CN103458902A - Tlr激动剂和联合治疗的治疗应用 - Google Patents
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Abstract
本发明通常涉及TLR激动剂优选TLR8激动剂的制剂,和其在各种疾病治疗中的应用,包含治疗癌症的联合治疗。
Description
相关应用的交叉参考
本申请要求2010年10月1日提交的美国临时申请号61/388,953,2010年10月1日提交的美国临时申请号61/388,967和2010年10月6日提交的美国临时申请号61/390,447的优先权和权益,其内容通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及TLR激动剂优选TLR8激动剂的制剂,和包含给予TLR8激动剂和抗癌剂以用于治疗癌症的联合治疗。
技术背景
包含刺激先天免疫和获得性免疫之一或两者的免疫系统刺激是复杂的现象,能引起对宿主保护或有害的生理结果。近年来对先天免疫机理的研究兴趣不断上升,其被认为能够引发和促进获得性免疫。这些兴趣的提升部分是由于最近发现的被称为Toll样受体(TLR)的高度保守模式识别受体蛋白家族,认为所述蛋白家族作为病原相关分子模式(PAMP)的受体参与先天免疫。因此对用于调节先天免疫的组合物和方法有巨大兴趣,因为其能影响病症的治疗方案,所述病症涉及癌症、传染病、自身免疫、炎症、过敏、哮喘、移植物排斥、移植物抗宿主病(GvHD)和免疫缺陷。
Toll样受体(TLR)是I型跨膜蛋白家族,所述I型跨膜蛋白的体内激活引起涉及特定细胞因子、趋化因子和生长因子的先天免疫反应。虽然所有TLR能够活化某些胞内信号分子,如核因子κB(NF-kB)和促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶),但是释放的特定细胞因子和趋化因子组似乎对每种TLR独特。TLR7、8和9包含一个TLR亚家族,其位于免疫细胞如树突细胞和单核细胞的内体或溶酶体中。与在浆细胞样树突细胞(pDC)中高表达的TLR7和9相反,TLR8主要在骨髓DC(mDC)和单核细胞中表达。这个亚家族调节微生物核酸如单链RNA的识别。TLR8激动剂刺激生成多种炎性细胞因子,包含白介素-6、白介素-12、肿瘤坏死因子α和干扰素γ。这些激动剂也促进共刺激分子如CD40、CD80、CD83、和CD86、主要组织相容性复合物分子、和趋化因子受体的表达增加。TLR8激动剂活化后细胞也生成所述I型干扰素IFNα和IFNβ。
类似嘌呤核苷酸腺嘌呤和鸟嘌呤的小、低分子量(小于400道尔顿)合成咪唑喹啉化合物,是要鉴定的第一TLR7和TLR8激动剂。已经证实许多这些化合物有抗病毒和抗肿瘤的性质。例如,TLR7激动剂咪喹莫特(ALDARATM)被美国食品药品管理局批准作为治疗由某些人乳头瘤病毒株引发的皮肤损伤的局部药剂。咪喹莫特也对治疗原发皮肤癌和皮肤肿瘤如基底细胞癌、角化棘皮瘤、光化角质骨骼和博温病有用。正在评估TLR7/8激动剂瑞喹莫德(R-848)作为治疗人类生殖器疱疹的局部药剂。
多柔比星是用于癌症化疗的药物。其是蒽环类抗生素,与天然产物道诺霉素密切相关,并且类似所有的蒽环类抗生素,其通过插入DNA起作用。多柔比星通常用于治疗广泛的癌症,包含血液恶性肿瘤、很多类型的癌和软组织肉瘤。
发明内容
本发明通常涉及包含给予苯并[b]氮杂TLR8激动剂和一种或多种其他治疗方法例如抗癌剂(如多柔比星)的联合治疗,所述抗癌剂用于治疗、缓解或预防癌症优选实体瘤(如肉瘤、癌(carcinomas)和淋巴瘤),以及用于其他应用,包含治疗白血病、治疗某些皮肤病症或疾病如特应性皮炎、治疗传染病优选病毒性疾病、和用作配制用于治疗癌症和治疗传染病的疫苗中的佐剂。特别地,本发明涉及包含苯并[b]氮杂TLR8激动剂、VTX-2337和多柔比星的方法和组合物。在优选实施方式中,VTX-2337和多柔比星用于治疗癌症,并且所述癌症选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌、黑素瘤和淋巴瘤或其任意组合。
优选以浓度约0.001mg/ml-约50mg/ml、约0.01mg/ml-约50mg/ml、约0.5mg/ml-约50mg/ml、约1mg/ml-约40mg/ml或约2mg/ml-约15mg/ml配制VTX-2337。在某些实施方式中,以浓度约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约8mg/ml、约0.5mg/ml-约6mg/ml、约0.5mg/ml-约4mg/ml、或约0.5mg/ml-约2mg/ml配制VTX-2337。在某些实施方式中,以浓度约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约4mg/ml、约6mg/ml、约8mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml或约50mg/ml配制VTX-2337。优选地,所述制剂包含约1-30%、5-15%或5-10%重量/体积(w/v)的环糊精,优选β-环糊精,和最优选磺基丁基醚β-环糊精。在某些实施方式中,制剂包含约1%、5%、10%、15%、20%、25%或30%重量/体积的环糊精,优选β-环糊精,最优选磺基丁基醚β-环糊精。在一个特定实施方式中,所述制剂是一种包含浓度至少为2mg/ml的VTX-2337的水溶液。在其他实施方式中,所述制剂包含15%重量/体积的环糊精,优选β-环糊精,和最优选磺基丁基醚β-环糊精。在优选的实施方式中,所述制剂适合注射哺乳动物,优选人。在特定实施方式中,注射是通过皮下途径、肌肉内途径或透皮途径。在某些实施方式中,所述制剂适合静脉内给药。
优选地,所述重建制剂适合注射哺乳动物,优选人。在特定实施方式中,注射是通过皮下途径、肌肉内途径或透皮途径。在特定实施方式中,所述制剂适合静脉内给药。
本发明还提供了通过给予对象(优选人对象)包含环糊精的多柔比星和TLR8激动剂VTX-2337以治疗癌症的方法。在优选的实施方式中,联合给予VTX-2337与一种或多种其他治疗方案,其中所述方案选自化疗剂、细胞因子、抗体、激素治疗或放疗。在一个实施方式中,给予VTX-2337作为治疗实体瘤方案的一部分。在其他实施方式中,所述实体瘤是选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌、或淋巴瘤或其任意组合的癌症形式。在一个实施方式中,给予VTX-2337作为治疗淋巴瘤方案的一部分。在一个实施方式中,所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤。在另一个实施方式中,所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。在另一个实施方式中,VTX-2337用作治疗癌症的疫苗佐剂。在某些治疗癌症方法的实施方式中,通过注射或静脉内给予VTX-2337。在特定实施方式中,注射是通过皮下途径、肌肉内途径或透皮途径。在特定实施方式中,通过皮下注射给予所述制剂。
在某些治疗癌症方法的实施方式中,以剂量约0.02-10mg/kg对象体重(如约0.05-0.075mg/kg,或约0.04-5mg/kg)给予所述对象VTX-2337。在某些实施方式中,VTX-2337以剂量约.02mg/kg、约0.05mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg或约5mg/kg给予。例如,假设所述对象体重约70kg,VTX-2337以剂量约1.4mg-700mg(如3.5mg-5.25mg,或约2.8-350mg)给予。在某些其他实施方式中,每周或每两周给予对象VTX-2337。
本发明也提供了某种药包或药盒,所述药包或药盒包含一种或多种装有本发明用于治疗癌症或者其一种或多种症状的液体或冻干VTX-2337和抗癌剂(如多柔比星)的容器。所述液体或冻干VTX-2337和抗癌剂(如多柔比星)能包装在所述药盒的相同或不同容器中。优选地,所述VTX-2337制剂包含约1-30%、5-15%或5-10%w/v的环糊精,优选β-环糊精,和最优选磺基丁基醚β-环糊精。在某些实施方式中,所述VTX-2337制剂包含约2%、5%、10%、15%、20%、25%或30%w/v的环糊精,优选β-环糊精,和最优选磺基丁基醚β-环糊精。在特定实施方式中,所述制剂是VTX-2337的液体制剂。优选地,以浓度至少2mg/ml配制VTX-2337,并且所述制剂不论是液体或重建冻干制剂,都适用于哺乳动物优选人的皮下注射。
在一个实施方式中,以浓度至少2mg/ml制备VTX-2337。此外,所述制剂适于向对象(所述对象优选是人)通过注射和通过皮下、肌肉内或透皮注射给药。在某些实施方式中,以约0.02-10mg/kg的剂量、约0.04-5mg/kg的剂量或约0.05-0.075mg/kg的剂量给予对象VTX-2337。在某些其他实施方式中,每周或每两周给予VTX-2337。
在优选的实施方式中,联合给予VTX-2337与一种或多种其他治疗方案,其中所述方案选自化疗剂、细胞因子、抗体、激素治疗或放疗。本发明也提供了治疗由病毒引起的传染病的方法,其中所述病毒是肝炎病毒。
在优选实施方式中,配制多柔比星以用于注射,最优选静脉内给药。在某些实施方式中,配制本发明VTX-2337以用于通过皮内、透皮、皮下或肌肉内途径给药。
在某些治疗癌症方法的实施方式中,以剂量约0.02-10mg/kg体重或约0.04-5mg/kg对象体重将多柔比星给予所述对象。
本发明也提供了用低剂量苯并[b]氮杂TLR8激动剂制剂治疗癌症的方法。所述方法包含给予需要对象剂量低于0.007mg/kg/周(如0.002mg/kg/周-0.006mg/kg/周)的苯并[b]氮杂TLR8激动剂。在一个实施方式中,所述苯并[b]氮杂TLR8激动剂是2-氨基-N,N-二丙基-8-(4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂-4-羧酰胺。所述方法可以包含给予苯并[b]氮杂TLR8激动剂作为唯一活性成分,或还包含给予第二治疗剂如与低剂量苯并[b]氮杂TLR8激动剂制剂组合的抗癌药。所述第二治疗剂能是另一种苯并[b]氮杂TLR8激动剂或本文公开的药物分子(如多柔比星、吉西他滨或环磷酰胺)。也能在治疗癌症的方案中联合一种或多种其他治疗方案(如放疗)进行所述方法。
另一方面,本发明也提供了包含苯并[b]氮杂TLR8激动剂的皮下剂型以治疗对象癌症,其中将剂量为2-4mg/m2的激动剂给予人后,皮下剂型提供的所述激动剂的AUC0-inf是约55–约90h*ng/mL,如约60–约80h*ng/mL。另一方面,本发明也提供了包含苯并[b]氮杂TLR8激动剂的皮下剂型以治疗对象癌症,其中将剂量为2-4mg/m2的激动剂给予人后,皮下剂型提供的所述激动剂的C最大是约10–约30ng/mL,如约15–约25ng/mL。
本发明也提供了包含苯并[b]氮杂TLR8激动剂(如VTX-2337)和抗癌剂(如多柔比星)的液体或冻干制剂的药物组合物。所述激动剂和抗癌剂的制剂能在相同的药物组合物或不同的组合物中,该情况下所述激动剂和抗癌剂的制剂能同时或顺序给予。
上面的描述相对广泛列出本发明更重要的特性,从而可以理解下面的详细说明,并且可以更好理解对本领域的贡献。结合实施例考虑下面的详细描述使本发明的其他目标和特性显而易见。
附图说明
图1A是一组来自NSG-HIS小鼠的淋巴造血细胞获得的FACS图像。NSG小鼠接受脐带血源性人造血CD34+干细胞。显示了人细胞移植(CD45+、CD45+CD14+、CD45+CD33)的水平。用0.5或5mg/kg的VTX-2337处理小鼠。显示了CD14+细胞(CD83,CD86)的成熟。
图1B的一组柱状图显示SC给予NSG-HIS小鼠VTX-2337后6小时,单核细胞(CD45+CD14+)、mDC(CD45+CD11c+)和pDC(CD45+CD123+)上活化标记(CD86+,II型MHC)水平变化。
图1C的一组柱状图显示SC给予NSG-HIS小鼠VTX-2337后6小时,血浆细胞因子水平(INF-g、TNF-α、IL-12和IL-10)变化。
图2的一组柱状图显示用Doxil治疗后第5天,没有接受治疗(对照(CTRL))、接受最大耐受剂量(MTD,50mg/m2)Doxil(盐酸多柔比星脂质体注射剂)或5mg/kgVTX-2337的小鼠中血浆细胞因子水平(IFN-g、IL-10、TNF-α)变化。
图3A显示在用人卵巢癌细胞系OVCAR5生成肿瘤的人源化小鼠(NSG-HIS)卵巢癌模型中,用Doxil、VTX-2337或其组合治疗NSG-HIS小鼠的方案。
图3B的线形图显示接种OVCAR5细胞后,用50mg/m2Doxil、0.5mg/kgVTX-2337或其组合治疗的NSG-HIS小鼠中随着时间的肿瘤大小变化。
图3C的一组IHC图像显示在人源化卵巢癌模型中,用50mg/m2Doxil、0.5mg/kgVTX-2337或其组合治疗的小鼠所得CD45+细胞浸润的肿瘤。图3D的一组柱状图显示在人源化卵巢癌模型中,用50mg/m2Doxil、0.5mg/kg VTX-2337或其组合治疗的小鼠中,肿瘤浸润CD3+、CD8+、CD69+活化的CD3+CD8+T细胞和CD40+活化的巨噬细胞(CD45+CD11b+)、pDC(CD45+CD123+)和mDC(CD45+CD11c+)水平变化。
图4A的线形图显示了响应效应TIL与靶标OVCAR5细胞的不同比率,由TIL裂解的裂解51Cr标记OVCAR5细胞的每分钟计数(cpm)变化,所述TIL从Doxil或VTX-2337和Doxil组合治疗的小鼠中扩增。
图4B的线形图显示NSG-HIS小鼠中随着时间的肿瘤大小变化,所述小鼠用OVCAR5细胞接种,并用来自图3所述实验小鼠的过继转移(adoptively transfer)TILS治疗。
图4C的一组线形图显示由来自用Doxil或VTX-2337和Doxil组合治疗小鼠的TIL(有或没有抗I型MHC(MHCI)中和抗体)裂解的裂解51Cr标记OVCAR5细胞计数变化。
图4D的一组柱状图显示用OVCAR5细胞或黑素瘤细胞所孵育TIL释放的IFNg水平变化。
图5A的柱状图显示用来自人PBMC的条件培养基处理的OVCAR5细胞中,膜联蛋白-V和7AAD染色的凋亡细胞百分比变化,所述人PBMC用单独缓冲液、CD3/CD28珠或1μg/mL VTX-2337孵育。
图5B的柱状图显示用来自人PBMC的条件培养基处理的OVCAR5细胞中活细胞数目变化,所述人PBMC用单独缓冲液、CD3/CD28珠或1ug/mL VTX-2337孵育。
图5C是显示OVCAR5细胞上TNFα受体1表达的western印迹膜的图片。
图5D的一组图显示用TNFα(10ng/ml)或Doxil(1μg/ml)或其组合处理的OVCAR5细胞,以及用膜联蛋白-V和7AAD染色的所得凋亡细胞百分比变化的FACS图像。
图5E是显示用0.5或2.5μg/mL Doxil处理的OVCAR5细胞上FLIPL表达的western印迹膜的图片。
图5F的一组图显示用10μg/ml环己酰亚胺(cyclx)预培养24h并且然后用10或50ng/ml TNFα处理的OVCAR5细胞,以及用膜联蛋白-V和7AAD染色的所得凋亡细胞百分比结果变化的FACS图像。
图6的一组图显示来自15个健康供体的外周血单核细胞(PBMC)以及用TLR8或TLR7和NF-κB驱动报道基因转染的HEK293细胞中,VTX-2337的潜能和选择性。
图7的一组图显示VTX-2337刺激人全血中一定范围的细胞因子和趋化因子。
图8的一组图显示VTX-2337活化单核细胞和髓细胞性树突细(mDC)但不是浆细胞树突细胞(pDC)。
图9是显示皮下给药后VTX-2337药代动力学的图片。这个图中数字标记“1-8”分别对应组(Cohort)1-8。
图10A和10B显示随着多个治疗周期的一致药效学反应。
发明详述
下面所附说明中详细描述了本发明的一种或多种实施方式。虽然与本文所述类似或等同的任何方法和材料也能用于实施或测试本发明,但描述了优选的方法和材料。通过描述,本发明的其它特征、目的和优点是显而易见的。在说明书中,单数形式也包含多数形式,除非上下文中另有明确说明。除非另有说明,本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。在抵触的情况下,以本说明书为准。
本发明提供了使用苯并[b]氮杂TLR8激动剂(如VTX-2337)和另一种治疗方案(例如抗癌剂如多柔比星)以治疗、缓解或预防本文公开的癌症或其他疾病的组合物和方法。VTX-2337是一种新型、有效和选择性的小分子TLR8激动剂。VTX-2337制剂描述在PCT国际公开WO10/014913中。本发明的制剂适用于如本文所述治疗人癌症的方法。
除非另有说明,应理解,本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不意在构成限制。在本说明书和下面的权利要求书中,参考许多术语,这些术语具有以下定义:
本发明内容中的“对象”优选哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、或牛,但不限于这些例子。对象可以是雄性或雌性。对象能是原先诊断或鉴定有癌症,并且可选已经接受,或正在接受癌症的治疗干预,如Doxil治疗或放射治疗。或者,对象也可以原先未诊断有癌症,而具有发生所述病症的风险。例如,对象能显示癌症的一种或多种病症。
术语“疾病”、“紊乱”和“病症”在本文中可互换使用,其指对正常身体功能的任何破坏,或出现任何种类的病变。造成正常生理破坏的病因可能已知或未知。此外,虽然两个患者可能被诊断为相同病症,这些个体表现出的特定症状可能相同或不同。
本文所用的术语“治疗”和“处理”指减少症状的严重性和/或频率、消除症状和/或根本原因、预防症状的发生和/或它们的根本原因、以及改善或消除损伤。例如,通过给予本发明抗癌剂来治疗患者包含易发展癌症的患者(例如,由于基因倾向、环境因素等引起的高风险)和/或有癌症复发风险的癌症幸存者中的化学预防,以及通过抑制紊乱或疾病或使之消退以双重治疗癌症患者。
本文使用的术语“缓解”或“改善”指缓解疾病、紊乱或病症的至少一种症状。
本文使用的术语“预防”包含预防或减缓临床上显著疾病进展的开始,或者在风险个体中预防或减缓疾病的临床前显著阶段开始。这包含对有发生病症风险的个人的预防性治疗。
当涉及本发明化合物时,申请人意指术语“化合物”不仅包含特定分子实体,也包含其药物上可接受的、药理学上活性的类似物,包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、偶联物、活性代谢物和其他此类衍生物、类似物和有关化合物。
术语“有效量”和“治疗有效量”的本发明化合物指无毒但足以提供所需效果的药物或药剂的量。
“药学上可接受”指生物学或其它方面没有不良影响的材料,例如所述材料可以整合到给予患者的药物组合物中,而不引起任何不良的生物学作用或不与包含其的所述组合物中任何其它成分以有害方式发生相互作用。当术语“药学上可接受”用于指药物运载体或赋形剂时,其表示所述运载体或赋形剂符合毒理学和生产测试的所需标准或其包含于美国食品药品管理局制定的非活性成分指南。在“药理学活性”的衍生物或类似物中的“药理学活性”(或简单的“活性”)指有与本专利化合物相同类型和大致相等程度的药理学活性的衍生物或类似物。
在“根据所需给药”或“有需要的”中的“根据所需”意思是当观察到症状时、或当预期病症要出现、或患者和/或治疗医生认为适合治疗(治疗性或预防性)不需要病症(例如,癌症引发的病症)的任何时候,给予患者制剂。
本发明TLR激动剂
1.1制剂
VTX-2337制剂包含有下面结构的活性化合物。本发明制剂适于皮下给予对象(优选人对象),但能用于其它方法给药。
本发明所述VTX-2337制剂包含一种或多种药学上可接受赋形剂。
本文使用的术语赋形剂广泛指与制剂的活性试剂联用的生物学上无活性物质。
赋形剂能使作例如增溶剂、稳定剂、稀释剂、惰性运载体、防腐剂、粘结剂、崩解剂、涂料剂、调味剂或着色剂。优选地,选择至少一种赋形剂以向制剂提供一种或多种有益的物理性质,如增加活性试剂的稳定性和/或溶解性。本文所述的VTX-2337在本发明制剂中是主要的活性试剂。然而,可用本文所述其他活性剂如其他TLR激动剂、抗癌剂或抗病毒剂制备VTX-2337。
“药学上可接受”赋形剂是由州或联邦管理机构批准在动物优选人中使用的,或在美国药典、欧洲药典或其他公认药典中所列举用于动物,优选用于人的那些。
赋形剂的例子包括某些惰性蛋白如白蛋白、亲水性聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮;氨基酸如天冬氨酸(可替代性称为天冬氨酸盐)、谷氨酸(可替代性称为谷氨酸盐)、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸和组氨酸;脂肪酸和磷脂如烷基磺酸盐和辛酸酯;表面活性剂如十二烷基硫酸钠和聚山梨酯;非离子型表面活性剂如 或聚乙二醇(PEG);碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、海藻糖和糊精,包括环糊精;多元醇如甘露醇和山梨糖醇;螯合剂如EDTA;和成盐的抗衡离子如钠。
VTX-2337制剂可以包含增加TLR激活剂水溶性的环糊精。环糊精是α-D-吡喃葡萄糖的晶体状、非吸湿性的环形低聚物。由于连接吡喃葡萄糖单元的键缺少旋转,环糊精不是圆柱形而为环形。因为这种受限旋转,它们有带中心空腔的刚性结构,中央腔的大小根据分子中吡喃葡萄糖单元的数量而不同。最常见的三种环糊精是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精,分别由6、7或8个吡喃葡萄糖单元组成。由于环糊精分子内的羟基排列和分子的形状,腔的内表面是疏水性的,而外表面是亲水性的。伯羟基位于环形分子的窄侧(内侧),而仲羟基位于宽侧(外侧)。这种组合使环糊精能够通过形成包合络合物而在疏水性腔中容纳(accommodate)大量疏水小分子。
用于本发明制剂的合适环糊精为本领域已知。例如,TRAPPSOLTM和其它环糊精由CTD有限公司(CTD,Inc)(佛罗里达州高泉(High Springs,FL))生产,以及(磺基丁基醚β-环糊精)在市售可得注射剂如ABILIFY IMTM、GEODON、和VFEND IV中出现。优选地,用于本发明制剂。
可以使用其他增溶水剂。其它所述试剂的例子包含聚乙烯吡咯酮、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K12、吐温80、乙醇、克列莫佛(Cremophor)/乙醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400和聚丙二醇。在优选的实施方式中,本发明制剂包含少于10%体积/体积的此类溶剂。在某些实施方式中,使用油基增溶剂如碘化油或花生油。
在某些实施方式中,VTX-2337制剂可制成液体或固体形式如粉剂、片剂、丸剂或胶囊。液体制剂可以是诸如油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式,可含有制剂,如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。在一个实施方式中,所述制剂是水溶液。在另一个实施方式中,最终制剂是冻干的。在其它实施方式中,所述制剂包含胶体药物递送系统。此药物递送系统包括例如,脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊。
在一个实施方式中,VTX-2337是适于注射哺乳动物(优选人)的液体或冻干制剂。在一个实施方式中,所述制剂无菌。在另一个实施方式中,所述制剂是用一定量的水性运载体重建后适于注射的无菌冻干制剂。在一个实施方式中,所述液体或冻干制剂制备成如下述的单位剂型。所述制剂可以包含或不包含加入的防腐剂。
在某些实施方式中,VTX-2337还包含一种或更多种佐剂。合适佐剂的例子包括免疫反应的增强剂如微生物衍生物(例如,细菌产物、毒素如霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定毒素、脂质、脂蛋白、核酸、肽聚糖、碳水化合物、多肽)、细胞、细胞因子(例如,树突细胞、IL-12和GM-CSF)、激素和小分子。佐剂包括但不限于油基佐剂(例如,弗氏佐剂)、CpG寡核苷酸、铝盐佐剂、钙盐佐剂、乳剂和基于表面活性剂的制剂(例如,MF59、ASO2、蒙塔尼、ISA-51、ISA-720和QA21)。
根据某些实施方式,以浓度约0.5–约50mg/ml制备VTX-2337。在一些实施方式中,以浓度约1mg/ml–约5mg/ml、约1mg/ml–约10mg/ml、约1mg/ml–约20mg/ml、或约1mg/ml–约30mg/ml制备所述苯并[b]氮杂TLR激动剂。在其他实施方式中,以浓度约0.5mg/ml–约1mg/ml、约0.5mg/ml–约2mg/ml、或约0.5mg/ml–约5mg/ml制备VTX-2337。在某些实施方式中,以浓度0.5-10mg/ml、0.5-5mg/ml或1-5mg/ml制备VTX-2337。在其他实施方式中,以浓度10-20mg/ml、20-30mg/ml、或30-50mg/ml制备VTX-2337。在特定实施方式中,以浓度约1mg/ml、约2mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约8mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml或约40mg/ml制备VTX-2337。
VTX-2337制剂可选制备成单位剂型。“单位剂型”指适于目标用途的物理离散单元,即作为要治疗对象的单个给药。各单位包含用合适药学可接受赋形剂配制的预定量活性剂。例如,每个小瓶的单位剂量可以包含有特定浓度活性剂的某一体积,如1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml。剂量单位可以包含单个活性剂,如上述VTX-2337、其衍生物和类似物、或其与其他活性剂(如抗癌剂如多柔比星)的混合物,以用于组合治疗。在优选实施方式中,所述单位剂型包含约15mg/ml–约40mg/ml的VTX-2337。制剂任选含有单位剂量或多剂量容器,例如,在密封的安瓿或小瓶中,和可在冻干条件下。根据本领域已知方法,即配即用型注射溶液和混悬液可以从无菌粉末、颗粒和片剂进行制备。单位剂型的例子包括但不限于:片剂;囊片;胶囊,如软弹性明胶胶囊;扁囊剂;含片;锭剂;分散体;栓剂;软膏;吲哚美辛巴布膏(膏状药);糊料;粉剂;敷料;乳膏;膏;溶液;贴片;气雾剂(例如,鼻喷雾或吸入器);凝胶;适于向患者口服或粘膜给药的液体剂型,包括混悬液(例如,水性或非水性混悬液,水包油乳液,或油包水液体乳液),溶液,和酏剂;适于向对象皮下给药的液体剂型;和无菌固体(例如,晶体或无定形固体),其能够重建以提供适于向对象皮下给药的液体剂型。
关于根据本发明制作组合物和制剂和含有组合物和制剂的成分的另外信息能在本领域的标准参考文献中找到,如“Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)”美国宾夕法尼亚州伊顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.)。
1.2使用方法
在治疗癌症的方法中可用VTX-2337和一种或多种其他治疗方案(如抗癌剂如多柔比星)的组合。优选地,在治疗癌症的方案中联用VTX-2337制剂与一种或多种其他治疗方案。在某些实施方式中,所述癌症是实体瘤。在一个实施方式中,所述癌症选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌、黑素瘤、和淋巴瘤或其任意组合。在具体实施方式中,所述癌症是淋巴瘤。在一个实施方式中,所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
测试TLR8激动剂治疗癌症或抗癌剂和TLR8激动剂组合治疗癌症的功效的方法包括但不限于,体外试验如使用人PBMC、HEK细胞的那些、或用于浸润细胞的IHC和FACS、和肿瘤细胞裂解,以及体内试验如使用注射有卵巢细胞系的NSG-HIS小鼠或人源化小鼠(NSG-HIS)或人患者的那些。
1.2.1联合治疗
联合治疗包含除了给予VTX-2337外,辅助使用一种或多种帮助预防或治疗癌症的方案。这种方案包括但不限于化疗剂、免疫治疗、抗血管生成剂、细胞因子、激素、抗体、多核苷酸、放射和光动力治疗剂。在特定实施方式中,联合治疗能用于预防癌症复发、抑制转移、或抑制癌症或转移的生长和/或扩散。如文中所用,“联用”指本发明VTX-2337制剂作为治疗方案的一部分给药,所述治疗方案包括一种或多种另外的治疗方法,如以下章节中更详细所述。
在某些实施方式中,VTX-2337在给予一种或多种其它方法之前、同时或之后给药。在某些实施方式中,在给予抗癌剂(如多柔比星)前或后(如5天后)给予VTX-2337。在一个实施方式中,用一种或多种其他方案制备VTX-2337。在另一个实施方式中,在分开的药物组合物中给予一种或多种其它方案。根据此实施方式,一种或多种其它方案可通过与VTX-2337相同或不同的给药途径给予对象。
1.2.1.1与多柔比星联合
在某些实施方式中,包含VTX-2337的所述制剂与多柔比星联合给予。优选地,多柔比星是PEG化脂质体形式。多柔比星的化学结构如下所示:
1.2.1.2与其他抗癌剂联合
在某些实施方式中,包含本发明VTX-2337的制剂与一种或多种抗癌剂(优选化疗剂)联合给予。这种化疗剂包括但不限于下列化合物组:细胞毒性抗生素、抗代谢剂、抗有丝分裂剂、烷化剂、铂化合物、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷类似物、植物生物碱、和毒素;以及其合成衍生物。下面是这些组中特定化合物的非限定性示例。烷化剂包含氮芥如环磷酰胺、异环磷酰胺、曲磷胺和苯丁酸氮芥;亚硝基脲如卡莫司汀(BCNU)和洛莫司丁(CCNU);烷基磺酸盐如白消安和曲奥舒凡;和三氮烯如达卡巴嗪。含铂化合物包含顺铂、卡铂、阿罗铂和奥沙利铂。植物生物碱包含长春花生物碱如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨;和紫杉类如紫杉醇和多西他赛。DNA拓扑异构酶抑制剂包含表鬼臼毒素如依托泊甙、替尼泊苷、拓扑替康、9-氨基喜树碱、喜树碱和克立那托;和丝裂霉素如丝裂霉素C。抗叶酸药包含DHFR抑制剂如氨甲喋呤和三甲曲沙;IMP脱氢酶抑制剂如霉酚酸、噻唑呋林、利巴韦林、羟基脲和EICAR;和核苷酸还原酶抑制剂如去铁胺。嘧啶类似物包含尿嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶、氮尿苷、脱氧氟尿苷和雷替曲塞(ratitrexed);和胞嘧啶类似物如阿糖胞苷(ara C)、胞嘧啶阿糖胞苷和氟达拉滨。嘌呤类似物包含巯基嘌呤和硫鸟嘌呤。DNA抗代谢物包含3-HP、2’-脱氧-5-氟尿苷、5-HP、α-TGDR、甘氨酸阿非迪霉素、ara-C、5-氮杂-2’-脱氧胞苷、β-TGDR、环胞苷、胍唑、次黄嘌呤核苷羟乙醛、麦克菌素(macebecin)II和吡唑并咪唑。抗有丝分裂剂包含异秋水仙素、软海绵素B、秋水仙素、秋水仙素衍生物、海兔毒素(dolstatin)10、美登素、根霉素、硫代秋水仙素和三苯甲基半胱氨酸。
与本发明苯并[b]氮杂TLR激动剂制剂一起使用的其他化疗剂示例包含异戊二烯化抑制剂;多巴胺能神经毒素如1-甲基-4-苯基吡啶离子;细胞周期抑制剂如星形孢菌素;放线菌素如放线菌素D和更生霉素;博来霉素如博来霉素A2、博来霉素B2和培洛霉素;蒽环类抗生素如柔红霉素、多柔比星(亚德里亚霉素)、伊达比星、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星和米托蒽醌;MDR抑制剂如维拉帕米;和Ca2+ATP酶抑制剂如毒胡萝卜素。
也考虑与本发明VTX-2337联用包含一种或多种化疗剂(如FLAG、CHOP)的组合物。FLAG包含氟达拉滨、胞嘧啶阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和氯泼尼松。前面列表中的各个试剂是说明性的,并且不意在构成限制。
在一个实施方式中,VTX-2337与下面一种或多种联合给予:IFNα、IL-2、达卡巴嗪(拜尔公司(Bayer))、替莫唑胺(世林公司(Schering))、他莫昔芬(AZ)、卡莫司汀(BMS)、美法仑(GSK)、丙卡巴肼(西格玛托公司(Sigma-Tau))、长春碱、卡铂、顺铂、紫杉醇、环磷酰胺、多柔比星、利妥昔(基因泰克公司(Genentech)/罗氏公司(Roche))、贺赛汀(基因泰克公司/罗氏公司)、格列卫、易瑞沙(AZ)、贝伐单抗(基因泰克公司/罗氏公司)或特罗凯(基因泰克公司/罗氏公司)。
在另一个实施方式中,本发明VTX-2337与下面一种或多种联合给予:烯二炔如卡奇霉素和埃斯培拉霉素;倍癌霉素(duocarmycin)、氨甲喋呤、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、Ara-C、长春地辛、丝裂霉素C、顺铂、依托泊甙、博来霉素和5-氟尿嘧啶。
能与本发明苯并[b]氮杂TLR激动剂制剂联用的合适毒素和化疗药参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》),第19版(马克出版公司(Mack Publishing Co.),1995)以及Goodman和Gilman的《治疗学的药理学基础》(ThePharmacological Basis of Therapeutics),第7版(麦克米兰出版公司(MacMillanPublishing Co.)1985)。本领域技术人员已知其它合适的毒素和/或化疗药。
能与本发明VTX-2337联用的其他抗癌剂示例包括但不限于以下:阿西维辛;阿柔比星;盐酸阿考达唑;阿克罗宁;阿多来新;阿地白介素;六甲蜜胺;安波霉素;乙酸阿美蒽醌;氨鲁米特;安吖啶;阿那曲唑;安曲霉素;门冬酰胺酶;曲林菌素;阿扎胞苷;阿扎替派;阿佐霉素;巴马司他;苯佐替派;比卡鲁胺;盐酸比生群;二甲磺酸双奈法德;比折来新;硫酸博来霉素;布喹那钠;溴匹立明;白消安;放线菌素C;卡普睾酮;卡醋胺;卡贝替姆;卡铂;卡莫司汀;盐酸卡柔比星;卡折来新;西地芬戈;苯丁酸氮芥;西罗霉素;顺铂;克拉屈滨;甲磺酸克立那托;环磷酰胺;阿糖胞苷;达卡巴嗪;放线菌素D;盐酸柔红霉素;地西他滨;右奥马铂;地扎胍宁;甲磺酸地扎胍宁;地吖醌;多西他赛;多柔比星;盐酸多柔比星;屈洛昔芬;柠檬酸屈洛昔芬;丙酸屈他雄酮;达佐霉素;依达曲沙;盐酸依氟鸟氨酸;依沙芦星;恩洛铂;恩普氨酯;依匹哌啶;盐酸表柔比星;厄布洛唑;盐酸依索比星;雌莫司汀;雌莫司汀磷酸钠;依他硝唑;依托泊苷;磷酸依托泊苷;氯苯乙嘧胺;盐酸法倔唑;法扎拉滨;芬维A胺;氮尿苷;磷酸氟达拉滨;氟尿嘧啶;氟西他滨;磷喹酮;福司曲星钠;吉西他滨;盐酸吉西他滨;羟基脲;盐酸伊达比星;异环磷酰胺;伊莫福新;白介素II(包括重组白介素II或rIL2),干扰素α2a;干扰素α-2b;干扰素α-n1;干扰素α-n3;干扰素β-Ia;干扰素γ-Ib;异丙铂;盐酸伊立替康;乙酸兰瑞肽;来曲唑;乙酸亮丙瑞林;盐酸利阿唑;洛美曲索钠;洛莫司汀;盐酸洛索蒽醌;马索罗酚;美登素;盐酸氮芥;乙酸基孕甾酮;乙酸美仑孕酮;苯丙氨酸氮芥;美诺立尔;巯嘌呤;氨甲喋呤;氨甲喋呤钠;氯苯氨啶;美妥替哌;米丁度胺;米托卡星;丝裂红素;米托洁林;丝裂马菌素;丝裂霉素;米托司培;米托坦;盐酸米托蒽醌;霉酚酸;诺考达唑;诺拉霉素;奥马铂;奥昔舒仑;紫杉醇;培门冬酶;培利霉素;奈莫司汀;硫酸培洛霉素;培磷酰胺;哌泊溴烷;哌泊舒凡;盐酸吡罗蒽醌;普卡霉素;普洛美坦;卟菲尔钠;泊非霉素;泼尼莫司汀;盐酸丙卡巴肼;嘌罗霉素;盐酸嘌罗霉素;吡唑呋喃菌素;利波腺苷;罗谷亚胺;沙芬戈;盐酸沙芬戈;司莫司汀;辛曲秦;磷乙酰天冬氨酸钠;司帕霉素;盐酸锗螺胺;螺莫司汀;螺铂;链黑霉素;链佐星;磺氯苯脲;他利霉素;替可加兰钠;替加氟;盐酸替洛蒽醌;替莫泊芬;替尼泊苷;替罗昔隆;睾内酪;硫咪嘌呤;硫鸟嘌呤;塞替派;噻唑呋林;替拉扎明;柠檬酸托瑞米芬;乙酸曲托龙;磷酸曲西立滨;三甲曲沙;葡糖醛酸三甲曲沙;曲普瑞林;盐酸妥布氯唑;乌拉莫司汀;乌瑞替派;伐普肽;维替泊芬;硫酸长春碱;硫酸长春新碱;长春地辛;硫酸长春地辛;硫酸长春匹定;硫酸长春甘酯;硫酸长春罗新;酒石酸长春瑞滨;硫酸长春罗定;硫酸长春利定;伏氯唑;折尼铂;净司他丁;盐酸佐柔比星。能使用的其他抗癌剂包括但不限于:5-乙炔基尿嘧啶;阿比特龙;阿柔比星;酰基富烯;腺环戊醇(adecypenol);阿多来新;阿地白介素;ALL-TK拮抗剂;六甲蜜胺;氨莫司汀;2,4二氯苯氧乙酸(amidox);氨磷汀;氨基乙酰丙酸;氨柔比星;安吖啶;阿那格雷;阿那曲唑;穿心莲内酯;血管新生抑制剂;拮抗剂D;拮抗剂G;安雷利克斯;抗-背侧化形成蛋白1;抗雄激素,前列腺癌;抗雌激素;抗瘤酮(antineoplaston);反义寡核苷酸;甘氨酸阿非迪霉素;凋亡基因调节剂;凋亡调节剂;脱嘌呤核酸;ara-CDP-DL-PTBA;精氨酸脱氨酶;苯胺丫啶(asulacrine);阿他美坦;阿莫司汀;阿西他汀(axinastatin)1;阿西他汀2;阿西他汀3;阿扎司琼;阿扎毒素;重氮酪氨酸;浆果赤霉素III衍生物;巴拉醇(balanol);巴马司他;BCR/ABL拮抗剂;苯并二氢卟酚(benzochlorin);苯甲酰星孢素;β内酰胺衍生物;β-阿里辛(β-alethine);亚阿克拉霉素(betaclamycin)B;桦木酸;bFGF抑制剂;比卡鲁胺;比生群;双氮丙啶精胺;双奈法德;比特迪尼(bistratene)A;比折来新;贝伏特(breflate);溴匹立明;布度钛;丁基硫堇亚胺;卡泊三醇;卡弗他丁(calphostin)C;喜树碱衍生物;金丝雀痘IL2;卡培他滨;羧酰胺-氨基-三唑;羧基酰胺三唑;CaRest M3;CARN700;软骨衍生的抑制剂;卡折来新;酪蛋白激酶抑制剂(ICOS);澳粟精胺;杀菌肽B;西曲瑞克;绿素类(chlorlns);氯代喹喔啉磺酰胺;西卡前列素;顺-卟啉;克拉屈滨;恩氯米芬类似物;克霉唑;克利霉素(collismycin)A;克利霉素B;考布他汀A4;考布他汀类似物;克纳宁(conagenin);科莱贝司丁(crambescidin)816;克立那托;自念珠藻环肽(cryptophycin)8;自念珠藻环肽A衍生物;库拉索(curacin)A;环戊蒽醌(cyclopentanthraquinone);环铂(cycloplatam);塞培霉素(cypemycin);阿糖胞苷十八烷基磷酸钠;细胞裂解因子;磷酸己烷雌酚(cytostatin);达昔单抗;地西他滨;脱氢代代宁B;地洛瑞林;地塞米松;右异环磷酰胺;右雷佐生;右维拉帕米;地吖醌;代代宁B;3,4-二羟基苯并氧肟酸(didox);二乙基正精胺;二氢5-氮杂胞苷;二氢紫杉醇,9-;二氧霉素(dioxamycin);二苯基螺莫斯汀;多西他赛;二十二烷醇;多拉司琼;去氧氟尿苷;屈洛昔芬;屈大麻酚;多卡霉素SA;依布硒;依考莫司汀;依地福新;依决洛单抗;依氟鸟氨酸;榄香烯;乙嘧替氟;表柔比星;依立雄胺;雌莫司汀类似物;雌激素激动剂;雌激素拮抗剂;依他硝唑;磷酸依托泊甙;依西美坦;法倔唑;法扎拉滨;芬维A胺;非格司亭;非那雄胺;夫拉平度(flavopiridol);氟卓斯汀;夫卢丝龙(fluasterone);氟达拉滨;盐酸氟代柔红霉素(fluorodaunorunicin);福酚美克;福美坦;福司曲星;福莫司汀;德卟啉钆(gadolinium texaphyrin);硝酸镓;加洛他滨;加尼瑞克;明胶酶抑制剂;吉西他滨;谷胱甘肽抑制剂;赫舒反(hepsulfam);调蛋白;环己基双乙酰胺;金丝桃蒽酮;伊班膦酸;黄胆素;艾多昔芬;伊决孟酮;伊莫福新;伊洛马司他;咪唑并吖啶酮;咪喹莫特;免疫刺激肽;胰岛素样生长因子1受体抑制剂;干扰素激动剂;干扰素;白介素;碘苄胍;碘阿霉素;4-甘薯苦醇;伊罗普拉;伊索拉定;异本格唑(isobengazole);异高软海绵素(isohomohalicondrin)B;伊他司琼;结丝立得(jasplakinolide);卡哈拉得(kahalalide)F;片螺素(lamellarin)-N三乙酸;兰瑞肽;雷纳霉素(leinamycin);来格司亭;硫酸蘑菇多糖;莱托斯汀(leptolstatin);来曲唑;白血病抑制因子;白细胞α干扰素;亮丙瑞林+雌激素+孕酮;亮丙瑞林;左旋咪唑;利阿唑;直链多胺类似物;亲脂性二糖肽;亲脂性铂化合物;利索纳得(lissoclinamide)7;洛铂;胍乙基磷酸丝氨酸;洛美曲索;氯尼达明;洛索蒽醌;洛伐他汀;洛索立宾;勒托替康;德卟啉镥(lutetium texaphyrin);莱索菲林(lysofylline);细胞裂解肽;美坦新;慢诺他汀(mannostatin)A;马立马司他;马索罗酚;乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin);基质溶解因子抑制剂;基质金属蛋白酶抑制剂;美诺立尔;硫巴妥苯胺;美替瑞林;甲硫氨酸酶;甲氧氯普胺;MIF抑制剂;米非司酮;米替福新;米立司亭;错配的双链RNA;米托胍腙;二溴卫矛醇;丝裂霉素类似物;米托萘胺;迈托毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂草毒蛋白;米托蒽醌;莫法罗汀;莫拉司亭;单克隆抗体,人绒毛膜促性腺激素;单磷酰基脂质A+分支杆菌细胞壁骨架;莫哌达醇;多药耐药基因抑制剂;基于多肿瘤抑制物1的治疗;芥类抗癌剂;印度洋海绵(mycaperoxide)B;分枝杆菌细胞壁提取物;米亚普龙(myriaporone);N-乙酰基地那林;N-取代的苯甲酰胺;那法瑞林;那瑞替喷(nagrestip);纳洛酮+镇痛新;纳帕英(napavin);萘萜二醇(naphterpin);那托司亭;奈达铂;奈莫柔比星;奈立膦酸;中性内肽酶;尼鲁米特;尼萨霉素(nisamycin);氮氧化物调节剂;硝基氧抗氧化剂;尼多林(nitrullyn);O6-苄基鸟嘌呤;奥曲肽;奥可斯酮(okicenone);寡核苷酸;奥那司酮;昂丹司琼;昂丹司琼;奥莱辛(oracin);口服细胞因子诱导物;奥马铂;奥沙特隆;奥沙利铂;氧杂奥诺霉素(oxaunomycin);紫杉醇;紫杉醇类似物;紫杉醇衍生物;帕劳胺(palauamine);棕榈酰根霉素;帕米磷酸;人参炔三醇;帕诺米芬;副菌铁素(parabactin);帕折普汀;培门冬酶;培得星;戊聚硫钠;喷司他丁;喷托唑(pentrozole);全氟溴烷;培磷酰胺;紫苏子醇;苯那霉素(phenazinomycin);乙酸苯酯(phenylacetate);磷酸酶抑制剂;皮西巴尼(picibanil);盐酸匹鲁卡品;吡柔比星;吡曲克辛;胎盘素(placetin)A;胎盘素B;纤溶酶原激活物抑制剂;铂络合物;铂化合物;铂-三胺络合物;卟菲尔钠;泊非霉素;氯泼尼松;丙基双吖啶酮;前列腺素J2;蛋白酶体抑制剂;基于蛋白A的免疫调节剂;蛋白激酶C抑制剂;蛋白激酶C抑制剂,微藻(microalgal);蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂;嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂;红紫素;吡唑啉吖啶;吡哆醛化的血红蛋白聚氧乙烯偶联物;raf拮抗剂;雷替曲塞;雷莫司琼;ras法尼基蛋白转移酶抑制剂;ras抑制剂;ras-GAP抑制剂;去甲基化的瑞替普汀;依替膦酸铼Re186;根霉素;核酶;RII维甲酰胺(retinamide);罗谷亚胺;罗希吐碱(rohitukine);罗莫肽;罗喹美克;卢比格酮(rubiginone)B1;卢伯西(ruboxyl);沙芬戈;伞托平(saintopin);SarCNU;萨可菲醇(sarcophytol)A;沙格司亭;Sdi1模拟物;司莫司汀;衰老衍生的抑制剂1;有义寡核苷酸;信号转导抑制剂;信号转导调节剂;单链抗原结合蛋白;西佐喃;索布佐生;硼卡钠;苯基乙酸钠;索尔醇(solverol);生长调节素结合蛋白;索纳明;膦门冬酸;斯卡霉素(spicamycin)D;螺莫司汀;脾脏五肽(splenopentin);海绵他汀(spongistatin)1;角鲨胺;干细胞抑制剂;干细胞分裂抑制剂;斯提酰胺(stipiamide);基质分解素抑制剂;斯菲诺辛(sulfinosine);强效血管活性肠肽拮抗剂;素拉迪塔(suradista);苏拉明;苦马豆碱;合成粘多糖;他莫司汀;他莫昔芬甲碘化物;牛磺莫司汀;他扎罗汀;替可加兰钠;替加氟;碲吡喃洋(tellurapyrylium);端粒酶抑制剂;替莫泊芬;替莫唑胺;替尼泊苷;十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide);四佐胺(tetrazomine);泰立拉汀(thaliblastine);噻可拉林;血小板生成素;血小板生成素模拟物;胸腺法新;胸腺生成素受体激动剂;胸腺曲南;促甲状腺激素;本紫红素乙酯锡;替拉扎明;二氯环戊二烯钛;拓扑森汀(topsentin);托瑞米芬;全能干细胞因子;翻译抑制剂;维甲酸;三乙酰基尿苷;曲西立滨;三甲曲沙;曲普瑞林;托烷司琼;妥罗雄脲;酪氨酸激酶抑制剂;酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin);UBC抑制剂;乌苯美司;泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子;脲激酶受体拮抗剂;伐普肽;瓦立奥林(variolin)B;载体系统,红细胞基因治疗;维拉雷琐;藜芦明;瓦尔丁(verdins);维替泊芬;长春瑞滨;威科萨汀(vinxaltine);维他辛(Vitaxin);伏氯唑;扎诺特隆;折尼铂;亚苄维C;和净司他丁斯酯。
1.2.1.3与放疗联合
在另一个实施方式中,本发明VTX-2337与治疗癌症的放疗方案联合给予。所述方法包括含外束放疗、间质植入放射性同位素(I-125、钯、铱)、放射性同位素如锶-89、胸放疗、腹膜内P-32放疗、和/或全腹和骨盆放疗的方案。任意合适的细胞毒性放射性核素或放射性同位素可以用于放疗的方案。在某些实施方式中,所述同位素是α-发射性同位素,如225Ac、224Ac、211At、212Bi、213Bi、212Pb、224Ra或223Ra。在其他实施方式中,细胞毒性放射性核素是β-发射性同位素,如186Re、188Re、90Y、131I、67Cu、177Lu、153Sm、166Ho或64Cu。在一些实施方式中,细胞毒性放射性核素是发射俄歇(Auger)和低能量电子如125I、123I或77Br的同位素。在其它实施方式中,同位素是198Au、32P等。
在某些实施方式中,给予对象的放射性核素量为约0.001mCi/kg-约10mCi/kg。在一些实施方式中,给予对象的放射性核素量为约0.1mCi/kg-约1.0mCi/kg。在其它实施方式中,给予对象的放射性核素量为约0.005mCi/kg-0.1mCi/kg。
1.2.1.4与治疗性抗体联合
在另一个实施方式中,本发明VTX-2337与一种或多种免疫治疗剂,如抗体或疫苗联合给予。在一些实施方式中,所述抗体有针对癌症的体内治疗和/或预防应用。
能与本发明苯并[b]氮杂TLR激动剂制剂联用的治疗和预防抗体的非限定性示例包含MDX-010(新泽西州麦得莱克斯公司(Medarex)),其是目前临床上用于治疗前列腺癌的人源化抗CTLA-4抗体;(马里兰州医学免疫公司(MedImmune)),其是用于治疗RSV感染的人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体;和(曲妥珠单抗)(加利福尼亚州基因泰克公司),其是用于治疗转移乳腺癌的人源化抗HER2单克隆抗体。其它例子是人源化抗CD18F(ab’)2(基因泰克公司(Genentech));CDP860,其是人源化抗CD18F(ab’)2(英国塞尔泰克公司(Celltech,UK));PRO542,其是与CD4融合的抗HIV gp120抗体(普罗杰尼克公司/健赞转基因公司(Progenics/Genzyme Transgenics));Ostavir,其是人抗乙型肝炎病毒抗体(蛋白设计实验室/诺华公司(Protein Design Lab/Novartis));PROTOVIRTM,其是人源化抗CMV IgG1抗体(蛋白设计实验室/诺华公司);MAK-195(SEGARD),其是鼠抗TNF-αF(ab’)2(科诺尔制药公司/巴斯夫公司(Knoll Pharma/BASF));IC14,其是抗CD14抗体(ICOS制药公司(ICOS Pharm));人源化抗VEGF IgG1抗体(基因泰克公司);OVAREXTM,其是鼠抗CA125抗体(阿塔雷公司(Altarex));PANOREXTM,其是鼠抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(葛兰素威康/山陶克(Glaxo Wellcome/Centocor));BEC2,其是鼠抗独特型(GD3表位)IgG抗体(免疫克隆系统公司(ImClone System));IMC-C225,其是嵌合抗EGFR IgG抗体(免疫克隆系统公司);维他辛(VITAXIN)TM,其是人源化抗αVβ3整联蛋白抗体(应用分子进化/医学免疫公司(Applied MolecularEvolution/MedImmune));坎帕斯(Campath)1H/LDP-03,其是人源化抗CD52IgG1抗体(刘克赛特公司(Leukosite));Smart M195,其是人源化抗CD33IgG抗体(蛋白设计实验室(Protein Design Lab)/嘉娜宝公司(Kanebo));RITUXANTM(利妥昔单抗TM),其是嵌合抗CD20IgG1抗体(IDEC制药(IDEC Pharm)/基因泰克,罗氏/杰题克(Zettyaku));LYMPHOCIDETM,其是人源化抗CD22IgG抗体(免疫医学公司(Immunomedics));Smart ID10,其是人源化抗HLA抗体(蛋白设计实验室);ONCOLYMTM(Lym-1),其是放射性标记的鼠抗HLA DR抗体(特尼克隆公司(Techniclone));ABX-IL8,其是人抗IL8抗体(安根尼克斯(Abgenix));抗CD11a,是人源化IgG1抗体(基因泰克/索马公司(Xoma));ICM3,是人源化抗ICAM3抗体(ICOS制药公司);IDEC-114,是灵长类化抗CD80抗体(IDEC制药公司/三菱公司(Mitsubishi));ZEVALINTM,它是放射性标记的鼠抗-CD20抗体(IDEC/先灵公司(Schering AG));IDEC-131,是人源化抗CD40L抗体(IDEC/卫材公司(Eisai));IDEC-151,是灵长类化抗CD4抗体(IDEC);IDEC-152,是灵长类化抗-CD23抗体(IDEC/SKK公司(Seikagaku));SMART抗-CD3,是人源化抗CD3IgG(蛋白设计实验室);5G1.1,是人源化抗补体因子5(C5)抗体(亚力兄制药公司(Alexion Pharm));D2E7,是人源化抗TNF-α抗体(CAT/巴斯夫公司);CDP870,是人源化抗TNF-αFab片段(塞尔泰克公司);IDEC-151,是灵长类化抗CD4IgG1抗体(IDEC制药公司/史克必成公司(SmithKline Beecham));MDX-CD4,是人抗CD4IgG抗体(麦得莱克斯公司(Medarex)/卫材公司/基麦公司(Genmab));CDP571,是人源化抗TNF-αIgG4抗体(赛尔泰克公司);LDP-02,是人源化抗α4β7抗体(刘克赛特公司/基因泰克公司);OrthoClone OKT4A,是人源化抗CD4IgG抗体(奥多生物技术公司(OrthoBiotech));ANTOVATM,是人源化抗CD40L IgG抗体(拜耳基因公司(Biogen));ANTEGRENTM,是人源化抗VLA-4IgG抗体(伊兰公司(Elan));MDX-33,是人抗CD64(FcγR)抗体(麦得莱克斯公司/贝林公司(Centeon));SCH55700,是人源化抗IL-5IgG4抗体(赛尔泰克公司/先灵公司);SB-240563和SB-240683,分别是人源化抗IL-5和抗IL-4抗体(史克必成公司(SmithKline Beecham));rhuMab-E25,是人源化抗IgEIgG1抗体(基因泰克公司/诺华公司(Norvartis)/谭诺生物系统公司(Tanox Biosystems));ABX-CBL,是鼠抗CD-147IgM抗体(安根尼克斯公司(Abgenix));BTI-322,是大鼠抗CD2IgG抗体(医学免疫公司/生物移植公司(Bio Transplant));奥多克隆/OKT3(Orthoclone/OKT3),是鼠抗CD3IgG2a抗体(奥多生物科技公司(ortho Biotech));SIMULECTTM,是嵌合抗CD25IgG1抗体(诺华制药);LDP-01,是人源化抗β2-整联蛋白IgG抗体(刘克赛特公司);抗LFA-1,是鼠抗CD18F(ab′)2(PM公司(Pasteur-Merieux)/免疫技术公司(Immunotech));CAT-152,是人抗TGF-β2抗体(剑桥抗体技术公司(Cambridge Ab Tech));和Corsevin M,是嵌合抗因子VII抗体(山陶克公司)。以上列出的免疫反应试剂以及任意其它免疫反应试剂可按照本领域技术人员已知的任意方案给药,包括免疫反应试剂供应商推荐的方案。
1.2.1.5与其他治疗剂联合
除了抗癌剂和治疗抗体以外,本发明VTX-2337能与其他治疗剂联合给予,所述其他治疗剂例如抗血管新生剂(如治疗实体瘤以及治疗和预防转移的方法)和抗激素剂(特别是治疗激素依赖性癌症例如乳腺癌和前列腺癌的方法)。
在一个实施方式中,本发明VTX-2337与一种或多种抗血管新生剂联合给予。这种试剂包括但不限于血管抑制素、沙利度胺、重组人纤溶酶原(kringle5)、内皮他汀、Serpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂)抗凝血酶、纤连蛋白的29kDa N末端和40kDa C末端蛋白水解片段、促乳激素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、对应血小板因子-4片段的13氨基酸肽(Maione等,1990,CancerRes.51:20772083)、对应胶原I片段的14氨基酸肽(Tolma等,1993,J.Cell Biol.122:497511)、对应血小板反应蛋白I的19氨基酸肽(Tolsma等,1993,J.Cell Biol.122:497511)、对应SPARC片段的20氨基酸肽(Sage等,1995,J.Cell.Biochem.57:13291334)、或任何片段、家族成员或其变体,包含其药学上可接受的盐。也描述了抑制血管生成以及对应层连蛋白、纤连蛋白、前胶原和EGF的其他肽(参见例如Cao,1998,Prog Mol Subcell Biol.20:161176)。显示了阻断某些结合RGD蛋白(如有肽基序Arg-Gly-Asp)的整联蛋白的单克隆抗体和环五肽有抗血管生成活性(Brooks等,1994,Science264:569571;Hammes等,1996,Nature Medicine2:529533)。另外,通过受体拮抗剂抑制尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体而抑制了血管生成、肿瘤生长和转移(Min等,1996,Cancer Res.56:242833;Crowley等,1993,Proc Natl Acad Sci.90:502125)。
在另一个实施方式中,本发明VTX-2337与激素治疗方案联用。这种治疗方案包含给予激素拮抗剂(如氟他胺、比卡鲁胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、乙酸亮丙瑞林(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工抑制剂、和类固醇(如地塞米松、类视黄醇、类德尔醇、倍他米松、皮质醇、可的松、氯泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素类、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕激素)、维生素A衍生物(如全反式视黄酸(ATRA));维生素D3类似物;抗促孕激素(如米非司酮、奥那司酮)、和抗雄激素(如醋酸塞普隆)。
在另一个实施方式中,本发明VTX-2337与使用多核苷酸化合物的治疗方案联用,所述化合物如反义多核苷酸、核酶、RNA干涉分子、三螺旋多核苷酸等。
1.2.1.6与免疫调节剂联合
在某些实施方式中,本发明VTX-2337与免疫调节剂联合给药。在一些实施方式中,用所述免疫调节剂制备所述苯并[b]氮杂TLR激动剂。“免疫调节剂”是抑制、掩蔽或增强给药对象免疫系统的物质。示例性试剂是抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达,或遮蔽MHC抗原的那些试剂。这类药物示例包括:2-氨基-6-芳基-5-取代嘧啶(参见美国专利4,665,077)、硫唑嘌呤(或环磷酰胺,如果对硫唑嘌呤存在不良反应);溴隐亭;戊二醛(其遮蔽MHC抗原,如美国专利4,120,649所述);MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体;环孢菌素A;类固醇,如糖皮质类固醇,例如氯泼尼松、甲泼尼龙和地塞米松;细胞因子或细胞因子受体拮抗剂,包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体;抗肿瘤坏死因子-α抗体;抗肿瘤坏死因子-β抗体;抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体;抗L3T4抗体;异源抗淋巴细胞球蛋白;泛T抗体,优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体;含有LFA-3结合域的可溶性肽;链激酶;TGF-β;链道酶;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素;和雷帕霉素。细胞因子示例包括但不限于:淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括:生长激素,如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松弛素;松弛素原;糖蛋白激素,如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH);肝脏生长因子;成纤维细胞生长因子;促乳素;胎盘催乳素;肿瘤坏死因子-α;苗勒管抑制剂;小鼠促性腺素相关肽;抑制素;活化素;血管内皮生长因子;整联蛋白;血小板生成素(TPO);神经生长因子,如NGF-α;血小板生长因子;转化生长因子(TGF),如TGF-α和TGF-α;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子;干扰素;集落刺激因子(CSF),如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CgP(GM-CSP);和粒细胞-CSF(G-CSF);白介素(IL),如IL-1、IL-1a、IL-2、1L-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15;肿瘤坏死因子,如TNF-α或TNF-β;以及其它多肽因子,包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语“细胞因子”包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质,以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
在某些实施方式中,该方法还包括给予所述对象一种或多种免疫调节剂,优选细胞因子。优选的细胞因子选自白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、G-CSF、GM-CSF、血小板生成素或γ干扰素。
1.2.1.7与增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物联合
在某些实施方式中,增强单核细胞或巨噬细胞功能(如至少约25%、50%、75%、85%、90%、9%或更多)的化合物可与本发明苯并[b]氮杂TLR激动剂制剂联用。本领域已知这类化合物,包括但不限于:细胞因子如白介素(如IL-12)和干扰素(如α或γ干扰素)。
在某些实施方式中,增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物用VTX-233配制并由此与VTX-2337同时给药。
在其它实施方式中,增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物与VTX-2337分开给药且能与VTX-2337同时(彼此在数小时以内)、同一疗程、或依次给药。在这个实施方式中,增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物优选向人给药。在一个实施方式中,人对象的血白细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、和/或嗜碱性白细胞计数属于人体正常范围。人白细胞(总体)的正常范围约为3.5-10.5(109/L)。人血嗜中性粒细胞的正常范围约为1.7-7.0(109/L),单核细胞约为0.3-0.9(109/L),淋巴细胞约为0.9-2.9(109/L),嗜碱性细胞约为0-0.3(109/L),嗜酸性细胞约为0.05-0.5(109/L)。在其它实施方式中,人对象的血白细胞计数小于人体正常范围,例如至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8(109/L)个白细胞。
1.2.2靶标癌症
用本发明方法治疗的癌症类型是实体瘤,例如卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌或淋巴瘤或其任意组合。用本发明方法治疗的其他类型癌症包括但不限于人肉瘤和癌,如纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤;白血病,如急性淋巴细胞性白血病和急性成髓细胞性白血病(成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞和红细胞白血病);慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病);和真性红细胞增多、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。
1.3给药和剂量
本发明VTX-2337优选配制用于注射,最优选皮下注射。在某些实施方式中,配制本发明VTX-2337以用于皮内、透皮、静脉内或肌肉内途径给药。
本发明的制剂含有对预定用途有效的VTX-2337量。也会根据一些其它因素选择特定剂量,包括病人的年龄、性别、种类和病症。有效量也可从体外试验系统或动物模型所得剂量反应曲线外推。
在某些实施方式中,以mg/kg体重单位测量VTX-2337剂量。在其它实施方式中,所述剂量以mg/kg去脂体重(即体重减去体脂含量)为单位计量。在其他实施方式中,以单位mg/m2体表面积测量所述剂量。在其他实施方式中,以给予患者每剂量的mg为单位测量所述剂量。任何剂量测量方法均可与本发明组合物和方法联用,可通过本领域标准方式转换剂量单位。
可用于本发明方法的给药方案示例包括但不限于:每天、每周三次(间歇)、每周或每14天。在某些实施方式中,给药方案包括但不限于:每月给药或每6-8周给药。在优选实施方式中,通过每周或每两周皮下注射联合给予本发明苯并[b]氮杂TLR激动剂制剂与治疗对象(优选人对象)中癌症的合适治疗方案。
VTX-2337的示范性剂量包括对象每千克的毫克量。在一个实施方式中,所述剂量是约0.02-10mg/kg体重或约0.04-5mg/kg体重。在特定实施方式中,所述剂量是约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、或约10mg/kg对象体重。
在某些治疗癌症方法的实施方式中,以约0.02-10mg/kg或约0.04-5mg/kg所述对象体重的剂量单独给予所述对象VTX-2337或与癌症处理治疗联合给予。在特定实施方式中,以剂量约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、或约10mg/kg对象体重给予所述苯并[b]氮杂TLR激动剂。在某些其他实施方式中,每周或每两周给予对象VTX-2337。在特定实施方式中,每天剂量是至少0.05mg、0.50mg、1.0mg、5.0mg、10mg、15mg、20mg、30mg、或至少50mg。
在一些实施方式中,单独给予苯并[b]氮杂TLR8激动剂(如VTX-2337)或与治疗癌症方案联合给予的剂量是0.1-10mg/m2(如0.1-0.3mg/m2、0.1-3.9mg/m2、0.1-1mg/m2、0.1-2mg/m2、0.1-4mg/m2、2-4mg/m2、2.5-3.5mg/m2、2-6mg/m2、2-8mg/m2)。这包含0.1mg/m2、1mg/m2、2mg/m2、3mg/m2、4mg/m2、5mg/m2、6mg/m2、7mg/m2、8mg/m2和其中的点。注意到,如果假设体表面积1.5m2对应体重70kg,那么2.5-3.5mg/m2对应约0.05-0.075mg/kg。给药频率优选每7–21天一次(如每7、10、14、18、21天一次)。在一些实施方式中,给药频率优选是每7–21天1、2或3次(如每7、10、14、18、21天一次)。可以给予所述苯并[b]氮杂TLR激动剂,直到疾病进展或毒性不可接受。在一些实施方式中,给予2-20剂量(如2、4、6、8、10、12、14、16、18、20剂量)。所述优选给药途径是皮下。
在某些治疗癌症方法的实施方式中,单独给予所述对象多柔比星或与本发明联合治疗,剂量是约0.02-10mg/kg对象体重,或约0.04-5mg/kg对象体重,或不多于50mg/m2对象体表面积。
皮内、肌内、腹膜内、皮下、硬膜外或静脉内给药的推荐剂量范围是每天约0.02-10mg/kg体重。局部给药的合适剂量范围是根据给药面积的约0.001毫克–约50毫克。本领域技术人员应理解,与维持方案相比,初始治疗的剂量通常更高和/或给药频率更高。
优选制备多柔比星用于注射,最优选静脉内给药。在某些实施方式中,制备多柔比星用于皮内、透皮、皮下或肌肉内途径给药。
在某些实施方式中,以mg/kg体重单位测量多柔比星剂量。在其它实施方式中,所述剂量以mg/kg去脂体重(即体重减去体脂含量)为单位计量。在其他实施方式中,以单位mg/m2体表面积测量所述剂量。在其他实施方式中,以给予患者每剂量的mg为单位测量所述剂量。任何剂量测量方法均可与本发明组合物和方法联用,可通过本领域标准方式转换剂量单位。
在某些实施方式中,在给予VTX-2337之前、同时或之后给予多柔比星。
在某些治疗癌症方法的实施方式中,以剂量约0.02-10mg/kg或约0.04-5mg/kg对象体重将多柔比星给予所述对象。
1.3.1治疗癌症的示例性方案
在特定实施方式中,本发明VTX-2337制剂与现有治疗方案联用,以治疗对象(优选人对象)的癌症。与这个实施方式一致,所述苯并[b]氮杂TLR激动剂制剂能在治疗癌症的合适抗癌剂之前、之后或同时给予。优选地,根据癌症类型、所述对象病史和病症以及特定选择的抗癌剂,给予VTX-2337与抗癌剂的剂量和时间协调。
在一个实施方式中,所述方案包含治疗乳腺癌的5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨、IL-2、紫杉醇、和/或VP-16(依托泊苷)。在另一个实施方式中,所述方案包含治疗前列腺癌的紫杉醇、多西他赛、米托蒽醌、和/或雄激素受体拮抗剂(如氟他胺)。在另一个实施方式中,所述方案包含治疗白血病的氟达拉滨、胞嘧啶阿糖胞苷、吉姆单抗(MYLOTARG)、柔红霉素、氨甲喋呤、长春新碱、6-巯基嘌呤、伊达比星、米托蒽醌、依托泊甙、天冬酰胺酶、氯泼尼松和/或环磷酰胺。在一个实施方式中,所述方案包含治疗骨髓瘤的地塞米松。在一个实施方式中,所述方案包含治疗黑素瘤的达卡巴嗪。在一个实施方式中,所述方案包含治疗结直肠癌的伊立替康。在一个实施方式中,所述方案包含治疗肺癌的紫杉醇、多西他赛、依托泊甙和/或顺铂。在一个实施方式中,所述方案包含治疗非霍奇金淋巴瘤的环磷酰胺、CHOP、博来霉素、米托蒽醌和/或顺铂。在一个实施方式中,所述方案包含治疗胃癌的顺铂。在一个实施方式中,所述方案包含治疗胰腺癌的吉西他滨。
用抗癌剂治疗时限根据使用的特定治疗剂而不同。在某些实施方式中,所述给药是非连续的,如每天剂量分成几个部分给药。根据某些实施方式,所述治疗方法包含至少一个周期,优选多于一个周期,其中给予单一治疗或顺序治疗。一个周期的合适时间段,以及总周期数和周期间隔能由技术人员根据常规方法来确定。
在特定实施方式中,所述方案包含剂量范围为100-1000mg/m2/周期的吉西他滨。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为200-4,000mg/m2/周期的达卡巴嗪。在优选实施方式中,达卡巴嗪剂量范围为700-1000mg/m2/周期。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为25-50mg/m2/周期的氟达拉滨。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为200-2,000mg/m2/周期的胞嘧啶阿糖胞苷(AraC)。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为1.5-7.5mg/kg/周期的多西他赛。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为5-15mg/kg/周期的紫杉醇。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为5-20mg/kg/周期的顺铂。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为5-20mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为2-8mg/kg/周期的多柔比星。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为40-160mg/kg/周期的表鬼臼毒素。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为50-200mg/kg/周期的环磷酰胺。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为50–75、75–100、100–125、或125-150mg/m2/周期的伊立替康。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为3.7–5.4、5.5–7.4、7.5–11、或11-18.5mg/m2/周期的长春碱。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为0.7-1.4、或1.5-2mg/m2/周期的长春新碱。在另一个实施方式中,所述方案包含剂量范围为3.3–5、5–10、10–100、或100-1,000mg/m2/周期的氨甲喋呤。
在一个实施方式中,所述方案包含使用低剂量化疗剂。与这个实施方式一致,用本发明VTX-2337初始治疗对象增加了肿瘤对后续抗癌剂攻击的灵敏度。因此,能以接近或低于就单独给予试剂而言可接受剂量范围下限的剂量给予对象所述抗癌剂。在一个实施方式中,所述方案包含后续给予6-60mg/m2/天或更少的多西他赛。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予10-135mg/m2/天或更少的紫杉醇。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予2.5-25mg/m2/天或更少的氟达拉滨。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予0.5-1.5g/m2/天或更少的胞嘧啶阿糖胞苷(AraC)。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予10-100mg/m2/周期的吉西他滨。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予顺铂,如PLATINOL或PLATINOL AQ(百时美公司(Bristol Myers)),剂量范围是5–10、10–20、20–40、或40-75mg/m2/周期。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予7.5-75mg/m2/周期的顺铂。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予卡铂,如PARAPLATIN(百时美公司(Bristol Myers)),剂量范围是2–4、4–8、8–16、16–35、或35-75mg/m2/周期。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予多西他赛,如TAXOTERE(RPR公司(Rhone Poulenc Rorer)),剂量范围是6–10、10–30、或30-60mg/m2/周期。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予紫杉醇,如TAXOL(百时美施贵宝公司(Bristol Myers Squibb)),剂量范围是10–20、20–40、40–70、或70-135mg/kg/m2/周期。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予剂量范围为0.5-5mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。在另一个实施方式中,所述方案包含后续给予多柔比星,如ADRIAMYCIN(法玛西亚普强公司(Pharmacia&Upjohn))、DOXIL(阿尔扎公司(Alza))、RUBEX(百时美施贵宝公司(Bristol Myers Squibb)),剂量范围是2–4、4–8、8–15、15–30、或30-60mg/kg/m2/周期。
上述给予方案仅作为说明目的,并且不应视作限定。
1.4药盒
本发明提供包括一个或多个装有液体或冻干VTX-2337和/或多柔比星的容器的药包或药盒。在优选实施方式中,所述液体或冻干制剂是无菌的。在一实施方式中,所述药盒在一个或多个容器中包含本发明液体或冻干制剂,和用于治疗癌症或传染病的一种或多种其它预防剂或治疗剂。所述一种或多种其它预防剂或治疗剂可以与VTX-2337在相同容器中,或在一个或多个其他容器中。优选地,VTX-2337以浓度约0.5mg/ml-约50mg/ml、约1mg/ml-约40mg/ml、或约2mg/ml-约15mg/ml制备,并且所述制剂适合注射,优选皮下注射。优选所述药盒包含单位剂型的VTX-2337。最优选地,所述单位剂型的形式适合提供单位剂量约0.02-10mg/kg或约0.04-5mg/kg要治疗对象体重。
在某些实施方式中,该药盒还包括用于治疗癌症(例如,单独或与另一预防剂或治疗剂联合使用本发明液体制剂或),以及副作用和一种或多种给药途径的剂量信息的说明书。所述容器任选附有关于药品或生物制品的生产、使用或销售的政府管理机构颁发的告知书,该告知书反映出生产、使用或销售管理机构批准其用于人体。
本文引用的所有出版物和专利文献都通过引用纳入本文,就好像每个所述出版物或文献都特定和单独表示通过引用纳入本文。对上述出版物和专利文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的在先技术,也并不表示承认其内容或日期。
进一步参照以下实施例描述本发明,这些实施例并不意味着限制本发明的范围。本领域技术人员清楚了解,在不背离本发明目的和利益的情况下可对材料和方法实施很多修改。
1.5实施例
实施例1:TLR8激动剂和Doxil化疗有效活化人免疫系统小鼠模型中的人抗肿瘤免疫反应。
由于小鼠和人免疫系统之间的区别,很多免疫调节药物的影响不能在同系小鼠模型中充分研究。生成有人免疫系统(HIS)的新型荷瘤小鼠模型以研究化疗和免疫调节治疗之间的相互作用。测试多柔比星(诱导免疫原性肿瘤细胞死亡和活化抗原呈递细胞的药物)和VTX-2337(诱导人髓样DC的有效活化和1型极化的TLR8激动剂)之间的个体影响和相互作用,并且在鼠白细胞上显示降低的活性。用来自HLA-A2+人供体的人CD34+脐带血细胞接种Nod/SCID/ILRγc敲除(NSG)小鼠;用人HLA-A2+OVCAR5卵巢癌肿瘤移植s.c.;并且用PEG化脂质体多柔比星(Doxil或PLD);VTX-2337;或两种试剂组合处理。NSG-HIS小鼠显示了全人造血系统,包含人单核细胞、巨噬细胞和类浆细胞和髓样DC以及T细胞亚组。在NSG-HIS小鼠中,VTX-2337在6小时内诱导体内人CD14+和CD11c+细胞的剂量依赖性活化。在用VTX-2337处理的小鼠血浆中观察到人Th1细胞因子和IL-10的短暂、剂量依赖性上调,在6小时内达到峰值并且24小时内减轻。仅仅Doxil也诱导体内CD11c+ DC的温和活化,和Th1细胞因子的温和上调。两种药物的组合诱导有效活化CD11c+ DC和单核细胞,并且显著增加Th1细胞因子,但不是IL-10。成功移植HLA-A2+ OVCAR5肿瘤,显示了人白细胞的浸润。VTX-2337和Doxil治疗独立诱导肿瘤浸润的人白细胞,并且以剂量依赖性方式限制人卵巢癌肿瘤异种移植物的生长,而两种药物的组合诱导最高频率的肿瘤浸润人白细胞,且有效限制卵巢肿瘤的生长。通过VTX-2337和Doxil的先天和获得性免疫的组合活化,以及肿瘤细胞通过Doxil对获得性和先天免疫效应物机制的致敏是观察到的抑制肿瘤生长相互作用的基础。所述NSG-HIS提供了建立TLR8激动剂和Doxil化疗相互作用的合适工具,并且所述结果保证了临床测试。
材料和方法
试剂:
VTX-2337制剂:40mg/mL的2-氨基-N,N-二丙基-8-(4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂-4-羧酰胺,配制为10mM柠檬酸盐缓冲液(pH=6.5)中有15%w/v(磺基丁基醚β-环糊精)的包含络合物。使用前,所述制剂还用0.9%无菌氯化钠稀释到合适浓度。
从宾夕法尼亚大学医院药房购买PLD(即Doxil,由本维纽实验室公司(Ben VenueLaboratories Inc),俄亥俄州贝尔福德4414146生产)。
生成NSG-HIS小鼠:所有体内小鼠研究都由宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会根据国立卫生研究院(NIH)的指南批准。先照射(250Rads)获自宾夕法尼亚大学异种移植机构的NOD-scid IL2rγ无(null)(NSG)小鼠,然后第二天通过静脉内(i.v.)注射包含1-2×105CD34+的T细胞耗尽人脐带血细胞(隆萨公司(LONZA),2C-101)。约3个月后,通过流血和hCD45染色(BD法敏进公司(BD Pharmingen),克隆2D1目录号557833APC-CY7)确证人造血系统的植入水平和重建。
测量细胞因子:在一些实验中,皮下(s.c.)单独注射NSG-HIS0.5或5mg/kgVTX-2337或与腹膜内(i.p.)最大耐受剂量(MTD,50mg/m2)的PLD组合。在其他实验中,用VTX-2337体外刺激人PBMC。在所有实验中,在所述VTX-2337给药后6小时,收集血浆或培养基上清。体外和体内测量由VTX-2337或VTX-2337加上PLD给药诱导的细胞因子水平,所述测量通过RBM(Rules Based Medicine) (德克萨斯州奥斯汀),使用从经处理动物中收集的培养物上清或血浆样品中96个人分析物水平的基于Luminex技术完成。
治疗OVCAR5荷瘤NSG-HIS小鼠:将OVCAR5细胞s.c.注射(5x106细胞)到HLA-A2+CD34+移植NSG-HIS小鼠。在未处理对照小鼠中,肿瘤逐步发展,造成了肿瘤攻击90天内的动物死亡。每周两次测量肿瘤,并且所述体积如下计算:(长度x长度)x(宽度)/2。当平均肿瘤体积达到约50mm3或肿瘤细胞移植后约30天时,荷瘤小鼠随机分成4个治疗组(n=8-10/组)。治疗组由以下组成:载剂对照、PLD(50mg/m2每两周i.p.给予)、VTX-2337(0.5mg/kg,就每次周期而言每隔一天s.c.给予三次)、或PLD和VTX-2337的组合,PLD后5天开始VTX-2337处理。治疗周期持续时间是14天,并且给予每个组三个治疗周期。对各治疗周期过程,给予PLD的组在第1天接受化疗药物,而接受仅VTX-2337或与PLD组合的组在周期的第5、7和9天接受VTX-2337。
流式细胞术:对白细胞的流式细胞术分析而言,切碎肿瘤、骨髓或脾,置于6cm皮氏培养皿中、转移到15ml管,并且在包含2mg/ml胶原酶(西格玛公司(Sigma)#C9407)和DNA酶(西格玛公司#D5025-15KO)的RPMI(Cellgro#1640CV)的溶液中于连续旋转下孵育2小时。所述悬浮液使用注射器柱塞通过70-μm细胞过滤器、洗涤、离心、并且在PBS,2%FBS(吉布可公司(GIBCO)#10437)中重新悬浮团块。分离后,3-5x106细胞用0.5μg/ml抗体4°C染色30分钟,洗涤,并用流式细胞仪FACS-Canto(BD法敏进公司(BD Pharmingen))分析。使用人hCD45(BD法敏进公司克隆2D1目录号557833APC-CY7)、hCD3(白乐津公司(Biolegend)克隆UCHT1#300429PerCP/Cy5.5)、hCD4(BD法敏进公司克隆RPA-T4#555349APC)、hCD8(eBioscience克隆RPA-T8#11-0088FITC)、hCD11b(BD法敏进公司克隆ICRF44#555388PE)、hCD11c(白乐津公司克隆3.9#301608Pe-Cy7)、hCD123(BD法敏进公司克隆7G3#558714PerCP-Cy5.5)、hCD14(eBioscience克隆61D3#25-0149PE-Cy7)、hCD40(eBioscience克隆5C3#11-0409FITC)hCD80(白乐津公司克隆2D10#305216AF647)和hCD86[BD法敏进公司克隆2331(FUN-1)#555658PE]染色细胞。
体外T细胞扩增、反应选择和过继转移研究:从置于有高浓度重组人白介素2(rhIL-2,600IU/ml)的培养物中不同处理组来源的肿瘤片段起始扩增肿瘤浸润白细胞(TIL),如他处所报道(参见例如Dudley,M.E.,等,2003.J Immunother26:332-342以及Riddell,S.R.,和Greenberg,P.D.1990.J Immunol Methods128:189-201)。简单说,来自不同处理组的肿瘤片段(约2x2mm)置于补充有5%人血清(VB公司(Valley BiomedicalInc)#1017)和600I.U./ml hIL-2(派普泰克公司(PeproTech)#AF-200-02)的AIMV培养基(吉布可公司#12055)中。每三天替换一半培养基,直到达到指数生长;然后按需分裂所述培养物以保持所述细胞浓度在约5x105-1x106细胞/mL范围内。一旦获得充足数目的细胞,体外评价所有培养物的OVCAR5反应性。然后使用先前所述技术扩增OVCAR5特异反应TIL(参见例如Dudley,M.E.等,2003.J Immunother26:332-342)。简单说,2×108同种异体、辐照的饲细胞(HLA-A2+人PBMC)与30μg/mL OKT3抗体(eBioscience克隆OKT3#16-0037-85)、600IU/mL rhIL-2(派普泰克公司#AF-200-02)和1×106TIL组合,混合,并且等分到175cm2组织培养瓶中。然后于37°C5%CO2下直立孵育瓶。在第5天,用包含600IU/mL rhIL-2的1:1AIMV混合物替换一半培养基。按需加入培养基到这些瓶中,以维持细胞浓度约0.5-1×106细胞/mL。认为各起始孔是独立TIL培养物,并且与其他分开维持。在所述过继转移研究中,静脉内(i.v.)注射1x107扩增T细胞后30–40天,用5×106OVCAR5细胞s.c.攻击CD34+移植NSG小鼠。
细胞因子释放和细胞毒性分析:通过细胞因子分泌和直接CTL分析测定TIL活性和特异性。对于干扰素γ(IFNγ)分析,在共培养分析除去rhIL-2前,洗涤TIL和对照T细胞系两次。将1×105TIL和1×105刺激器细胞接种于96孔平底板的各孔中。通常用OVCAR5和两个对照HLA-A2+黑素瘤细胞系(526mel和624mel)刺激TIL培养物。在一些孔中,为确保MHC依赖性活性,靶标细胞预先用抗HLA A、B和C中和抗体(eBioscience克隆w6/32#16-9983-85)处理。过夜共培养后,收集上清并且用ELISA定量IFNγ分泌(白乐津公司#430102)。在所述CTL试验中,用铬55脉冲OVCAR5,并且将不同比率的TIL:靶标接种于96孔板中,并孵育4小时。在一些孔中,OVCAR5预先用抗HLA-A、B和C中和抗体孵育。孵育后,来自共培养的30μl培养基点样到Lumaplate,并且干燥过夜。通过液体闪烁计数器Wallac1450MicrobetaPlus检测放射性。
细胞活力膜联蛋白V/7AAD:为了检测凋亡,用膜联蛋白V/7AAD(BD法敏进公司#559763)染色肿瘤细胞。用流式细胞仪根据生产商的方案分析凋亡细胞。简单说,收集生长并接受不同处理的OVCAR5细胞,以1200rpm沉淀,然后用冰冷PBS洗涤两次,并且重悬于结合缓冲液(法敏进公司#51-66121E),浓度为1×106细胞/mL;将100μL溶液(1×105细胞)转移到两个5-mL培养管中每一个。向各100μL溶液加入5μL膜联蛋白V-PE(法敏进公司#51-65875Y),温和涡旋,避光室温孵育15分钟,用PBS洗涤,用5μL7AAD(BD法敏进公司#51-68981E)孵育10分钟,并且1小时内用FACS分析。
蛋白提取和western印迹分析:在裂解缓冲液[M-PER哺乳动物蛋白提取试剂#78501赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)]中冰上提取总细胞蛋白30分钟。然后各样品的50μg蛋白在2X加样缓冲液中100°C变性5分钟,在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上分离,并且转移到硝酸纤维素膜。所述膜然后在5%脱脂牛奶中室温孵育2小时,然后用第一抗体(细胞信号公司(Cell Signaling)#3210兔)4°C孵育过夜。所述膜然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)0.5%吐温20(西格玛公司)洗涤三次,并且用第二抗体(伯乐公司(BioRad)172-1019)室温孵育2小时。使用ECL(安玛西亚公司#RPN2132)通过X胶片(拜力公司(Bioexpress)#F-9023)观察蛋白条带。
人PBMC中TLR8激动剂体外活化抗肿瘤效应物机制
VX-2337是有效活化人mDC和单核细胞的选择性和有效TLR8激动剂。其活性主要限于这些群,且其他人白细胞群没有被直接活化,尽管间接活化可以接着单核细胞和DC活化而发生。为了测试TLR8活化对人白细胞的整体影响,来自正常人志愿者(n=6)的外周血单核细胞(PBMC)用VTX-2337在广泛浓度范围孵育24小时。响应通过VTX-2337的TLR8活化,以剂量依赖性方式诱导高水平的TNFα、IFNγ和IL-12p70。因此,PBMC的TLR8活化的独特特性是诱导已知在对癌症的细胞介导免疫反应中起重要作用的效应物调节剂。结果,TLR8激动剂对人免疫治疗有用。
TLR8激动剂有效活化人APC并且驱动NSG-HIS小鼠中体内Th1免疫活性。
在新的鼠模型中评价VTX-2337的活性,其中NSG小鼠用人CD34+脐带血细胞重建。一旦人造血干细胞重建骨髓并且开始血细胞生成,所述动物在3-4个月内显示人免疫系统(包含B细胞、CD3、CD4、CD8、NK、mDC、pDC和单核细胞)完全重建。由于人PBMC中观察到通过VTX-2337刺激的免疫刺激影响,期望所述NSG-HIS小鼠对VTX-2337高度响应。确实,给予这些小鼠VTX-2337复制了人PBMC中已经显示的免疫刺激影响,有多个共刺激分子表面表达的剂量依赖性增加,所述多个共刺激分子包含已移植人CD14+单核细胞CD11c、mDC和CD123pDC上的CD83、CD86和II型MHC。也显示了人细胞因子血液水平的增加,已知这对肿瘤的免疫反应重要,并且已经与TLR8活化相关联。这些包含IFNγ、TNFα和IL-12p40。
所述TLR8蛋白结构在各物种中不同,而VTX-2337在小鼠中有活性,所述分子对潜能最优化并且选择性针对人TLR8。
由于对人TLR8的VTX-2337选择性,选择NSG-HIS作为用人造血系统重建的小鼠宿主模型,从而研究VTX-2337对人白细胞的体内影响。在14–22周龄的NSG-HIS小鼠中,通过IV途径给予6周龄NSG小鼠人脐带血CD34+细胞转移后,观察到高水平的人淋巴造血细胞植入,由多个部分的人(h)CD45定量所评价(图1A);hCD45+细胞代表了血液中35–75%的总细胞,脾中40–68%的总细胞,和骨髓中40–70%的总细胞。
为了显示体内VTX-2337的活性,以0.5或5mg/kg s.c.给予VTX-2337以在移植后数周全部重建NSG-HIS小鼠。6小时后收集脾细胞以评价活化标记的水平。用0.5或5mg/kg VTX-2337处理的小鼠显示了与对照未处理小鼠相比,单核细胞(CD45+CD14+)、髓样DC(mDC、CD45+CD11c+)和类浆细胞DC(pDC、CD45+CD123+)上CD83,CD86以及II型MHC表达显著增加(图1B)。
在单次s.c.给予VTX-2337(0.5或5mg/kg)后,使用基于Luminex的试验检测小鼠血浆中的人细胞因子概况(图1C)。在6小时观察到包含IFNγ、TNFα和IL-12p40在内的Th1极化细胞因子浓度剂量依赖性增加。与对照相比,在VTX-2337处理的动物中也检测到IL-10血浆水平显著增加。因此,尽管也观察到IL-10生成增加,VTX-2337诱导了人单核细胞/DC部分的直接活化和体内人免疫系统的后续有效Th1活化。
PLD后的TLR8活化引起Th1细胞因子反应。
测试了“分阶段”给药方案,其中先给予20-28周龄hCD34+移植NSG小鼠最大耐受剂量(MTD,50mg/m2,i.p.)的PLD,从而引起肿瘤细胞损伤和免疫原性抗原释放;5天后给予VTX-2337(0.5mg/kg)以活化APC。注射VTX-2337后6小时,在血浆中测量多个细胞因子的水平。未处理的NSG-HIS显示血浆中检测不到干扰素γ(IFNγ)。相似地,仅用PLD处理不诱导任何IFNγ;然而VTX-2337和PLD的组合(图2)诱导显著水平的IFNγ,其与仅用VTX-2337诱导的那些类似(图1C)。另外,用VTX-2337和PLD组合处理诱导了相较未处理对照的TNFα上调,这与单独用PLD或VTX-2337相似。因此,PLD后给药使VTX-2337能诱导Th1反应。重要的是,尽管PLD以及VTX-2337在单独给予时诱导IL-10上调(图2),组合所述两种药物时减弱了这种影响(图2)。总之,这些数据表明PLD和VTX-2337给予之间的5天间隔维持了所述由VTX-2337诱导的Th1细胞因子概况,并且另外降低了IL-10水平。因此,这个组合诱导了最优细胞因子反应。由于其抑制IFNγ反应,同时给予PLD和VTX-2337生成负相互作用。
TNFα和IL-10的血浆水平增加显示了用PLD治疗NSG-HIS小鼠诱导免疫活化。这种免疫活化与正常和肿瘤细胞中多柔比星诱导的“抗原细胞死亡”一致,并且支持了通过VTX-2337的TLR8活化增强所述抗肿瘤反应。给予VTX-2337和造成抗炎调节剂IL-10的血浆水平下降和IFNγ与TNFα水平增加。
TLR8活化增加体内PLD的抗肿瘤活性
采用0.5mg/kg(与临床肿瘤学研究中所评价相当的小鼠中剂量)的MTD PLD和VTX-2337组合随后用于处理荷瘤NSG-HIS小鼠。设计所述治疗方案使用多个14天治疗周期,以利用PLD和VTX-2337的药效学活性优势。开始给予荷瘤NSG-HIS小鼠PLD以诱导肿瘤细胞死亡。这之后5天用多个VTX-2337治疗以活化免疫清道夫细胞,包含mDC、单核细胞和去除死亡肿瘤细胞的巨噬细胞。如预期,MTD的PLD引起肿瘤生长率相对载剂对照显著降低,而仅用VTX-2337观察到对肿瘤生长率的小影响。所述两种试剂的组合相较单独PLD,在三个14天治疗周期上产生肿瘤生长率的显著降低。
在研究PLD和VTX-2337组合对人卵巢癌影响的过程中,用HLA-A2+匹配的人卵巢癌细胞系OVCAR5(5x106)接种hCD34移植NSG-HIS-A2小鼠。一旦良好确立了肿瘤,用载剂、单独Doxil、单独VTX-2337或VTX-2337与Doxil的组合治疗小鼠组(n=8-9/组)。有趣的是,尽管有VTX-2337的免疫调节剂影响,仅用TLR8激动剂治疗的小鼠显示了与对照未治疗小鼠相似的肿瘤生长。如预期,用PLD在MTD(50mg/m2,i.p.)治疗的小鼠显示了相较对照未治疗小鼠降低的肿瘤生长。重要的是,所述两种药物之间有强的正相互作用;与VTX-2337的组合显著增强PLD的影响(P=0.04)(图3B),其几乎完全抑制肿瘤生长。
在进一步定性这种药物相互作用的步骤中,在研究末期从各治疗组收集肿瘤,并且通过免疫组织化学和流式细胞术评价白细胞浸润。来自所述对照组的肿瘤中出现相对少的人CD45+细胞(图3C),而所有治疗引起CD45+浸润增加。来自用PLD和VTX-2337联合治疗小鼠的肿瘤显示了相较仅用PLD或VTX-2337,浸润人CD45+细胞的最大增加(图3C)。流式细胞术用于进一步鉴定所述组合物和不同组中人白细胞群浸润肿瘤的成熟状态。仅用PLD不诱导肿瘤浸润淋巴细胞相较基线的显著变化。有趣的是,所述TLR8激动剂诱导总CD3+T细胞的显著增加,采用CD8+T细胞百分比以及CD69+(活化的)CD3+CD8+T细胞百分比形式。PLD和TLR8激动剂的组合诱导相似的变化。另外,用VTX-2337、单独PLD或其组合治疗的小鼠中发现肿瘤浸润CD40+(活化的)巨噬细胞(CD45+CD11b+)、pDC(CD45+CD123+)和mDC(CD45+CD11c+)增加(图3D)。有趣的是,在用所述组合治疗的小鼠中,肿瘤浸润巨噬细胞与pDC比率和mDC与pDC比率相较各单独药物有相对的增加。
TLR8活化促进PLD后肿瘤特异性CTL的发展
上述结果显示了针对肿瘤的PLD和VTX-2337之间强的正相互作用。CD8+T细胞介导的排斥是抗肿瘤免疫反应的重要组成,并且可以是上述相互作用调节机制之一。重要的是,所述VTX-2337加上PLD组合生成有效的肿瘤抑制。
在研究这种相互作用的过程中,响应PLD、VTX-2337或其组合分析所述T细胞浸润的质量。分离来自仅用单独药物、PLD和VTX-2337组合或对照/载剂治疗的NSG-HIS-A2小鼠中收集的肿瘤TIL,并且用rhIL-2扩增(600IU/mL)。从非荷瘤NSG-HIS-A2小鼠的脾中分离T细胞作为对照。
离体扩增的TIL过继转移(在肿瘤接种后第30和40天)到负荷OVCAR5肿瘤的NSG小鼠中。从载剂对照或PLD治疗供体分离的TIL、以及来自非荷瘤小鼠脾的T细胞,过继转移到荷瘤受体中,不能控制受体小鼠中肿瘤的生长(图4B)。然而,来自用PLD和VTX-2337组合(“PLD/VTX-2337”或“VTX-2337/Doxil”)治疗的小鼠的TIL能有效控制受体小鼠中OVCAR5肿瘤的生长(图4B)。这些结果确证了在体内,PLD和TLR8激动剂组合引起有效T细胞抗肿瘤免疫反应。
就体外肿瘤特异性CTL的存在测试TIL。来自用PLD和VTX-2337组合治疗的供体小鼠的TIL有效裂解51Cr标记的OVCAR5靶标细胞(图4A),而来自仅用PLD治疗的供体小鼠的TIL有更少裂解活性。其裂解靶标细胞的能力显著高于来自对照/载剂治疗组的TIL。在所有治疗组中,通过TIL的靶标细胞裂解归因于CTL响应MHC-I限制抗原,因为加入抗I型MHC中和抗体降低了CTL的杀灭(图4C)。TIL与OVCAR5细胞或黑素瘤细胞系共培养。来自PLD和PLD/VTX-2337治疗供体的TIL响应OVCAR5细胞时,比黑素瘤细胞释放显著更多的IFNγ(图4D)。来自对照未治疗小鼠的TIL响应OVCAR5刺激产生最少特异性IFNγ。从非荷瘤小鼠的脾扩增的淋巴细胞没有显示响应OVCAR5细胞的细胞溶解活性或IFNγ生成。
来自PLD/VTX-2337治疗小鼠的CTL(细胞毒性T细胞或细胞毒性淋巴细胞)有比仅用PLD治疗小鼠高得多的细胞毒性活性水平,确证了APC的TLR8活化增强了抗肿瘤特异性T细胞的发育。所述CTL活性是I型MHC限制性和对OVCAR5特异,如加入mAb到I型MHC和缺乏针对不相关HLA-A2+靶标细胞活性所显示。使用过继转移实验,显示了肿瘤特异性CTL活性的增加是由于所述PLD/VTX-2337治疗赋予的体内抗肿瘤活性。在用OVCAR5攻击后30天和40天,用1x107T细胞过继转移的非重建NSG荷瘤小鼠中,来自给予小鼠的经扩增肿瘤浸润细胞能有效控制肿瘤生长。有趣的是,来自仅用治疗小鼠的肿瘤的细胞不比来自对照治疗小鼠的细胞更有效。
结果还显示了通过VTX-2337的APC活化增强了由蒽环类抗生素诱导的获得性免疫反应的发展。而当给予PLD时,肿瘤特异性CTL的发展是VTX-2337治疗影响的重要组成,释放有抗肿瘤活性的调节剂能是互补的。释放高水平IFNγ能活化NK细胞,增加肿瘤细胞的裂解。通过VTX-2337的IL-12释放也在对肿瘤的成功免疫反应发展中有重要应用。报道了这个调节剂活化NK细胞,增强抗血管生成通路,和扩大Th1和CTL反应,并且也有由TNFα增强的直接抗肿瘤活性。因此,评价由VTX-2337的选择性TLR8活化诱导的调节剂对OVCAR5肿瘤细胞的直接活性。
TNFα部分介导TLR8活化和PLD间的相互作用
进行实验以显示TNFα引起用Doxil/VTX-2337组合观察到的抗肿瘤活性增强。用VTX-2337(1ug/ml)或抗CD3/28珠活化新鲜淘选的人PBMC,并且6小时后收集所述培养基。OVCAR5细胞暴露于所述培养基,并且在24小时进行凋亡评价,而在48小时评价细胞活力。
除了肿瘤特异性CTL,TLR8活化也可以引起先天抗肿瘤反应,包含释放可溶性调节剂如TNF家族成员,其能直接作用于肿瘤细胞以诱导凋亡。由于TLR8活化与生成高水平TNFα有关,如图1所示,TNFα是VTX-2337影响的可能调节剂。用Western印迹测试并且记录OVCAR5细胞中TNFα受体1(TNFR1)的表达(图5C)。在OVCAR5细胞对TNFα的灵敏度测试中,用20ng/mlTNFα孵育细胞24小时,所述剂量施加直接细胞毒性影响。尽管表达TNFR1,OVCAR5细胞对TNFα介导的凋亡有抗性,如膜联蛋白V和7AAD染色所测试(图5D)。
肿瘤细胞能通过过量表达FADD样IL-1h转化酶(FLICE)样抑制蛋白或FLIP而抵抗TNFα介导的凋亡。FLIP能以长形式(FLIPL,55KDa)和短形式(FLIPS,28KDa)存在,能阻断不同细胞类型中TNFα家族成员(包含TNFα和TRAIL)诱导的凋亡。OVCAR5细胞表达FLIPL,所述FLIPL是55Kd形式的FLIP(图5E,CTRL泳道:对照未处理细胞)。
由于多柔比星引起细胞死亡并且VTX-2337增强其体内活性,已经测试了多柔比星使OVCAR5细胞对TNFα诱导的凋亡更加敏感。OVCAR5细胞用对照培养基或包含1μg/mL的PLD培养基预孵育24小时,然后用对照培养基或包含TNFα(20ng/ml)的培养基孵育12小时。单独TNFα和Doxil诱导最小凋亡,而当细胞用所述两种试剂组合处理时,检测到凋亡显著增加(图5D)。发现用PLD处理OVCAR5细胞抑制了FLIP的表达,由western印迹所显示(图5E)。
如图1C和图2所示,VTX-2337或组合处理体内显著上调了TNFα。TNFα受体家族对肿瘤细胞的活化能引起半胱天冬酶8的活化,产生凋亡。发现OVCAR5细胞表达所述TNFα受体1,但是几乎完全抗单独TNFα。然而,与单个试剂相比,用组合试剂处理OVCAR5细胞时检测到凋亡增加。多柔比星通过嵌插到DNA上杀死细胞,其损伤DNA复制,抑制翻译,造成受损的大分子生物合成,并且通过生成ROS来损害DNA。也显示了由PLD预处理的OVCAR5细胞抑制FLIP表达,提示了损害新蛋白合成使这些肿瘤细胞对由TNF家族成员介导的凋亡更加敏感。
总之,多柔比星介导的肿瘤细胞死亡不是免疫沉默,但是由免疫系统活化和参加肿瘤细胞控制的获得性免疫反应发展介导。然而,多柔比星活性也能由于免疫系统毒性损伤保护性免疫反应发展。出乎意料的是,发现加入TLR8激动剂VTX-2337到治疗方案增强了使用荷瘤NSG-HIS小鼠的新卵巢癌鼠模型中的抗肿瘤影响。发现VTX-2337处理增加了免疫细胞向肿瘤的迁移,并且增强了能体外裂解OVCAR5细胞和体内控制肿瘤生长的肿瘤特异性CTL的发育。TLR8的活化也造成释放有抗肿瘤活性并能进一步增强抗肿瘤反应的多个调节剂,包含TNFα、IL-12和IFNγ。由TLR8活化引起的高水平TNFα能直接作用于OVCAR5细胞以诱导凋亡,而由于多柔比星对蛋白合成的影响,使得细胞对这个凋亡通路更加敏感。总体来说,这些结果显示了免疫治疗能增加当前卵巢癌癌症治疗的有效性。正在进行VTX-2337与组合的研究作为有晚期复发卵巢癌患者的二线治疗。
实施例2:VTX-2337的效力和选择性
在来自15个健康供体的外周血单核细胞(PBMC)以及在转染有TLR8或TLR7和NF-κB驱动报道基因的HEK293细胞中评价TLR8和TLR7的VTX-2337活化的半最大有效浓度(EC50)。如图6所示,在PBMC中,VTX-2337刺激生成TNFα(EC50为74nM的TLR8活化标记),和生成IFNα(EC50>3,333nM的TLR7活化标记),指示了VTX-2337对TLR8相较TLR7有>45倍的更高选择性。来自TLR7和TLR8HEK293转染体的数据与使用对TLR8的EC50为70nM和对TLR7为2,005nM的PBMC获得的数据密切相关。也观察到VTX-2337对TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6或TLR9在浓度多至25μM时没有活性。
实施例3:在人全血中VTX-2337刺激一定范围的细胞因子和趋化因子
使用人多分析物组(MAP)1.8版(RBM(Rules Based Medicine))定性VTX-2337的免疫刺激属性,以定量98种与炎性过程有关的不同分析物的水平,所述分析物包含细胞因子、趋化因子和白细胞响应TLR7/8活化生成的其他蛋白。从6个正常人志愿者收集全血,并且使用即时白细胞培养系统用浓度0.1、0.3、1.0和3.0μM的VTX-2337体外活化。用VTX-2337的共培养引起很多免疫调节剂的剂量依赖性增加,所述免疫调节剂包含TNFα、IL-12p40、IL-1β和MIP-1β,如图7所示。
实施例4:VTX-2337活化单核细胞和髓样树突细胞(mDC)但不是浆细胞样树突状细胞(pDC)
为评价VTX-2337的细胞特异性,用0.8μM VTX-2337刺激来自健康供体的人PBMC,并且通过流式细胞仪评价PBMC中所存在特异性细胞亚组的胞内细胞因子生成。如图8所示,数据表示为单核细胞(CD14+)、pDC(CD123+)和mDC(CD11c+)中对IL-12、TNFα和IFNα阳性的细胞百分比。各数据点表示来自单个供体的反应(n=10)。横条代表组平均值。在VTX-2337处理的单核细胞和mDC但不是pDC中评价IL-12和TNFα的胞内水平,与TLR8的细胞表达模式一致。
实施例5:VTX-2337的I期临床研究
当给予有晚期实体瘤或淋巴瘤的成人对象时,进行剂量递增研究以评价VTX-2337的安全性、耐受性和药理学。所述研究的首要目标是评价VTX-2337的安全性和药代动力学,以及鉴定任意剂量限定性毒性。所述研究的第二目标是评价对VTX-2337的药效学反应,和确定有VTX-2337的单个治疗周期的最大耐受剂量(MTD)。
研究过程:对于两个周期,在28天剂量周期的第1、8和15天,每周通过皮下注射给予VTX-2337。使用改良的Fibonacci剂量递增方案,连续组接受剂量范围为0.1mg/m2-3.9mg/m2的VTX-2337。对于药代动力学分析,在第一治疗周期的第一剂量后收集血浆样品,而对于药效学研究,在第一和第二治疗周期的第一剂量后收集血浆样品。
通过RECIST评价临床反应,并且使有CR(即全部反应)、PR(即部分反应)或SD(即稳定疾病)的患者接受其他治疗周期。
患者人口统计:在8个连续组中评价有各种晚期实体恶性肿瘤的33个患者。评价的肿瘤分布如下:结直肠(n=9,或招募对象的27%)、胰腺(n=6/18%)、黑素瘤(n=5/15%)、胆管癌(n=2/6%)、肾细胞(n=2/6%)和有肝细胞、乳腺、子宫内膜、前列腺、卵巢、舌腺样囊性癌、转移基底细胞、十二指肠和肝的神经内分泌癌、未知来源肿瘤的患者各1个(3%)。
在皮下给予第一剂量VTX-2337后0.5、1、1.5、2、4、8和24小时收集样品,并且通过LC-MS/MS定量VTX-2337的血浆水平。VTX-2337快速吸附到全身循环中,给药后出现的平均T最大为0.5-0.8小时。VTX-2337也从循环中快速清除,平均半衰期(t1/2)范围为1.7-6.7小时。随着剂量增加,峰值血浆水平(C最大)和总体全身接触都增加。就C最大和AUC(0-∞)计算剂量标准化(DN)的值。通常,在评价的剂量范围中,所述VTX-2337的药代动力学似乎是线性的。所述药代动力学结果示于图9和下表1。
表1
为评价对VTX-2337的药效学(PD)反应,在皮下注射第一周期VTX-2337的第一剂量后0、4、8、24小时收集血液。使用人多分析物组(MAP)1.8版(RBM(RulesBased Medicine))定量免疫调节剂的血浆水平。在给药后4–8小时观察到包含G-CSF、MCP-1、MIP-1β和TNFα在内很多生物标记的剂量依赖性增加,24小时时水平通常回到基线。显示从9个健康志愿者收集的血浆中的调节剂水平以与肿瘤学群作比较。皮下给予VTX-2337后的药效学反应示于下表2。
表2
有VTX-2337的第一和第二治疗周期的第一剂量后(第1天和第29天)测量VTX-2337的药效学反应,以评价重复给予是否生成类似影响。图10A和10B中的条表示接受多个VTX-2337周期的各组中,来自个体患者的G-CSF和MIP-1β的血浆水平。一次VTX-2337治疗周期后,免疫反应既没有扩大,也没有广泛脱敏。换言之,药效学反应与多个治疗周期一致。
不良事件概况:VTX-2337通常是安全和耐受良好的。最常见药物相关的不良事件是注射位点反应,轻微发烧和流感样症状。给予免疫调节剂后,这些观察并不出乎意料。没有观察到药物有关的血液或胃肠道不良事件。
总而言之,观察到每周皮下给予新型TLR8激动剂VTX-2337通常是安全和耐受良好的;VTX-2337的血浆水平和对VTX-2337的PD反应以剂量依赖性方式增加;并且皮下给予VTX-2337刺激生成与先天免疫反应活化一致的多种炎性调节剂,所述炎性调节剂包含细胞因子和趋化因子。
通过引用纳入
本文参考的各专利文档和科学论文的全部公开内容通过引用纳入以用于全部目的。
等同形式
本发明体现在其他特定形式中,而不偏离其精神或基本特性。因此认为前述实施方式在所有方面是说明性的,而不对本文所述发明构成限制。因此由附加的权利要求而不是前面描述指示发明的范围,并且因此意谓着包含与权利要求等同含义和范围之内的所有改变。
Claims (47)
1.一种用于治疗癌症的联合治疗的药物组合物,所述组合物包括含有苯并[b]氮杂TLR8激动剂和药学上可接受的运载体的制剂,其中,所述联合治疗还包含一种或多种其他治疗方案。
2.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂是2-氨基-N,N-二丙基-8-(4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂-4-羧酰胺或其药学上可接受的盐。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述癌症是选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌、结直肠癌、淋巴瘤、及其任意组合的实体瘤。
4.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述一种或多种其他治疗方案包含给予有效量的抗癌剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述抗癌剂是多柔比星、吉西他滨、环磷酰胺或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂和所述抗癌剂同时或顺序给予。
7.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂和所述抗癌剂间隔5天给予。
8.如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述癌症是卵巢癌,和所述抗癌剂是多柔比星的peg化脂质体形式。
9.如权利要求8所述的药物组合物,其特征在于,所述多柔比星是静脉内给予。
10.如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述癌症是乳腺癌,和所述抗癌剂是吉西他滨或环磷酰胺。
11.如权利要求1-10中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述对象是哺乳动物。
12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂通过皮下途径、静脉内途径、肌肉内途径或透皮途径注射。
13.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂是皮下给予。
14.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述一种或多种其他治疗方案选自化疗剂、细胞因子、抗体、激素治疗和放疗。
15.如权利要求1-14中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂的剂量浓度是约0.02-约10mg/kg对象体重,或约0.04-约5mg/kg对象体重。
16.如权利要求1-14中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂的剂量浓度是约0.02mg/kg、约0.05mg/kg、约0.075mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、或约5mg/kg对象体重。
17.如权利要求1-14中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂的剂量浓度是约2.5-3.5mg/m2对象体表面积。
18.如权利要求1-14中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂的剂量浓度是约0.002mg/kg-0.006mg/kg对象体重。
19.如权利要求1-18中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂每周或每两周给予对象。
20.如权利要求4-9和11-19中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述多柔比星给予剂量是约0.02-10mg/kg对象体重或约0.04-5mg/kg对象体重。
21.如权利要求1-20中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂还包含约1%-约30%、约5%-15%、或约5%-约10%体重/体积的环糊精。
22.如权利要求1-20中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂还包含约1%、约5%、约10%、约15%、约20%、约25%或约30%体重/体积的环糊精。
23.如权利要求1-20中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂还包含约15%w/v的环糊精。
24.如权利要求21-23中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述环糊精是β环糊精。
25.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述癌症是淋巴瘤,和所述一种或多种治疗方案包含放疗。
26.如权利要求25所述的药物组合物,其特征在于,所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
27.一种治疗癌症的药物组合物,所述药物组合物包含苯并[b]氮杂TLR8激动剂,剂量是0.002mg/kg/周-0.006mg/kg/周。
28.如权利要求27所述的药物组合物,其特征在于,所述苯并[b]氮杂TLR8激动剂是2-氨基-N,N-二丙基-8-(4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂-4-羧酰胺。
29.如权利要求27所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂是2-氨基-N,N-二丙基-8-(4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂-4-羧酰胺或其药学上可接受的盐。
30.一种包含抗癌剂和苯并[b]氮杂TLR8激动剂制剂的药物组合物。
31.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述TLR8激动剂是2-氨基-N,N-二丙基-8-(4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂-4-羧酰胺或其药学上可接受的盐。
32.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述抗癌剂是多柔比星、吉西他滨、环磷酰胺或其药学上可接受的盐。
33.如权利要求32所述的药物组合物,其特征在于,所述多柔比星是peg化脂质体形式。
34.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂的TLR8激动剂浓度是约0.01-50mg/ml。
35.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂的TLR8激动剂浓度是约0.5mg/ml-约50mg/ml、约1mg/ml-约40mg/ml、或约2mg/ml-约15mg/ml。
36.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂的TLR8激动剂浓度是约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约8mg/ml、约0.5mg/ml-约15mg/ml、约0.5mg/ml-约4mg/ml、或约0.5mg/ml-约2mg/ml。
37.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂的TLR8激动剂浓度是约0.01mg/ml、约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约4mg/ml、约15mg/ml、约8mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml或约50mg/ml。
38.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂还包含1%-约30%、约5%-15%、约5%-约10%体重/体积的环糊精。
39.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂还包含约1%、约5%、约10%、约15%、约20%、约25%或约30%体重/体积的环糊精。
40.如权利要求30所述的药物组合物,其特征在于,所述制剂还包含约15%w/v的环糊精。
41.如权利要求38-40中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述环糊精是β环糊精。
42.如权利要求41所述的药物组合物,其特征在于,所述β环糊精是磺基丁基醚β-环糊精。
43.一种药包或药盒,所述药包或药盒包含一种或多种装有如权利要求30-42中任一项所述药物组合物的液体或冻干形式的容器。
44.如权利要求43所述的药包或药盒,其特征在于,所述药物组合物是水性制剂。
45.一种药包或药盒,所述药包或药盒包含一种或多种装有液体或冻干形式苯并[b]氮杂TLR8激动剂制剂的第一容器和一种或多种装有抗癌剂的第二容器。
46.如权利要求45所述的药包或药盒,其特征在于,所述TLR8激动剂是2-氨基-N,N-二丙基-8-(4-(吡咯烷-1-羰基)苯基)-3H-苯并[b]氮杂-4-羧酰胺或其药学上可接受的盐。
47.如权利要求45所述的药包或药盒,其特征在于,所述抗癌剂是多柔比星、吉西他滨、环磷酰胺或其药学上可接受的盐。
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