KR101764462B1 - 모르폴리노 핵산 유도체 - Google Patents

모르폴리노 핵산 유도체 Download PDF

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Abstract

모르폴리노 핵산 올리고머의 제조에 유용한 모르폴리노 핵산 유도체를 제공한다. 본 발명으로서는, 하기 화학식 (1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 들 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00037

상기 식에서, R1은 수소 또는 트리틸 등을 나타낸다. R2는 아미드 또는 이민을 나타낸다. R3은 트리알킬실릴 등으로 보호되어 있어도 좋은 수산기, 또는 하기 화학식 (5)로 표시되는 기를 나타낸다.
Figure 112013037667838-pct00038

[상기 식에서, X는 O 또는 S를 나타낸다. Y는 디알킬아미노 또는 알콕시를 나타낸다. Z는 염소를 나타낸다.]

Description

모르폴리노 핵산 유도체{MORPHOLINO NUCLEIC ACID DERIVATIVE}
본 발명은, 신규한 모르폴리노 핵산 유도체에 관한 것이다.
염기 부분이 구아닌인 모르폴리노 핵산 모노머(이하, 「G 모노머」라 함)는, 구아닌의 6위치의 탄소 원자에 산소 원자가 결합되어 있다. 그 때문에, 구아닌의 6위치 수산기가 보호되어 있지 않은 G 모노머를 사용하여 모르폴리노 핵산 올리고머를 합성한 경우, 부반응이 일어날 수 있다. 예컨대, 축합 공정에 있어서, 구아닌의 6위치 수산기가 다른 모르폴리노 핵산 모노머의 활성 부위와 반응하여 포스포릴체를 형성하고, 이것이 탈보호 공정에서 이용되는 암모니아와 반응하여 구아닌이 디아미노퓨린으로 변환되는 경우가 있다. 이러한 부반응은, 목적물의 합성 수율을 저하시키는 커다란 요인이 된다.
상기 부반응을 억제하기 위해, AVI BIOPHARMA사는, 구아닌의 6위치 수산기가 피발로일옥시벤질(POB기)로 보호된 G 모노머를 보고하고 있다(예컨대, 특허문헌 1 참조). 그러나, POB기는, 탈보호 공정에 있어서 4-메틸렌시클로헥사-2,5-디에논으로 변환되고, 이것이 모르폴리노 핵산 올리고머의 모르폴린의 NH 부분에 부가하여 부생성물을 형성한다.
그 이외에, 특허문헌 1은 구아닌의 6위치 수산기의 다른 보호기에 대해서도 보고하고 있다. 이러한 다른 보호기로서, 특허문헌 1에서는, 예컨대, 4-니트로페네틸, 페닐술포닐에틸, 메틸술포닐에틸이 개시되어 있다. 그러나, 이들 보호기는, 탈보호 공정에 있어서, 예컨대, 4-니트로스티렌과 같은 반응 활성종으로 변환되고, 이것이 모르폴리노 핵산 올리고머의 모르폴린의 NH 부분에 부가하여 부생성물을 형성한다. 또한, t-부틸디메틸실릴 등의 실릴계 보호기가 알려져 있지만, 이것은, 모르폴리노 핵산 올리고머의 합성 조건 하에서는 불안정하여 이탈하기 쉽기 때문에, 구아닌의 6위치 수산기가 보호되어 있지 않은 G 모노머와 동일한 부반응이 보고되어 있다. 또한, 페닐에테르계 보호기나 카르바메이트계 보호기가 알려져 있지만, 이들은 탈보호 공정에 있어서 이 보호기의 이탈이 불완전하거나, 축합 공정에 있어서의 축합 효율이 악화되는 것이 보고되어 있다.
특허문헌 1 : WO2009/064471 A1
본 발명의 목적은, 주로, 효율적으로 모르폴리노 핵산 올리고머를 합성하기 위한 신규한 모르폴리노 핵산 유도체 및 그 유도체의 원료를 제공하는 데에 있다.
본 발명자는, 하기 화학식 (1)로 표시되는 화합물(이하, 「본 발명 화합물」이라 함) 또는 그의 염이, 모르폴리노 핵산 올리고머의 합성 원료, 또는, 그 합성 원료를 얻기 위한 원료로서 유용한 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
Figure 112013037667838-pct00001
상기 식에서, R1은 수소 또는 하기 화학식 (2)로 표시되는 기를 나타낸다.
Figure 112013037667838-pct00002
[상기 식에서, *는 결합 위치를 나타낸다. R11, R12, R13은 동일하거나 또는 상이하고, 수소, 알킬 또는 알콕시를 나타낸다.]
R2는 하기 화학식 (3) 또는 화학식 (4)로 표시되는 기를 나타낸다.
Figure 112013037667838-pct00003
[상기 식에서, *는 상기와 동일하다. R4는 알킬, 아릴메틸 또는 아릴옥시메틸을 나타낸다.
R5, R6은 동일하거나 또는 상이하고, 알킬을 나타낸다.]
R3은 트리알킬실릴 혹은 디페닐알킬실릴로 보호되어 있어도 좋은 수산기 또는 하기 화학식 (5)로 표시되는 기를 나타낸다.
Figure 112013037667838-pct00004
[상기 식에서, *는 상기와 동일하다. X는 O 또는 S를 나타낸다.
Y는 디알킬아미노 또는 알콕시를 나타낸다.
Z는 할로겐을 나타낸다.]
본 발명으로서, 상기 본 발명 화합물 또는 그의 염을 들 수 있다.
이하에, 본 명세서에서 기재하고 있는 용어에 대해서 상세히 설명한다.
「알킬」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼8의 알킬, 구체적으로는 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, n-헥실, 이소헥실, n-헵틸, 이소헵틸, n-옥틸을 들 수 있다. 그 중에서도, 탄소수 1∼6의 알킬이 바람직하고, 탄소수 1∼3의 알킬이 보다 바람직하다.
「트리알킬실릴」, 「디페닐알킬실릴」, 「디알킬아미노」의 「알킬」 부분으로서는 상기 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
「아릴메틸」, 「아릴옥시메틸」, 「아릴술포닐」의 「아릴」 부분으로서는, 탄소수 6∼10의 것, 예컨대, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸을 들 수 있다. 그 중에서도 페닐이 바람직하다.
「알콕시」로서는, 예컨대 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼8의 알콕시, 구체적으로는 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, t-부톡시, n-펜틸옥시, n-헥실옥시, n-헵틸옥시, n-옥틸옥시를 들 수 있다.
「할로겐」으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 그 중에서도 염소가 바람직하다.
「아실」로서는, 직쇄형 또는 분지쇄형의 알카노일, 또는 아로일을 들 수 있다. 알카노일로서는, 예컨대 포르밀, 아세틸, 2-메틸아세틸, 2,2-디메틸아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 펜타노일, 2,2-디메틸프로피오닐, 헥사노일을 들 수 있다. 아로일로서는, 예컨대 벤조일, 톨루오일, 나프토일을 들 수 있다. 이러한 아로일은 치환 가능한 위치에서 치환되어 있어도 좋고, 알킬로 치환되어 있어도 좋다.
「핵산 염기」로서는, 예컨대 아데닌, 구아닌, 히포크산틴, 시토신, 티민, 우라실 또는 이들의 수식 염기를 들 수 있다. 이러한 수식 염기로서는, 예컨대 슈도우라실, 3-메틸우라실, 디히드로우라실, 5-알킬시토신(예컨대, 5-메틸시토신), 5-알킬우라실(예컨대, 5-에틸우라실), 5-할로우라실(5-브로모우라실), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘(6-메틸우라실), 2-티오우라실, 4-티오우라실, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5'-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 1-메틸아데닌, 1-메틸히포크산틴, 2,2-디메틸구아닌, 3-메틸시토신, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메틸카르보닐메틸우라실, 5-메틸옥시우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산, 2-티오시토신, 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이소구아닌, 인돌, 이미다졸, 크산틴을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명 화합물 중에서, 하기 화합물 (a)∼(c) 또는 그의 염이 바람직하다.
(a) N9-[(2R,6S)-6-{(tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸}-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌,
(b) N9-{(2R,6S)-6-히드록시메틸-4-트리틸모르폴린-2-일}-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌,
(c) [(2S,6R)-6-{N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌-9-일}-4-트리틸모르폴린-2-일]메틸 디메틸포스포로아미도클로리데이트.
도 1은 CE-G 모노머(정의는 표 1을 참조)를 이용하여 합성된 미정제의 모르폴리노 핵산 올리고머의 HPLC 크로마토그램의 차트를 나타낸다. 종축은 강도(mAU), 횡축은 유지 시간(분)을 각각 나타낸다.
도 2는 POB-G 모노머(정의는 표 1을 참조)를 이용하여 합성된 미정제의 모르폴리노 핵산 올리고머의 HPLC 크로마토그램의 차트를 나타낸다. 종축은 강도(mAU), 횡축은 유지 시간(분)을 각각 나타낸다.
도 3은 CE-G 모노머를 이용하여 합성된 미정제의 모르폴리노 핵산 올리고머의 MS 스펙트럼 차트를 나타낸다. 종축은 이온 강도(a.u.)를, 횡축은 질량 전하비(m/z)를 각각 나타낸다.
도 4는 POB-G 모노머를 이용하여 합성된 미정제의 모르폴리노 핵산 올리고머의 MS 스펙트럼 차트를 나타낸다. 종축은 이온 강도(a.u.)를, 횡축은 질량 전하비(m/z)를 각각 나타낸다.
본 발명의 실시형태에 대해서 설명한다.
이하에 나타내는 제조 방법에 있어서, 원료가 반응에 영향을 미치는 치환기(예컨대, 히드록시, 아미노, 카르복시)를 갖는 경우는, 원료를 미리 공지된 방법에 따라, 적당한 보호기로 보호한 후에 반응을 행한다. 보호기는, 최종적으로, 접촉 환원, 알칼리 처리, 산 처리 등의 공지된 방법에 따라 이탈할 수 있다.
본 발명 화합물의 제법
본 발명 화합물은, 공지 화합물 또는 용이하게 제조 가능한 중간체로부터, 예컨대, 이하의 제법 1∼제법 3을 실시함으로써 제조할 수 있다.
제법 1 R 3 이 트리알킬실릴옥시 또는 디페닐알킬실릴옥시인 경우
Figure 112013037667838-pct00005
상기 식에서, R2는 상기와 동일하다. R7은 트리알킬실릴 또는 디페닐알킬실릴을 나타낸다. R8은 1개∼3개의 알킬로 치환되어 있어도 좋은 아릴술포닐을 나타낸다. R14는 상기한 화학식 (2)로 표시되는 기를 나타낸다.
본 반응은, 화합물 (6)과 2-시아노에탄올과의 축합 반응으로서, 그 자체가 공지된 방법에 의해 행해진다.
2-시아노에탄올의 사용량은, 화합물 (6)에 대하여 몰비로 1배량∼20배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 1.2배량∼10배량의 범위 내이다. 사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 N,N-디메틸포름아미드, 그리고, 이들 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 특히, 디클로로메탄이 바람직하다. 본 공정에서 사용할 수 있는 「염기」로서는 예컨대 N-메틸피롤리딘 및 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데카-7-엔, 그리고, 이들의 혼합물을 들 수 있다. 이러한 염기의 사용량은, 화합물 (6)에 대하여 몰비로 1배량∼20배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 1배량∼10배량의 범위 내이다. 반응 온도는 0℃∼50℃의 범위 내가 적당하다. 또한, 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 1시간∼30시간의 범위 내가 적당하다.
원료 화합물인 화합물 (6)은 예컨대 WO2009/064471의 실시예 1 화합물 4의 조제의 항에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
제법 2 R 3 이 히드록실인 경우
Figure 112013037667838-pct00006
상기 식에서, R2, R7, R14는 상기와 동일하다.
본 반응은, 화합물 (1A)의 R7을 이탈시키기 위한 반응으로서, 그 자체가 공지된 방법에 의해 행해진다.
본 공정에서 사용할 수 있는 「R7을 이탈시키기 위한 시약」으로서는, 예컨대 테트라부틸암모늄플루오라이드, 아민과 불화수소산과의 염 또는 적당한 용매 중에 아민과 불화수소산을 임의의 비로 혼합한 것을 들 수 있다.
사용하는 용매로서는, 예컨대 테트라히드로푸란(THF), 아세토니트릴, 디클로로메탄, 톨루엔, 디메틸술폭시드 및 N,N-디메틸포름아미드, 그리고, 이들 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 특히, THF, 디클로로메탄이 바람직하다.
화합물 (1A)의 종류, 이용하는 R7을 이탈시키기 위한 시약, 사용하는 용매 등에 따라 다르지만, 본 공정에서 사용할 수 있는 R7을 이탈시키기 위한 시약의 사용량으로서는, 화합물 (1A)에 대하여 몰비로 1배량∼10배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 1.2배량∼5배량의 범위 내이다. 반응 온도는 0℃∼50℃의 범위 내가 적당하다. 또한, 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 1시간∼30시간의 범위 내가 적당하다.
제법 3 R 3 이 하기 화학식 (5)로 표시되는 기인 경우
Figure 112013037667838-pct00007
[상기 식에서, X, Y, Z, *는 상기와 동일하다.]
Figure 112013037667838-pct00008
상기 식에서, R2, R14, X, Y, Z는 상기와 동일하다.
본 반응은, 화합물 (1B)를 포스포로아미드화하기 위한 반응으로서, 그 자체가 공지된 방법에 의해 행해진다.
사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 아세토니트릴, 디클로로메탄, THF를 들 수 있다.
본 공정에서 사용할 수 있는 화합물 (9)의 사용량은, 화합물 (1B)에 대하여 몰비로 1배량∼10배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 1.2배량∼5배량의 범위 내이다.
본 공정에서 사용할 수 있는 「활성화제」로서는, 예컨대, 1H-테트라졸, 5-에틸티오테트라졸, 4,5-디클로로이미다졸, 4,5-디시아노이미다졸, N-메틸이미다졸, 4-디메틸아미노피리딘을 들 수 있다. 특히 N-메틸이미다졸이 바람직하다. 이러한 「활성화제」의 사용량은, 화합물 (9)에 대하여 몰비로 0.2배량∼3배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 0.5배량∼2배량의 범위 내이다.
본 공정에서 사용할 수 있는 「염기」로서는, 예컨대 N-에틸모르폴린을 들 수 있다. 이러한 염기의 사용량은, 화합물 (9)에 대하여 몰비로 0.8배량∼5배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 1배량∼3배량의 범위 내이다. 반응 온도는 0℃∼80℃의 범위 내가 적당하다. 또한, 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 1시간∼30시간의 범위 내가 적당하다.
제법 4 R 1 이 수소인 경우
Figure 112013037667838-pct00009
상기 식에서, R2, R3, R14는 상기와 동일하다.
본 반응은, 화합물 (1D)의 R14를 탈보호하기 위한 반응으로서, 그 자체가 공지된 방법에 의해 행해진다.
본 공정에서 사용할 수 있는 「산」, 즉 「R14를 이탈시키기 위한 시약」으로서는 예컨대 아세트산, 염산 또는 인산을 들 수 있다. 이러한 산의 사용량은, 화합물 (1D)에 대하여 몰비로 1배량∼1000배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 10배량∼100배량의 범위 내이다.
사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 디클로로메탄, 메탄올, 물을 들 수 있다.
또한, 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 통상 30분∼5시간의 범위 내가 적당하다.
모르폴리노 핵산 올리고머의 제법
바람직한 모르폴리노 핵산 올리고머는 이하의 식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 올리고머이다.
Figure 112013037667838-pct00010
(상기 식에서, Base는 핵산 염기를 나타낸다. X, Y는 상기와 동일하다.)
모르폴리노 핵산 올리고머는 예컨대 WO1991/009033 또는 WO2009/064471에 따라 제조할 수 있다. 특히, 모르폴리노 핵산 올리고머는 WO2009/064471에 기재된 방법에 따라 제조하거나 또는 이하에 나타내는 방법에 따라 제조할 수 있다.
모르폴리노 핵산 올리고머의 하나의 양태로서 예컨대 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물[이하, 모르폴리노 핵산 올리고머(I)라 함]을 들 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00011
[상기 식에서, Base, X, Y는 상기와 동일하고;
n은 1∼99의 범위 내에 있는 임의의 정수이며, 바람직하게는, 18∼28의 범위 내에 있는 임의의 정수이다.]
모르폴리노 핵산 올리고머(I)는, 공지된 방법에 따라 제조할 수 있지만, 예컨대, 하기 공정의 조작을 실시함으로써 제조할 수 있다.
하기 공정에 사용되고 있는 화합물 및 시약은, 모르폴리노 핵산 올리고머의 제조에 일반적으로 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
또한, 하기의 모든 공정은, 액상법 또는 고상법(메뉴얼 또는 시판되고 있는 고상 자동 합성기를 이용함)에 의해 실시할 수 있다. 고상법으로 모르폴리노 핵산 올리고머를 제조하는 경우, 조작 절차의 간편화 및 합성의 정확성의 점에서 자동 합성기를 이용하는 방법이 바람직하다.
(1) 공정 A:
하기 화학식 (II)로 표시되는 화합물[이하, 화합물 (II)라 함]에 산을 작용시킴으로써, 하기 화학식 (III)으로 표시되는 화합물[이하, 화합물 (III)이라 함]을 제조하는 공정.
Figure 112013037667838-pct00012
[상기 식에서, n, X, Y는 상기와 동일하며;
BP는 독립적으로 보호되어 있어도 좋은 핵산 염기를 나타내고;
R1은 트리틸기, 모노메톡시트리틸기 또는 디메톡시트리틸기를 나타내며;
L은 수소, 아실 또는 하기 화학식 (IV)로 표시되는 기(이하, 「기 (IV)」라고 함)를 나타낸다.]
Figure 112013037667838-pct00013
BP에 따른 「핵산 염기」로서는 Base와 동일한 「핵산 염기」를 들 수 있다. 단, BP에 따른 핵산 염기의 아미노기 또는 수산기는 보호되어 있어도 좋다.
이러한 아미노기의 보호기로서는 핵산의 보호기로서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는 예컨대 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌을 들 수 있다. 수산기의 보호기로서는 예컨대 2-시아노에틸, 4-니트로페네틸, 페닐술포닐에틸, 메틸술포닐에틸, 트리메틸실릴에틸, 치환 가능한 임의의 위치에서 1∼5개의 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 페닐, 디페닐카르바모일, 디메틸카르바모일, 디에틸카르바모일, 메틸페닐카르바모일, 1-피롤리디닐카르바모일, 모르폴리노카르바모일, 4-(tert-부틸카르복시)벤질, 4-[(디메틸아미노)카르복시]벤질, 4-(페닐카르복시)벤질을 들 수 있다(예컨대, WO2009/064471 참조). 그 중에서도, 구아닌의 6위치 수산기의 보호기는, 2-시아노에틸이 바람직하다.
「고상 담체」로서는, 핵산의 고상 반응에 사용할 수 있는 담체라면 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, (i) 모르폴리노 핵산 유도체의 합성에 사용할 수 있는 시약(예컨대, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라졸, N-메틸이미다졸, 피리딘, 무수 아세트산, 루티딘, 트리플루오로아세트산)에 거의 용해되지 않으며, (ii) 모르폴리노 핵산 유도체의 합성에 사용할 수 있는 시약에 대하여 화학적으로 안정하고, (iii) 화학 수식이 가능하며, (iv) 바람직한 모르폴리노 핵산 유도체의 장전이 가능하고, (v) 처리 중에 가해지는 고압에 견디는 충분한 강도를 지니며, (vi) 일정한 입경 범위와 분포인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 팽윤성 폴리스티렌[예컨대, 아미노메틸폴리스티렌 수지 1% 디벤질벤젠 가교(200∼400 메시)(2.4∼3.0 mmol/g)(도쿄카세이사 제조), Aminomethylated Polystyrene Resin·HCl[디벤질벤젠 1%, 100∼200 메시](펩티드 겐큐쇼사 제조)], 비팽윤성 폴리스티렌[예컨대, Primer Support(GE 헬스케어사 제조)], PEG쇄 결합형 폴리스티렌(예컨대, NH2-PEG　resin(와타나베카가쿠사 제조), TentaGel resin), 정공 유리(controlled pore glass; CPG)(예컨대, CPG사 제조), 옥살릴화-정공 유리[예컨대, Alul 등, Nucleic Acids Research, Vol.　19, 1527(1991)을 참조], TentaGel 지지체-아미노폴리에틸렌글리콜 유도체화 지지체[예컨대, Wright 등, Tetrahedron Letters, Vol.　34, 3373(1993)을 참조], Poros-폴리스티렌/디비닐벤젠의 코폴리머를 들 수 있다.
「링커」로서는 통상 핵산이나 모르폴리노 핵산 유도체를 연결하기 위해서 사용되는 공지된 것을 이용할 수 있지만, 예컨대, 3-아미노프로필, 숙시닐, 2,2'-디에탄올술포닐, 롱 체인 알킬아미노(LCAA)를 들 수 있다.
본 공정은, 화합물 (II)에 산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
본 공정에 사용할 수 있는 「산」으로서는 예컨대 트리플루오로아세트산, 디클로로아세트산 또는 트리클로로아세트산을 들 수 있다. 산의 사용량으로서는 예컨대 화합물 (II) 1몰에 대하여 몰비로 0.1배량∼1000배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 1배량∼100배량의 범위 내이다.
또한, 상기 산과 함께 유기 아민을 사용할 수 있다. 유기 아민으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 트리에틸아민을 들 수 있다. 유기 아민의 사용량은 예컨대 산 1몰에 대하여 몰비로 0.01배량∼10배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는, 0.1배량∼2배량의 범위 내이다.
본 공정에 있어서 산과 유기 아민과의 염 또는 혼합물을 사용하는 경우에는, 예컨대, 트리플루오로아세트산과 트리에틸아민의 염 또는 혼합물을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 트리플루오로아세트산 2당량에 대하여 트리에틸아민 1당량을 혼합한 것을 들 수 있다.
본 공정에 사용할 수 있는 산은, 0.1%∼30%의 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
상기 반응에 있어서의 반응 온도는 예컨대 10℃∼50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 20℃∼40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는, 25℃∼35℃의 범위 내이다.
반응 시간은, 사용하는 산의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 0.1분∼24시간의 범위 내가 적당하다. 바람직하게는, 1분∼5시간의 범위 내이다.
또한, 본 공정이 종료된 후, 필요에 따라, 계 내에 존재하는 산을 중화하기 위해서 염기를 첨가할 수 있다. 「염기」로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 디이소프로필아민을 들 수 있다. 염기는 0.1%(v/v)∼30%(v/v)의 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다.
본 공정에 이용하는 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 반응 온도는 예컨대 10℃∼50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20℃∼40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는 25℃∼35℃의 범위 내이다.
반응 시간은, 사용하는 염기의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 0.1분∼24시간의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 1분∼5시간의 범위 내이다.
또한, 화합물 (II)에 있어서, n=1이고, L이 기 (IV)인, 하기 화학식 (IIa)로 표시되는 화합물[이하, 화합물 (IIa)이라 함]은 이하의 방법에 따라 제조할 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00014
[상기 식에서, BP, R1, 링커, 고상 담체는 상기와 동일하다.]
공정 1:
하기 화학식 (V)로 표시되는 화합물에 아실화제를 작용시킴으로써, 하기 화학식 (VI)으로 표시되는 화합물[이하, 화합물 (VI)이라 함]을 제조하는 공정.
Figure 112013037667838-pct00015
[상기 식에서, BP, R1, 링커는 상기와 동일하고;
R6은 수산기, 할로겐 또는 아미노를 나타낸다.]
본 공정은, 화합물 (V)를 출발 원료로 하여 공지된 링커의 도입 반응에 의해 실시할 수 있다.
특히, 하기 화학식 (VIa)로 표시되는 화합물은, 화합물 (V)와 무수 호박산을 이용하여 에스테르화 반응으로서 알려진 방법을 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00016
[상기 식에서, BP, R1은 상기와 동일하다.]
공정 2:
화합물 (VI)에 축합제 등을 작용시킴으로써, 고상 담체와 반응시켜, 화합물 (IIa)를 제조하는 공정.
Figure 112013037667838-pct00017
[상기 식에서, BP, R6, R1, 링커, 고상 담체는 상기와 동일하다.]
본 공정은, 화합물 (VI)과 고상 담체를 이용하여 축합 반응으로서 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다.
화합물 (II)에 있어서, n=2∼99의 정수이고, L이 기 (IV)인 하기 화학식 (IIa2)로 표시되는 화합물은, 화합물 (IIa)를 출발 원료로 하며, 본 명세서에 기재된 모르폴리노 핵산 올리고머의 제법에 관한 공정 A 및 공정 B를 원하는 횟수만큼 반복하여 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00018
[상기 식에서, BP, X, Y, R1, 링커, 고상 담체는 상기와 동일하고;
n'는 1∼98의 정수를 나타낸다.]
또한, 화합물 (II)에 있어서, n=1이고, L이 수소인, 하기 화학식 (IIb)로 표시되는 화합물은 예컨대 WO1991/009033에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00019
[상기 식에서, BP, R1은 상기와 동일하다.]
화합물 (II)에 있어서, n=2∼99의 정수이고, L이 수소인, 하기 화학식 (IIb2)로 표시되는 화합물은, 화합물 (IIb)를 출발 원료로 하며, 본 명세서에 기재된 모르폴리노 핵산 올리고머의 제법에 관한 공정 A 및 공정 B를 원하는 횟수만큼 반복하여 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00020
[상기 식에서, BP, n', R1, X, Y는 상기와 동일하다.]
또한, 화합물 (II)에 있어서, n=1이고, L이 아실인, 하기 화학식 (IIc)로 표시되는 화합물은, 화합물 (IIb)에 대하여 아실화 반응으로서 알려진 방법을 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00021
[식 중, BP, R1은 상기와 동일하며;
R7은 아실을 나타낸다.]
화합물 (II)에 있어서, n=2∼99의 정수이고, L이 아실인, 하기 화학식 (IIc2)로 표시되는 화합물은, 화합물 (IIc)를 출발 원료로 하며, 본 명세서에 기재된 모르폴리노 핵산 올리고머의 제법에 관한 공정 A 및 공정 B를 원하는 횟수만큼 반복하여 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00022
[상기 식에서, BP, n', R1, R7, X, Y는 상기와 동일하다.]
(2) 공정 B:
화합물 (III)에 염기 존재 하에 모르폴리노 모노머 화합물을 작용시킴으로써, 하기 화학식 (VII)로 표시되는 화합물[이하, 화합물 (VII)이라 함]을 제조하는 공정.
Figure 112013037667838-pct00023
[상기 식에서, BP, L, n, R1, X, Y는 상기와 동일하다.]
본 공정은, 화합물 (III)에 염기 존재 하에 모르폴리노 모노머 화합물을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
모르폴리노 모노머 화합물로서는 예컨대 하기 화학식 (VIII)로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
Figure 112013037667838-pct00024
[상기 식에서, BP, R1, X, Y, Z는 상기와 동일하다.]
본 공정에 사용할 수 있는 「염기」로서는 예컨대 디이소프로필아민, 트리에틸아민 또는 N-에틸모르폴린을 들 수 있다. 염기의 사용량으로서는 예컨대 화합물 (III) 1몰에 대하여 몰비로 1배량∼1000배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 10배량∼100배량의 범위 내이다.
본 공정에 사용할 수 있는 모르폴리노 모노머 화합물 및 염기는, 0.1%∼30%의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, N,N-디메틸이미다졸리돈, N-메틸피페리돈, DMF, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
반응 온도는, 예컨대 0℃∼100℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10℃∼50℃의 범위 내이다.
반응 시간은, 사용하는 염기의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 1분∼48시간의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는, 30분∼24시간의 범위 내이다.
또한, 본 공정의 종료 후, 필요에 따라, 아실화제를 첨가할 수 있다. 「아실화제」로서는 예컨대 무수 아세트산, 아세트산클로라이드, 페녹시아세트산 무수물을 들 수 있다. 아실화제는, 예컨대, 0.1%∼30%의 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
또한, 필요하다면, 아실화제와 함께, 예컨대, 피리딘, 루티딘, 콜리딘, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-에틸모르폴린의 염기를 사용할 수 있다. 아실화제의 사용량으로는 몰비로 0.1배량∼10000배량의 범위 내가 바람직하고, 1배량∼1000배량의 범위 내가 보다 바람직하다. 염기의 사용량으로서는 예컨대 아실화제 1몰에 대하여 몰비로 0.1배량∼100배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 2배량∼10배량의 범위 내이다.
본 반응의 반응 온도는, 10℃∼50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 10℃∼50℃의 범위 내가 바람직하며, 보다 바람직하게는, 20℃∼40℃의 범위 내이고, 더욱 바람직하게는, 25℃∼35℃의 범위 내이다. 반응 시간은, 예컨대, 사용하는 아실화제의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만, 통상 0.1분∼24시간의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는, 1분∼5시간의 범위 내이다.
(3) 공정 C:
공정 B에 있어서 제조되는 화합물 (VII)에 있어서, 탈보호제를 이용하여 보호기를 이탈시키고, 화학식 (IX)로 표시되는 화합물을 제조하는 공정.
Figure 112013037667838-pct00025
[식 중, Base, BP, L, n, R1, X, Y는 상기와 동일하다.]
본 공정은, 화합물 (VII)에 탈보호제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
「탈보호제」로서는, 예컨대, 진한 암모니아수, 메틸아민을 들 수 있다. 본 공정에 사용할 수 있는 「탈보호제」는 예컨대 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, DMF, N,N-디메틸이미다졸리돈, N-메틸피페리돈 또는 이들의 혼합 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 그 중에서도, 에탄올이 바람직하다. 탈보호제의 사용량으로서는 예컨대 화합물 (VII) 1몰에 대하여 예컨대 몰비로 1배량∼100000배량의 범위 내가 적당하며, 바람직하게는 10배량∼1000배량의 범위 내이다.
반응 온도는, 예컨대, 15℃∼75℃의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 40℃∼70℃의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 50℃∼60℃의 범위 내이다. 탈보호 반응 시간은, 화합물 (VII)의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 10분∼30시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 30분∼24시간의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 5시간∼20시간의 범위 내이다.
(4) 공정 D:
공정 C에 제조되는 화합물 (IX)에 산을 작용시킴으로써, 모르폴리노 핵산 올리고머(I)를 제조하는 공정.
Figure 112013037667838-pct00026
[상기 식에서, Base, n, R1, X, Y는 상기와 동일하다.]
본 공정은 화합물 (IX)에 산을 가함으로써 실시할 수 있다.
본 공정에 사용할 수 있는 「산」으로서는 예컨대 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 아세트산, 인산 및 염산을 들 수 있다. 산의 사용량으로서는 예컨대 용액의 pH가 0.1∼4.0의 범위 내가 되도록 사용하는 것이 적당하며, 보다 바람직하게는 1.0∼3.0의 범위 내가 되도록 사용한다. 용매로서는 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 아세토니트릴, 물 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다.
반응 온도는, 10℃∼50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 20℃∼40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는, 25℃∼35℃의 범위 내이다. 탈보호 반응 시간은 화합물 (IX)의 종류, 반응 온도 등에 따라 다르지만, 0.1분∼5시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1분∼1시간의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 1분∼30분의 범위 내이다.
모르폴리노 핵산 올리고머(I)는, 본 공정에서 얻어진 반응 혼합물로부터 통상의 분리 정제 수단, 예컨대, 추출, 농축, 중화, 여과, 원심분리, 재결정, C8∼C18의 역상 칼럼 크로마토그래피, 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 겔 여과 칼럼 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 투석, 한외 여과 등의 수단을 단독으로 또는 조합하여 이용함으로써 얻을 수 있고, 원하는 모르폴리노 핵산 올리고머(I)를 단리 정제할 수 있다(예컨대, WO1991/09033을 참조).
역상 크로마토그래피를 이용하여 모르폴리노 핵산 올리고머(I)를 정제하는 경우에는, 용출 용매로서, 예컨대 20 mM의 트리에틸아민/아세트산 완충액과 아세토니트릴의 혼합 용액을 사용할 수 있다.
또한, 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 모르폴리노 핵산 올리고머(I)를 정제하는 경우에는, 예컨대, 1 M의 식염수와 10 mM의 수산화나트륨 수용액의 혼합 용액을 사용할 수 있다.
본 발명 화합물은, 그대로 모르폴리노 핵산 올리고머의 합성 원료 모노머 또는 그 원료 모노머를 합성하기 위한 원료로서 이용할 수 있지만, 공지된 방법에 의해 염의 형태로 하여 이용할 수도 있다. 이러한 염으로서는, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등의 무기산의 염, 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 말레산, 호박산, 푸마르산, p-톨루엔술폰산, 벤젠술폰산, 메탄술폰산 등의 유기산의 염 등을 들 수 있다.
본 발명 화합물, 또는 그의 염 중에는 비대칭 탄소를 갖는 것도 존재하지만, 각 광학이성체 및 이들의 혼합물 모두 본 발명에 포함된다. 광학이성체는, 예컨대, 상기한 바와 같이 하여 얻어진 라세미체로부터, 그의 염기성을 이용하여 광학 활성인 산(타르타르산, 디벤조일타르타르산, 만델산, 10-캄파술폰산 등)을 이용하여 공지된 방법에 의해 광학 분할하거나, 미리 조제한 광학 활성인 화합물을 원료로 이용하여 제조할 수 있다. 기타, 키랄 칼럼을 이용한 광학 분할이나 비대칭 합성에 의해 제조할 수도 있다.
또한, 본 발명 화합물, 또는 그의 염에 기하이성체나 호변이성체가 존재하는 경우는, 어느 한쪽의 이성체뿐만 아니라, 이들의 혼합물도 본 발명 화합물에 포함된다.
이와 같이 하여 제조되는 본 발명 화합물, 또는 그의 염은, 그 자체가 공지된 수단, 예컨대, 농축, 액성 변환, 전용(轉溶), 용매 추출, 결정화, 재결정, 분류, 크로마토그래피에 의해 분리 정제할 수 있다.
실시예
이하에 참고예, 실시예, 제조예, 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들만으로 한정되지 않는다.
참고예 1 N 9 -{(2R,6S)-6-(히드록시메틸)모르폴린-2-일}-N 2 -(페녹시아세틸)구아닌 p-톨루엔술폰산염
공정 1 N2-(페녹시아세틸)구아노신
구아노신(100 g)을 80℃로 감압 하, 24시간 동안 건조시켰다. 피리딘(탈수, 500 ㎖), 디클로로메탄(탈수, 500 ㎖)을 첨가하여 아르곤 분위기 하, 0℃에서 클로로트리메틸실란(401 ㎖)을 적하하여 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 재차 빙냉하고, 페녹시아세틸클로라이드(66.3 g)를 적하하여, 빙냉 하에서 3시간 더 교반하였다. 반응액에 메탄올(500 ㎖)을 첨가하여 실온에서 밤새 교반한 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 잔류물에 메탄올(500 ㎖)을 첨가하여 감압 하에서 농축시키는 것을 3회 행하였다. 잔류물에 물(4 ℓ)을 첨가하여 빙냉 하에서 1시간 동안 교반하고, 석출물을 여과하여 취하였다. 이것을, 물, 계속해서, 냉 메탄올로 세정하고, 건조시켜 목적 화합물을 150.2 g 얻었다(참고: Org. Lett. (2004), Vol.　6, No.15, 2555-2557).
공정 2 N9-{(2R,6S)-6-(히드록시메틸)모르폴린-2-일}-N2-(페녹시아세틸)구아닌 p-톨루엔술폰산염
공정 1에서 얻어진 화합물(30 g)을 메탄올(480 ㎖)에 현탁시키고, 빙냉 하에서 2 N 염산(130 ㎖)을 첨가하였다. 계속해서, 4붕산암모늄 4수화물(56.8 g), 과요오드산나트륨(16.2 g)을 이 순서로 첨가하여 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응액을 빙냉하고, 불용물을 여과하여 제거하며, 이것을 메탄올(100 ㎖)로 세정하였다. 여과액과 세정액을 합하여 빙냉하고, 2-피콜린보란(11.52 g)을 첨가하여 20분간 교반한 후, p-톨루엔술폰산·1수화물(54.6 g)을 천천히 첨가하여 4℃에서 밤새 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 냉 메탄올(500 ㎖)로 세정한 후, 건조시켜 목적 화합물을 17.7 g 얻었다(수율: 43.3%).
1H-NMR(DMSO-d6): δ 9.9-9.2(2H, br), 8.35(1H, s), 7.55(2H, m), 7.35(2H, m), 7.10(2H, d, J=7.82Hz), 7.00(3H, m), 5.95(1H, dd, J=10.64, 2.42Hz), 4.85(2H, s), 4.00(1H, m), 3.90-3.60(2H, m), 3.50-3.20(5H, m), 2.90(1H, m), 2.25(3H, s)
참고예 2 아미노메틸폴리스티렌 수지(GE 헬스케어사 제조, Custom Primer Support Amino 200, 28-9229-46)에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1-일)-4- 트리틸모르폴린 -2-일] 메톡시 }-4- 옥소부탄산의 제조
아르곤 분위기 하, N-{1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일}벤즈아미드 0.46 g과 4-디메틸아미노피리딘(4-DMAP) 0.15 g을 디클로로메탄 10 ㎖에 현탁하고, 무수 호박산 0.12 g을 첨가하여 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응액에 메탄올 1 ㎖를 첨가하여 감압 농축하였다. 잔류물에 아세트산에틸과 0.5 M의 인산이수소칼륨 수용액을 이용하여 추출 조작을 행하였다. 얻어진 유기층을 0.5 M의 인산이수소칼륨 수용액, 물, 포화 식염수의 순으로 세정하였다. 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 농축하였다.
얻어진 잔류물을 피리딘(탈수) 50 ㎖에 용해하고, 4-DMAP 0.1 g, 1-에틸-3­(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 1.5 g을 첨가하였다. 계속해서, 아미노메틸폴리스티렌 수지(GE 헬스케어사 제조, Custom Primer Support Amino 200, 28-9229-46) 5.0 g, 트리에틸아민 1.7 ㎖를 첨가하여 실온에서 6일간 진탕하였다. 반응 후, 수지를 여과하여 취하였다. 얻어진 수지를 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하고, 감압 건조시켰다. 얻어진 수지에 테트라히드로푸란(탈수) 40 ㎖, 무수 아세트산 3 ㎖, 2,6-루티딘 3 ㎖를 첨가하여 실온에서 1시간 30분간 진탕하였다. 수지를 여과하여 취하고, 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하며, 감압 건조시켜 5.0 g의 표기 화합물을 얻었다.
상기 목적물의 로딩량은, 공지된 방법을 이용하여 수지 1 g당 트리틸의 몰량을 409 ㎚에 있어서의 UV 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 수지의 로딩량은 46.3 μmol/g이었다.
UV 측정 조건
기기: U-2910(히타치세이사쿠쇼)
용매: 메탄술폰산
파장: 265 nm
ε값: 45000
참고예 3 아미노메틸폴리스티렌 수지(1% DVB 가교, 도쿄카세이고교사 제조, A1543)에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산의 제조
아르곤 분위기 하, N-{1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일}벤즈아미드 30 g과 4-디메틸아미노피리딘(4-DMAP) 9.6 g을 디메틸포름아미드 60 ㎖에 현탁하고, 무수 호박산 7.86 g을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응액에 1 M의 인산이수소칼륨 수용액을 첨가하여 아세트산에틸로 추출 조작을 행하였다. 얻어진 유기층을 1 M의 인산이수소칼륨 수용액, 물, 포화 식염수의 순으로 세정하였다. 얻어진 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 감압 농축하여 조결정 34.0 g을 얻었다.
얻어진 조결정의 29.5 g을 피리딘(탈수) 300 ㎖에 용해하고, 4-DMAP 5.1 g, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 20.1 g을 첨가하였다. 계속해서, 아미노메틸폴리스티렌 수지(1% DVB 가교, 도쿄카세이고교사 제조, A1543) 25.0 g, 트리에틸아민 24 ㎖를 첨가하여 실온에서 3일간 진탕하였다. 반응 후, 수지를 여과하여 취하였다. 얻어진 수지를 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하고, 감압 건조시켰다. 얻어진 수지에 테트라히드로푸란(탈수) 300 ㎖, 무수 아세트산 30 ㎖, 2,6-루티딘 30 ㎖를 첨가하여 실온에서 2시간 30분간 진탕하였다. 수지를 여과하여 취하고, 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하며, 감압 건조시켜 33.2 g의 표기 화합물을 얻었다.
상기 목적물의 로딩량은, 공지된 방법을 이용하여 수지 1 g당 트리틸의 몰량을 409 ㎚에 있어서의 UV 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 수지의 로딩량은 292.4 μmol/g이었다.
UV 측정 조건
기기: U-2910(히타치세이사쿠쇼)
용매: 메탄술폰산
파장: 265 ㎚
ε값: 45000
실시예 1 [(2S,6R)-6-{N 2 -(페녹시아세틸)-O 6 -(2-시아노에틸)구아닌-9-일}-4-트리틸모르폴린-2-일]메틸 디메틸포스포로아미드클로리데이트
공정 1 N9-{(2R,6S)-6-히드록시메틸-4-트리틸모르폴린-2-일}-N2-(페녹시아세틸)구아닌의 제조
N9-{(2R,6S)-6-(히드록시메틸)모르폴린-2-일}-N2-(페녹시아세틸)구아닌 p-톨루엔술폰산염(2.0 g)(참고예 1)을 디클로로메탄(30 ㎖)에 현탁하고, 빙냉 하, 트리에틸아민(13.9 g), 트리틸클로라이드(18.3 g)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응액을 포화 중조수, 계속해서 물로 세정한 후, 유기층을 회수하여 황산나트륨으로 건조시키고, 유기층을 감압 농축하였다. 잔류물에 0.2 M 시트르산나트륨 완충액(pH3)/메탄올[1:4(v/v), 40 ㎖]을 첨가하여 교반하고, 계속해서 물(40 ㎖)을 첨가하여 빙냉 하에서 1시간 동안 교반하였다(현탁 상태). 이것을 여과하여 취하고, 냉 메탄올로 세정, 건조시켜 목적 화합물을 1.84 g 얻었다(수율: 82.0%).
공정 2 N9-[(2R,6S)-6-{(tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸}-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)구아닌의 제조
공정 1에서 얻어진 화합물(38.3 g)을 디클로로메탄(300 ㎖)에 용해하고, 빙냉 하, 이미다졸(4.64 g), t-부틸디메틸실릴클로라이드(9.47 g)를 이 순서로 첨가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응액을 0.2 M 시트르산나트륨 완충액(pH3), 계속해서, 포화 식염수로 세정한 후, 유기층을 회수하여 황산마그네슘으로 건조시키고, 유기층을 감압 농축시켜 목적 화합물을 조생성물로서 44.1 g 얻었다.
공정 3 N9-[(2R,6S)-6-{(tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸}-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-트리이소프로필벤젠술포닐구아닌의 제조
공정 2에서 얻어진 화합물(44.1 g)을 디클로로메탄(300 ㎖)에 용해하고, 빙냉 하, 4-디메틸아미노피리딘(0.64 g), 트리에틸아민(29.2 ㎖), 트리이소프로필벤젠술포닐클로라이드(19.0 g)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응액을 1 M 인산이수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 유기층을 회수하여 황산나트륨으로 건조시키고, 유기층을 감압 농축시켜 목적 화합물을 조생성물로서 60.5 g 얻었다.
공정 4 N9-[(2R,6S)-6-{(tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸}-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌의 제조
공정 3에서 얻어진 화합물(60.5 g)을 디클로로메탄(300 ㎖)에 용해하고, 빙냉 하에서 N-메틸피롤리딘(54.5 ㎖)을 첨가하여 1시간 동안 교반하였다. 반응액에 에틸렌시아노히드린(37.2 g), 계속해서 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데카-7-엔(11.96 g)을 첨가하여 빙냉 하에서 2시간 더 교반하였다. 반응액을 1 M 인산이수소나트륨 수용액, 계속해서 물로 세정한 후, 유기층을 회수하여 황산나트륨으로 건조시키고, 유기층을 감압 농축시켜 목적 화합물을 조생성물로서 72.4 g 얻었다.
공정 5 N9-[(2R,6S)-6-히드록시메틸-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌의 제조
공정 4에서 얻어진 화합물(72.4 g)을 디클로로메탄(300 ㎖)에 용해하고, 트리에틸아민트리히드로플루오라이드(21.1 g)를 첨가하여 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 반응액을 냉 포화 중조수에 부어 중화한 후 디클로로메탄층을 회수하여 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피[PSQ100B(후지실리시아카가쿠 가부시키가이샤 제조, 이하 동일함)]에 의해 정제하고, 목적 화합물을 14.3 g 얻었다(공정 2에서의 수율: 39.2%).
공정 6 [(2S,6R)-6-{N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌-9-일}-4-트리틸모르폴린-2-일]메틸 디메틸포스포로아미도클로리데이트의 제조
아르곤 분위기 하, THF(86 ㎖)에 디메틸아미노포스포릴디클로라이드(4.03 ㎖)를 첨가하여 빙냉하고, 이것에 N-메틸이미다졸(3.37 ㎖)을 첨가하였다. 반응액은 현탁 상태가 되었다. 5분 후, 공정 5에서 얻어진 화합물(11.86 g)을 분말 상태로 첨가하여 5분간 더 교반하고, N-에틸모르폴린(2.16 ㎖)을 첨가한 후, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응액을 빙냉한 1 M 인산이수소나트륨 수용액에 부어 아세트산에틸(300 ㎖)로 추출 조작을 행하였다. 계속해서, 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 유기층을 회수하여 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(PSQ100B)에 의해 정제하고, 목적 화합물을 9.9 g 얻었다(수율: 70.7%).
1H-NMR(CDCl3): δ 8.85(1H, bs), 7.85(1H, d, J=3.45Hz), 7.60-7.00(20H, m), 6.30(1H, d, J=9.51Hz), 4.90-4.70(4H, m), 4.60-4.40(1H, m), 4.20-4.00(1H, m), 3.50(1H, d, J=11.28Hz), 3.25(1H, d, J=10.21Hz), 3.00(2H, t, J=6.56Hz), 2.65(6H, dd, J=13.89, 4.1Hz), 1.85-1.55(2H, m)
31P-NMR(CDCl3): δ 20.7097, 20.3500
이하의 제조예, 또는 시험예에 이용하는 모르폴리노 모노머 화합물의 구조식과 약칭을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure 112013037667838-pct00027
제조예 1 CE-G를 이용한, 염기 서열이 5'-CAGTGC-3'인 하기 구조를 갖는 모르폴리노 핵산 올리고머의 합성
Figure 112013037667838-pct00028
[공정 1] 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 2) 216 ㎎(10 μmol)을 합성용 칼럼에 옮겨 넣고, 자동 합성기(Oligopilot 10: GE 헬스케어사 제조)에 장전하였다. 기타, 필요한 시약류도 조제하여 장전하였다. 고상 합성은 50℃에서(칼럼 오븐을 사용), 표 2의 합성 조건으로 합성을 행하였다.
[표 2]
Figure 112013037667838-pct00029
※ 모노머 용액과 액티베이터 용액은, 6:4의 체적비로 설정하였다.
또한, 디블록 용액(deblocking solution)으로서는 3%(w/v) 트리클로로아세트산을 함유하는 디클로로메탄 용액을 이용하였다. 액티베이터로서는 20%(v/v)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 10%(v/v)의 테트라히드로푸란을 함유하는 아세토니트릴 용액을 이용하였다.
모르폴리노 모노머 화합물로서 표 1에 기재된 AP, CP, TP 및 CE-G를 이용하였다.
모르폴리노 모노머 용액으로서는, 상기 모르폴리노 모노머 화합물을 0.13-0.15 M이 되도록, 테트라히드로푸란으로 용해한 것을 이용하였다(AP, CP: 0.14 M; TP: 0.15 M ; CE-G: 0.13 M).
[공정 2]
[공정 1]에서 얻어진 모르폴리노 핵산 올리고머가 담지된 아미노메틸폴리스티렌 수지를 반응 용기로부터 회수하여 2시간 이상 실온에서 감압 건조시켰다. 건조시킨 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 모르폴리노 핵산 올리고머 10 ㎎을 반응 용기에 넣고, 28% 암모니아수-에탄올(1/3) 1.0 ㎖를 첨가하여 55℃에서 15시간 동안 교반하였다. 아미노메틸폴리스티렌 수지를 여과 분별하고, 에탄올 1.0 ㎖로 세정하였다. 얻어진 여과액에 에틸에테르 10 ㎖를 첨가하였다. 원심 후에 상청을 제거하고, 감압 건조시킴으로써 목적물을 백색 침전으로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS 계산값: 1921.66
측정값: 1917.69
제조예 2 POB-G를 이용한, 염기 서열이 5'-CAGTGC-3'인 모르폴리노 핵산 올리고머의 합성
CE-G 모노머 대신에 [(2S,6R)-6-{N2-(페녹시아세틸)-O6-(피발로일옥시벤질)구아닌-9-일}-4-트리틸모르폴린-2-일]메틸 디메틸포스포로아미드클로리데이트[WO2009/064471 A1 참조, 이하, POG-G라 함(표 1 참조)]를 사용하여 제조예 1의 [공정 1], [공정 2]와 동일한 방법으로, 제조예 1과 동일한 서열의 모르폴리노 핵산 올리고머를 제조하였다.
제조예 3 염기 서열이 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTT-3'인 모르폴리노 핵산 올리고머의 합성
아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 3) 6.02 g(1.75 mmol)을 반응조에 옮겨 넣고, 디클로로메탄 90 ㎖을 첨가하여 30분간 정치시켰다. 여과 후, 표 3의 합성 사이클을 시작하였다. 표기 화합물의 염기 서열이 되도록, 각 사이클에 있어서 원하는 모르폴리노 모노머 화합물을 첨가하였다.
[표 3]
Figure 112013037667838-pct00030
※1 고상 담체가 팽윤하여 교반 가능하게 되는 최소량.
※2 10 mer까지 90 min, 11-21 mer는 300 min.
또한, 디블록 용액으로서는 트리플루오로아세트산(2당량)과 트리에틸아민(1당량)의 혼합물을 3%(w/v)가 되도록, 1%(v/v)의 에탄올과 10%(v/v)의 2,2,2-트리플루오로에탄올을 함유하는 디클로로메탄 용액으로 용해한 것을 이용하였다. 중화 용액으로서는 N,N-디이소프로필에틸아민을 5%(v/v)가 되도록, 25%(v/v)의 2-프로판올을 함유하는 디클로로메탄 용액으로 용해한 것을 이용하였다.
커플링 용액 A로서는 모르폴리노 모노머 화합물(AP, CP, TP 및 CE-G)을 0.15 M이 되도록, 10%(v/v)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 함유하는 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논으로 용해한 것을 이용하였다. 커플링 용액 B로서는 N,N-디이소프로필에틸아민을 10%(v/v)가 되도록, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논으로 용해한 것을 이용하였다. 캡핑 용액으로서는 디클로로메탄에 대하여 20%(v/v)의 무수 아세트산과 30%(v/v)의 2,6-루티딘을 용해한 것을 사용하였다.
상기에서 합성한 모르폴리노 핵산 올리고머가 담지된 아미노메틸폴리스티렌 수지를 반응 용기로부터 회수하여 2시간 이상 실온에서 감압 건조시켰다. 건조시킨 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 모르폴리노 핵산 올리고머를 반응 용기에 넣고, 28% 암모니아수-에탄올(1/4) 350 ㎖를 첨가하여 55℃에서 15시간 동안 교반하였다. 아미노메틸폴리스티렌 수지를 여과 분별하고, 물-에탄올(1/4) 150 ㎖로 세정하였다. 얻어진 여과액을 감압 농축하였다. 얻어진 잔류물을 20 mM의 아세트산-트리에틸아민 완충액(TEAA 완충액)과 아세토니트릴의 혼합 용매(4/1) 400 ㎖에 용해하고, 멤브레인 필터로 여과하였다. 얻어진 여과액을 역상 HPLC로 정제하였다. 사용한 조건은 표 4와 같다.
[표 4]
Figure 112013037667838-pct00031
각 분획(fraction)을 분석하여 목적물을 회수하고, 감압 농축하여 담황색 고체를 얻었다. 얻어진 고체에 10 mM의 인산 수용액 200 ㎖를 첨가하여 현탁시켰다. 2 M의 인산 수용액 10 ㎖를 첨가하여 15분간 교반하였다. 2 M의 수산화나트륨 수용액 15 ㎖를 더 첨가하여 중화하였다. 2 M의 수산화나트륨 수용액 20 ㎖를 더 첨가하여 알칼리성으로 하고, 멤브레인 필터(0.22㎛)로 여과하였다. 10 mM의 수산화나트륨 수용액 180 ㎖로 세정하고, 목적물(5.8 g, 수율 50%)을 포함하는 수용액(400 ㎖)을 얻었다.
ESI-TOF-MS 계산값: 6609.62
측정값: 6609.09
시험예 1 본 발명 화합물(CE-G)을 이용하여 제조된 모르폴리노 핵산 올리고머(제조예 1)와, 선행 기술 화합물(POB-G)을 이용하여 제조된 모르폴리노 핵산 올리고머(제조예 2)의 비교
(1) 합성된 모르폴리노 핵산 올리고머의 순도 내지 수율의 비교
제조예 1의 [공정 1] 및 제조예 2의 [공정 1]과 동일한 조작으로 얻어진 모르폴리노 핵산 올리고머가 담지된 아미노메틸폴리스티렌 수지를, 각각 진한 암모니아수/에탄올 혼합액으로 처리하고, 모르폴리노 핵산 올리고머를 고상 담체로부터 잘라내었다. 담체를 여과로써 제거한 후, 여과액에 대과잉의 에테르를 첨가하여 원심분리에 제공하고, 상청액을 제거하여 상기 올리고머의 조생성물을 고형물로서 회수하였다. 고형물을 건조시킨 후, 물(20 ㎖)에 용해하고, 이 중 5 ㎕를 채취하여 HPLC에 제공하며, 상기 미정제의 혼합물 속에 포함되는 표기 모르폴리노 핵산 올리고머의 함유량을 측정하였다. 결과를 각각 도 1 및 도 2의 HPLC 크로마토그램에 나타낸다.
또한, 측정 조건은 이하와 같다.
측정 조건:
HPLC 장치
송액 유닛: LC-10AT VP(시마즈세이사쿠쇼 제조)
검출기: SPD-10AVP(시마즈세이사쿠쇼 제조)
역상 HPLC 칼럼
XBridge＜2.5 ㎛, φ4.6 ㎜×50㎜＞(Waters사 제조)
칼럼 온도: 60℃
이동상
구배(gradient): 선형 구배 20분(B액: 0-40%)
A액: 50 mM 트리에틸아민-아세트산 완충액
B액: 아세토니트릴
이동상의 유량: 0.75 ㎖/분
자외선 가시 분광기 검출 파장: 260 ㎚
도 1 및 도 2의 HPLC 크로마토그램을 해석하여 얻어진, 미정제의 혼합물 속에 포함되는 표기 모르폴리노 핵산 올리고머의 면적 백분율(%) 및 피크 면적(μAU·sec)을 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure 112013037667838-pct00032
표 5의 결과로부터, 모르폴리노 핵산 올리고머의 합성에 있어서, CE-G 모노머를 이용한 경우는, POB-G 모노머를 이용한 경우에 비하여 면적 백분율이 높고, 피크 면적이 크기 때문에, 합성된 모르폴리노 핵산 올리고머의 순도가 높고, 수율이 많다고 할 수 있으므로, 본 발명은 선행 기술보다도 우수한 것이 분명하다.
(2) 합성된 모르폴리노 핵산 올리고머의 MS 스펙트럼 분석에 의한 비교
상기 (1)에서 얻어진 각각의 미정제의 모르폴리노 핵산 올리고머에 대해서, MS 스펙트럼(MALDI-TOF-MS; Autoflex/Bruker Daltonics사 제조)을 측정하고, 각각 도 3 및 도 4의 MS 스펙트럼을 얻었다.
그 결과, POB-G 모노머를 이용한 경우(도 4)에는, CE-G 모노머를 이용한 경우(도 3)에서는 확인되지 않는 부생성물의 존재가 확인되었다. 이 부생성물의 분자량의 측정값은, 표기 모르폴리노 핵산 올리고머의 기준 피크보다도 106 큰 것으로서, WO2009/064471로 보고되어 있는 p-히드록시벤질 부가체라고 추정되었다.
한편, CE-G 모노머를 이용한 경우, CE기는 β-이탈됨에도 불구하고, 아크릴로니트릴의 부가체는 검출되지 않았기 때문에(도 3), CE-G 모노머는 모르폴리노 핵산 올리고머의 합성에 있어서 우수하다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 (1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염.
    Figure 112013037667838-pct00033

    상기 식에서, R1은 수소 또는 하기 화학식 (2)로 표시되는 기를 나타낸다.
    Figure 112013037667838-pct00034

    [상기 식에서, *는 결합 위치를 나타낸다. R11, R12, R13은 동일하거나 또는 상이하고, 수소, 알킬 또는 알콕시를 나타낸다.]
    R2는 하기 화학식 (3) 또는 화학식 (4)로 표시되는 기를 나타낸다.
    Figure 112013037667838-pct00035

    [상기 식에서, *는 상기와 동일하다. R4는 알킬, 아릴메틸 또는 아릴옥시메틸을 나타낸다.
    R5, R6은 동일하거나 또는 상이하고, 알킬을 나타낸다.]
    R3은 트리알킬실릴 혹은 디페닐알킬실릴로 보호되어 있어도 좋은 수산기 또는 하기 화학식 (5)로 표시되는 기를 나타낸다.
    Figure 112013037667838-pct00036

    [상기 식에서, *는 상기와 동일하다. X는 O 또는 S를 나타낸다.
    Y는 디알킬아미노 또는 알콕시를 나타낸다.
    Z는 할로겐을 나타낸다.]
  2. 제1항에 있어서, X가 O, Y가 디알킬아미노, Z가 염소인 화합물 또는 그의 염.
  3. 제1항에 있어서, R3이 t-부틸디메틸실릴 또는 t-부틸디페닐실릴로 보호되어 있어도 좋은 수산기인 화합물 또는 그의 염.
  4. 제1항에 있어서, R4가 페녹시메틸인 화합물 또는 그의 염.
  5. 제1항에 있어서, R1가 트리틸, 4-메톡시트리틸, 4-메틸트리틸, 4,4'-디메틸트리틸, 4,4'-디메톡시트리틸 또는 4,4',4''-트리메틸트리틸인 화합물 또는 그의 염.
  6. 하기 화합물 (1)∼(3)에서 선택되는 화합물 또는 그의 염:
    (1) N9-[(2R,6S)-6-{(tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸}-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌,
    (2) N9-{(2R,6S)-6-히드록시메틸-4-트리틸모르폴린-2-일}-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌,
    (3) [(2S,6R)-6-{N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌-9-일}-4-트리틸모르폴린-2-일]메틸 디메틸포스포로아미도클로리데이트.
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