CN101784522A - 质子受体亚铵/碳阳离子型偶联剂 - Google Patents

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Abstract

公开了在其亚铵部分中包含质子受体的具有结构式I或II的新型亚铵型偶联剂，它可有益地作为偶联剂用于各种化学多肽和/或多核苷酸合成，和特别可作为产率增加性和外消旋抑制性偶联剂用于肽合成。进一步公开了一种制备这些亚铵型偶联剂的方法及其在制备多肽和/或多核苷酸中的应用。

Description

质子受体亚铵/碳阳离子型偶联剂
本发明的领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及偶联剂和，更尤其，但不唯一地，涉及可有益地用于合成物质如肽和低聚核苷酸的新型偶联剂的制备和用途。
治疗肽，或药物肽在活性药物成分(API)市场，尤其作为，例如，抗生素，荷尔蒙，免疫调节剂，抗血管生成剂，用于治疗CNS和其他神经病学病症的治疗剂，止痛药，抗肥胖药物，和作为用于治疗免疫病症如变态反应，哮喘，血友病，贫血和自身免疫疾病的治疗剂而不断增长[关于概述，参见，Loffet，A.，″作为药物的肽：存在市场吗？，2002，J.PeptideSci.8，1]。根据Frost&Sullivan报道，目前世界上有超过40种上市的肽药物，约270肽种处于临床阶段测试，和约400种处于超前的临床前阶段。肽占所有总API的1％，市场份额估计在US$300-500M/年和年增长速度为15-25％。人们期望，如果最近被认可的新型化学物质进入市场，那么该市场在今后几年会加倍。
尽管肽具有巨大的治疗潜力，但其广泛使用已受到几个限制性技术因素的限制。目前，制造公司面临产生数百千克至数吨量的配合物肽的空前挑战。这种大量生产通常使用昂贵的和复杂的现代技术，使得肽制造与其他″小分子″药物相比困难和成本低效。生物活性形式的肽的大规模制造和纯化可因此是肽-基药物商业化的一个限制性步骤。
肽生产工艺的一个主要步骤是在两种氨基酸之间受控形成肽键(在羧酸基团和胺基团之间形成的酰胺键)(所谓″偶联″反应)。在肽合成中，肽键的形成通常需要合适地处置保护基团，和活化羧酸，或一般来说羧基团，这通常涉及肽偶联剂的使用[关于肽偶联剂的全面概述，参见，F.Albericio，S.A.Kates，固相合成：实际向导，S.A.Kates，F.Albericio Eds；Marcel Dekker，New York，NY，2000，PP.273-328和F.Albericio，R.Chinchilla，DJ.Dodsworth，C.Najera，2001，Org.Prep.Proc.Int.，33，202]。
磷酸盐基团也可按照在肽合成中将羧基团活化用于偶联至氨基团上的类似方式活化。磷酸盐基团的活化是合成用于构建DNA和RNA的各种核酸和低聚核苷酸，以及模拟其化学结构的分子的基本步骤和因此后者的活性可受到各种各样活化或偶联试剂的影响。可用于活化磷酸盐基团的这些活化试剂和反应条件描述于肽合成领域(参见例如，L.Carpino(1997)酶学方法，289：104和WO 2006/063717)，本文对此进行讨论。
尽管用于基础研究的中至大肽的合成是完全确实的步骤，20种自然存在的氨基酸和不断增加的人造氨基酸的组合使得每一肽合成在工业水平上是独特的，时常需要更精细地注意每一氨基酸偶联。在研究尺度上有效的用于偶联剂的某些规则可在工业水平上应用，但结果仍难以预测。
两种主要的偶联技术包括(a)需要现场活化羧酸的那些和(b)取决于已被事先制备，分离，纯化，和表征的活化氨基酸物质的那些。第一种类型迄今最方便地用于肽链的逐步伸展和更常用于会聚性工艺，其中使用被保护的肽替代被保护的氨基酸。
如本文所述，偶联剂的作用是活化一种氨基酸的羧基团，这有助于其与另一氨基酸的氨基团的偶联。活化工艺或许是近年来已最广泛发展的肽合成的一个方面。所有偶联方法的一个基本特点在于，除了提高肽键形成的产率，羧酸组分的构型完整性必须也得到保持，即在任何氨基酸手性中心不应发生外消旋化。
偶联剂要求的这种双重性，即高肽键形成产率和氨基酸外消旋的不存在通常难于实现，因为最有效肽键形成方法通常包括将酸转化成带有良好的离去基团的中间体。这些离去基团往往增加活化氨基酸的α-质子的酸度，这增加去质子化和噁唑酮的形成，两者都导致立体-构型的损失。
外消旋是在制备肽过程中发生的副反应。在生产规模上，少量差向异构体的形成难以检测，而且更重要的是，它使得这些杂质的去除在任何规模上，尤其在工业规模工艺中非常具有挑战性。这构成了用于实现肽作为API′s的最严重缺陷之一。
目前最广泛使用的偶联试剂包括碳二亚胺(一方面)，和鏻和亚铵盐(另一方面)。值得注意的是，可用于肽合成的偶联剂也可用于需要活化羧酸部分的其他有机合成。这些合成可用于产生具有生物重要性的有机化合物，例如，类胨，低聚氨基甲酸酯，低聚酰胺，β-内酰胺，酯，聚烯酰胺，苯并地西泮，二酮哌嗪，和乙内酰脲。
碳二亚胺是目前已知的试剂中最可得到的低价格偶联剂，和包括二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)。原有的反应性物质，O-酰基异脲，用于肽偶联的最反应性物质之一。与使用碳二亚胺作为偶联剂有关的缺点因此大部分源自其高的和相对无法控制的反应性和包括，例如，外消旋，副反应和低产率(由于形成活性较差的N-酰基脲)。另外，尽管低介电常数溶剂如CHCl3或CH2Cl2是用于碳二亚胺最佳的，但有助于形成N-酰基脲的具有较高介电常数的溶剂如DMF的使用排除了其单独使用。另外，二环己基碳二亚胺也与Fmoc/t-Bu固相化学不相容，因为形成在这些合成中形成的脲衍生物通常不溶于常用溶剂。这些脲衍生物也难以在溶液化学中去除。
在70年代初，1-羟基苯并三唑(HOBt)作为DCC的添加剂被提出。加入HOBt的目的是减少与DCC偶联有关的外消旋化。该添加剂的相对成功发出了开始一个时期的信号，在该时期，其他苯并三唑衍生物如1-羟基-6-氯苯并三唑(6-Cl-HOBt)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)被开发初并成功使用。在稍后的年代，苯并三唑衍生物作为DCC和其他碳二亚胺的添加剂的加入变得几乎强制性以保证肽键形成时避免碳二亚胺活化的低产率，非所需副反应和手性损失。
在最近十年中，在本文中被简称为″鎓盐″的羟基苯并三唑衍生物的鏻和亚铵/脲盐作为肽偶联剂的应用被引入。尽管这些试剂已迅速地用于研究目的，仅仅少数已被发现与目前的工业要求和合成策略相容和被工业所采用。与鎓盐反应的物质是氨基/有机酸的羧酸盐。因此，在至少1当量碱的存在下进行偶联反应是使用这些试剂是所必需的。目前最反应性亚铵盐偶联剂是1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶鎓六氟磷酸盐3-氧化物(HATU)。
对这些和其他偶联剂的结构的误解被Carpino，L.A.等人[Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，No.3，p.441]解决，现在认为，这些试剂中的离去基团通过三唑氮而不通过氧在键接至亚铵部分上，保持为其N-氧化物形式。HATU及其类似物的化学结构在以下方案1中给出。
方案1
亚铵盐，如HATU，TBTU，HBTU，HCTU，或TCTU可能是已知的最有效的偶联剂，由离去基团和碳阳离子骨架而形成。但目前已知的肽偶联剂通常受其低所需反应性，由此所形成的副产物和/或高成本的限制。
U.S.专利No.6,825,347和WO 94/07910教导了脲和亚铵盐及其在酰胺形成时，尤其在肽合成过程中影响酰化步骤的用途。这些出版物中教导的偶联剂具有连接到脲和亚铵部分上的离去基团，其特征在于具有N-烷基或P-烷基取代的氮或磷原子。这些偶联剂，尽管是创新的，但仍提供与以前已知的偶联剂类似的偶联效率。
鏻-基偶联剂在工业上正在增加，和包括7-氮杂苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸盐(PyAOP)，和苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。但这些仅或多或少地比其碳阳离子/亚铵对应物更有效和因此通常是不合理地更昂贵的偶联剂。最近，6-氯-1-羟基苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸盐(PyClock)，一种最有效鏻-基偶联剂，由本受让人引入(参见，例如，WO 2007/020620)。
本发明的综述
在找寻新型偶联剂时，本发明人设计，制备和成功地实践了一组比常用偶联剂更有效和更安全，且生产和在现代肽和低聚核苷酸合成技术中使用时简单和安全的新偶联剂。
因此，根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种具有选自以下的通式的偶联剂：
Figure G2008800247628D00051
         结构式I                              结构式II
其中：
A是无机阴离子；
L是离去基团；
n是整数1至4，
每一R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分别独立地连接形成杂脂环族部分，前提是，至少一个R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基和/或至少一个R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6连接形成杂脂环族部分。
根据本发明的一些实施方案，杂原子选自O，S，N，P和B。
根据一些实施方案，杂脂环族部分选自吡咯烷，哌啶，吗啉，硫代吗啉，咪唑烷，氮杂膦烷，氮杂磷烷，氮杂烃基硼烷，氮杂硼烷，氮杂膦烷，氮杂磷烷和哌嗪。例如，杂脂环族部分是吗啉。
根据一些实施方案，无机阴离子选自卤化物，六卤代磷酸盐，六卤代锑酸盐，四卤代硼酸盐，三卤代甲烷磺酸盐和二(三卤代甲基磺酰基)酰亚胺。例如，无机阴离子是六氟磷酸盐。
根据一些实施方案，离去基团选自卤代，乙酸盐，甲苯磺酸盐，三氟甲磺酸盐，磺酸盐，叠氮化物，羟基，硫代羟基，烷氧基，氰酸盐，硫氰酸盐，硝基，氰基，苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亚胺，酮肟，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，咪唑，吲哚啉酮-1-氧基，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
根据一些实施方案，苯并三唑具有通式III：
Figure G2008800247628D00061
结构式III
其中：X是O或S；
Z1和Z2分别独立地是CH或N；和Z3是F，Cl，Br，CF3或NO2。
根据一些实施方案，X是O或S；Z1和Z2分别为CH；和Z3是Cl。优选X是O。
根据一些实施方案，X是O或S；Z1和Z2分别为CH；和Z3是CF3或NO2。例如，X是O；和Z3是CF3或NO2。
根据一些实施方案，苯并三嗪酮具有通式IV：
Figure G2008800247628D00062
结构式IV
其中X是O或S。
根据一些实施方案，琥珀酰亚胺具有通式V：
Figure G2008800247628D00071
结构式V
其中X是O或S。
根据一些实施方案，酮肟具有通式VI：
Figure G2008800247628D00072
结构式VI
其中：
Z4和Z5分别独立地选自F，Cl，Br，CORa，COORa，CONRa，CN，CF3或NO2；和Ra是烷基。
根据一些实施方案，Z4是COORa；Ra是乙基；和Z5是CN。
根据其他实施方案，Z4和Z5都是COORa，其中Ra是乙基。
根据其他实施方案，Z4和Z5都是CN。
根据进一步其他实施方案，Z4和Z5分别独立地是COORa或CN和Ra是乙基或甲基。
根据一些实施方案，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基具有通式VII：
Figure G2008800247628D00073
结构式VII
根据一些实施方案，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基具有通式VIII：
Figure G2008800247628D00081
结构式VIII
其中Z6和Z7分别独立地选自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
根据一些实施方案中的其他特征，Z6是CH3；和Z7是Cl。
根据一些实施方案，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基具有通式IX：
Figure G2008800247628D00082
结构式IX
其中Z1是CH或N，和Z8和Z9分别独立地选自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
根据一些实施方案Z1是CH，Z8是苯基，和Z9是H或Cl。
根据其他实施方案，Z1是N，Z8是甲基和Z9是H。
根据一些实施方案，吲哚啉酮-1-氧基具有通式X：
Figure G2008800247628D00083
结构式X
其中Z10选自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
根据本发明的一些实施方案，提供了选自以下的偶联剂：
Figure G2008800247628D00091
根据本发明的一些实施方案，提供了一种制备本文所述偶联剂的方法，该方法包括：将具有以下通式的化合物：
Figure G2008800247628D00111
    结构式XI                          结构式XII
其中每一R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分别独立地连接形成杂脂环族部分，前提是，至少一个R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基和/或至少一个R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6连接形成杂脂环族部分；和n是整数1至4；与：
(i)卤化剂；和
(ii)无机阴离子的饱和水溶液接触；这样得到本文所给出的偶联剂，其中L是卤代。
根据一些实施方案，该方法进一步包括，在接触之前：将具有通式XIII的化合物：
Figure G2008800247628D00112
结构式XIII
其中每一R1和R2独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R1和R2连接形成杂脂环族部分；与具有通式XIV的化合物：
Figure G2008800247628D00113
结构式XIV
其中每一R3和R4独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R3和R4连接形成杂脂环族部分；在碱的存在下反应，这样得到具有通式XI的化合物；
或与具有通式XV的化合物：
Figure G2008800247628D00121
结构式XV
其中：
每一R3，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R5和R6连接形成杂脂环族部分；n是整数1至4；在碱的存在下反应，这样得到具有通式XII的化合物。
根据一些实施方案，该方法进一步包括将偶联剂(其中L是卤代)与离去基团的前体化合物在三乙胺的存在下反应。
根据一些实施方案，离去基团选自乙酸盐，甲苯磺酸盐，三氟甲磺酸盐，磺酸盐，叠氮化物，羟基，硫代羟基，烷氧基，氰酸盐，硫氰酸盐，硝基，氰基，苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亚胺，酮肟，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种合成肽的方法，该方法将多个氨基酸顺序地，一个接一个地，在本文所给出的偶联剂的存在下偶联，这样得到包含所述多个氨基酸的肽。根据一些实施方案，每个偶联步骤的外消旋化比率是8％至0.3％。
根据一些实施方案，每个偶联步骤的偶联产率是80％至99％。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种合成多核苷酸的方法，该方法将多个核苷酸顺序地，一个接一个地，在本文所给出的偶联剂的存在下偶联，这样得到包含所述多个核苷酸的多核苷酸。
根据一些实施方案，肽或多核苷酸的合成通过固相合成而进行。根据一些实施方案，肽或多核苷酸的合成通过溶液相合成而进行。
根据本发明的一些实施方案，提供了肽的一种粗组合物，所述肽在C-末端至N-末端方向上由多个氨基酸合成，所述组合物由基本上具有所需氨基酸顺序的肽和具有非所需氨基酸顺序且相对该具有所需氨基酸顺序的肽为杂质的多个肽组成，其中具有所需氨基酸顺序的肽在组合物中的浓度比具有所需氨基酸顺序的相同肽在下述肽的组合物中的浓度高至少5％：所述肽在C-末端至N-末端方向上使用本文所给出的偶联剂作为偶联剂，在相同条件下制备。
根据一些实施方案，所述肽的粗组合物的形式选自粉状组合物，冻干组合物，键接至固体载体上的组合物，增溶组合物和溶解组合物。
根据一些实施方案，至少一种氨基酸选自具有仲α胺的氨基酸，具有叔α胺的氨基酸，具有取代的α碳原子的氨基酸，具有取代的α胺的氨基酸，具有含氨基的侧链的氨基酸，和其任何组合。
根据一些实施方案，α碳被烷基取代。
根据一些实施方案，具有取代的α碳原子的氨基酸是α-氨基异丁酸(Aib)。
根据一些实施方案，具有取代的α胺的氨基酸是苯基甘氨酸(Phg)。
根据一些实施方案，具有含氨基的侧链的氨基酸是精氨酸。
根据一些实施方案，肽或多核苷酸的合成通过固相合成而进行。
根据一些实施方案，肽或多核苷酸的合成通过溶液相合成而进行。
单数形式的″一个″，和″该″包括多个指示物，除非另外明确地表示。例如，术语″蛋白质″或″至少一种蛋白质″可包括多种蛋白质，包括其混合物。
在本公开内容中，本发明的各方面可以范围形式给出。应该理解，范围格式的描述仅为了方便和简洁而不应理解为对本发明范围的僵硬的限制。因此，对范围的描述应该被理解为已具体地公开了所有可能子范围以及在该范围内的各个数值。例如，对范围如1至6的描述应该被认为已具体地公开了子范围如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6，等，以及在该范围内的各个数，例如，1，2，3，4，5，和6。其适用性与范围的宽度无关。
只要在本文中提出数值范围，它意味着包括在所述范围内的任何所引用的数字(分数或整数)。词语″在第一表示数和第二表示数之间的范围″和″从第一表示数至第二表示数的范围″在本文中可互换使用且意味着包括第一和第二表示数和在其之间的所有分数和整数。
这里所用的术语″包含″是指，可以加入对最终结果没有影响的其他步骤和成分。该术语包括术语″组成为”和″基本上组成为”。
术语″方法″或″工艺″是指用于实现给定任务的方式，措施，技术和步骤，包括，但不限于，化学，药物，生物，生物化学和医学领域的从业人员已知的，或容易从已知的方式，是指，技术和步骤开发出的那么方式，措施，技术和步骤。
本文使用以下简称：
BOP代表苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐；
Cl-HOBt代表6-氯-1-羟基苯并三唑；
DCC代表N，N′-二环己基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺；
DIBOC代表二碳酸二t-丁基酯；
DIEA代表N，N-二异丙基乙胺；
DIC，DIP或DIPCDI代表N，N′-二异丙基碳二亚胺或1，3-二异丙基碳二亚胺；
DMAP代表4-二甲基氨基吡啶；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺；
EDC代表1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；
EDCHCl代表1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二盐酸盐亚胺；
Fmoc代表9-芴基甲氧基羰基；
HATU代表2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐或1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶鎓六氟磷酸盐3-氧化物；
HBTU代表2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐或1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-1H-苯并三唑鎓六氟磷酸盐3-氧化物；
HCTU，N-[(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐
HMPyOP代表1-(吗啉代(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐
HDMOCC代表1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐
HDMODC代表1-[(1-(二氰基亚甲基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐
HDMODeC代表1-[(1，3-二乙氧基-1，3-二氧代丙烷-2-叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐
HDMOPC代表N-[(氰基(吡啶-2-基)亚甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亚甲基)-N-吗啉代甲酰胺鎓六氟磷酸盐
HOAt代表1-羟基-7-氮杂苯并三唑；
HOBt代表1-羟基苯并三唑；
HPTU代表N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑并-[4.5-beta]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸盐；
PyAOP代表7-氮杂苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸盐；
PyBOP代表苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸盐；
TBTU代表N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亚甲基]-N-甲基甲酰胺鎓四氟硼酸盐N-氧化物或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐；
TCTU代表N-[(1H-6-氯苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亚甲基]-N-甲基甲酰胺鎓四氟硼酸盐N-氧化物；
TFA代表三氟乙酸；
TFFH代表氟-N，N，N-，N″-四甲基形式脒鎓六氟磷酸盐；
TCP代表2，4，6-三甲基吡啶(可力丁)；和
TNBSA代表三硝基苯磺酸。
除非另有定义，本文所用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述类似或相当的方法和材料可用于实施或测试本发明实施方案，但以下描述示例性方法和/或材料。在矛盾时，本专利说明书，包括定义，占优。另外，这些材料，方法，和实施例仅是说明性的和无意于进行必然性限定。
附图的简要描述
本发明的一些实施方案，例如仅参照附图描述。现在详细地具体参考附图，但要强调指出，所示的细节是举例性的和用于对本发明实施方案的说明性讨论。在这方面，结合附图的描述使得本领域熟练技术人员显然看出如何可实施本发明的实施方案。
在附图中：
图1给出根据本发明的示例性肽-偶联剂，1-((二甲基亚氨基)(吗啉代)甲基)3-H-苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇盐六氟磷酸盐(HDMB)的X-射线晶体结构，显示该偶联剂是其N-形式，其中苯并三唑部分直接通过一个三唑氮原子而不通过氧原子连接到亚铵部分上；和
图2给出使用根据本实施方案的示例性肽-偶联剂制备的五肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2所得的HPLC色谱图，HDMB，显示所得最终产物具有优异的产物纯度。
优选实施方案的详细描述
本发明在其一些实施方案中涉及在碳阳离子部分中包含质子受体的新型亚铵型偶联剂，它可在各种化学合成中有益地用作偶联剂和尤其作为偶联剂用于肽和低聚核苷酸合成。本发明在其一些实施方案中进一步涉及一种制备这些偶联剂的方法和采用该方法制备的肽和低聚核苷酸。
本发明的原理和操作可参照附图和附图描述而较好地理解。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，本发明要被理解为在其申请不是必然地被限定至以下说明所给出或实施例所例举的细节。本发明能够以各种方式实施或进行其他实施方案。另外要理解，本文所用的词语和术语用于说明和不应理解为限定。
如上所详细讨论，肽-偶联剂是药物肽工业中最有效工具。现代肽-偶联剂基于其在正形成的肽的羧基端形成短暂活化羧基体的能力，同时避免由于其离去基团部分的作用而产生其外消旋化。尽管近年在偶联剂发展领域的研究集中于识别最佳离去基团，对碳阳离子/亚铵部分的性质较少关注。
如上所进一步讨论，用于肽合成的偶联剂通常也有效地在低聚核苷酸合成中用作偶联剂。目前已知的低聚核苷酸偶联试剂，如1，1-二氧化物-3H-1，2-苯并二硫代-3-酮(Beaucage试剂)，2-氰基乙基四异丙基磷odiamidite(CAS No.102691-36-1)，4，5-二氰基咪唑(DCI)，4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl)，N，N-二乙基氨基磷酸二叔丁基酯(CASNo.117924-33-1)，N，N-二异丙基氨基磷酸二叔丁基酯CASNo.137348-86-8)，4-甲氧基三苯甲基氯CAS No.14470-28-1)和苯基乙酰基二硫化物(PADS)，通常用于活化一个核苷酸的端磷酸盐基团使得与另一核苷酸的糖部分反应。因此，类似于肽合成中的羧基团的活化，磷酸盐可使用相同种类的肽偶联剂活化。
在找寻更有效偶联剂的过程中，本发明人已意外地发现，将质子受体基团引入脲型偶联剂的亚铵/碳阳离子部分，可明显改进所述试剂，在偶联效率和外消旋抑制方面的性能。所加的质子受体基团似乎有助于以较低的转变能活化羧基中间体，基本上降低氨基酸外消旋的比率，同时增加偶联反应动力学。
不愿局限于任何特殊理论，碱性点(质子受体)在亚铵/碳阳离子部分中的存在被假设可有助于羧酸的去质子化和离去基团的配合物酸的中和，在与目前可得偶联试剂相比时增加偶联产率和减少外消旋。另外，质子受体被假设在与目前可得偶联试剂相比时可有助于增加偶联剂在常用于肽化学的溶剂中的溶解度。
如上所讨论，肽偶联剂普遍还在核苷酸以及其衍生物和类似物的偶联中有效。因此本文提出，在本发明的上下文中，对肽偶联剂的偶联能力的任何提及还包括其在核苷酸，以及其衍生物和类似物的偶联中活化磷酸盐基团的能力。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种具有选自以下的通式的偶联剂：
        结构式I                              结构式II
其中：
A是无机阴离子；
L是离去基团；
n是整数1至4，
每一R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分别独立地连接形成杂脂环族部分，
其中：至少一个R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一个杂原子中断，封端和/取代的具有1-4个碳原子的烷基和/或至少一个R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6连接形成杂脂环族部分。
本文所用的术语″杂原子″是指可用作质子受体的非碳和非氢原子。杂原子可因此是，作为非限定性例子，氮(N)，氧(O)，硫(S)，磷(P)，硼(B)和硒(Se)。例如，杂原子是O，S，N，P或B，和另外，杂原子是O，S或N。
本文所用的词语″质子受体″是指可在偶联反应常用的pH范围内被质子化的杂原子，其形式从形式-
Figure G2008800247628D00181
-变化成形式-AH+-，其中--是在被质子化之前的杂原子和-AH+-是其质子化形式。一般来说，质子接受性杂原子具有至少一对非共有化合价电子，可在道质子(H+)和因此被称作质子受体。
本文所用的词语″被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的烷基″描述本文所述的一种烷基，它在烷基烃链内的一个或多个位置上，在烷基烃链的末端和/或作为烷基中的一个碳原子的取代基包含杂原子。被杂原子中断的烷基的例子包括，但不限于，醚如甲氧基甲基，硫醚如3-硫代丁烷，胺如二乙胺和膦如三乙基膦；被杂原子取代的烷基的例子包括，但不限于，醇(用羟基团取代的烷基)如异丙醇，胺如2-氨基丁烷，和硫醇(用硫代羟基团取代的烷基)如丁烷-3-硫醇；被杂原子封端的烷基是其中烷基烃主链被杂原子在端碳上取代的特殊情形。
根据一些实施方案，在至少一对N-取代基，即，R1和R2对，R3和R4对，和R5和R6对中，取代基连接形成杂脂环族部分。因此，双取代的胺的氮原子和连接其上的取代基形成包含至少两个杂原子的杂脂环族环。
杂脂环族部分因此至少包含带有R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6个取代基的氮原子和进一步包含本文所定义的另一杂原子。示例性杂原子包括，但不限于，氧，硫或氮。
杂脂环族部分的例子包括，但不限于，吗啉，硫代吗啉，噁唑烷，咪唑烷，1，4-氮杂膦烷(如4-甲基-1，4-氮杂膦烷)，氮杂磷烷，氮杂烃基硼烷(如4-甲基-1，4-氮杂烃基硼烷)，氮杂硼烷(如2-甲基-1，2-氮杂硼烷)和哌嗪(如，4-甲基哌嗪)。例如，R1和R2可分别是乙基，通过氧原子连接在一起，与它们所连接的氮一起形成吗啉部分，如以下方案2所示。
方案2
Figure G2008800247628D00191
如果这些R1和R2通过硫原子连接在一起，那么形成硫代吗啉部分。如果这些R1和R2通过氮原子连接在一起，那么形成哌嗪部分。
类似地，如果R1是乙基和R2是甲基，通过氮原子连接在一起，那么与它们所连接的氮一起形成咪唑烷。如果R1是β-甲基硼乙烷和R2是乙基，通过硼原子连接在一起，那么与它们所连接的氮一起形成4-甲基-1，4-氮杂烃基硼烷，诸如此类。
这些实施方案也可适用于R3和R4，和R5和R6。
本文所用的词语″部分″描述通常具有某些官能度或有区别的特点的化学体或化合物的一部分。
本文所用的术语″胺″描述一种-NR′R″基团，其中R′和R″分别独立地是氢，烷基，环烷基，杂脂环族，芳基或杂芳基，这些术语如本文所定义。
本文所用的术语″烷基″描述脂族烃，包括直链和支化链基团。例如，烷基团具有1至20个碳原子或1-10个碳原子。只要在本文中描述数字范围；如，″1-10-，这意味着，该基团(在这种情况下，烷基团)可包含1个碳原子，2个碳原子，3个碳原子，等，最高和包括10个碳原子。烷基可以是取代的或未取代的。如果取代，取代基可以是，例如，烷基，链烯基，炔基，环烷基，芳基，杂芳基，卤化物，羟基，烷氧基和羟基烷基，其中这些术语在下文定义。本文所用的术语″烷基″还包括饱和或不饱和烃，因此该术语进一步包括链烯基和炔基。
术语″链烯基″描述本文所定义的具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和烷基。链烯基可被一个或多个在上文描述的取代基取代或未取代。
本文所定义的术语″炔基″是具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键的不饱和烷基。炔基可被一个或多个在上文描述的取代基取代或未取代。
术语″芳基″描述具有完全共轭的pi-电子体系的全碳单环或稠环多环(即，共有相邻碳原子对的环)基团。芳基团可被一个或多个在上文描述的取代基取代或未取代。
术语″杂芳基″描述在环中具有一个或多个原子，如，例如，氮，氧和硫和，另外，具有完全共轭的pi-电子体系的单环或稠环(即，共有相邻原子对的环)基团。杂芳基团的例子包括，但不限于吡咯，呋喃，噻吩，咪唑，噁唑，噻唑，吡唑，吡啶，嘧啶，喹啉，异喹啉和嘌呤。杂芳基团可被一个或多个在上文描述的取代基取代或未取代。代表性例子是噻二唑，吡啶，吡咯，噁唑，吲哚，嘌呤和类似物。
本文所用的术语″杂脂环族″描述在环中具有一个或多个原子如氮，氧和硫的单环状或稠环基团。环也可具有一个或多个双键。但环不具有完全共轭的pi-电子体系。杂脂环族可以是取代的或未取代的。取代的杂脂环族可具有一个或多个取代基，其中每一取代基团可独立地是，例如，烷基环烷基，链烯基，炔基，芳基，杂芳基和杂脂环族。代表性例子是吗啉，哌啶，哌嗪，四氢呋喃，四氢吡喃和类似物。
本文所用的术语″膦″描述一种-PR′R″R′″基团，其中R′，R″和R′″分别独立地是氢，烷基，环烷基，杂脂环族，芳基或杂芳基，这些术语如本文所定义。
术语″羟基″和″硫代羟基″相应地是指-OH和-SH基团。
示例性无机阴离子包括，但不限于，卤化物，六卤代磷酸盐，六卤代锑酸盐，四卤代硼酸盐，三卤代甲烷磺酸盐和二(三卤代甲基磺酰基)酰亚胺。
本文所用的术语″卤化物″是指卤代原子的阴离子，即F-，Cl-，Br-和I-。
术语″卤代″是指F，Cl，Br和I原子。
术语″六卤代磷酸盐″是指无机阴离子PX6 -，其中X是卤代。示例性六卤代磷酸盐是六氟磷酸盐或PF6 -，它是根据本实施方案的示例性无机阴离子。
术语″六卤代锑酸盐″是指无机阴离子SbX6 -，其中X是卤代。
术语″四卤代硼酸盐″是指无机阴离子BX4 -，其中X是卤代。
术语″三卤代甲烷磺酸盐″是指无机阴离子CX3SO3 -，其中X是卤代。
术语″二(三卤代甲基磺酰基)酰亚胺″是指无机阴离子N(SO2CX3)2 -，其中X是卤代。
如本文所讨论，在结构式I和II中表示为L的离去基团的类型和特征在作为偶联剂的化合物的有效性方面，以及在其安全性方面起着重要的作用。
本文所用的词语″离去基团″描述在化学反应过程中容易从有机分子上脱离的不安定原子，基团或化学部分，同时该脱离因此由离去原子，基团或部分的相对稳定性而辅助。通常，强酸的共轭碱的任何基团可用作离去基团。根据本实施方案的合适的离去基团的代表性实施例因此包括，但不限于，卤化物，乙酸盐，甲苯磺酸盐，三氟甲磺酸盐，磺酸盐，叠氮化物，羟基，硫代羟基，烷氧基，氰酸盐，硫氰酸盐，硝基和氰基。
术语″乙酸盐″是指乙酸阴离子。
术语″甲苯磺酸盐″是指甲苯-4-磺酸阴离子。
术语″三氟甲磺酸盐″是指三氟甲烷磺酸阴离子。
术语″磺酸盐″是指磺酸阴离子。
术语″叠氮化物″是指N3 -。
术语″羟基″和″硫代羟基″分别是指OH-和SH-阴离子。
术语″烷氧基″是指R′-O-阴离子，其中R′定义如上。
术语″氰酸盐″和″硫氰酸盐″分别是指[O＝C＝N]-和[S＝C＝N]-阴离子。
术语″硝基″是指NO2 -。
术语″氰基″是指[C≡N]-。
根据一些实施方案，离去基团选自苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亚胺，酮肟，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，咪唑，吲哚啉酮-1-氧基，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
根据一些实施方案，苯并三唑具有通式III：
结构式III
其中：
X是O或S；
Z1和Z2分别独立地是CH或N；和
Z3是F，Cl，Br，CF3或NO2。
一种示例性苯并三唑是其中X是O或S；Z1和Z2分别为CH；和Z3是Cl的那种，导致离去基团具有以下结构式：
Figure G2008800247628D00221
其中X是O，和离去基团是：
Figure G2008800247628D00222
另一示例性苯并三唑是其中X是O或S；Z1和Z2分别为CH；和Z3是CF3或NO2的那种。例如X是O；和Z3是CF3或NO2，和另外Z3是CF3，得到离去基团：
Figure G2008800247628D00223
根据其他实施方案，苯并三嗪酮具有通式IV：
Figure G2008800247628D00231
其中X是O或S，或X是O。
本发明人还认为需要一种使用安全且有效的偶联剂。包含三氮杂部分的物质要被确认是可能爆炸性的。最新报道[Wehourstedt等人，JHazard.Mat.A 126(2005)1]已经确认，HOBt衍生物在某些条件下具有爆炸性能，一般来说大概由于1-羟基-苯并三唑和苯并三唑衍生物的爆炸性能。类似地，基于其他含三氮杂的基团(如，三嗪，三唑)的偶联剂与可爆性有关。
为此，本发明人已经开发出几个系列的基于不太危害的离去基团，如琥珀酰亚胺-，酮肟-，吡啶-，喹唑啉-，咪唑-和吲哚啉酮-基离去基团的偶联剂。这些偶联剂因为其制备，储存，传输和使用方面安全而高度有利。
因此，根据一些实施方案，琥珀酰亚胺型离去基团具有通式V：
Figure G2008800247628D00232
结构式V
其中X是O或S，或X是O。
根据一些实施方案中的其他特点，酮肟具有通式VI：
结构式VI
其中：Z4和Z5可分别独立地是F，Cl，Br，CORa，COORa，CONRa，CN，CF3或NO2中的任何一种；其中Ra是氢或烷基。
例如，Z4是COORa；Ra是乙基；和Z5是CN，得到离去基团：
Figure G2008800247628D00241
另外，Z4和Z5都是COORa，其中Ra是乙基，得到离去基团：
Figure G2008800247628D00242
另外，Z4和Z5都是CN，得到离去基团：
Figure G2008800247628D00243
根据一些实施方案中的其他特点，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基具有通式VII：
Figure G2008800247628D00244
结构式VII
根据一些实施方案中的其他特点，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基具有通式VIII：
结构式VIII
其中：
Z6和Z7可分别独立地是H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基中的任何一种。例如，Z6是CH3；和Z7是Cl。
根据一些实施方案，苯并[d]咪唑-1-氧基具有通式IX：
Figure G2008800247628D00252
结构式IX
其中：
Z8和Z9可分别独立地是H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基中的任何一种。
例如，Z1是CH，Z8是苯基；和Z9是Cl。
另外，Z1是N，Z8是甲基；和Z9是H。
根据一些实施方案，吲哚啉酮-1-氧基具有通式X：
Figure G2008800247628D00253
结构式X
其中：
Z10可以是H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基中的任何一种。
根据本发明的另一方面，提供了一种制备本文所给出的偶联剂的方法，该方法包括：将具有选自以下的通式的在本文中也称作脲衍生物的化合物：
Figure G2008800247628D00261
     结构式XI              结构式XII
其中：
每一R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分别独立地连接形成杂脂环族部分，和
其中：
至少一个R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基和/或至少一个R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6连接形成杂脂环族部分；与：(i)卤化剂；和(ii)以上所给出的无机阴离子的饱和水溶液接触，这样得到本文所给出的偶联剂，其中L是卤代。
第一步骤(i)使用能够卤化脲衍生物和将羰基替代为卤素的卤化剂。
本实施方案中所用的词语″卤化剂″因此是指用于引入卤代取代基以替代羰基的试剂。
示例性卤化剂包括草酰卤，光气如COCl2，亚硫酰卤(SOX2)如亚硫酰氯和磷氧基卤化物(POX3)如磷酰氯(POCl3)。根据本实施方案的示例性卤化剂是草酰卤。
本文所用的词语″草酰卤″是指卤化剂(COX)2或X(C＝O)(C＝O)X，其中X是卤代。例如，所用的草酰卤是草酰氯。亚硫酰卤(X2S＝O，其中X是卤代)，如亚硫酰氯也可用于进行相同转化。
使用包含选择无机阴离子的饱和水溶液的第二步骤(ii)提供具有亚铵/碳鎓阳离子和所选无机阴离子的盐形式的偶联剂，其中离去基团是从草酰卤得到的卤素。
本文所用的术语″亚铵″描述＝N+R′R″基团，其中R′和R″如本文所定义。
这里所用的词语″亚铵/碳鎓阳离子″描述-{C(NR′R″)(NRmR″″)}+基团，其中R′，R″和R′″如本文所定义，和R″″定义如R′。
应该注意，进行步骤(i)和(ii)的顺序可反转或，视需要，步骤(i)和(ii)可同时进行。
具有通式XI或XII的脲衍生物通过将具有通式XIII的化合物：
Figure G2008800247628D00271
结构式XIII
其中每一R1和R2独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R1和R2连接形成杂脂环族部分；与具有通式XIV的化合物：
Figure G2008800247628D00272
结构式XIV
其中每一R3和R4独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R3和R4连接形成杂脂环族部分；在碱的存在下接触而得到，这样得到具有通式XI的化合物；或
与具有通式XV的化合物：
Figure G2008800247628D00281
结构式XV
其中每一R3，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R5和R6连接形成杂脂环族部分；和n是整数1至4；在碱的存在下接触而得到，这样得到具有通式XII的化合物。
碱可以是有机碱，如三乙胺，或无机碱如NaOH。
一旦制备出具有卤代离去基团的碱性偶联剂，该离去基团可被替换为在上文所给出的各种离去基团。
该步骤通过将碱性偶联剂(其中L是卤代)与具有所选离去基团的前体化合物在碱如，例如，三乙胺的存在下反应而进行。
本文所用的词语″离去基团的前体化合物″是指作为离去基团的共轭酸的化合物，通常酸。例如，乙酸是离去基团乙酸盐的前体化合物，甲苯-4-磺酸是离去基团最甲苯磺酸盐的前体化合物，三氟甲烷磺酸是离去基团三氟甲磺酸盐的前体化合物，等等。
另外例如，如果所选的离去基团是苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇盐，那么该离去基团的前体化合物是1-羟基苯并三唑，还称作HOBt。如果所选离去基团是6-氯-苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇盐，那么该离去基团的前体化合物是6-Cl-HOBt。
如果所选离去基团是[1，2，3]三唑[4，5-b]吡啶-1-3-醇盐，那么该离去基团的前体化合物是1-羟基-7-氮杂苯并三唑。
如果所选离去基团是[1，2，3]三唑[2，3-b]吡啶-1-鎓-3-醇盐，那么该离去基团的前体化合物是4-HOAt。
如果所选离去基团是吡咯烷-2，5-二酮，那么该离去基团的前体化合物是1-羟基吡咯烷-2，5-二酮。类似地，五氟苯酚是离去基团氧基五氟苯基的前体化合物。
如果所选离去基团是2-(氧基亚氨基化物)丙二腈，那么该离去基团的前体化合物是2-(羟基亚氨基化物)丙二腈，在本文中也称作KONDC。
如果所选离去基团是吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，那么该离去基团的前体化合物是N-羟基吡啶-2(1H)-酮。
如果所选离去基团是3-氧基-2-甲基喹唑啉-4(3H)-酮，那么该离去基团的前体化合物是3-羟基-2-甲基喹唑啉-4(3H)-酮，在本文中也称作HOMQ。
如果所选离去基团是6-氯-2-苯基-1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，那么该离去基团的前体化合物是6-氯-2-苯基-1H-苯并[d]咪唑-1-醇，在本文中也称作6-Cl-HOPBI。
如果所选离去基团是2-甲基-3H-咪唑[4，5-b]吡啶-3-氧基，那么该离去基团的前体化合物是2-甲基-3H-咪唑[4，5-b]吡啶-3-醇，在本文中也称作HOMPI，和等等。
如以下实施例章节中所述，基于在本文所给出的杂脂环族部分取代的亚铵/碳鎓部分的偶联剂要被制备并成功地用于肽合成。
根据本发明一些实施方案的示例性偶联剂在下表1中给出。
表1
Figure G2008800247628D00291
Figure G2008800247628D00301
Figure G2008800247628D00311
Figure G2008800247628D00331
Figure G2008800247628D00341
表1(继续)
如上所讨论，偶联剂根据在肽合成中重要的几个标准分级，这些标准是：肽键形成中的大体产率和在具有特殊空间偶联位阻的氨基酸之间的肽键形成的产率，和偶联剂在其上施加活性的活化氨基酸的外消旋比率。
本文所用的术语″肽″包括包含一个接一个地通过肽键或其变型连接的多个氨基酸残基的生物分子。肽包括至少2个氨基酸残基和最高200个氨基酸残基和甚至更多。本文所用的该术语还包括多肽，肽模拟物，以及是肽类似物的类胨和半类胨，可具有，例如，使得肽更稳定，同时整体上更能够渗入细胞的变型。这里所用的词语″氨基酸残基″描述构成肽一部分，即，是偶联至至少一个另一氨基酸残基上的氨基酸的残基。
正如本领域所完全认可，本文所用的术语″残基″是指已经历化学反应和现共价键接至另一分子体上的分子体的部分，和通常主要部分，如分子或分子的一部分如基团。例如，分子体可以是氨基酸分子，和在形成肽链之后构成肽链一部分的氨基酸的部分是氨基酸残基。氨基酸残基因此是在，例如，其α-胺基团与肽序列中的相邻氨基酸的羧酸基团反应形成肽酰胺键和/或其α-羧酸基团与肽序列中的相邻氨基酸的α-胺基团反应形成肽酰胺键时，存在于肽序列中的那部分氨基酸。本文在涉及氨基酸时所用的术语″侧链″是指连接到氨基酸的α-碳原子上的化学基团。侧链对每种类型的氨基酸是独特的且不参与形成用于连接多肽中的氨基酸的肽键。例如，甘氨酸的侧链是氢，丙氨酸的侧链是甲基，缬氨酸的侧链是异丙基和蛋氨酸的侧链是甲基磺胺基-乙基。对于所有氨基酸的特定侧链，参考A.L.Lehninger的生物化学(参见，第4章)。
本文在说明书和在以下权利要求章节中所用的术语″氨基酸″或″多个氨基酸″要被理解为包括20种自然存在的氨基酸；通常在体内翻译后改性的那些氨基酸，包括，例如，羟基脯氨酸，磷丝氨酸和磷苏氨酸；和其他未常规的氨基酸，包括，但不限于，2-氨基己二酸，羟基赖氨酸，异锁链素，正缬氨酸，正亮氨酸和鸟氨酸。另外，术语″氨基酸″包括D-和L-氨基酸两者。
本文用于氨基酸的简称和肽的名称遵循IUPAC-IUB生物化学命名委员会的规则，J.Biol.Chem.1972，247，977-983。
下表2和3列出了可用于本发明的自然存在的氨基酸(表2)和非常规，改性的和未天然氨基酸(表3)。
表2
  氨基酸   三字母简称   单字母符号
  丙氨酸   Ala   A
  精氨酸   Arg   R
  天冬酰胺   Asn   N
  天门冬氨酸   Asp   D
  半胱氨酸   Cys   C
  谷酰胺   Gin   Q
  谷氨酸   Glu   E
  甘氨酸   Gly   G
  组氨酸   His   H
  异亮氨酸   lie   I
  亮氨酸   Leu   L
  赖氨酸   Lys   K
  甲硫氨酸   Met   M
  苯基丙氨酸   Phe   F
  脯氨酸   Pro   P
  丝氨酸   Ser   S
  苏氨酸   Thr   T
  色氨酸   Trp   W
  酪氨酸   Tyr   Y
  缬氨酸   Val   V
  氨基酸   三字母简称   单字母符号
  如上的任何氨基酸   Xaa   X
表3
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  α-氨基丁酸   Abu   L-N-甲基丙氨酸   Nmala
  α-氨基-α-甲基丁酸盐   Mgabu   L-N-甲基精氨酸   Nmarg
  氨基环丙烷-   Cpro   L-N-甲基天冬酰胺   Nmasn
  羧酸盐   L-N-甲基天门冬氨酸   Nmasp
  氨基异丁酸   Aib   L-N-甲基半胱氨酸   Nmcys
  氨基降冰片基-   Norb   L-N-甲基谷酰胺   Nmgin
  羧酸盐   L-N-甲基谷氨酸   Nmglu
  环己基丙氨酸   Chexa   L-N-甲基组氨酸   Nmhis
  环戊基丙氨酸   Cpen   L-N-甲基异亮氨酸   Nmile
  D-丙氨酸   Dal   L-N-甲基亮氨酸   Nmleu
  D-精氨酸   Darg   L-N-甲基赖氨酸   Nmlys
  D-天门冬氨酸   Dasp   L-N-甲基甲硫氨酸   Nmmet
  D-半胱氨酸   Dcys   L-N-甲基正亮氨酸   Nmnle
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  D-谷酰胺   Dgln   L-N-甲基戊氨酸   Nmnva
  D-谷氨酸   Dglu   L-N-甲基鸟氨酸   Nmorn
  D-组氨酸   Dhis   L-N-甲基苯基丙氨酸   Nmphe
  D-异亮氨酸   Dile   L-N-甲基脯氨酸   Nmpro
  D-亮氨酸   Dleu   L-N-甲基丝氨酸   Nmser
  D-赖氨酸   Dlys   L-N-甲基苏氨酸   Nmthr
  D-蛋氨酸   Dmet   L-N-甲基色氨酸   Nmtrp
  D-鸟氨酸   Dorn   L-N-甲基酪氨酸   Nmtyr
  D-苯基丙氨酸   Dphe   L-N-甲基缬氨酸   Nmval
  D-脯氨酸   Dpro   L-N-甲基乙基甘氨酸   Nmetg
  D-丝氨酸   Dser   L-N-甲基-t-丁基甘氨酸   Nmtbug
  D-苏氨酸   Dthr   L-正亮氨酸   Nle
  D-色氨酸   Dtrp   L-戊氨酸   Nva
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  D-酪氨酸   Dtyr   α-甲基-氨基异丁酸盐   Maib
  D-缬氨酸   Dval   α-甲基-γ-氨基丁酸盐   Mgabu
  D-α-甲基丙氨酸   Dmala   α-甲基环己基丙氨酸   Mchexa
  D-α-甲基精氨酸   Dmarg   α-甲基环戊基丙氨酸   Mcpen
  D-α-甲基天冬酰胺   Dmasn   α-甲基-α-萘基丙氨酸   Manap
  D-α-甲基门冬氨酸盐   Dmasp   α-甲基青霉胺   Mpen
  D-α-甲基半胱氨酸   Dmcys   N-(4-氨基丁基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基谷酰胺   Dmgln   N-(2-氨基乙基)甘氨酸   Naeg
  D-α-甲基组氨酸   Dmhis   N-(3-氨基丙基)甘氨酸   Norn
  D-α-甲基异亮氨酸   Dmile   N-氨基-α-甲基丁酸盐   Nmaabu
  D-α-甲基亮氨酸   Dmleu   α-萘基丙氨酸   Anap
  D-α-甲基赖氨酸   Dmlys   N-苄基甘氨酸   Nphe
  D-α-甲基甲硫氨酸   Dmmet   N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸   Ngln
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  D-α-甲基鸟氨酸   Dmom   N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸   Nasn
  D-α-甲基苯基丙氨酸   Dmphe   N-(2-羧基乙基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基脯氨酸   Dmpro   N-(羧基甲基)甘氨酸   Nasp
  D-α-甲基丝氨酸   Dmser   N-环丁基甘氨酸   Ncbut
  D-α-甲基苏氨酸   Dmthr   N-环庚基甘氨酸   Nchep
  D-α-甲基色氨酸   Dmtrp   N-环己基甘氨酸   Nchex
  D-α-甲基酪氨酸   Dmty   N-环癸基甘氨酸   Ncdec
  D-α-甲基缬氨酸   Dmval   N-环十二烷基甘氨酸   Ncdod
  D-α-甲基alnine   Dnmala   N-环辛基甘氨酸   Ncoct
  D-α-甲基精氨酸   Dnmarg   N-环丙基甘氨酸   Ncpro
  D-α-甲基天冬酰胺   Dnmasn   N-环十一烷基甘氨酸   Ncund
  D-α-甲基门冬氨酸盐   Dnmasp   N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸   Nbhm
  D-a-甲基半胱氨酸   Dnmcys   N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸   Nbhe
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  D-N-甲基亮氨酸   Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸   Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸盐   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基鸟氨酸   Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸   Nala   D-N-甲基苯基丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸盐   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nva
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  α-氨基丁酸   Gabu   N-(p-羟基苯基)甘氨酸   Nhtyr
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  L-t-丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫代甲基)甘氨酸   Ncys
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯基丙氨酸   Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基门冬氨酸盐   Masp   L-α-甲基-t-丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷酰胺   Mgln   L-α-甲基谷氨酸盐   Mglu
  L-α-甲基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯基丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸   Mile   N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸   Nmet
  D-N-甲基谷酰胺   Dnmgin   N-(3-胍基丙基)甘氨酸   Narg
  D-N-甲基谷氨酸盐   Dnmglu   N-(1-羟基乙基)甘氨酸   Nthr
  D-N-甲基组氨酸   Dnmhis   N-(羟基乙基)甘氨酸   Nser
  D-N-甲基异亮氨酸   Dnmile   N-(咪唑基乙基)甘氨酸   Nhis
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  D-N-甲基亮氨酸   Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸   Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸盐   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基鸟氨酸   Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸   Nala   D-N-甲基苯基丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸盐   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nval
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmvai   N-甲基青霉胺   Nmpen
  y-氨基丁酸   Gabu   N-(p-羟基苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-t-丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫代甲基)甘氨酸   Ncys
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯基丙氨酸   Hphe   L-tz-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基门冬氨酸盐   Masp   L-α-甲基-t-丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷酰胺   Mgln   L-α-甲基谷氨酸盐   Mglu
  L-α-甲基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯基丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸   Mile   N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸   Nmet
  L-α-甲基亮氨酸   Mleu   L-α-甲基赖氨酸   Mlys
  L-α-甲基甲硫氨酸   Mmet   L-α-甲基正亮氨酸   Mnle
  L-α-甲基戊氨酸   Mnva   L-α-甲基鸟氨酸   Morn
  L-α-甲基苯基丙氨酸   Mphe   L-α-甲基脯氨酸   Mpro
  L-α-甲基丝氨酸   mser   L-α-甲基苏氨酸   Mthr
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  L-α-甲基缬氨酸   Mtrp   L-α-甲基酪氨酸   Mtyr
  L-α-甲基亮氨酸   Mval Nnbhm   L-N-甲基高苯基丙氨酸   Nmhphe
  N-(N-(2，2-二苯基乙基)   N-(N-(3，3-二苯基丙基)
  氨基甲酰甲基-甘氨酸   Nnbhm   氨基甲酰甲基(1)甘氨酸   Nnbhe
  1-羧基-1-(2，2-二苯基乙基氨)环丙烷烷   Nmbc   苯基甘氨酸   Phg
  氨基环丙烷-羧酸盐   Cpro   氨基降冰片基-羧酸盐   Norb
肽键形成的产率可简单地通过相对起始原料和/或副反应杂质的量测量产物(例如伸长肽)的量而确定。在偶联特殊空间位阻氨基酸，如苯基甘氨酸，或更难以偶联的氨基酸如2-氨基异丁酸时，所得肽的长度和顺序用作偶联产率的指示。
在以偶联剂为媒的肽键形成的过程中，氨基酸的羧酸部分与偶联剂相互作用，形成活化中间体，后者又与下一氨基酸的氨基部分相互作用。在该过程中，可发生活化氨基酸的立体构型的完全反转，和更有可能的部分反转，导致该特定氨基酸的手性中心的外消旋。
外消旋是肽合成中最主要的技术问题，其比率也最难以测定。本文所用的术语″外消旋″是指手性分子的一种对映体至其其他立体异构体形式的部分转化，或其″镜图像″反转。
本文所用的术语″对映异构体″是指化合物，如氨基酸的一种立体异构体，它可相对其相应物仅通过相互的完全反转/反射(镜图像)而重合。对映异构体据说具有″偏手性-，因为它们相互参考，如同右和左手。对映异构体具有相同化学和物理性能，除了存在于本身具有偏手性的环境，如所有的生存体系中。
如以下实施例章节所示，本文所给出的偶联剂在一些最具挑战性的肽合成任务中测试，和根据其肽键形成产率和外消旋比率分级。
因此，根据本发明的另一方面，提供了一种合成肽的方法，该方法包括顺序地将多个氨基酸，一个接一个地，在本文所给出的偶联剂的存在下偶联，这样得到包含多个氨基酸的肽。
偶联剂的质量因此根据所得肽的质量，即其生产效率(反应产率)和其中每一手性中心的内外消旋化比率(产物纯度)而测定。对质量的这种评估可被量化成每个伸长步骤的阶梯指标，或每个完全肽的总比率。显然，在比较偶联剂时，最好避免其中肽顺序在其合成效率中其中关键作用的标准，和因此考虑到特殊氨基酸对的阶梯标准可用作指示性的偶联剂质量分级标准。
根据一些实施方案，每个一般偶联步骤的偶联产率为80％至99％，取决于偶联剂和其他条件。实质上，具有质子受体取代基的偶联剂与不具有这些取代基的其目前已知的相应物相比更有效至少5％，或至少10％。
特别重要的是在本文所给出的偶联剂在用于合成引入氨基酸残基的肽时的有效性，所述残基否则会以相对低的产率引入和一些时间特别难以引入。
被任务难以在普通肽合成中引入的示例性氨基酸包括，但不限于，具有仲α胺的氨基酸，具有叔α胺的氨基酸，具有取代的α碳原子的氨基酸和具有含氨基的侧链的氨基酸。
具有仲或叔α胺的氨基酸特别难以被引入合成制备的肽中，因为参与偶联反应的胺具有位阻。
具有取代的α碳原子的氨基酸的引入也由于影响偶联反应的取代基所引起的空间相互作用而基本上影响合成产率。两个依次相连的这些氨基酸的引入甚至更复杂。正如本领域熟知，在α碳上甚至被低级烷基如甲基取代的氨基酸也难以被引入肽顺序。
具有含氨基的侧链的氨基酸的引入通常因为偶联剂与侧链胺基团的非选择性反应而变得复杂。这种非选择性反应导致肽链的终止。如上所述，根据本发明的该方面的方法因此特别可用于合成包括上述氨基酸的一个或多个残基的肽。
因此，在本发明的一些实施方案中，用于合成肽的多种氨基酸中的至少一种是具有仲α胺的氨基酸，具有叔α胺的氨基酸，具有取代的α碳原子的氨基酸和/或具有含氨基的侧链的氨基酸。通过该方法制备的肽因此包括这些氨基酸的至少一个残基。
根据本发明的一些实施方案，多种氨基酸中的一种或多种是具有取代的α碳的氨基酸。
在一个实施方案中，α碳被烷基如甲基取代。在这方面的示例性氨基酸是α-氨基-异丁酸(Aib)。
在另一实施方案中，至少两个这样的氨基酸被顺序地引入通过本文所述方法制备的肽中，使得肽包含两个被相互偶联的这样氨基酸。
根据本发明的另一实施方案，包含被相互偶联的这种氨基酸的两个或多个残基的肽以大于80％，大于85％，大于90％，大于95％，和甚至大于98％的产率得到。
在本发明该方面的示例性实施方案中，多种氨基酸中的一种或多种是具有取代的手性α碳的氨基酸。如上所讨论，偶联剂为媒的肽合成倾向于将活化氨基酸的立体-构型反转，和更可能地会发生部分反转，导致该特殊氨基酸的手性中心的外消旋化，和如果考虑到其立体异构体，最终导致形成肽的多相混合物肽。在α-碳上具有手性中心的任何氨基酸在立体构型的保持方面对偶合反应敏感。这些氨基酸的例子包括所有D/L-氨基酸(除了甘氨酸)，D/L-α-甲基-氨基酸如D-α-甲基异亮氨酸和类似物。根据本发明的另一实施方案，包含被相互偶联的这种氨基酸的一个或多个残基的肽以大于80％，大于85％，大于90％，大于95％，和甚至大于98％的产率得到。
如以下实施例章节中所述，本文所给出的偶联剂在α-氨基-异丁酸(Aib)的挑战性立体-位阻偶联反应，甚至在两个依次相连的Aib残基的偶联的产率上上优于目前已知的偶联剂。本文所观给出的示例性偶联剂，6-Cl-HDMB，HDMA和HDMB分别具有每个特殊Aib-Aib偶联步骤98.7％，98％和89％的产率，相比而言，两种已知的偶联剂，HATU的产率被测定为83％和HBTU的产率被测定为47％。
正如以下实施例章节所进一步说明，本文所给出的偶联剂在一个序列超过10个氨基酸的挑战性偶联反应的产率方面优于目前已知的偶联剂。如实施例章节所述，本文所给出的偶联剂用于形成具有15个氨基酸的特定顺序的肽，肽H-Glu-Lys-Ile-Thr-Thr-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-NH2。根据本发明的该实施方案，包含10个以上残基的肽以大于40％，大于50％和甚至大于60％的产率得到。
根据一些实施方案，每个偶联步骤的外消旋化比率不高于10％，和可以是约10％至约0.5％，或约5％至约0.1％。
如以下实施例章节中所述，在使用偶联剂时在偶联剂活化用于偶联反应的手性中心上发生外消旋化的比率方面，本文所给出的偶联剂上优于目前已知的偶联剂。苯基甘氨酸(Phg)在脯氨酸残基偶联其上之后评估该标准；和缬氨酸在脯氨酸残基偶联其上之后评估。
在本发明该方面的另一实施方案中，在氨基酸的每一顺序连接中，偶联剂的用量是0.2mol当量至5mol当量，相对氨基酸的摩尔量，或约0.5mol当量至3mol当量，相对氨基酸的摩尔量，或另外使用化学计量的偶联剂。
使用本文所述偶联剂的高反应性和选择性的上述方法，可得到包含高浓度所需肽的肽组合物，即，具有所需顺序的肽。这些组合物通常具有的所需肽的浓度高于使用目前已知的偶联剂所得的。
因此，根据本发明的另一方面，提供了一种肽的粗组合物，它在C-末端至N-末端方向上合成，和基本上由具有所需氨基酸顺序的肽和作为具有所需氨基酸顺序的肽的杂质的多个具有非所需氨基酸顺序的肽组成。根据本发明的该方面，在使用本文所述偶联剂在C-末端至N-末端方向上合成的肽的组合物中，具有所需氨基酸顺序在组合物中的浓度比具有所需氨基酸顺序的相同肽的浓度高至少5％，与在相同条件下使用目前已知的偶联剂制备的组合物相比。
本文所用的词语″具有所需顺序的肽″描述在肽链中的氨基酸的顺序和组成方面包含所需顺序和在肽链中的氨基酸的数目方面包含所需链长的肽。
本文所用的词语″具有非所需顺序的肽″描述在肽链中的氨基酸的顺序和组成方面包含不同顺序和在肽链中的氨基酸的数目方面包含不同链长的肽，与具有所需顺序的肽相比。
词语″粗组合物肽″描述肽合成的粗品(其中肽在C-末端至N-末端方向上制备)。正如本领域所熟知，这种粗品由本文所定义的具有所需顺序的肽，和对其污染的具有非所需顺序的肽组成。根据用于制备肽的合成方法和其中所采用的条件和步骤，这种粗组合物可以是固体或溶液的形式。固体组合物可被，例如，粉碎或冻干。组合物可进一步被键接至其上合成由所述肽的固体载体。溶液可包括溶解在液体介质中的组合物。这种液体介质通常是除了水，还包含各种盐，缓冲剂和类似物的水介质。
在本发明该方面的一些实施方案中，具有所需氨基酸顺序的肽在组合物中的浓度比具有所需氨基酸顺序的相同肽在组合物(在C-末端至N-末端方向上使用目前已知的偶联剂在相同条件下合成的肽)中的浓度高至少5％，至少8％，至少10％，至少12％，至少15％，至少18％，至少20％，至少22％，至少25％，和甚至至少30％。
根据本发明该方面的示例性粗组合物是其中具有所需氨基酸顺序的肽包含至少一种选自以下的氨基酸残基的那些：具有仲α胺的氨基酸的残基，具有叔α胺的氨基酸的残基，具有取代的α碳原子的氨基酸的残基，和具有含氨基的侧链的氨基酸的残基，以上给出了具体定义。
根据本发明该方面的其他粗组合物是其中具有所需氨基酸顺序的肽包含至少两个偶联的氨基酸残基的那些，其中所述至少两个氨基酸残基中的至少一个选自具有仲α胺的氨基酸的残基和具有叔α胺的氨基酸的残基。
根据本发明该方面的其他粗组合物是其中具有所需氨基酸顺序的肽包含至少两个偶联的氨基酸残基的那些，所述残基具有取代的α碳原子(如，Aib残基)。
任何目前已知的用于化学合成肽的技术可用于本发明实施方案。这些包括，例如，标准固相技术，包括专用固相合成，部分固相合成方法，和片断缩合，和传统溶液合成。固相肽合成步骤是本领域熟知的和进一步由John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young描述，固相肽合成(2ndEd.，Pierce Chemical Company，1984)。
所得肽可，使用，例如，制备高性能液体色谱进一步纯化[CreightonT.(1983)蛋白质，结构和分子原理。WH Freeman和Co.N.Y.]。其他示例性纯化步骤可包括羟基磷灰石，尺寸排斥和固定金属离子吸附(IMAC)色谱。
合适的色谱介质包括衍生的右旋糖酐，琼脂，纤维素，聚丙烯酰胺，特殊硅石，和类似物。示例性色谱介质包括使用苯基，丁基，或辛基团衍生的那些介质，如苯基-琼脂糖FF(Pharmacia)，Toyopearl butyl 650(TosoHaas，Montgomeryville，Pa.)，辛基-琼脂糖(Pharmacia)和类似物；或聚丙烯酸树脂，如Amberchrom CG 71(Toso Haas)和类似物。
合适的固体载体包括在它们使用的条件下不可溶的玻璃珠粒，硅石-基树脂，纤维素树脂，琼脂珠粒，交联琼脂珠粒，聚苯乙烯珠粒，交联聚丙烯酰胺树脂和类似物。
这些载体可用反应性基团改性使得肽能够被氨基团，羧基团，巯基团，羟基团和/或碳水化合物部分连接。这些和其他固体介质是本领域熟知的和广泛使用的，且可得自商业供应商。对特定方法的选择根据所选载体的性能确定。参见，例如，亲合性色谱：原理&方法，PharmaciaLKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。
通过根据本发明该方面的方法制备的肽是线性，但也可得到环形的肽。环状肽可被合成成环状形式或在所需条件(如，生理条件)下构造成环状形式。
如上所讨论，本文所给出的偶联剂也可以用合成各种核酸，低聚核苷酸，多核苷酸，其类似物和衍生物。偶联剂按照与它们活化氨基酸的羧基团的类似方式活化核苷酸的磷酸盐基团，这样将一个核苷酸偶联至另一核苷酸上。
因此，根据另一方面本发明，提供了一种合成多核苷酸或低聚核苷酸的方法，该方法通过固相技术或溶液相技术进行，和顺序地将多个核苷酸，一个接一个地，在本文所述偶联剂的存在下偶联，这样得到包含多个核苷酸的多核苷酸。
在本文中可互换使用的术语″多核苷酸-，″低聚核苷酸″和″核酸″被通称为″多核苷酸-，和包括，例如，一个以上核苷酸的单链或复式的RNA，DNA，或RNA/DNA混合顺序。但在本实施方案中，因为低聚核苷酸的化学合成通常是包括单链物质，低聚核苷酸至少在使用偶联剂化学合成的那部分基本上是单链物质。因此，核苷酸是多核苷酸或核酸如DNA和RNA的单体单元。
本文所用的术语″核苷酸″是指包含核碱-糖-磷酸盐组合的分子，含义包含嘌呤，嘧啶或其类似物，核糖，脱氧核糖部分或其类似物，和磷酸盐基团或磷二酯连接基团(在低聚核苷酸或多核苷酸内的核苷酸的情况下)的分子，或较大核酸分子中的单个单元。因此，术语″核苷酸″包括自然存在的核苷酸以及在连接的含磷酸盐的基团，嘌呤或嘧啶，或糖部分中包含至少一个变型的″改性的核苷酸″。
术语″核苷酸″包括脱氧核糖核苷三磷酸盐(″dNTPs″)如dATP(2′-脱氧腺苷5′-三磷酸盐)，dCTP(2′-脱氧胞苷5′-三磷酸盐)，dITP(2′-脱氧肌苷5′-三磷酸盐)，dUTP(2′-脱氧尿嘧啶核苷5′-三磷酸盐)，dGTP(2′-脱氧鸟嘌呤核苷5′-三磷酸盐)，dTTP(2′-脱氧胸腺啶5′-三磷酸盐)，或其衍生物。这些衍生物包括，例如，α-dATP，7-脱氮杂-dGTP，7-脱氮杂-dATP，氨基烯丙基-UTP(5-[3-氨基烯丙基]-尿嘧啶核苷-5′-三磷酸盐)，氨基烯丙基-dUTP，氨基烯丙基-dUTP，生物素-11-dUTP(生物素-e-氨基己基-[5-{3-氨基烯丙基}-2′-脱氧尿嘧啶核苷-5′-三磷酸盐])，荧光素-12-dUTP(荧光素-6-碳x氨基己基-[5-{3-氨基烯丙基}-2′-脱氧尿嘧啶核苷-5′-三磷酸盐])，dm6ATP(2′-脱氧-N6-甲基腺苷5′-三磷酸盐)，dm4CTP(2′-脱氧-N4-甲基胞苷5′-三磷酸盐)或dm5CTP(2′-脱氧-5-甲基胞苷5′-三磷酸盐)。这里所用的术语″核苷酸″还表示二脱氧核糖核苷三磷酸盐(″ddNTPs″)和其衍生物，包括，但不限于，ddATP，ddCTP，ddGTP，ddITP，和ddTTP。另外，术语″核苷酸″包括核糖核苷三磷酸盐(rNTPs)如rATP，rCTP，rITP，rUTP，rGTP，rTTP和其衍生物，它们类似于上述的dNTPs和ddNTPs，除了rNTPs在其糖-磷酸盐主链中包含核糖而非脱氧核糖或二脱氧核糖。
可以理解，为清楚起见在单独实施方案中描述的本发明某些特点也可在单个实施方案中组合提供。相反，为简要起见而在单个实施方案中描述的本发明的各种特点也可单独或以任何合适的子组合或如果合适，提供在本发明任何其他所述实施方案中。
各种实施方案中描述的某些特点不被认为是那些实施方案的基本特征，除非该实施方案在没有这些要素时不起作用。
本文以上描述和在以下权利要求中所要求的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中具有实验支持。
实施例
现在参考以下实施例及以上描述来，以非限定性方式说明本发明的一些实施方案。
材料和方法
溶剂购自Carlo Erba Reactifs-Sds和没有进一步纯化而施用(除非指出)。
N，N-二甲基甲酰胺用氮气鼓泡2小时和保持在分子筛上。
乙腈在使用之前从无水碳酸钾上蒸馏并保持在分子筛上。
二异丙基乙胺用nihydrine(2，2-二羟基茚满-1，3-二酮)回流2小时，并随后蒸馏和保持在分子筛上。
六氟磷酸钾，吗啉，三光气，硫代吗啉，4-氯-3-硝基三氟苯，和2-氯-3-硝基吡啶，N-羟基琥珀酰亚胺，五氟苯酚购自Sigma-Aldrich。
草酰氯，N，N，N-三甲基亚乙基二胺，N，N-二甲基氨基甲酰氯，N，N-二乙基氨基甲酰氯，氟化钾购自Fluka。
氟化钾在使用之前在100摄氏度炉中保持24小时进行干燥。
HOBt，HOAt，和Rink Amide树脂购自Biotech GMBH。
6-Cl-HOBt购自Luxembourg industries。其他起始原料和试剂购自Carlo Erba Reactifs-Sds，Sigma-Aldrich，Fluka，Biotech GMBH或Luxembourg industries Ltd。
TLC在来自Albet的硅石板(8X4cm)上使用合适的溶剂体系和用CM-10型Spectroline UV灯(254nm)观察而进行。
熔点在开口毛细管中使用Buchi熔点B-540装置得到。
红外光谱(IR)在FT-IR Thermo Nicolet系列Fourrier转化器仪器上使用KBr粒料而记录。吸收带(vmax)以波数(cm-1)给出。
UV-Vis光谱在Shimadzu UV-250/PC分光光度计上记录。
NMR光谱在Varian汞400MHz光谱计上在室温下记录，化学位移记录为相对所用的内溶剂的ppm数。
HPLC分析通过使用Waters Symmetry柱C18，5μ，4.6X150mm和双波长吸光率检测器进行。
质谱测量在MALDI质谱计上使用ACH作为内基质而进行。
X-射线晶体学分析使用Bruker Appex-II CCD衍射计，使用3363反射和四圈衍射仪进行。
实施例1
称作脲/亚铵型偶联剂的各种脲衍生物的化学合成
脲衍生物的制备-一般步骤A：
在0摄氏度下将N，N-二烷基-氨基甲酰氯(0.6mol)滴加至仲胺化合物(0.5mol)和三乙胺(0.5mol)在DCM(400ml)中的混合物。混合物在室温下搅拌3-4小时并随后用10％NaOH碱化。收集有机层并将水层用二氯甲烷(DCM，100ml)洗涤。将合并的DCM相用H2O(2x100ml)和用NaCl的饱和溶液(2x100ml)洗涤，在无水MgSO4上干燥，过滤，和在减压下去除溶剂。通常得到油状残余物并通过真空蒸馏纯化。
脲衍生物的制备-一般步骤B：
脲衍生物通过使用由DCM和10％NaOH组成的二相体系而制成。将仲胺(0.5摩尔)溶解在DCM(300ml)和10％NaOH(300ml)中。滴加N，N-二烷基-氨基甲酰氯(0.6mol在200ml DCM)10分钟。反应混合物在室温下搅拌3小时和收集有机层。NaOH层用DCM(200ml)洗涤并将合并的DCM用水(2x100ml)，饱和NaOH(2x100ml)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并将溶剂在减压下去除，得到通常为纯无色油的脲衍生物。
一系列示例性脲衍生物根据一般步骤A或B(参见以下方案3)使用各种环仲胺(在方案3中表示为R1R2NH)，如吡咯烷，吗啉，硫代吗啉，N-甲基-2-(吡咯烷-1-基)乙胺，N-甲基-2-(哌啶-1-基)乙胺和N-甲基-2-吗啉代乙胺而制成。
方案3
Figure G2008800247628D00471
N，N-二甲基吡咯烷-1-甲酰胺的制备：
Figure G2008800247628D00481
将N，N-二甲基吡咯烷-1-甲酰胺，脲衍生物，根据一般步骤A或B使用吡咯烷作为仲胺在98-100摄氏度下蒸馏并收集成无色油，85.5％产率。
1H NMR(CDCl3)：δ＝1.81-2.10(m，4H，2CH2)，2.81(s，6H，2CH3)，3.15-3.18(m，4H，2CH2)ppm
N，N-二甲基吗啉-4-甲酰胺的制备：
Figure G2008800247628D00482
N，N-二甲基吗啉-4-甲酰胺，脲衍生物，根据一般步骤A或B使用吗啉作为仲胺在127-129摄氏度下蒸馏和收集成无色油，92.4％产率(73克，来自0.5摩尔反应)。
1H NMR(CDCl3)：δ＝2.84(s，6H，2CH3)，3.22-3.2(m，4H，2CH2)，3.68-3.70(m，4H，2CH2)ppm；
13CNMR(CDCl3)：δ＝38.62，47.51，66.89，164.96ppm。
N，N-二甲基硫代吗啉-4-甲酰胺的制备
Figure G2008800247628D00483
N，N-二甲基硫代吗啉-4-甲酰胺，另一脲衍生物，作为浅棕色晶体在89.5％产率下根据一般步骤A或B使用硫代吗啉作为仲胺而得到。
m.p.：61-62摄氏度；
1H NMR(CDCl3)：δ＝2.62-2.65(m，4H，2CH2)，2.81(s，6H，2CH3)，3.48-3.50(m，4H，2CH2)ppm；
13C NMR(CDCl3)：δ＝27.41，38.77，49.38，165.17ppm。
二吗啉代甲酮的制备：
Figure G2008800247628D00491
二吗啉代甲酮，另一脲衍生物，通过将吗啉和三光气(BTC)在二氯甲烷(DCM)中缩合而合成。将在DCM(200ml)中的吗啉(0.4mol)放在装配滴液漏斗的250ml三颈烧瓶中，并在氮气氛下在0摄氏度下向其中加入BTC(0.033mol)溶解在DCM(100ml)中的溶液。反应混合物在0摄氏度下搅拌1小时，和在室温下搅拌另外3-4小时。加入水(100ml)以溶解白色固体，收集有机层并随后用饱和Na2CO3(50ml)，1N HCl(50ml)，饱和NaCl(50ml)洗涤，干燥(MgSO4)，和过滤，并随后将溶剂在减压下去除，得到纯白色固体，86％产率。
m.p.141-142摄氏度；
1H NMR(CDCl3)：δ＝3.19-3.21(m，8H，4CH2)，3.59-3.62(m，8H，4CH2)ppm；
13C NMR(CDCl3)：δ＝47.39，66.75，163.94ppm。
1，1，3-三甲基-3-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)脲的制备：
1，1，3-三甲基-3-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)脲，另一脲衍生物，根据一般步骤A或B使用N-甲基-2-(吡咯烷-1-基)乙胺作为仲胺在134-135摄氏度下蒸馏和收集成浅黄色油，74.2％产率(11.6克，来自78mmol)。
1H NMR(CDCl3)：δ＝1.75-1.78(m，4H，2CH2)，2.52-2.56(m，4H，2CH2)，2.65(t，2H，CH2)，2.79(s，6H，2CH3)，2.84(s，3H，CH3)，3.12(t，2H，CH2)，ppm。
13C NMR(CDCl3)：δ＝23.67，37.18，38.91，49.80，53.94，54.54，165.68ppm。
m/z：199.17。
1，1，3-三甲基-3-(2-(哌啶-1-基)乙基)脲的制备：
Figure G2008800247628D00501
1，3-三甲基-3-(2-(哌啶-1-基)乙基)脲，另一脲衍生物，根据一般步骤A或B使用N-甲基-2-(哌啶-1-基)乙胺作为仲胺在89-91摄氏度下蒸馏和收集成无色油，81.7％产率(34.8克，来自0.3摩尔)。
1H NMR(CDCl3)：δ＝1.39-1.45(m，2H，CH2)，1.54-1.59(m，4H，2CH2)，1.60-1.65(br，1H，NH)，2.35-2.41(m，4H，2CH2)，2.37-2.44(m，5H，CH2，CH3)，2.66(t，2H，CH2)ppm。
1，1，3-三甲基-3-(2-吗啉代乙基)脲的制备：
Figure G2008800247628D00502
1，1，3-三甲基-3-(2-吗啉代乙基)脲，另一脲衍生物，根据一般步骤A或B使用N-甲基-2-吗啉代乙胺作为仲胺在152-154摄氏度下蒸馏和收集成浅黄色油，76.8％产率。
1H NMR(CDCl3)：δ＝2.45(t，4H，2CH2)，2.54(t，2H，CH2)，2.77(s，6H，2CH3)，2.82(s，3H，CH3)，3.29(t，2H，CH2)，3.66(t，4H，2CH2)ppm。
13C NMR(CDCl3)：δ＝37.33，38.91，47.36，54.04，56.47ppm。
氯亚铵衍生物的制备-一般步骤C：
氯亚铵衍生物的制备按照以下方案4所述而进行：
方案4
Figure G2008800247628D00511
在室温下在5分钟内将在DCM(100ml)中的草酰氯(100mmol)滴加至脲衍生物(100mmol)在干DCM(200ml)中的溶液。反应混合物在回流下搅拌3小时，和溶剂在减压下去除，将残余物用无水醚(2x100ml)洗涤，并随后用N2鼓泡以去除过量醚。所得残余物通常是非常吸水的，和因此将它直接溶解在DCM中；和将的饱和含水六氟磷酸钾(100mmol，在50mL水中，KPF6)溶液在室温下在剧烈搅拌下加入10-15分钟。收集有机层，一次性用水(100ml)洗涤，在无水MgSO4上干燥，过滤并将溶剂在减压下去除，得到通常白色固体，可从DCM-醚或乙腈-醚中重结晶，得到通常白色晶体。
4-((二甲基氨基)氯亚甲基)吗啉-4-亚铵六氟磷酸盐(DCMH)的制备：
Figure G2008800247628D00512
在室温下在5分钟内将在DCM(100ml)中的草酰氯(100mmol)滴加至根据一般步骤A或B制备的，在干DCM(200ml)中的N，N-二甲基吗啉-4-甲酰胺(100mmol)的溶液。反应混合物在回流下搅拌3小时，溶剂随后在减压下去除，将残余物用无水醚(2x100ml)洗涤，并随后用N2鼓泡以去除过量醚。将所得白色固体溶解在DCM(500ml)中并将饱和含水KPF6(18.4克，在50ml H2O中)在室温下在剧烈搅拌下加入10-15分钟。收集有机层，一次性用水(50ml)洗涤，在无水MgSO4上干燥，过滤并将溶剂在减压下去除，得到白色固体，从DCM-醚中重结晶，得到通常白色晶体，89.6％产率(28.9克)。
m.p.94-95摄氏度；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.39(s，6H，2CH3)，3.75(t，4H，2CH2)，3.86(t，4H，2CH2)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝44.36，52.82，65.99，162.79ppm。
N-(氯(吡咯烷-1-基)亚甲基)-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸盐(DmPyCH)的制备：
Figure G2008800247628D00521
N-(氯(吡咯烷-1-基)亚甲基)-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸盐(DmPyCH)根据一般步骤C和如上DCMH所述而制备，和得到白色固体，89.0％，产率。
m.p.93-95摄氏度；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝2.00-2.13(m，4H，2CH2)，3.49(s，6H，2CH3)，3.90-4.02(m，4H，2CH2)ppm。
1-(氯(吗啉代)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐的制备：
1-(氯(吗啉代)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐按照以下方案5所述而制备：
方案5
Figure G2008800247628D00522
将在100ml DCM中的4-吗啉代羰基氯(36克，1.2当量)在10分钟内加入吡咯烷(0.2摩尔，17ml)在100ml DCM和100ml 10％NaOH中的搅拌溶液。反应混合物在室温下搅拌3小时并随后收集有机层并将NaOH层用100ml DCM洗涤。将合并的DCM用水(2X100ml)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并将溶剂在真空下去除，得到在室温下凝固的无色油，产率92.4％(34克)。
粗脲衍生物进一步通过真空蒸馏而纯化和收集在165-169摄氏度下的级分。
1H NMR(CDCl3)：δ＝1.76-1.81(m，4H，2CH2)，3.24(t，4H，2CH2)，3.32-3.35(m，4H，2CH2)，3.64(t，2H，CH2)ppm；
13C NMR(CDCl3)：δ＝25.72，46.84，48.52，66.97，162.84ppm；
氯亚铵盐根据一般步骤C如上所述而制备。所得产物作为白色固体得到，产率83.9％。
m.p.99-100摄氏度。
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝2.10-2.14(m，4H，2CH2)，3.87(t，4H，2CH2)，4.00(t，4H，2CH2)，4.04-4.06(m，4H，2CH2)ppm；
13C NMR(CDCl3)：δ＝25.80，51.75，55.97，65.97，154.85ppm。
实施例2
称作偶联剂中的离去基团的各种化合物的化学合成：
N-羟基二氢吲哚-2-酮(HOI)的制备：
该合成是对现有技术[Kenneth H.Collins，J Amer.Chem.Soc，78，221-224(1956)]的修改和在以下方案6中说明。
方案6
Figure G2008800247628D00531
2-硝基苯基乙酸(9克，50mmol)溶解在50％H2SO4(40ml)中并随后在1小时内加入7克锌粉。反应混合物在30-35摄氏度下搅拌3小时并将不可溶部分过滤掉。产物溶解在Na2CO3溶液中和用HCl再沉淀，过滤，干燥和从水中重结晶，得到浅黄色固体，产率20％(1.5克)。
m.p.198-199摄氏度；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝3.97(s，2H，CH2)，7.51-7.56(m，2H，ar)7.68(t，1H，ar)，8.04(d，1H，ar)，12.51(br，1H，OH)ppm。
3-羟基-2-甲基喹唑啉-4-酮(HOMQ)的制备：
该合成是对已有技术[F.Gutierrez，C.Tedeschi，L.Maron，J-P.Daudey，R.Poteau，J.Azema，P.Tisnes，和C.Picard，DaIt.Trans.1334-1347(2004)]的修改和在以下方案7中说明。
方案7
Figure G2008800247628D00541
将K2CO3(0.93克)慢慢加入o-苄基羟胺/HCl(2.16克，12.58mmol)在水(60ml)中的溶液。该混合物搅拌30分钟并随后向其中加入衣托酸酐(2克，12.3mmol)。反应混合物在室温下在搅拌下保持24小时并随后过滤。将固体在减压下干燥并随后从形式二氯甲烷-己烷中重结晶，得到浅棕色固体，产率89.7％(5.34克)。
m.p.105-106摄氏度；
1H NMR(CDCl3)：δ＝5.02(s，2H，CH2)，6.58-6.62(m，1H，ar)，6.67-6.69(m，1H，ar)，7.1-7.25(m，3H，ar)，7.37-7.46(m，6H，ar，NH)，8.37-8.46(brs，1H，NH)ppm。
2-氨基-N-苄基氧基苯并酰胺(2克，8.25mmol)和乙酸酐(9.12ml，8.5mmol)的混合物在回流下加热2小时。在冷却之后，趁热加入水(3.9ml)和活性炭并将混合物另外煮沸30分钟，随后滤过Celite垫。Celite垫用甲醇洗涤并将合并的滤液在减压下蒸发。将残余物使用(DCM-MeOH，9∶1)滤过硅胶，并随后将溶剂在减压下蒸发。粗残余物在室温下溶解在MeOH中并用(0.02克)Pd/C处理30分钟，滤过Celite和洗涤与MeOH洗涤。将合并的MeOH在真空下蒸发，得到产物，产率48.1％。
m.p.161-162摄氏度；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝2.27(s，3H，CH3)，7.13(t，1H，ar)，7.61(t，1H，ar)，8.13(d，1H，ar)，8.73(d，1H，ar)，11.04(s，1H，OH)ppm。
相同化合物使用在乙酸中的乙酰氯-三乙胺制备如下。
在室温下，2-氨基-N-羟基苯并酰胺(10mmole)悬浮在10mmol三乙胺中(放热溶解)并随后加入乙酸(10ml)，随后加入乙酰氯(1ml)。反应混合物在室温下搅拌1小时并随后向其中加入20ml水。沉淀物通过过滤而收集，干燥得到纯产物，产率78.5％。
3-羟基喹唑啉-4-酮(HOQ)的制备：
该合成是对现有技术[Robert H.Clark和E.C.Wagner，J.Org.Chem.，1，55-67(1944)]的修改，和从2-氨基-N-羟基苯并酰胺的合成开始，如下方案8所示。
方案8
Figure G2008800247628D00551
将Na2CO3(5.5克，0.55摩尔，1当量)加入羟胺盐酸盐(6.9g，0.1摩尔，1当量)在250ml水中的溶液。将衣托酸酐(8.15克，0.05摩尔)加入溶液，自发地启动反应。反应混合物在室温下放置过夜。将固体产物过滤和从水中在40摄氏度下重结晶，简短地风干并在减压下完全干燥(该化合物对潮湿空气敏感)，得到产物，产率85.8％。
m.p 86摄氏度。
该步骤在合成3-羟基喹唑啉-4-酮(HOQ)时，通过两种方法如下进行。
方法(A)：1.52克(10mmol)异羟肟酸和4ml 98％甲酸的混合物在回流下加热15分钟，在加入10ml水之后，将整个混合物煮沸15分钟和冷却至室温。沉淀物通过过滤而收集和用冷水(2x5ml)洗涤，干燥得到0.35克(22％产率)黄白色固体。
m.p.212-21A摄氏度(分解)；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝7.54(td，1H，ar)，7.71(dd，1H，ar)，7.82(td，1H，ar)，8.17(dd，1H，ar)，8.53(s，1H，ar)，11.92(br，1H，OH)ppm。
方法(B)：8mmol异羟肟酸溶解在包含8mmol NaOH的20ml MeOH中，并将溶液在室温下搅拌30分钟。将溶剂蒸发至无水并将残余固体溶解在8ml 98％甲酸中。反应混合物回流30分钟并随后冷却至室温。用水(20ml)稀释，得到黄白色固体，过滤，干燥并随后从水中重结晶，得到浅棕色固体0.59克(37％产率)。
m.p.270-272摄氏度(分解)；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝7.54(td，1H，ar)，7.71(dd，1H，ar)，7.82(td，1H，ar)，8.17(dd，1H，ar)，8.53(s，1H，ar)，11.92(br，1H，OH)ppm。
6-氯-3-羟基喹唑啉-4-酮(6-Cl-HOQ)的制备：
化合物根据上述的方法(B)制备，如下方案9所示。
方案9
Figure G2008800247628D00561
所得产物是0.71克(36.6％产率，来自10mmol反应)，浅棕色固体。
m.p.268-269摄氏度；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝7.74(d，1H)，7.85(dd，1H)，8.09(d，1H)，8.56(s，1H)，12.02(s，1H，OH，可与D2O交换)。
6-氯-3-羟基2-甲基喹唑啉-4-酮(6-Cl-HOMQ)的制备：
6-氯-3-羟基2-甲基喹唑啉-4-酮(6-Cl-HOMQ)的合成在以下方案10中说明。
方案10
Figure G2008800247628D00571
在室温下将2-氨基-5-氯-N-羟基苯并酰胺(186克，10mmole)悬浮在三乙胺(1.3ml，10mmole)中并随后加入乙酸(10ml)，然后加入乙酰氯(1ml)。反应混合物在室温下搅拌1小时并随后向其中加入20ml水。沉淀物通过过滤而收集，用冷水洗涤，干燥得到1.69克纯产物，产率80.3％。
m.p.183-185摄氏度；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝2.11(s，3H，CH3)，7.63(dd，1H)，7.87(d，1H)，8.45(d，1H)，10.93(s，1H，OH)ppm。
N-羟基-2-苯基苯并咪唑(HOPBI)的制备：
N-羟基-2-苯基苯并咪唑(HOPBI)的合成在以下方案11中说明：
方案11
Figure G2008800247628D00572
方法(A)：由现有技术[N.D.Kokare，R.R.Nagwade，V.P.Rane，D.B.Shinde，合成，766-772(2007)]修改，进行如下。将悬浮在干THF(30ml)和2-硝基苯胺(2.68克，20mmol)中的NaH(48mmol，3.25克，60％，分散在矿物油中，在使用之前用干THF洗涤三次)在冷却下分批加入。在15分钟之后，慢慢加入苄基溴(5.8克，50mmol)并将反应混合物在80摄氏度下加热4小时。反应混合物冷却至室温，用水(25ml)淬灭和提取到乙酸乙酯(2x15ml)中。将有机层干燥(Na2SO4)和在真空下浓缩。产物通过用己烷研磨和过滤而分离，得到黄白色固体，产率87.2％(5.1克)。NMR显示一些痕量的起始原料(约12-15％)，和需要进一步重结晶或通过柱而纯化。
1H NMR(CDCl3)：δ＝5.10(s，2H)，7.20-7.40(m，5H)，7.60-7.80(m，5H)，7.8(d，2H)，8.20(d，2H)ppm。
方法(B)：由现有技术[J.M.Gardiner，C.R.Loyns，C.H.Schwallabe，G.C.Barrett，P.R.Lowe，四面体，51，4101-4110(1995)]修改，进行如下。O-硝基苯胺(14.5mmol)溶解在干THF(100ml)中，和在环境温度下加入NaH(60％在油，1.45mmol)。慢慢加入苄基溴(14.5mmol)，并将反应回流4小时。反应冷却至环境温度，和进一步慢慢加入14.5mmol NaH，将反应加热另外4小时，和加入第二部分的苄基溴(14.5mmol)。在另外4小时之后，将反应再次冷却至环境温度，加入第三部分的NaH(14.5mmol)并将反应加热另外4小时(NaH必须在使用之前用THF洗涤三次)。将反应冷却和用NaCl溶液淬灭，用DCM(3X100ml)提取。将有机提取物合并，用饱和NaCl溶液(100ml)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并将溶剂在真空下去除。粗固体产物用己烷研磨三次(3X100ml)，得到白色固体，产率88.4％。
粗品(5.3克，0.17mol)溶解在MeOH(50ml)中，加入Pd/C(10％，500mg)并将反应混合物在H2气氛下在室温下搅拌15-30分钟(TLC，AcOEt，己烷1∶1)。将反应混合物滤过高流动Celite并将滤液浓缩和通过柱色谱(MeOH-CHCl3，1∶9)纯化，得到N-羟基化合物作为白色固体，产率75.9％(2.75克)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝7.23-7.46(m，2H)，7.61-7.83(m，5H，Ph)，8.22(d，2H)，12.22(s，1H，OH)ppm。
o-氯-N-羟基-1-苯基苯并咪唑(6-Cl-HOPBI)的制备：
6-氯-N-羟基-2-苯基苯并咪唑(6-Cl-HOPBI)如下方案12所述而制备。
方案12
Figure G2008800247628D00591
产物使用方法(B)得到，浅棕色晶体4.22克，来自20mmol(65.8％产率)。
m.p.123-124摄氏度；
1H NMR(CDCl3)：δ＝5.03(s，2H，CH2)，7.19-7.38(m，7H)，7.51(t，3H)，7.68(d，1H)，8.13-8.16(m，2H)。
OBn衍生物(3.345克，10mmol)溶解在10ml MeOH和10ml THF中。然后加入Pd/C(10％，500mg)并将反应混合物在H2气氛下在室温下搅拌15-30分钟(TLC，AcOEt，己烷1∶1)。反应混合物滤过高流动Celite并将滤液浓缩和用醚(2x10ml)洗涤而纯化，得到纯产物作为米白色固体，产率73％(1.78克)。
m.p.262-264摄氏度；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝7.25(dd，1H)，7.53-7.57(m，4H，Ph)，7.68(d，1H)，8.20-8.25(m，2H)，12.19(s，1H，OH)ppm。
13C NMR(DMSOd6)：δ＝123.72，125.90，130.35，131.35，132.36，133.87，134.88，135.58，136.35，147.34，148.17，159.99，165.26ppm。
2-甲基-3H-咪唑[4，5-b]吡啶-3-醇(HOMPI)的制备：
2-甲基-3H-咪唑[4，5-b]吡啶-3-醇(HOMPI)如下方案13所述而制备。
方案13
Figure G2008800247628D00601
8-硝基-[1，2，4]三唑[1，5-a]吡啶根据公开步骤[CharlotteK.Lowe-Ma，Robin A.Nissan，William S.Wilson，J Org.Chem.，55，3755-3761(1990)]制备如下。2-氯-3-硝基吡啶(4克，25.6mmol)和叠氮化钠(4克，61.6mmol)在环境温度下溶解在10％含水乙醇(400ml)中，和加入10％HCl(40ml)。溶液随后在回流下加热48小时。蒸发至无水，加入水(80ml)和过滤，得到固体残余物，从乙醇中重结晶，得到浅棕色晶体2.4g(74.1％产率)。
m.p.176-178摄氏度；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝7.65(t，1H)，8.88(d，1H)，9.76(d，1H)ppm。
[1，2，5]-噁二唑[3，4-b]吡啶1-氧化物制备如下。8-硝基-[1，2，4]三唑[1，5-a]吡啶(1克，6mmol)溶解在甲苯(100ml)中和在回流下加热4小时。将溶液用活性炭脱色和过滤，蒸发至无水，得到浅黄色固体，从环己烷中重结晶，得到黄色晶体，产率62.4％(0.52克)。
m.p.54-56摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝7.47(dd，1H)，8.25(dd，1H)，8.65(dd，1H)ppm。
3-羟基-2-甲基-3H-咪唑[4，5，b]吡啶1-氧化物根据公开步骤[M.Boiani，L.Boiani，A.Denicola，S.Torres de Ortiz，E.Serna，N.VeradeBilbao，L.Sanabria，G.Yaluff，H.Nakayama，A.Rojasde Arias，C.Vega，M.Rolan，A.Gomez-Barrie，H.Cerecette，M.Gonzalez，J.Med.Chem.，49，3215-3224(2006)]制备如下。
[1，2，5]噁二唑[3，4-b]吡啶1-氧化物(3mmol)和硝基乙烷(3mmol)溶解在5ml THF中。滴加哌啶(3mmol)(放热反应)。在完全加入加入之后，将反应混合物在室温下放置12小时。过滤得到棕色沉淀物，从DCM-己烷中重结晶。
羟基碳亚氨基二氰化物的钾盐的制备：
合成根据公开步骤[Mitsuru Kitamura，Shunsuke Chiba，KoichiNarasaka，Bull.Chem.Soc.Jpn，76，1063-1070(2003)]制备，如下方案14所示。
方案14
Figure G2008800247628D00611
亚硝酸钠(14.2克，206mmol)在0摄氏度在下20-30分钟内慢慢加入丙二腈(9.06克，138mmol)在乙酸(20ml)和水(50ml)中的溶液并随后将混合物在相同温度下搅拌45分钟。在将反应用2N HCl(100ml)淬灭之后，反应用醚(3x100ml)提取三次。将提取物在无水Na2SO4上干燥，并将醚在真空下去除，得到油状残余物。将油状产物慢慢加入KOH(8.0克)在MeOH(100ml)中的冷溶液，并随后将反应混合物在0摄氏度下搅拌20分钟。加入过量醚，得到罐盐作为黄色晶体，产率77.5％(14.1克)。
2-(羟基亚氨基)丙二酸二乙酯的钾盐的制备：
2-(羟基亚氨基)丙二酸二乙酯的钾盐根据公开步骤[KennethN.F.Shaw和Chis Nolan，J Org.Chem.，22，1668-1670(1957)]制备，如下方案15所示。
方案15
Figure G2008800247628D00621
16克(0.1摩尔)丙二酸二乙酯在17.5ml(0.3摩尔)冰乙酸中的溶液在0-5摄氏度下剧烈搅拌，同时将20.7克NaNO2(0.3摩尔)在250ml水中的溶液在3-4小时过程中滴加。去除冰浴并将混合物剧烈搅拌另外20小时。硝化反应在具有合适的接头和用于氮氧化物脱逸的小排气口的三颈烧瓶中进行。反应混合物用400ml并随后用三次100ml部分的DCM提取。将合并的DCM提取物在无水Na2SO4上干燥。DCM在真空下去除并将所得油状产物溶解在400ml DCM中，用无水K2CO3(32克)搅拌15分钟和过滤，并将DCM浓缩至200ml。然后加入醚直至溶液变浑浊，并随后在冷冻机中保持过夜，得到米白色晶体，产率63.4％。
m.p.116-118摄氏度；
1H NMR(CDCl3)：δ＝1.24-1.29(q，6H，2CH3)，4.20-4.29(m，4H，2CH2)ppm。
2-吡啶基羟基亚氨基乙腈的制备：
2-吡啶基羟基亚氨基乙腈根据公开步骤[Jan Izdebski，PolishJ.Chem.，53，1049-1057(1979)]制备，如下方案16所示。
方案16
Figure G2008800247628D00631
将亚硝酸钠(4.5克，0.065摩尔，在5ml水中)的溶液慢慢加入2.2克(0.019摩尔)2-吡啶基乙腈在4.5ml冰乙酸中的溶液。在12小时放置之后，将沉淀物过滤，用水洗涤，干燥并随后从乙醇中重结晶，得到产物，产率65％。
m.p 220-222摄氏度；
1H NMR(DMSO-d6)：δ＝7.45-7.52(IH)，7.87-7.90(2H)，8.67(d，1H)，14.12(OH)ppm。
实施例3
各种脲/亚铵型偶联剂的化学合成
1-((二甲基亚氨基)(吗啉)甲基)3-H-苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇盐六氟磷酸盐(HDMB)的制备：
Figure G2008800247628D00632
在0摄氏度下将4-((二甲基氨基)氯亚甲基)吗啉-4-亚铵六氟磷酸盐(6.45克)加入HOBt(20mmol，2.7克)和三乙胺(20mmol，2.8克)在DCM(50ml)中的溶液。反应混合物在该温度下搅拌和暖至室温过夜。将所得白色沉淀物过滤，用冷DCM洗涤，和从乙腈-醚中重结晶，得到白色晶体，88.27％产率(7.54克)。
m.p.：196-197摄氏度(分解)；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.22(s，3H，CH3)，3.51(s，3H，CH3)，3.66-3.88(m，4H，2CH2)，4.03-4.06(m，4H，2CH2)，7.65-7.96(dt，1H，ar)，7.86-7.92(dm，2H，ar )，7.98.7.99(dd，1H，ar)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝41.76，42.23，50.81，51.51，66.19，66.41，109.99，114.56，127.52，133.54ppm。MS(MALDI，ACH基质)：m/z＝421.23
图1给出HDMB了的X-射线晶体结构显示其N-形式的偶联剂，而非O-形式，这意味着，苯并三唑部分通过一个三唑氮原子而不是通过氧原子(在已知的偶联剂，HBTU的情况下)直接连接到亚铵部分上。
1-((二甲基亚氨基)(吗啉代)甲基)3-H-6-氯苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇盐六氟磷酸盐(6-Cl-HDMB)的制备：
Figure G2008800247628D00641
6-Cl-HDMB是根据上述用于制备HDMB的方法，使用6-Cl-HOBt而非HOBt制备。产物在93.5％产率下得到。
m.p.：193-194摄氏度(分解)；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.31(s，3H，CH3)，3.69(s，3H，CH3)，3.94-3.951(m，4H，2CH2)，4.12-4.14(m，4H，2CH2)，7.96-8.03(qd，2H，ar)，8.12-8.13(dd，1H，ar)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝41.78，42.30，50.84，51.58，66.21，66.39，115.77，116.18，132.85，133.93，150.49ppm。
1-((二甲基亚氨基)(吗啉代)甲基)3-H-[1，2，3]三唑[4，5-b]吡啶-1-3-醇盐六氟磷酸盐(HDMA)的制备：
Figure G2008800247628D00651
HDMA根据上述用于制备HDMB的方法，使用HOAt而非HOBt制备。白色固体从乙腈-醚中重结晶，得到白色晶体，91％产率。
m.p.194-195摄氏度(分解)；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.27(s，3H，CH3)，3.64(s，3H，CH3)，3.85-3.89(m，4H，2CH2)，4.00-4.07(m，4H，2CH2)，7.93-7.96(dd，1H，ar)，8.44-8.47(dd，1H，ar)，8.76-8.77(dd，1H，ar)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝41.74，42.35，50.82，51.58，66.19，66.42，124.37，127.84，149.65ppm；MS(MALDI，ACH基质)：m/z＝422.2。
1-((二甲基亚氨基)(吗啉代)甲基)3-H-[1，2，3]三唑[2，3-b]吡啶-1-鎓-3-醇盐六氟磷酸盐(4-HDMA)的制备：
Figure G2008800247628D00652
4-HDMA根据上述用于制备HDMB的方法，使用4-HOAt而非HOBt制备。白色固体从乙腈-醚中重结晶，得到浅黄色固体，产率88.9％(7.5克)，
m.p.：208-210摄氏度(分解)；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.30(s，3H，CH3)，3.71(s，3H，CH3)，3.75-4.02(m，4H，2CH2)，4.11-4.16(m，4H，2CH2)，7.86-7.89(dd，1H，ar)，8.58-8.61(dd，1H，ar)，9.09-9.11(dd，1H，ar)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝42.09，42.52，50.66，51.78，66.14，123.25，126.34，155.36ppm。
1-((二甲基亚氨基)(吗啉代)甲基)3-H-6-三氟甲基苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇盐六氟磷酸盐(6-CF3HDMB或6-HDMFB)的制备：
Figure G2008800247628D00661
6-CF3HDMB根据上述用于制备HDMB的方法，使用6-CF3-HOBt而非HOBt制备。产物在81.5％产率下得到。
m.p.：194-195摄氏度；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.34(s，3H，CH3)，3.72(s，3H，CH3)，3.95-3.961(m，4H，2CH2)，4.08-4.15(m，4H，2CH2)，8.24-8.27(qd，2H，ar)，8.43(t，1H，ar)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝41.84，42.42，50.88，51.66，66.21，66.35，114.45，116.35，129.9，150.47ppm。
1-((二甲基氨基)(吗啉代))吡咯烷-2，5-二酮亚甲基亚铵六氟磷酸盐(HDMS)的制备：
Figure G2008800247628D00662
HDMS根据上述用于制备HDMB的方法，使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)而非HOBt制备。白色固体从乙腈-醚中重结晶，得到产物，78％产率。
m.p.：192-194摄氏度；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.03(s，4H，2CH2)，3.35(s，6H，2CH3)，3.82-3.85(m，8H，4CH2)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝25.88，49.42，65.78，161.5，170.16ppm。
1-((二甲基氨基)(吗啉代))氧基五氟苯基亚甲基亚铵六氟磷酸盐(HDMPfp)的制备：
Figure G2008800247628D00671
HDMPfp根据上述用于制备HDMB的方法，使用五氟苯酚(Pfp-OH)而非HOBt制备。产物在91％产率下得到。
m.p.：202-203摄氏度；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.38(s，6H，CH3)，3.80-3.83(m，4H，CH2)，3.86-3.89(m，4H，2CH2)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝40.58，49.25，65.69，159.72ppm。
四甲基脲/亚铵型偶联试剂的制备-一般步骤D：
在0摄氏度下将如上在方案4中制备的氯亚铵盐(20mmol)加入离去基团羟基-前体的钾盐(在方案17中表示为表示KOLi，20mmol)在乙腈(50ml)中的溶液。反应混合物在该温度下搅拌30分钟并在搅拌6小时的同时暖至室温。将所得沉淀物过滤并用乙腈洗涤，将溶剂在减压下浓缩至小体积(1/4)，并随后加入干醚，得到产物，通常为纯态的白色固体。
方案17
Figure G2008800247628D00672
1，1，3，3-四甲基-2-(2-氧代吡啶-1(2H)-基)异脲六氟磷酸盐(HTOP)的制备：
Figure G2008800247628D00681
1，1，3，3-四甲基-2-(2-氧代吡啶-1(2H)-基)异脲六氟磷酸盐(HTOP)根据一般步骤D制备，和得到白色固体，产率85.6％(6.08克)。
m.p.204-205摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝3.12(s，12H，4CH3)，6.49(d，1H)，6.74(dd，1H)，7.63(td，1H)，8.42(dd，1H)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝40.76，107.11，122.05，135.98，142.14，156.66，162.22ppm。
O-[氰基(乙氧基羰基)甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HTOCC)的制备：
Figure G2008800247628D00682
O-[氰基(乙氧基羰基)甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐根据一般步骤D制备，和得到白色固体，产率82.1％(6.32克)，
m.p.135-137摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝1.37(1，3H，CH3)，3.37(s，12H，4CH3)，4.82(q，2H，CH2)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝13.46，40.71，64.56，106.78，135.09，156.11，161.43ppm。
O-[(二氰基甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HTODC)的制备：
Figure G2008800247628D00691
O-[(二氰基甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HTODC)根据一般步骤D制备，和得到白色固体，产率74.0％(5.0克)。
m.p.180-181摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝3.27(s，12H，4CH3)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝40.80，105.10，108.21，119.65，160.67ppm。
O-[(二乙氧基羰基甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HTODeC)的制备：
Figure G2008800247628D00692
O-[(二乙氧基羰基甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HTODeC)根据一般步骤D制备，和得到浅黄色油，产率84.5％。
1H NMR(CDCl3)：δ＝1.35(t，6H，2CH3)，3.18(s，12H，4CH3)，4.39-4.48(q，4H，2CH2)ppm。
二甲基吗啉代脲/亚铵型偶联试剂的制备-一般步骤E：
一系列二甲基吗啉代脲/亚铵型偶联试剂的制备如下方案18所示而进行。
方案18
Figure G2008800247628D00701
1-(N-甲基-N-吗啉代亚甲基)-(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基1)甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMOP)的制备：
Figure G2008800247628D00702
1-(N-甲基-N-吗啉代亚甲基)-(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基1)甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMOP)根据一般步骤E制备，和的白色固体，产率78.1％(6.2克)。
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝3.21(s，6H，2CH3)，3.51(brs，4H，2CH2)，3.61-3.64(m，4H，2CH2)，6.44(td，1H)，6.71(dd，1H)，7.58(td，1H)，8.13(dd，1H)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝49.33，65.47，106.98，122.22，134.98，141.73，156.94，162.06ppm。
1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMOCC)的制备：
Figure G2008800247628D00711
1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基1氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMOCC)根据一般步骤E制备，和得到白色晶体，产率88.8％(7.6克)。
m.p.143-144摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝1.38(t，3H，CH3)，3.41(s，6H，2CH3)，3.82(t，4H，2CH2)，3.89(t，4H，2CH2)，4.48(q，2H，CH2)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝13.48，40.70，49.94，64.59，66.04，106.76，135.03，156.14，160.61ppm。
1-[(1-(二氰基亚甲基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMODC)的制备：
Figure G2008800247628D00712
1-[(1-(二氰基亚甲基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMODC)根据一般步骤E制备，和得到白色固体，产率74.8％(5.7克)，
m.p.118-119℃；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝3.42(s，6H，2CH3)，3.80-3.88(m，8H，4CH2)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝40.97，49.93，65.92，105.13，108.15，119.84，159.77ppm。
1-[(1，3-二乙氧基-1，3-二氧代丙烷-2-叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMODeC)的制备：
Figure G2008800247628D00721
1-[(1，3-二乙氧基-1，3-二氧代丙烷-2-叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMODeC)根据一般步骤E制备，和得到浅黄色油，产率84.3％。
1H NMR(CDCl3)：δ＝1.35(t，6H，2CH3)，3.21(s，6H，2CH3)，3.35(t，2H，CH2)，3.61(t，2H，CH2)，3.78(t，2H，CH2)，3.87(t，2H，CH2)，4.37-4.50(q，4H，2CH2)ppm。
二甲基吡啶基脲/亚铵型偶联试剂的制备-一般步骤F：
一系列二甲基吡啶基脲/亚铵型偶联试剂的制备如下方案19所示使用与以上方案17和方案18所示相同种类的离去基团部分(OL1)进行。
方案19
Figure G2008800247628D00722
6-氯-1-((二甲基氨基)(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸盐(6-Cl-HDmPyB)的制备：
6-氯-1-((二甲基氨基)(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸盐(6-Cl-HDmPyB)根据一般步骤F制备，和得到白色固体，产率88.6％(7.8克)。
m.p.192-193摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝1.98(bs，3H，CH3)，2.14(brs，3H，CH3)，2.70(t，4H，2CH2)，4.10(t，4H，2CH2)，7.83-7.84(m，2H，ar)，7.99(q，1H，ar)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝24.52，26.02，41.60，52.83，115.76，132.50，132.59，134.06，137.34，148.32ppm。
1-((二甲基氨基)(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐(HDmPyOP)的制备：
1-((二甲基氨基)(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐(HDmPyOP)根据一般步骤F制备，和得到白色固体，产率6.6g(86.7％)。
m.p.146-147摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝1.98-2.15(m，4H，2CH2)，3.06(s，6H，2CH3)，3.71-3.8O(m，4H，2CH2)，6.41(td，1H)，6.73(dd，1H)，7.50(td，1H)，7.94(dd，1H)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝25.16，39.77，51.25，106.70，122.04，135.40，156.73，159.84ppm。
1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吡咯烷亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDmPyOCC)的制备：
Figure G2008800247628D00732
1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吡咯烷亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDmPyOCC)根据一般步骤F制备，和得到白色固体，产率82.7％(6.8克)。
m.p.126-127摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝1.37(t，3H，CH3)，2.10，2.13(m，4H，2CH2)，3.36(s，6H，2CH3)，3.95-3.99(m，4H，2CH2)，4.48(q，2H，CH2)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝13.47，25.09，40.40，51.58，64.52，106.74，134.82，156.12，158.66ppm。
1-[(1-(二氰基甲叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吡咯烷亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDmPyODC)的制备：
Figure G2008800247628D00741
1-[(1-(二氰基甲叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吡咯烷亚甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDmPyODC)根据一般步骤F制备，和得到浅黄色固体，产率74％(5.4克)，
m.p.146-147摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝1.97-2.00(m，4H，2CH2)，3.28(s，6H，2CH3)，3.96-4.04(m，4H，2CH2)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝25.07，40.41，51.77，105.06，108.23，119.30，157.86ppm。
吡咯烷吗啉代脲/亚铵型偶联试剂的制备-一般步骤G：
一系列二甲基吡啶基脲/亚铵型偶联试剂的制备如下方案20所示使用与以上方案18所示相同种类的离去基团部分(OL1)进行。
方案20
Figure G2008800247628D00742
1-(吗啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸盐(HMPyB)的制备：
Figure G2008800247628D00751
1-(吗啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-7H-苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸盐(HMPyB)根据一般步骤G制备，和得到白色固体，产率82.8％(7.4克)。
mp 203-204摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝2.12-2.15(m，2H，CH2)，2.16-2.29(m，2H，CH2)，3.42-3.58(m，2H，CH2)，3.80-4.26(m，1OH，5CH2)，7.75(td，1H)，7.97-8.02(m，2H)，8.07(d，1H)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝25.09，41.76，42.23，50.81，51.51，66.19，66.41，109.99，114.56，127.52，143.54ppm。
1-(吗啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H-[1，2，3]三唑[4，5-I]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HMPyA)的制备：
Figure G2008800247628D00752
1-(吗啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-7H-[1，2，3]三唑[4，5-I]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HMPyA)根据一般步骤G制备，和得到白色固体，产率81.3％(7.3克)。
mp 206-208摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝2.11-2.15(m，2H，CH2)，2.18-2.30(m，2H，CH2)，3.48-3.63(m，2H，CH2)，3.79-4.16(m，1OH，5CH2)，8.02(dd，1H)，8.53(dd，1H)，8.85(dd，1H)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝25.09，41.74，42.35，50.82，51.58，66.19，66.42，124.37，127.84，149.65ppm。
5-氯-1-(吗啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸盐(6-HMPyCB)的制备：
Figure G2008800247628D00761
5-氯-1-(吗啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸盐(6-荕PyCB)根据一般步骤G制备，和得到白色固体，产率82.7％(7.96克)。
m.p.217-218摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝2.10-2.15(m，2H，CH2)，2.19-2.29(m，2H，CH2)，3.45-3.65(m，2H，CH2)，3.81-4.09(m，1OH，5CH2)，7.99(d，1H)，8.02(d，1H)，8.12(dd，1H)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝25.93，52.89，53.36，66.09，66.42，115.79，115.84，132.57，132.62，134.06，134.12，147.38ppm。
1-(吗啉代(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐(HMPyOP)的制备：
1-(吗啉代(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐(HMPyOP)根据一般步骤G制备，和得到白色固体，产率70％(5.9克)。
m.p.145-146摄氏度(分解)；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝2.05-2.13(m，4H，2CH2)，3.54(t，4H，2CH2)，3.65(t，4H，2CH2)，3.94-3.98(m，4H，2CH2)，6.85(dd，1H)，7.72(td，1H)，8.21(dd，1H)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝25.16，39.77，51.25，52.87，106.70，122.04，135.44，156.76，159.94ppm。
1-((1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)(吗啉代)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐(HMPyOCC)的制备：
Figure G2008800247628D00771
1-((1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)(吗啉代)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐(HMPyOCC)根据一般步骤G制备，和得到白色固体，产率90.3％(8.2克)，mp 171-172摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝1.26(t，3H，CH3)，1.98-2.02(m，4H，2CH2)，3.65-3.68(m，4H，2CH2)，3.74-3.76(m，4H，2CH2)，3.84-3.87(m，4H，2CH2)，4.37-4.40(q，2H，CH2)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝13.49，25.09，49.20，51.57，55.98，51.76，64.54，66.06，106.69，134.63，156.11，157.88ppm。
1-((二氰基亚甲基氨基氧基)(吗啉代)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐(HMPyODC)的制备：
Figure G2008800247628D00772
1-((二氰基亚甲基氨基氧基)(吗啉代)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐(HMPyODC)根据一般步骤G制备，和得到浅黄色固体，产率78.6％(6.4克)。
m.p.158-159摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝2.11-2.14(m，4H，2CH2)，3.79.3.85(m，4H，2CH2)，3.86-3.88(m，4H，2CH2)，3.98-4.01(m，4H，2CH2)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝25.28，49.15，65.95，105.07，108.17，119.48，157.00ppm。
2-氰基-2-(二苯氧基磷酰基氧基亚氨基)乙酸乙酯的制备：
2-氰基-2-(二苯氧基磷酰基氧基亚氨基)乙酸乙酯的制备根据公开步骤[F.Hoffmann，L.Jager，C.Criehl，磷，硫，和硅，178，299-309(2003)]修改和如下方案21所示而进行。
方案21
Figure G2008800247628D00781
TEA(1.3ml，10mmol)在氩气氛下加入氯磷酸二苯基酯(2.69克，10mmol)和相应添加剂(10mmol)在无水THF(50ml)中的溶液。在室温下搅拌3小时之后，将反应混合物过滤并将溶剂在减压下去除。所得油用n-戊烷洗涤和在真空下干燥。所得产物为油，产率64.5％(2.42克)。
1H NMR(CDCl3)：δ＝1.41(t，3H，CH3)，4.47(q，2H，CH2)，7.22-7.44(m，1OH，2Ph)ppm。
含2-吡啶基乙腈肟的偶联试剂的制备-一般步骤H：
一系列含2-吡啶基乙腈肟的偶联试剂的制备按照如下方案22所示而进行。
方案22
Figure G2008800247628D00782
N-[(氰基(吡啶-2-基)亚甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亚甲基)-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HTOPC)的制备：
Figure G2008800247628D00783
N-[(氰基(吡啶-2-基)亚甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亚甲基)-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HTOPC)根据一般步骤H制备，和得到浅微红色棕色固体，产率82.7％(6.2克)。
m.p.169-171摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.30(s，12H，4CH3)，7.57-7.61(m，1H)，7.94(td，1H)，8.10(dd，1H)，8.70(dd，1H)ppm。
13C NMR(丙酮-d6)δ＝40.48，107.56，122.52，127.87，138.18，142.46，146.67，150.68，162.03ppm。
N-[(氰基(吡啶-2-基)亚甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亚甲基)-N-吗啉代甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMOPC)的制备：
Figure G2008800247628D00791
N-[(氰基(吡啶-2-基)亚甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亚甲基)-N-吗啉代甲酰胺鎓六氟磷酸盐(HDMOPC)根据一般步骤H制备，和得到浅棕色固体，产率89.4％(7.74克)。
m.p.154-155摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝3.34(s，12H，4CH3)，3.79-3.83(m，8H，4CH2)7.58-7.62(m，1H)，7.96(td，1H)，8.12(dd，1H)，8.71(dd，1H)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)δ＝40.76，49.79，66.13，107.60，122.53，127.92，138.23，142.74，146.63，150.69，161.06ppm。
4-((二甲基氨基)氟亚甲基)吗啉-4-亚铵六氟磷酸盐(DFMH)的制备：
Figure G2008800247628D00792
DFMH通过将根据上述和用于制备DCMH的一般步骤C制备的4-((二甲基氨基)氯亚甲基)-吗啉-4-亚铵六氟磷酸盐(DCMH)用在乙腈中的KF处理而得到，90％产率。
m.p.：92-93摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝3.31(d，6H，2CH3)，3.70-3.81(m，4H，2CH2)3.84-3.86(m，4H，2CH2)ppm；
13C NMR(丙酮-d6)：δ＝39.15，48.11，65.57，157.09ppm。
4-(氯(吗啉代)亚甲基)吗啉-4-亚铵六氟磷酸盐(CMMH)的制备：
Figure G2008800247628D00801
CMMH根据以上描述和用于制备DCMH的一般步骤C，使用二吗啉代甲酮而得到，产率72.6％(白色晶体)。
m.p.：136-137摄氏度；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝3.27(t，8H，4CH2)，3.68(t，8H，4CH2)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝47.44，66.60，163.99ppm。
4-(氟(吗啉代)亚甲基)吗啉-4-亚铵六氟磷酸盐(FMMH)的制备：
FMMH通过处理根据上述一般步骤C制备的4-(氯(吗啉代)亚甲基)吗啉-4-亚铵六氟磷酸盐(CMMH)而得到，84％产率。
m.p.：168-170摄氏度；
1H NMR(丙酮-d6)：δ＝3.21-2.38(m，8H，4CH2)，3.61(t，8H，4CH2)ppm。
HDTMA的制备：
Figure G2008800247628D00811
在0摄氏度下将4-((二甲基氨基)氯亚甲基)硫代吗啉-4-亚铵六氟磷酸盐(20mmol)加入HOAt(20mmol，2.72克)，和三乙胺(20mmol)在DCM(50ml)中的溶液。反应混合物在0摄氏度下在N2下搅拌，和然后温度暖至室温过夜。将浅黄色固体过滤和用冷DCM洗涤和从乙腈-醚中重结晶，得到白色晶体，76％产率。
m.p.：197-199摄氏度(分解)；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝2.76-2.77(m，1H，CH)，2.97-3.01(dt，1H，CH)，3.14-3.23(m，2H，CH2)，3.56(s，3H，CH3)，3.71(s，3H，CH3)，3.72-3.73(dt，1H，CH)，3.96-4.00(dt，1H，CH)，4.11-4.18(m，1H，CH)，4.39-4.458(dt，1H，CH)，8.00-8.03(dd，1H，ar)，8.47-8.50(dd，1H，ar)，8.84-8.85(dd，1H，ar)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝14.70，27.02，38.75，45.47，59.72，120.50，128.75，135.17，140.23，150.20ppm。
HDTMB的制备：
Figure G2008800247628D00812
HDTMB根据上述用于制备HDTMA的方法，但使用HOBt而非HOAt制备。白色晶体通过从乙腈-醚中重结晶而得到，80％产率。
m.p.190-191摄氏度(分解)；
1H NMR(CD3COCD3)：δ＝2.67-2.70(m，1H，CH)，2.91-2.96(m，1H，CH)，2.97(s，3H，CH3)，3.33-3.48(m，5H，CH2，CH3)，3.65-3.69(m，1H，CH)，3.88-3.95m，1H，CH)，4.09-4.12(m，1H，CH)，8.00-8.03(dd，1H，ar)，7.68-7.72(td，1H，ar)，7.86-7.88(d，1H，ar)，7.93-7.97(d，1H，ar)，8.08(d，1H，ar)ppm；
13C NMR(CD3COCD3)：δ＝14.70，27.28，40.61，40.82，42.82，43.09，52.94，53.17，115.44，116.46，127.94，133.60，150.79ppm。
实施例4
肽-偶联剂的表征
氧对偶联剂的溶解度的影响：
各种已知的和新型肽-偶联剂的最大溶解度在DMF中测试以评估其参与溶液-和固体-载体肽形成反应的能力。表4给出了测试的偶联剂(已知的或新的)的名称，其化学结构，每体积DMF的试剂质量和在DMF中的计算摩尔浓度。
表4
Figure G2008800247628D00831
Figure G2008800247628D00841
从表4可以看出，本文给出的质子受体亚铵型偶联剂明显比其碳衍生物相应物更可溶。
二肽Z-Phg-Pro-NH2的溶液合成：
新型亚铵型肽-偶联剂用于偶联两个氨基酸而不造成其外消旋的能力在溶液中测试。苄基氧基羰基(Z)-保护苯基甘氨酸(Z-Phg-OH)与H-Pro-NH2在DMF中在碱和偶联剂的存在下溶液偶联得到Z-Phg-Pro-NH2，这用于将新的和已知的肽-偶联剂的分级，和测定Phg残基外消旋的程度并用作分级标准。
表5给出了偶联剂的名称，用于反应的碱的种类和量，偶联反应的产率和在DMF中形成Z-Phg-Pro-NH2(溶液相合成)时造成的外消旋。
表5
Figure G2008800247628D00851
Figure G2008800247628D00861
Figure G2008800247628D00871
Figure G2008800247628D00881
Figure G2008800247628D00891
DIEA＝二异丙基乙胺；和TMP＝2，4，6-三甲基吡啶(可力丁)。
从表5可以看出，本文给出的新型质子受体亚铵型偶联剂与其碳相应物衍生物相比造成较小的外消旋，同时在其肽键形成能力上更有效。例如，6-Cl-HOBt，6-CF3-HOBt，和HONCC的衍生物在减少外消旋方面比类似HOAt偶联剂明显更有效，在相同时间提供较好的产率。这些结果清楚地表明，本文给出的新型偶联剂优于其目前已知的相应物。
以上表5中给出的结果强调了偶联剂的亚铵部分中的质子受体的存在所造成的明显影响，与类似已知的偶联剂(其与新偶联剂的差异仅在于结构特点)相比。因此，这些结果应该被认为比较了偶联剂对，新试剂对已知的相应物：
HDMA(新的)/HDTMA(新的)对HATU(已知的)；
HDMB(新的)/HDTMB(新的)对HBTU(已知的)；
6-Cl-HDMB(新的)对6-Cl-HBTU(已知的)；
DFMH(新的)对TFFH(已知的)；和
DCMH(新的)对TCFH(已知的)。
本文给出的偶联剂的相比目前已知的偶联剂的惊人益处通过分离和比较这些结果而表达。
表5A
  偶联试剂   碱(当量)   产率(％)   DL(％)
  HDMB   DIEA(2)TMP(2)DIEA(1)   80.879.982.3   3.87.83.1
  HDTMB   DIEA(2)   81.3   3.5
  HBTU   DIEA(2)TMP(2)DIEA(1)   80.281.275.0   8.26.45.3
  HDMA   DIEA(2)TMP(2)DIEA(1)   81.280.382.3   1.63.91.6
  HDTMA   DIEA(2)   83.0   2.1
  HATU   DIEA(2)TMP(2)DIEA(1)   78.477.974.8   3.12.12.4
  HDMOCC   DIEA(2)TMP(2)   88.291.0   0.120.90
  HDMODC   DIEA(2)   90.1   0.40
表5A中的结果分离和比较了HDMB和HDTMB与HBTU，和HDMA和HDTMA与HATU，和清楚地表明，在使用二异丙基乙胺作为碱用于偶联反应时，吗啉(HDMB和HDMA)或硫代吗啉基团(HDTMA和HDTMB)对二甲基团(HBTU和HATU)在外消旋抑制和产率方面的有益效果。
该效果在考虑偶联剂DCMH和DFMH(新的)对TCFH和TFFH(已知的)时甚至更明显。
表5B
  偶联试剂   碱(当量)   产率(％)   DL(％)
  DCMH   DIEA(2)(无预活化)   81.9   6.9
  TCFH   DIEA(2)(无预活化)   80.0   29.9
  偶联试剂   碱(当量)   产率(％)   DL(％)
  DFMH   DIEA(2)(无预活化)   82.6   4.9
  TFFH   DIEA(2)(无预活化)   80.1   7.1
表5B中给出的结果分离和比较了DCMH与TCFH，和DFMH与TFFH，和清楚地表明吗啉(DCMH和DFMH)对二甲基(TCFH和TFFH)在外消旋抑制和产率方面的有益效果。
三肽Z-Phe-Val-Pro-NH2的溶液合成：
新型亚铵型肽-偶联剂用第三残基延长二肽的能力在DMF中在Z-Phe-VaI-OH与H-PrO-NH2在碱存在下的溶液相偶联反应中测试，该反应得到三肽Z-Phe-VaI-PrO-NH2。测定缬氨酸残基的外消旋的程度和用作分级标准。
表6给出了偶联剂的名称，用于反应的碱的种类和量，偶联反应的产率和在DMF中形成Z-Phe-Val-Pro-NH2(2+1)(溶液相合成)过程中造成的外消旋。
表6
  偶联试剂   碱(当量)   产率(％)  LDL(％)
  HDMA(新的)   TMP(2)   86.2  3.7
  HDMA(新的)   TMP(1)   84.1  3.8
  HATU(已知的)   TMP(1)   76.1  4.9
  HDMA(新的)   DIEA(1)   87.4  5.1
  HATU(已知的)   TMP(2)   78.0  5.3
  HDMA(新的)   DIEA(2)   89.3  10.5
  HDMB(新的)   TMP(1)   80.1  10.5
  HATU(已知的)   DIEA(1)   83.2  11.0
  HDMB(新的)   DIEA(1)   86.3  11.5
  HDMB(新的)   TMP(2)   87.1  13.3
  HATU(已知的)   DIEA(2)   85.8  13.9
  6-Cl-HDMB(新的)   DIEA(1)   79.9  13.9
  偶联试剂   碱(当量)   产率(％)  LDL(％)
  HBTU(已知的)   TMP(2)   81.2  14.2
  HBTU(已知的)   DIEA(1)   78.6  16.3
  HDMB(新的)   DIEA(2)   88.7  20.3
  HBTU(已知的)   DIEA(2)   89.7  27.7
  HDMOCC(新的)   TMP(2)   89.8  8.0
  HDMOCC(新的)   TMP(1)   90.3  3.5
  HDmPyOCC(新的)   TMP(2)   88.0  7.9
  HMPyOCC   TMP(2)   91.0  10.2
DIEA＝二异丙基乙胺；和TMP＝2，4，6-三甲基吡啶(可力丁)。
从表6可以看出，本文给出的新型质子受体亚铵型偶联剂与其碳相应物相比造成明显较少的外消旋，同时至少在其肽键形成能力上有效。
本文给出的具有质子受体的偶联剂相比不具有质子受体但其他方面相同的目前已知的偶联剂的惊人益处通过分离和比较这些结果而带来。
表6A
  偶联试剂   碱(当量)   产率(％)   LDL(％)
  HDMA   DIEA(2)DIEA(1)TMP(2)TMP(1)   89.387.486.284.1   10.55.13.73.8
  HATU   DIEA(2)DIEA(1)TMP(2)TMP(1)   85.883.278.076.1   13.911.05.34.9
  HDMB   DIEA(2)DIEA(1)TMP(2)TMP(1)   88.786.387.180.1   20.311.513.310.5
  偶联试剂   碱(当量)   产率(％)   LDL(％)
  HBTU   DIEA(2)DIEA(1)TMP(2)   89.778.681.2   27.716.314.2
  HDMOCC   DIEA(2)TMP(2)TMP(2)   91.389.890.3   19.37.03.5
表6A中给出的结果分离和比较了HDMB与HBTU，和HDMA与HATU，和清楚地表明吗啉基团(HDMB和HDMA)对二甲基团(HBTU和HATU)在外消旋抑制和产率上有益效果。可以看出，肟衍生物，HDMOCC在与HOBt衍生物相比时是有利的。
五肽H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2的合成：
五肽H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2通过溶液相合成使用新型肽-偶联剂HDMB和Boc-保护的氨基酸(除了最后一个，Fmoc-Tyr(OtBu)-OH)制备。在反应结束时，Fmoc-基团通过使用在乙腈中的30％二乙胺1小时去除并将而粗肽用TFA-DCM(1∶1)在室温下处理2小时。
图2给出了五肽Tyr-Gly-Gly-Phe-LeU-NH2所得的HPLC色谱图。从图2可以看出，优异产物纯度的最终产物使用HDMB作为偶联剂而得到。
Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-NH2在固相中的合成
挑战性地将一个α-氨基异丁酸残基与另一残基偶联(Aib-Aib)的肽Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-NH2在固相使用Fmoc保护氨基酸在碱DIEA(2当量)的存在下合成。不能形成Aib-Aib肽键的程度，即在五肽的固相组装过程中(Tyr-Aib-Aib-Phe-LeU-NH2)五肽对(Tyr-Aib-Phe-Leu-NH2)四肽形成的比率用于评估偶联剂的效力。
表7给出了偶联剂的名称，五肽占总粗品的百分数和四肽占总粗品的百分数。
表7
  偶联试剂   五肽(％)   四肽(％)
  6-Cl-HDMB(新的)   98.7   1.3
  HDMA(新的)   98   ＜1
  HDMB(新的)   89   10
  HATU(已知的)   83   17
  HBTU(已知的)   47   53
从表7可以看出，新型质子受体亚铵型偶联剂明显比其碳相应物更有效地用于包含挑战性立体位阻偶联反应的肽的固相合成。五肽产率一致性地高于使用已知的偶联剂所得的。
酰基载体蛋白质(ACP)的(60-74)链段的15-聚体的合成：
肽H-Glu-Lys-Ile-Thr-Thr-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-NH2(15-聚体肽)手工在Fmoc-Rink酰胺-AM-树脂上使用Fmoc-保护氨基酸伸长。偶联时间是30分钟，过量试剂是3当量，和过量碱DIEA是6当量。
表8给出了通过反-相HPLC分析测定的所得肽的纯度。
表8
  偶联试剂   15-聚体肽(％)
  HDMA(新的)   63.6
  6-CI-HDMB(新的)   62.9
  HDMB(新的)   61.6
  HBTU(已知的)   48.3
  HATU(已知的)   44.5
  HDMOCC(新的)   79.4
从表8可以看出，新型质子受体亚铵型偶联试剂在15-聚体肽的固相合成方面明显优于其对应物。
尽管本发明已结合其特定实施方案描述，但本领域熟练技术人员显然得出许多替代物，变型和变化。因此，所有这些变化，改变，和变型意味着落入所附权利要求的主旨和宽范围内。
在本说明书中提及的所有出版物，专利和专利申请在此作为参考完全并入本发明，如同每一出版物，专利或专利申请被特定地和各个地指出要作为参考并入本发明。另外，对本申请中的任何参考文件的引用或确认不应理解为，这些参考文件被认为可用作本发明的已有技术。关于所使用的章节，它们不应被理解为必然性限定。

Claims (42)

1.一种具有选自以下的通式的偶联剂：
Figure F2008800247628C00011
结构式I    结构式II
其中：
A是无机阴离子；
L是离去基团；
n是整数1至4，
每一R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分别独立地连接形成杂脂环族部分，前提是：至少一个R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基和/或至少一个R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6连接形成杂脂环族部分。
2.权利要求1的偶联剂，其中所述杂原子选自O，S，N，P和B。
3.权利要求1的偶联剂，其中所述杂脂环族部分选自吡咯烷，哌啶，吗啉，硫代吗啉，咪唑烷，氮杂膦烷，氮杂磷烷，氮杂烃基硼烷，氮杂硼烷，氮杂膦烷，氮杂磷烷和哌嗪。
4.权利要求3的偶联剂，其中所述杂脂环族部分是吗啉。
5.权利要求1的偶联剂，其中所述无机阴离子选自卤化物，六卤代磷酸盐，六卤代锑酸盐，四卤代硼酸盐，三卤代甲烷磺酸盐和二(三卤代甲基磺酰基)酰亚胺。
6.权利要求1的偶联剂，其中所述无机阴离子是六氟磷酸盐。
7.任一权利要求1-6的偶联剂，其中所述离去基团选自卤代，乙酸盐，甲苯磺酸盐，三氟磺酸盐，磺酸盐，叠氮化物，羟基，硫代羟基，烷氧基，氰酸盐，硫氰酸盐，硝基，氰基，苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亚胺，酮肟，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，咪唑，吲哚啉酮-1-氧基，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
8.权利要求7的偶联剂，其中所述苯并三唑具有通式III：
Figure F2008800247628C00021
结构式III
其中：
X是O或S；
Z1和Z2分别独立地是CH或N；和
Z3是F，Cl，Br，CF3或NO2。
9.权利要求7的偶联剂，其中所述苯并三嗪酮具有通式IV：
Figure F2008800247628C00022
式IV
其中X是O或S。
10.权利要求7的偶联剂，其中所述琥珀酰亚胺具有通式V：
Figure F2008800247628C00023
结构式V
其中X是O或S。
11.权利要求7的偶联剂，其中所述酮肟具有通式VI：
Figure F2008800247628C00031
结构式VI
其中：
Z4和Z5分别独立地选自F，Cl，Br，CORa，COORa，CONRa，CN，CF3或NO2；和
Ra是烷基。
12.权利要求7的偶联剂，其中所述吡啶-2(1H)-酮-1-氧基具有通式VII：
Figure F2008800247628C00032
结构式VII
13.权利要求7的偶联剂，其中所述喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基具有通式VIII：
Figure F2008800247628C00033
结构式VIII
其中：
Z6和Z7分别独立地选自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
14.权利要求7的偶联剂，其中所述1H-苯并[d]咪唑-1-氧基具有通式IX：
结构式IX
其中：
Z1是CH或N；
Z8和Z9分别独立地选自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
15.权利要求7的偶联剂，其中所述吲哚啉酮-1-氧基具有通式X：
Figure F2008800247628C00042
结构式X
其中：
Z10选自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
16.权利要求8的偶联剂，其中：X是O或S；
Z1和Z2分别为CH；和Z3是Cl。
17.权利要求16的偶联剂，其中X是O。
18.权利要求16的偶联剂，其中：X是O或S；
Z1和Z2分别为CH；和Z3是CF3或NO2。
19.权利要求18的偶联剂，其中：X是O；和
Z3是CF3或NO2。
20.权利要求11的偶联剂，其中：
Z4是COORa；Ra是乙基；和Z5是CN。
21.权利要求11的偶联剂，其中：Z4和Z5分别独立地是COORa或CN；和Ra是甲基。
22.权利要求13的偶联剂，其中：Z6是CH3；和
Z7是Cl。
23.权利要求14的偶联剂，其中Z1是CH；
Z6是苯基；和Z7是H或Cl。
24.权利要求14的偶联剂，其中Z1是N；
Z6是甲基；和Z7是H。
25.一种选自以下的偶联剂：
Figure F2008800247628C00051
Figure F2008800247628C00061
Figure F2008800247628C00071
Figure F2008800247628C00111
Figure F2008800247628C00121
26.一种制备权利要求1的偶联剂的方法，该方法包括将具有选自以下的通式的化合物：
Figure F2008800247628C00122
结构式XI    结构式XII
其中：每一R1，R2，R3，R4，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分别独立地连接形成杂脂环族部分，前提是：至少一个R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基和/或至少一个R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6连接形成杂脂环族部分；和n是整数1至4；与：
(i)卤化剂；和
(ii)所述无机阴离子的饱和水溶液接触；这样得到权利要求1的偶联剂，其中L是卤代。
27.权利要求26的方法，进一步包括，在所述接触之前：将具有通式XIII的化合物：
Figure F2008800247628C00131
结构式XIII
其中每一R1和R2独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R1和R2连接形成杂脂环族部分；与具有通式XIV的化合物：
Figure F2008800247628C00132
结构式XIV
其中每一R3和R4独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R3和R4连接形成杂脂环族部分；在碱的存在下反应，这样得到具有通式XI的化合物；或与具有通式XV的化合物：
Figure F2008800247628C00133
结构式XV
其中：每一R3，R5和R6独立地选自具有1-4个碳原子的烷基和被至少一个杂原子中断，取代和/或封端的具有1-4个碳原子的烷基，或R5和R6连接形成杂脂环族部分；n是整数1至4；在碱的存在下反应，这样得到具有通式XII的化合物。
28.权利要求26的方法，进一步包括：将其中L是卤代的所述偶联剂与所述离去基团的前体化合物在三乙胺的存在下反应。
29.权利要求28的方法，其中所述离去基团选自乙酸盐，甲苯磺酸盐，三氟甲磺酸盐，磺酸盐，叠氮化物，羟基，硫代羟基，烷氧基，氰酸盐，硫氰酸盐，硝基，氰基，苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亚胺，酮肟，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，咪唑，吲哚啉酮-1-氧基，五氟苯酚，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
30.一种合成肽的方法，该方法包括：将多个氨基酸顺序地，一个接一个地，在权利要求1的偶联剂的存在下偶联，这样得到包含所述多个氨基酸的肽。
31.权利要求30的方法，其中每个偶联步骤的外消旋比率是8％至0.3％。
32.权利要求30的方法，其中每个偶联步骤的偶联产率偶联是80％至99％。
33.一种合成多核苷酸的方法，该方法包括：
将多个核苷酸顺序地，一个接一个地，在权利要求1的偶联剂的存在下偶联，这样得到包含所述多个核苷酸的多核苷酸。
34.任一权利要求30或33的方法，通过固相合成而进行。
35.任一权利要求30或33的方法，通过溶液相合成而进行。
36.肽的粗组合物，所述肽在C-末端至N-末端方向上由多个氨基酸合成，所述组合物基本上由具有所需氨基酸顺序的肽和具有非所需氨基酸顺序且为所述所需氨基酸顺序的所述肽的杂质的多个肽组成，其中具有所述所需氨基酸顺序的所述肽在所述组合物中的浓度比具有所述所需氨基酸顺序的相同肽在所述C-末端至N-末端方向上使用权利要求1的偶联剂作为偶联剂，在相同条件下合成的肽组合物中的浓度高至少5％。
37.权利要求36的肽的粗组合物，其形式选自粉状组合物，冻干组合物，键接至固体载体上的组合物，增溶组合物和溶解组合物。
38.任一权利要求31-36的方法或组合物，其中至少一种所述氨基酸选自具有仲α胺的氨基酸，具有叔α胺的氨基酸，具有取代的α碳原子的氨基酸，具有取代的α胺的氨基酸，具有含氨基的侧链的氨基酸，和其任何组合。
39.权利要求38的方法或组合物，其中所述α碳被烷基取代。
40.权利要求39的方法或组合物，其中具有取代的α碳原子的所述氨基酸是α-氨基异丁酸(Aib)。
41.权利要求38的方法或组合物，其中具有取代的α胺的所述氨基酸是苯基甘氨酸(Phg)。
42.权利要求38的方法或组合物，其中具有含氨基的侧链的所述氨基酸是精氨酸。
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Denomination of invention: Proton acceptor ammonium sulfite / carbon cationic coupling agent

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