CN108096576B - Tlr8激活剂在制备结核疫苗佐剂中的用途及其制备的结核疫苗 - Google Patents

Tlr8激活剂在制备结核疫苗佐剂中的用途及其制备的结核疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及TLR8激活剂在制备结核疫苗佐剂中的用途及其制备的结核疫苗。所述TLR8激活剂具有如下所示的结构式：
Figure DDA0001529980220000011
本发明通过研究发现，TLR8激活剂TL8‑506在免疫小鼠受到结核分枝杆菌攻击时能提供保护效果，即可以作为结核疫苗的佐剂；进一步研究发现，TLR8激活剂TL8‑506联合氢氧化铝凝胶相比氢氧化铝凝胶在免疫小鼠受到结核分枝杆菌攻击时能提供更强的保护效果。

Description

TLR8激活剂在制备结核疫苗佐剂中的用途及其制备的结核 疫苗
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及TLR8激活剂在制备结核疫苗佐剂中的用途及其制备的结核疫苗。
背景技术
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis，MTB)引起的传染性疾病，严重危害人类健康。结核病是继艾滋病之后、在全世界由单一传染性病原体引起的最大杀手。目前，全世界有1/3的人口感染过MTB。据WHO统计，近年全球每年约有900万人新发结核病，150万人死亡。我国是全球22个结核病高负担国家之一，发病人数仅仅次于印度，居世界第二。卡介苗(Bacillus Calmette Guérin，BCG)是目前唯一批准使用的人用结核病疫苗，尽管其对儿童粟粒性结核病和结核性脑膜炎具有一定的预防效果，但是其对成年人肺结核的预防效果并不理想。而且，结核菌多药耐药菌株和广泛耐药菌株的出现、免疫缺陷疾病与结核病并发、流动人口的增加等因素，使得全球的结核病疫情形势更加严峻。因此，研究新型的结核疫苗具有重要意义。
疫苗佐剂是能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。佐剂能够诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。Toll样受体(TLR)是表达于多种细胞的一类模式识别受体，可以识别病原体，如细菌、病毒和寄生虫等的分子模式。人类共有10类TLR受体，分别识别高度保守的微生物分子模式。在识别病原体后，TLR受体与其配体相互作用触发下游信号级联反应，诱导促炎细胞因子和趋化因子分泌，上调MHC分子及共刺激分子，从而架起宿主抵御病原体攻击时固有免疫识别与适应性免疫应答(即：特异性T、B淋巴细胞反应)之间的桥梁。因此，TLR受体激动剂广泛应用于疫苗的佐剂。
然而，目前尚未见TLR8受体激动剂用于制备结核疫苗佐剂的相关报道，这可能是由于以下原因：首先，TLR7与TLR8在细胞内定位、配体类型(ssRNA等)、下游通路等方面很类似，特异性不强的激活剂如R848能同时激活TLR7和TLR8，诱导二者同时活化所导致的免疫反应，但TLR7与TLR8之间所存在的差异，以及二者间的相互作用，使得单独研究特异性激活TLR8的体内效应成为一个有待解决的问题。其次，小鼠作为最广泛使用的实验动物，其TLR8在功能上与人TLR8有较显著的差异，不能直接作为TLR8功能研究的体内模型。
发明内容
为此，本发明提出TLR8激活剂在制备结核疫苗佐剂中的用途，进而提供其制备的结核疫苗。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供TLR8激活剂在制备结核疫苗的佐剂中的用途。
优选地，上述用途，所述TLR8激活剂具有如下所示的结构式：
Figure BDA0001529980200000021
第二方面，本发明还提供一种结核疫苗的佐剂，包括以下成分：TLR8激活剂，铝盐。
优选地，上述佐剂，所述TLR8激活剂具有如下所示的结构式：
Figure BDA0001529980200000031
进一步优选地，上述佐剂，所述铝盐为氢氧化铝凝胶。
进一步优选地，上述佐剂，所述佐剂中，
Figure BDA0001529980200000032
0.28重量份，氢氧化铝凝胶5重量份。
第三方面，本发明还提供上述佐剂在制备结核疫苗中的用途。
第四方面，本发明还提供一种结核疫苗，包括以下成分：权利要求3-6任一项所述的佐剂，结核分枝杆菌抗原。
优选地，上述结核疫苗，所述结核分枝杆菌抗原为ESAT-6。
进一步优选地，上述结核疫苗，所述疫苗中，ESAT-6 0.12重量份。
进一步优选地，上述结核疫苗，所述疫苗中，包括以下成分：
Figure BDA0001529980200000033
0.1～1.0重量份，氢氧化铝凝胶1-10重量份，ESAT-6 0.05～1.2重量份。
进一步优选地，上述结核疫苗，所述疫苗中，包括以下成分：
Figure BDA0001529980200000034
0.28重量份，氢氧化铝凝胶5重量份，ESAT-6 0.12重量份。
进一步优选地，上述结核疫苗，所述疫苗中，包括以下成分：
Figure BDA0001529980200000041
0.1重量份，氢氧化铝凝胶10重量份，ESAT-6 0.05重量份。
进一步优选地，上述结核疫苗，所述疫苗中，包括以下成分：
Figure BDA0001529980200000042
1.0重量份，氢氧化铝凝胶1重量份，ESAT-6 1.2重量份。
进一步优选地，上述结核疫苗，所述疫苗中，包括以下成分：
Figure BDA0001529980200000043
0.6重量份，氢氧化铝凝胶8重量份，ESAT-6 0.20重量份。
第五方面，本发明还提供上述结核疫苗的制备方法，包括以下步骤：分别取选定重量份的TLR8激活剂、铝盐和结核分枝杆菌抗原，混合均匀，静置，即得。
优选地，上述结核疫苗的制备方法，包括以下步骤：分别取选定重量份的
Figure BDA0001529980200000044
氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明通过研究发现，TLR8激活剂TL8-506在免疫小鼠受到结核分枝杆菌攻击时能提供保护效果，即可以作为结核疫苗的佐剂；
(2)本发明通过进一步研究发现，TLR8激活剂TL8-506联合氢氧化铝凝胶相比氢氧化铝凝胶在免疫小鼠受到结核分枝杆菌攻击时能提供更强的保护效果。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1(a)是实验例1中TLR8在野生型C57BL/6小鼠脾脏中单核细胞(CD11b+)中的表达比例，图1(b)是实验例1中TLR8在转基因小鼠的脾脏中单核细胞(CD11b+)中的表达比例，图1(c)是实验例1中TLR8在野生型C57BL/6小鼠的骨髓中单核细胞(CD11b+)中的表达比例，图1(d)是实验例1中TLR8在转基因小鼠的骨髓中单核细胞(CD11b+)中的表达比例；
图2是实验例1中野生型和转基因小鼠骨髓细胞对TLR8激活剂的不同应答水平；
图3(a)是实验例1中初免-加强方式免疫后的转基因小鼠，给予结核分枝杆菌H37Rv攻击10周后，不同组织(肺、脾、肝)内结核分枝杆菌的荷菌量；图3(b)是实验例1中初免-加强方式免疫后的转基因小鼠，给予结核分枝杆菌H37Rv攻击10周后，不同组织(肺、脾、肝)经过BACTEC MGIT 960系统(BD)检测给出的样品报阳时间；图3(c)是实验例1中初免-加强方式免疫后的转基因小鼠，给予结核分枝杆菌H37Rv攻击10周后，不同组织(肺、脾、肝)经过BACTEC MGIT 960系统(BD)检测给出的样品生长单元；
图4(a)是实验例1中初免-加强方式免疫后的转基因小鼠，给予结核分枝杆菌H37Rv攻击10周后，肺组织的病理表现；图4(b)是实验例1中初免-加强方式免疫后的转基因小鼠，给予结核分枝杆菌H37Rv攻击10周后，肉芽肿的比例；
图5(a)和5(b)分别是实验例1中初免-加强方式免疫后的转基因小鼠，给予结核分枝杆菌H37Rv攻击10周后，检测脾的CD8+中央记忆性T细胞比例CD44hiCD62Lhi的代表性流式分析图和流式统计图；
图6(a)是实验例1中实施例1制备的疫苗免疫小鼠2周后诱导的CD8+中央记忆性T细胞比例，图6(b)是实验例1中实施例1制备的疫苗免疫小鼠2周后分泌IFNγ的抗原特异性CD4+T细胞；
图7(a)是实验例1中I型干扰素信号通路缺失时，TL8-506诱导的中央记忆性T细胞形成，IFNAR1敲除水平代表性流式分析图；图7(b)是实验例1中I型干扰素信号通路缺失时，TL8-506诱导的中央记忆性T细胞形成，免疫2周后，免疫所诱导的CD8+中央记忆性T细胞形成受损；
图8是实验例1中氢氧化铝和TL8-506的吸附实验的具体实验结果。
具体实施方式
本发明以下实施例和实验例中，TL8-506是指
Figure BDA0001529980200000061
CAS号为：1268163-15-0；氢氧化铝凝胶和ESAT-6也为市售品。
实施例1
本实施例结核疫苗的成分为：TL8-506 25μg，氢氧化铝凝胶450μg，ESAT-6 10μg；
其制备方法为：分别取选定重量的TL8-506、氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
实施例2
本实施例结核疫苗的成分为：TL8-50625.2μg，氢氧化铝凝胶450μg，ESAT-6 10.8μg；
其制备方法为：分别取选定重量的TL8-506、氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
实施例3
本实施例结核疫苗的成分为：
Figure BDA0001529980200000071
9μg，氢氧化铝凝胶900μg，ESAT-64.5μg；
其制备方法为：分别取选定重量的TL8-506、氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
实施例4
本实施例结核疫苗的成分为：
Figure BDA0001529980200000072
氢氧化铝凝胶90μg，ESAT-6 108μg；
其制备方法为：分别取选定重量的TL8-506、氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
实施例5
本实施例结核疫苗的成分为：
Figure BDA0001529980200000073
54μg，氢氧化铝凝胶720μg，ESAT-618μg；
其制备方法为：分别取选定重量的TL8-506、氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
实施例6
本实施例结核疫苗的成分为：
Figure BDA0001529980200000081
8.9μg，氢氧化铝凝胶900μg，ESAT-6 4.2μg；
其制备方法为：分别取选定重量的TL8-506、氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
实施例7
本实施例结核疫苗的成分为：
Figure BDA0001529980200000082
89.2μg，氢氧化铝凝胶90μg，ESAT-6 100μg；
其制备方法为：分别取选定重量的TL8-506、氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
实施例8
本实施例结核疫苗的成分为：
Figure BDA0001529980200000083
53.6μg，氢氧化铝凝胶720μg，ESAT-6 16.7μg；
其制备方法为：分别取选定重量的TL8-506、氢氧化铝凝胶和ESAT-6，混合均匀，静置1h，即得。
实验例1TL8-506作为结核疫苗的佐剂的研究
1、实验目的
研究TL8-506对结核病疫苗免疫效果的影响。
2、实验方法及实验结果
2.1单核巨噬细胞特异表达人TLR8基因的C57BL/6小鼠品系的建立
将人TLR8基因的开放阅读框加上巨噬细胞特异的合成启动子SP146+P47后转入C57BL/6小鼠，筛选并建立这样一种转基因小鼠，其表达的人TLR8水平相对较低以避免自发性的自身免疫性疾病，同时其体内表达分布与人类似(以单核细胞为主)。通过流式检测该转基因小鼠的稳定后代骨髓和脾脏中人TLR8蛋白。
将小鼠脾脏在70μm尼龙膜上轻柔研磨至磷酸盐缓冲液(PBS)中以获得脾单细胞悬液。使用PBS从小鼠大腿骨内冲洗出骨髓，吹打均匀后通过100μm尼龙膜以获得骨髓单细胞悬液。分别加入红细胞裂解液混匀，10min后1500rpm离心5min弃去上清。PBS洗两遍。细胞计数后，将106个细胞用100μL染色缓冲液(含0.09％胎牛血清的缓冲盐溶液)重悬，加入1μgRat IgG抗小鼠CD16/CD32(Fc block)后4℃孵育15min。加入5μL CD11b-FITC抗体，混匀后4℃避光孵育30min。加入1mL染色缓冲液洗两遍，离心弃上清(离心条件同上)。加入BD公司固定破膜试剂盒中250μL固定破膜液，4℃20min，加入1mL破膜漂洗液洗两遍，离心去上清。加入50μL破膜漂洗液重悬，加入5μL TLR8-Fluro 647抗体，混匀后4℃避光孵育30min。加入1mL破膜漂洗液洗两遍后，用500μL染色缓冲液重悬后进行流式检测。
具体实验结果如图1(a)～1(d)所示。
由图1(a)～1(b)可知，在TLR8转基因小鼠脾细胞中CD11b+TLR8+细胞群显著多于野生型小鼠；由图1(c)～1(d)可知，在TLR8转基因小鼠骨髓细胞中CD11b+TLR8+细胞群显著多于野生型小鼠。
2.2野生型和转基因小鼠骨髓细胞对TLR8激活剂的应答水平
使用PBS从小鼠大腿骨内冲洗出骨髓，吹打均匀后通过100μm尼龙膜以获得骨髓单细胞悬液。分别加入红细胞裂解液混匀，10min后1500rpm离心5min弃去上清。PBS洗两遍。细胞计数后，将5×106个细胞用2mL含10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养基重悬，分入6孔板内。实验组加入终浓度为2μg/mL的TL8-506，混匀后37℃孵育12h。1500rpm离心5min弃上清，PBS将细胞漂洗一遍，每孔细胞加入1mL TRIzol，提取RNA后反转录为cDNA。利用实时定量PCR方法检测细胞中IL-1β、IL6、TNF-α的mRNA表达水平，以Gapdh为内参基因。
具体实验结果如图2所示。
由图2可知，转基因小鼠骨髓细胞能对TLR8激活剂(TL8-506)产生迅速应答，而野生型小鼠骨髓细胞则无显著应答。
2.3检测免疫小鼠受到结核分枝杆菌攻击时的保护效果
将6周龄的雌性转基因小鼠随机分成4组，每组4只，分别肌肉注射90μL PBS(正常对照组和感染对照组)、450μg氢氧化铝凝胶和10μg ESAT-6制备的疫苗(ESAT6-氢氧化铝凝胶免疫组)、25μg TL8-506，450μg氢氧化铝凝胶和10μg ESAT-6制备的疫苗(ESAT6-氢氧化铝-TL8-506免疫组，即实施例1制备的疫苗免疫组)。4周后，各组按上述剂量加强免疫一次。再经过4周后，感染对照组、ESAT6-氢氧化铝凝胶免疫组和ESAT6-氢氧化铝-TL8-506免疫组通过尾静脉注射方式接受200μL 105CFU结核分枝杆菌H37Rv攻击。感染10周后进行解剖，测定各组不同组织(肺、脾、肝)内结核分枝杆菌荷菌量，肺组织在10％福尔马林溶液中固定4天后进行石蜡包埋、切片及HE染色，脾脏制备成单细胞悬液后进行染色及流式检测。上述实验方案经中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全三级实验室管理委员会批准，感染过程及感染动物饲养均在中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全三级实验室内完成。
初免-加强方式免疫后的转基因小鼠，给予结核分枝杆菌H37Rv攻击10周后，检测不同组织(肺、脾、肝)内结核分枝杆菌的荷菌量，具体实验结果如图3(a)～3(c)所示；检测肺组织的病理表现及肉芽肿的比例，具体实验结果如图4(a)～4(b)所示；检测脾的CD8+中央记忆性T细胞比例CD44hiCD62Lhi，具体实验结果如图5(a)～5(b)所示。
由图3(a)可知，以罗氏培养基培养方式测定，实施例1制备的疫苗免疫组小鼠肺中荷菌量显著低于感染对照组及ESAT6-氢氧化铝凝胶(氢氧化铝凝胶450μg和ESAT-6 10μg)免疫组；由图3(b)和3(c)可知，以MGIT 960系统培养方式测定，实施例1制备的疫苗免疫组小鼠肺中荷菌量显著低于感染对照组及ESAT6-氢氧化铝凝胶(氢氧化铝凝胶450μg和ESAT-6 10μg)免疫组。
由图4(a)～4(b)可知，实施例1制备的疫苗免疫组小鼠肺组织病变显著轻于感染对照组及ESAT6-氢氧化铝凝胶(氢氧化铝凝胶450μg和ESAT-6 10μg)免疫组。
由图5(a)～5(b)可知，实施例1制备的疫苗免疫组小鼠脾脏中CD8+中央记忆性T细胞比例显著高于感染对照组及ESAT6-氢氧化铝凝胶(氢氧化铝凝胶450μg和ESAT-6 10μg)免疫组。
这表明，实施例1制备的疫苗比ESAT6-氢氧化铝凝胶(氢氧化铝凝胶450μg和ESAT-6 10μg)在免疫小鼠受到结核分枝杆菌攻击时能提供更强的保护效果。
2.4免疫记忆和Th1型免疫应答
将6周龄的雌性转基因小鼠随机分成3组，每组4只，分别肌肉注射90μL PBS(未免疫组)，450μg氢氧化铝凝胶和10μg ESAT-6制备的疫苗(ESAT6-氢氧化铝凝胶免疫组)，25μgTL8-506，450μg氢氧化铝凝胶和10μg ESAT-6制备的疫苗(ESAT6-氢氧化铝-TL8-506免疫组，即实施例1制备的疫苗免疫组)。4周后，各组按上述剂量加强免疫一次。两周后解剖，脾脏制备成单细胞悬液后，进行染色及流式检测CD8+中央记忆性T细胞比例，并通过酶联免疫斑点实验检测分泌IFNγ的抗原特异性CD4+T细胞比例。酶联免疫斑点实验过程具体如下：将上述方法制备的各组脾脏单细胞悬液活细胞计数后，按每孔8×105个细胞的密度加入至鼠IFNγ预包被的PVDF板内，每只小鼠3个重复孔。每孔加入终浓度为40μg/mL ESAT-6，37℃孵育16小时后，进行细胞裂解、抗体孵育、显色和斑点计数。具体实验结果如图6(a)～6(b)所示。
由图6(a)～6(b)可知，实施例1制备的疫苗免疫小鼠2周后相比对照组能诱导更高的CD8+中央记忆性T细胞比例，更多分泌IFNγ的抗原特异性CD4+T细胞。
2.5作用机制研究
通过建立hTLR8+/IFNAR1KO的双修饰小鼠，I型干扰素信号通路缺失时，检测TL8-506诱导的CD8+中央记忆性T细胞形成。将6周龄的雌性基因修饰小鼠分成以下三组，hTLR8+/IFNAR1KO(肌肉注射450μg氢氧化铝凝胶和10μg ESAT-6制备的疫苗，即ESAT6-氢氧化铝凝胶免疫组)，hTLR8+/IFNAR1WT(肌肉注射25μg TL8-506，450μg氢氧化铝凝胶和10μgESAT-6制备的疫苗，即ESAT6-氢氧化铝-TL8-506免疫组)，hTLR8+/IFNAR1KO(肌肉注射25μgTL8-506，450μg氢氧化铝凝胶和10μg ESAT-6制备的疫苗，即ESAT6-氢氧化铝-TL8-506免疫组)，每组4只小鼠。4周后各组按上述剂量加强免疫一次。两周后解剖，脾脏制备成单细胞悬液后，进行染色及流式检测CD8+中央记忆性T细胞比例。具体实验结果如图7(a)～7(b)所示。
由图7(a)～7(b)可知，TL8-506诱导增强的CD8+中央记忆性T细胞形成依赖于I型干扰素信号通路。
2.6氢氧化铝和TL8-506的吸附实验
TL8-506与氢氧化铝按不同比例充分持续混合5min，静置1小时，14000g离心5min。将上清加入THP-1细胞中处理12h，检测THP-1细胞中TNFα和IFNαmRNA水平。上清如未刺激细胞表达TNFα和IFNαmRNA，则表明TL8-506被充分吸附；吸附比例大于0.1mg TL8-506/mg氢氧化铝。
具体实验结果如图8所示。由图8可知，氢氧化铝能够吸附TL8-506。
3、实验结论
本发明的结核疫苗在免疫小鼠受到结核分枝杆菌攻击时能提供更强的保护效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (3)

1.TLR8激活剂在制备结核疫苗的佐剂中的用途，其特征在于，所述TLR8激活剂作用依赖于I型干扰素信号通路；所述TLR8激活剂具有如下所示的结构式：
Figure 74683DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述佐剂包括以下成分：TLR8激活剂，铝盐；所述铝盐为氢氧化铝凝胶；TLR8激活剂0.1~1.0重量份，氢氧化铝凝胶1~10重量份。
3.权利要求2中所述的佐剂在制备结核疫苗中的用途，其特征在于，所述结核疫苗包括以下成分：权利要求2中所述的佐剂，结核分枝杆菌抗原；所述结核分枝杆菌抗原为ESAT-6；所述疫苗中，ESAT-6 0.05~1.2重量份。
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