CN112739856A - 有机化合物功能性独立的标记 - Google Patents

Abstract

本文公开了不依赖于化合物的任何官能团来标记有机化合物的方法。在一些实施方案中，提供了可用于所述方法的双官能连接子。

Description

有机化合物功能性独立的标记

本申请要求2018年7月18日提交的PCT/CN2018/096052和2019年4月24日提交的PCT/CN2019/084031的优先权，所述申请的内容通过引用整体并入本文中。

技术领域

本公开一般涉及化学和生物，尤其涉及天然产品的标记和筛选。

背景技术

目前，天然产物的靶向鉴定通常需要大量的构效关系(SAR)工作，以便引入合适的标签，例如亲和标签和交联标签。这种工作通常是试错过程。如果标签位于不适当的位置，将对化合物和靶点的相互作用产生空间阻碍，造成生物筛选的假阴性结果。因此，靶向鉴定需要各种药物标签结合不同的位点标记，以减少假阴性结果。然而，多位点标记依赖天然产物上的官能团或全合成来引入新的官能团。天然产物的结构复杂，全合成对化学家来说具有挑战性。所以这种方法既耗时又低效。

随着化学的发展，越来越多新的天然产物被分离出来。为了高通量筛选化学物质，一些机构提出了使用组合化学和DNA编码技术的策略，例如，参见US5565324、EP0643778、US7935658、WO2010/094036和CN103882531。

这些方法使用组合化学来建立化学库，使用小的化学片段来构建大的化学物质。但是这些化学反应受DNA稳定性的限制，所以很多常用试剂，包括强碱、强还原剂等都被排除在外。因此，许多复杂的天然产物没有被列入组合化学库。

发明概述

本公开提供了一种新的标记策略，以覆盖更大的化学空间。因此，本文提供了使用寡核苷酸对有机化学物质进行位点非选择性标记的方法、在所述方法中有用的化合物以及标记化合物，包含所属标记化合物的库及其用途。

在一些实施方案中，提供了一种用于标记有机化合物的方法，所述方法包括：

(1)在位点非选择性反应条件下，例如卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将连接子前体分子与有机化合物接触，其中所述连接子前体分子具有两个官能团，即第一官能团R和第二官能团M，其中所述连接子前体分子的第一官能团R产生位点非选择性反应基团，例如卡宾或氮宾或自由基，在位点非选择性反应条件下与有机化合物反应，所述第二官能团在第一官能团反应的条件下是不反应的，其中所述连接子前体分子与有机化合物接触形成具有连接子前体分子第二官能团M的中间体；和

(2)将(1)中所述中间体与标记分子接触，从而使连接子前体分子的第二官能团M与标记分子反应生成标记的有机化合物，其中所述标记分子包含标记。

在一些实施方案中，提供了一种包含第一官能团和第二官能团的连接子前体分子，其中第一官能团能够产生位点非选择性反应基团，例如卡宾、氮宾或自由基，其能够以位点非选择性方式与有机化合物反应，并且第二官能团在第一官能团与有机化合物反应的条件下不反应，但是能够与标记分子反应。

在一些实施方案中，提供了一种标记的有机化合物，其通过包括以下步骤的方法生产：

(1)在位点非选择性反应条件下，例如卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将连接子前体分子与有机化合物接触，其中所述连接子前体分子具有两个官能团，即第一官能团R和第二官能团M，其中所述连接子前体分子的第一官能团R产生位点非选择性反应基团，例如卡宾或氮宾或自由基，在位点非选择性反应条件下与有机化合物反应，所述第二官能团在第一官能团与有机化合物反应的条件下是不反应的，其中所述连接子前体分子与有机化合物接触形成具有连接子前体分子第二官能团M的中间体；和

(2)将(1)中所述中间体与标记分子接触，从而使连接子前体分子的第二官能团M与标记分子反应生成标记的有机化合物，其中所述标记分子包含标记。

在一些实施方案中，提供了一组包含位置异构体的标记的有机化合物，其各自包含标记部分、连接子和有机化合物部分，其中所述的异构体在有机化合物部分的位置上不同，标记部分通过连接子连接到有机化合物部分。

在一些实施方案中，提供了一种标记的有机化合物库，其包含至少两种标记的有机化合物(或两组异构的标记的有机化合物)，其中独特的有机化合物(Unique organiccompound)用独特的标记(Unique lable)进行标记。

在一些实施方案中，提供了一种鉴定与靶点结合的有机化合物的方法，其包括分析所述的标记的有机化合物、一组异构的标记的有机化合物或标记的有机化合物库，并根据其标记鉴定与靶点结合的有机化合物。

下文将进一步描述这些和其他实施方案。

附图说明

图1显示了实施例5中冬凌草甲素连接子的HPLC和质谱。

图2显示了实施例6中化合物8的质谱。

图3显示了实施例7中标记化合物9的质谱。

图4显示了实施例8中标记化合物8的质谱。

图5和6显示了实施例9中的冬凌草甲素-连接子II缀合化合物的HPLC和质谱。

图7和8显示了实施例10中的雷公藤红素-连接子II缀合化合物的HPLC和质谱。

图9和10显示了实施例11中的紫杉醇-连接子II缀合化合物的HPLC和质谱。

图11和12显示了实施例12中的雷酚内酯-连接子II缀合化合物的HPLC和质谱。

图13和14显示了实施例13中的美登醇-连接子II缀合化合物的HPLC和质谱。

图15和16显示了实施例14中的脱氢枞酸II缀合化合物(A)和氢化枞酸连II缀合化合物(B)化合物的HPLC和质谱。

图17显示了四个样品在琼脂糖凝胶电泳中的DNA迁移：1.化合物6与寡核苷酸缀合；2.化合物7与寡核苷酸缀合；3.未反应的寡核苷酸；和4.带有连接子II的DNA头部4用紫外光照射2小时，然后用寡核苷酸连接。

图18显示了在不抽真空的情况下用连接子IV标记的粗辐照产物2，4-二羟基苯乙酮的¹H NMR；和ii)抽真空后用连接子IV标记的2,4-二羟基苯乙酮的粗产物。连接子IV-2,4-二羟基苯乙酮缀合物用箭头标识。

图19显示了通过定量聚合酶链反应(qPCR)和测序来定量天然产物-DNA缀合的通用方案。

图20(a)显示了热休克70kDa蛋白(HSP70)的DEL选择指纹。图20(b)显示了聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)的DEL选择指纹。在图20中，红色虚线是命中选择的截止点。相应的化学结构如图21所示。

图21显示了从PAPR1的DEL选择中选中的结合物的化学结构。

图22显示了对nDEL选择的PARP1结合物的命中验证。木犀草素(图22(a))和F003(图22(b))抑制人PARP1的酶活性。木犀草素在人PARP1活性位点的分子对接如图22(c)所示。

应认识到，出于说明目的，部分或全部附图是示意性表示。

发明详述

定义

以下描述阐述了本技术的示例性实施方案。然而，应当认识到，这种描述并非旨在限制本公开的范围，而是作为示例性实施方案的描述而提供。

除非另有明确说明，否则适用以下定义：

如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，“一种产品”包括多种产品，例如异构体。

如本文所用，术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述成分，但不排除其他成分。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”是指排除对所述目的的组合物具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文定义的成分组成的组合物不排除实质上不影响所要求的基本特征和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”应指排除超过微量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本公开的范围内。

术语“大约”用于数字名称之前时，例如，温度、时间、数量和浓度(包括范围)，表示近似值，其变化幅度为(+)或(-)10％、5％或1％。

“烷基”是指单价饱和直链或支链脂肪烃基。在一些实施方案中，烷基具有1至30个碳原子(即，C_1-30烯基)、1至20个碳原子(即，C_1-20烯基)、1至8个碳原子(即，C_1-8链烯基)、1至6个碳原子(C_1-6烷基)或1至4个碳原子(即，C_1-4烯基)。该术语包括例如直链和支链烃基，例如甲基(CH₃-)、乙基(CH₃CH₂-)、正丙基(CH₃CH₂CH₂-)、异丙基((CH₃)₂CH-)、正丁基(CH₃CH₂CH₂CH₂-)、异丁基((CH₃)₂CHCH₂-)、仲丁基((CH₃)(CH₃CH₂)CH-)和叔丁基((CH₃)₃C-)。“亚烷基”是指二价直链或支链饱和脂肪烃基。

“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的烷基。在一些实施方案中，烯基具有2至30个碳原子(即，C_2-30烯基)、2至20个碳原子(即，C_2-20烯基)、2至8个碳原子(即，C_2-8链烯基)、2至6个碳原子(即，C_2-6烯基)、或2至4个碳原子(即，C_2-4烯基)。烯基的例子包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁二烯基(包括1,2-丁二烯基和1,3-丁二烯基)。“亚烯基”是指二价烯基。

“炔基”是指含有至少一个碳-碳三键的烷基。在一些实施方案中，链烯基具有2至30个碳原子(即，C_2-30炔基)、2至20个碳原子(即，C_2-20炔基)、2至8个碳原子(即，C_2-8炔基)、2至6个碳原子(即，C_2-6炔基)、或2至4个碳原子(即，C_2-4炔基)。术语“炔基”也包括那些具有一个三键和一个双键的基团。“亚炔基”是指二价炔基。

“烷氧基”是指“烷基-O-”基团。烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。

“卤代烷氧基”是指如上定义的烷氧基，其中一个或多个氢原子被卤素取代。

“烷硫基”是指“烷基-S-”基团。

“酰基”是指-C(O)R基团，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂烷基或杂芳基；如本文所定义，各自可以任选被取代。酰基的例子包括但不限于甲酰基、乙酰基、环己基羰基、环己基甲基羰基和苯甲酰基。

“酰氨基”是指-C(O)NR^yR^z的“C-酰氨基”基团和-NR^yC(O)R^z的“N-酰氨基”基团，其中R^y和R^z独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂烷基或杂芳基；各自可以任选被取代。

“氨基”是指-NR^yR^z基团，其中R^y和R^z独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；各自可以任选被取代。

“脒基”指-C(NH)(NH₂)。

“芳基”是指具有单环(例如单环)或多个环(例如双环或三环)包括稠合系统的一价芳香碳环基团。在一些实施方案中，芳基具有6至20个环碳原子(即，C_6-20芳基)、6至14个碳环原子(即，C_6-14芳基)、6至12个碳环原子(即，C_6-12芳基)、或6至10个碳环原子(即，C_6-10芳基)。芳基的例子包括但不限于苯基、萘基、芴基和蒽基。然而，芳基不以任何方式包含或重叠于下文定义的杂芳基。如果一个或多个芳基与杂芳基稠合，得到的环系是杂芳基。如果一个或多个芳基与杂环烷基稠合，得到的环系是杂环烷基。“亚芳基”是指二价芳基。

“O-氨基甲酰基”是指基团-O-C(O)NR^yR^z,“N-氨基甲酰基”是指基团-NR^yC(O)OR^z，其中R^y和R^z独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；各自可以任选被取代。

“羧基”是指-C(O)OH。

“羧酸酯”是指-OC(O)R和-C(O)OR，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；如本文所定义，各自可以任选被取代。

“氰基”或“腈基”是指-CN基团。

“环烷基”是指单价饱和或部分不饱和的非芳香环状烷基，其具有单环或多环，包括稠合、桥接和螺环系统。术语“环烷基”包括环烯基(即，具有至少一个双键的非芳香碳环基团)。在一些实施方案中，环烷基具有3至20个环碳原子(即，C_3-20环烷基)、3至12个环碳原子(即，C_3-12环烷基)、3至10个环碳原子(即，C_3-10环烷基)、3至8个环碳原子(即，C_3-8环烷基)、或3至6个环碳原子(即，C_3-6环烷基)。环烷基的例子包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。“环亚烷基”是指二价饱和或部分不饱和的环状烷基。

“胍基”指-NHC(NH)(NH₂)。

“肼基”指-NHNH₂。

“亚氨基”是指-C(NR)R基团，其中R各自是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；如本文所定义，各自可以任选被取代。

“卤素”或“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

“卤代烷基”是指如上定义的烷基，其中一个或多个氢原子被卤素取代。例如，当一个残基被一个以上的卤素取代时，可以使用与所连接的卤素基团数量对应的前缀来指代它。二卤代烷基和三卤代烷基是指被两个(“di”)或三个(“tri”)卤素基团取代的烷基，它们可以是但不一定是相同的卤素。卤代烷基的例子包括二氟甲基(-CHF₂)和三氟甲基(-CF₃)。

“卤代烯基”是指如上定义的烯基，其中一个或多个氢原子被卤素取代。

“卤代炔基”是指如上定义的炔基，其中一个或多个氢原子被卤素取代。

“杂烷基”是指其中一个或多个碳原子(和任何相关的氢原子)各自独立地被相同或不同的杂原子基团取代的烷基。术语“杂烷基”包括具有碳和杂原子的直链或支链饱和链。例如，1、2或3个碳原子可以独立地被相同或不同的杂原子基团取代。杂原子基团包括但不限于，-NR-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-等，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，它们各自可以任选被取代。杂烷基的例子包括-OCH₃、-CH₂OCH₃、-SCH₃、-CH₂SCH₃、-NHCH₃和-CH₂NRCH₃。在一些实施方案中，杂烷基包括1至10个碳原子、1至8个碳原子或1至4个碳原子；及1至3个杂原子、1至2个杂原子或1个杂原子。“杂亚烷基”是指二价杂烷基。

“杂芳基”是指具有单环、多环或多个稠环的芳香基团，其中一个或多个环杂原子独立选自氮、氧和硫。在一些实施方案中，杂芳基包括5至24个环原子(即，5至24元杂芳基)、或5至14个环原子(即，5至14元杂芳基)、5至10个环原子(即，5至10元杂芳基)、或5或6个环原子(即，5或6元杂芳基)。在一些实施方案中，杂芳基包括1至20个环碳原子(即，C_1-20杂芳基)、5至14个环碳原子(即，C_5-14杂芳基)、3至12个环碳原子(即，C_3-12杂芳基)、或3至8个碳环原子(即，C_3-8杂芳基)；和1至5个杂原子、1至4个杂原子、1至3个环杂原子、1至2个环杂原子或1个独立选自氮、氧和硫的环杂原子。杂芳基的例子包括但不限于嘧啶基、嘌呤基、吡啶基、哒嗪基、苯并噻唑基、吡唑基、苯并[d]噻唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并[b]噻吩基、吲唑基、苯并[d]咪唑基、吡唑并[1,5-a]吡啶基和咪唑并[1,5-a]吡啶基。任何具有单个或多个稠环且含有至少一个杂原子的芳环都被认为是杂芳基，而与分子其余部分的附着性无关(即通过任何稠合环)。杂芳基不包含如上定义的芳基或与其重叠。“杂芳基”是指二价杂芳基。

“杂环烷基”是指饱和或不饱和的非芳香环状烷基，具有一个或多个独立选自氮、氧和硫的环杂原子。术语“杂环烷基”包括杂环烯基(即具有至少一个双键的杂环烷基)、桥杂环烷基、稠杂环烷基和螺杂环烷基。杂环烷基可以是单环或多环，其中多个环可以是稠环、桥环或螺环。任何含有至少一个杂原子的非芳环都被认为是杂环烷基，无论其连接方式如何(即，可以通过碳原子或杂原子结合)。此外，术语杂环烷基旨在包括含有至少一个杂原子的任何非芳环，该环可以与芳基或杂芳基环稠合，而与分子的其余部分无关。在一些实施方案中，杂环烷基包括3至24个环原子(即，3至24元杂环烷基)、或3至14个环原子(即，3至14元杂环烷基)、3至10个环原子(即，3至10元杂环烷基)、或5或6个环原子(即，5或6元杂环烷基)。在一些实施方案中，杂环烷基具有2至20个环碳原子(即，C_2-20杂环烷基)、2至12个环碳原子(即，C_2-12杂环烷基)、2至10个环碳原子(即，C_2-10杂环烷基)，2至8个环碳原子(即，C_2-8杂环烷基)、3至12个环碳原子(即，C_3-12杂环烷基)、3至8个环碳原子(即，C_3-8杂环烷基)、或3至6个环碳原子(即，C_3-6杂环烷基)；具有1至5个环杂原子、1至4个环杂原子、1至3个环杂原子、1至2个环杂原子或1个独立选自氮、硫或氧的环杂原子。杂环烷基的例子包括但不限于吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、氧杂环丁基、二氧戊环基、氮杂环丁基、吗啉基、2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛基、6-氧杂-1-氮杂螺[3.3]庚基、1,2,3,4-四氢异喹啉基、4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶基、吲哚基和异吲哚啉基。“杂环亚烷基”是指二价杂环烷基。

“羟基”是指-OH基团。

“氧代”是指(＝O)或(O)基团。

“硝基”是指-NO₂基团。

“磺酰基”是指-S(O)₂R基团，其中R为烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。磺酰基的例子包括但不限于甲磺酰基、乙磺酰基、苯磺酰基和甲苯磺酰基。

“烷基磺酰基”是指-S(O)₂R基团，其中R为烷基。

“磺酸”指-SO₃H基团。

“烷基亚磺酰基”是指-S(O)R基团，其中R为烷基。

“硫氰酸酯”是指-SCN基团。

“硫醇”是指-SH基团。

“硫代氧”或“硫酮”是指(＝S)或(S)基团。

可以使用某些常用的替代化学名称。例如，诸如二价“烷基”、二价“芳基”等的二价基团也可以分别称为“亚烷基”基团、“亚芳基”基团。同样，除非另有明确说明，否则基团的组合在本文中称为一个部分，例如芳烷基，最后提到的基团包含一个原子，该部分通过该原子与分子的其余部分相连。

术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及事件或情况不发生的实例。此外，术语“任选地被取代”是指指定原子或基团上的任何一个或多个氢原子可以或不可以被氢以外的基团取代。

术语“取代”是指指定原子或基团上的任何一个或多个氢原子被一个或多个氢以外的取代基取代，前提是不超过指定原子的正常化合价。一个或多个取代基包括但不限于烷基、烯基、炔基、烷氧基、酰基、氨基、酰氨基、脒基、芳基、N₃、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、羧基、羧酸酯、氰基、胍基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、杂烷基、杂芳基、杂环烷基、羟基、肼基、亚氨基、氧代、硝基、烷基亚磺酰基、磺酸、烷基磺酰基、硫氰酸酯、硫醇、硫酮，或其组合。通过定义带有无限地附加其他取代基的取代基(例如，具有取代烷基的取代芳基，取代烷基本身被取代芳基取代，取代芳基进一步被取代杂烷基取代，等等)而获得的聚合物或类似的不确定结构不打算包含在本文中。除非另有说明，否则本文所述化合物中最大连续取代数为三个。例如，被两个其它取代芳基取代的取代芳基的连续取代被限于((取代的芳基)取代的芳基)取代芳基。类似地，上述定义不打算包括不允许的取代方式(例如，被5个氟取代的甲基或具有两个相邻氧环原子的杂芳基)。这种不允许的取代方式是技术人员熟知的。当用于修饰化学基团时，术语“取代”可以描述本文定义的其它化学基团。在一些实施方案中，当基团被描述为任选地被取代时，该基团的任何取代基本身是未被取代的。例如，在一些实施方案中，术语“取代的烷基”是指具有一个或多个取代基的烷基，所述取代基包括羟基、卤素、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。在其他实施方案中，一个或多个取代基可以进一步被各自都被取代的卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基取代。在其他实施方案中，取代基可以进一步被各自都未被取代的卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、羟基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基取代。

如本文所用，术语“溶剂”是指溶解固体、液体或气体溶质以形成溶液的液体。常见的溶剂在本领域众所周知的，包括但不限于水；饱和脂肪烃，如戊烷、己烷、庚烷和其他轻质石油；芳香烃，如苯、甲苯、二甲苯等；卤代烃，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等；脂肪醇，如甲醇、乙醇、丙醇等；醚，例如乙醚、二丙醚、二丁醚、四氢呋喃、二恶烷等；酮，如丙酮、乙基甲基酮等；酯，如乙酸甲酯、乙酸乙酯等；含氮溶剂，如二甲基乙酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、喹啉、硝基苯等；含硫溶剂，如二硫化碳、二甲基亚砜、环丁砜等；含磷溶剂，如六甲基磷酸三酰胺等。除非另有明确说明，术语溶剂包括两种或多种溶剂的组合。合适溶剂的具体选择将取决于许多因素，包括溶剂和待溶解溶质的性质和预期目的，例如，溶液中会发生什么化学反应，这在本领域中是众所周知的。

如本文所用，术语“接触”是指使两种或多种化学分子接近，使得两种或多种化学分子之间能够发生化学反应。例如，接触可以包括混合和任选地连续混合化学物质。接触可以通过将两种或多种化学物质完全或部分溶解或悬浮在一种或多种溶剂中，将溶剂中的化学物质与另一种化学物质在固相和/或气相中混合，或者附着在固体载体如树脂上，或者将两种或多种化学物质在气相或固相和/或固体载体上混合来完成，这是本领域技术人员通常已知的。

如本文所用，“有机化合物”是指待标记的化合物，其可以针对与一个或多个靶点的结合活性进行筛选。术语“药物”，中药和天然产物(NP)是指此处定义的待标记的有机化合物。

如本文所用，“连接子前体分子”是指具有两个官能团的分子，每个官能团与分子反应从而连接，使得反应后，连接子前体分子的残基成为产物的连接子。

如本文所用，“标记分子”是指具有可通过分析方法检测的标记的分子，例如寡核苷酸。

如本文所用，术语“位点非选择性反应”、“位点非选择性标记”等中的“位点非选择性”是指可以在许多条件下发生的反应或标记等，这些反应或标记可能不需要依赖于分子的官能团。“位点非选择性反应”的例子包括卡宾、氮宾和自由基反应，其中化合物X-Y(其中Y是位点非选择性反应基团，例如卡宾、氮宾或自由基)与化合物Z的不同位点反应，形成化合物X-Z。这种位点非选择性反应通常会产生几种位置异构体X-Z，其中X连接到Z的不同位点。

如本文所用，“异构化合物”或“异构产物”等是指由位点非选择性反应产生的异构体，例如，在适当的情况下，使具有位点非选择性反应基团的连接子前体分子与有机化合物或相应的标记异构产物反应。“一组异构产物”是指由一种独特的有机化合物产生的异构化合物的混合物。

如本文所用，“歧化反应产物”是指由歧化反应产生的两种产物，歧化反应有时称为歧化，是一种氧化还原反应，其中中间氧化态的化合物转化为两种不同的化合物，一种为较高氧化态，一种为较低氧化态。歧化反应可以描述为：

2P→P'+P"

其中P、P’和P”都是不同的化学物质，而P’和P”是歧化反应的产物。

除非明确指出相反的情况，否则在本文所述的式中指定的所有原子，无论是在所提供的结构中，还是在与该结构相关的变量的定义中，都旨在包括其任何同位素。应当理解，对于任何给定的原子，同位素可以根据其自然出现的比例基本存在，或者可以使用本领域技术人员已知的合成方法，相对于一种或多种同位素增强一种或多种特定的原子。因此，氢包括例如¹H、²H、³H；碳包括例如¹¹C、¹²C、¹³C、¹⁴C；氧包括例如¹⁶O、¹⁷O、¹⁸O；氮包括例如¹³N、¹⁴N、¹⁵N；硫包括例如³²S、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、³⁷S、³⁸S；氟包括例如¹⁷F、¹⁸F、¹⁹F；氯包括例如³⁵Cl、³⁶Cl、³⁷Cl、³⁸Cl、³⁹Cl等等。

本文所述的化合物包括任何互变异构形式，尽管本文可能只提供给定化合物的互变异构形式之一的结构式。

如本文所用，术语“盐”是指酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐的例子包括含有硫酸盐、氯化物、盐酸盐、富马酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐的那些。盐可以从酸如盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸、富马酸和奎尼酸中获得。碱加成盐包括含有苄星青霉素、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙醇胺、叔丁胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌的那些，当存在酸性官能团如羧酸或酚时。例如，见Remington的Pharmaceutical Sciences,19^th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,Vol.2,p.1457,1995。盐类包括药学上可接受的盐类，考虑到要治疗的疾病或病症以及各自的给药途径，这些盐类不具有会导致合理谨慎的医生避免将该物质给药于患者的性质。本文所述的化合物、中间体或产品包括其盐。

此外，本文使用的缩写具有如下各自的含义：

缩略语列表

化合物

本文提供了包含两个官能团的双官能连接子，其中一个官能团是能够产生高反应性化学物质如卡宾或氮宾或自由基的化学基团，其可用于通过利用卡宾或氮宾或自由基的高反应性来标记化合物，以产生具有空间结构多样性的异构化合物的集合。连接子的另一个官能团用于连接标记分子，例如特定的寡核苷酸，使用寡核苷酸的序列编码异构体集合的合成。最后，各种化合物可以被这种双功能连接子和标记分子标记以产生标记产物，这些标记产物可以混合在一起以构建化合物库。在本公开中，优化了与寡核苷酸标记相容的卡宾或氮宾或自由基化学反应，例如，优化了溶剂、反应顺序、催化剂组成等。该方法避免了化合物功能研究中复杂的构效关系实验，操作简单快速，筛选效率高。

本文提供了使用寡核苷酸对有机化学物质进行位点非选择性标记的方法、在所述的方法中有用的化合物、以及标记的化合物、包含标记的化合物库及其用途。

标记方法

本文所述的方法利用位点非选择性反应，如卡宾或氮宾或自由基反应，并且可以同时在不同的位点上标记有机化合物，而与化合物的官能团无关，因此使假阴性结果最小化。这些方法也可用于标记不含官能团的有机化合物。此外，该方法不使用强碱或强还原剂等试剂，寡核苷酸标记对这些试剂不稳定。

在一些实施例中，该方法可以如方案1所示进行描述：

方案1

在一些实施方案中，提供了一种标记有机化合物的方法，该方法包括：

(1)在位点非选择性反应条件下，例如卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将连接子前体分子C与有机化合物A接触，其中所述连接子前体分子C具有两个官能团，即第一官能团R和第二官能团M，其中所述连接子前体分子C的第一官能团R产生位点非选择性反应基团，例如卡宾或氮宾或自由基，在位点非选择性反应条件下与有机化合物A反应，所述第二官能团在第一官能团与有机化合物A反应的条件下是不反应的，其中所述连接子前体分子C与有机化合物A接触形成具有连接子前体分子第二官能团M的中间体D。当连接子前体分子C与有机化合物A在位点非选择性反应条件下反应产生两种或多种异构体时，本文所用的“中间体D”可指所有异构体，或一种或一些异构体。

在一些实施例中，所述方法还包括：

(2)将中间体D与标记分子B接触，从而使连接子前体分子C的第二官能团M与标记分子B反应形成标记的有机化合物E，其中标记分子B包含标记。当通过该方法产生两种或多种异构体时，本文所用的“标记的有机化合物E”可以指所有的异构体，或者一种或一些异构体。

在一些实施方案中，位点非选择性反应条件是卡宾反应条件，连接子前体分子C的第一官能团R在卡宾反应条件下生成卡宾。在一些实施方案中，位点非选择性反应条件是氮宾反应条件，连接子前体分子C的第一官能团R在氮宾反应条件下产生氮宾。在一些实施方案中，位点非选择性反应条件是自由基反应条件，连接子前体分子C的第一官能团R在自由基反应条件下产生自由基。

本文提供的方法不依赖于有机化合物上的任何官能团来标记有机化合物。因此，在一些实施方案中，连接子前体分子C的第一官能团R可以与有机化合物A的多个位点反应，形成多种异构产物的混合物。在一些实施方案中，有机化合物A不包含反应功能性。

在一些实施方案中，中间体D是多种异构体的混合物。

在一些实施方案中，标记的有机化合物E是多种异构体的混合物。

在一些实施方案中，标记包括用于化学标记的独特的序列(Unique sequence)或荧光标记(例如，荧光团或GFP)或生物素标记，或其组合。在一些实施方案中，独特的序列包括单链DNA或RNA、双链DNA或RNA、多链DNA或RNA或其他化学修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，标记包含寡核苷酸。

在一些实施方案中，独特的序列包含化学修饰的寡核苷酸，包括天然核苷酸或任何其他人工核苷酸或两者的混合物。在一些实施方案中，化学修饰的寡核苷酸通过寡核苷酸上的氨基进行修饰。在一些实施方案中，化学修饰的寡核苷酸包含乙炔基(C≡CH)。在一些实施方案中，乙炔基通过连接子连接到寡核苷酸上。在一些实施方案中，连接子包含-CH₂-(OCH₂CH₂)_n-O-CH₂-，其中n是0至10或1至5的整数。

在一些实施方案中，位点非选择性反应条件，例如卡宾或氮宾或自由基反应条件，包括将有机化合物A和连接子前体分子C溶解在溶剂中以形成反应混合物。在一些实施例中，自由基反应条件包括紫外线(例如，365nm)辐射反应混合物一段时间，例如1-5小时或大约3小时或更长时间。在一些实施方案中，位点非选择性反应条件，例如卡宾或氮宾或自由基反应条件，包含自由基引发剂，例如过氧化物(具有过氧化物键(-O-O-)的化合物)，例如，过氧化二叔丁基、过氧化苯甲酰、过氧化甲乙酮和过二硫酸盐)或过渡金属络合物。其他自由基引发剂在本领域中是公知的，参见例如，Denisov,et al.,Handbook of Free RadicalInitiators,Wiley-Interscience；1st edition(April 4,2003)，其全部内容通过引用结合于此。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括分离步骤(1)中的中间体D和/或上述步骤(2)中的标记的有机化合物E。分离是指将所需的反应产物与反应混合物中的其他物质分离，如溶剂、试剂、副产物等。如果所述方法产生多种异构化和/或歧化反应产物，这些产物可以作为混合物或单独的化合物分离。

连接子前体分子

本文所述的方法使用连接子前体分子通过连接子前体分子的连接子与被标记分子标记的有机分子连接。连接子前体分子具有能够产生卡宾或氮宾或自由基的官能团，这些官能团能够与有机化合物反应，而不依赖于有机化合物的任何官能团。

在一些实施方案中，提供了包含第一官能团和第二官能团的连接子前体分子C，其中所述第一官能团能生成能够与有机化合物A反应的位点非选择性反应基团，例如卡宾或氮宾或自由基，所述第二官能团在第一官能团与有机化合物A反应的条件下不与有机化合物A反应，但能与标记分子B反应。

在一些实施方案中，连接子前体分子C具有式R-L-M，其中R为第一官能团，M为第二官能团，L为连接子部分，其包含一个或多个独立选自任选取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、环亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基和杂亚芳基的部分。

在一些实施方案中，L为亚烷基，其中亚烷基的一个或多个亚甲基单元任选被独立选自NR¹、O、S、SO、SO₂、CO、NR¹C(O)、C(O)NR¹、环亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基和杂芳基的部分取代，其中R¹各自独立地为氢或烷基。

在一些实施方案中，L为亚烷基，其中亚烷基的一个或多个亚甲基单元被独立选自亚苯基、氧、NHC(O)和C(O)NH的部分取代。

在一些实施方案中，L包括亚苯基。

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C的第一官能团或R包含能够产生卡宾或氮宾或自由基(例如重氮、烯酮、异氰酸酯或叠氮基团)的基团。在一些实施方案中，所述连接子前体分子C的第一官能团或R包括重氮甲烷、芳基叠氮化物、二苯甲酮或重氮。

在一些实施方案中，所述第一官能团或R包含亚芳基，并通过亚芳基如亚苯基连接至连接子前体分子C的其余部分。

在一些实施方案中，所述连接子前体分子的第一官能团选自

其中

表示连接至连接子前体分子C其余部分的连接位点。

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C的第二官能团或M包含叠氮化物(例如，烷基叠氮化物)、炔、烯或-C(O)-O-。

在一些实施方案中，所述第二官能团或M包含亚烷基，并通过亚烷基连接到连接子前体分子C的其余部分。

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C的第二官能团或M选自

其中

表示连接至连接子前体分子C其余部分的连接位点。

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C选自

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C选自

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C选自

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C选自

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C为

标记的有机化合物

在一些实施方案中，提供了标记的有机化合物E，其由包括以下步骤的方法制得：

(1)在位点非选择性反应条件下，例如卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将连接子前体分子C与有机化合物A接触，其中所述连接子前体分子C具有两个官能团，即第一官能团R和第二官能团M，其中所述连接子前体分子C的第一官能团R产生与有机化合物A反应的位点非选择性反应基团，例如卡宾或氮宾或自由基，在位点非选择性反应条件下，所述第二官能团在第一官能团与有机化合物A反应的条件下是不反应的，并且其中所述连接子前体分子C与有机化合物A的连接生成具有连接子前体分子C的第二官能团M的中间体D；和

(2)将所述中间体D与标记分子B接触，从而所述连接子前体分子C的第二官能团M与标记分子B反应生成标记的有机化合物E，其中标记分子B包含标记。

在一些实施方案中，所述有机化合物A不包含反应功能性。

在一些实施方案中，所述中间体D是多种异构体的混合物。

在一些实施例中，所述标记的有机化合物E是多种异构体的混合物。

在一些实施例中，所述标记包括用于化学标记的独特的序列或荧光标签(例如，荧光团或GFP)或生物素标记，或其组合。

在一些实施方案中，所述独特的序列包括单链DNA或RNA、双链DNA或RNA、化学修饰的寡核苷酸、多链天然或人工寡核苷酸或人工寡核苷酸。

在一些实施方案中，独特的序列包括寡核苷酸。

在一些实施方案中，提供了一组异构标记的有机化合物，其包括标记部分和有机化合物部分，其中所述标记部分通过连接子连接到有机化合物部分的不同位点。

在一些实施方案中，提供了一种混合物，其包括(1)多种异构化合物，其中所述异构化合物由有机化合物A的卡宾或氮宾或自由基与所述的连接子前体分子C经位点非选择反应制得，和/或(2)一对或多对化合物，其为异构化合物的歧化反应产物，所述异构化合物通过(1)的自由基反应制得。

在一些实施方案中，所述一对歧化反应产物包括化合物F，其分子量为由卡宾或氮宾或自由基反应制得的化合物D的分子量加2，和化合物F’，其分子量为由卡宾或氮宾或自由基反应制得的化合物D的分子量减2。

在一些实施方案中，提供了多种异构标记化合物的混合物，其通过包括以下步骤的方法制得：

(1)在位点非选择性反应条件下，例如卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将具有本文所述的第一和第二官能团的连接子前体分子C的第一官能团与有机化合物A反应，生成具有连接子前体分子C的第二官能团的中间体D；和

(2)将所述第二官能团与包含标记的标记分子B反应。

在一些实施例中，所述标记包括用于化学标记的独特的序列或荧光标签(例如，荧光团或GFP)或生物素标记，或其组合。

在一些实施方案中，所述独特的序列包括单链DNA或RNA、双链DNA或RNA、其他化学修饰的寡核苷酸或其他人工寡核苷酸，例如多链天然或人工寡核苷酸。在一些实施方案中，所述独特的序列包括寡核苷酸。

在一些实施方案中，所述连接子前体分子C的第一官能团与所述有机化合物A的多个位点反应，生成多个异构中间体D的混合物，其与标记分子B反应，形成多个异构的标记的有机化合物E。在一些实施方案中，提供了标记的有机化合物的库，其包括至少两种标记的有机化合物(或两组异构标记的有机化合物)，每种都通过本文所述的方法制得，其中独特的有机化合物用独特的标记进行标记。

在一些实施方案中，所述库包含至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500组独特的标记的有机化合物(或5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500组异构标记有机化合物)，每种都用独特的标记进行标记。

在一些实施方案中，独特的标记是具有独特的序列的寡核苷酸。

筛选方法

在一些实施方案中，提供了一种鉴定与靶分子结合的有机化合物的方法，包括分析本文所述的标记有机化合物、一组异构标记有机化合物或标记的有机化合物的库，并根据它们的标记鉴定与靶点结合的有机化合物。这种试验在本领域中是公知的，例如，《DNA编码化学手册》第十三章和第十六章，Goodnow Jr.,Wiley，1版(2014年)，Decurtins,W.等人，Automated screening for small organic ligands using DNA-encoded chemicallibraries,Nat Protoc.2016；11(4):764-80，其全部内容通过引用结合于此。

在一些实施方案中，通过本文所述的标记的有机分子和待测试的靶分子之间的亲和力来筛选有机化合物。待测试的靶点包括蛋白质分子、细胞、细胞器(细胞核、线粒体、高尔基体、过氧化物酶体、溶酶体、胞外体等)、细胞骨架(微管、中间丝、微丝)、DNA、RNA、糖、磷脂分子、磷脂蛋白复合物或上述的复合物等。这种筛选方法在本领域中通常是已知的，并且可以根据具体用途，例如待测试的特定靶点而变化。

在一些实施方案中，选择与靶分子具有结合亲和力的标记点有机化合物进行鉴定。在一些实施方案中，对选定的标记的有机化合物进行其标记的测序反应，以解释编码的寡核苷酸序列(例如，Sanger测序、第二代测序等)，鉴定与靶点结合的有机化合物。

在一些实施方案中，提供了一种用于鉴定具有两个共轭双键的化合物的方法，所述方法包括

(1)在位点非选择性反应条件下，如卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将本文所述的连接子前体分子C的第一官能团与有机化合物A反应，生成产物或产物混合物D，其中所述连接子前体分子C的第二官能团未反应；和

(2)分析所述产物或产物混合物D，其中一对歧化反应产物的存在表明有机化合物A具有两个共轭双键，其中所述一对歧化反应产物包括化合物F，其分子量为卡宾或氮宾或自由基反应的产物D的分子量加2，和化合物F’，其分子量为卡宾或氮宾或自由基反应的产物D的分子量减2。

在一些实施方案中，所述两个共轭双键中至少有一个在环体系中，例如环烷基环。

所述产物或产物混合物可通过本领域公知的方法，例如液相色谱结合质谱进行分析。

治疗方法

在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的化合物，其中所述疾病或病症被预定生物靶点的活性所调节或影响。在一些实施方案中，通过本文所述的筛选方法鉴定该化合物，并任选进一步修饰，例如，以增强与预定生物靶点的结合效力。在某些实施方案中，所述化合物衍生自本文所述的标记的有机化合物。所述预定生物靶点可为任何生物靶点，包括但不限于蛋白质、酶、细胞、细胞器(细胞核、线粒体、高尔基体、过氧化物酶体、溶酶体、胞外体等)、细胞骨架(微管、中间丝、微丝)、DNA、RNA、糖、磷脂分子、磷脂蛋白复合物或上述的复合物等。

在某些实施方案中，所述预定生物靶点为聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是一个蛋白质家族，其参与许多细胞过程，如DNA修复、基因组稳定性和程序性细胞死亡。PARP家族包括17个成员，如PARP1、PARP2、VPARP(PARP4)、Tankyrase-1和-2(PARP-5a或TNKS、PARP-5b或TNKS2)、PARP3、PARP6、TIPARP(或“PARP7”)、PARP8、PARP9、PARP10、PARP11、PARP12、PARP14、PARP15和PARP16。

在某些实施方案中，所述预定生物靶点为PARP1。PARP1是一种对修复单链断裂很重要的蛋白质。抑制PARP1的药物会导致形成多个双链断裂，在具有BRCA1、BRCA2或PALB2突变的肿瘤中，这些双链断裂不能被有效修复，导致肿瘤细胞死亡。由于Rad51的下调，一些缺乏肿瘤抑制因子PTEN的癌细胞可能对PARP抑制剂敏感。因此PARP抑制剂可以有效对抗PTEN缺陷型肿瘤。

除了用于癌症治疗之外，PARP抑制剂被认为是中风、心肌梗死和神经退行性疾病的潜在疗法。

因此，在一些实施方案中，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症、中风、心肌梗塞、神经退行性疾病或炎症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的通过本文所述的筛选方法鉴定为能够结合或抑制PARP1的化合物。

在一些实施方案中，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症、中风、心肌梗塞、神经退行性疾病或炎症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的木犀草素、柚皮苷、金丝桃苷、甘草黄苷、表儿茶素、表没食子儿茶素、瑞香素、F001、F002、F003或F006，或其衍生物。在一些实施方案中，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症、中风、心肌梗塞、神经退行性疾病或炎症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的木犀草素，或其衍生物。

在一些实施例中，需要治疗的受试者患有癌症。在一些实施方案中，所述受试者具有BRCA1、BRCA2、PALB2或PTENT突变的癌细胞。在某些实施方案中，所述突变为失活突变。

在一些实施方案中，与对应的正常细胞相比，受试者具有过表达PARP蛋白的癌细胞。在一些实施方案中，PARP蛋白为PARP1。

在一些实施方案中，需要治疗的受试者患有神经退行性疾病。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、萎缩性脊髓炎、艾滋病性痴呆、血管性痴呆及其组合。

在一些实施例中，需要治疗的受试者患有中风。

在一些实施方案中，需要治疗的受试者患有炎症，例如但不限于，与选自以下的疾病或病症相关的炎症：帕金森病、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、银屑病关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、狼疮、系统性红斑狼疮、幼年类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、爱迪生氏病、乳糜泻、皮肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、干燥综合征、I型糖尿病、血管炎、葡萄膜炎、动脉粥样硬化和强直性脊柱炎。

“治疗”是一种获得包括临床结果在内的有益或期望结果的方法。有益或期望的临床结果可包括以下一种或多种：a)抑制疾病或病症(例如，减轻由疾病或病症引起的一种或多种症状，和/或减轻疾病或病症的程度)；b)减缓或阻止与疾病或病症相关的一种或多种临床症状的发展(例如，稳定疾病或病症，防止或延迟疾病或病症的恶化或进展，和/或防止或延迟疾病或病症的扩散(例如，转移))；和/或c)缓解疾病，即引起临床症状的消退(例如，改善疾病状态，使疾病或病症部分或全部缓解，增强另一种药物的效果，延缓疾病的进展，提高生活质量，和/或延长生存期。

“预防”是指避免疾病或病症的临床症状发展的疾病或病症的任何治疗。在一些实施方案中，可以将化合物给予处于风险中或具有疾病或病症家族史的受试者(包括人)。

“受试者”是指已经或将成为治疗、观察或实验对象的动物，如哺乳动物(包括人)。本文描述的方法可用于人类治疗和/或兽医应用。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一个实施例中，受试者是人。

本文所述化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、立体异构体混合物、前药或氘代类似物的术语“治疗有效量”或“有效量”是指当给予受试者时足以实现治疗的量，以提供治疗益处，例如改善症状或减缓疾病进展。例如，治疗有效量可以是足以减少预定生物靶点的疾病或病症的症状的量，所述预定生物靶点例如但不限于PARP蛋白。治疗有效量可根据受试者、所治疗的疾病或病症、受试者的体重和年龄、疾病或病症的严重程度以及给药方式而变化，这可由本领域技术人员容易地确定。

本文所述的方法可应用于体内或体外细胞群。“体内”是指活的个体体内，如动物或人体内。在这种情况下，本文所述的方法可用于个体治疗。“体外”是指在活的个体之外。体外细胞群的例子包括体外细胞培养物和生物样品，包括从个体获得的流体或组织样品。这种样品可以通过本领域公知的方法获得。示例性生物流体样本包括血液、脑脊液、尿液和唾液。在这种情况下，本文所述的化合物和组合物可用于多种目的，包括治疗和实验目的。例如，本文所述的化合物和组合物可用于体外，以确定给定适应症、细胞类型、个体和其他参数的本发明化合物的最佳给药方案和/或给药剂量。从这种使用中收集的信息可用于实验目的或在临床中设定体内治疗方案。下文描述了本文所述化合物和组合物可能适合的其它体外用途，或者对本领域技术人员来说将变得显而易见。可以进一步表征所选化合物，以检查人类或非人类受试者的安全性或耐受性剂量。可以使用本领域技术人员公知的方法来检查这些性质。

本公开的方法具体提供了对任何前述疗效标准的改进。

实施例

通过以下实施例来展示本公开的具体实施方式。本领域的技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表了在本公开的实践中能很好发挥作用的技术，因此可以被认为构成了其实践的特定模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应该理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方式进行许多改变，仍然能获得相似或类似的结果。

实施例1

将化合物1(200mg)溶解在10mL二氯甲烷中，然后在搅拌下与化合物2(200mg)、EDCI(416mg)和DMAP(10mg)混合。在室温下搅拌3小时后，混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤，浓缩并通过快速色谱法纯化，得连接子I(210mg，70.4％)。¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.82(d,J＝8.5Hz,2H),7.25(d,J＝8.2Hz,2H),6.63(s,1H),3.79–3.62(m,6H),3.45–3.36(m,2H)；HRMS-ESI(m/z)[M+H]⁺C₁₃H₉F₃N₆O₂，计算，343.1130，实测，343.1133。

实施例2

将化合物3(200mg)溶解在10mL二氯甲烷中，然后在搅拌下与化合物2(513mg)、EDCI(405mg)和DMAP(10mg)混合。在室温下搅拌3小时后，混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤，浓缩并通过快速色谱法纯化，得连接子II(283mg，75.6％)。¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.93(s,1H),3.72–3.66(m,2H),3.57(t,J＝5.0Hz,2H),3.48(t,J＝5.1Hz,2H),3.41–3.35(m,2H),2.06-1.98(m,2H),1.82–1.67(m,2H),1.03(s,3H)；HRMS-ESI(m/z)[M+H]⁺C₉H₁₇N₆O₂，计算，241.1413，实测，241.1417。

实施例3

将化合物4(50mg)溶于5mL二氯甲烷中，然后与化合物5(25μL)、HATU(150mg)和DIPEA(138μL)混合，在室温下搅拌3小时后，混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤，浓缩并通过快速色谱法纯化，得连接子III(49mg，79.1％)。¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(d,J＝8.5Hz,2H),7.26(d,J＝8.5Hz,2H),6.23(s,1H),4.26(dd,J＝5.2,2.6Hz,2H),2.30(t,J＝2.6Hz,1H).HRMS-ESI(m/z)[M+H]⁺C₁₂H₉F₃N₃O，计算，268.0698，实测，268.0699。

实施例4

根据梁等人(Angew Chem Int Ed Eng(2017)56(10):2744-2748)的方法，通过将乙腈替代溶剂N,N-二甲基甲酰胺，制备得3-(2-叠氮乙基)-3-甲基-3H-二嗪。¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)＝1.05(s,3H),1.60(t,2H,J＝5.4Hz),3.18(t,2H,J＝5.4Hz)。

实施例5

将冬凌草甲素(2mg，0.0054mM)溶解在1mL二氯甲烷中，并与双官能连接子I(3.3mg，0.011mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成冬凌草甲素连接子I缀合物，其包含至少五种的异构产物，MS(ESI(m/z)[M+H]+)为679.27(图1)。

实施例6

在500μL管中，初始DNA7(50μL，1mM的硼酸盐缓冲液(pH 9.4))通过涡旋与化合物6(5μL，200mM的DMSO)混合，然后用旋转器旋转10小时。向混合物中加入5M氯化钠(5.5μL)，然后加入EtOH(160μL)。将内容物短暂涡旋，并在-20℃的冰箱中孵育20分钟。然后将悬浮液以10000×g离心5分钟，弃去上清液，并在真空下除去微量的EtOH。将沉淀溶解在H₂O(50μL)中，制得1mM的化合物8溶液。(图2)。

实施例7

将化合物8(20μL，1mM在H₂O中)与连接子I(4μL，100mM)、五水合硫酸铜(II)(4μL，100mM)、抗坏血酸钠(4μL，200mM)和四氢大麻酚(4μL，100mM)混合。混合物通过涡旋混合，然后在旋转器上旋转5小时。然后向混合物中加入5M氯化钠(3.6μL)，然后加入EtOH(100μL)。将内容物短暂涡旋并在-20℃孵育20分钟。然后将悬浮液以10000×g离心5分钟，弃去上清液，在真空下除去微量的乙醇，生成标记的化合物9(图3)。

实施例8

将化合物8(20μL，1mM在H₂O中)与冬凌草甲素-连接子I缀合物(4μL，100mM)、五水合硫酸铜(II)(4μL，100mM)、抗坏血酸钠(4μL，200mM)和四氢大麻酚(4μL，100mM)混合。混合物通过涡旋混合，并在旋转器上旋转5小时。然后向混合物中加入5μL氯化钠(3.6μL)，然后加入EtOH(100μL)。混合物短暂涡旋，并在-20℃下孵育20分钟。然后将悬浮液以10000×g离心5分钟，弃去上清液，在真空下除去微量的EtOH，生成标记的化合物10(图4)。

实施例9

冬凌草甲素(2mg，0.0054mM)溶于1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(2.6mg，0.011mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，产生冬凌草甲素-连接子II缀合物，其包含至少五种异构化合物，MS(ESI(m/z)[M+H]⁺)为577.3(图5和图6)。

实施例10

将雷公藤红素(2mg，0.0044mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(2.1mg，0.009mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成雷公藤红素-连接子II缀合物，其包含至少三种异构化合物，MS(ESI(m/z)[M+H]⁺)为663.38(图7和图8)。

实施例11

将紫杉醇(2mg，0.0047mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(2.3mg，0.0094mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成紫杉醇-连接子II缀合物，其包含至少三种异构化合物，MS(ESI(m/z)[M+H]⁺)为1066.46(图9和图10)。

实施例12

将雷酚内酯(2mg，0.0064mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(3.1mg，0.0128mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成雷酚内酯-连接子II缀合物(图11和图12)。

实施例13

将美登醇(4mg，0.0071mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(3.4mg，0.0142mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时，生成美登醇-连接子II缀合物，其包含至少两种异构化合物，MS(ESI(m/z)[M+H]⁺)为777.3(图13和图14)。

实施例14

将枞酸(2mg，0.0066mM)溶解在1mL乙腈中，然后与双官能连接子II(3.1mg，0.013mM)混合。混合物在室温下用紫外光(365nm)照射3小时。生成了两种类型的缀合物(脱氢枞酸连接子II缀合物(A)，MS(ESI(m/z)[M+H]⁺)为513.37，和氢化枞酸连接子II缀合物(B)，MS(ESI(m/z)[M+H]⁺)为517.40)。(图15和图16)。

实施例15

与寡核苷酸的反应：使用连接酶将化合物6和7与寡核苷酸连接。将头部-DNA缀合物4与光敏连接子2混合。混合物用紫外光(365nm)照射2小时。用寡核苷酸连接产物，涂抹条带，表明产生了多个连接产物(图17)。

实施例16

可用作标记的寡核苷酸包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、化学修饰的寡核苷酸和一些功能物种如反义RNA(asRNA)。

用于标记的几个寡核苷酸例子的序列列举如下：

ssDNA:5’-AAATAAATT，5’氨基修饰

ssRNA:5’-AUUUAUUUU，5’氨基修饰

ssDNA:5’-AAATAAATT，3’氨基修饰

ssRNA:5’-AUUUAUUUU，3’氨基修饰

ssDNA:5’-AAATAAATT，5’氨基用硫代磷酸酯键修饰(耐核酸酶降解)

ssDNA:5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG，5’氨基用硫代磷酸酯键修饰(耐核酸酶降解)

实施例17

DNA编码的化学库(DELs)通过组合优化将遗传学和化学合成的力量联系起来。通过组合化学，DELs可以发展为前所未有的数十亿到数万亿的规模，为生物和药物研究提供丰富的化学多样性。虽然在大多数情况下，在分子水平上，多样性仅限于DNA兼容化学反应的可用构件，但现代化学方法正被用来增加多样性。为了充分利用DEL方法，将遗传学的力量直接与化学结构联系起来，将在有限的化学世界中提供更大的多样性。随着生物进化，天然产物已经进化出令人难以置信的结构多样性。

以下提供了一个使用天然产品、FDA批准的药物、临床试验中的化合物和源自组合合成的化合物的示例性DNA编码化学库(DEL)，其根据本文所述的方法制备。在下面的例子中，挥发性双官能连接子(连接子IV)允许在自动并行合成器上进行“一锅”反应。

在一些实施方案中，本文描述的方法表现出以下标准：(1)位点非选择性，(2)化学非选择性，(3)生物相容性(例如，DNA相容)，和(4)与小反应规模相容(例如，微克)。传统的化学选择性反应是在一个特定的原子上修饰天然产物，由于空间屏蔽作用，可能会遗漏调节靶蛋白功能的潜在结合口袋。设计了一种后期修饰方法，利用化学反应和位点非选择性反应来靶向所有可接近的原子。这种后期修饰产生了一组具有独特DNA标签的异构体，为靶蛋白提供了多种空间可及性。

一般方法

除非另有说明，所有市售有机化合物和DNA头部(HP-NH₂,5’-/5phos/GAGTCA/iSp9/iUniAmM/iSp9/TGACTCCC-3’)均从商业来源获得。除非另有说明，所有商业试剂和溶剂都是在没有额外纯化的情况下使用的。NMR光谱记录在Bruker AM-500NMR光谱仪上。化学位移报告为δ(ppm)，耦合常数报告为J(赫兹)。四甲基硅烷(TMS)用作¹H NMR的内部参考，CDCl₃用作¹³C NMR(δ77.0ppm)的内部参考。质谱记录在AB SCIEX 4600质谱仪或waters SQD2质谱仪上。连接子IV根据实施例4制备。

连接子筛选

对本文所述的各种双官能连接子进行了检测，以开发一种用于天然产物的高通量DNA注释策略。连接子上官能团的反应性是正交的，其中一个末端被设计成用于化学反应和位点非选择性反应，另一个被用于通过铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)缀合DNA标签，如本文所述。

使用冬凌草甲素作为模型底物检测示例性双功能连接子(表1A)，将冬凌草甲素(1当量)和双官能连接子(2当量)溶解在乙腈中，并在室温下经紫外线照射。

如表1A中所示，含3-(三氟甲基)-3H-二氮杂茚-3-基的连接子III生成了三种异构体，产率为20％(基于冬凌草甲素的浓度)。含3-甲基-3H-二氮杂茚-3-基的连接子II生成了6种标记的冬凌草甲素异构体，标记效率为69％，其中两种异构体具有一种用两个连接子II分子标记的冬凌草甲素。含3-甲基-3H-重氮甲烷-3-基的连接子3-(2-叠氮基乙基)-3-甲基-3H-重氮甲烷(连接子IV)产生一种异构体。如¹H-NMR所示，在连接子IV和冬凌草甲素之间的反应完成后，通过真空除去未反应的连接子IV和/或连接子IV的副产物。

表1A.不同卡宾或自由基生成系统的标记效率

^a向0.5mL(0.1mM)冬凌草甲素在无水乙腈中的溶液中加入1mL(0.1mM)对应的双官能连接子，所得混合物用365nm灯照射30分钟，然后用LC-MS分析混合物。

^b用一个连接子标记的冬凌草甲素。

^c用两个连接子标记的冬凌草甲素。

^d未反应。

如表1B所示，通过连接子IV与浓度高达5当量的2,4-二羟基苯乙酮的反应，连接子IV不与叠氮化物官能团反应。如图18所示，反应完成后，如¹H-NMR所示，未反应的连接子IV和/或连接子IV的副产物很容易通过真空除去(连接子IV-2,4-二羟基苯乙酮缀合物用箭头表示)。结果表明，微量的剩余连接子IV对基于CuAAC的点击化学和酶促DNA连接的后续DNA连接没有干扰。

表1B.连接子IV的标记效率

^a向0.5mL(0.1mM)2，4-二羟基苯乙酮在无水乙腈中的溶液中加入对应的双官能连接剂IV，所得混合物用365nm紫外灯照射30分钟，然后用LC-MS和¹H NMR分析混合物。

^b用一个连接子IV标记的2,4-二羟基苯乙酮。

^c用两个连接子IV标记的2,4-二羟基苯乙酮。

使用连接子IV制备表2所示的连接子缀合物。

表2

^a由LC测定的产率。

^b由LC和MS-MS测定的标记异构体。

方案2显示了通过由DMTMM促进的用于与药物和天然产物反应的酰胺偶联化学，由丙炔-(PEG)₅-CH₂CH₂COOH制备丙炔-HP-DNA。

方案2：丙炔-HP-DNA

在方案2中，在pH 9.5的硼酸钠缓冲液(250mM)中加入HP-DNA(1mM)，加入40当量的丙炔-(PEG)₅-CH₂CH₂COOH(200mM，在DMF中)，然后加入50当量的二甲基甲酰胺(200mM，在水中)。在室温下搅拌18小时后，向反应混合物中加入5mL氯化钠溶液(10％体积)和冷乙醇(2.5倍体积，乙醇储存在-20℃)。混合物在-80℃下储存30分钟以上。之后，混合物在微型离心机中以12000转/分钟的速度在4℃下离心15分钟。除去上清液，将沉淀溶解在水中至最终浓度为1mM，无需进一步纯化即可直接用于点击偶联反应的下一步。计算的精确质量：5267.07。实测质量：5266.46。

使用双官能连接子IV标记各种药物的一般程序如下方案3所示。在方案3中，NP是药物或天然产物，丙炔-HP-DNA如上所述。表3和表4中的化合物是使用这些方法制备的。

方案3：连接子-IV缀合物和标记化合物的合成

简而言之，将CH₃CN(100μL)加入到96孔板的每个孔中，每个孔中含有化合物(1μmol)和连接子IV(5μmol)。将该板在室温下于UV下以365nm的波长照射30分钟。通过LC-MS测定产物和收率。将CH₃CN在真空中蒸发过夜，生成对应的NP-N₃。然后，将化合物(NP-N₃)溶于DMSO(30μL)，并与丙炔-HP-DNA(10μL，1mM在水中)、THPTA(10μL，80mM在DMSO中)、CuSO₄·5H₂O(10μL，80mM在水中)和抗坏血酸钠(20μL，80mM在水中)混合。将所得混合物在室温下振荡过夜，反应结束后，通过LC-MS测定产物和产率进行。之后，加入清除剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(12L，160mM在水中)。然后收集所有的HP-DNA缀合化合物(NP-HP-DNA)，并加入5M氯化钠溶液(10％体积)和冷乙醇(2.5倍体积，乙醇储存在-20℃)。混合物在-80℃的冰箱中储存30分钟以上。混合物在微型离心机中以12000转/分钟的速度在4℃下离心15分钟。除去上清液，将沉淀溶解在水中。

如本文所述，在96孔板中使用“一锅法”逐步合成进行DNA编码。表3和表4中所示的药物-连接子ⅳ缀合物和标记化合物是根据上述程序制备的。总共获得了110个DNA编码的终产物(表4)。对于具有多个官能团(包括羟基、羧基、胺基等中的一个或多个)的化合物(如编号为17、25、74、82、108、91、99和114的化合物)，如在不同保留时间下显示相同分子量的HPLC馏分所示，DNA缀合容易发生在多个位点，而对于具有单个官能团的化合物，通常在单个位点观察到DNA缀合。

表3

表4

实施例18：组合合成结构

为了利用DNA编码的化学库(DEL)可以在单个试管中筛选的事实，将通过后期修饰反应合成的选定DELs整合到DEL库格式中进行筛选。为此，准备了后期注释的DEL(包括中药天然产物(TCMs)、FDA批准的药物和临床试验中的对照化合物)和大小为104的小型组合DEL库，然后以1:10的比例(单一化合物浓度)进行组合。使用两种已知的碳酸酐酶II(CAII)抑制剂，卡西尼特和布林佐胺，测试了不同混合比例对后期标记DELs富集的影响。首先对这两种CAII抑制剂进行DNA编码，并以0.05pM、0.5pM和5pM的最终浓度加入到104组合DEL(0.5pM/分子)中。标记为DELs(1:10的比例)的后期0.05pM浓度的混合显示布林佐胺和卡西尼特的最高富集度分别为300倍和410倍(表5)。

表5：碳酸酐酶结合物选择的富集倍数

通过定量聚合酶链式反应(qPCR)对加标的天然产物-DNA缀合物的量进行定量，然后以指定的比例与DEL库混合。先导DEL库包含12696个化合物，由6个胺-(PEG)_n-酸(构件1)、46个氨基酸(构件2)和46个羧酸(构件3)偶联而成。

DNA编码框架是根据文献中的头部和其他条形码的结构设计的。头部是DNA头部(5’-/5phos/GATCCA/ISp9/iUniAmm/ISp9/TGACCCC-3’)。在连接缓冲液和T4 DNA连接酶(NEB,Cat.#Z1811S)中酶促连接DNA酸寡核苷酸-条形码。将反应混合物在16℃孵育16小时，并通过LCMS和凝胶分析。测序引物为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG和5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTC，总体方案如图19所示。

His-标签融合重组人PARP-1(Sino Biological,Cat.#11040-H08B)和人HSP70(Sino Biological,Cat.#11660-H07H)从商业来源获得。这两种可溶性蛋白的淘选过程相同。将5μg靶蛋白与镍磁珠(GenScript,Cat.#L00295)，5nM DEL库和10μg/mL鲑鱼精DNA进行混合。最终体积调整至100μL。混合物在室温下旋转1.5小时。用含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤5次后，在50μL洗脱缓冲液(20mM Tris,pH 7.4,100mM NaCl)中，在95℃加热10min，洗脱靶蛋白结合化学-DNA缀合物。用Takara PrimerSTAR Max DNA聚合酶(Takara,Cat.#R045A)通过PCR扩增洗脱的DEL化合物。然后用Hieff NGSTM smarter DNA清洁珠(Yeasen,Cat.#12600ES03)去除多余的引物，并在4％DNA琼脂糖凝胶上进行评估。使用Illumina HiSeq X10分析仪对扩增产物进行高通量测序。表6总结了不同靶的寡核苷酸标签的亲和选择和PCR扩增。

表6.

1.Sino Biological,Cat.#11660-H07H

2.Sino Biological,Cat.#11040-H08B

3.GenScript,Cat.#L00295

4.Takara,Cat.#R045A

组合化学文库由三个构件子库构建而成，其中第一、第二和第三个构件子库分别包含6个、46个和46个化学构件。每个构件都由10个碱基对(bp)的DNA序列编码。天然产物由30-bp的DNA序列编码，长度与组合化学库的DNA编码相同。这三个子库之间所有可能的组合(组合化合物)都是由一个内部java程序生成的，该程序生成了一个包含12696个DNA编码序列的参考DNA编码库。测序后，使用CLC基因组工作台版本12(Qiagen)修剪DNA编码序列周围的Illumina衔接子。在3轮“裂池”迭代中，左侧的DNA编码序列与构件的3个DNA序列相对应，长度为30bp。对于每个样本，DNA编码序列被映射到参考DNA编码化合物库。映射中不允许错配。计算不同样品中所有化合物的编码序列。计算给定样品中所有化合物的总读数。每个单独化合物的读数除以总读数，再乘以常数100000。

归一化计数_{化合物M，样品A}＝次数_{化合物M，样品A}/(总数_样品A)*100000

计算选择后库中每种化合物与参考库相比的倍数变化。例如，如果将样品A和参考库进行比较，对于化合物M的倍数变化，计算如下：

倍数变化_化合物M＝归一化计数_{化合物M，样品A}/归一化计数_{化合物M，参考}

nDEL筛选的命中标准考虑了标准化富集倍数值(y轴)和深度测序读数计数(x轴)。读取计数小于10的化合物被认为是不可靠的，因此在目标筛选前，应立即将其从DEL中清除。对于每个DEL库，在不存在靶蛋白的情况下记录基线富集倍数，并且可以计算库中每个DEL化合物的归一化富集倍数值。命中鉴定的临界值是基于对高度多样化的数据总体的简化统计分析，这是整个库的富集倍数平均值(μ)加3倍标准偏差(σ)的总和。富集倍数大于μ+3σ的任何DEL化合物均视为命中。

PARP-1酶分析

按照提供的方案进行基于PARP-1自动糖基化的分析(BPS,Cat.#80580)。化合物溶解在DMSO中。通过将蛋白质与取决于不同化合物(DMSO在所有样品中的最终浓度为1％)的不同范围的化合物在室温下预孵育15分钟，以建立一式三份的实验反应。然后通过二倍稀释到底物包被的检测板中，并在室温下孵育1小时，来进行ADP-核糖基化反应。使用酶标仪(EnVision，PerkinElmer)检测化学发光。所得数据用GraphPad拟合到单部位剂量反应模型，提取实验IC₅₀值。报告的误差代表每个实验的拟合参数的标准误差。

分子建模

使用计算机上的分子对接来研究木犀草素在PARP1的催化结构域(残基660至1011)上的可能结合模式。AutoDock工具(4.2.6版)用于PARP1(PDB 4pjt)和配体准备，以生成pdbqt文件。从PARP1 PDB文件中删除水分子和抑制剂，加入极性氢和Gasteiger部分电荷。x、y、z轴上60×60×40个点的网格和

的空间位于抑制剂结合位点的中心。总共进行了200次运行，最多进行了2500000次能量评估。选择结合自由能最低的木犀草素结合模式进行进一步的分子动力学模拟。

木犀草素分子动力学模拟的参数和拓扑结构通过ANTECHAMBER软件和ACPYPE脚本使用半经验量子化学程序(SQM)和广义琥珀力场(GAFF)导出。对木犀草素-PARP1复合物进行短暂的能量最小化，然后进行100-ns分子动力学模拟，以放松相互作用并稳定复合物的结构。使用Gromacs4.6.7软件包和Amber14ffSB力场进行模拟。该体系用含有Cl^-和K⁺的全原子TIP3P水溶解，浓度为0.13M，以模拟生理离子强度。温度T和压力P分别在300K和1个大气压下保持恒定，使用Berendsen恒温器和恒压器。对于长程静电相互作用，使用快速平滑的Particle-Mesh Ewald求和，直接相互作用的截止值为1.0nm。据认为，如果在分子动力学轨迹上，PARP-1残基与亮托林的距离在90％以上的时间内低于3.0埃的截止值，则它们会稳定地相互作用。这些残基列于表7中。

表7.在分子动力学模拟轨迹中与木犀草素相互作用的PARP-1残基。

抗热休克蛋白70kDa(HSP70)和聚[ADP-核糖]聚合酶1(PARP1)的nDEL的筛选

在nDEL筛选中使用了两种具有不同细胞位置和生物物理特性的靶蛋白。这些包括细胞质中的HSP70和细胞核中的PARP1，它们各自对小分子配体具有不同的亲和力。这些靶点的已知功能性结合物作为内部阳性对照包含在nDEL中，例如，用于HSP70的冬凌草甲素和用于PARP-1的奥拉帕尼的衍生物(F001、F002、F003和F006)。为了解决nDEL中DNA条形码的不均匀分布，首先在不存在靶蛋白但存在固定基质珠的情况下进行nDEL的空白筛选，然后进行深度测序以建立库中条形码的基线分布。使用Decurtins等人(Nat Protoc.2016；11(4):764-80)描述的方法分析所有筛选数据。根据每种nDEL化合物的测序计数，对它们的相应DNA序列进行计数。富集倍数计算为靶蛋白存在和不存在时归一化测序计数的比率。下表显示了富集倍数。

表8A：HSP70结合物选择的富集倍数

表8B：PARP-1结合剂选择的富集倍数

药物(NP)	倍数变化
		F001	4.38
F002	3.69
		冬凌草甲素-A1	3.28
F006	3.21
		白花丹素	2.97
东莨菪素	2.82
		(-)-表儿茶素没食子酸酯	2.81
甘草黄苷	2.66
		表没食子儿茶素	2.53
可可碱	2.42
		F003	2.34
金丝桃苷	2.25
		盐酸药根碱	2.23
龙胆酸	2.21
		柚皮苷	2.17
木犀草素	2.17
		瑞香素	2.17
辛弗林	2.17
		盐酸小檗胺	2.15
噻氨酯哒唑	2.06
		药根碱	2.04
茜素	2.02
		秦皮素	2.01

如图20所示，将nDEL的筛选指纹图谱绘制为富集倍数与归一化测序计数的关系。使用已知的结合物作为内部参考，基于阳性对照化合物的富集倍数，鉴定出nDEL筛选的命中率。

针对纯化的人HSP70和PARP-1蛋白进行nDEL筛选。对亲和力捕获的nDEL进行深度测序和解码分析。结果总结在表9中。所有对照化合物都在nDEL筛选中富集，命中率在0.15％至0.47％之间(图20)。HSP70的高命中率可能与HSP70蛋白的粘性有关。收集前两个部分并用两个独特的DNA序列N055和N056编码。值得注意的是，ordorion标记的化合物N055和N056的两种立体异构体分别富集了5.3倍和2.3倍(图20(a)和表8A)，表明HSP70对不同立体异构体的结构偏好。

表9.DEL筛选总结

靶点名称	命中(数量)	命中率
			HSP70	60	0.47％
PARP1	34	0.27％

在PARP-1筛选中，富集了34种nDELs(图20(b))，其中4种被证实包括阳性对照化合物(图21)。使用nDEL中已知化合物的内部对照似乎大大有助于选择真正的阳性命中。有趣的是，在富集的化学物质中聚集了结构相似的黄酮类化合物，特别是中药化合物、木犀草素及其糖基化类似物柚皮苷和金丝桃苷。

nDEL命中PARP-1酶抑制作用的生化特征

PARP-1是癌症治疗中的一个有效靶点，可催化ADP-核糖片段从NAD⁺迅速转移至受体蛋白，其本身导致蛋白质结合的线性和分支的同型ADP-核糖聚合物的形成，以响应DNA损伤和修复的细胞信号。在剪切的DNA存在下，基于PARP-1的自动核糖基化来测量酶活性。

富集的nDELs的抑制活性通过PARP-1自动核糖基化分析来表征。阳性对照奥拉帕尼的衍生物F003显示出对PARP-1的有效抑制作用，IC₅₀值为2.5nM(图22(b))。中药nDEL木犀草素可抑制PARP-1的酶活性，IC₅₀值为7.5μM(图22(a))。为了理解PARP-1和木犀草素之间的相互作用，进行了一系列基于分子模拟的计算机分析。通过分子对接发现，在最低自由能结合模式下，木犀草素占据了PARP-1的催化域。为了进一步评估这种模式的稳定性和理解相互作用的分子细节，从预测的对接模型开始，进行了100ns的分子动力学模拟。该复合物在模拟的时间窗内表现稳定，蛋白质中的几个残基与木犀草素在相当长的时间内相互作用。特别是D766、H862、Y896和E988在超过90％的模拟轨迹中保持与木犀草素的接触。由于G863、E988和D766残基的侧链形成了氢键，木犀草素在PARP-1的催化位点似乎是稳定的，这些残基也是NAD⁺结合的关键残基(图22(c))。

讨论

DELs是使用包括裂池合成在内的组合方法合成的，从根本上讲，这是一个迭代过程，需要在DNA存在下进行多次复杂的转化。具有高度复杂立体结构的化合物，如天然产物，通常不包括在DELs中，因为它们的合成需要更复杂的化学转化。随时间推移的自然选择与使用大量数字进行DELs选择的相对优势尚未确定。然而，目前的研究首次提供了一种在单个试管中同时研究两种系统的方法。在相同的环境条件下启用DEL筛选可以更深入地了解不同的DEL及其应用。此外，在nDELs中，靶蛋白的已知结合物或抑制剂可以作为内部对照，这大大提高了DEL筛选中的确认率和命中选择。重要的是，天然产品可能已经朝着一个目标进化，可能对其他目标没有用处。通过将靶点暴露于大量潜在配体中，nDELs的使用克服了这一限制。

本文所述方案的一个特殊特征是在DNA和有机化合物之间使用挥发性连接子。已经证明不完全的化学合成和不希望的副产物会影响DEL筛选(例如，过量的连接子可以与生物靶点反应)。挥发性连接子可以容易地除去未反应的连接子分子，使得多个反应可以在单个样品中进行，而无需考虑连接子的修饰。因此，后续分析不会受到连接子修饰的干扰。对于某些化合物，特别是那些只含C-H的化学物质，重氮甲烷的标记效率较低，因为卡宾插入许多天然产物的C-H键可能会有问题。新的后期修饰方法对于扩展nDEL方法是必要的。4-((三甲硅基)乙炔基)苯基氨基磺酸盐和7-叠氮基-1,1-二氟庚烷-1-亚磺酸钠生成的氮宾和碳自由基的C-H插入物显示出作为辅助工具的巨大前景。这些修饰也可以作为替代标记方法，以在具有单一官能团的化合物中产生额外的几何异构体。

尽管nDEL处于早期发展阶段，但数量有限的nDEL在不同类别靶点的命中鉴定方面已经显示出令人鼓舞的潜力。木犀草素作为PARP-1酶抑制剂的发现突出了nDELs的作用。木犀草素是一种天然的类黄酮，存在于许多水果和蔬菜中，如胡萝卜、西兰花、洋葱叶、欧芹、芹菜、甜椒和菊花。木犀草素也是传统中药中许多药材的活性成分，如金银花、菊花、生草(Herba unripe)、夏枯草、朝鲜蓟、紫苏、黄芩、紫花等。传统上，这些草药在复杂的配方中用作抗炎剂，以止咳、化痰和治疗疾病，如心血管疾病和肝炎。木犀草素因其对多种癌细胞类型的强效抗癌活性而得到广泛研究。更重要的是，更重要的是，它在逆转多重耐药性癌细胞(MDR)的生长中显示出功效。木犀草素通过细胞凋亡和细胞周期调节发挥其抗癌活性。有人建议将木犀草素用于多个分子靶标，例如JNK、NF-κB、IGF-1等。但是，对于任何提议的靶点，仍然缺乏与定义的结合口袋直接相互作用的证据。而且，列出的靶点之一或全部不能调和木犀草素的所有药理行为。多重药理是天然产物研究中常见的一种障碍，极大地限制了这些活性天然化合物的临床开发。通过nDEL筛选鉴定木犀草素的PARP-1，证明nDEl在天然产物多药生态学分析中的潜力。聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)与DNA结合，以响应细胞中由多种生物过程(包括DNA修复、复制、重组和基因重排)引起的瞬时和局部DNA链断裂。

作为临床证明的化疗靶点，PARP-1抑制在凋亡，细胞周期停滞等方面表现出与木犀草素类似的调节模式。PARP可能是木犀草素的关键靶点之一，木犀草素具有多种药理作用。nDELs具有整合数字、多样性和信息的潜力，在我们寻找生物医学问题的治疗和解决方案的努力中可能是无价的。

* * *

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Claims (42)

1.一种包含第一官能团和第二官能团的连接子前体分子C，其中所述第一官能团能生成能够与有机化合物A反应的卡宾或氮宾或自由基，所述第二官能团在第一官能团与有机化合物A反应的条件下不反应，但能与第二有机化合物B反应。

2.如权利要求1所述的连接子前体分子C，其具有式R-L-M，其中R为第一官能团，M为第二官能团，L为连接子部分，其包含一个或多个独立地选自任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的环亚烷基、任选取代的杂环亚烷基、任选取代的亚芳基和任选取代的杂亚芳基的部分。

3.如权利要求1或2所述的连接子前体分子C，其特征在于，所述第一官能团包括重氮甲烷、芳基叠氮化物、二苯甲酮或重氮。

4.如权利要求1或2所述的连接子前体分子C，其特征在于，所述第一官能团选自

其中

表示连接至连接子前体分子C其余部分的连接位点。

5.如权利要求1-4中任一项所述的连接子前体分子C，其特征在于，所述第二官能团包括叠氮化物、炔烃、烯或-C(O)-O-。

6.如权利要求1-4中任一项所述的连接子前体分子C，其特征在于，所述第二官能团选自

其中

表示连接至连接子前体分子C其余部分的连接位点。

7.如权利要求2-6中任一项所述的连接子前体分子C，其特征在于，L为亚烷基，其中亚烷基的一个或多个亚甲基单元任选被独立地选自NR¹、O、S、CO、SO、SO₂、NR¹C(O)、C(O)NR¹、环亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基和杂芳基的部分所取代，其中R¹为氢或烷基。

8.如权利要求2-6中任一项所述的连接子前体分子C，其特征在于，L为亚烷基，其中亚烷基的一个或多个亚甲基单元被独立地选自O、NHC(O)和C(O)NH的部分所取代。

9.一种连接子前体分子C，其选自

10.一种连接子前体分子C，其选自

11.一种选自表3的化合物或其立体异构体或立体异构体混合物。

12.一种标记的有机化合物E，其由包括以下步骤的方法制得：

(1)在卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将如权利要求1-10中任一项所述的连接子前体分子C的第一官能团与有机化合物A反应，生成具有如权利要求1-10中任一项所述的连接子前体分子C的第二官能团的中间体D；和

(2)将所述第二官能团与带有标记的标记分子B反应。

13.如权利要求12所述的标记的有机化合物E，其特征在于，所述有机化合物A不包含反应功能性。

14.如权利要求12或13所述的标记的有机化合物E，其特征在于，所述标记包括独特的序列或荧光标签，或其组合。

15.如权利要求14所述的标记的有机化合物E，其特征在于，所述独特的序列包括单链DNA或RNA、双链DNA或RNA、三链DNA或RNA、多链天然或人工寡核苷酸或化学修饰的寡核苷酸。

16.如权利要求13所述的标记的有机化合物E，其中所述独特的序列包括寡核苷酸。

17.一种选自表4的化合物或其立体异构体或立体异构体混合物。

18.一组标记的有机化合物，其为包括标记部分、连接子和有机化合物部分的异构体，其特征在于，所述异构体各自具有相同的标记部分、相同的连接子和相同的有机化合物部分，每个不同异构体中，所述标记部分通过所述连接子连接至所述有机化合物部分的不同位点。

19.一种混合物，其包括(1)多个异构化合物，其中所述异构化合物由有机化合物A的卡宾或氮宾或自由基与如权利要求1-10中任一项所述的连接子前体分子C反应制得，和/或(2)一对或多对化合物，其为化合物D的歧化反应产物，所述化合物D由有机化合物A的卡宾或氮宾或自由基与连接子前体分子C反应制得。

20.如权利要求19所述的混合物，其特征在于，所述有机化合物A不包含反应功能性。

21.如权利要求19或20所述的混合物，其特征在于，所述一对歧化反应产物包括化合物F，其分子量为由卡宾或氮宾或自由基反应制得的化合物D的分子量加2，和化合物F’，其分子量为由卡宾或氮宾或自由基反应制得的化合物D的分子量减2。

22.一种多个异构标记化合物的混合物，其由包括以下步骤的方法制得：

(1)在卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将权利要求1-10中任一项所述的连接子前体分子C的第一官能团与有机化合物A反应，生成具有如权利要求1-10中任一项所述的连接子前体分子的第二官能团的中间体D；和

(2)将所述第二官能团与带有标记的标记分子B反应。

23.如权利要求22所述的混合物，其特征在于，所述标记包括独特的序列或荧光标签，或其组合。

24.如权利要求23所述的混合物，其特征在于，所述独特的序列包括单链DNA或RNA、双链DNA或RNA、三链DNA或RNA、或多链天然或人工寡核苷酸或化学修饰的寡核苷酸。

25.如权利要求23所述的混合物，其特征在于，所述独特的序列包括寡核苷酸。

26.一种标记有机化合物A的方法，其包括

(1)在卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将如权利要求1-10中任一项所述的连接子前体分子C的第一官能团与有机化合物A反应，生成具有如权利要求1-10中任一项所述的连接子前体分子的第二官能团的中间体D；和

(2)将所述第二官能团与带有标记的标记分子B反应。

27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述有机化合物A不包含反应功能性。

28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述连接子前体分子C的第一官能团与有机化合物A的多个位点反应，生成多个异构产物的混合物。

29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述标记包括独特的序列或荧光标签，或其组合。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述独特的序列包括单链DNA或RNA、双链DNA或RNA、三链DNA或RNA、多链天然寡核苷酸、多链人工寡核苷酸或化学修饰的寡核苷酸等。

31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述独特的序列包括寡核苷酸。

32.一种标记的有机化合物的库，其包括至少两种标记的有机化合物，每种标记的有机化合物通过如权利要求26-30中任一项所述的方法制得，其中独特的有机化合物用独特的标记进行标记。

33.如权利要求32所述的库，其包括至少10种独特的有机化合物，每种都用独特的标记进行标记。

34.如权利要求32所述的库，其包括至少50种独特的有机化合物，每种都用独特的标记进行标记。

35.如权利要求32-34中任一项所述的库，其特征在于，所述独特的标记为具有独特的序列的寡核苷酸。

36.一种鉴定与靶点结合的有机化合物的方法，其包括分析如权利要求32-35中任一项所述的库，根据其标记鉴定与靶点结合的有机化合物。

37.一种鉴定具有两个共轭双键的化合物的方法，所述方法包括

(1)在卡宾或氮宾或自由基反应条件下，将如权利要求1-10中任一项所述的连接子前体分子C的第一官能团与有机化合物A反应，生成产物或产物混合物，其中连接子前体分子的第二官能团未反应；和

(2)分析所述产物或产物混合物，其中一对歧化反应产物的存在表明有机化合物A具有两个共轭双键，其中所述一对歧化反应产物包括化合物F，其分子量为卡宾或氮宾或自由基反应的产物D的分子量加2，和化合物F’，其分子量为卡宾或氮宾或自由基反应的产物D的分子量减2。

38.一种治疗有需要的受试者的癌症、中风、心肌梗塞、神经退行性疾病或炎症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的木犀草素、柚皮苷、金丝桃苷、甘草黄苷、表儿茶素、表没食子儿茶素、瑞香素、F001、F002、F003或F006，或其衍生物。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述受试者具有BRCA1、BRCA2、PALB2或PTENT突变的癌细胞。

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述突变为失活突变。

如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述受试者具有与对应的正常细胞相比过表达PARP蛋白的癌细胞。

41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、萎缩性脊髓炎、艾滋病性痴呆和血管性痴呆，或其组合。

42.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述炎症与选自以下的疾病或病症相关：帕金森氏病、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、银屑病关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、狼疮、系统性红斑狼疮、幼年类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、爱迪生氏病、乳糜泻、皮肌炎、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、干燥综合征、I型糖尿病、血管炎、葡萄膜炎、动脉粥样硬化和强直性脊柱炎。

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