（ｃ）反応混合物への官能化された検出可能な標識の添加は、リンカー分子のリンカー分子結合部分を介した検出可能な標識の基材表面への標的が限局された係留を生じ、リンカー分子は順に、第１の共有結合形成性の反応基を含む分子を介して基材表面に共有結合する。 本開示に係る代わりの標的検出方法の間で形成される結合複合体を以下のように説明する図である。（ａ）第１の共有結合形成性の反応基を有する分子を含む基材の表面上で、基材に結合した標的特異的な捕捉プローブと、標的分子と、標識プローブと、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体を含む複合体が形成される。生成された（又は放出された）活性化剤の存在下で、第２の共有結合形成性の反応基によって官能化された検出可能な標識は、基材に結合した第１の基との共有結合を形成し、それによって、（ｂ）にて示すように標的が限局された様態にて官能化された検出可能な標識を基材表面に係留する。 図１で描いた一般的なスキームの一実施形態を説明する図であり、第１の共有結合形成性の反応基を含む分子はチラミン誘導体を含み、標識プローブはビオチン化した標識プローブであり、活性化剤を生成する（放出する）ことが可能である実体はストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素抱合体であり、第２の共有結合形成性の反応基を含むリンカー分子はビオチン−チラミン抱合体であり、官能化された検出可能な標識はストレプトアビジン分子によって官能化された磁気ビーズである。（ｃ）では、ストレプトアビジンとビオチン部分との間での複数の結合相互作用を介して磁気ビーズが基材表面に係留され、ビオチン部分は基材表面に共有結合する。 図２で描いた一般的なスキームの一実施形態を説明する図であり、第１の共有結合形成性の反応基を含む分子はチラミン誘導体を含み、標識プローブはビオチン化した標識プローブであり、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体はストレプトアビジン／ＨＲＰ酵素抱合体であり、第２の共有結合形成性の反応基によって官能化された検出可能な標識はチラミンで官能化されたビーズである。（ｂ）では、第１と第２のチラミン部分の間でのＨＲＰが活性化された共有結合の形成を介してビーズが基材表面に係留される。 基材表面を官能化するのに使用することができるスルフヒドリル基及びフェノール基を含有する化合物についての合成スキームの一例を示す図である。描いた化合物の基材表面への共有結合を可能にするために、基材表面を先ずマレイミド基で誘導体化し得るが、それはチオール基と容易に反応することができる。 不動化した標的分子の近傍にて複数のビオチン部分のＨＲＰが介在する堆積を可能にするためのリンカー分子についての合成スキームの一例を示す図である。リンカー分子は、スペーサーによって離されたビオチン部分とフェノール基を含む。描かれたビオチン化試薬には、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルが含まれ、それは容易にチラミンと反応してリンカー分子を生じる。 不動化した標的分子の近傍にて複数のビオチン部分のＨＲＰが介在する堆積を可能にするためのリンカー分子についての合成スキームの一例を示す図である。リンカー分子は、図６に示したものより長いスペーサーによって離されたビオチン部分とフェノール基を含む。描かれたビオチン化試薬には、ＮＨＳエステルが含まれ、それは容易にチラミンと反応してリンカー分子を生じる。 本開示の種々の態様に従って官能化された検出可能な標識を提供するのに使用され得る種々のビーズ表面のフェノール基官能化スキームの例を示す図である。ビーズ表面とチロシン誘導体との間の異なる距離での官能化スキームの例を提供する。 図８のスペーサーで示した最長の分子を生成するのに使用される試薬の一部についての合成スキームを示す図である。 実施例１で詳説する実験の結果の画像を示す図であり、検出可能な標識として磁気ビーズを用いて２つの異なる基材上での標的分子の捕捉を比較する。 実施例２で詳説する実験の結果の画像を示す図であり、検出可能な標識として磁気ビーズを用いて２つの異なる基材上でのリンカー分子の酵素が介在する、標的が限局された堆積を比較する。 ＳＡ−８−Ｔで官能化した基材表面の試験を行って標識としての磁気ビーズを用いた検出限界を判定する実施例３の画像結果を示す図である。 異なる長さのスペーサーによって離されたビオチン部分と芳香族基を含む２つのリンカー分子を示す図である。 １８のリンカー分子の芳香族環部分の化学構造を示す図である。

定義
本明細書で使用されるとき、用語「検出可能な標識」は、蛍光粒子、化学発光粒子、磁気粒子（たとえば、磁気ビーズ）等を含むが、これらに限定されない検出され得る分子又は粒子を指す。

用語「リンカー分子」は、本明細書で定義されるような少なくとも１つの共有結合形成性の反応基及び特異的な結合対のメンバー又はその後の共有結合形成が可能である官能基のいずれかである少なくとも１つの基を含む分子を指すのに本明細書で使用される。

用語「標的特異的な捕捉プローブ」は、好適な反応条件下にて標的分子又は他の当該分析物に接触させると標的分子又は他の当該分析物に特異的に結合することが可能である基材に不動化された分子を指すのに本明細書で使用される。

用語「共有結合形成性の反応基」は、特定の活性化剤の存在下で第２の分子の第２の基と共に特定の共有結合の形成に加わることが可能である第１の分子の第１の基を指すのに本明細書で使用される。特定の活性化剤の非存在下では、共有結合を形成する第１の基と第２の基の間の反応は進行しないか、又は遅々とした速度で進行する。すなわち、第１の基と第２の基の間での共有結合形成の可能性が有意に低下する。たとえば、その他の点で同一条件下では、特定の活性化剤の非存在下における第１の基と第２の基の間での共有結合形成の可能性は２０％未満、たとえば、１０％未満、５％未満又は１％未満であり得る。

用語「標的特異的な標識プローブ」及び「標識プローブ」は、好適な反応条件下にて標的分子又は他の当該分析物に接触させると標的分子又は他の当該分析物の少なくとも一部を特異的に結合することが可能である第１の特異的な結合部分と、好適な反応条件下にて活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体に接触させると活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体を特異的に結合することが可能である第２の特異的な結合部分を有する二官能性分子を指すのに本明細書で使用される。

本明細書で使用されるとき、用語「活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体」は、標的分子又は他の当該分析物に直接又は間接的に特異的に結合し、第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基との間での共有結合の形成を開始する又は触媒する、及び／又は活性化剤の存在下で１以上の第１と第２の共有結合形成性の反応基を活性化することが可能である分子実体、たとえば、酵素抱合体を指す。

本明細書で相互交換可能に使用される用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の高分子形態を指し、それには、天然の及び非天然のアミノ酸、化学的に又は生化学的に修飾した又は誘導体化したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを挙げることができる。その用語には、非相同のアミノ酸配列を伴った融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基がある場合又はない場合での非相同で天然のリーダー配列との融合、免疫的にタグを付けたタンパク質、検出可能な融合相手との融合タンパク質、たとえば、融合相手として、蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない融合タンパク質が含まれる。

用語「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は相互交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか任意の長さのヌクレオチド、又は２つの天然に存在する核酸に類似する配列特異的な様態で天然に存在する核酸とハイブリッド形成することができる、すなわち、ワトソン／クリックの塩基対相互作用に加わることができる合成で製造される化合物の高分子形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次構造を有してもよく、任意の既知の又は未知の機能を実行してもよい。ポリヌクレオチドの非限定例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、対照領域、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが挙げられる。

用語「配列」は、塩基の特定の配列を指してもよく、及び／又は塩基の特定の配列を有するポリヌクレオチドを指してもよい。従って、配列は、情報であってもよく、又は用途の文脈によって示されるような分子実体を指してもよい。

用語「部分」は、通常、特定の機能、構造又は構造的特徴を有する実体又は分子の一部を指すのに使用される。

用語「抗体」、「免疫グロブリン」及びその複数指示対象には、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦｄ断片を含むが、これらに限定されない抗原への特異的結合を保持する抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、及び抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。抗体は、その検出を可能にする実体、たとえば、放射性同位元素、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質等に結合し得る。抗体はさらに、たとえば、特異的な結合対のメンバー、たとえば、ビオチン（ビオチンとアビジン／ストレプトアビジン特異的結合対のメンバー）等のような他の部分に共有結合又は非共有結合で抱合され得る。抗体はまた、ポリスチレンプレート又はビーズ等を含むが、これらに限定されない固形支持体にも結合し得る。抗原への特異的結合を保持するＦａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗体断片もその用語に含まれる。

抗体は、たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びに二官能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（たとえば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７， １０５ （１９８７））、及び単鎖（たとえば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ５８７９−５８８３ （１９８８）； Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２， ４２３−４２６ （１９８８）； ｓｅｅ Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｎｊａｍｉｎ， Ｎ．Ｙ．， ２ｎｄ ｅｄ． （１９８４）， ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ， Ｎａｔｕｒｅ， ３２３， １５−１６ （１９８６））を含む種々の他の形態で存在し得る。

用語「ハイブリッド形成することが可能である」、「ハイブリッド形成すること」及び「ハイブリッド形成」は本明細書で使用されるとき、相補性分子又は部分的に相補性の分子の間、たとえば、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間での結合を指す。そのような結合は、普通非共有結合であり、十分に特異的なので、相補性の高い分子と他の相補性の低いものの間を区別するのに使用され得る。相補性の高い分子の例には、相補性のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられ、それには、第２の核酸配列に対して正確に相補性であるヌクレオチド配列で配置されるヌクレオチドの領域が含まれ；相補性の低いオリゴヌクレオチドの例には、第２のオリゴヌクレオチドに対して正確に相補性である配列にない１以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を持つものが挙げられる。

用語「相補性（である）」は、ポリヌクレオチドの配列に基づくポリヌクレオチド間の特異的結合の特性を言う。本明細書で使用されるとき、ストリンジェントな条件下でのハイブリッド形成アッセイにて互いに結合するのであれば、ポリヌクレオチドは相補性である。従来の塩基対ルール、たとえば、ＡがＴ（又はＵ）と対になり、ＧはＣと対になることに従えば、ポリヌクレオチドの一部は互いに相補性である。「相補性（である）」には、絶対的な配列相補性がある実施形態が含まれ、実質的な配列相補性がある実施形態も含まれる。

「絶対的な配列相補性」は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの間で１００％の配列相補性がある、すなわち、他方のポリヌクレオチドに関して（相補性領域にわたって）第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドのいずれかにて挿入、欠失又は置換がないことを意味する。言い換えれば、相補性領域のあらゆる塩基が通常の塩基対ルールに従ってその相補性塩基と対になる。

「実質的な配列相補性」は、他方のポリヌクレオチドに関して（相補性領域にわたって）第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドにて１以上の相対的に少量（１０塩基未満、たとえば、５塩基未満、通常３塩基未満、さらに通常単一塩基）の挿入、欠失又は置換を許容する。相補性領域は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの間で相補性である領域である（たとえば、核酸標的分子と標的特異的な捕捉プローブの独特の配列）。相補性配列は通常、より長いポリヌクレオチドの中に埋め込まれているので、相対的に長いポリヌクレオチドはその全長の一部にわたってのみ相補性であり得る。相補性領域は通常、長さ少なくとも約１０塩基、さらに通常、長さ少なくとも約１２塩基、さらに通常、長さ少なくとも約１５塩基、一層さらに通常、長さ少なくとも約２０塩基であり、長さ少なくとも約２５塩基であってもよい。

用語「と特異的にハイブリッド形成すること」、「特異的なハイブリッド形成」「と選択的にハイブリッド形成すること」等は、「ストリンジェントな条件」下で特定のヌクレオチド配列に核酸分子を優先的に結合すること、二本鎖化すること又はハイブリッド形成することを指すのに本明細書で使用される。

用語「ストリンジェントな条件」は、第１の分子、たとえば、第１の核酸が、第２の分子、たとえば、第２の核酸に優先的に結合し、他の配列にほとんど又は全く結合しない条件を指す。言い換えれば、用語「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、相補性の結合メンバーの間、たとえば、標的特異的な捕捉プローブの配列と標的核酸の相補性配列の間で二本鎖を作るのに匹敵する条件を指すのに本明細書で使用される。

核酸のハイブリッド形成の文脈における「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」及び「ストリンジェントなハイブリッド形成洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメータのもとで異なる。ストリンジェントなハイブリッド形成条件には、たとえば、５０％ホルムアミド、５×生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）及び１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液における４２℃でのハイブリッド形成、又は５×ＳＳＣと１％ＳＤＳを含む緩衝液における６５℃でのハイブリッド形成、双方とも０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳによる６５℃での洗浄を挙げることができる。例となるストリンジェントなハイブリッド形成条件には、４０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ及び１％ＳＤＳを含む緩衝液における３７℃でのハイブリッド形成、及び４５℃での１×ＳＳＣによる洗浄を挙げることができる。さらに別のストリンジェントなハイブリッド形成条件には、３×ＳＳＣ（４５０ｍＭのＮａＣｌ／４５ｍＭのクエン酸ナトリウム）にて６０℃以上でのハイブリッド形成、又は３０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、０．５％サルコシンナトリウム、５０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ６．５を含有する溶液における４２℃でのインキュベートが挙げられる。当業者は、代わりの、しかし、匹敵するハイブリッド形成及び洗浄の条件を利用して類似のストリンジェントな条件を提供することができることを容易に認識するであろう。

特定の実施形態では、ストリンジェントな洗浄条件は核酸分子が特異的にハイブリッド形成する程度に影響を及ぼし得る。好適な洗浄条件には、たとえば、ｐＨ７での約０．０２Ｍの塩濃度と少なくとも約５０℃若しくは約５５℃〜約６０℃の温度；又は７２℃で約１５分間の０．１５ＭのＮａＣｌの塩濃度；又は少なくとも約５０℃若しくは約５５℃〜約６０℃の温度で約１〜約２０分間の約０．２×ＳＳＣの塩濃度；又は２０℃〜５０℃での１〜１５分間の、０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液による複数回の洗浄；又は同等の条件が挙げられ得る。洗浄のストリンジェントな条件はまた、たとえば、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでもあり得る。核酸分子がオリゴデオキシヌクレオチド（すなわち、デオキシリボヌクレオチドのサブユニットでできたオリゴヌクレオチド）である場合、ストリンジェントな条件には、３７℃（１４塩基のオリゴ用）、４８℃（１７塩基のオリゴ用）、５５℃（２０塩基のオリゴ用）、及び６０℃（２３塩基のオリゴ用）にて６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄を挙げることができる。同等のハイブリッド形成及び洗浄条件の詳細な記載、並びに試薬及び緩衝液、たとえば、ＳＳＣ緩衝液及び同等の試薬及び条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。

ストリンジェントなハイブリッド形成条件にはまた、反復配列を抑えるための複雑性を下げる核酸による水性相核酸の「プレハイブリッド形成」も含まれ得る。たとえば、特定のストリンジェントなハイブリッド形成条件には、表面に結合したポリヌクレオチドとのハイブリッド形成に先立って、Ｃｏｔ−１ＤＮＡ又は無作為配列合成オリゴヌクレオチド（たとえば、２５量体）等によるハイブリッド形成が含まれる。

ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、それらが、上記特定のストリンジェントな条件と少なくとも約８０％ストリンジェント、通常少なくとも約９０％ストリンジェントであれば、条件が少なくともストリンジェントであるとみなされる上記代表的な条件と同様にストリンジェントであるハイブリッド形成条件である。他のストリンジェントなハイブリッド形成条件は当該技術で既知であり、適宜採用され得る。

用語「結合する」及び「結合される」は本明細書で使用されるとき、２以上の実体間での結合相互作用を指す。２つの実体、たとえば、分子が互いに結合する場合、それらは直接結合してもよく、すなわち、互いに直接結合してもよく、又はそれらは間接的に結合してもよく、すなわち、中間の連結部分又は連結実体の使用を介して結合してもよい。いずれの場合も、結合は、たとえば、共有結合を介した共有結合であってもよいし、たとえば、イオン結合、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力又はそれらの組み合わせを介した非共有結合であってもよい。

用語「特異的な結合」、「特異的に結合する」等は、反応混合物における他の分子又は部分に比べて第２の結合分子又は結合部分（たとえば、標的分子）に優先的に直接結合する第１の結合分子又は結合部分（たとえば、標的特異的な結合部分）の能力を指す。特定の実施形態では、第１の結合分子又は結合部分と第２の結合分子又は結合部分の間の親和性は、それらが互いに特異的に結合する場合、１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満、１０^−１２Ｍ未満、１０^−１３Ｍ未満、１０^−１４Ｍ未満、又は１０^−１５Ｍ未満のＫＤ（解離定数）を特徴とする。

本明細書で使用されるとき、「特異的な結合対のメンバー」は、特異的な結合相互作用に加わる分子又は実体の対のメンバーである。特異的な結合対の第１のメンバーが特定される場合、特異的な結合対の第２のメンバーの正体は容易に特定可能である。結合対のいずれかのメンバーが第１のメンバーと呼ばれる場合、残りのメンバーが第２のメンバーであると理解され、逆もまた同様であることが留意されるべきである。特異的な結合対相互作用の例には、抗原／抗体及びハプテン／抗体のような免疫相互作用、並びに相補性核酸の結合、糖とそれに特異的なレクチン、酵素とそれに特異的な阻害剤、アポ酵素と補因子、ホルモンとその受容体、ビオチン／アビジンとビオチン／ストレプトアビジンのような非免疫の相互作用が挙げられる。

用語「アルキル」は本明細書で使用されるとき、たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等のような分枝状、非分枝状、又は環状の１〜約５０の炭素原子の飽和炭化水素基を指す。好まれるアルキル基は本明細書では、１〜約３６、さらに通常、１〜１０の炭素原子を含有し得る。用語「低級アルキル」は、１〜６の炭素原子、好ましくは１〜４の炭素原子のアルキル基を意図する。本明細書で記載されるポリマー上に存在するアルキル基は、置換されなくてもよいし、又は官能基（たとえば、アミン、ヒドロキシル、ビニル基又はアリル基のようなオレフィン性の基）等を含む１以上の置換基で置換されてもよい。「置換されたアルキル」は、１以上の置換基で置換されたアルキルを指し、これには、アルキル置換基における同一炭素原子に由来する２つの水素原子が、たとえば、カルボニル基で置き換えられる（すなわち、置換されたアルキル基は−Ｃ（＝Ｏ）−部分を含み得る）例が含まれる。他の置換基には、以下でさらに詳細に定義されるような、ハロゲン、エーテル、ヒドロキシル、アミン官能基等が挙げられる。用語「ヘテロ原子含有アルキル」及び「ヘテロアルキル」は、少なくとも１つの炭素原子が、以下でさらに詳細に記載されるような、たとえば、Ｏ、Ｓ、Ｐ又はＮのようなヘテロ原子で置き換えられるアルキル置換基を指す。特に示されない限り、用語「アルキル」及び「低級アルキル」には、直鎖、分枝鎖、環状の非置換、置換及び／又はヘテロ原子含有のアルキル又は低級アルキルがそれぞれ含まれる。

用語「アルキレン」は本明細書で使用されるとき、１〜５０の炭素原子を含有する二官能性の飽和分枝鎖又は非分枝鎖の炭化水素鎖を指す。「低級アルキレン」は、１〜１２の炭素原子を含有するアルキレン結合を指し、それには、たとえば、メチレン（−ＣＨ_２−）、エチレン（−ＣＨ_２ＣＨ_２−）、プロピレン（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）、２−メチルプロピレン（−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−）、ヘキシレン（−（ＣＨ_２）_６−）等が挙げられる。アルキル基と同様に、特記されない限り、アルキレン基には、直鎖、分枝鎖、環状の非置換、置換及びヘテロ原子含有のアルキレン基が含まれる。同様に、用語「アルケニレン」、「アルキニレン」、「アリーレン」、「アルカリレン」及び「アラルキレン」は、それぞれ、二官能性の（すなわち、連結する）アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルカリル基及びアラルキル基を指す。

用語「アルケニル」は本明細書で使用されるとき、たとえば、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニル等のような、少なくとも１つの二重結合を含有する２〜約５０の炭素原子の直鎖、分枝鎖、環状の炭化水素基を指す。一般に、再び必然ではないが、アルケニル基は本明細書では、２〜約３６の炭素原子、たとえば、２〜１２の炭素原子を含有し得る。用語「低級アルケニル」は２〜６の炭素原子のアルケニル基を意図する。用語「置換されたアルケニル」は、１以上の置換基で置換されたアルケニルを指し、用語「ヘテロ原子含有のアルケニル」及び「ヘテロアルケニル」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子で置き換えられるアルケニルを指す。特に示されない限り、用語「アルケニル」及び「低級アルケニル」にはそれぞれ、直鎖、分枝鎖、環状の非置換、置換及び／又はヘテロ原子含有のアルケニル及び低級アルケニルが含まれる。同様に、「オレフィン性化合物」におけるような用語「オレフィン」は本明細書で使用されるとき、２〜３６の炭素原子のモノ不飽和又はジ不飽和の炭化水素を指し、好まれる実施形態では、炭素／炭素二重結合が末端の２つの炭素原子間に位置する。この部類の中での好まれるオレフィン性基は本明細書では、単一の末端二重結合を含有する２〜１８の炭素原子を含有する炭化水素を意図する「低級オレフィン性基」と表されることがある。後者の部分は「低級アルケニル」とも呼ばれ得る。場合によっては、それは珪素含有化合物の一部である。通常、必然ではないが、オレフィン性基を含有する化合物は、開示の方法で使用する間、液体の形態である。

用語「アルキニル」は本明細書で使用されるとき、たとえば、エチニル、ｎ−プロピニル等のような少なくとも１つの三重結合を含有する２〜５０の炭素原子の直鎖又は分枝鎖の炭化水素基を指す。一般に、再び必然ではないが、アルキニル基は本明細書では、２〜約１８の炭素原子を含有し得るが、そのような基はさらに、２〜１２の炭素原子を含有し得る。用語「低級アルキニル」は２〜６の炭素原子のアルキニル基を意図する。用語「置換されたアルキニル」は、１以上の置換基で置換されたアルキニルを指し、用語「ヘテロ原子含有のアルキニル」及び「ヘテロアルキニル」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子で置き換えられるアルキニルを指す。特に示されない限り、用語「アルキニル」及び「低級アルキニル」にはそれぞれ、直鎖、分枝鎖の非置換、置換及び／又はヘテロ原子含有のアルキニル及び低級アルキニルが含まれる。

用語「アリール」は本明細書で使用されるとき、１〜３の環を有する芳香族種を指すが、通常、たとえば、フェニル基又は１−若しくは２−ナフチル基のような単環式又は二環式の部分を意図する。任意で、これらの基は、１〜４、さらに好ましくは１〜２の、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ及び／又はニトロのような本明細書で記載されるもののような置換基で置換される。アリール基はたとえば、６〜５０の炭素原子を含有し得るが、さらなる例としてアリール基は６〜１２の炭素原子を含有し得る。たとえば、アリール基は、たとえば、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン、ベンゾフェノン等のように、１つの芳香族環又は２つの縮合した若しくは連結した芳香族環を含有し得る。「置換されたアリール」は１以上の置換基で置換されたアリール部分を指し、用語「ヘテロ原子含有のアリール」及び「ヘテロアリール」は、以下でさらに詳細に記載されるように少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子で置き換えられるアリール置換基を指す。特に示されない限り、用語「アリール」には、非置換の、置換の及び／又はヘテロ原子含有の芳香族置換基が含まれる。

用語「アラルキル」は、アリール置換基を伴ったアルキル基を指し、用語「アルカリル」は、アルキル置換基を伴ったアリール基を指し、その際、「アルキル」及び「アリール」は上記で定義したとおりである。一般に、アラルキル基及びアルカリル基は本明細書では６〜５０の炭素原子を含有する。アラルキル基及びアルカリル基は、たとえば、６〜２０の炭素原子を含有し得るが、さらなる例としてそのような基は６〜１２の炭素原子を含有し得る。

用語「アルコキシ」及び「アリールオキシ」は、それぞれ酸素結合を介して結合するアルキル基及びアリール基を指す。一部の実施形態では、アルキル基又はアリール基は、酸素結合を介して非炭素要素、たとえば、珪素原子に結合する。「低級アルコキシ」は１〜１０、さらに好ましくは１〜７の炭素原子を含有するアルコキシ基を意図する。用語「オキシアルキレン」及び「オキシアリーレン」はそれぞれ、二官能性の（すなわち、連結する）アルコキシ基及びアリールオキシ基を指す。

用語「アミノ」は、Ｒが水素又は代わりの置換基、通常低級アルキルであるアミノ基−ＮＲ_２を意図する。従って、用語「アミノ」は、１級アミノ（すなわち、ＮＨ_２）、「アルキルアミノ」（すなわち、単一のアルキル置換基を含有する２級アミノ基）及び「ジアルキルアミノ”（すなわち、２つのアルキル置換基を含有する３級アミノ基）を含むことを意図する。

「ヘテロ原子含有のアルキル基」（「ヘテロアルキル」基とも言う）又は「ヘテロ原子含有のアリール基」（「ヘテロアリール」基とも言う）におけるような用語「ヘテロ原子含有の」は、１以上の炭素原子が炭素以外の原子、たとえば、窒素、酸素、イオウ、リン又は珪素、通常、窒素、酸素又はイオウによって置き換えられる分子、結合又は置換基を指す。同様に、用語「ヘテロアルキル」はヘテロ原子含有であるアルキル置換基を指し、用語「複素環」はヘテロ原子含有である環状置換基を指し、用語「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族」はそれぞれ、ヘテロ原子含有等である「アリール」及び「芳香族」置換基を指す。ヘテロアルキル基の例には、アルコキシアリール、アルキルスルファニル置換のアルキル、Ｎ−アルキル化アミノアルキル等が挙げられる。ヘテロアリール置換基の例には、ピロリル、ピロリジニル、ピリジニル、キノリニル、インドリル、フリル、ピリミジニル、イミダゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル等が挙げられ、ヘテロ原子含有の脂環式基の例はピロリジノ、モルフォリノ、ピペラジノ、ピペリジノ、テトラヒドロフラニル等である。

「ヒドロカルビル」は、１〜約５０の炭素原子を含む、１〜約３６の炭素原子を含む、さらに１〜約１８の炭素原子を含む、及びさらに１〜１２の炭素原子を含む、たとえば、アルキル基、アルケニル基、アリール基等のような直鎖、分枝鎖、環状の、飽和及び不飽和の種を含む一価のヒドロカルビルラジカルを指す。「置換されたヒドロカルビル」は１以上の置換基で置換されたヒドロカルビルを指し、「ヘテロ原子含有のヒドロカルビル」は、少なくとも１つの炭素原子がＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ又はＳのようなヘテロ原子で置き換えられるヒドロカルビルを指す。置換されたヒドロカルビル基の例にはアルカリル、アラルキル等が挙げられ、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル基の例にはアルコキシ、アルキルアミノ等が挙げられる。特に指示されない限り、用語「ヒドロカルビル」は置換されたヒドロカルビル部分及び／又はヘテロ原子含有のヒドロカルビル部分を含むと解釈されるべきである。さらに、用語「ヒドロカルビレン」は、二価の（すなわち、連結する）ヒドロカルビル基を指し、特に指示されない限り、置換されたヒドロカルビル部分及び／又はヘテロ原子含有のヒドロカルビル部分を含む。

用語「エーテル」は、モノエーテル及びポリエーテルの双方を含み、炭素及び酸素を含有する鎖を有する基を指し、これらの単位のそれぞれは各酸素原子について２〜６の炭素からなる。例は、ジエチルエーテル及びジプロピルエーテル、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリブチレンオキシドである。

「ハロ」又は「ハロゲン」はフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを指し、普通、有機化合物における水素原子のためのハロ置換に関する。

本明細書で使用されるとき、たとえば、パーフルオロ基、パーフルオロモノマー、パーフルオロオリゴマー又はパーフルオロポリマーのような用語「パーフルオロ」は、フルオロ原子が水素原子と完全に又はほぼ完全に置き換わる部分又は化合物を指す。パーフルオロ基の一部の実施形態では、末端又は末端結合部位（すなわち、基が基材又は別の化学部分に結合するところ）における１〜３の炭素の間での水素原子はフルオロ原子で置き換えられない。パーフルオロ基はさらにフルオロ原子で置き換えられた水素原子を有するポリ炭素鎖又はポリエーテル鎖を含む。

用語「ハロカルビル」及び「ハロ炭素」は、１以上の水素ラジカルがハロラジカルで置き換えられているヒドロカルビル基（上記で定義したような）を指す。同様に、用語「パーハロカルビル」は、水素ラジカルすべてがハロラジカルで置き換えられているヒドロカルビル基を指す。用語「ハロカルビル」及び「ハロ炭素」はパーハロカルビルを含み、さらに、フルオロカルビル基、パーフルオロ化ヒドロカルビル基、クロロカルビル基、過塩素化ヒドロカルビル基、ブロモカルビル基、過臭素化ヒドロカルビル基、ヨードカルビル基、及び過ヨウ素化ヒドロカルビル基を含む。同様に、用語「ハロエーテル」は１以上の水素ラジカルがハロラジカルで置き換えられているエーテル基を指し、用語「パーハロエーテル」は水素ラジカルすべてがハロラジカルで置き換えられているエーテルを指す。用語「ハロエーテル」は特に特定されない限り、パーハロエーテルを含む。

用語「高分子部分」及び「高分子基」は、直鎖、分枝鎖、超分枝鎖、樹状又は環状の配列、又はその任意の組み合わせで連結される２以上の反復サブユニットを含有する基を指す。サブユニット自体はさらに直鎖、分枝鎖又は環状であってもよい。さらに、サブユニットは高分子部分がヘテロ原子を含む主鎖を有するようにヘテロ原子を含有し得る。その用語には、２以上のサブユニットからなる高分子部分であるコポリマー部分も含まれる。特に特定されない限り、コポリマーには、たとえば、ランダム、ブロック、コーム及びスター、並びにそれらの組み合わせのような構造が含まれる。高分子部分には合成の部分並びに天然に存在する部分、又はそれらの断片が含まれる。サブユニットの例にはアルキレン、アリーレン、ヘテロアルキレン、アミノ酸、核酸、糖類、等が挙げられる。同様に、用語「高分子リンカー」は二官能性の（すなわち、連結する）高分子部分を指す。高分子部分の例には、ポリ（エチレングリコール）基、ポリ（エチレンアミン）基及びポリ（アミノ酸）基が挙げられる。

前述の定義の一部にて示唆したような、「置換されたヒドロカルビル」、「置換されたアルキル」、「置換されたアリール」等におけるような「置換された」によって、ヒドロカルビル、アルキル、アリール、又は他の部分にて炭素（又は他の）原子に結合した少なくとも１つの水素原子が１以上の非水素置換基で置き換えられることを意味する。そのような置換基の例には、限定しないで、官能基及びヒドロカルビル部分 Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル（Ｃ_１−Ｃ_１８アルキルを含む、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルをさらに含む、及びＣ_１−Ｃ_６アルキルをさらに含む）、Ｃ_２−Ｃ_２４アルケニル（Ｃ_２−Ｃ_１８アルケニルを含む、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニルをさらに含む、及びＣ_２−Ｃ_６アルケニルをさらに含む）、Ｃ_２−Ｃ_２４アルキニル（Ｃ_２−Ｃ_１８アルキニルを含む、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニルをさらに含む、及びＣ_２−Ｃ_６アルキニルをさらに含む）、Ｃ_５−Ｃ_３０アリール（Ｃ_５−Ｃ_２０アリールを含む、及びＣ_５−Ｃ_１２アリールをさらに含む）、並びにＣ_６−Ｃ_３０アラルキル（Ｃ_６−Ｃ_２０アラルキルを含む、及びＣ_６−Ｃ_１２アラルキルをさらに含む）が挙げられる。「官能基」によって、１以上の反応性部分を含有する基を意味する。官能基の例には、ハロ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ_１−Ｃ_２４アルコキシ、Ｃ_２−Ｃ_２４アルケニルオキシ、Ｃ_２−Ｃ_２４アルキニルオキシ、Ｃ_５−Ｃ_２０アリールオキシ、アシル（Ｃ_２−Ｃ_２４アルキルカルボニル（−ＣＯ−アルキル）及びＣ_６−Ｃ_２０アリールカルボニル（−ＣＯ−アリール）を含む）、アシルオキシ（−Ｏ−アシル）、Ｃ_２−Ｃ_２４アルコキシカルボニル（−（ＣＯ）−Ｏ−アルキル）、Ｃ_６−Ｃ_２０アリールオキシカルボニル（−（ＣＯ）−Ｏ−アリール）、ハロカルボニル（Ｘがハロである−（ＣＯ）−Ｘ）、Ｃ_２−Ｃ_２４アルキルカルボナト（−Ｏ−（ＣＯ）−Ｏ−アルキル）、Ｃ_６−Ｃ_２０アリールカルボナト（−Ｏ−（ＣＯ）−Ｏ−アリール）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（−ＣＯＯ−）、カルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ_２）、モノ−置換のＣ_１−Ｃ_２４アルキルカルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ（Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル））、ジ−置換のアルキルカルバモイル（−（ＣＯ）−Ｎ（Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル）_２）、モノ−置換のアリールカルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ−アリール）、チオカルバモイル（−（ＣＳ）−ＮＨ_２）、カルバミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−ＮＨ_２）、シアノ（−Ｃ≡Ｎ）、イソシアノ（−Ｎ＋≡Ｃ−）、シアナト（−Ｏ−Ｃ≡Ｎ）、イソシアナト（−Ｏ−Ｎ≡Ｃ−）、イソチオシアナト（−Ｓ−Ｃ≡Ｎ）、アジド（−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−）、ホルミル（−（ＣＯ）−Ｈ）、チオホルミル（−（ＣＳ）−Ｈ）、アミノ（−ＮＨ_２）、モノ−及びジ−（Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル）−置換アミノ、モノ−及びジ−（Ｃ_５−Ｃ_２０アリール）−置換アミノ、Ｃ_２−Ｃ_２４アルキルアミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−アルキル）、Ｃ_５−Ｃ_２０アリールアミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−アリール）、イミド（Ｒ＝水素、Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル、Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、Ｃ_６−Ｃ_２０アルカリル、Ｃ_６−Ｃ_２０アラルキル等である−ＣＲ＝ＮＨ）、アルキルイミノ（Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル等である−ＣＲ＝Ｎ（アルキル））、アリールイミノ（Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル等である−ＣＲ＝Ｎ（アリール））、ニトロ（−ＮＯ_２）、ニトロソ（−ＮＯ）、スルホ（−ＳＯ_２−ＯＨ）、スルホナト（−ＳＯ_２−Ｏ−）、Ｃ_１−Ｃ_２４アルキルスルファニル（−Ｓ−アルキル；「アルキルチオ」とも呼ばれる）、アリールスルファニル（−Ｓ−アリール；「アリールチオ」とも呼ばれる）、Ｃ_１−Ｃ_２４アルキルスルフィニル（−（ＳＯ）−アルキル）、Ｃ_５−Ｃ_２０アリールスルフィニル（−（ＳＯ）−アリール）、Ｃ_１−Ｃ_２４アルキルスルホニル（−ＳＯ_２−アルキル）、Ｃ_５−Ｃ_２０アリールスルホニル（−ＳＯ_２−アリール）、ホスホノ（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２）、ホスホナト（−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）_２）、ホスフィナト（−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−））、ホスホ（−ＰＯ_２）、及びホスフィノ（−ＰＨ_２）、モノ−及びジ−（Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル）−置換ホスフィノ、並びにモノ−及びジ−（Ｃ_５−Ｃ_２０アリール）−置換ホスフィノが挙げられる。加えて、前述の官能基は、特定の基が許容するのであれば、さらに１以上の追加の官能基又は上記で特に列挙したもののような１以上のヒドロカルビル部分で置換され得る。類似して、上述のヒドロカルビル部分は１以上の官能基又は上記で特に列挙したもののような追加のヒドロカルビル部分でさらに置換され得る。

用語「置換された」が考えられる置換された基のリストの前に現れる場合、それは、用語がその基のメンバーすべてに適用されることが意図される。たとえば、語句「置換されたアルキル及びアリール」は「置換されたアルキル及び置換されたアリール」として解釈されるべきである。

特に特定されない限り、原子への言及は、その原子の同位元素を含む。たとえば、Ｈへの言及は、^１Ｈ、^２Ｈ（すなわち、Ｄ）及び^３Ｈ（すなわち、Ｔ）を含むことを意味し、Ｃへの言及は、^１２Ｃ及び炭素の同位元素すべて（たとえば、^１３Ｃ）を含むことを意味する。

上記で提供した定義の多くは範囲が重複し、互いに排他的ではないことが当業者によって十分に理解されるであろう。従って、特定の化学基は、１を超える上記で提供した定義に入り得る。

本発明をさらに説明する前に、本発明は、それ自体当然変化し得るように、記載される特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限及び下限及びその言及された範囲における他の言及された値又は介在値の間で、文脈が明瞭に述べない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値が本発明の範囲内に含まれることが理解される。それらのさらに小さな範囲の上限と下限は独立してさらに小さな範囲に含まれてもよく、本発明内に含まれ、言及される範囲における特に排除された限界に左右される。言及された範囲が限界の一方又は双方を含む場合、含められた限界の一方又は双方を除外する範囲も本発明に含まれる。

特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践又は試験において本明細書で記載されるものに類似する又はそれと同等である任意の方法及び材料も使用することができるが、好まれる方法及び材料をここで記載する。本明細書で言及される出版物はすべて参照によって本明細書に組み入れられて、出版物が引用されるのと併せて方法及び／又は材料を開示し、記載する。

本明細書及び添付の特許請求の範囲にて使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明瞭に述べない限り、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。従って、たとえば、「（ａ）リンカー分子」への言及は複数のそのようなリンカー分子を含み、「（ｔｈｅ）結合複合体」への言及は１以上の結合複合体及び当業者等に既知のその同等物への言及を含む。特許請求の範囲は任意の要素を排除するように書かれ得ることがさらに留意される。そのようなものとして、本明細書は、特許請求の範囲の要素の記述又は「否定的な」限定の使用と併せて、「単に」、「のみ」等のような排他的用語の使用について先行詞として役立つことが意図される。

本明細書で議論される出版物は、本出願の出願日に先立つその開示のために単に提供される。前の発明を理由にして本発明がそのような出版物に先行する権利がないという了解として解釈されるものは本明細書には何もない。さらに、提供される出版の日付は独立して確認される必要があり得る実際の出版日とは異なり得る。

以下の詳細な説明及び実施例は、本発明の作り方及び使い方の完全な開示及び説明を当業者に提供できるように提示されるものであって、本発明者がその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものでもなく、また以下の実験がすべてである又は行った実験のみであることを示すことを意図するものでもない。使用される数（たとえば、量、温度等）に関する精度を確保するために尽力が払われたが、一部の実験の誤差及び偏差は説明されるべきである。特に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。標準的な略記、たとえば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；μＬ、マイクロリットル；ｐＬ、ピコリットル；μｍ、マイクロメートル／ミクロン；ｓ又はｓｅｃ、秒；ｍｉｎ，分；ｈ又はｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド等を使用してもよい。

詳細な説明
本開示は、基材表面上で空間的に分散されている標的分子及び他の当該分析物の定性的検出及び／又は定量的検出と併せて使用するための方法及び組成物を指向する。態様の１つでは、検出可能な標識の標的が限局された堆積を含む方法と併せて使用され得る高度に反応性の官能化された基材が提供される。提供されるのはまた、共有結合形成性の反応基を含む種々の分子である。これらの分子を用いて標的の検出で使用するための基材表面及び／又は検出可能な標識を官能化し得る。本開示はまた、検出可能な標識の標的が限局された係留に関与する方法にて官能化された基材表面又は検出可能な標識と共に使用され得るリンカー分子も提供する。最後に、本開示は検出可能な標識の標的が限局された堆積に関与する方法にて使用するためのキット及び方法を提供する。

官能化された基材
態様の１つでは、本開示は、１以上の共有結合形成性の反応基を含む分子で官能化された表面を有する基材を提供する。官能化に好適な基材は、ガラススライド、融合シリカ、珪素及びプラスチックを含むが、これらに限定されない種々の物質から調製され得る。

本明細書で開示される特定の実施形態では、当該基材は、基材の表面に不動化された磁気粒子の存在を検出することが可能である磁気センサーに埋め込まれた珪素系物質を含む。そのようなセンサーの記載については、たとえば、Ｂａｓｅｌｔら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１３，７３１?７３９（１９９８）；Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１４，８０５?８１３（２０００）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｍａｇｎ．Ｍａｔｅｒ．，２２５，１３８?１４４（２００１）；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，９１，７７８６?７７８８（２００２）；Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，９３，７２８１（２００３）；Ｌｉら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，９３，７５５７?７５５９（２００３），Ｍａｙ；Ｌｉら、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｍａｇｎ．，４０，３０００（２００４）；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｍａｇｎ．Ｍａｔｅｒ．，２９３，７３１?７３６（２００５）；Ｓｈｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，８６，２５３９０１（２００５）；Ｂａｓｅｌｔら、米国特許第５，９８１，２９７号；Ｔｏｎｄｒａ，米国特許第６，７４３，６３９号；及びＴｏｎｄｒａ、米国特許第６，８７５，６２１号を参照のこと。

本開示と併せて使用する基材は種々の形状及びサイズを有し得る。たとえば、一部の実施形態では、好適な基材は、固形の実質的に平面の構造を有する。他の実施形態では、好適な基材は、実質的に球状の構造（たとえば、ビーズ）を有し得る。

基材物質は、共有結合形成性の反応基を含む分子の結合のために支持構造を提供する。そのような分子は、たとえば、図１及び図２に一般的に描かれるように、リンカー分子の堆積のための位置を提供することによって又は共有結合形成性の反応基を含む検出可能な標識を係留することによって官能化された表面を提供する。

種々の単一工程又は複数工程の方法を用いて共有結合形成性の反応基を含む分子を基材表面に結合させることができる。たとえば、一実施形態では、共有結合形成性の反応基を含む分子に存在するカルボン酸基のカルボジイミド活性化と組み合わせてアミノアルキルシランで誘導体化したシリコンウエハー基材を利用して、基材表面に共有結合形成性の反応基を含む分子の抱合を生じることができる。別の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーによって分離したＮＨＳエステル基とマレイミド基を含む二官能性分子を用いて、基材表面上で誘導体化されたアミノアルキルシランのアミノ基をマレイミド基に変換し得る。次いで基材表面上のマレイミド基と反応させることによって共有結合形成性の反応基とスルフヒドリル基を含む分子を基材に抱合させ得る。

官能化された基材表面を提供するための基材表面への抱合に好適である共有結合形成性の反応基を含む分子は種々の構造を有し得る。これらの分子は種々の好適な構造のいずれかを有する二官能性又は多官能性の試薬であり得る。たとえば、基材表面の官能化に好適な分子は、直鎖、分枝鎖又は樹状であってもよく、分子の官能性部分を連結する１以上のスペーサーを含み得る。好適なスペーサーは、基材の表面に比べてそれらが、分子、たとえば、共有結合形成性の反応基の種々の官能性部分を効果的に位置付けることが可能であるという条件で、種々の構造を有し得る。好適なスペーサーには、たとえば、ポリマー（たとえば、ＰＥＧ系ポリマー）；アルキル基等が挙げられ得る。スペーサー部分（又は分子の他の好適な部分）の長さは、捕捉プローブ、標的分子又は当該分析物、標識プローブ、及び活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体の１以上の長さ及び／又はサイズを考慮して調整され得るので、１以上の共有結合形成性の反応基は、基材の表面から離れ、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体、標識プローブ、標的分子又は当該分析物、及び捕捉プローブを含む複合体の近傍に位置し、複合体は基材表面に不動化される。このことは、基材表面を官能化する分子と連結分子又は好適に官能化された検出可能な標識との間で共有結合形成性の反応が生じる可能性を高め得る。

分子における共有結合形成性の反応基の相対的な位置は、それらが基材表面及び存在する場合の標的結合複合体に比べて効果的に位置して、存在する場合の検出可能な標識の標的が限局される堆積を提供するという条件で、変化し得る。たとえば、一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含む分子は、基材表面への分子の結合点に比べて末端の位置にて共有結合形成性の反応基を含む。そのような実施形態はまた、分子の末端と基材表面への分子の結合点の間に位置する１以上の共有結合形成性の反応基を含み得る。

他の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含む分子は、末端に位置する共有結合形成性の反応基を含まないが、代わりに分子の末端と基材表面への分子の結合点の間に位置する１以上の共有結合形成性の反応基を含む。

一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含む分子は、天然に存在する分子、たとえば、天然に存在する核酸又はタンパク質の分子の構造を含まない。一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基自体は、天然に存在する核酸又はタンパク質の分子の共有結合形成性の反応基の構造を含まない。たとえば、一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基は、チロシン及びチミン以外の反応基である。
一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含む分子には、高分子構造、たとえば、高分子スペーサー構造が含まれる。そのような一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基には、芳香族の環構造が含まれる。一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含む好適な基材官能化分子には、基材表面、高分子スペーサー構造及び１以上の共有結合形成性の反応基に結合することが可能である部分が含まれる。一部の実施形態では、基材表面に直接又は間接的に結合することが可能である部分は、特異的な結合部分であり、たとえば、本明細書で定義されるような特異的な結合対のメンバーである。他の実施形態では、基材表面に直接又は間接的に結合することが可能である部分には、共有結合形成性の反応基が含まれる。

好適な共有結合形成性の反応基には、芳香族基、たとえば、フェノール基が挙げられる。一部の実施形態では、芳香族基はチラミン又はチラミン誘導体である。他の実施形態では、芳香族基はチミン又はチミン誘導体である。共有結合形成性の反応基（単数）又は反応基（複数）が芳香族基である場合、芳香族基は一部の実施形態では、アルキル及びオキシアルキル基及び不飽和系を含む、芳香族環上の複数の電子供与体置換基を含む。

共有結合形成性の反応基は、それと共に及び逆も同様に利用されるべきである特定の活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体に基づいて選択され得る。たとえば、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体がペルオキシダーゼ抱合体、たとえば、ＨＲＰ抱合体、又はフェノール基と別の共有結合形成性の反応基の間で共有結合形成を生じる遊離のラジカルを生成することが可能である他の実体である場合、フェノール基が選択され得る。しかしながら、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体と共有結合形成性の反応基の他の組み合わせが当該技術で既知であり、そのようなものが、開示される方法及び組成物と併せて利用され得る。たとえば、グリコシド結合を切断することが可能であるグリコシダーゼ抱合体と併せて共有結合形成性の反応基として１以上のグリコシド結合を利用して、アミノ又はヒドラジド共有結合形成性の反応基との共有結合を順次形成することができるアルデヒド基を露出し得る。

共有結合形成性の反応基を含む分子は、単一の関与反応基又は複数の関与反応基を含み得る。共有結合形成性の反応基を含む分子が複数の共有結合形成性の反応基を含む場合、分子における共有結合形成性の反応基の数は２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上であってもよい。

一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含む分子は、高い濃度の共有結合形成性の反応基を伴ったポリマー単位を含有するコポリマーである。たとえば、一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含有するポリマー単位と共有結合形成性の反応基を含有しないポリマー単位の比が少なくとも１：２０、少なくとも１：１０、少なくとも１：４、少なくとも１：３、少なくとも１：２、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、又は少なくとも１０：１であるコポリマーが利用される。

一部の実施形態では、本開示に係る基材はフェノールサブユニットとカルボン酸サブユニットを含む複数のポリマー、たとえば、チロシン／グルタミン酸コポリマー又はチロシン／アスパラギン酸コポリマーによって官能化される。

一部の実施形態では、基材表面は、本明細書で記載されるようなリンカー分子（又は好適な官能化された検出可能な標識）と共に共有結合を形成することが可能である第１の共有結合形成性の反応基（たとえば、フェノール基）を含む複数の分子、たとえば、ポリマーによって官能化される。加えて、分子は、本明細書で記載されるような捕捉プローブと共に抱合することが可能である複数の第２の基を含み得る。これらの第２の基は、化学抱合に一般に使用される官能基の特異的な対の１つのメンバーであることができる一方で、捕捉プローブは化学抱合を形成するための対の他のメンバーを含む。化学抱合を形成するための官能基のそのような特異的な対は当該技術で既知である。そのような対の一部の例は、ＮＨＳエステルとのアミノ基の対合、マレイミド基とのスルフヒドリル基の対合、アルデヒド基とのヒドラジン誘導体の対合等である。たとえば、好適な抱合化学反応を介して基材表面に直接捕捉プローブを抱合することとは対照的に、このようにして、共有結合形成性の反応基を含む分子に捕捉プローブを抱合することによって、リンカー分子（又は好適な官能化された検出可能な標識）との共有結合を形成するのに利用できる共有結合形成性の反応基と捕捉プローブの双方によって基材表面を官能化し得る。

官能化された基材表面を提供するための基材表面への抱合に好適である共有結合形成性の反応基を含む分子は以下の式（Ｉ）で示されるような構造を有し得る。
式中、波線は表面への結合点を表し；
ｍ及びｎは独立して０及び１から選択される整数であり；
ｐはｎが０のときｐは０ではないという条件で０以上に等しい整数であり；
ｑは０及び１から選択される整数であり；
Ｌ^１は非置換のアルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、置換されたヘテロ原子含有のアルキレン、非置換のアルケニレン、置換されたアルケニレン、ヘテロ原子含有のアルケニレン、置換されたヘテロ原子含有のアルケニレン、非置換のアリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、及び高分子リンカーから選択され；
Ｍ^１及びＭ^２のそれぞれは独立して、結合、非置換のアルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、置換されたヘテロ原子含有のアルキレン、非置換のアルケニレン、置換されたアルケニレン、ヘテロ原子含有のアルケニレン、置換されたヘテロ原子含有のアルケニレン、非置換のアリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、及び置換されたヘテロアリーレンから選択され；
Ｗ^１のそれぞれは、Ｗ^１がアルケン、アリール、アジド、及びα、β−不飽和カルボニルから選択される部分を含む基によって置換されるという条件で、アルキレン、アリーレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、及びヘテロアリーレンからなる群から選択され；
Ｄは、Ｈ、非置換のアルキル、置換されたアルキル、ヘテロ原子含有のアルキル、置換されたヘテロ原子含有のアルキル、非置換のアルケニル、置換されたアルケニル、ヘテロ原子含有のアルケニル、置換されたヘテロ原子含有のアルケニル、非置換のアリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、及び置換されたヘテロアリールから選択される末端基であり、Ｄは任意でアルケン、アリール、アジド、及びα、β−不飽和カルボニルから選択される部分を含む基によって置換される。

たとえば、式（Ｉ）の一部の実施形態では、Ｗ^１は以下の構造を有し：
式中、
Ｘ^１は−ＣＨ−又は−Ｎ−であり；
Ｍ^３は、アルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、及び置換されたヘテロ原子含有のアルキレンから選択されるリンカー部分であり；
Ｌ^２は、結合（すなわち、直接結合）であってもよい、又はそのいずれもが置換されてもよく、若しくは非置換であってもよく、及び１以上のヘテロ原子を含有してもよいアルキレン、アルケニレン、及びアリーレンから選択されてもよいリンカーであり；
Ａｒ^１は、少なくとも１つの電子供与性置換基を含み、１以上の置換基でさらに置換されてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよく、且つ２以上の縮合芳香族環を含んでもよい芳香族部分であり；
Ｒ^１は、アルキレン、置換されたアルキレン、アルケニレン、置換されたアルケニレン、
（式中、
Ｒ^３はＯＨ及びＮＨ_２から選択され；
ｎ１は０、１、２、３及び４から選択され；
各Ｒ^４は、Ｈ、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル、置換されたヘテロ原子含有のヒドロカルビル、及び官能基から独立して選択され；
α、β及びγは、βが存在する又はα及びγが存在するという条件で任意の結合であり；
Ａ及びＢは、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のアルケン、及び官能基から独立して選択され、又はＡ及びＢは、炭素及び窒素から選択され、一緒になって環を形成し；
Ｙは、γが存在すればＣＲ^ａ又はＮであり、γが存在しなければ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（Ｒ^ａ）_２、ＮＲ^ａ、Ｓ及びＯであり；
Ｘは、ＣＲ^ａ又はＮであり；
Ｚは、ＺがＮであればＢは存在しないという条件で、ＣＲ^ａ又はＮであり；
Ｒ^２は、αが存在すればＯ、Ｃ（Ｒ^ａ）_２又はＮＲ^ａであり、αが存在しなければＣ（Ｒ^ａ）_３、Ｎ（Ｒ^ａ）_２、ＳＲ^ａ又はＯＲ^ａであり；
Ｖは、ＶがＳ又はＯであれば、Ａが存在しないという条件でＣＲ^ａ、Ｎ、Ｓ及びＯから選択され；
Ｒ^ａは、Ｈ、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル、及び置換されたヘテロ原子含有のヒドロカルビルから選択される）から選択される不飽和部分である。

たとえば、一部の実施形態では、Ｗ^１はチロシンのようなアミノ酸である（すなわち、アラルキル基で置換され、カルボニル基を有するヘテロアルキレン）。一部の実施形態では、Ｍ_２は結合又はアルキレンリンカーである。

たとえば、式（Ｉ）の一部の実施形態では、Ｄはチロシンのようなアミノ酸である。また、たとえば、Ｄは構造：
を有し、
式中、Ｍ^３、Ｒ^１及びＡｒ^１は上記で定義したとおりである。

たとえば、式（Ｉ）の一部の実施形態では、Ｌ^１は、高分子リンカー部分である。そのようなものの例には、たとえば、ポリ（メチレンオキシド）（すなわち、（−ＯＣＨ_２−）_ｎ）、ポリ（エチレンオキシド）（すなわち、（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２−）_ｎ）、ポリ（プロピレンオキシド）（すなわち、（−ＯＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）−）_ｎ）等のようなポリ（エチレンイミン）及びポリ（アルキレンオキシド）リンカー部分が挙げられる。高分子リンカー部分の他の例には、ポリ（アミノ酸）、ポリ（糖類）及びポリ（核酸）が挙げられる。Ｌ^１が高分子連結部分である場合、Ｌ^１の分子量は、約１００Ｄａと約１００、０００Ｄａの間、又は約１００Ｄａと１０、０００Ｄａの間、又は約１００Ｄａと１、０００Ｄａの間であってもよい。一部の実施形態では、Ｌ^１は、ブロック様の特徴を有する。たとえば、Ｌ^１は、任意のサイズの上述の例の高分子部分の２、３、４以上のブロックを含み得る。他の実施形態では、Ｌ^１は、それが特定可能な反復部分を有さないという意味で高分子部分ではない。そのようなＬ^１基の例にはアミノ酸（たとえば、チロシン）が挙げられる。

たとえば、式（Ｉ）の一部の実施形態では、Ｍ^１及びＭ^２はアルカリ基、アミド基、エーテル基、エステル基及びそれらの組み合わせから選択される部分を含有する連結部分である。例には、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−等が挙げられ、式中、ｎは０以上の整数である。

また、たとえば、一部の実施形態では、Ａｒ^１は構造：
を有し、
式中、
２つの隣接するＲ基が一緒になって任意でさらに置換され、任意でさらにヘテロ原子を含有する環を形成するという条件で、
Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＪは、Ｃ−Ｒ及びＮから選択され、各Ｒは独立してＨ、アルキル、アルケニル、アリール、酸素含有の置換基及び窒素含有の置換基から選択される。一部の実施形態では、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＪの１以下、又は２以下、又は３以下、又は４以下がＮである。

また、たとえば、一部の実施形態では、Ａｒ^１は構造：
を有し、
式中、Ｒ^１〜Ｒ^５のそれぞれは独立してＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、モノ−アルキル置換のアミノ、ジ−アルキル置換のアミノ及びアミドから選択される。

一部の実施形態では、Ｒ^３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アミノ、アルコキシ、アルキル置換のアミノ、アミド及びアリールから選択され；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも１つは、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、アルキル置換のアミノ、又はアミドである。そのような一部の実施形態では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも１つはヒドロキシルである。

共有結合形成性の反応基を含む分子に加えて、本開示に係る官能化された基材は、それに結合する１以上の標的特異的な捕捉プローブも含み得る。たとえば、共有結合形成性の反応基を含む複数の分子と標的特異的な捕捉プローブによって官能化された基材を説明する図１を参照のこと。標的特異的な捕捉プローブは、好適な反応条件下でそれらが標的分子又は他の当該分析物に特異的に結合することが可能であるという条件で、種々の構造を有し得る。たとえば、標的分子が核酸である場合、好適な標的特異的な捕捉プローブは、標的核酸分子の領域に配列相補性の領域、たとえば、実質的な又は絶対的な配列相補性の領域を有する核酸分子であり得る。標的分子がタンパク質又はその断片である場合、好適な標的特異的な捕捉プローブは、標的分子に特異的に結合することが可能である抗体であり得る。特異的な相互作用が可能である追加の結合メンバーは当該技術で既知であるので、好適な標的特異的な捕捉プローブは、常法を用いて特定の標的分子又は当該分析物に関して容易に特定され、調製され得る。

本開示に係る官能化された基材が標的特異的な捕捉プローブ及び共有結合形成性の反応基を含む分子の双方を含む場合、それらが互いに近傍に位置するようにこれら２種の分子は基材表面上に分配され得る。一部の実施形態では、単位面積当たりの共有結合形成性の反応基を含む分子と標的特異的な捕捉プローブの比は、少なくとも１：２０、少なくとも１：１０、少なくとも１：５、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、又は少なくとも１０：１である。

検出可能な標識
開示される方法及び組成物と併せて利用することができる当該技術で既知の種々の検出可能な標識がある。これらには、たとえば、蛍光粒子、化学発光粒子及び磁気粒子が挙げられる。

本明細書で開示される方法及び組成物の一実施形態では、検出可能な標識が利用され、検出可能な標識は磁気粒子、たとえば、磁気ナノ粒子又はマイクロ粒子である。磁気粒子には、たとえば、強磁性物質、フェリ磁性物質、常磁性物質又は超常磁性物質のような磁気物質から作製される磁気ビーズ又は他の小型物体が挙げられる。一部の実施形態では、磁気粒子は、約１０ｎｍ〜約１００μｍに及ぶ直径を持つ酸化鉄（Ｆｅ_２Ｏ_３及び／又はＦｅ_３Ｏ_４）を含む。磁気ナノ粒子は、たとえば、ドイツ、ベルギッシュ・グラートバッハのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社から入手可能である。これらは、直径通常約１０〜約１００ｎｍの被覆された単一ドメインの酸化鉄粒子から構成される相対的に小さな粒子である。磁気粒子はまた、たとえば、ポリスチレンのような高分子マトリクスに埋め込まれた磁気ナノ粒子から作製することもできる。そのような粒子は約１〜約５μｍの直径を有する。この種の粒子は、カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社から入手可能である。磁気粒子の追加の例には、Ｂａｓｅｌｔら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１３，７３１−７３９（１９９８）；Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１４，８０５−８１３（２０００）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．ｏｆ Ｍａｇ．Ｍａｇｎ．Ｍａｔｅｒ．，２２５，１３８−１４４（２００１）；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，９１，７７８６?７７８８（２００２）；Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，９３，７２８１−７２８６（２００３）；及び米国特許出願公開番号２００５／０１００９３０（２００５年５月１２日に公開）によって記載されたものが挙げられる。

一部の実施形態では、本開示と併せて使用するための検出可能な標識、たとえば、磁気粒子又は非磁気粒子は、約１００ｎｍ〜約５μｍ、たとえば、約２００ｎｍ〜約４μｍ、約３００ｎｍ〜約３μｍ、約４００ｎｍ〜約２μｍ、又は約５００ｎｍ〜約１μｍの直径を有し得る。

好適な検出可能な標識は、蛍光視野又は磁場のような検出可能な標識の検出可能な特徴を特に利用してもよく又はしなくてもよい顕微鏡方式を用いて検出できるものであり得る。たとえば、一部の実施形態では、好適な検出可能な標識は、単にそのサイズに基づいた光学顕微鏡方式によって検出可能であってもよい。たとえば、０．１μｍ以上、たとえば、０．５μｍ以上の直径を有する検出可能な粒子が使用される場合、これが当てはまり得る。

開示される方法及び組成物と併せて使用するための検出可能な標識粒子は、それに結合する分子で官能化された表面を含む。一部の実施形態では、検出可能な標識粒子は、本明細書で記載されるような共有結合形成性の反応基を含む分子によって官能化される。たとえば、図２、４、８及び９を参照のこと。他の実施形態では、検出可能な標識粒子は、リンカー分子結合部分を特異的に結合することが可能である分子によって官能化される。たとえば、図１（ｃ）を参照のこと。本明細書で記載される官能化された検出可能な標識結合部分及びリンカー分子結合部分は、本明細書で前に定義したような特異的な結合対のメンバーを含み得る。

一部の実施形態では、開示される方法及び組成物と併せて使用するのに好適な検出可能な標識粒子は、共有結合形成性の反応基を含む分子によって官能化された表面を含み、分子は、たとえば、式（Ｉ）で示すような官能化された基材表面の文脈にて上記で議論したものに類似する又はそれと同じである構造を有する。そのような実施形態では、式（Ｉ）の波線は検出可能な標識粒子への共有結合を表す。

他の実施形態では、開示される方法及び組成物と併せて使用するのに好適な検出可能な標識粒子は、式（ＩＩ）の構造を有する分子によって官能化された表面を含む：
式中、
Ｌ^１は、式（Ｉ）で定義したとおりであり；
Ｕ^１は、特異的な結合対のメンバー（たとえば、特異的な結合対の第１又は第２のメンバー）又は共有結合形成性の反応基であり；
波線は、検出可能な標識粒子への共有結合を表す。

一部の実施形態では、Ｕ^１は、ビオチン部分、核酸配列、抗原、抗体、ハプテン又は抗原、アビジン又はストレプトアビジン部分、糖部分及びレクチン部分から選択される。

一部の実施形態では、開示される方法及び組成物と併せて使用するのに好適な検出可能な標識粒子は、式（ＩＩＩ）の構造を有する分子によって官能化された表面を含む：
式中、
Ｌ^１及びＤは式（Ｉ）について上記で定義されたとおりであり；
波線は、検出可能な標識粒子への共有結合を表す。

リンカー分子
本開示は、本明細書で記載される組成物、方法及びキットと併せて使用するためのリンカー分子を提供する。これらのリンカー分子は、たとえば、図１で描かれるように、少なくとも１つの特異的結合部分又は本明細書では「リンカー分子結合部分」と呼ばれるその後の共有結合形成が可能である官能基、たとえば、本明細書で定義されるような特異的な結合対のメンバー、及び本明細書で定義されるような少なくとも１つの共有結合形成性の反応基を含む。本開示に係るリンカー分子は、本明細書で記載されるような官能化された基材及び１以上の検出可能な標識と共に使用するために構成される。従って、リンカー分子のリンカー分子結合部分は、本明細書で記載されるような好適な官能化された検出可能な標識との１以上の共有結合を特異的に結合する又は形成するように構成され、共有結合形成性の反応基は、本明細書で記載されるような基材表面に結合する分子の共有結合形成性の反応基との共有結合を形成するように構成される。リンカー分子の結合部分が検出可能な標識の結合部分で官能化された検出可能な標識に結合する結合複合体を説明する図１（ｃ）を参照のこと。加えて、リンカー分子の共有結合形成性の反応基は、基材表面に不動化された分子の共有結合形成性の反応基と共に共有結合を形成する。示されるように、そのような結合複合体は、複数の係留結合を介して基材表面上での検出可能な標識の不動化を生じ得る。

本明細書で前に記載されたような基材表面又は検出可能な標識を官能化するのに使用される分子と同様に、リンカー分子は種々の構造を有し得る。リンカー分子は種々の好適な構造のいずれかを有する二官能性又は多官能性の試薬であり得る。たとえば、リンカー分子は、直鎖又は樹状であってもよく、分子の官能性部分を連結する１以上のスペーサーを含んでもよい。好適なスペーサーは、それらが分子の種々の官能性部分、たとえば、リンカー分子結合部分に対する共有結合形成性の反応基を効果的に位置付することが可能であるという条件で、種々の構造を有し得る。好適なスペーサーには、たとえば、ポリマー（たとえば、ＰＥＧ系ポリマー）；アルキル基等が挙げられ得る。たとえば、使用される検出可能な標識のサイズ及び／又は形成される標的結合複合体の長さ及び／又はサイズ（たとえば、捕捉プローブ、標的又は当該分析物、標識プローブ、及び活性化剤を生成する（放出する）ことが可能である実体の長さ及び／又はサイズ）を考慮してスペーサー部分（又はリンカー分子の他の好適な部分）の長さを調整し得る。一実施形態では、たとえば、リンカー分子がスペーサーによって分離されたビオチン及びチラミンを含む場合、スペーサーは１０を超える数の原子を含む。

リンカー分子における共有結合形成性の反応基の相対的な位置は、それらがリンカー分子結合部分に対して効果的に位置付けられて、官能化された検出可能な標識への結合及び基材表面を官能化する分子との共有結合形成の双方を提供するという条件で、変化し得る。たとえば、一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含むリンカー分子は、たとえば、図１で描くように、リンカー分子結合部分に対して末端位置で共有結合形成性の反応基を含む。そのような実施形態はまた、分子の末端とリンカー分子結合部分の間に位置する１以上の共有結合形成性の反応基を含み得る。

他の実施形態では、リンカー分子は末端に位置する共有結合形成性の反応基を含まないが、代わりに分子の末端とリンカー分子結合部分の間に位置する１以上の共有結合形成性の反応基を含む。

一部の実施形態では、リンカー分子は天然に存在する分子、たとえば、天然に存在する核酸又はタンパク質の分子の構造を有さない。一部の実施形態では、リンカー分子の共有結合形成性の反応基は、天然に存在する核酸又はタンパク質の分子の共有結合形成性の反応基の構造を有さない。たとえば、一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基は、チロシン及びチミン以外の反応基である。

一部の実施形態では、リンカー分子は高分子構造、たとえば、高分子スペーサー構造を含む。一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基は芳香族の環構造を含む。一部の実施形態では、好適なリンカー分子はリンカー分子結合部分、高分子スペーサー構造及び１以上の共有結合形成性の反応基を含む。共有結合形成性の反応基は、芳香族基、たとえば、フェノール基を含み得る。一部の実施形態では、芳香族基はチラミン又はチラミン誘導体である。他の実施形態では、芳香族基はチミン又はチミン誘導体である。

共有結合形成性の反応基（単数）又は反応基（複数）が芳香族基である場合、芳香族基は、一部の実施形態では、芳香族環上にてアルキル基及びオキシアルキル基及び不飽和系を含む複数の電子供与性置換基を含む。

基材表面の官能化と同様に、リンカー分子で使用するための共有結合形成性の反応基は、それと共に及び逆もまた同様に利用されるべきである活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である特定の実体に基づいて選択され得る。たとえば、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体がペルオキシダーゼ抱合体、たとえば、ＨＲＰ抱合体、又はフェノール基と別の共有結合形成性の反応基の間で共有結合形成を生じる遊離のラジカルを生成することが可能である他の実体である場合、フェノール基が選択され得る。活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体と共有結合形成性の反応基の他の組み合わせは当該技術で既知であり、開示される方法及び組成物と併せてそのようなものが利用され得る。たとえば、グリコシド結合を切断することが可能であるグリコシダーゼ抱合体と併せて共有結合形成性の反応基として１以上のグリコシド結合を利用して、アミノ又はヒドラジド共有結合形成性の反応基との共有結合を順次形成することができるアルデヒド基を露出し得る。

リンカー分子は、単一の関与反応基又は複数の関与反応基を含み得る。リンカー分子が複数の共有結合形成性の反応基を含む場合、分子における共有結合形成性の反応基の数は２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上であってもよい。

一部の実施形態では、リンカー分子は高濃度の共有結合形成性の反応基を伴ったポリマー単位を含有するコポリマーである。たとえば、一部の実施形態では、共有結合形成性の反応基を含有するポリマー単位と共有結合形成性の反応基を含有しないポリマー単位の比が、少なくとも１：４、少なくとも１：３、少なくとも１：２、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、又は少なくとも１０：１であるコポリマーが利用される。好適なリンカー分子は、単一のリンカー分子結合部分、たとえば、特異的な結合対の単一の第１のメンバー又は複数のリンカー分子結合部分、たとえば、特異的な結合対の複数の第１のメンバーを含み得る。リンカー分子が複数の特異的な結合部分を含む場合、リンカー分子における特異的な結合部分の数は２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上であってもよい。一部の実施形態では、リンカー分子は高濃度のリンカー分子結合部分を含有するコポリマーである。たとえば、一部の実施形態では、リンカー分子結合部分を含有するモノマー単位とリンカー分子結合部分を欠くモノマー単位の比が少なくとも１：４、少なくとも１：３、少なくとも１：２、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、又は少なくとも１０：１であるコポリマーが提供される。

従って、特定のリンカー分子は、単一の共有結合形成性の反応基と単一のリンカー分子結合部分、単一の共有結合形成性の反応基と複数のリンカー分子結合部分、複数の共有結合形成性の反応基と複数のリンカー分子結合部分（たとえば、複数のチラミン分子と複数のビオチン分子）、又は複数の共有結合形成性の反応基と単一のリンカー分子結合部分を含み得ることが理解されるべきである。

リンカー分子は、以下の式（ＩＶ）で示される構造を有し得る：
式中、
Ｌ^１、Ｗ^１、Ｍ^１、Ｍ^２、Ｄ、ｎ、ｐ、及びｑは式（Ｉ）に記載されたとおりであり；
Ｕ^１は、式（ＩＩ）について上記で定義されたような特異的な結合対の第１のメンバー又は共有結合形成性の反応基である。

一部の実施形態では、Ｌ^２の各例及びＬ^１の各例は独立して、そのいずれかが置換されてもよく又は非置換であってもよいＣ_１−Ｃ_２４アルキレン、ヘテロ原子含有のＣ_１−Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_２−Ｃ_２４アルケニレン、ポリアルキレン、及びポリ（アルキレンオキシド）から選択される。

一部の実施形態では、Ｕ^１は、ビオチン部分、核酸配列、抗原、抗体、ハプテン、アビジン又はストレプトアビジン部分、糖部分、レクチン部分及び酵素又はアポ酵素から選択される。

一部の実施形態では、Ｕ^１は、ビオチン部分なので、リンカー分子は式（ＩＶａ）の構造を有する：

たとえば、一部の実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＶ）においてＤは＊−Ｍ^３−Ａｒ^１であり、式中、Ａｒ^１は４−ヒドロキシフェニルであり、Ｍ^３は置換されたヘテロ原子含有のアルキレン（すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）である。さらに、ｐは０であり、ｍ及びｎは双方とも１である。さらにＬ^１は（ＣＨ_２）_５−であり、Ｍ_１は−（ＣＨ_２）_４−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−である。或いは、Ｌ^１は、−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ１−であり、式中、ｎ１は１〜３０、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、又は３０の整数であり、他の変数は前に記載されたとおりである。

また、たとえば、一部の実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＶ）において、Ｄは＊−Ｍ^３−Ａｒ^１であり、式中、Ａｒ^１は４−ヒドロキシフェニルであり、Ｍ^３は置換されたヘテロ原子含有のアルキレン（すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ_２Ｈ）−ＣＨ_２−）である。さらに、ｐは０であり，ｍ及びｎは双方とも０である。或いは、ｍ及びｎは双方とも１であり、Ｌ^１は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｍ^１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ１−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、その際、ｍ１は１〜３０、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、又は３０の整数である。

また、たとえば、一部の実施形態では、Ｍ^３はピロリジノン部分のような複素環部分を含有する。たとえば、Ｄは＊−Ｍ^３−Ａｒ^１であり、式中、Ａｒ^１は４−ヒドロキシフェニルであり、Ｍ^３は
である。
さらに、ｐは０であり，ｍ及びｎは双方とも０である。さらにＬ^１は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ１−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｍ^１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ１−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、ｎ１及びｍ１は上述のとおりである。

また、たとえば、一部の実施形態では、Ｍ^１は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−（ＣＨ_２）_４−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−であり、他の変数は上述のとおりである。

一実施形態では、本開示に係るリンカー分子は図３にて一般に描かれるようなビオチン／チラミン抱合体であり、ビオチンがリンカー分子結合部分であり、チラミンが共有結合形成性の反応基である。一実施形態では、本開示に係るビオチン／チラミン抱合体は、以下の式（Ｖ）にて提供されるような構造を有する。

別の実施形態では、本開示に係るビオチン／チラミン抱合体は、以下の式（ＶＩ）にて提供されるような構造を有する。

特異的な結合部分（たとえば、ビオチン部分）と共有結合形成性の反応基（たとえば、チラミン部分）を連結する上記分子のリンカー部分の長さを調整して、特異的な結合部分と共有結合形成性の反応基の間でさらに長い又は短い距離を有するリンカー分子を提供し得ることが留意されるべきである。

一部の実施形態では、本開示に係るリンカー分子は、表４（本明細書の以後で提供される）にて示すような構造を有する１以上のフェノール性の共有結合形成性の反応基を含む。一部の実施形態では、リンカー分子は、１以上の特異的な結合部分（たとえば、１以上のビオチン部分）を含む。

標的分子及び当該分析物
多種多様な標的分子及び当該分析物、たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸、ウイルス、抗体又はその断片（単鎖抗体、Ｆａｂ等を含む）、全細胞、細胞成分、有機及び無機の小分子、又はそれらの組み合わせのいずれかの定性的な及び／又は定量的な検出と併せて本開示の組成物、方法及びキットが利用され得る。当該タンパク質標的には、たとえば、細胞表面受容体、シグナル伝達因子及びホルモンが挙げられる。当該核酸標的には、たとえば、ＤＮＡ及びＲＮＡの標的が挙げられる。当該細胞標的には、たとえば、哺乳類細胞（特にヒト細胞）幹細胞及び細菌細胞が挙げられる。

検出可能な標識及び／又はリンカー分子の標的が限局された係留
上記の成分は、試料における標的分子又は他の当該分析物の存在、非存在及び／又は量を検出する方法にて使用される。

リンカー分子を用いた官能化された検出可能な標識の検出
本開示に係る検出方法の一実施形態は図１にて一般に説明されている。この実施形態では、標的分子又は他の当該分析物を含有することが疑われる試料を伴った反応混合物にて、官能化された基材を組み合わせる。官能化された基材は、少なくとも１つの標的特異的な捕捉プローブと第１の共有結合形成性の反応基を含む複数の分子とを含む。ストリンジェントな反応条件を調整し、１以上の洗浄工程を利用して標的分子又は他の当該分析物の非特異的な結合をできるだけ抑え得る。これは、たとえば、ｐＨ、温度及び／又は洗浄条件の塩濃度を調整することによって達成することができる。

上記反応混合物に１以上の標識プローブを添加する。用語「標識プローブ」は、好適な反応条件下にて標的分子又は他の当該分析物に接触させると標的分子又は他の当該分析物の少なくとも一部を特異的に結合することが可能である第１の特異的な結合部分と、好適な反応条件下にて活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体に接触させると活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体を特異的に結合することが可能である第２の特異的な結合部分を有する二官能性分子を指すのに本明細書で使用される。ストリンジェントな反応条件を調整し、１以上の洗浄工程を利用して標的プローブの非特異的な結合をできるだけ抑え得る。

活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体も反応混合物に添加する。一部の実施形態では、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体は酵素抱合体である。本明細書で使用されるとき、「酵素抱合体」は、第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の間での共有結合の形成を触媒し、及び／又は共有結合形成のために第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の１以上を活性化することが可能である酵素を指し、酵素は本明細書で記載されるような標識プローブを特異的に結合することが可能である結合部分に連結される。酵素抱合体に好適な酵素は、第１と第２の共有結合形成性の反応基の化学的な正体及び／又は特徴に基づいて選択され得る。同様に、第１と第２の共有結合形成性の反応基は、酵素の正体及び／又は特徴に基づいて選択され得る。第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の間での共有結合の形成を触媒し、及び／又は共有結合形成のために第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の１以上を活性化することが可能である酵素の非限定例には、たとえば、ペルオキシダーゼ（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、グリコシダーゼ及びホスファターゼ（たとえば、アルカリホスファターゼ）が挙げられる。

好適な反応条件下で標的分子が試料に存在する場合、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体が標的分子又は当該分析物に結合する標的特異的な捕捉プローブから生じる一連の連結を介して基材表面に連結され、標的分子又は当該分析物が標識プローブに結合し、標識プローブが活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体に結合する結合複合体が、図１（ａ）に描かれるように生じる。ストリンジェントな反応条件を調整し、１以上の洗浄工程を利用して活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体の非特異的な結合をできるだけ抑え得る。

本明細書で記載されるような複数のリンカー分子を反応混合物に添加し、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体が、基材表面に不動化された分子の第１の共有結合形成性の反応基とリンカー分子の第２の共有結合形成性の反応基との間での共有結合の形成を触媒し、及び／又は共有結合形成のために第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の１以上を活性化するように好適な反応条件が提供される。一部の実施形態では、好適な反応条件は１以上の緩衝液及び／又は酵素基質の添加を必要とし得る。たとえば、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体が、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む酵素抱合体である場合、好適な過酸化物を含有する緩衝液を反応混合物に添加して共有結合形成反応を可能にする。活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体の標的を限局する作用の結果、たとえば、図１（ｂ）及び図３（ｂ）で示すように、リンカー分子は、標的を限局する様態で基材表面に共有結合する。これによって、好適に官能化された検出可能な標識の標的を限局する様態でのその後の結合のための複数の「フック」を提供し、標的が結合する個々の、空間的に離れた部位の特定を可能にするリンカー分子結合部分の標的を限局する堆積が生じる。

リンカー分子結合部分に特異的な結合部分を有する分子によって官能化された検出可能な標識の添加によって、たとえば、図１（ｃ）及び図３（ｃ）にて説明するような結合複合体、すなわち、複数の独立した連結が、基材表面に捕捉された標的分子の近傍で基材表面に検出可能な標識を係留するのに役立つ結合複合体が生じる。ストリンジェントな反応条件を調整し、１以上の洗浄工程を利用して官能化された標識の非特異的な結合をできるだけ抑え得る。

標的を限局する様態にて検出可能な標識がいったん基材表面に係留されると、１以上の検出系を利用して、不動化された標的分子の位置及び／又は量を示す検出可能な標識の位置及び／又は量を検出し及び／又は視覚化し得る。係留された検出可能な標識を検出するのに使用される特定の方法は利用される検出可能な標識の種類に左右されるであろう。たとえば、検出可能な標識が蛍光粒子である場合、１以上の蛍光系の検出システムが利用され得る。検出可能な標識が磁気粒子である場合、１以上の磁気センサーが利用され得る。

一部の実施形態では、基材表面に係留された検出可能な標識は、蛍光視野又は磁場のような検出可能な標識の特異的に検出可能な特徴を利用してもよいし、又はしなくてもよい顕微鏡方式を用いて検出され得る。たとえば、一部の実施形態では、基材表面に係留された検出可能な標識は、単にそのサイズに基づいた光学顕微鏡方式によって検出可能であり得る。たとえば、０．５μｍ以上の直径を有する検出可能な粒子が使用される場合、これが当てはまり得る。

リンカー分子を使用しない官能化された検出可能な標識の検出
別の実施形態では、代わりの検出方法が利用され得る。この方法は、図４で提供される具体例と共に図２で一般的に説明されている。上述の方法におけるように、標的分子又は当該分析物を含有することが疑われる試料を伴った反応混合物にて官能化された基材を組み合わせる。官能化された基材は、少なくとも１つの標的特異的な捕捉プローブと第１の共有結合形成性の反応基を含む複数の分子とを含む。ストリンジェントな反応条件を調整し、１以上の洗浄工程を利用して標的分子又は当該分析物の非特異的な結合をできるだけ抑え得る。

上記反応混合物に、上述のように１以上の標識プローブを添加する。ストリンジェントな反応条件を調整し、１以上の洗浄工程を利用して標識プローブの非特異的な結合をできるだけ抑え得る。

活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体、たとえば、酵素抱合体も上述のように反応混合物に添加する。好適な反応条件下で標的が試料に存在する場合、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体が標的分子又は当該分析物に結合する標的特異的な捕捉プローブから生じる一連の連結を介して基材表面に連結され、標的分子又は当該分析物が標識プローブに結合し、標識プローブが活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体に結合する結合複合体が、図２（ａ）に描かれるように生じる。ストリンジェントな反応条件を調整し、１以上の洗浄工程を利用して活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体の非特異的な結合をできるだけ抑え得る。

第２の共有結合形成性の反応基を有するリンカー分子を利用する代わりに、第２の共有結合形成性の反応基を有する分子によって官能化された検出可能な標識を図２に示すように利用する。

上記で議論したように、一部の実施形態では、好適な反応条件は１以上の緩衝液の添加を必要とし得る。たとえば、活性化剤を生成する（又は放出する）ことが可能である実体がＨＲＰを含む酵素抱合体である場合、好適な過酸化物を含有する緩衝液を反応混合物に添加して共有結合形成反応を円滑にする。酵素の標的が限局される作用の結果、たとえば、図２（ｂ）及び図４（ｂ）で示すように、検出可能な標識は、標的が限局される様態で基材表面に共有結合する。

空間的に離れた個々に検出可能な標的分子の部位
一部の実施形態では、空間的に離れた、個々に検出可能な標的分子の部位の堆積を促進するように１以上の反応条件のパラメータを調整する。言い換えれば、個々の又は非常に少ない数の標的分子（たとえば、約２０未満、約１０未満又は約５未満）が基材表面の部位に存在するように１以上の反応条件のパラメータを調整する。本明細書で前に記載したように、１以上の検出可能な標識は、標的が限局される様態でそれぞれ個々の標的分子の部位にて結合し、個々の標的部位の検出を可能にする。空間的に離れた、個々の標的部位の検出を可能にするために調整され得るパラメータには、標的特異的な捕捉プローブによる標的捕捉の効率；酵素活性のレベル；１以上の官能化された基材表面、検出可能な標識及びリンカー分子の共有結合形成性の反応基の反応性のレベル；官能化された検出可能な標識における特異的結合メンバーの数；及び官能化された検出可能な標識における共有結合形成性の反応基の数が挙げられる。

一部の実施形態では、試料における標的分子の濃度を調整してもよく、又はさもなければ、空間的に離れた、個々に検出可能な標的部位の形成を促進する濃度で標的分子が提供されてもよい。たとえば、一部の実施形態では、標的分子の濃度を調整して、基材表面の０．２平方μｍ当たり１以下の部位の密度で標的部位の形成を生じる試料中の標的分子の濃度を提供する。

一部の実施形態では、単一の検出可能な標識、たとえば、単一の磁気粒子が各標的分子部位にて結合するように反応パラメータを調整し得る。従って、一部の実施形態では、上述のような標的分子部位には、１以下の標的分子及び１以下の検出可能な標識が含まれ得る。

結合複合体を強化し、安定化する架橋
本明細書で記載される２以上の実体間で結合複合体が形成されると、１以上の架橋剤の導入によって結合複合体を強化し、及び／又は安定化することができる。たとえば、標識プローブを導入する前に標的特異的な捕捉プローブを介して基質表面に結合した標的分子又は当該分析物を安定化させることが望ましいことがある。同様に、官能化された検出可能な標識が１以上のリンカー分子を介して基質表面に結合した後、形成された結合複合体を安定化させることが望ましいことがある。

共有結合の導入を介した架橋
架橋剤を導入して結合複合体のメンバー間の共有結合の形成を円滑にすることができる。共有結合のエネルギーは普通３００〜４００ＫＪ／モルの範囲である。受容体とリガンド、タンパク質とタンパク質又はハイブリッド形成した二本鎖核酸の間での非共有結合の相互作用よりも共有結合は何倍も強い。

結合複合体に加わる分子内での基又は部分の間で共有結合を形成するのに好適な種々の共有結合形成反応は、銅が触媒するアジド／アルキン［３＋２］付加環化「クリック化学」、アジド／ＤＩＦＯ（ジフッ素化シクロオクチン）又は銅を含まないクリック化学、アジド／ホスフィン「Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応」、アジド／トリアリールホスフィン「修飾Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応」、及びオレフィンメタセシス反応を含めて当該技術で知られている。これらの共有結合形成反応を利用し、共有結合を導入して上述のような結合複合体を安定化し及び／又は強化し得る。当業者は、これら反応の一部、たとえば、銅が触媒するアジド／アルキン［３＋２］付加環化は結合対相互作用を触媒するのに触媒剤の添加を必要とするが、アジド／ＤＩＦＯ反応のような他のものはそうではないことに気付くであろう。

ハイブリッド形成した核酸の鎖間、核酸とタンパク質の間、及び異なるタンパク質分子間を架橋するのに使用することができる当該技術で利用できる種々の剤がある。官能基の異なる長さ及び組み合わせの架橋試薬は市販されている。或いは、特定の架橋状況の要件に合うように架橋試薬を設計し、合成することができる。

たとえば、タンパク質分子を架橋するのに広く使用されている小型のホモ二官能性架橋剤であるグルタールアルデヒドを、本明細書で開示される方法及び組成物と併せて使用することができる。

別の例では、光化学付加を介して共有結合の核酸付加体を形成する光変異原性化合物の部類であるソラーレンが利用される。一次反応は、ＤＮＡにおけるチミジンの５，６二重結合とソラーレン分子の４’，５’又は３，４二重結合との間でのシクロブタン環の形成である。４’，５’二重結合での反応はフラン側鎖のモノ付加体をつくり、それはさらに対向する鎖における隣接ピリミジンの部位で反応し、鎖内架橋をつくることができる。Ｓｐｉｅｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，２３４５−２３４９（１９９５）。８−メトキシソラーレンからのソラーレンを含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）の合成を記載しているＯｋａｍｏｔｏら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．３，９２５−７（２００１）も参照のこと。鎖の末端でソラーレン単位を含有するＰＮＡは相補性のＤＮＡと安定な二本鎖を形成する。追加の官能性を持つソラーレン誘導体も合成されている。たとえば、Ｓａｆｆｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，７２２１−３１（１９８８）は、ビオチン化ソラーレン（ＢＰｓｏｒ）の合成を記載している。ＢＰｓｏｒは、ＤＮＡと光反応して鎖内架橋を形成する一方で、その後ストレプトアビジン分子と結合することができるビオチン部分の形態で追加の結合官能性を提供する。

ハイブリッド形成した核酸分子の架橋も米国特許第６，８００，７６８号（２００４年１０月５日発行）にて記載されたように達成することができ、非ヌクレオシド光反応性のクマリン誘導体が核酸に取り込まれて鎖内架橋を可能にする。

Ｐｅｎｄｅｒｇｒａｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０２８７−１０２９１（１９９２）で記載されたように、光架橋を利用してタンパク質と核酸の間での結合複合体を安定化することもできる。具体的には、Ｐｅｄｅｒｇｒａｓｔらは、部位特異的な変異誘発とその後のシステイン特異的な化学修飾からなる２工程手順によってタンパク質内の単一アミノ酸部位で光活性化可能な架橋剤を組み入れる。先ず、部位特異的な変異誘発を用いて当該位置にて独特の溶媒露出システイン残基を導入する。次いで、得られたタンパク質をシステイン特異的なヘテロ二官能性の光活性化可能架橋剤、たとえば、臭化４−アジドフェナシルによって誘導体化する。定義された条件下で、独特の溶媒露出システイン残基を有するタンパク質との臭化４−アジドフェナシルの反応は、システイン残基の完全で高度に選択性の誘導体化を生じ、［（４−アジドフェナシル）−Ｃｙｓ］タンパク質の形態の抱合体が得られる。次いでタンパク質／ＤＮＡの複合体を形成し、ＵＶ照射によってタンパク質／ＤＮＡの複合体にて共有結合架橋剤が導入される。

別の無関係な試薬として架橋剤を適用することができる。或いは、架橋官能基を直接、リンカー分子、捕捉プローブ、標識プローブ、基材、検出可能な標識等に抱合することができる。光、ｐＨ変化又は指定した時点で適用される特異的な化合物のような入力による命令で架橋官能基を活性化することができる。さらに、本明細書で開示される結合部分及び／又はリンカー分子を選択した架橋剤の適用に好適にするように設計することができる。たとえば、タンパク質、たとえば、抗体を含む標的特異的な結合部分への核酸分子の抱合は、元々核酸のみに適用可能であった架橋試薬とこれら結合部分を架橋するのを可能にする。逆に、核酸を含む標的特異的な結合部分にタンパク質又は他の化学実体を抱合することは、架橋剤の選択を元々核酸に適用できないものに広げることを可能にする。

実施例１：共有結合形成性分子によって官能化された基材上での標的の捕捉
２枚のシリコンウエハー基材を調製した。酸化シリコンウエハー表面をアミノアルキルシランで誘導体化して酸化シリコン表面にアミノ基を付与することによってオリゴヌクレオチド捕捉プローブで第１の基材表面（指定されたオリゴチップ）を官能化した。次いで、ＰＥＧスペーサーによって離したマレイミド基とＮＨＳエステル基を含有する二官能性試薬を用いてアミノ基をマレイミド基に変換した。次いでマレイミド基を介して、末端スルフヒドリル基を持つオリゴヌクレオチドをウエハーに抱合した。最後に、短いＰＥＧ／スルフヒドリル誘導体で未反応のマレイミド基に蓋をした。

第２の基材表面（指定されたＷ１チップ）については、アミノアルキルシランで誘導体化した同じシリコンウエハーをオリゴヌクレオチド捕捉プローブで抱合した。抱合方法は第１の基材に使用したものとは異なるが、オリゴヌクレオチドプローブの同程度の抱合を生じた。この場合、末端アミノ基を持つオリゴヌクレオチドを調製した。その後、無水コハク酸との反応によってアミノ基をカルボン酸基に変換した。次いでオリゴヌクレオチドの末端カルボン酸基をカルボジイミドで活性化し、基材表面上のアミノ基に抱合した。その後、オリゴヌクレオチド抱合によって取り上げられないアミノ基を介してチロシン／グルタミン酸コポリマーを基材表面に抱合して基材表面に不動化された共有結合形成性の反応基を提供した。チロシン／グルタミン酸コポリマーの抱合は、コポリマーにおけるカルボン酸基のカルボジイミド活性化を介して行った。チロシン／グルタミン酸コポリマーは、チロシン１にグルタミン酸部分４の近似比で調製し、約５〜２０ｋＤの平均分子量を有した。

図１０にて、モデル標的を捕捉する２つの表面の捕捉能を調べた。基材表面に抱合された捕捉プローブに対して相補性の配列の断片を持つモデル標的分子を示した濃度で適用した。モデル標的分子は、その後適用したオリゴヌクレオチド標識プローブ対して相補性の配列の第２の断片も含有した。捕捉プローブによって標的が基材表面に捕捉された後、末端ビオチン部分を持つオリゴヌクレオチド標識プローブを適用してモデル標的分子上の第２の断片とハイブリッド形成させた。次いでストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、１μｍ）を適用してモデル標的上で結合したビオチン化標識プローブに結合させた。

酵素が介在する標的が限局されるリンカー分子の堆積又は検出可能な標識の係留を行うことなく、この実験を実施した。従って、検出のレベルは、基材表面が標的分子を捕捉する程度を直接反映する。図１０に示すように、オリゴチップ及びＷ１チップはモデル標的分子を捕捉するのに類似の能力を示した。

実施例２：共有結合形成性の反応基を含む分子で官能化された基材上での標的の捕捉及び酵素によって生成された活性化剤の存在下での標的が限局されたリンカー分子の堆積
図１１は、ＨＲＰが介在する標的が限局されたリンカー分子の堆積による双方の基材（オリゴチップ及びＷ１チップ）についての検出のレベルを示す。示した濃度にてモデル標的オリゴヌクレオチドとビオチン化標識プローブとストレプトアビジン／ＨＲＰ抱合体で構成された出来上がった標的複合体を用いて実験を行った。これによって基材表面の捕捉プローブにより複合体が捕捉されるのが可能になった。次いで、ＨＲＰの遊離のラジカルを生成する活性を利用することによって、図１３の構造Ａを有するリンカー分子を基材表面上のチロシン部分に共有結合させた。その結果、複数のビオチン部分が基材表面にて不動化された標的分子の近傍に堆積し、それによって検出可能な標識についての複数の標的が限局された結合位置を提供した。基材表面は双方とも、磁性のストレプトアビジン化した直径約１μｍのビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））と共にインキュベートし、特異的なビーズ結合の程度を判定した。結果を図１１に示すが、それは、オリゴチップに比べて、チロシン部分で修飾したＷ１チップの方が検出感度を高めることを示している。

実施例３：リンカー分子の高い堆積を有する表面
共有結合形成性の反応基を含む異なる分子を含むように修飾した種々の基材を調製し、以下に記載するように試験した。基材表面を名づける規定及び官能化スキームは以下の表１で概説する。基材表面を解析するために、２つの実験を行った。これらの実験では、基材Ｇが、捕捉オリゴヌクレオチドに存在するものにわたって及びその上で共有結合形成性の反応基を有さない対照基材である。第１の実験はモデル標的分子を捕捉する修飾された基材表面の能力を測定した。表２に示すような種々の濃度でモデル標的を適用した。標的分子の区分に対して相補性の配列を持つビオチン化オリゴヌクレオチドによって、捕捉された標的を標識した。その後、標的分子を介して基材表面に捕捉されたビオチン化オリゴヌクレオチド標識プローブをストレプトアビジン化したアルカリホスファターゼで標識し、リン酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰＰ）の脱リン酸化によって定量した。

ＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎにて１：１０００希釈（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐａｒｔ＃２１３２４、元々２．８ｍｇ／ｍＬ）にてストレプトアビジン／アルカリホスファターゼを加え、プレートを１５分間振盪した。３回目の洗浄の後、プレートにてチップの位置を移動することを含めてＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎでチップを４回洗浄してアッセイの次の工程でアルカリホスファターゼが確実に存在しないようにした。

１工程ＰＮＰＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐａｒｔ＃３７６２１）を各チップに加え、プレートを正確に３０分間振盪した。３０分後、２ＮのＮａＯＨ５０μＬを各ウェルに加え反応を停止した。ＤＩ水をブランクとして用いて各チップの溶液について４０５ｎｍでの吸光度を測定した。

表２に示すこの第１の型の実験の結果は、修飾した基材のそれぞれがモデル標的分子を上手く捕捉できるが、レベルは異なることを示している。

第２の実験は、ＨＲＰの存在下でフェノール基を含有するリンカー分子との共有結合を形成する修飾された基材の能力を測定した。示した濃度にてモデル標的オリゴヌクレオチドとビオチン化標識プローブとストレプトアビジン／ＨＲＰ抱合体で構成された出来上がった標的複合体を用いて実験を行った。これによって基材表面の相補性捕捉プローブにより複合体が捕捉されるのが可能になった。次いで、ＨＲＰの遊離のラジカルを生成する活性を利用することによって、図１３の構造Ａを有するリンカー分子を基材表面上のフェノール基又はチミン基に共有結合させた。ＨＲＰ反応の後、表面上のビオチン部分は、基材表面上でのリンカーの堆積の結果、ストレプトアビジン化したアルカリホスファターゼで標識され、リン酸ｐ−ニトロフェニルの脱リン酸化によって定量された。

チップが供されるアッセイ条件を以下の表３に要約する。チップは９６穴プレートに入れた。チップに加えた全容積は示した場合を除いてすべて１００μＬだった。ＰＢＳ／ＮａＣｌ／０．１％Ｔｗｅｅｎ／ｓＤＮＡ１３（ＮａＣｌは追加の０．５ＭのＮａＣｌをＰＢＳ緩衝液に加えたことを意味し、ｓＤＮＡ１３は犠牲ＤＮＡ（１０ｎＭでの５０量体のオリゴヌクレオチド）を意味する）にて１０分間チップを濡らした。

所与の濃度の標的複合体をチップに加え、プレートを３０分間振盪した。次いでチップを３回洗浄した。

図１３の構造Ａを有するリンカー分子をＳＰＢ／ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中のチップに加え、プレートを１５分間静置した（すなわち、振盪しない）。（ＳＰＢは安定な過酸化物緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐａｒｔ＃３４０６２）を意味し、ＮａＣｌは追加の０．５ＭのＮａＣｌをＳＰＢ緩衝液に加えたことを意味し、この溶液で使用したＴｗｅｅｎは、低過酸化物、低カルボニルのＴｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐａｒｔ＃Ｐ６５８５である。）

ＰＢＳ／１％ＳＤＳによってチップを１回洗浄した。次いでＰＢＳ／１％ＳＤＳにて１０分間、チップを静置した。

４回目の洗浄の後、プレートにてチップの位置を動かすことを含めてＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎにてチップを５回洗浄し、アッセイの次の工程でＳＤＳが確実に存在しないようにした。

ＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎにて１：１０００希釈（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐａｒｔ ＃２１３２４、元々２．８ｍｇ／ｍＬ）にてストレプトアビジン／アルカリホスファターゼを加え、プレートを１５分間振盪した。３回目の洗浄の後、プレートにてチップの位置を移動することを含めてＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎでチップを４回洗浄してアッセイの次の工程でアルカリホスファターゼが確実に存在しないようにした。

１工程ＰＮＰＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐａｒｔ＃３７６２１）を各チップに加え、プレートを正確に３０分間振盪した。３０分後、２ＮのＮａＯＨ５０μＬを各ウェルに加え反応を停止した。ＤＩ水をブランクとして用いて各チップの溶液について４０５ｎｍでの吸光度を測定した。

表４に示すように、基材Ｇ（オリゴ）が、捕捉オリゴヌクレオチドに存在するものにわたって及びその上で共有結合形成性の反応基を有さない対照基材である場合、捕捉オリゴヌクレオチドに存在するものにわたる及びその上の追加の共有結合形成性の反応基によって修飾された基材は、基材表面上でのビオチン化リンカー分子の酵素が介在する高い堆積を示す。

精選した修飾した基材表面のさらなる試験を行って検出可能な標識として磁気ビーズを用いて検出の限界を決定した。具体的には、図１３で示したリンカー分子（構造Ａ）及び１μｍのストレプトアビジン化磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を利用してＳＡ−８−Ｔ修飾した基材を試験した。図１２に提供した結果は、１０ｆＭ範囲の検出限界を明らかにし、それは、オリゴ捕捉プローブに存在するもの以外の追加の共有結合形成性の基を持たない基材Ｇ（オリゴチップ）の検出限界の改善を示している。

実施例４：リンカー分子の調製及び試験
共有結合形成性の反応基を含む種々のリンカー分子を合成し、基材表面での共有結合形成反応に加わることが可能である他の基とのＨＲＰが介在する共有結合形成反応におけるその反応性について試験した。それぞれ、図１３の区分Ａ及びＢで示され、式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）にて以下で提供される２つのビオチン／ＰＥＧスペーサー構造の１つを用いて異なる共有結合形成性の反応基を有するリンカー分子を調製した。

１８の選択されたリンカー分子のフェノール環部分の化学構造を図１４に示す。リンカー分子の完全な化学名を以下の表５で提供する。化合物１、２及び５は図１３（Ａ）に示すビオチン／ＰＥＧスペーサー構造に基づく。化合物６〜１４及び１６〜１８は図１３（Ｂ）に示すビオチン／ＰＥＧスペーサー構造に基づく。化合物３、４及び５は合成されなかったが、図１３（Ｂ）に示す構造に基づく先見的な例である。

化合物１は、ＰＥＧスペーサーを介して連結されるチラミン環とビオチン部分に基づく基本的なリンカー分子の構造を提供する。化合物２は、芳香族環の極めて近傍にて遊離のカルボン酸を伴うチロシン構造に基づく。酵素が介在する共有結合形成反応におけるリンカー分子の反応性／効率性を検討するために、異なる電子特性を持つ一連のリンカー分子を設計し、合成した。リンカー分子３、４及び５は合成しなかったが、図４（Ｂ）に示す構造に基づいて設計した。一般に、リンカー分子の反応性は、電子供与性置換基を芳香族環に付加することによって高められると思われるが、それは芳香族環の電子密度を高め、その結果、反応中心、すなわち、フェノール基又はアニリン基にて電子密度を高める。リンカー分子３〜６は安息香酸に基づく。リンカー分子７〜９はフェニル酢酸に基づき、それは環構造から潜在的に電子求引性であるアミド基を遠ざける。リンカー分子１０〜１３はそれぞれ、クマル酸、フェルラ酸、コーヒー酸及び桂皮酸に基づく。特定の理論に束縛されることは望まないで、リンカー分子１０〜１３における不飽和系は環に電子密度を供与し、それによって反応中心での反応性を高める。反応中心の相対的な環の位置及び他の環置換基も反応性に影響を有し得るので、リンカー分子３〜１３は他の置換基と比べて異なる環位置で反応性フェノール中心を含むように調製した。リンカー分子１０及び１４及び１及び１５は、反応中心としてのアニリン基に対するフェノール基の直接比較を提供する。リンカー分子１６、１７及び１８は比較のための「不確定要素」の電子濃縮系である。

上述のＳＡ−８−Ｔを表す基材及びＧＴ８−Ｔを表す基材との酵素が介在する共有結合形成反応にて上記リンカー分子の幾つかを試験したが、ＳＡ−８−Ｔ及びＧＴ−８−Ｔ双方についての基材表面の官能化を表６に概説する。

ＳＡ８−Ｔ及びＧＴ８−Ｔチップが供されるアッセイ条件は、表３と併せて上述されたとおりだった。リンカー分子７、１０、１１、１２、１３、１５（図１４及び表５）及びＳＡ−８−Ｔ基材を伴った図１３の構造Ａを有するリンカー分子（表ではＢ−Ｔと表した）の結果を以下の表７に提供する。リンカー分子Ｂ−Ｔ及びＳＡ−８−Ｔチップ及びＧＴ−８−Ｔチップにおけるリンカー分子１０の結果は以下の表８に示す。

上記リンカー分子のそれぞれは標的複合体のナノモルレベルで標的複合体の測定可能なレベルの検出を提供し、リンカー分子１０もまたピコモルレベルで測定可能な検出を示した。

その特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく種々の変更が行われてもよく、同等物が置き換えられてもよいことが当業者によって理解されるべきである。加えて、本発明の目的、精神及び範囲に特定の状況、材料、物質の組成物、方法、方法の工程（単数）又は工程（複数）を適合させるために多数の改変がなされ得る。そのような改変はすべて本明細書に添付される特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (99)

1. 官能化された基材であって、
   支持材と、
   前記支持材の表面に結合する１以上の標的特異的な捕捉プローブと、
   前記支持材の表面に結合する複数の合成の天然に存在しない分子を含み、
   前記合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、天然に存在するタンパク質又は核酸で見られるものより高い濃度で存在する芳香族の共有結合形成性の反応基を含む官能化された基材。
2. 芳香族の共有結合形成性の反応基（複数）の芳香族の共有結合形成性の反応基（単数）が、合成の天然に存在しない分子の１つの露出した末端に位置する請求項１の官能化された基材。
3. 合成の天然に存在しない分子が、チロシンもチミンも含有しない請求項１の官能化された基材。
4. 官能化された基材が、天然に存在するタンパク質又は組織で見られるものより多数の、単位面積当たりの共有結合形成性の反応基を含む請求項１の官能化された基材。
5. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、天然に存在するタンパク質又は核酸の共有結合形成性の反応基よりも高い反応性を有する共有結合形成性の反応基を含む請求項１の官能化された基材。
6. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チミン及びチロシンよりも高い反応性を有する共有結合形成性の反応基を含む請求項１の官能化された基材。
7. 支持材がシリコンを含む請求項１の官能化された基材。
8. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、デンドリマー構造を含む請求項１の官能化された基材。
9. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チロシンアミノ酸を含む請求項１の官能化された基材。
10. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、フェノール／カルボン酸コポリマーを含む請求項１の官能化された基材。
11. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、フェノール基及びアミノ基を含む請求項１の官能化された基材。
12. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、リジン及びチロシンアミノ酸を含む請求項１の官能化された基材。
13. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チラミン又はチラミン誘導体を含む請求項１の官能化された基材。
14. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チミン又はチミン誘導体を含む請求項１の官能化された基材。
15. 合成の天然に存在しない分子が、天然に存在するタンパク質で見られるものより高い濃度で存在する共有結合形成性の反応基を含むポリペプチドである請求項１の官能化された基材。
16. 合成の天然に存在しない分子が、天然に存在するオリゴヌクレオチドで見られるものより高い濃度で存在する共有結合形成性の反応基を含むオリゴヌクレオチドである請求項１の官能化された基材。
17. 複数の標的特異的な捕捉プローブを含み、前記標的特異的な捕捉プローブがオリゴヌクレオチドである請求項１の官能化された基材。
18. 複数の標的特異的な捕捉プローブを含み、前記標的特異的な捕捉プローブがポリペプチドである請求項１の官能化された基材。
19. ポリペプチドが抗体又はその断片である請求項１８の官能化された基材。
20. 官能化された基材表面であって、基材の前記表面に結合した複数の合成の天然に存在しない分子を含み、前記合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、
    式（Ｉ）の構造を有する
    （式中、波線は表面への結合点を表し；
    ｍ及びｎは独立して０及び１から選択される整数であり；
    ｐはｎが０のときｐは０ではないという条件で０以上に等しい整数であり；
    ｑは０及び１から選択される整数であり；
    Ｌ^１は非置換のアルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、置換されたヘテロ原子含有のアルキレン、非置換のアルケニレン、置換されたアルケニレン、ヘテロ原子含有のアルケニレン、置換されたヘテロ原子含有のアルケニレン、非置換のアリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、及び高分子リンカーから選択され；
    Ｍ^１及びＭ^２の各例は独立して、結合、非置換のアルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、置換されたヘテロ原子含有のアルキレン、非置換のアルケニレン、置換されたアルケニレン、ヘテロ原子含有のアルケニレン、置換されたヘテロ原子含有のアルケニレン、非置換のアリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、及び置換されたヘテロアリーレンから選択され；
    Ｗ^１の各例は、Ｗ^１がアルケン、アリール、アジド、及びα、β−不飽和カルボニルから選択される部分を含む基によって置換されるという条件で、アルキレン、アリーレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、及びヘテロアリーレンからなる群から選択され；
    Ｄは、Ｈ、非置換のアルキル、置換されたアルキル、ヘテロ原子含有のアルキル、置換されたヘテロ原子含有のアルキル、非置換のアルケニル、置換されたアルケニル、ヘテロ原子含有のアルケニル、置換されたヘテロ原子含有のアルケニル、非置換のアリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、及び置換されたヘテロアリールから選択される末端基であり、Ｄは任意でアルケン、アリール、アジド、及びα、β−不飽和カルボニルから選択される部分を含む基によって置換される）官能化された基材表面。
21. Ｄが構造：
    を有し、及び
    Ｗ^１が構造
    を有する
    （式中、
    Ｘ^１は−ＣＨ−又は−Ｎ−であり；
    Ｍ^３は、アルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、及び置換されたヘテロ原子含有のアルキレンから選択されるリンカー部分であり；
    Ｌ^２は、結合であってもよい、又はそのいずれもが置換されてもよく、若しくは非置換であってもよく、及び１以上のヘテロ原子を含有してもよいアルキレン、アルケニレン、及びアリーレンから選択されてもよいリンカーであり；
    Ａｒ^１は、少なくとも１つの電子供与性置換基を含み、１以上の置換基でさらに置換されてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよく、且つ２以上の縮合芳香族環を含んでもよい芳香族部分であり；
    Ｒ^１は、アルキレン、置換されたアルキレン、アルケニレン、置換されたアルケニレン、
    （式中、
    Ｒ^３はＯＨ及びＮＨ_２から選択され；
    ｎ１は０、１、２、３及び４から選択され；
    各Ｒ^４は、Ｈ、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル、置換されたヘテロ原子含有のヒドロカルビル、及び官能基から独立して選択され；
    α、β及びγは、βが存在する又はα及びγが存在するという条件で任意の結合であり；
    Ａ及びＢは、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のアルケン、及び官能基から独立して選択され、又はＡ及びＢは、炭素及び窒素から選択され、一緒になって環を形成し；
    Ｙは、γが存在すればＣＲ^ａ又はＮであり、γが存在しなければ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（Ｒ^ａ）_２、ＮＲ^ａ、Ｓ及びＯであり；
    Ｘは、ＣＲ^ａ又はＮであり；
    Ｚは、ＺがＮであればＢは存在しないという条件で、ＣＲ^ａ又はＮであり；
    Ｒ^２は、αが存在すればＯ、Ｃ（Ｒ^ａ）_２又はＮＲ^ａであり、αが存在しなければＣ（Ｒ^ａ）_３、Ｎ（Ｒ^ａ）_２、ＳＲ^ａ又はＯＲ^ａであり；
    Ｖは、ＶがＳ又はＯであれば、Ａが存在しないという条件でＣＲ^ａ、Ｎ、Ｓ及びＯから選択され；
    Ｒ^ａは、Ｈ、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル、及び置換されたヘテロ原子含有のヒドロカルビルから選択される）から選択される不飽和部分である）請求項２０の官能化された基材表面。
22. Ａｒ^１が構造
    を有する
    （式中、２つの隣接するＲ基が一緒になって任意でさらに置換され、任意でさらにヘテロ原子を含有する環を形成するという条件で、
    Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＪは、Ｃ−Ｒ及びＮから選択され、各Ｒは独立してＨ、アルキル、アルケニル、アリール、酸素含有の置換基及び窒素含有の置換基から選択される）請求項２１の官能化された基材表面。
23. Ａｒ^１が構造：
    を有する
    （式中、Ｒ^１〜Ｒ^５のそれぞれは独立してＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、モノ−アルキル置換のアミノ、ジ−アルキル置換のアミノ及びアミドから選択される）請求項２１の官能化された基材表面。
24. Ｒ^３が、Ｈ、アルキル、アルケニル、アミノ、アルコキシ、アルキル置換のアミノ、アミド及びアリールから選択され；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも１つは、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、アルキル置換のアミノ、又はアミドである請求項２３の官能化された基材表面。
25. Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも１つがヒドロキシルである請求項２４の官能化された基材表面。
26. Ｌ^２が、そのいずれかが置換されてもよく又は非置換であってもよいＣ_１−Ｃ_２４アルキレン、ヘテロ原子含有のＣ_１−Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_２−Ｃ_２４アルケニレン、ポリアルキレン、及びポリ（アルキレンオキシド）から選択される請求項２１の官能化された基材表面。
27. 検出可能な標識粒子であって、
    支持材の表面に結合した複数の合成の天然に存在しない分子によって官能化された表面を含み、
    合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、天然に存在するタンパク質又は核酸で見られるものよりも高い濃度で存在する芳香族の共有結合形成性の反応基を含む検出可能な標識粒子。
28. 芳香族の共有結合形成性の反応基（複数）の芳香族の共有結合形成性の反応基（単数）が、合成の天然に存在しない分子の１つの露出した末端に位置する請求項２７の検出可能な標識粒子。
29. 合成の天然に存在しない分子が、チロシンもチミンも含有しない請求項２７の検出可能な標識粒子。
30. 官能化された基材が、天然に存在するタンパク質又は組織で見られるものより単位面積当たり多数の共有結合形成性の反応基を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
31. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、天然に存在するタンパク質又は核酸の共有結合形成性の反応基よりも高い反応性を有する共有結合形成性の反応基を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
32. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チミン及びチロシンよりも高い反応性を有する共有結合形成性の反応基を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
33. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、デンドリマー構造を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
34. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チロシンアミノ酸を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
35. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、フェノール／カルボン酸コポリマーを含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
36. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、フェノール基及びアミノ基を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
37. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、リジン及びチロシンアミノ酸を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
38. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チラミン又はチラミン誘導体を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
39. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チミン又はチミン誘導体を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
40. 合成の天然に存在しない分子が、天然に存在するタンパク質で見られるものより高い濃度で存在する共有結合形成性の反応基を含むポリペプチドである請求項２７の検出可能な標識粒子。
41. 合成の天然に存在しない分子が、天然に存在するオリゴヌクレオチドで見られるものより高い濃度で存在する共有結合形成性の反応基を含むオリゴヌクレオチドである請求項２７の検出可能な標識粒子。
42. 粒子が、磁気物質を含む請求項２７の検出可能な標識粒子。
43. 検出可能な標識粒子であって、式（ＩＩＩ）
    （式中、
    Ｌ^１は、非置換のアルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、置換されたヘテロ原子含有のアルキレン、非置換のアルケニレン、置換されたアルケニレン、ヘテロ原子含有のアルケニレン、置換されたヘテロ原子含有のアルケニレン、非置換のアリーレン、置換されたアリーレン、ヘテロアリーレン、置換されたヘテロアリーレン、及び高分子リンカーから選択され；
    Ｄは、Ｈ、非置換のアルキル、置換されたアルキル、ヘテロ原子含有のアルキル、置換されたヘテロ原子含有のアルキル、非置換のアルケニル、置換されたアルケニル、ヘテロ原子含有のアルケニル、置換されたヘテロ原子含有のアルケニル、非置換のアリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、及び置換されたヘテロアリールから選択される末端基であり、Ｄは任意でアルケン、アリール、アジド、及びα、β−不飽和カルボニルから選択される部分を含む基によって置換され；
    波線は、検出可能な標識粒子への共有結合を表す）の構造を有する分子によって官能化された表面を含む検出可能な標識粒子。
44. Ｄが、構造：
    を有する
    （式中、Ｍ^３は、アルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、及び置換されたヘテロ原子含有のアルキレンから選択されるリンカー部分であり；
    Ａｒ^１は、少なくとも１つの電子供与性置換基を含み、それは１以上の置換基でさらに置換されてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよく、且つ２以上の縮合芳香族環を含んでもよい芳香族部分であり；
    Ｒ^１は、アルキレン、置換されたアルキレン、アルケニレン、置換されたアルケニレン、
    （式中、
    Ｒ^３はＯＨ及びＮＨ_２から選択され；
    ｎ１は０、１、２、３及び４から選択され；
    各Ｒ^４は、Ｈ、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル、置換されたヘテロ原子含有のヒドロカルビル、及び官能基から独立して選択され；
    α、β及びγは、βが存在する又はα及びγが存在するという条件で任意の結合であり；
    Ａ及びＢは、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のアルケン、及び官能基から独立して選択され、又はＡ及びＢは、炭素及び窒素から選択され、一緒になって環を形成し；
    Ｙは、γが存在すればＣＲ^ａ又はＮであり、γが存在しなければ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（Ｒ^ａ）_２、ＮＲ^ａ、Ｓ及びＯであり；
    Ｘは、ＣＲ^ａ又はＮであり；
    Ｚは、ＺがＮであればＢは存在しないという条件で、ＣＲ^ａ又はＮであり；
    Ｒ^２は、αが存在すればＯ、Ｃ（Ｒ^ａ）_２又はＮＲ^ａであり、αが存在しなければＣ（Ｒ^ａ）_３、Ｎ（Ｒ^ａ）_２、ＳＲ^ａ又はＯＲ^ａであり；
    Ｖは、ＶがＳ又はＯであれば、Ａが存在しないという条件でＣＲ^ａ、Ｎ、Ｓ及びＯから選択され；
    Ｒ^ａは、Ｈ、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル、及び置換されたヘテロ原子含有のヒドロカルビルから選択される）から選択される不飽和部分である）請求項４３の検出可能な標識粒子。
45. Ａｒ^１が構造
    を有する
    （式中、２つの隣接するＲ基が一緒になって任意でさらに置換され、任意でさらにヘテロ原子を含有する環を形成するという条件で、
    Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＪは、Ｃ−Ｒ及びＮから選択され、各Ｒは独立してＨ、アルキル、アルケニル、アリール、酸素含有の置換基及び窒素含有の置換基から選択される）請求項４４の検出可能な標識粒子。
46. Ａｒ^１が構造：
    を有する
    （式中、Ｒ^１〜Ｒ^５のそれぞれは独立してＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、モノ−アルキル置換のアミノ、ジ−アルキル置換のアミノ及びアミドから選択される）請求項４４の検出可能な標識粒子。
47. Ｒ^３が、Ｈ、アルキル、アルケニル、アミノ、アルコキシ、アルキル置換のアミノ、アミド及びアリールから選択され；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも１つは、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、アルキル置換のアミノ、又はアミドである請求項４６の検出可能な標識粒子。
48. Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも１つがヒドロキシルである請求項４７の検出可能な標識粒子。
49. 式（ＩＶ）
    （式中、Ｌ^１、Ｗ^１、Ｍ^１、Ｍ^２、Ｄ、ｎ、ｐ、及びｑは式（Ｉ）に記載されたとおりであり；
    Ｕ^１は、式（ＩＩ）について上記で定義されたような特異的な結合対の第１のメンバー又は共有結合形成性の反応基である）の構造を有する分子を含むリンカー分子。
50. Ｄが構造：
    を有し、及び
    Ｗ^１が構造
    を有する
    （式中、
    Ｘ^１は−ＣＨ−又は−Ｎ−であり；
    Ｍ^３は、アルキレン、置換されたアルキレン、ヘテロ原子含有のアルキレン、及び置換されたヘテロ原子含有のアルキレンから選択されるリンカー部分であり；
    Ｌ^２は、結合であってもよい、又はそのいずれもが置換されてもよく、若しくは非置換であってもよく、及び１以上のヘテロ原子を含有してもよいアルキレン、アルケニレン、及びアリーレンから選択されてもよいリンカーであり；
    Ａｒ^１は、少なくとも１つの電子供与性置換基を含み、１以上の置換基でさらに置換されてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよく、且つ２以上の縮合芳香族環を含んでもよい芳香族部分であり；
    Ｒ^１は、アルキレン、置換されたアルキレン、アルケニレン、置換されたアルケニレン、
    （式中、
    Ｒ^３はＯＨ及びＮＨ_２から選択され；
    ｎ１は０、１、２、３及び４から選択され；
    各Ｒ^４は、Ｈ、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル、置換されたヘテロ原子含有のヒドロカルビル、及び官能基から独立して選択され；
    α、β及びγは、βが存在する又はα及びγが存在するという条件で任意の結合であり；
    Ａ及びＢは、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、置換又は非置換のアルケン、及び官能基から独立して選択され、又はＡ及びＢは、炭素及び窒素から選択され、一緒になって環を形成し；
    Ｙは、γが存在すればＣＲ^ａ又はＮであり、γが存在しなければ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（Ｒ^ａ）_２、ＮＲ^ａ、Ｓ及びＯであり；
    Ｘは、ＣＲ^ａ又はＮであり；
    Ｚは、ＺがＮであればＢは存在しないという条件で、ＣＲ^ａ又はＮであり；
    Ｒ^２は、αが存在すればＯ、Ｃ（Ｒ^ａ）_２又はＮＲ^ａであり、αが存在しなければＣ（Ｒ^ａ）_３、Ｎ（Ｒ^ａ）_２、ＳＲ^ａ又はＯＲ^ａであり；
    Ｖは、ＶがＳ又はＯであれば、Ａが存在しないという条件でＣＲ^ａ、Ｎ、Ｓ及びＯから選択され；
    Ｒ^ａは、Ｈ、ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビル、ヘテロ原子含有のヒドロカルビル、及び置換されたヘテロ原子含有のヒドロカルビルから選択される）から選択される不飽和部分である）請求項４９のリンカー分子。
51. Ａｒ^１が構造
    を有する
    （式中、２つの隣接するＲ基が一緒になって任意でさらに置換され、任意でさらにヘテロ原子を含有する環を形成するという条件で、
    Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及びＪは、Ｃ−Ｒ及びＮから選択され、各Ｒは独立してＨ、アルキル、アルケニル、アリール、酸素含有の置換基及び窒素含有の置換基から選択される）請求項５０のリンカー分子。
52. Ａｒ^１が構造：
    を有する
    （式中、Ｒ^１〜Ｒ^５のそれぞれは独立してＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、モノ−アルキル置換のアミノ、ジ−アルキル置換のアミノ及びアミドから選択される）請求項５０のリンカー分子。
53. Ｒ^３が、Ｈ、アルキル、アルケニル、アミノ、アルコキシ、アルキル置換のアミノ、アミド及びアリールから選択され；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも１つは、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、アルキル置換のアミノ、又はアミドである請求項５２のリンカー分子。
54. Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５の少なくとも１つがヒドロキシルである請求項５３のリンカー分子。
55. Ｕ^１が、ビオチン部分、核酸配列、抗原、抗体、ハプテン、アビジン又はストレプトアビジン部分、糖部分、レクチン部分及び酵素又はアポ酵素から選択される請求項４９のリンカー分子。
56. Ｕ^１がビオチン部分なので、リンカー分子が、式（ＩＶａ）
    の構造を有する請求項５５のリンカー分子。
57. その使用のための指示書と共に包装された組み合わせにて請求項１〜２６のいずれか１項の官能化された基材を含むキット。
58. さらに、複数の検出可能な標識粒子を含み、前記複数の検出可能な標識粒子のそれぞれが、前記検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子によって官能化されて官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子のそれぞれが、共有結合形成性の反応基を含む請求項５７のキット。
59. さらに、複数のリンカー分子を含み、前記複数のリンカー分子の各リンカー分子が、共有結合形成性の反応基を含む請求項５７のキット。
60. さらに、複数の検出可能な標識粒子を含み、前記複数の検出可能な標識粒子のそれぞれが、前記検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子によって官能化されて官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合する分子のそれぞれが、１以上のリンカー分子を結合するように構成される結合部分を含む請求項５９のキット。
61. 結合部分が、１以上のリンカー分子を非共有結合するように構成される請求項６０のキット。
62. 結合部分が、ビオチン又はストレプトアビジンである請求項６０のキット。
63. 結合部分がストレプトアビジンであり、リンカー分子がビオチンを含む請求項６２のキット。
64. 結合部分がビオチンであり、リンカー分子がストレプトアビジンを含む請求項６２のキット。
65. 官能化された検出可能な標識粒子が官能化された磁気ビーズである請求項６０のキット。
66. 官能化された磁気ビーズが約１００ｎｍ〜約１μｍの直径を有する請求項６５のキット。
67. 官能化された磁気ビーズが約１μｍ以上の直径を有する請求項６５のキット。
68. 反応混合物であって、
    支持材と、
    前記支持材の表面に結合する１以上の標的特異的な捕捉プローブと、
    合成の天然に存在しない分子のそれぞれが第１の共有結合形成性の反応基を含む、前記支持材の表面に結合する複数の合成の天然に存在しない分子を含む官能化された基材及び、
    複数の官能化された検出可能な標識粒子を含み、
    官能化された検出可能な標識粒子のそれぞれが、検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子を含んで官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子のそれぞれが、第２の共有結合形成性の反応基を含む反応混合物。
69. さらに、１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子を含む請求項６８の反応混合物。
70. さらに、標的分子に特異的に結合する標識プローブを含む請求項６９の反応混合物。
71. さらに、標識プローブに特異的に結合する酵素抱合体を含む請求項７０の反応混合物。
72. 複数の官能化された検出可能な標識粒子の官能化された検出可能な標識粒子（単数）が、第２の共有結合形成性の反応基との第１の共有結合形成性の反応基の相互作用を介して１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子の近傍で、複数の共有結合を介して支持材の表面に結合する請求項７１の反応混合物。
73. 複数の空間的に離れた個々に検出可能な標的部位を含む請求項７２の反応混合物。
74. 標的分子が約１００ｆＭ未満の濃度で反応混合物に存在する請求項７２の反応混合物。
75. 標的分子が約０．１ｆＭ〜約１００ｆＭの濃度で反応混合物に存在する請求項７２の反応混合物。
76. 反応混合物であって、
    支持材、前記支持材の表面に結合する１以上の標的特異的な捕捉プローブ、及び前記支持材の表面に結合する複数の合成の天然に存在しない分子を含む官能化された基材と、
    複数の官能化された検出可能な標識粒子と、
    複数のリンカー分子を含み、
    前記合成の天然に存在しない分子のそれぞれが第１の共有結合形成性の反応基を含み、
    前記複数の官能化された検出可能な標識粒子が、検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子を含んで官能化された検出可能な標識粒子を提供し、検出可能な標識粒子の表面に結合する複数の分子のそれぞれが特異的な結合対のメンバーを含み、
    複数のリンカー分子における各リンカー分子が、官能化された検出可能な標識の表面に結合する複数の分子の１つを結合するように構成され、各リンカー分子が、複数の第２の共有結合形成性の反応基を含む、反応混合物。
77. さらに、１以上の標的特異的な捕捉プローブの１つに特異的に結合する標的分子を含む請求項７６の反応混合物。
78. さらに、標的分子に特異的に結合する標識プローブを含む請求項７７の反応混合物。
79. さらに、標識プローブに特異的に結合する酵素抱合体を含む請求項７８の反応混合物。
80. 複数の官能化された検出可能な標識粒子の官能化された検出可能な標識粒子（単数）が、複数のリンカー分子の多様なリンカー分子に結合し、リンカー分子が、結合した標的分子の近傍にて、第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基との間の共有結合を介して、支持材の表面に結合する請求項７９の反応混合物。
81. 複数の空間的に離れた個々に検出可能な標的部位を含む請求項８０の反応混合物。
82. 標的分子が約１００ｆＭ未満の濃度で反応混合物に存在する請求項８０の反応混合物。
83. 標的分子が約０．１ｆＭ〜約１００ｆＭの濃度で反応混合物に存在する請求項８０の反応混合物。
84. 官能化された検出可能な標識粒子が官能化された磁気ビーズである請求項６８〜８３のいずれか１項の反応混合物。
85. 官能化された磁気ビーズが約１００ｎｍ〜約１μｍの直径を有する請求項８４の反応混合物。
86. 官能化された磁気ビーズが約１μｍ以上の直径を有する請求項８４の反応混合物。
87. 支持材がシリコンを含む請求項６８〜８３のいずれか１項の反応混合物。
88. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、デンドリマー構造を含む請求項６８〜８３の反応混合物。
89. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チロシンアミノ酸を含む請求項６８〜８３の反応混合物。
90. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、フェノール／酸コポリマーを含む請求項６８〜８３の反応混合物。
91. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、リジン及びチロシンアミノ酸を含む請求項６８〜８３の反応混合物。
92. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チラミン又はチラミン誘導体を含む請求項６８〜８３の反応混合物。
93. 合成の天然に存在しない分子のそれぞれが、チミン又はチミン誘導体を含む請求項６８〜８３の反応混合物。
94. 基材表面に不動化された標的分子を間接的に検出する方法であって、
    反応混合物にて
    支持材と支持材の表面に結合する１以上の標的特異的な捕捉プローブとそれぞれが第１の共有結合形成性の反応基を含む、支持材の表面に結合する複数の合成の天然に存在しない分子を含む官能化された基材と、
    各メンバーが複数の第２の共有結合形成性の反応基を含む複数の官能化された検出可能な標識粒子と、
    標的分子を含有することが疑われる試料と、
    標的特異的な標識プローブと、
    標的特異的な標識プローブを特異的に結合し、第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の間の共有結合の形成を触媒するように構成される酵素抱合体とを混ぜ合わせることと、
    官能化された表面に結合した官能化された検出可能な標識粒子の存在又は非存在を検出することを含み、
    官能化された検出可能な標識粒子の存在が官能化された基材に不動化された標的分子の存在を指し示す方法。
95. 標的分子を含有することが疑われる試料が、約１００ｆＭ未満の濃度で標的分子を含有する請求項９４の方法。
96. 標的分子を含有することが疑われる試料が、約０．１ｆＭ〜約１００ｆＭの濃度で標的分子を含有する請求項９４の方法。
97. 基材表面に不動化された標的分子を間接的に検出する方法であって、
    反応混合物にて
    支持材と支持材の表面に結合する１以上の標的特異的な捕捉プローブとそれぞれが第１の共有結合形成性の反応基を含む、支持材の表面に結合する複数の合成の天然に存在しない分子を含む官能化された基材と、
    各メンバーが第１の結合部分を含む複数の官能化された検出可能な標識粒子と、
    各メンバーが、第１の結合部分を特異的に結合するように構成される第２の結合部分及び複数の第２の共有結合形成性の反応基を含む複数のリンカー分子と、
    標的分子を含有することが疑われる試料と、
    標的特異的な標識プローブと、
    標的特異的な標識プローブを特異的に結合し、第１の共有結合形成性の反応基と第２の共有結合形成性の反応基の間の共有結合の形成を触媒するように構成される酵素抱合体とを混ぜ合わせることと、
    官能化された表面に結合した官能化された検出可能な標識粒子の存在又は非存在を検出することを含み、
    官能化された検出可能な標識粒子の存在が官能化された基材に不動化された標的分子の存在を指し示す方法。
98. 標的分子を含有することが疑われる試料が、約１００ｆＭ未満の濃度で標的分子を含有する請求項９７の方法。
99. 標的分子を含有することが疑われる試料が、約０．１ｆＭ〜約１００ｆＭの濃度で標的分子を含有する請求項９７の方法。