CN113209064A - 白花丹醌在制备预防或治疗帕金森病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于白花丹醌的新用途技术领域,本发明提供了白花丹醌在制备预防或治疗帕金森病药物中的应用。本发明通过细胞和动物实验观察了神经毒素MPP+/MPTP致帕金森病的毒性作用,以及白花丹醌拮抗MPP+/MPTP致帕金森病的毒性作用。经研究发现,白花丹醌能抑制神经毒素MPP+/MPTP所致的SH‑SY5Y和PC12神经细胞、多巴胺能神经元的死亡和运动功能障碍。这表明白花丹醌在预防和治疗帕金森病及神经保护方面有良好的应用前景和巨大的新药开发价值。
Description
技术领域
本发明涉及白花丹醌的新用途技术领域,尤其涉及白花丹醌在制备预防或治疗帕金森病药物中的应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见于老年人的渐进性神经系统退行性疾病,我国65岁以上人群的患病率大约是1.7%,其主要的临床症状为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和步态异常,非运动症状表现为睡眠障碍、便秘、抑郁、嗅觉减退等。这种疾病的主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的丢失和主要由α-突触核蛋白构成的路易小体(Lewy body)的形成。帕金森病的发病机制复杂,与线粒体功能障碍、氧化应激、α-突触核蛋白异常聚集、神经炎症、细胞自噬和环境暴露等密切相关。目前还没有有效的治疗方法,药物治疗主要是控制症状并且需要长期用药,但是长期用药导致药物功效丧失和严重不良反应,更重要的是仍不能阻止神经变性。因此,探讨PD发病的分子机制,寻找有效的干预药物,对于保护我国人民尤其是中老年人的身体健康和生活质量至关重要。
白花丹(Plumbago zeylanica Linn1)系白花丹科白花丹属植物,始载于《唐本草》,为白花丹科植物白花丹的全草及根,又名白雪花、白皂药、山波苓、一见消、乌面马、火灵丹、假茉莉、白花岩陀等,在我国各民族医药中都很常用,广西瑶医称:猛老虎、三钱三、比比娘,壮医称为“巅邦”或“裸端”。在我国产于台湾、福建、广东、广西、贵州南部、云南、四川等地,为民间常用药。该植物辛苦涩,性温,有毒。用于治疗风湿性关节疼痛,血瘀闭经,跌打损伤,肿毒恶疮,疥癣等症。白花丹醌(Plumbagin,PL)是白花丹的主要活性成分,具有抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗疟、抗菌、神经保护等多种药理学活性,但是对于白花丹醌在预防或治疗帕金森病方面的功效却没有任何研究。
发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术中存在的缺陷,提供白花丹醌在制备预防或治疗帕金森病药物中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了白花丹醌在制备预防或治疗帕金森病药物中的应用。
优选的,所述帕金森病具有神经元的死亡和运动功能障碍的症状。
优选的,所述神经元的死亡和运动功能障碍是由神经毒素MPP+/MPTP所致。
优选的,所述药物为注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液或片剂。
优选的,所述药物中还含有医学上可接受的辅料。
本发明通过细胞和动物实验研究发现:白花丹醌有防治帕金森病的效果,起到抑制帕金森病中多巴胺能神经元数目减少和运动功能障的一系列问题。白花丹醌的预防和治疗有效量,应按照治疗者的年龄、身体状况等确定。
本发明所述的白花丹醌是白花丹的主要活性成分之一,其具有抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗疟、抗菌、神经保护等作用,白花丹醌可以通过市售得到,也可以通过多种方法提取获得,提取方法成熟。
本发明通过细胞和动物实验观察了神经毒素MPP+/MPTP致帕金森病的毒性作用,以及白花丹醌拮抗MPP+/MPTP致帕金森病的毒性作用。经研究发现,白花丹醌能抑制神经毒素MPP+/MPTP所致的SH-SY5Y和PC12神经细胞、多巴胺能神经元的死亡和运动功能障碍。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
1.本发明提供了白花丹醌的医药新用途,本发明人通过大量试验发现,白花丹醌具有明显的神经保护作用,在动物体内外实验中证实白花丹醌能够保护PC12细胞和SH-SY5Y细胞、多巴胺能神经元免受神经毒素MPP+/MPTP的损伤。白花丹醌能抑制MPTP所致帕金森病的多巴胺神经元死亡和运动功能障碍。
2.白花丹醌作为结构明确的天然活性物质,毒性低,安全性好,能够对抗神经毒素MPP+/MPTP所致的帕金森病,故在预防和治疗帕金森病及神经保护方面有良好的应用前景和巨大的新药开发价值。
3.我国已进入老龄化社会,本发明对中老年帕金森病患者具有深远的意义,能起到预防或治疗帕金森病,提高患者生活质量,延长寿命等作用。
附图说明
图1为CCK-8法检测白花丹醌对MPP+致PC12细胞存活率下降的拮抗作用(n=5)(注:数据以平均值±SEM表示,***P<0.001,**P<0.01);
图2为CCK-8法检测白花丹醌对MPP+致SH-SY5Y细胞存活率下降的拮抗作用(n=5)(注:数据以平均值±SEM表示,***P<0.001,**P<0.01);
图3为白花丹醌对MPTP诱导的亚急性PD模型致小鼠运动能力下降的保护作用(n=15)(注:数据以平均值±SEM表示,***P<0.001,**P<0.01);
图4为免疫荧光检测检测的MPTP诱导的亚急性PD模型致黑质神经元死亡情况;
图5为白花丹醌对MPTP诱导的亚急性PD模型致黑质多巴胺神经元存活率下降的保护作用(n=3)(注:数据以平均值±SEM表示,***P<0.001);
图6为白花丹醌对MPTP-丙磺舒诱导的慢性PD模型致小鼠运动能力下降的保护作用(n=15)(注:数据以平均值±SEM表示,***P<0.05,**P<0.01,*P<0.05);
图7为免疫荧光检测检测的MPTP-丙磺舒诱导的慢性PD模型致黑质神经元死亡情况;
图8为白花丹醌对MPTP-丙磺舒诱导的慢性PD模型致黑质多巴胺神经元存活率下降的保护作用(n=3)(注:数据以平均值±SEM表示,***P<0.05,**P<0.01)。
具体实施方式
下面结合实验例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验例1
研究白花丹醌拮抗MPP+对PC12细胞和SH-SY5Y细胞神经毒性。
实验材料为:白花丹醌(美国Sigma公司)、MPP+(美国Sigma公司)、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12、SH-SY5Y细胞、RPMI 1640培养基(Gibco公司)、胎牛血清FBS(Gibco公司)、马血清(Gibco公司)、Ham’s F-12、丙酮酸钠溶液、MEM非必须氨基酸溶液、谷氨酰胺添加剂、100IU/ml青链霉素混合液、Cell Counting Kit-8(东仁化学科技(上海)有限公司)。
实验分组为:实验设为正常对照组(A)、MPP+染毒组(B)、白花丹醌低剂量保护组(C)、白花丹醌中剂量保护组(D)、白花丹醌高剂量保护组(E)、白花丹醌低剂量对照组(F)、白花丹醌中剂量对照组(G)、白花丹醌高剂量对照组(H)。其中对照组(A)不给药,给予生理盐水,MPP+染毒组(B)给予500μM或1000μM,白花丹醌低剂量保护组(C)给予0.01μM白花丹醌+MPP+,白花丹醌中剂量保护组(D)给予给予0.1μM白花丹醌+MPP+,白花丹醌高剂量保护组(E)给予给予1μM白花丹醌+MPP+,白花丹醌低剂量对照组(F)、白花丹醌中剂量对照组(G)、白花丹醌高剂量对照组(H)分别给予白花丹醌0.01μM、0.1μM、1μM。
采用统计软件SPSS 22.0和GraphPad Prism8.0进行数据分析,数据以均数±标准差(mean±SD)形式表示,计量资料采用t检验进行两两比较,采用单因素方差分析进行组间数据比较。以P<0.05作为差异有统计学意义。
(1)将T25培养瓶中长至80-90%的PC12细胞吹下来收集于离心管中,1000g离心4min,加1mL完全培养液重悬,血细胞计数板计数,取5×103个PC12细胞接种至96孔板并置培养箱中培养24h;按实验分组加0.01μM、0.1μM、1μM的白花丹醌溶液预处理,5%CO2,37℃培养24h;再按分组分别加500μM MPP+共同处理24h,CCK-8法测PC12细胞存活率,使用酶标仪在450nm处读取吸光度。结果如图1所示。
由图1可知,与正常对照组(A)相比,MPP+染毒组(B)PC12细胞存活率下降,差异有统计学意义(P<0.001)。白花丹醌中剂量保护组(D)能显著抑制MPP+染毒引起的PC12细胞存活率下降,差异有统计学意义(P<0.01)。
(2)将T25培养瓶中长至80-90%的SH-SY5Y细胞用胰酶消化下来并收集于无菌离心管中,1000g离心4min,加1mL完全培养液重悬,血细胞计数板计数,取5×103个SH-SY5Y细胞接种至96孔板并置培养箱中培养24h,按实验分组加0.01μM、0.1μM、1μM的白花丹醌溶液预处理,5%CO2,37℃培养24h;再按分组分别1000μM MPP+共同处理24h,CCK-8法测SH-SY5Y细胞存活率,使用酶标仪在450nm处读取吸光度。结果如图2所示。
由图2可知,与正常对照组(A)相比,MPP+染毒组(B)SH-SY5Y细胞存活率下降,差异有统计学意义(P<0.001)。白花丹醌中剂量保护组(D)能显著抑制MPP+染毒引起的SH-SY5Y细胞存活率下降,差异有统计学意义(P<0.01)。
实验例2
研究白花丹醌对MPTP诱导的亚急性和慢性帕金森小鼠神经元死亡和运动功能障碍的影响。
实验材料为:白花丹醌(美国Sigma公司)、MPTP(美国Sigma公司)、TH单克隆抗体(EMD Millipore公司)、荧光二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、山羊血清原液(北京中杉金桥生物技术有限公司)、转棒疲劳测试仪(上海欣软信息科技有限公司)、旷场实验箱(上海欣软信息科技有限公司)、冰冻切片机(德国徕卡公司)、正置荧光显微镜(奥林巴斯公司)。
实验动物及分组为:成年雄性3月龄C57BL/6小鼠,随机分为4组,每组15只,分别为正常对照组、MPTP染毒组、白花丹醌保护组、白花丹醌对照组。其中对照组不给药,给予生理盐水,MPTP染毒组给予25mg/kg MPTP,白花丹醌保护组给予白花丹醌5mg/kg+MPTP 25mg/kg,白花丹醌对照组给予白花丹醌5mg/kg。
采用统计软件SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0进行数据分析,数据以均数±标准差(mean±SD)形式表示,计量资料采用t检验进行两两比较,采用单因素方差分析进行组间数据比较。以P<0.05作为差异有统计学意义。
行为学检测
转棒实验:首先将小鼠放置在滚轴上,然后逐渐调整滚轴转速30rmp/min并开始计时,当小鼠掉落滚轴时停止计时,记录小鼠从转棒仪上掉落的时间,小鼠若没有掉下来则记为5min。共检测5次,取平均值作为最终试验结果。
旷场实验:提前3天将小鼠置于50cm×50cm×25cm旷场内让其适应,实验时将小鼠置于旷场内,让其自由活动20min,摄像头记录小鼠的运动路径、运动总距离。每只小鼠实验结束后,彻底清理小鼠粪便、尿液等,用75%酒精擦拭箱底以免留下气味对下一只小鼠产生影响。
免疫荧光TH染色:各组小鼠麻醉后经心脏灌流固定,断头取脑,对脑组织进行连续冠状切片,取黑质部位切成,进行免疫荧光染色。用免疫组化笔圈出脑组织,脑片上滴加1%SDS抗原修复5min,0.3%TritonX-100破膜10min,10%山羊血清室温封闭1h,加鼠抗TH(1:250)4℃冰箱孵育过夜,一抗孵育过夜后,加荧光二抗(1:400)室温孵育1h,再滴加DAPI(10ug/mL)染核10min,以上每一步均用0.01mol/L的PBS洗三次,每10min,最后在载玻片上滴加1-2滴抗荧光淬灭剂,用干净盖玻片从一端往另一端轻轻盖下,避免产生气泡,然后在盖玻片四周涂上指甲油封片。用OLYMPUS正置荧光显微镜观察拍照及图像,使用ImageJ软件进行图像处理。
(1)MPTP诱导的亚急性PD模型:将3月龄C57雄性小鼠分4组,每组15只,分别为正常对照组,PD模型组,PL+PD模型组,PL对照组。PL对照组和PL+PD模型组灌胃PL(5mg/kg),正常对照组和PD模型组灌胃空白溶剂,连续14天;第15天开始,各组灌胃1小时后,PD模型组和PL+PD模型组按25mg/kg腹腔注射MPTP,正常对照组和PL对照组则腹腔注射生理盐水,持续7天;第22天开始,各组继续灌胃14天。检测运动能力后(转棒、旷场实验检测),牺牲小鼠,取中脑腹内侧组织,免疫荧光检测检测黑质神经元死亡情况。结果如图3(其中,A为实验前各组在转棒上的运动时间,B为实验后各组在转棒上的运动时间,C为实验前各组在旷场中运动的总距离,D为实验后各组在旷场中运动的总距离)、图4和图5所示。
由图3可知,与正常对照组相比,MPTP染毒组小鼠的运动能力下降,在转棒上的运动时间减少,在旷场中运动的总距离也明显减少,差异均有统计学意义(P<0.001)。白花丹醌保护组能抑制MPTP染毒组引起的小鼠运动能力下降,白花丹醌保护组小鼠在转棒上的运动时间与MPTP染毒组相比有显著差异(P<0.001),与正常对照组相比,没有显著差异(P>0.05)。白花丹醌保护组小鼠在旷场中运动的总距离与MPTP染毒组相比有显著差异(P<0.01),与正常对照组相比,没有显著差异(P>0.05)。
由图4和图5可知,与正常对照组相比,MPTP染毒组小鼠黑质多巴胺神经元存活率下降,差异有统计学意义(P<0.001)。说明白花丹醌保护组能抑制MPTP染毒引起的小鼠黑质多巴胺神经元存活率下降,差异有统计学意义(P<0.001)。
(2)MPTP-丙磺舒诱导的慢性PD模型:将3月龄C57雄性小鼠分4组,每组15只,分别为正常对照组,PD模型组,PL+PD模型组,PL对照组。PL对照组和PL+PD模型组灌胃PL(5mg/kg),正常对照组和PD模型组灌胃空白溶剂,连续14天;第15天开始,各组灌胃1小时后,PD模型组和PL+PD模型组小鼠腹腔注射丙磺舒250mg/kg(溶解于0.03mL DMSO),30min后皮下注射MPTP 25mg/kg,而正常对照组和PL对照组则腹腔注射生理盐水,共注射10次,持续时间为5周,同时PL和空白溶剂继续灌胃49天。检测运动能力后(转棒、旷场实验检测),牺牲小鼠,取中脑腹内侧组织,免疫荧光检测检测黑质神经元死亡情况。结果如图6(其中,A为实验前各组在转棒上的运动时间,B为实验后各组在转棒上的运动时间,C为实验前各组在旷场中运动的总距离,D为实验后各组在旷场中运动的总距离)、图7和图8所示。
由图6可知,与正常对照组相比,MPTP染毒组小鼠的运动能力下降,在转棒上的运动时间减少,在旷场中运动的总距离也明显减少,差异均有统计学意义(P<0.001)。白花丹醌保护组能抑制MPTP染毒组引起的小鼠运动能力下降,白花丹醌保护组小鼠在转棒上的运动时间与MPTP染毒组相比有显著差异(P<0.01),与正常对照组相比,没有显著差异(P>0.05)。白花丹醌保护组小鼠在旷场中运动的总距离与MPTP染毒组相比有显著差异(P<0.05),与正常对照组相比,没有显著差异(P>0.05)。
由图7和图8可知,与正常对照组相比,MPTP染毒组小鼠黑质多巴胺神经元存活率下降,差异有统计学意义(P<0.001)。说明白花丹醌保护组能抑制MPTP染毒引起的小鼠黑质多巴胺神经元存活率下降,差异有统计学意义(P<0.01)。
从以上实验例可以看出,白花丹醌能抑制MPTP所致的神经元存活率下降和运动能力下降,白花丹醌对MPP+/MPTP所致神经毒性具有良好的抑制作用。说明白花丹醌能抑制MPP+/MPTP所致的帕金森病症状,可用于制备预防或治疗帕金森病的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.白花丹醌在制备预防或治疗帕金森病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的白花丹醌在制备防治帕金森病药物中的应用,其特征在于,所述帕金森病具有神经元的死亡和运动功能障碍的症状。
3.根据权利要求2所述的白花丹醌在制备防治帕金森病药物中的应用,其特征在于,所述神经元的死亡和运动功能障碍是由神经毒素MPP+/MPTP所致。
4.根据权利要求3所述的白花丹醌在制备防治帕金森病药物中的应用,其特征在于,所述药物为注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液或片剂。
5.根据权利要求4所述的白花丹醌在制备防治帕金森病药物中的应用,其特征在于,所述药物中还含有医学上可接受的辅料。
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