CN103210849A - 荷叶离褶伞新菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3，其保藏编号是CCTCCNO: M2013007。Finc-LD-3菌株具有单株内菌柄长度均匀度好，抗杂菌能力强，栽培环节不需要覆土，采收期集中等特点，适宜工厂化推广种植。

Description

荷叶离褶伞新菌株
【技术领域】
本发明涉及食用菌技术领域，更确切地说，涉及一种荷叶离褶伞新菌株。 
【背景技术】
荷叶离褶伞（拉丁文名称Lyophyllum decastes），隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶伞属，是国内外食用菌界竞相研究培育的优良野生食用菌。荷叶离褶伞菌肉肥厚细腻、清香扑鼻、口感脆滑、味道鲜美、营养丰富，并且在对人体细胞的修复作用和在治疗心血管性疾病、抗衰老等方面已显示出极大的优越性，是一种食药兼用的名贵食用菌。从2006年开始，荷叶离褶伞在日本开始少量人工栽培并获得成功。基于此，亟待通过人工驯化和选育适合人工栽培的新菌株。 
【发明内容】
本发明解决的技术问题是提供一种荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3，该菌株具有单株内菌柄长度均匀度好，抗杂菌能力强，栽培环节不需要覆土，采收期集中等特点，适宜工厂化推广种植。 
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3是通过采集云南的野生资源，经驯化栽培，再经系统筛选获得。该菌株已经于2013年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:M2013007。 
本发明荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3的特征在于： 
1、形态特征 
Finc-LD-3的菌丝：气生菌丝浓密；菌盖：直径为3±2cm，颜色呈浅黄色，圆形，菌盖表面有细小绒毛，质地脆嫩、易碎；菌褶：浅黄色，菌褶断面呈月牙形；菌柄：长度为6～15cm，菌柄上部浅黄，下部洁白，靠近菌盖处的菌柄内部致密紧实，远离菌盖处菌柄中空，菌柄有鳞片，鳞片主要着生在靠近菌盖的中上部，分布不规律，菌柄簇生。 
2、生物学特性 
营养成分来源：木屑、玉米芯、米糠、麸皮、玉米粉、棉籽壳、大豆皮等，其中，含水量64%～66%(重量百分比，下同)。 
培养及栽培条件：菌丝体培养温度为20～25℃，湿度75%，CO2浓度2000 ～3500ppm，培养周期50～70天。适宜出菇温度为15～18℃，湿度93%～100%，CO2浓度1000～2000ppm，前1～7天，光照强度10～50Lux，后8～32天光照强度200～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期约为32天。 
3、遗传学特性 
荷叶离褶伞Finc-LD-3菌株的基因组DNA经过通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，获得大小约为690bp的特异性DNA片断，对该片段进行测序，序列信息参见序列表。 
本发明荷叶离褶伞Finc-LD-3新菌株，具有单株内菌柄长度均匀度好，子实体外观品质优良，抗杂菌能力强，降低了生产管理难度，栽培环节不需要覆土，采收期集中等特点，大大地降低了生产环节的人工作业强度，且单产高，适宜工厂化推广种植。 
【附图说明】
图1是本发明荷叶离褶伞Finc-LD-3菌株的子实体外观图片。 
图2是本发明荷叶离褶伞Finc-LD-3菌株的系统发育树。 
【具体实施方式】
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。 
实施例1本发明Finc-LD-3的驯化 
本实施例说明了荷叶离褶伞Finc-LD-3的驯化过程，具体步骤如下： 
1）配制培养基 
PDA培养基：每1L培养基用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。 
2)资源采集 
2007年9月，于云南宾川鸡足山1800～3000米海拔地带，采集野生资源4株，带回实验室，进行组织分离，再接种于PDA培养基上，获得待驯化菌株4个，编号分别为FLD-A，FLD-C，FLD-C，FLD-D。 
3）菌种驯化 
将获得的4个菌株中的FLD-C使用PDA培养基进行扩繁，22℃，湿度70%，二氧化碳浓度小于3000ppm，黑暗培养。 
对上述4个菌株分别进行传代培养，每次扩繁20支，接种12～15天后，选取发菌最快的两只试管继代扩繁，接种在PDA培养基上，接种12～15天后，再取发菌最快的两只试管继代扩繁，重复10个循环，至扩繁后代试管发 菌速率较快，发菌速率整齐均一，完成初步驯化工作，并用液氮保藏法将菌株保藏于上海市农科院食用菌研究所。 
4)生产配方筛选 
经多轮配方试验筛选，获得母种、栽培种配方为： 
母种培养基：木屑50%（重量百分比，下同）、米糠25%、麸皮15%和玉米粉10%，含水量为60%～62%。 
栽培种培养基：木屑15%，玉米芯25%、棉籽壳25%、米糠10%、麸皮20%和玉米粉5%，含水量为64%～66%。 
5)获得目标菌株：通过一系列的驯化选育工作，获得一个荷叶离褶伞菌株，它具有单株内菌柄长度均匀度好，抗杂菌能力强，栽培环节不需要覆土，采收期集中等特点，达到了驯化选育优良菌株的目的。该菌株被命名为“Finc-LD-3”。 
本发明荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3已于于2013年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2013007，菌株经检测存活，分类地位为离褶伞属荷叶离褶伞。 
实施例2碳源对荷叶离褶伞菌丝生长的影响 
供试碳源：葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉。 
所用基础培养基配方为：硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、蛋白胨2g、琼脂20g，加水1000ml。 
向基础培养基中分别加入供试碳源的一种，加入量为20g(纯C含量)，混匀后装入250ml三角瓶中，每瓶150ml，放入灭菌锅中121℃灭菌30min，待稍冷却后倒平板，每板约20ml培养基，每个平板中央接一直径为5mm的菌块，每一处理设置5次重复，置于25℃恒温条件下连续培养20天。每7天用十字交叉法测定菌落直径，用两次测试数值之差来除以间隔天数，即为平均每天的菌丝生长速率。 
表1碳源对Finc-LD-3和FLD-C菌丝生长的影响 
Figure BDA00002881076300031
由表1可知，从3种供试碳源来看，FLD-C在以淀粉为碳源的培养基中菌丝生长最快，平均生长速率达到1.38cm/d（即厘米/天，下同），其次为蔗糖，最后为葡萄糖；而本发明Finc-LD-3在以淀粉为碳源的培养基中菌丝平均生长速率最快，达到了1.42cm/d，要比野生菌株快0.04cm/d，在蔗糖和葡萄糖中生长偏慢，平均生长速率为0.74cm/d和0.57cm/d。由此说明，在不同碳源的培养基中，Finc-LD-3的平均菌丝生长速率都比野生菌株快，淀粉最好，且生长速率的一致性较好，变化范围小。 
实施例3氮源对荷叶离褶伞菌丝生长的影响 
供试氮源：硫酸铵、蛋白胨和麦麸。 
所用基础培养基配方为：硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水1000ml。 
向测定氮源所用的基础培养基中分别加入供试氮源的一种，加入量为2g（纯N含量），混匀后装入250ml三角瓶中，每瓶装150ml，放入灭菌锅中121℃灭菌30min，待稍冷却后倒平板，每板约20ml培养基，每个平板中央接一直径为5mm的菌块，每一处理设置5次重复，置于25℃恒温培养条件下连续培养20天。每7天用十字交叉法测定菌落直径，用两次测试数值之差来除以间隔天数，即为平均每天的菌丝生长速率。 
表2氮源对Finc-LD-3和FLD-C菌丝生长速率的影响 
Figure BDA00002881076300042
由表2可知，从3种供试氮源来看，FLD-C在以麦麸为氮源的培养基中菌丝生长最快，平均生长速率为1.74cm/d，其次为蛋白胨，最后为硫酸铵,仅0.35cm/d；而本发明Finc-LD-3在以麦麸为氮源的培养基中菌丝平均生长速率达到了1.83cm/d，比野生菌株快0.09cm/d，在蛋白胨中生长速率次之，为0.93cm/d，硫酸铵为氮源则生长最慢，为0.39cm/d。由此表明，在不同氮源的培养基中，Finc-LD-3的平均菌丝生长速率都比野生菌株快，麦麸最 好，蛋白胨次之，硫酸铵最差，菌丝生长速率的一致性以蛋白胨为最好。 
实施例4碳氮比对荷叶离褶伞菌丝生长的影响 
以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源，使用硫酸镁0.5g、酵母膏2g、磷酸二氢钾1g、琼脂20g，加水1000ml，配制碳氮比分别为20:1、30:1、40:1、50:1和60:1的5种培养基，装入250ml三角瓶中，每瓶装120ml，pH调整为6.0，放入灭菌锅中121℃灭菌30min，待稍冷却后倒平板。每板约20ml培养基，在每个平板中央接种一直径为5mm的菌块，每一碳氮比的处理设置5次重复，置于25℃恒温条件下连续培养20天。每5天用十字交叉法测定菌落直径，两次测试数值差除以间隔天数，即得出平均每天的菌丝生长速率，结果见表3。 
表3碳氮比对Finc-LD-3和FLD-C的菌丝生长的影响 
Figure BDA00002881076300051
从表3可知，当碳氮比由20:1增大到60:1时，Finc-LD-3和FLD-C两个菌株的菌丝平均生长速率变化趋势不明显，在碳氮比为60:1时，都达到最大平均生长速率，Finc-LD-3为0.44cm/d，且一致性较好，而FLD-C为0.38cm/d。由此表明，本发明Finc-LD-3菌株在不同碳氮比的培养基中培养，较野生菌株FLD-C的适应能力更强，发菌速率更快，同时还表明，Finc-LD-3菌株的生长速率受碳氮比影响很小，适宜在各不同碳氮比的培养基中生长，对培养基的适应能力较强。 
实施例5pH对荷叶离褶伞菌丝生长的影响 
用1.0%的氢氧化钠溶液和1.0%的盐酸溶液调节PDA培养基的酸碱度，得到pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的6个酸碱梯度。将所得的培养基分别装入250ml三角瓶中，每瓶120ml，放入灭菌锅中121℃灭菌30min，稍冷却倒平板。每培养皿平板约20ml培养基，待完 全冷却后即成固体平板。接种时，用灭菌的无菌打孔器取直径5mm的菌落一块，接种在PDA平板中央。同一pH条件做5次重复，置于25℃恒温培养条件下连续培养20天。每5天用十字交叉法测定菌落直径，两次测定数值之差再除以间隔天数，即得出平均每天的菌丝生长速率，结果见表4。 
表4pH对Finc-LD-3和FLD-C菌丝生长的影响 
由表4可知，Finc-LD-3与FLD-C所需培养基的最适pH都为7.0，菌丝平均生长速率分别为0.65cm/d和0.62cm/d，Finc-LD-3比FLD-C生长速率稍快。并且，在相同pH条件的培养基中培养，Finc-LD-3的菌丝生长速率都要比FLD-C略快。 
实施例6形态特征和生物学特性 
形态特征：Finc-LD-3的菌丝：气生菌丝浓密；菌盖：直径为3±2cm，呈浅黄色，圆形，菌盖表面有细小绒毛，质地脆嫩、易碎；菌褶：浅黄色，菌褶断面呈月牙形；菌柄：长度为6～15cm，菌柄上部浅黄，下部洁白，靠近菌盖处的菌柄内部致密紧实，远离菌盖处菌柄中空，菌柄有鳞片，鳞片主要着生在靠近菌盖的中上部，分布不规律，菌柄簇生，请参阅图1。 
生物学特性：营养成分来源：木屑、玉米芯、米糠、麸皮、玉米粉、棉籽壳、大豆皮等，其中，含水量64%～66%(重量百分比，下同)。 
培养及栽培条件：菌丝体培养温度为20～25℃，湿度75%，CO2浓度2000～3500ppm，培养周期50～70天。适宜出菇温度为15～18℃，湿度93%～100%，CO2浓度1000～2000ppm，前1～7天，光照强度10～50Lux，后8～32天光照强度200～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期约为32天。 
实施例7栽培对比试验 
本实施例通过荷叶离褶伞Finc-LD-3新菌株，与未经驯化野生菌株FLD-C进行栽培对比，考察供试菌株的抗杂菌能力、不覆土条件下的原基（将来形成子实体）发生情况、采收集中度和单产等指标，以体现该菌株适用于工厂化瓶栽生产的优势和特点。 
所用栽培种培养基为：木屑15%，玉米芯25%、棉籽壳25%、米糠10%、麸皮20%和玉米粉5%，含水量为64%～66%。 
培养阶段污染率试验采取先预培养再普通培养的方式进行，接种128瓶，然后放置在洁净度高的预培养室中培养15天，再转至普通培养室，总培养周期64天，搔菌时统计污染情况，结果参阅表5。 
从表5可知，通过驯化获得的荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3污染率为0，而野生菌株污染率为3.13%。由此可见，与野生菌株相比，Finc-LD-3具有更强的抗杂菌侵染能力。 
表5Finc-LD-3与FLD-C培养阶段污染对比 
Figure BDA00002881076300071
栽培过程中原基发生数以上述128接种瓶为研究对象，在不覆土的情况下，Finc-LD-3与野生菌株FLD-C的原基发生情况见下表6。从表6可知，通过驯化获得的荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3，与野生菌株相比，原基发生比例更高，对于不覆土栽培的适应能力更强。 
表6Finc-LD-3与FLD-C原基发生情况对比 
Figure BDA00002881076300072
采收时统计同批次采收集中度，以上述128接种瓶为试验对象，试验结果参阅下表7。从表7可知，通过驯化获得的荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3集中于第一批采收，采收率达68.97%，而FLD-C的采收以第二批为主，采收率为57.28%。由此可见，与野生菌株相比，Finc-LD-3的子实体采收周期更集中，且集中采收日期较野生菌株明显提前。 
表7Finc-LD-3与FLD-C采收集中度对比 
用于单产测定的试验对象为上述128接种瓶，从表8可知，通过驯化获得的荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3，与野生菌株相比，栽培单产更高，在同样测试数量的情况下，Finc-LD-3获得了更高的总产量，总增产幅度达到了23.88%。 
表8Finc-LD-3与FLD-C采收单产对比 
Figure BDA00002881076300082
实施例8子实体均匀度对比 
以上述实施例7中所采收的Finc-LD-3与FLD-C子实体为统计对象，统计分析菌盖大小均匀度与菌柄长度均匀度。其中， 
变异系数（%）=标准偏差/平均值*100% 
由下表9可知，Finc-LD-3菌盖直径平均为3.0cm，FLD-C菌盖直径平均为3.1cm，且Finc-LD-3菌盖直径的变异系数为41.3%，而FLD-C菌盖直径的变异系数达50.3%。由此可见，Finc-LD-3菌盖直径的相对变异度较小，说明Finc-LD-3的菌盖直径更为均匀。 
表9不同荷叶离褶伞菌株子实体菌盖大小均匀度 
Figure BDA00002881076300091
下表10显示，本发明Finc-LD-3子实体菌柄长度平均为9.5cm，比FLD-C菌柄长度高出0.3cm，并且，Finc-LD-3菌柄长度的变异系数为22.6%，FLD-C菌柄长度的变异系数达到38.3%，由此可见，Finc-LD-3菌柄长度的相对变异度较小，本发明荷叶离褶伞菌株子实体的菌柄长度均匀度要明显优于对照野生菌株。 
表10不同荷叶离褶伞菌株子实体菌柄长均匀度 
Figure BDA00002881076300092
实施例9尝味试验 
选取新鲜的Finc-LD-3和FLD-C，清炒，室温冷却，随机抽取100人就Finc-LD-3和FLD-C的香味、苦味和脆性进行盲试，参与调查的每人填写尝味评分表，评分标准见表11。 
表11尝味试验评分标准 
Figure BDA00002881076300093
本实验结果从表12可知，Finc-LD-3的各项评分为：香味4.5，苦味4.8，脆性4.6，上述各项评分结果都略高于FLD-C的得分，这说明本发明荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3具有悦人的味道和脆性，更易受到消费者的青睐。 
表12Finc-LD-3和FLD-C尝味对比结果 
Figure BDA00002881076300094
Figure BDA00002881076300101
实施例10ITS测序鉴定 
本实施例委托生工生物工程（上海）股份有限公司(以下简称“生工”)进行，包括以下步骤： 
基因组的提取：按照生工SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存，备用。 
PCR扩增体系为：总体积25μL，基因组模板1μL，真菌rDNA通用引物ITS1序列为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(10μM)0.5μL，ITS4序列为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(10μM)0.5μL，dNTP mix(10mM each)0.5μL，10×Taq反应缓冲液，2.5μL，5U/μL Taq0.2μL，加水至25μL。PCR程序：预变性94℃5mim，94℃30s，55℃35s，72℃1min，35个循环，72℃延伸8min。 
采用常规测序方法对上述PCR扩增产物进行测序。本试验菌株Finc-LD-3的ITS序列测序结果请参阅序列表，其序列为690bp的DNA片段。从GenBank中查得，Finc-LD-3菌株ITS序列与离褶伞属荷叶离褶伞的ITS序列相似性最高。同时，从GenBank中查得与离褶伞属相近种的ITS序列，应用DNAStar MegAlign软件构建出供试菌株的系统发育树，请参阅附图2。 
以上描述仅为本发明的实施例，谅能理解，在不偏离本发明构思的前提下，对本发明的简单修改和替换皆应包含在本发明的技术构思之内。 
SEQUENCE LISTING 
<110>上海丰科生物科技股份有限公司 
<120>荷叶离褶伞-LD-3 
<130>ITS序列 
<160>1 
<170>PatentIn version3.3 
<210>1 
<211>690 
<212>DNA 
<213>Lyophyllum shimeji 
<400>1 
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ttgaataaat ttggttgggc tgttgctggc      60 
tcctaggagc atgtgcacgc ctagctccat ctttaccacc tgtgcacctt ttgtagacct      120 
ggatatcttt cgaggaaact cggtttgagg actgctgagc gaaagcccct agcttttctt      180 
acatttccgg tctatgtctt tacatacccc atatgaatgt aacagaatgt cgtttactgg      240 
cctttgtgcc tttaatcaga tacaactttc agcaacggat ctcttggctc tcgcatcgat      300 
gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat      360 
ctttgaacgc acctggcgct ccctggtatt ccggggagca tgtctgtttg agtgtcatta      420 
aattctcaac ttttccaact tttgcgagtt tggttaggct tggatgtggg ggtttgcggg      480 
cttcacagaa gtcggctcct ctgaaatgca ttagtgaaac ctttgttgat catctcttgg      540 
tgtgataatt atctacgcca ctagagtgtc agcctcaact agttgagagg attttgcttc      600 
taatcgtcct ccaaggacaa cttctttact ttttgacctc aaatcagata agactacccg      660 
ctgaacttaa            gcatatcaat           aagcggagga690 

Claims (1)

1. 一种荷叶离褶伞新菌株Finc-LD-3，其保藏编号是CCTCC NO:  M 2013007。
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