CN103503780A - 纯白色真姬菇新菌株 - Google Patents

Abstract

一种纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247，其保藏编号是CCTCCNO:M2012378。该菌株具有以下优点：培养及栽培周期短，单产高，单株之间以及单株内单根子实体之间的外观均一度高，瘤盖菇出现率低，可食率高，保鲜期长、口感好，β-葡聚糖含量高，且对培养基适性强，适宜大面积推广种植等。

Description

纯白色真姬菇新菌株

【技术领域】

本发明涉及了食用菌技术领域，更确切的说，涉及一种纯白色真姬菇新菌株。 

【背景技术】

真姬菇（拉丁文名称Hypsizygus marmoreus），隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶菌族、玉蕈属，因它具有独特的蟹鲜味，故又称它为蟹味菇。最初的人工栽培于1978年前后开始于日本，其味道鲜美、食感脆嫩、营养丰富，其味比平菇鲜，其肉比滑菇厚，其质比香菇韧，口感甚佳，其干品还香味浓溢。真姬菇含有丰富维生素和17种氨基酸，子实体中提取的β-1，3-D葡聚糖具有很高的抗肿瘤活性，是一种低热量、低脂肪的保健食品。 

真姬菇从栽培伊始，基本上就是走的工厂化生产的路线。由于工厂化栽培具有周年连续生产、规模化生产的特点，大多实现半机械化、机械化及智能化，生长环境容易控制，产量品质更有保障。在工厂化生产的过程中我们会发现，如果单株之间以及单株内单根子实体之间的外观差异较大，将制约采收和包装的机械化和自动化的使用，这不但增加了劳动力成本、还会因过多的人为搬动、挑选及搭配而增加了子实体的破损度，从而导致外观品质降低，市场接受度差，削弱了产品的市场竞争力。 

众所周知，菌种对食用菌的工厂化栽培起着至关重要的作用。目前，工厂化生产的真姬菇主要有棕色和纯白色两种，纯白色真姬菇又称白玉菇或玉龙菇，深受市场欢迎，主要栽培品种主要有日本北斗株式会社公司的白玉菇1号(以下简称“H-W”)，H-W的子实体通体雪白、无苦味，增加了菜肴的美感，然而，它存在以下缺陷：（1）该品种的培养及栽培周期较长，且单产较低；（2）容易出现瘤盖菇；（3）单株之间以及单株内单根子实体之间外观均一度差。这些缺陷无疑都最终导致了生产成本的增加，降低了产品的市场竞 争力。因此，有必要培育出一种可以克服上述缺陷的纯白色真姬菇新菌株。 

【发明内容】

本发明解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供一种培养及栽培周期短，单产高，单株之间以及单株内单根子实体之间的外观均一度高，且瘤盖菇出现率低的纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247。 

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明一种纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247是通过亲本TNN-11和H-W杂交，再经系统选育获得的。该菌株已经于2012年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:M2012378，其生物学分类命名为Hypsizygus marmoreus Finc-W-247。 

本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247的特征在于： 

1、形态特征 

菌丝：气生菌丝发达，密度一般；菌盖：直径为1.8±0.44cm，断面呈圆山型，通体雪白，肉厚，斑纹清晰、中央分布，无龟裂；菌褶：雪白、笔直排列；孢子印颜色为白色；菌柄：长度为6.8±0.93cm，中粗、雪白、无毛，与菌盖连接略偏生；有效茎重量比例（指菌盖直径大于1cm，鲜重大于0.75g的单根子实体的重量之和占单株子实体总重量的比例，下同）达95%以上。 

2、生物学特性 

营养成分来源：玉米芯、杂木屑、米糠、麸皮、玉米粉、棉籽壳等，其中，含水量64～66%(重量百分比，下同)。 

培养及栽培条件：菌丝体培养温度为20～25℃，湿度75%，CO₂浓度2500～4000ppm，培养周期70～90d。适宜出菇温度为13～15℃，湿度93～100%，CO₂浓度1000～2000ppm，前1～7d光照强度50～100Lux，后8～20d光照强度200～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期19～22d。 

3、遗传学特性 

本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247的DNA经特异性引物对5′GACGACGTTTGTGGGGTGA3′和5′AGGGAGATCGACGTCCATATTG3′的PCR扩增，获得约为975bp大小的SCAR分子标记片段，其电泳图谱见图7。 

与现有技术相比，本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247具有以下优点： 

（1）培养及栽培周期短，提高了生产效率，降低了生产成本； 

（2）单株之间以及单株内单根子实体之间的外观均一度高，有利于机械化和自动化作业； 

（3）单产高，且瘤盖菇出现率低； 

（4）有效茎重量比例高达95%以上，大幅提高了产品的可食率； 

（5）β-葡聚糖含量高； 

（6）保鲜期长、口感好； 

（7）对培养基适应性强，适宜大面积推广种植等特点。 

【附图说明】

图1是真姬菇Finc-W-247和H-W在培养基A中的单产、栽培周期与菌龄关系图。 

图2是真姬菇Finc-W-247和H-W在培养基B中的单产、栽培周期与菌龄关系图。 

图3是温度对真姬菇Finc-W-247和H-W菌丝生长速率的影响。 

图4是通用引物ITS1和ITS4对4个真姬菇菌株的PCR扩增产物电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-247，3为G-W，4为GC-W，M为marker。 

图5是本发明真姬菇新菌株Finc-W-247系统发育树。 

图6随机是引物S67对4个真姬菇菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-247，3为G-W，4为GC-W，M为marker。 

图7是所设计的特异引物对4个真姬菇菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为H-W，2为Finc-W-247，3为G-W，4为GC-W，M为marker。。 

【具体实施方式】

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。 

以下实施例中的“G-W”菌株是从市场上购买的一种真姬菇菌株，它的原基为灰色，随着子实体的生长和发育逐渐变白，采收期菌柄为灰白色，菌盖为纯白色；“GC-W”菌株为日本葛城新育成的白玉菇菌株。 

实施例1 杂交获得Finc-W-247 

本实施例说明了本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247的育种过程。具体步骤如下： 

1)选择亲本菌株：选取TNN-11和H-W为亲本，这两个亲本的子实体能在市场上购买到，并且在上海市农业科学院菌种保藏中心也有保藏。 

2)配制培养基 

PDA培养基：每1L培养基用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。 

原种培养基：木屑65%（重量百分比，下同）、米糠18%、麸皮7%、玉米粉10%，含水量为60%～62%。 

栽培种培养基：玉米芯40%、大豆皮24%、米糠14%、麸皮17%，玉米粉5%，含水量为64%～66%。 

3)采用常规的杂交方法获得杂合子800个。 

4)栽培与筛选：把获得的杂合子根据常规的方法进行栽培试验和筛选。 

5)获得目标菌株：通过系统筛选，从800个杂合子中，获得一个纯白色菌株，它的培养及栽培周期短，单株之间之间的外观均一度高，菌盖直径、菌柄长度及单根子实体鲜重一致性好，有效茎重量比例高，并且单产高，保鲜期长，对培养基适应范围广，达到了选育优良菌株的目的。该菌株被命名为“Finc-W-247”。 

本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247已于2012年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012378，菌株经检测存活，分类地位为玉蕈属真姬菇。 

实施例2 菌龄试验 

本实施例通过本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247与现有纯白色真姬菇品种中种植最广泛的H-W进行培养周期（即菌龄）、栽培周期及单产的对比，总结出本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247的优势和特点。 

本实施例采用的栽培种培养基为： 

培养基A： 

木屑65%、米糠18%、麸皮7%、玉米粉10%，其中，含水量为60%～62%。 

培养基B为： 

玉米芯25%、杂木屑23%、大豆皮20%、米糠12%、麸皮15%，玉米 

粉5%，其中含水量64%～66%。 

以H-W为对照，培养时间从70d（即天，下同）到110d设置9个菌龄，每5d为一菌龄，每菌龄80瓶。培养及栽培采用常规的真姬菇培养和栽培参数，栽培瓶的容积为850cc，瓶口直径58mm。试验结果请一并参阅图1、图2和表1。 

表1 Finc-W-247与H-W菌龄试验 

在培养基A中，H-W的最佳培养周期长达100d，相应最高单产为145g/bottle（级克/瓶，下同），栽培周期为22d，而Finc-W-247的最佳培养周期缩短为80d，相应的最高单产达到168g/bottle，栽培周期为22d；在培养基B中，H-W的最佳培养周期为95d，相应最高单产为157g/bottle，栽培周期为22d，而Finc-W-247的最佳培养周期则只有80d，最佳培养周期的单产可达186g/bottle，栽培周期缩短为21d。通过与H-W对比可知，在A、B两种不同供试培养基中，Finc-W-247的培养周期和栽培周期都有所缩短，且平均瓶单产都高于H-W，这说明Finc-W-247在培养周期、栽培周期和单产方面都有明显优势，同时也表明本发明真姬菇新菌株Finc-W-247对培养基的适应能 力较好，能适应更广泛的培养基。 

实施例3 保鲜试验 

Finc-W-247和H-W采收后，以每包155g～165g进行包装，各24包，先于冷库（3℃～8℃）保藏11d，然后取出放置在23℃环境，记录子实体品质变化情况。其中，正常：表示子实体完全新鲜；开始变质：表示有一根及以上子实体开始霉腐，但整体仍有商品价值；完全变质：两根以上子实体霉腐，无商品价值。 

试验结果参见表2，冷库（3℃～8℃）保藏11d后，取出，放置在23℃室内环境条件下，Finc-W-247继续保存13d依然完好，H-W在23℃室内环境继续保存的第10d开始由雪白变黄，失去了新鲜感，而Finc-W-247第18d部分开始变黄；H-W在冷库保藏11d后，23℃室内继续保存的第18d全部24包都已失去商业价值，而Finc-W-247在第26d后才全部失去商业价值。上述结果表明，本发明Finc-W-247子实体的保鲜期比H-W具有明显优势。 

表2 Finc-W-247与H-W子实体保鲜试验 

实施例4 尝味试验 

选取新鲜的Finc-W-247和H-W子实体分别2kg，清炒，室温冷却，随机抽取100人就Finc-W-247和H-W的色泽、香味、美味、苦味与脆性进行 盲试，参与调查的每人填写尝味评分表，评分标准见表3。 

表3 尝味试验评分标准 

从表4可知，Finc-W-247的各项评分为：色泽4.3，香味4.5，美味3.8，苦味得分4.7，脆性5.0，上述各项评分结果都高于对照的得分，说明Finc-W-247的色、香、味及脆性都优于对照。尝味试验统计结果表明，本发明真姬菇新菌株Finc-W-247具有悦人的色泽、香味、口感和脆性，更受消费者的青睐。 

表4 尝味试验 

实施例5 形态特征和生物学特性 

Finc-W-247的形态特征： 

菌丝：气生菌丝发达，密度一般；菌盖：直径为1.8±0.44cm，断面呈圆山型，通体雪白，肉厚，斑纹清晰、中央分布，无龟裂；菌褶：雪白、笔直排列；孢子印颜色为白色；菌柄：长度为6.8±0.93cm，中粗、雪白、无毛，与菌盖连接略偏生；有效茎重量比例达95%以上；Finc-W-247与H-W的具体形态特征的差异请参阅表5。 

表5 Finc-W-247与H-W形态特征对比 

Finc-W-247的生物学特性： 

营养成分来源为：玉米芯、杂木屑、米糠、麸皮、玉米粉和棉籽壳等，其中，含水量64%～66%。菌丝体培养温度20～25℃，湿度75%，CO₂浓度2500ppm～4000ppm，培养周期70d～90d。适宜出菇温度为13℃～15℃，湿度93%～100%，CO₂浓度1000～2000ppm，前1d～7d光照强度50Lux～ 100Lux，后8d～20d光照强度200Lux～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期19d～22d。 

实施例6 菌丝生长的温度梯度试验 

本实施例以培养温度为标准，设计4组实验，每组包括Finc-W-247和H-W，各10次重复。从Finc-W-247和H-W培养平板上分别切取直径为5.0mm的接种块接种到PDA培养基上，分别于20℃、25℃、30℃和35℃培养11d，试验结果见表6和图3。试验结果表明：Finc-W-247的菌丝在25℃生长速度最快，分别达到4.04mm/d，当升高到30℃，则生长速度大幅下降为1.57mm/d，当升高到35℃时，则不能生长。由此可见，本发明真姬菇Finc-W-247菌株的适宜培养温度为20℃～25℃。 

表6 温度对不同真姬菇菌株菌丝生长速率的影响 

实施例7 β-葡聚糖检测 

Finc-W-247和H-W的β-葡聚糖含量的检测委托SGS公司完成。Finc-W-247和H-W鲜品分别送检，测试方法为：AOAC995.16-大麦和燕麦β-D-葡聚糖简化酶法。检测结果见表7，Finc-W-24的β-葡聚糖含量（以干重计）是4.2g/100g，而H-W的β-葡聚糖含量小于0.1g/100g，Finc-W-247的β-葡聚糖含量是H-W的β-葡聚糖含量的42倍以上。 

表7 真姬菇Finc-W-247与H-W的β-葡聚糖含量测定 

实施例8 拮抗试验 

本实施例以本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247和三个对照菌株H-W、G-W及GC-W为试验材料，所用培养基为PDA培养基。 

Finc-W-247和H-W、G-W、GC-W在平板培养基上分别对峙接种和培养，接种点相距2cm，24℃恒温培养26d。 

本试验结果请参阅表8，在对峙培养菌落交界处的正面和背面，Finc-W-247与H-W、Finc-W-247与G-W和Finc-W-247与GC-W拮抗线明显，说明Finc-W-247是与H-W、G-W及GC-W不同的真姬菇新菌株。 

表8 不同真姬菇菌株间拮抗试验 

实施例9 栽培对比试验 

本实施例对Finc-W-247和H-W两个菌株的瓶单产、菌盖、菌柄长和单根子实体鲜重的均匀度进行统计。 

所用培养基为：玉米芯22%、杂木屑17%、米糠18%、麸皮20%，玉米粉5%、棉籽壳18%，其中含水量64%～66%。以培养周期为85天的Finc-W-247和H-W为统计对象，不同菌株随机抽取40栽培瓶为样本，统计结果见下表9～表12。其中， 

变异系数（%）=标准偏差/平均值*100%（下同）。 

根据下表9可知，Finc-W-247单产的变异系数为7.6%，H-W单产的变异系数为12.1%，可见Finc-W-247单产的相对变异度较小，说明Finc-W-247菇朵间单产更均匀。 

表9 不同真姬菇菌株单产均匀度 

由表10可知，Finc-W-247菌盖直径平均为1.8cm，H-W菌盖直径平均为1.5cm，Finc-W-247菌盖直径的变异系数为24.3%，H-W菌盖直径的变异 系数为42.6%，可见Finc-W-247菌盖直径的相对变异度较小，说明Finc-W-247的菌盖直径更均匀。 

表10 不同真姬菇菌株子实体菌盖大小均匀度 

表11显示，Finc-W-247菌柄长度平均为6.8cm，H-W菌柄长度平均为5.6cm，Finc-W-247菌柄长度的变异系数为13.6%，H-W菌柄长度的变异系数为19.7%，可见Finc-W-247菌柄长度的相对变异度较小，说明Finc-W-247菌柄长度更均匀。 

表11 不同真姬菇菌株子实体菌柄长均匀度 

由表12可知，Finc-W-247的单根子实体鲜重平均达到3.2g，而H-W平均为2.5g；Finc-W-247的单根子实体鲜重的变异系数为46.8%，而H-W的单根子实体鲜重的变异系数达到了59.3%，可见Finc-W-247的单根子实体鲜重的相对变异度较小，说明Finc-W-247的单根子实体鲜重更均匀。 

表12 不同真姬菇菌株子实体单跟子实体鲜重均匀度 

通过上述对比可知，与H-W相比，本发明Finc-W-247的菇朵、菌盖直径、菌柄长度和单根子实体鲜重的均匀度更高，因此Finc-W-247提高了可机械化和自动化程度，此外，本发明Finc-W-247平均菌盖直径大、平均菌柄长、平均单根子实体重量大，并且它们的变异系数小，这说明Finc-W-247大都处于易食用状态，即可食率明显高于菌株H-W。 

实施例10 ITS测序鉴定 

本实施例委托生工生物工程（上海）股份有限公司(以下简称“生工”)进行，包括以下过程： 

基因组的提取：按照生工SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存，备用。 

PCR扩增体系为：总体积25μL，基因组模板1μL，真菌核糖体DNA通用引物ITS1序列为5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′(10μM)0.5μL，ITS4序列为5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′(10μM)0.5μL，dNTP mix(10mM each)0.5μL，10×Taq反应缓冲液，2.5μL，5U/μL Taq 0.2μL，加水至25μL。PCR程序：预变性94℃5mim；94℃30s，55℃35s，72℃1min，35个循环，72℃延伸8min。扩增得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，其电泳结果请参阅图4。 

DNA琼脂糖凝胶回收胶纯化和测序采用常规方法。 

本试验菌株Finc-W-247的ITS序列测序结果请参阅序列表，其序列为660bp的DNA片段。从GenBank中查得，Finc-W-247菌株ITS序列与玉蕈属真姬菇的ITS序列相似性最高。同时，从GenBank中查得与玉蕈属真姬菇相近种的ITS序列，应用DNAStar MegAlign软件构建出供试菌株的系统发育树，请参阅附图5。 

实施例11 RAPD分析 

本实施例以本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247和H-W、G-W、GC-W为分析对象，利用RAPD分析技术，进一步鉴定本发明纯白色真姬菇新菌株的遗传特性。本实施例中的DNA提取、琼脂糖凝胶电泳体系与实施例10相同，在此不再赘述。PCR扩增体系为：总体积25μL，基因组模板20-30ng/μL1.0μL，随机引物0.5pmol/μL 1.0μL，dNTP mix(10mM each)0.5μL，10×Taq缓冲液2.5μL，MgCl₂（25mM）2.0μL，5U/μL Taq酶0.25μL，加水至25μL。PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃45s，36℃60s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。 

本实施例所用的16个随机引物序列请参阅表13。在RAPD分析中，从16个随机引物中筛选出1个引物，它的编号是S67，这个引物能清晰地将本 发明新菌株Finc-W-247和所用三个对照真姬菇菌株H-W、G-W及GC-W区分出来。 

表13 随机引物 

RAPD分析的结果如下： 

引物S67对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图6，其中a框所在的位置为本发明Finc-W-247独有DNA条带，H-W、G-W和GC-W均无该条带，所以引物S67能区别本发明Finc-W-247与三个对照菌株H-W、G-W和GC-W。 

上述检测结果表明，本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247与H-W、G-W和GC-W存在明显的遗传差异，进一步说明本发明Finc-W-247是一种全新的纯白色真姬菇新菌株。 

实施例12 SCAR分子标记 

SCAR（Sequence-characterized Amplified Region）标记是一种十分稳定的分子标记，该技术是通过对RAPD扩增产物测序的基础上，设计一对新的引物特异地扩增原引物可扩增的DNA片段，能够简便、快速、稳定的进行菌种鉴定。本实施例建立了纯白色真姬菇Finc-W-247菌种的SCAR分子标记，能够对Finc-W-247菌种进行快速鉴定。 

将图6中a框所在位置Finc-W-247独有的DNA条带切割，并回收DNA。在本实施例中，回收方法按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明。 

回收的DNA采用常规方法进行测序，结果见序列表，其为989bp的DNA 片段。 

根据上述989bp的DNA片段两端碱基序列，用Primer premier5.0软件设计特异引物序列，所述DNA片段两端各舍弃数个碱基，最终设计的扩增引物对序列为5'-GACGACGTTTGTGGGGTGA-3'和5'-AGGGAGATCGACGTCCATATTG-3'。 

采用上述设计引物，对Finc-W-247和H-W、G-W和GC-W的DNA进行SCAR-PCR扩增，扩增体系为：总体积25μL，模板20-30ng/μL 1μL，真姬菇Finc-W-247菌株检测专用引物对0.5pmol/μL各0.5μL，dNTP mix(10mM each)0.5μL，10×Taq Buffer2.5μL，MgCl₂（25mM）2.0μL，5U/μL Taq酶0.25μL，加水至25μL。PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃1min35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱见图7。从图7可知，只有Finc-W-247有专一扩增条带，而H-W、G-W和GC-W均无扩增条带，说明5'-GACGACGTTTGTGGGGTGA-3'和5'-AGGGAGATCGACGTCCATATTG-3'是Finc-W-247的SCAR分子标记引物，由该引物对所扩增产物为大小975bp的特异DNA片段，所述特异DNA片段为本发明真姬菇新菌株Finc-W-247的SCAR分子标记。 

以上描述仅为本发明的实施例，谅能理解，在不偏离本发明构思的前提下，对本发明的简单修改和替换皆应包含在本发明的技术构思之内。 

Claims (1)

1.一种纯白色真姬菇新菌株Finc-W-247，其保藏编号是CCTCC NO: M 2012378。

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