CN103275986A - 京海黄鸡产蛋数分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及京海黄鸡300日龄产蛋数的分子遗传标记及筛选应用，该分子标记IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因。在育种筛选时，提取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物扩增得到192、250和270bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择选择AA/LL/OQ三基因复合基因型的个体。本发明方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。

Description

京海黄鸡产蛋数分子标记及应用
技术领域
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种利用复合基因型提高鸡产蛋数的方法。
背景技术
人类对家禽生产性状从无意识到有意识选择已经历几千年的历史，而从表型选择到遗传基础的研究和基因型选择这一过程仅是近几十年的事情。虽然常规育种方法在家禽遗传改良中取得一定进展，但它对数量性状的选择要在个体生长发育到一定时期，育种周期长，费用高。而家禽的生产性状多为数量性状，仅以个体或亲属表型值进行个体选择结果不十分可靠，因此，需要遗传标记进行辅助选择。在畜禽遗传育种过程中，人们致力寻找一些可靠的遗传标记来提高育种效率。随着人类基因组测序工作的完成，SNP的筛选及检测正式成为研究者广泛关注的焦点。SNPs作为第三代分子标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学等的研究中发挥着越来越重要的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用复合基因型提高鸡产蛋数的方法，该方法利用胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）、胰岛素样生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）和信号转导和转录激活子5b（STAT5b）基因的复合基因型对鸡的300日龄产蛋数进行标记辅助选择，不受环境影响。
本发明公开了IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因作为京海黄鸡300日龄产蛋数的分子遗传标记的应用。
基于上述应用的一种具体筛选方法是：提取待测样本的鸡基因组DNA，经特异性引物扩增得到192、250和270bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的基因型分别为AA/LL/OQ三基因复合基因型的个体，即在2276、2359、3746、3753和3754、9221和9401bp处分别为A、T、T、C、C、A/G和T等位基因的个体。
本发明的原理是：针对IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因分别设计1对引物，IGFBP-1引物的扩增产物经SSCP分析产生3种基因型（AA、AB和BB），直接测序表明BB型与AA型相比在2276bp处发生了A→T突变，在2359bp处发生了T→C突变；IGFBP-2引物的扩增产物经SSCP分析产生3种基因型（KK、KL和LL），LL型与KK型在3746bp处发生了G→T突变，在3753bp处发生了TT→CC的突变；STAT5b引物的扩增产物经SSCP分析产生5种基因型（OO、OP、OQ、PP和PQ），QQ型与OO型相比检测到A9921G突变，PP型和OO型相比发现一处T9401C突变。3个基因不同复合基因型与京海黄鸡300日龄产蛋数的相关分析表明，三个基因复合基因型AA/LL/OQ基因型组合的300日龄产蛋数最多，显著的高于AB/KK/PP、BB/KK/PP和BB/LL/OP复合基因型（P<0.05）。分析表明AA/LL/OQ复合基因型的300日龄产蛋数比复合前基因型的均值增加了7.00%。
本发明方法选择的效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于京海黄鸡300日龄产蛋数的分子遗传标记。
附图说明
图1是IGFBP-1基因的SSCP图谱。1，2：BB型；5，6：AA型；3，4：AB型。
图2是IGFBP-1基因的测序图。
图3是IGFBP-2基因的SSCP图谱。1，2，6：KK；3，5：LL；4：KL。
图4是IGFBP-2基因的测序图。
图5是STAT5b基因的SSCP图谱。1：QQ型；2：PP型；3：PQ型；4，5：OQ型；6，8：OP型；7：OO型。
图6是STAT5b基因的测序图。
具体实施方式
实施例1
1.试验材料
200只京海黄鸡血样采自江苏京海禽业集团有限公司，翅静脉采集血样1.5mL，肝素钠抗凝，-20℃保存。用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE，对基因组DNA进行浓度测定后备用。
2.引物设计和PCR扩增
2.1SSCP引物的设计
分别根据GenBank中已发表鸡的IGFBP-1基因外显子2序列（登录号为：NC_006089）、IGFBP-2基因第3内含子序列（登录号：NC_006094）、STAT5b基因内含子13序列（登录号：NC_006114）设计1对引物。扩增产物大小分别为192、250和272bp。引物序列如下：
IGFBP-1：F:5’-CCAGAATCTACCGAGCCTGA-3’（SEQ ID NO：1）
         R:5’-CCCACTCACCTGTTCTTTCC-3’（SEQ ID NO：2）
IGFBP-2：F:5’-GTGAGGGTGATCAAATCCCTA-3’（SEQ ID NO：3）
         R:5’-AAGCAGGACCACATCCATCT-3’（SEQ ID NO：4）
STAT5b：F:5’-ACCCTGTGCCGTGTCTTTC-3’（SEQ ID NO：5）
        R:5’-AGAGCAGCCAAGCCCATC-3’（SEQ ID NO：6）
2.2PCR扩增
PCR扩增反应体系为20μL：10×buffer（25mmol/L）2μL；Mg2+（10pmol/μL）2.2μL；dNTPs（2.5mmol/L）0.8μL，DNA模板1μL，引物（均为10pmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，双蒸水11.8μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存，3对引物的退火温度分别为60、60和61℃。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.3PCR-SSCP检测
2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃变性10min，然后冰浴5min。3对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10%，凝胶交联度为29：1，电压都为150V，过夜电泳。
IGFBP-1引物的SSCP图谱如图1所示，显示3种基因型（带型表明形成了3种基因型，两种纯合型分别用AA和BB表示，杂合型用AB表示，AA型在2276和2359bp处的等位基因分别为Ａ和Ｔ，BB型在相应的位点分别为Ｔ和Ｃ），分别定义为AA、AB和BB型。测序表明BB型与AA型相比在2276bp处发生了A→T突变，导致氨基酸的改变（Ile→Leu），在2359bp处发生了T→C突变，导致密码子ATT突变为ATC，但均编码异亮氨酸，属于同义突变（图2）。
IGFBP-2引物的SSCP图谱如图3所示，显示3种基因型（带型表明形成了3种基因型，两种纯合型分别用KK和LL表示，杂合型用KL表示，KK型在3746、3753和3754ｂp处的等位基因分别为G、T和T，LL型在相应的位点分别为T、C和Ｃ），分别定义为KK、KL和LL型。测序表明LL型与KK型相比在第3内含子区域发生了，3个突变分别为：3746bp处，G→T；3753和3754bp处，TT→CC（图4）。
STAT5b引物SSCP图谱如图5所示，显示6种基因型（带型表明形成了6种基因型，三种纯合型分别用OO、PP和QQ表示，相应的杂合型用OP、OQ和PQ表示，OO型在9221和9401bp处的等位基因分别为A和Ｔ，PP型在相应的位点分别为A和Ｃ，QQ型在相应的位点分别为G和T），分别定义为OO、OP、OQ、PP、PQ和QQ基因型。取OO、PP和QQ3种基因型的PCR产物片段进行测序。结果发现：QQ与OO相比在外显子13中检测到A9921G突变，PP和OO相比在内含子13内有一处T9401C突变（图6）。
2.4IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因复合基因型对京海黄鸡300日龄产蛋数的效应分析
配合下列模型分析IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b复合基因型对京海黄鸡300日龄产蛋数的影响：Y=μ+IGFBP-1基因的基因型效应+IGFBP-2基因的基因型效应+STAT5b基因的基因型效应+残差效应。京海黄鸡复合基因型AA/LL/OQ与不同复合基因型300日龄产蛋数的比较见表1。
表1  京海黄鸡复合基因型AA/LL/OQ与不同复合基因型300日龄产蛋数的比较
复合基因型 300日龄产蛋数（个）
AA/LLOQ 117.80±5.53a
BB/KK/PP 94.50±6.18c
AB/KK/PP 98.50±6.18bc
BB/LL/OP 100.00±6.18bc
AB/LL/OP 102.00±3.43abc
AA/LL/OP 102.17±5.05abc
AA/KK/OO 102.87±3.19abc
AB/KK/OO 105.28±2.91abc
AB/KK/OP 106.27±3.73abc
AA/KL/OO 106.75±6.18abc
BB/LL/OO 107.10±3.91abc
AA/LL/OO 107.47±3.00abc
BB/KK/OO 109.22±4.12abc
BB/KL/OP 109.25±6.18abc
AA/KK/OP 109.75±3.09abc
BB/KK/OP 111.13±4.37ab
AB/LL/OO 111.50±3.30ab
AA/KL/OP 112.25±6.18ab
注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表可见，三基因复合基因型AA/LL/OQ的300日龄产蛋数最多，比BB/KK/PP基因型多产23.3个（P<0.05），比AB/KK/PP基因型多产19.3个（P<0.05），比BB/LL/OP基因型多产17.8个（P<0.05），比17种复合基因型平均300日龄产蛋数105.65多产12.15个。在群体中筛选复合基因型AA/LL/OQ可以提高京海黄鸡群体300日龄产蛋数，所以根据IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的SSCP图谱筛选AA/LL/OQ三基因复合基因型可作为提早京海黄鸡300日龄产蛋数的方法，此法亦可推广至其他品种。
Figure IDA00003274932400011
Figure IDA00003274932400021

Claims (2)

1.IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因作为京海黄鸡300日龄产蛋数的分子遗传标记的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体操作是：提取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物扩增得到192、250和270bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择选择IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的基因型分别为AA/LL/OQ基因型的个体，即在2276、2359、3746、3753和3754、9221和9401bp处分别为A、T、T、C、C、A/G和T等位基因的个体。
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