CN103154009A

CN103154009A - 吗啉基核酸衍生物

Info

Publication number: CN103154009A
Application number: CN2011800474873A
Authority: CN
Inventors: 上田稔浩
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2031-09-29
Also published as: CA2813183C; HRP20170028T1; EP2623507B1; SMT201700038B; PT2623507T; WO2012043730A1; CY1118435T1; US20130197220A1; ES2607603T3; EP2623507A1; LT2623507T; DK2623507T3; JPWO2012043730A1; US8969551B2; CN103154009B; SI2623507T1; RS55610B1; HUE030292T2; JP5831455B2; EP2623507A4

Abstract

本发明提供在吗啉基核酸低聚物的制造中有用的吗啉基核酸衍生物。作为本发明，可例举以下述通式(1)表示的化合物或其盐。式中，R¹表示氢或三苯甲基等。R²表示酰胺或亚胺。R³表示可以被三烷基硅烷基等保护的羟基、或以下述通式(5)表示的基团。

Description

吗啉基核酸衍生物

技术领域

本发明涉及新型的吗啉基核酸衍生物。

背景技术

碱基部分为鸟嘌呤的吗啉基核酸单体(下称“G单体”)中，在鸟嘌呤的6位的碳原子上结合有氧原子。因此，使用鸟嘌呤的6位羟基未得到保护的G单体来合成吗啉基核酸低聚物时，会发生副反应。例如，在缩合工序中，鸟嘌呤的6位羟基与其它吗啉基核酸单体的活性位点反应形成磷酰基体，该磷酰基体与脱保护工序中使用的氨反应，鸟嘌呤可能会转化成二氨基嘌呤。该副反应成为使目标产物的合成收率降低的重要因素。

为了抑制上述副反应，AVI生物制药公司(AVI BIOPHARMA)报道了一种G单体，该G单体的鸟嘌呤的6位羟基被新戊酰氧基苄基(POB基)保护(例如参照专利文献1)。但是，POB基在脱保护工序中转化成4-亚甲基环己-2,5-二烯酮，其会加成在吗啉基核酸低聚物的吗啉的NH部分而形成副产物。

除此之外，专利文献1对于鸟嘌呤的6位羟基的其它保护基也有报道。作为该其它保护基，专利文献1中公开了例如4-硝基苯乙基、苯磺酰乙基、甲磺酰乙基。但是，这些保护基在脱保护工序中转化成例如4-硝基苯乙烯之类的反应活性种，其会加成在吗啉基核酸低聚物的吗啉的NH部分而形成副产物。此外也已知叔丁基二甲基硅烷基等硅烷基类保护基，但有报道称，其在吗啉基核酸低聚物的合成条件下不稳定，容易离去，因此有与鸟嘌呤的6位羟基未得到保护的G单体同样的副反应。还已知苯基醚类保护基和氨基甲酸酯类保护基，但有报道称，在脱保护工序中这些保护基的离去不完全，缩合工序中的缩合效率变差。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2009/064471A1

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的主要在于提供一种用于高效地合成吗啉基核酸低聚物的新型的吗啉基核酸衍生物及该衍生物的原料。

解决技术问题所采用的技术方案

本发明人发现，以下述通式(1)表示的化合物(下称“本发明化合物”)或其盐可以用作吗啉基核酸低聚物的合成原料或用于获得该合成原料的原料，从而完成了本发明。

[化1]

式中，R¹表示氢或以下述通式(2)表示的基团；

[化2]

式中，*表示键位置；R¹¹、R¹²、R¹³相同或不同，表示氢、烷基或烷氧基；

R²表示以下述通式(3)或(4)表示的基团；

[化3]

式中，*的含义与上文中相同；R⁴表示烷基、芳基甲基或芳氧基甲基；

R⁵、R⁶相同或不同，表示烷基；

R³表示可以被三烷基硅烷基或二苯基烷基硅烷基保护的羟基、或以下述通式(5)表示的基团；

[化4]

式中，*的含义与上文中相同；X表示O或S；

Y表示二烷基氨基或烷氧基；

Z表示卤素。

作为本发明，可例举上述本发明化合物或其盐。

以下，对本说明书中记载的术语进行详述。

作为“烷基”，可例举例如直链状或支链状的碳数1～8的烷基，具体可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基、正庚基、异庚基、正辛基。其中优选碳数1～6的烷基，更优选碳数1～3的烷基。

作为“三烷基硅烷基”、“二苯基烷基硅烷基”、“二烷基氨基”的“烷基”部分，可例举与上述“烷基”相同的烷基。

作为“芳基甲基”、“芳氧基甲基”、“芳基磺酰基”的“芳基”部分，可例举碳数6～10的芳基，例如苯基、1-萘基、2-萘基。其中优选苯基。

作为“烷氧基”，可例举例如直链状或支链状的碳数1～8的烷氧基，具体可例举例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、正己氧基、正庚氧基、正辛氧基。

作为“卤素”，可例举例如氟、氯、溴、碘。其中优选氯。

作为“酰基”，可例举直链状或支链状的烷酰基或芳酰基。作为烷酰基，可例举例如甲酰基、乙酰基、2-甲基乙酰基、2,2-二甲基乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、2,2-二甲基丙酰基、己酰基。作为芳酰基，可例举例如苯甲酰基、甲苯酰基、萘酰基。该芳酰基可以在能取代的位置上被取代，可以被烷基取代。

作为“核酸碱基”，可例举例如腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或它们的修饰碱基。作为该修饰碱基，可例举例如假尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如5-乙基尿嘧啶)、5-卤代尿嘧啶(5-溴尿嘧啶)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(6-甲基尿嘧啶)、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5’-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、N⁶-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-甲硫基-N⁶-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸、2-硫代胞嘧啶、嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、异鸟嘌呤、吲哚、咪唑、黄嘌呤，但不限定于此。

本发明化合物中，优选下述化合物(a)～(c)或其盐。

(a)N⁹-[(2R,6S)-6-{(叔丁基二甲基硅氧基)甲基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]-N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤、

(b)N⁹-{(2R,6S)-6-羟甲基-4-三苯甲基吗啉-2-基}-N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤、

(c)[(2S,6R)-6-{N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤-9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲基二甲基磷酰胺氯化物。

附图的简单说明

图1所示为使用CE-G单体(定义参照表1)合成的未纯化的吗啉基核酸低聚物的HPLC色谱图。纵轴表示强度(mAU)，横轴表示保留时间(分钟)。

图2所示为使用POB-G单体(定义参照表1)合成的未纯化的吗啉基核酸低聚物的HPLC色谱图。纵轴表示强度(mAU)，横轴表示保留时间(分钟)。

图3所示为使用CE-G单体合成的未纯化的吗啉基核酸低聚物的质谱图。纵轴表示离子强度(a.u.)，横轴表示质荷比(m/z)。

图4所示为使用POB-G单体合成的未纯化的吗啉基核酸低聚物的质谱图。纵轴表示离子强度(a.u.)，横轴表示质荷比(m/z)。

实施发明的方式

对本发明的实施方式进行说明。

以下所示的制造方法中，原料具有对反应造成影响的取代基(例如羟基、氨基、羧基)时，预先通过公知的方法用合适的保护基对原料进行保护，然后进行反应。保护基最终可以通过催化还原、碱处理、酸处理等公知的方法离去。

本发明化合物的制法

本发明化合物可以从公知化合物或能容易地制造的中间体出发，例如通过实施以下制法1～制法3来制造。

制法1R ³ 为三烷基硅氧基或二苯基烷基硅氧基的情况

[化5]

式中，R²的含义与上文中相同；R⁷表示三烷基硅烷基或二苯基烷基硅烷基；R⁸表示可以被1个～3个烷基取代的芳基磺酰基；R¹⁴表示以上述通式(2)表示的基团。

本反应是化合物(6)和2-氰基乙醇的缩合反应，通过本身公知的方法来进行。

2-氰基乙醇的用量相对于化合物(6)以摩尔比计合适的是在1倍量～20倍量的范围内，较好是在1.2倍量～10倍量的范围内。作为所使用的溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如乙腈、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺以及它们的任意混合溶剂。特别优选二氯甲烷。作为本工序中可以使用的“碱”，可例举例如N-甲基吡咯烷、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯以及它们的混合物。该碱的用量相对于化合物(6)以摩尔比计合适的是在1倍量～20倍量的范围内，较好是在1倍量～10倍量的范围内。反应温度合适的是在0℃～50℃的范围内。反应时间根据所使用的原料的种类、反应温度等而不同，通常合适的是在1小时～30小时的范围内。

作为原料化合物的化合物(6)例如可以WO2009/064471的实施例1化合物4的制备项目中记载的方法为基准来制造。

制法2R ³ 为羟基的情况

[化6]

式中，R²、R⁷、R¹⁴的含义与上文中相同。

本反应是使化合物(1A)的R⁷离去的反应，通过本身公知的方法来进行。

作为本工序中可以使用的“用于使R⁷离去的试剂”，可例举例如四丁基氟化铵、胺和氢氟酸的盐、或者将胺和氢氟酸在合适的溶剂中以任意的比例混合而成的溶剂。

作为所使用的溶剂，可例举例如四氢呋喃(THF)、乙腈、二氯甲烷、甲苯、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺以及它们的任意混合溶剂。特别优选THF、二氯甲烷。

本工序中可以使用的用于使R⁷离去的试剂的用量根据化合物(1A)的种类、所使用的用于使R⁷离去的试剂、所使用的溶剂等而不同，相对于化合物(1A)，以摩尔比计合适的是在1倍量～10倍量的范围内，较好是在1.2倍量～5倍量的范围内。反应温度合适的是在0℃～50℃的范围内。反应时间根据所使用的原料的种类、反应温度等而不同，通常合适的是在1小时～30小时的范围内。

制法3R ³ 为以下述通式(5)表示的基团的情况

[化7]

式中，X、Y、Z、*的含义与上文中相同。

[化8]

式中，R²、R¹⁴、X、Y、Z的含义与上文中相同。

本反应是使化合物(1B)磷酰胺化的反应，通过本身公知的方法来进行。

所使用的溶剂只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如乙腈、二氯甲烷、THF。

本工序中可以使用的化合物(9)的用量相对于化合物(1B)以摩尔比计合适的是在1倍量～10倍量的范围内，较好是在1.2倍量～5倍量的范围内。

作为本工序中可以使用的“活化剂”，可例举例如1H-四唑、5-乙基硫代四唑、4,5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、N-甲基咪唑、4-二甲氨基吡啶。特别优选N-甲基咪唑。该“活化剂”的用量相对于化合物(9)以摩尔比计合适的是在0.2倍量～3倍量的范围内，较好是在0.5倍量～2倍量的范围内。

作为本工序中可以使用的“碱”，可例举例如N-乙基吗啉。该碱的用量相对于化合物(9)以摩尔比计合适的是在0.8倍量～5倍量的范围内，较好是在1倍量～3倍量的范围内。反应温度合适的是在0℃～80℃的范围内。反应时间根据所使用的原料的种类、反应温度等而不同，通常合适的是在1小时～30小时的范围内。

制法4R ¹ 为氢的情况

[化9]

式中，R²、R³、R¹⁴的含义与上文中相同。

本反应是使化合物(1D)的R¹⁴脱保护的反应，通过本身公知的方法来进行。

作为本工序中可以使用的“酸”、即“用于使R¹⁴离去的试剂”，可例举例如乙酸、盐酸或磷酸。该酸的用量相对于化合物(1D)以摩尔比计合适的是在1倍量～1000倍量的范围内，较好是在10倍量～100倍量的范围内。

所使用的溶剂只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、甲醇、水。

反应时间根据所使用的原料的种类、反应温度等而不同，通常合适的是在0.5小时～5小时的范围内。

吗啉基核酸低聚物的制法

优选的吗啉基核酸低聚物是以下式表示的基团作为构成单元的低聚物。

[化10]

式中，Base表示核酸碱基；X、Y的含义与上文中相同。

吗啉基核酸低聚物例如可以按照WO1991/009033或WO2009/064471来制造。特别是吗啉基核酸低聚物可以按照WO2009/064471中记载的方法来制造，或者按照以下所示的方法来制造。

作为吗啉基核酸低聚物的一种形态，可例举例如以下述通式(I)表示的化合物(下称吗啉基核酸低聚物(I))。

[化11]

式中，Base、X、Y的含义与上文中相同；

n为1～99的范围内的任意整数，较好为18～28的范围内的任意整数。

吗啉基核酸低聚物(I)可通过公知的方法来制造，例如可通过实施下述工序的操作来制造。

下述工序中使用的化合物和试剂只要是吗啉基核酸低聚物的制造中常用的化合物和试剂即可，无特别限定。

下述所有工序均可通过液相法或固相法(使用手动或市售的固相自动合成机)实施。通过固相法来制造吗啉基核酸低聚物时，从操作步骤的简便化和合成的准确性的观点来看，理想的是使用自动合成机的方法。

(1)工序A：

通过使以下述通式(II)表示的化合物(下称化合物(II))与酸作用，来制造以下述通式(III)表示的化合物(下称化合物(III))的工序。

[化12]

式中，n、X、Y的含义与上文中相同；

B^P独立地表示可以被保护的核酸碱基；

R¹表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；

L表示氢、酰基或以下述通式(IV)表示的基团(下称“基团(IV)”)。

[化13]

作为B^P中的“核酸碱基”，可例举与Base相同的“核酸碱基”。其中，B^P中的核酸碱基的氨基或羟基可以被保护。

作为该氨基的保护基，只要是能用作核酸的保护基的基团即可，无特别限定，具体可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲氨基)亚甲基。作为羟基的保护基，可例举例如2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯磺酰基乙基、甲磺酰乙基、三甲基硅烷基乙基、可以在能取代的任意位置上被1～5个吸电子性基团取代的苯基、二苯基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、甲基苯基氨基甲酰基、1-吡咯烷基氨基甲酰基、吗啉基氨基甲酰基、4-(叔丁基羧基)苄基、4-[(二甲氨基)羧基]苄基、4-(苯基羧基)苄基(例如参照WO2009/064471)。其中，鸟嘌呤的6位羟基的保护基优选2-氰基乙基。

作为“固相载体”，只要是能用于核酸的固相反应的载体即可，无特别限定，理想的是例如满足下述条件的载体：(i)几乎不溶于吗啉基核酸衍生物的合成中可以使用的试剂(例如二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基咪唑、吡啶、乙酸酐、二甲基吡啶、三氟乙酸)；(ii)对于吗啉基核酸衍生物的合成中可以使用的试剂在化学上稳定；(iii)能进行化学修饰；(iv)能进行优选的吗啉基核酸衍生物的装填；(v)具有能耐受处理中施加的高压的足够的强度；(vi)呈一定的粒径范围和分布。具体可例举溶胀性聚苯乙烯(例如氨基甲基聚苯乙烯树脂1％二苄基苯交联(200～400目)(2.4～3.0mmol/g)(东京化成株式会社制)、盐酸氨基甲基化聚苯乙烯树脂(AminomethylatedPolystyrene Resin·HCl)[二苄基苯1％,100～200目](肽研究所株式会社制))、非溶胀性聚苯乙烯(例如底物支持物(Primer Support)(GE医疗(GEHealthcare)公司制))、PEG链键合型聚苯乙烯(例如NH₂-PEG树脂(渡边化学株式会社制)、TentaGel resin)、可控多孔玻璃(controlled pore glass；CPG)(例如CPG公司制)、草酰基化可控多孔玻璃(例如参照Alul等,NucleicAcids Research,Vol.19,1527(1991))、TentaGel支承体－氨基聚乙二醇衍生物化支承体(例如参照Wright等,Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993))、多孔聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。

作为“接头”，可使用通常用于连接核酸或吗啉基核酸衍生物的公知的接头，可例举例如3-氨基丙基、琥珀酰基、2,2’-二乙醇磺酰基、长链烷基氨基(LCAA)。

本工序可通过使化合物(II)与酸作用来实施。

作为本工序中可以使用的“酸”，可例举例如三氟乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。作为酸的用量，例如相对于化合物(II)1摩尔，以摩尔比计合适的是在0.1倍量～1000倍量的范围内，较好是在1倍量～100倍量的范围内。

此外，可以与上述酸一起使用有机胺。作为有机胺无特别限定，可例举例如三乙胺。有机胺的用量例如相对于酸1摩尔，以摩尔比计合适的是在0.01倍量～10倍量的范围内，较好是在0.1倍量～2倍量的范围内。

在本工序中使用酸和有机胺的盐或混合物的情况下，可例举例如三氟乙酸和三乙胺的盐或混合物，更具体而言，可例举相对于2当量三氟乙酸混合1当量三乙胺的混合物。

本工序中可以使用的酸也可以用合适的溶剂稀释后使用，使其达到0.1％～30％的范围内的浓度。作为溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、乙腈、醇类(乙醇、异丙醇、三氟乙醇等)、水或它们的混合物。

上述反应的反应温度例如较好是在10℃～50℃的范围内，更好是在20℃～40℃的范围内，进一步更好是在25℃～35℃的范围内。

反应时间根据所使用的酸的种类、反应温度而不同，通常合适的是在0.1分钟～24小时的范围内。较好是在1分钟～5小时的范围内。

此外，本工序结束后，可以根据需要添加用于中和体系中存在的酸的碱。作为“碱”无特别限定，可例举例如二异丙胺。碱也可以用合适的溶剂稀释后使用，使其达到0.1％(v/v)～30％(v/v)的范围内的浓度。

作为本工序中使用的溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举二氯甲烷、乙腈、醇类(乙醇、异丙醇、三氟乙醇等)、水或它们的混合物。反应温度例如较好是在10℃～50℃的范围内，更好是在20℃～40℃的范围内，进一步更好是在25℃～35℃的范围内。

反应时间根据所使用的碱的种类、反应温度而不同，通常合适的是在0.1分钟～24小时的范围内，较好是在1分钟～5小时的范围内。

化合物(II)中，n=1且L为基团(IV)的以下述通式(IIa)表示的化合物(下称化合物(IIa))可通过以下方法制造。

[化14]

式中，B^P、R¹、接头、固相载体的含义与上文中相同。

工序1：

通过使以下述通式(V)表示的化合物与酰基化剂作用，来制造以下述通式(VI)表示的化合物(下称化合物(VI))的工序。

[化15]

式中，B^P、R¹、接头的含义与上文中相同；

R⁶表示羟基、卤素或氨基。

本工序可以化合物(V)作为起始原料，通过公知的接头的引入反应来实施。

特别是以下述通式(VIa)表示的化合物可使用化合物(V)和琥珀酸酐，通过实施作为酯化反应已知的方法来制造。

[化16]

式中，B^P、R¹的含义与上文中相同。

工序2：

通过使化合物(VI)与缩合剂等作用，使其与固相载体反应来制造化合物(IIa)的工序。

[化17]

式中，B^P、R⁶、R¹、接头、固相载体的含义与上文中相同。

本工序可使用化合物(VI)和固相载体，通过作为缩合反应已知的方法来制造。

化合物(II)中，n=2～99的整数且L为基团(IV)的以下述通式(IIa2)表示的化合物可以化合物(IIa)作为起始原料，通过反复实施所要次数的本说明书中记载的吗啉基核酸低聚物的制法中的工序A和工序B来製造。

[化18]

式中，B^P、X、Y、R¹、接头、固相载体的含义与上文中相同；

n’表示1～98的整数。

化合物(II)中，n=1且L为氢的以下述通式(IIb)表示的化合物例如可通过WO1991/009033中记载着的方法来制造。

[化19]

式中，B^P、R¹的含义与上文中相同。

化合物(II)中，n=2～99的整数且L为氢的以下述通式(IIb2)表示的化合物可以化合物(IIb)作为起始原料，通过反复实施所要次数的本说明书中记载的吗啉基核酸低聚物的制法中的工序A和工序B来製造。

[化20]

式中，B^P、n’、R¹、X、Y的含义与上文中相同。

化合物(II)中，n=1且L为酰基的以下述通式(IIc)表示的化合物可通过对化合物(IIb)实施作为酰基化反应已知的方法来制造。

[化21]

式中，B^P、R¹的含义与上文中相同；

R⁷表示酰基。

化合物(II)中，n=2～99的整数且L为酰基的以下述通式(IIc2)表示的化合物可以化合物(IIc)作为起始原料，通过反复实施所要次数的本说明书中记载的吗啉基核酸低聚物的制法中的工序A和工序B来製造。

[化22]

式中，B^P、n’、R¹、R⁷、X、Y的含义与上文中相同。

(2)工序B：

通过使化合物(III)在碱的存在下与吗啉基单体化合物作用，来制造以下述通式(VII)表示的化合物(下称化合物(VII))的工程。

[化23]

式中，B^P、L、n、R¹、X、Y的含义与上文中相同。

本工序可通过使化合物(III)在碱的存在下与吗啉基单体化合物作用来实施。

作为吗啉基单体化合物，可例举例如以下述通式(VIII)表示的化合物。

[化24]

式中，B^P、R¹、X、Y、Z的含义与上文中相同。

作为本工序中可以使用的“碱”，可例举例如二异丙胺、三乙胺或N-乙基吗啉。作为碱的用量，例如相对于化合物(III)1摩尔，以摩尔比计合适的是在1倍量～1000倍量的范围内，较好是在10倍量～100倍量的范围内。

本工序中可以使用的吗啉基单体化合物和碱也可以用合适的溶剂稀释后使用，使其达到0.1％～30％的浓度。作为溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如N,N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基哌啶酮、DMF、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或它们的混合物。

反应温度例如较好是在0℃～100℃的范围内，更好是在10℃～50℃的范围内。

反应时间根据所使用的碱的种类、反应温度而不同，通常合适的是在1分钟～48小时的范围内，较好是在30分钟～24小时的范围内。

在本工序结束后，还可以根据需要添加酰基化剂。作为“酰基化剂”，可例举例如乙酸酐、乙酰氯、苯氧基乙酸酐。酰基化剂也可以用合适的溶剂稀释后使用，使其达到0.1％～30％的范围内的浓度。作为溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、乙腈、醇类(乙醇、异丙醇、三氟乙醇等)、水或它们的混合物。

如果需要，可以和酰基化剂一起使用例如吡啶、二甲基吡啶、紫堇定、三乙胺、二异丙基乙胺、N-乙基吗啉这样的碱。作为酰基化剂的用量，以摩尔比计较好是在0.1倍量～10000倍量的范围内，更好是在1倍量～1000倍量的范围内。作为碱的用量，例如相对于酰基化剂1摩尔，以摩尔比计合适的是在0.1倍量～100倍量的范围内，较好是在倍量～10倍量的范围内。

本反应的反应温度较好是在10℃～50℃的范围内，更好是在10℃～50℃的范围内，更好是在20℃～40℃的范围内，进一步更好是在25℃～35℃的范围内。反应时间根据例如所使用的酰基化剂的种类、反应温度而不同，通常合适的是在0.1分钟～24小时的范围内，较好是在1分钟～5小时的范围内。

(3)工序C：

工序B中制造的化合物(VII)中，使用脱保护剂使保护基离去，来制造以通式(IX)表示的化合物的工序。

[化25]

式中，Base、B^P、L、n、R¹、X、Y的含义与上文中相同。

本工序可通过使化合物(VII)与脱保护剂作用来实施。

作为“脱保护剂”，可例举例如浓氨水、甲胺。本工序中可以使用的“脱保护剂”也可以用例如水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、DMF、N,N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基哌啶酮或它们的混合溶剂稀释后使用。其中优选乙醇。作为脱保护剂的用量，例如相对于化合物(VII)1摩尔，例如以摩尔比计合适的是在1倍量～100000倍量的范围内，较好是在10倍量～1000倍量的范围内。

反应温度例如合适的是在15℃～75℃的范围内，较好是在40℃～70℃的范围内，更好是在50℃～60℃的范围内。脱保护反应时间根据化合物(VII)的种类、反应温度等而不同，合适的是在10分钟～30小时的范围内，较好是在30分钟～24小时的范围内，更好是在5小时～20小时的范围内。

(4)工序D：

通过使工序C中制造的化合物(IX)与酸作用，来制造吗啉基核酸低聚物(I)的工序。

[化26]

式中，Base、n、R¹、X、Y的含义与上文中相同。

本工序可通过在化合物(IX)中添加酸来实施。

作为本工序中可以使用的“酸”，可例举例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸和盐酸。作为酸的用量，例如合适的是按照溶液的pH在0.1～4.0的范围内的条件使用，更好是在1.0～3.0的范围内使用。作为溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如乙腈、水或它们的混合溶剂。

反应温度较好是在10℃～50℃的范围内，更好是在20℃～40℃的范围内，进一步更好是在25℃～35℃的范围内。脱保护反应时间根据化合物(IX)的种类、反应温度等而不同，合适的是在0.1分钟～5小时的范围内，较好是在1分钟～1小时的范围内，更好是在1分钟～30分钟的范围内。

吗啉基核酸低聚物(I)可以从本工序中得到的反应混合物通过单独或组合使用常规的分离纯化方法，例如萃取、浓缩、中和、过滤、离心分离、重结晶、C₈～C₁₈的反相柱色谱、阳离子交换柱色谱、阴离子交换柱色谱、凝胶过滤柱色谱、高效液相色谱、透析、超滤等方法而获得，可分离纯化所要的吗啉基核酸低聚物(I)(例如参照WO1991/09033)。

使用反向色谱法来纯化吗啉基核酸低聚物(I)时，作为洗脱溶剂，可使用例如20mM的三乙胺/乙酸缓冲液和乙腈的混合溶液。

使用离子交换色谱法来纯化吗啉基核酸低聚物(I)时，可使用例如1M的食盐水和10mM的氢氧化钠水溶液的混合溶液。

本发明化合物可以直接用作吗啉基核酸低聚物的合成原料单体或用于合成该原料单体的原料，也可以通过公知的方法制成盐的形态来使用。作为该盐，可例举盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等无机酸的盐，乙酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸等有机酸的盐等。

本发明化合物或其盐中也存在具有不对称碳的化合物或其盐，各光学异构体及它们的混合物也均包含在本发明中。光学异构体例如可以从如上所述得到的外消旋体中，利用其碱性用具有光学活性的酸(酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、10-樟脑磺酸等)通过公知的方法进行光学离析，或者用预先制备好的具有光学活性的化合物作为原料来制造。此外，也可以通过使用手性柱的光学离析或不对称合成来制造。

本发明化合物或其盐中存在几何异构体或互变异构体时，不仅是任一种异构体，它们的混合物也包含在本发明化合物中。

如上所述制成的本发明化合物或其盐可通过本身公知的方法，例如浓缩、液性转换、溶剂转换、溶剂萃取、结晶化、重结晶、分馏、色谱来分离纯化。

实施例

以下举出参考例、实施例、制造例、试验例来对本发明进行更详细的说明，但本发明不只限定于此。

参考例1N ⁹ -{(2R,6S)-6-(羟甲基)吗啉-2-基}-N ² -(苯氧基乙酰基)鸟嘌呤对甲苯磺酸盐

工序1N²-(苯氧基乙酰基)鸟苷

将鸟苷(100g)于80℃在减压下干燥24小时。添加吡啶(脱水,500ml)、二氯甲烷(脱水,500ml)，在氩气气氛下于0℃滴加三甲基氯硅烷(401mL)，在室温下搅拌3小时。再次冰冷，滴加苯氧基乙酰氯(66.3g)，在冰冷下再搅拌3小时。在反应液中添加甲醇(500ml)，在室温下彻夜搅拌后，在减压下蒸除溶剂。在残渣中添加甲醇(500ml)，在减压下浓缩3次。在残渣中添加水(4L)，在冰冷下搅拌1小时，滤取析出物。将其用水洗涤，接着用冷甲醇洗涤，进行干燥，得到目标化合物150.2g(参考:Org.Lett.(2004),Vol.6,No.15,2555-2557)。

工序2N⁹-{(2R,6S)-6-(羟甲基)吗啉-2-基}-N²-(苯氧基乙酰基)鸟嘌呤对甲苯磺酸盐

将工序1中得到的化合物(30g)悬浮于甲醇(480ml)，在冰冷下添加2N盐酸(130ml)。接着，依次添加四硼酸铵四水合物(56.8g)、高碘酸钠(16.2g)，在室温下搅拌3小时。将反应液冰冷，过滤除去不溶物，将其用甲醇(100ml)洗涤。将滤液和洗涤液合并，冰冷，添加2-甲基吡啶-N-甲硼烷(11.52g)，搅拌20分钟后，缓慢添加对甲苯磺酸一水合物(54.6g)，于4℃彻夜搅拌。滤取析出物，用冷甲醇(500ml)洗涤后，进行干燥，得到目标化合物17.7g(收率:43.3％)。

¹H-NMR(DMSO-d₆):δ9.9-9.2(2H,br),8.35(1H,s),7.55(2H,m),

7.35(2H,m),7.10(2H,d,J=7.82Hz),7.00(3H,m),

5.95(1H,dd,J=10.64,2.42Hz),4.85(2H,s),4.00(1H,m),

3.90-3.60(2H,m),3.50-3.20(5H,m),2.90(1H,m),2.25(3H,s)

参考例2承载于氨基甲基聚苯乙烯树脂(GE医疗公司（ＧＥヘルスケア社）制，自定义底物支持物氨基200(Custom Primer Support Amino200)， 28-9229-46)的4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲酰胺-2-氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸的制造

在氩气气氛下将N-{1-[(2R,6S)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基}苯甲酰胺0.46g和4-二甲氨基吡啶(4-DMAP)0.15g悬浮于二氯甲烷10mL，添加琥珀酸酐0.12g，在室温下搅拌3小时。在反应液中添加甲醇1mL，减压浓缩。用乙酸乙酯和0.5M的磷酸二氢钾水溶液对残渣进行萃取操作。依次用0.5M的磷酸二氢钾水溶液、水、饱和食盐水洗涤所得的有机层。用硫酸钠干燥所得的有机层，减压浓缩。

将所得的残渣溶解于吡啶(脱水)50mL，添加4-DMAP0.1g、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐1.5g。接着，添加氨基甲基聚苯乙烯树脂(GE医疗公司制，自定义底物支持物氨基200(Custom Primer SupportAmino200)，28-9229-46)5.0g、三乙胺1.7mL，在室温下振荡6天。反应后，滤取树脂。依次用吡啶、甲醇、二氯甲烷洗涤所得的树脂，减压干燥。在所得的树脂中添加四氢呋喃(脱水)40mL、乙酸酐3mL、2,6-二甲基吡啶3mL，在室温下振荡1.5小时。滤取树脂，依次用吡啶、甲醇、二氯甲烷洗涤，进行减压干燥，得到5.0g标题化合物。

该目标物的上样量通过如下方法确定：采用公知的方法测定409nm处的UV吸光度，从而测定每1g树脂的三苯甲基的摩尔量。树脂的上样量为46.3μmol/g。

UV测定条件

机器：U-2910(日立制作所)

溶剂：甲磺酸

波长：265nm

ε值：45000

参考例3承载于氨基甲基聚苯乙烯树脂(1％DVB交联，东京化成工业株式会社制，A1543)的4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲酰胺-2-氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸的制造

在氩气气氛下将N-{1-[(2R,6S)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基}苯甲酰胺30g和4-二甲氨基吡啶(4-DMAP)9.6g悬浮于二甲基甲酰胺60mL，添加琥珀酸酐7.86g，在室温下搅拌2小时。在反应液中添加1M的磷酸二氢钾水溶液，用乙酸乙酯进行萃取操作。依次用1M的磷酸二氢钾水溶液、水、饱和食盐水洗涤所得的有机层。用硫酸镁干燥所得的有机层，进行减压浓缩，得到粗结晶34.0g。

将所得的粗结晶29.5g溶解于吡啶(脱水)300mL，添加4-DMAP5.1g、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐20.1g。接着，添加氨基甲基聚苯乙烯树脂(1％DVB交联，东京化成工业株式会社制，A1543)25.0g、三乙胺24mL，在室温下振荡3天。反应后，滤取树脂。依次用吡啶、甲醇、二氯甲烷洗涤所得的树脂，减压干燥。在所得的树脂中添加四氢呋喃(脱水)300mL、乙酸酐30mL、2,6-二甲基吡啶30mL，在室温下振荡2.5小时。滤取树脂，依次用吡啶、甲醇、二氯甲烷洗涤，进行减压干燥，得到33.2g标题化合物。

该目标物的上样量通过如下方法确定：采用公知的方法测定409nm处的UV吸光度，从而测定每1g树脂的三苯甲基的摩尔量。树脂的上样量为292.4μmol/g。

UV测定条件

机器：U-2910(日立制作所)

溶剂：甲磺酸

波长：265nm

ε值：45000

实施例1[(2S,6R)-6-{N ² -(苯氧基乙酰基)-O ⁶ -(2-氰基乙基)鸟嘌呤 -9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲基二甲基磷酰胺氯化物

工序1N⁹-{(2R,6S)-6-羟甲基-4-三苯甲基吗啉-2-基}-N²-(苯氧基乙酰基)鸟嘌呤的制造

将N⁹-{(2R,6S)-6-(羟甲基)吗啉-2-基}-N²-(苯氧基乙酰基)鸟嘌呤对甲苯磺酸盐(2.0g)(参考例1)悬浮于二氯甲烷(30ml)，在冰冷下添加三乙胺(13.9g)、三苯甲基氯(18.3g)，在室温下搅拌1小时。用饱和碳酸氢钠水溶液、接着用水洗涤反应液后，回收有机层，用硫酸钠干燥，将有机层减压浓缩。在残渣中添加0.2M柠檬酸钠缓冲液(pH3)/甲醇(1:4(v/v),40ml)，搅拌，接着添加水(40ml)，在冰冷下搅拌1小时(悬浮状态)。将其滤取出来，用冷甲醇洗涤，进行干燥，得到目标化合物1.84g(收率:82.0％)。

工序2N⁹-[(2R,6S)-6-{(叔丁基二甲基硅氧基)甲基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]-N²-(苯氧基乙酰基)鸟嘌呤的制造

将工序1中得到的化合物(38.3g)溶解于二氯甲烷(300mL)，在冰冷下依次添加咪唑(4.64g)、叔丁基二甲基硅氯烷基(9.47g)，在室温下搅拌1小时。用0.2M柠檬酸钠缓冲液(pH3)、接着用饱和食盐水洗涤反应液后，回收有机层，用硫酸镁干燥，将有机层减压浓缩，以粗产物的形式得到目标化合物44.1g。

工序3N⁹-[(2R,6S)-6-{(叔丁基二甲基硅氧基)甲基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]-N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-三异丙基苯磺酰基鸟嘌呤的制造

将工序2中得到的化合物(44.1g)溶解于二氯甲烷(300mL)，在冰冷下添加4-二甲氨基吡啶(0.64g)、三乙胺(29.2mL)、三异丙基苯磺酰氯(19.0g)，在室温下搅拌1小时。用1M磷酸二氢钠水溶液洗涤反应液后，回收有机层，用硫酸钠干燥，将有机层减压浓缩，以粗产物的形式得到目标化合物60.5g。

工序4N⁹-[(2R,6S)-6-{(叔丁基二甲基硅氧基)甲基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]-N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤的制造

将工序3中得到的化合物(60.5g)溶解于二氯甲烷(300mL)，在冰冷下添加N-甲基吡咯烷(54.5mL)，搅拌1小时。在反应液中添加3-羟基丙腈(37.2g)，接着添加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(11.96g)，在冰冷下再搅拌2小时。用1M磷酸二氢钠水溶液、接着用水洗涤反应液后，回收有机层，用硫酸钠干燥，将有机层减压浓缩，以粗产物的形式得到目标化合物72.4g。

工序5N⁹-[(2R,6S)-6-羟甲基-4-三苯甲基吗啉-2-基]-N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤的制造

将工序4中得到的化合物(72.4g)溶解于二氯甲烷(300mL)，添加三乙胺三氢氟酸盐(21.1g)，在室温下搅拌17小时。将反应液注入冷饱和碳酸氢钠水溶液中，中和后回收二氯甲烷层，用硫酸钠干燥，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(PSQ100B(富士硅化学株式会社(冨士シリシア化学株式会社)制，下同))纯化，得到目标化合物14.3g(从工序2的收率:39.2％)。

实施例6[(2S,6R)-6-{N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤-9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲基二甲基磷酰胺氯化物的制造

在氩气气氛下在THF(86mL)中添加二甲氨基磷酰二氯(4.03mL)，冰冷，向其中添加N-甲基咪唑(3.37mL)。反应液呈悬浮状态。5分钟后，以粉末的形式直接添加工序5中得到的化合物(11.86g)，再搅拌5分钟，添加N-乙基吗啉(2.16mL)后，在室温下搅拌3小时。将反应液注入冰冷的1M磷酸二氢钠水溶液，用乙酸乙酯(300ml)进行萃取操作。接着，用饱和食盐水洗涤有机层，回收有机层，用硫酸钠干燥，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(PSQ100B)纯化，得到目标化合物9.9g(收率:70.7％)。

¹H-NMR(CDCl₃):δ8.85(1H,bs),7.85(1H,d,J=3.45Hz),7.60-7.00(20H,m),6.30(1H,d,J=9.51Hz),4.90-4.70(4H,m),4.60-4.40(1H,m),4.20-4.00(1H,m),3.50(1H,d,J=11.28Hz),3.25(1H,d,J=10.21Hz),3.00(2H,t,J=6.56Hz),2.65(6H,dd,J=13.89,4.1Hz),1.85-1.55(2H,m)

³¹P-NMR(CDCl₃):δ20.7097,20.3500

以下的制造例或试验例中使用的吗啉基单体化合物的结构式和缩写示于表1。

[表1]

制造例1使用CE-G的、碱基序列为5’-CAGTGC-3’的、具有下述结构的吗啉基核酸低聚物的合成

[化27]

[工序1]将承载于氨基甲基聚苯乙烯树脂的4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲酰胺-2-氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(参考例2)216mg(10μmol)移入合成用柱，装填于自动合成机(Oligopilot10:GE医疗公司制)。此外，也制备必要的试剂类并装填。固相合成于50℃(使用柱加热炉)在表2的合成条件下进行合成。

[表2]

※单体溶液和活化剂溶液设定为6:4的体积比。

作为脱保护溶液，使用含有3％(w/v)三氯乙酸的二氯甲烷溶液。作为活化剂，使用含有20％(v/v)的N,N-二异丙基乙胺和10％(v/v)的四氢呋喃的乙腈溶液。

作为吗啉基单体化合物，使用表1中记载的A^P、C^P、T^P和CE-G。

作为吗啉基单体溶液，使用用四氢呋喃溶解的溶液，使得上述吗啉基单体化合物为0.13～0.15M(A^P,C^P:0.14M；T^P:0.15M；CE-G:0.13M)。

[工序2]

从反应容器中回收[工序1]中得到的承载有吗啉基核酸低聚物的氨基甲基聚苯乙烯树脂，在室温下减压干燥2小时以上。将干燥后的承载于氨基甲基聚苯乙烯树脂的吗啉基核酸低聚物10mg投入反应容器，添加28％氨水－乙醇(1/3)1.0mL，于55℃搅拌15小时。过滤分离氨基甲基聚苯乙烯树脂，用乙醇1.0mL洗涤。在所得滤液中添加乙醚10mL。离心后除去上清，减压干燥，从而以白色沉淀的形式得到目标产物。

MALDI-TOF-MS计算值：1921.66

测定值：1917.69

制造例2使用POB-G的、碱基序列为5’-CAGTGC-3’的吗啉基核酸低聚物的合成

使用[(2S,6R)-6-{N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(新戊酰氧基苄基)鸟嘌呤-9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲基二甲基磷酰胺氯化物(参照WO2009/064471A1，下称POG-G(参照表1))来代替CE-G单体，通过与制造例1的[工序1]、[工序2]同样的方法来制造与制造例1同样序列的吗啉基核酸低聚物。

制造例3碱基序列为5’-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTT-3’的吗啉基核酸低聚物的合成

将承载于氨基甲基聚苯乙烯树脂的4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲酰胺-2-氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(参考例3)6.02g(1.75mmol)移入反应槽，添加二氯甲烷90mL，静置30分钟。过滤后，开始表3的合成循环。在各循环中添加所要的吗啉基单体化合物，使其成为标题化合物的碱基序列。

[表3]

※1固相载体发生溶胀而变得能搅拌的最少量。

※2到10mer为止为90分钟，

11-21mer为300分钟。

作为脱保护溶液，使用以三氟乙酸(2当量)和三乙胺(1当量)的混合物为3％(w/v)的条件将它们溶解在含有1％(v/v)乙醇和10％(v/v)2,2,2-三氟乙醇的二氯甲烷溶液中而得的溶液。作为中和溶液，使用以N,N-二异丙基乙胺为5％(v/v)的条件将其溶解在含有25％(v/v)2-丙醇的二氯甲烷溶液中而得的溶液。

作为偶联溶液A，使用以吗啉基单体化合物(A^P、C^P、T^P和CE-G)为0.15M的条件将它们溶解在含有10％(v/v)N,N-二异丙基乙胺的1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中而得的溶液。作为偶联溶液B，使用以N,N-二异丙基乙胺为10％(v/v)的条件将其溶解在1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中而得的溶液。作为保护溶液，使用在二氯甲烷中溶解有20％(v/v)乙酸酐和30％(v/v)2,6-二甲基吡啶的溶液。

从反应容器中回收上文中合成的承载有吗啉基核酸低聚物的氨基甲基聚苯乙烯树脂，在室温下减压干燥2小时以上。将干燥后的承载于氨基甲基聚苯乙烯树脂的吗啉基核酸低聚物投入反应容器，添加28％氨水－乙醇(1/4)350mL，于55℃搅拌15小时。过滤分离氨基甲基聚苯乙烯树脂，用水－乙醇(1/4)150mL洗涤。将所得滤液减压浓缩。将所得的残渣溶解于20mM的乙酸-三乙胺缓冲液(TEAA缓冲液)和乙腈的混合溶剂(4/1)400mL，用膜滤器过滤。用反相HPLC纯化所得的滤液。采用的条件如表4所示。

[表4]

分析各馏分，回收目标产物，减压浓缩而得到淡黄色固体。在所得的固体中添加10mM的磷酸水溶液200mL使其悬浮。添加2M的磷酸水溶液10mL，搅拌15分钟。进一步添加2M的氢氧化钠水溶液15mL进行中和。进一步添加2M的氢氧化钠水溶液20mL使其成为碱性，用膜滤器(0.22μm)过滤。用10mM的氢氧化钠水溶液180mL充分洗涤，得到含有目标产物(5.8g、收率50％)的水溶液(400mL)。

ESI-TOF-MS计算值：6609.62

测定值：6609.09

试验例1用本发明化合物(CE-G)制成的吗啉基核酸低聚物(制造例1) 和用现有技术化合物(POB-G)制成的吗啉基核酸低聚物(制造例2)的比较

(1)合成的吗啉基核酸低聚物的纯度或收量的比较

对于通过与制造例1的[工序1]和制造例2的[工序1]同样的操作而得的承载有吗啉基核酸低聚物的氨基甲基聚苯乙烯树脂，分别用浓氨水/乙醇混合液处理，将吗啉基核酸低聚物从固相载体取下。过滤除去载体后，在滤液中添加大幅过量的乙醚，供于离心分离，除去上清液，以固形物的形式回收该低聚物的粗产物。将固形物干燥后，溶解于水(20ml)，取其中的5μl供于HPLC，测定该未纯化的混合物中所含的标题吗啉核酸低聚物的含量。结果分别示于图1和图2的HPLC色谱图。

测定条件如下。

测定条件：

HPLC装置

送液单元：LC-10AT VP(岛津制作所株式会社制)

检测器：SPD-10AVP(岛津制作所株式会社制)

反相HPLC柱

XBridge<2.5μm,φ4.6mm×50mm>(沃特世公司制)

柱温：60℃

流动相

梯度：线性梯度20分钟(B液:0-40％)

A液：50mM三乙胺－乙酸缓冲液

B液：乙腈

流动相的流量：0.75ml/分钟

紫外可见分光器检测波长：260nm

分析图1和图2的HPLC色谱图而得的未纯化的混合物中所含的标题吗啉基核酸低聚物的面积百分率(％)和峰面积(μAU·sec)示于表5。

[表5]

由表5的结果可知，吗啉基核酸低聚物的合成中使用CE-G单体的情况下，与使用POB-G单体的情况相比，面积百分率更高，峰面积更大，所以可以认为，合成的吗啉基核酸低聚物的纯度更高，收量更多，因此本发明优于现有技术。

(2)合成的吗啉基核酸低聚物的基于质谱分析的比较

对于上述(1)中得到的各未纯化的吗啉基核酸低聚物测定质谱(MALDI-TOF-MS；Autoflex/布鲁克·道尔顿公司(Bruker Daltonics社)制)，分别得到图3和图4的质谱图。

其结果是，使用POB-G单体的情况下(图4)，确认到在使用CE-G单体的情况下(图3)未确认到的副产物的存在。该副产物的分子量的测定值比标题吗啉基核酸低聚物的标准峰大106，推测是WO2009/064471中报道的对羟基苄基加成物。

另一方面，使用CE-G单体的情况下，虽然CE基发生β－离去，但未检出丙烯腈的加成物(图3)，CE-G单体在吗啉基核酸低聚物的合成中表现优良。

Claims

1.下述通式(1)表示的化合物或其盐；

[化1]

式中，R¹表示氢或以下述通式(2)表示的基团；

[化2]

R²表示以下述通式(3)或(4)表示的基团；

[化3]

R⁵、R⁶相同或不同，表示烷基；

[化4]

式中，*的含义与上文中相同；X表示O或S；

Y表示二烷基氨基或烷氧基；

Z表示卤素。

2.如权利要求1所述的化合物或其盐，其中，X为O，Y为二烷基氨基，Z为氯。

3.如权利要求1所述的化合物或其盐，其中，R³是可以被叔丁基二甲基硅烷基或叔丁基二苯基硅烷基保护的羟基。

4.如权利要求1所述的化合物或其盐，其中，R⁴为苯氧基甲基。

5.如权利要求1所述的化合物或其盐，其中，R¹为三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4-甲基三苯甲基、4,4’-二甲基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基或4,4’,4’’-三甲基三苯甲基。

6.如权利要求1所述的化合物或其盐，其是下述化合物(1)～(3)中的任一种，

(1)N⁹-[(2R,6S)-6-{(叔丁基二甲基硅氧基)甲基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]-N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤、

(2)N⁹-{(2R,6S)-6-羟甲基-4-三苯甲基吗啉-2-基}-N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤、

(3)[(2S,6R)-6-{N²-(苯氧基乙酰基)-O⁶-(2-氰基乙基)鸟嘌呤-9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲基二甲基磷酰胺氯化物。