CN106795186A - 吗啉代寡核苷酸的制备方法 - Google Patents

吗啉代寡核苷酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及吗啉代寡核苷酸的液相合成法，其包括使缩合反应的反应混合物经受萃取操作并将作为产物的吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧。根据本发明，可提供能够通过液相合成法高效且高收率地制备吗啉代寡核苷酸的方法。

Description

吗啉代寡核苷酸的制备方法
技术领域
本发明涉及吗啉代寡核苷酸的制备方法以及用作该制备方法的原料的吗啉代核苷酸。
背景技术
吗啉代寡核苷酸由于对DNA和RNA的亲和性高，具有对各种核酸酶的抗性，在机体内稳定，毒性也低，因此是作为反义寡核苷酸的使用备受注目的化合物(参照非专利文献1)。
作为吗啉代寡核苷酸的制备方法，报道了固相合成法和液相合成法(参照非专利文献2、专利文献1～5)。
固相合成法由于能够自动合成化，在速度方面有利。相反，设备上的限制使其规模扩大受限，另外由于反应性低，因此用于核苷酸延伸反应中的试剂单体需要过量使用，不适合工业化大量合成。另外，还存在难以确认中间步骤中的反应进行状况、难以解析中间体结构等缺点。
另一方面，液相合成法具有溶解性、后处理操作的复杂性等问题，难以大规模且快速地合成可用作反义药品的具有长链的吗啉代寡核苷酸。
[文献清单]
[专利文献]
专利文献1：WO 91/09033
专利文献2：WO 2008/008113
专利文献3：US 2009/0131632 A1
专利文献4：WO 2009/064471
专利文献5：WO 2012/043730
[非专利文献]
非专利文献1：Summerton，J.等，Antisense and Nucleic Acid DrugDevelopment，1997，Vol.7，p.187。
非专利文献2：Harakawa等，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2012，Vol.22，p.1445-1447
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供利用液相法高效且高收率地制备吗啉代寡核苷酸的方法、以及作为该方法的原料的新型吗啉代核苷酸。
用于解决问题的手段
本发明人注意到这样的事实，在液相中通过缩合反应制备吗啉代寡核苷酸的过程中，脱保护反应和缩合反应后通过沉淀来分离目标化合物的方法要求复杂的操作和大量操作时间，发现通过包括进行利用萃取操作的后处理(work-up)来替代沉淀、并且将杂质除去至水层侧的方法可高效地分离目标化合物。本发明人还发现，通过组合脱保护反应后的利用萃取操作的后处理和缩合反应后的利用萃取操作的后处理，可以在一个反应容器中进行吗啉代寡核苷酸的延伸反应，并且所谓的一锅(one-pot)合成是可能的。
本发明人还注意到这样的事实，在液相中通过缩合反应制备吗啉代寡核苷酸的过程中，由于缩合反应后残留的原料吗啉代核苷单体在下一步骤中参与反应，引起双重加成并产生副产物，随着链长度变更长，纯化变得更加困难，并且吗啉代寡核苷酸的延伸也变得困难，发现通过在缩合反应后的后处理中采用萃取操作，例如用特定化合物(猝灭剂)处理体系，可高效地用萃取操作将源自残余原料单体的杂质除去至水层侧。
本发明人还注意到这样的事实，在液相中通过缩合反应制备吗啉代寡核苷酸的过程中，由于保护基如三苯甲基(trityl)等(其在缩合反应之前保护吗啉环上的氮)的脱保护而产生的源自保护基的化合物在下一缩合步骤中参与反应并产生副产物，由此还使得难以在液相合成中制备长链吗啉代寡核苷酸，发现通过在脱保护反应后的后处理中采用萃取操作，例如用特定化合物(阳离子清除剂)处理体系，可高效地用萃取操作将源自保护基如三苯甲基等的杂质除去至水层侧。
本发明人还发现，在液相中通过缩合反应制备吗啉代寡核苷酸的过程中，通过将5’末端和/或核酸碱基用具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基(下文中也称为“锚固物(anchor)”)进行保护(下文中也称为“锚固”)，从而上述缩合反应和脱保护反应良好地进行，进而在用萃取操作将杂质消除到水层侧时，吗啉代核苷酸在非极性溶剂中的溶解性和相分离能力得到提高，通过萃取操作可高效地将杂质除去至水层侧，可更高效地延伸合成吗啉代寡核苷酸。
本发明人还发现，在液相中通过缩合反应制备吗啉代寡核苷酸的过程中，通过使用核酸碱基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护的吗啉代核苷单体，从而上述缩合反应和脱保护反应良好地进行，进而在用萃取操作将杂质消除到水层侧时，吗啉代核苷酸在非极性溶剂中的溶解性和相分离能力得到提高，通过萃取操作可高效地将杂质除去至水层侧。
本发明人还注意到这样的事实，在液相中通过缩合反应制备吗啉代寡核苷酸的过程中，如上述作为保护基使用具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基时，通过使用具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基，从而上述缩合反应和脱保护反应良好地进行，进而在用萃取操作将杂质消除到水层侧时，吗啉代核苷酸在非极性溶剂中的溶解性和相分离能力得到提高，通过萃取操作可高效地将杂质除去至水层侧，可更高效地延伸合成吗啉代寡核苷酸。
本发明人发现，通过使用这些方法，可利用液相方法高效且高收率地制备吗啉代寡核苷酸，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下内容。
[1]n+p聚体吗啉代寡核苷酸的制备方法，该方法包含下述步骤：
使p聚体吗啉代寡核苷酸(p表示1以上的任意整数)与n聚体吗啉代寡核苷酸(n表示1以上的任意整数)经由其吗啉环氮原子通过磷酰胺键(phosphoramidate bond)或磷酰二胺键(phosphorodiamidate bond)进行缩合后，使所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n+p聚体吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧的步骤(下文中称为“步骤(2)”)，
所述p聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基被活化磷酰胺化，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，
所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’末端和/或核酸碱基各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的临时保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护。
[2]根据[1]所述的制备方法，其中，n聚体吗啉代寡核苷酸的5’末端和核酸碱基、以及p聚体吗啉代寡核苷酸的核酸碱基中，至少一个被具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基保护。
[3]根据[1]所述的制备方法，其中，n聚体吗啉代寡核苷酸的5’末端被具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基保护。
[4]根据[1]所述的制备方法，其中，p聚体吗啉代寡核苷酸的核酸碱基各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护。
[5]根据[1]所述的制备方法，其中，在萃取操作之前，用猝灭剂处理反应混合物。
[6]根据[5]所述的制备方法，其中，猝灭剂包含具有仲氨基和羧基的化合物、或具有膦酰基的化合物。
[7]根据[5]所述的制备方法，其中，猝灭剂包含具有一个仲氨基和一个或两个羧基的化合物。
[8]根据[5]所述的制备方法，其中，猝灭剂为脯氨酰基谷氨酸。
[9]根据[5]所述的制备方法，其中，猝灭剂为脯氨酰基脯氨酸。
[10]根据[5]所述的制备方法，其中，猝灭剂包含具有膦酰基的化合物。
[11]根据[5]所述的制备方法，其中，猝灭剂为苯膦酸。
[12]根据[1]-[11]中任一项所述的制备方法，该方法进一步包含下述步骤：
在上述[1]中所述的步骤(步骤(2))之前，在非极性溶剂中，从n聚体吗啉代寡核苷酸除去吗啉环氮原子的临时保护基，该n聚体吗啉代寡核苷酸中，吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，而且5’末端和/或核酸碱基各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，
使所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n聚体吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧的步骤(下文中称为“步骤(1)”)。
[13]根据[12]所述的制备方法，其中，在阳离子清除剂的存在下与酸反应而除去吗啉环氮原子的临时保护基。
[14]根据[13]所述的制备方法，其中，阳离子清除剂包含具有巯基和羧基的化合物、或具有羧基的吲哚化合物。
[15]根据[13]所述的制备方法，其中，阳离子清除剂包含具有一个巯基和一个或两个羧基的化合物。
[16]根据[13]所述的制备方法，其中，阳离子清除剂为硫羟苹果酸或3-巯基丙酸。
[17]根据[1]所述的制备方法，其中，在与针对吗啉环氮原子的临时保护基的条件不同的条件下可除去的保护基为甲硅烷基系保护基。
[18]根据[1]所述的制备方法，其中，在与针对吗啉环氮原子的临时保护基的条件不同的条件下可除去的保护基为叔丁基二甲基甲硅烷基、二异丙基苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基或二苯基叔丁氧基甲硅烷基。
[19]根据[1]-[18]中任一项所述的制备方法，其中，p为1。
[20]根据[1]-[19]中任一项所述的制备方法，其中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基是下述式(II)所示的基团：
Z-Y-L- (II)
L表示单键或者式(a1)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置；
**表示与待保护的氧原子或氮原子的键合位置；
L1表示任选取代的二价C1-22烃基；并且
L2表示C(＝O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**所示的基团(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基，或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键。)]，
Y表示单键、氧原子或NR(其中R表示氢原子、烷基或芳烷基。)，以及
Z表示式(a2)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置；
环A表示苯环或环己烷环；
R4表示氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团且环A和环B都是苯环时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基；
k个Q各自独立地表示单键、或者表示-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-；
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
k表示1至4的整数；
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子；
Rb表示氢原子或式(a3)所示的基团：
(式中，*表示键合位置；
环B表示苯环或环己烷环；
j表示0至4的整数；
j个Q表示与上述相同的含义；
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
R6表示氢原子，或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基；并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。)，或者
Ra和Rb一起形成羰基。]。
[21]根据[1]-[20]中任一项所述的制备方法，该方法进一步包含下述步骤：
除去由[1]中所述的步骤(步骤(2))得到的n+p聚体吗啉代寡核苷酸的全部保护基的步骤(下文中称为“步骤(4)”)。
[22]根据[1]-[21]中任一项所述的制备方法，其中，在酸性条件下可除去的临时保护基为三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或单甲氧基三苯甲基。
[23]根据[1]-[22]中任一项所述的制备方法，其中，非极性溶剂是选自卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂、脂族系溶剂、非极性醚系溶剂、以及它们的组合中的溶剂。
[24]根据[12]-[23]中任一项所述的制备方法，其中，由[12]中所述的步骤(步骤(1))得到的反应混合物直接用于[1]中所述的步骤(步骤(2))，而不分离吗啉代寡核苷酸。
[25]吗啉环氮原子未被保护的n聚体吗啉代寡核苷酸(n为1以上的任意整数)的制备方法，该方法包含下述步骤：
在非极性溶剂中，在阳离子清除剂的存在下，使下述n聚体吗啉代寡核苷酸与酸反应而除去吗啉环氮原子的临时保护基的步骤(步骤(1))，
该n聚体吗啉代寡核苷酸中，吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，而且5’末端被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护。
[26]根据[25]所述的制备方法，其中，阳离子清除剂包含具有巯基和羧基的化合物、或具有羧基的吲哚化合物。
[27]根据[25]所述的制备方法，其中，阳离子清除剂包含具有一个巯基和一个或两个羧基的化合物。
[28]根据[25]所述的制备方法，其中，阳离子清除剂为硫羟苹果酸或3-巯基丙酸。
[29]根据[1]所述的制备方法，其中，p聚体吗啉代寡核苷酸和n聚体吗啉代寡核苷酸所具有的核酸碱基中，至少一个被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护。
[30]根据[29]所述的制备方法，其中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基为具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基。
[31]吗啉代核苷酸，其由通式(I)表示：
式中，
m表示0以上的任意整数，
P1表示氢原子或在酸性条件下可除去的临时保护基，
P2表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基、或者在与针对P1的条件不同的条件下可除去的保护基，
碱基1表示任选被保护基保护的核酸碱基，
m个碱基2各自独立地表示任选被保护基保护的核酸碱基，
m个X各自独立地表示二C1-6烷基氨基、或者4位氮原子被保护基保护进而任选取代的1-哌嗪基，
m个W表示氧原子，
其中，1)碱基1被保护基保护时的保护基、m个任意的碱基2被保护基保护时的任意的保护基、及P2所示的保护基中的至少一个为具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基，而且
2)当P2为具有碳数10以上且300以下的直链烷基和/或碳数10以上且300以下的直链烯基的保护基时，碱基1及m个任意的碱基2中的至少一个为被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护的核酸碱基。
[32]根据[31]所述的吗啉代核苷酸，其中，m为0至19的整数。
[33]根据[31]或[32]所述的吗啉代核苷酸，其中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基是下述式(II)所示的基团：
Z-Y-L- (II)
L表示单键、或者式(a1)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置；
**表示与待保护的氧原子或氮原子的键合位置；
L1表示任选取代的二价C1-22烃基；并且
L2表示C(＝O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**所示的基团(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基，或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键)]，
Y表示单键、氧原子或NR(其中R表示氢原子、烷基或芳烷基)，以及
Z表示式(a2)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置；
环A表示苯环或环己烷环；
R4表示氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团且环A和环B都是苯环时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基；
k个Q各自独立地表示单键、或者表示-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-；
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
k表示1至4的整数；
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子；
Rb表示氢原子或式(a3)所示的基团：
(式中，*表示键合位置；
环B表示苯环或环己烷环；
j表示0至4的整数；
j个Q表示与上述相同的含义；
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
R6表示氢原子、或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基；并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基)，或者
Ra和Rb一起形成羰基]。
[34]根据[31]或[32]所述的吗啉代核苷酸，其中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基选自
3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酰基、和
3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯甲酰基。
[35]根据[31]-[34]中任一项所述的吗啉代核苷酸，其中，P2为甲硅烷基系保护基。
[36]根据[31]-[35]中任一项所述的吗啉代核苷酸，其中，P2表示叔丁基二甲基甲硅烷基、二异丙基苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基或二苯基叔丁氧基甲硅烷基。
[37]根据[31]-[36]中任一项所述的吗啉代核苷酸，其中，P1表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。
[发明的效果]
根据本发明，在吗啉代寡核苷酸的液相合成中，缩合反应后残留的原料吗啉代核苷单体和源自保护基的杂质(其由缩合反应前的脱保护引起)通过萃取操作可简便地除去至水层侧，并且由这些杂质引起的副反应也可得到抑制，因此能够大量且高效地制备高品质的吗啉代寡核苷酸。
同样，特别地，通过用具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基保护特别存在于5’末端的羟基和氨基和/或核酸碱基，优选通过用这种保护基或优选用具有支链烷基和/或支链烯基的保护基保护核酸碱基，从而缩合反应和脱保护反应良好地进行，进一步地，在萃取操作中吗啉代寡核苷酸的溶解性和相分离能力得以提高，可更高效地进行后处理。
即，根据本发明，与固相方法相比，通过在液相中进行缩合反应，反应性显著提高，待用的单体当量可显著降低，进而在反应后通过萃取操作可简便地分离和纯化吗啉代寡核苷酸。因此，通过液相合成法可高效且高收率地制备具有可用作药品的链长的吗啉代寡核苷酸。
具体实施方式
[术语说明]
除非在文中另外指明，在本说明书中使用的任何技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。与本说明书所描述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实施或试验中，并且优选的方法和材料在后文进行记载。本说明书引用的所有出版物和专利是以参照的方式引入本文中，以便描述和公开在例如关于所述发明有用的出版物中所描述的构建产品和方法论。
在本说明书中，作为吗啉代寡核苷酸的构成单元的“吗啉代核苷”是指下述式(1)所示的化合物。
(其中，碱基表示任选被保护的核酸碱基)。
吗啉代核苷(1)可以按照本身公知的方法(例如WO91/09033A1中描述的方法)或者与其类似的方法进行制备。具体而言，如以下方案所示，可以通过利用高碘酸钠等使相应核糖核苷(2)氧化开环形成相应2’，3’-二醛(3)，利用氨使该2’，3’-二醛(3)闭环形成2’，3’-二羟基吗啉代核苷(4)，利用还原剂(例如氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠等)将该2’，3’-二羟基吗啉代核苷(4)还原，由此得到吗啉代核苷(1)。
在本说明书中，吗啉代核苷的位置编号(1’、2’等)采用与原料核糖核苷(2)的核糖的碳原子的位置编号相对应的位置编号。
在本说明书中，吗啉代寡核苷酸是指2个以上的吗啉代核苷经由5’位羟基和吗啉环的氮原子通过磷酰胺键或磷酰二胺键聚合而成的化合物，例如，作为m’+1聚体吗啉代寡核苷酸，可提及下述式(5)所示的化合物。
(式中，
m’表示1以上的任意整数，
碱基1和m’个碱基2各自独立地表示任选被保护的核酸碱基，
m’个X各自独立地表示二C1-6烷基氨基或4位氮原子被保护基保护进而任选取代的1-哌嗪基等，以及
m’个W表示氧原子)。
在本说明书中，“4位氮原子被保护基保护进而任选取代的1-哌嗪基”是指哌嗪基的4位氮原子被保护基保护，优选被可耐受吗啉代核苷酸的吗啉环氮原子的脱保护条件的保护基保护的1-哌嗪基。作为所述“哌嗪基的4位氮原子的保护基”，优选为酰基，更优选为在碳链上具有氟基的酰基，例如单氟乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、2-氟丙酰基、2，2-二氟丙酰基、3，3，3-三氟丙酰基、2，3，3，3-四氟丙酰基、五氟丙酰基等(参见WO 2008/008113)。在哌嗪基中，哌嗪基的碳原子上键合的氢原子可被取代，取代基的实例包括烷基等(优选具有1-3个碳原子)如甲基等。
在本说明书中，按照核酸化学的惯例，将吗啉代寡核苷酸的5’位具有游离羟基一侧的末端(上述式(5)的左下侧)的吗啉代核苷称为“5’-末端”，相反侧的末端(上述式(5)的右上侧)的吗啉代核苷称为“3’-末端”。
在本说明书中，对“核酸碱基”没有特别限制，只要其可用于合成核酸即可，并且包括例如嘧啶碱基如胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基等，以及嘌呤碱基如腺嘌呤基、鸟嘌呤基等。吗啉代核苷酸中存在的多个核酸碱基可为异种(heterogeneous)的核酸碱基、或同种(allogeneic)的核酸碱基。“任选被保护的核酸碱基”是指，例如核酸碱基上存在的氨基和羟基被保护的核酸碱基，例如在腺嘌呤基、鸟嘌呤基或胞嘧啶基(其为具有氨基的核酸碱基)中，氨基可被保护，优选核酸碱基的氨基被可耐受吗啉代核苷酸的吗啉环氮原子的脱保护条件的保护基保护的核酸碱基。所述“氨基的保护基”没有特别限制，其实例包括Greene的有机合成中的保护基(Greene′s PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)，第4版，Wiley-Interscience，2006等中描述的保护基。“氨基的保护基”的具体实例包括新戊酰基、新戊酰氧甲基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、二甲基甲脒基、9-芴基甲氧羰基等。其中，优选苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基以及二甲基甲脒基。另外，核酸碱基的羰基任选被保护，例如可通过使苯酚、2，5-二氯苯酚、3-氯苯酚、3，5-二氯苯酚、2-甲酰基苯酚、2-萘酚、4-甲氧基苯酚、4-氯苯酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、4-乙酰基氨基苯酚、五氟苯酚、4-新戊酰氧基苯甲醇、4-硝基苯乙醇、2-(甲磺酰基)乙醇、2-(苯磺酰基)乙醇、2-氰基乙醇、2-(三甲基甲硅烷基)乙醇、二甲基氨基甲酰氯、二乙基氨基甲酰氯、乙基苯基氨基甲酰氯、1-吡咯烷碳酰氯、4-吗啉碳酰氯、二苯基氨基甲酰氯等进行反应来保护羰基。在一些情况下，无需特别引入羰基的保护基。此外，除了上述基团之外，该“核酸碱基”还包括修饰的核酸碱基(例如，8-溴腺嘌呤基、8-溴鸟嘌呤基、5-溴胞嘧啶基、5-碘胞嘧啶基、5-溴尿嘧啶基、5-碘尿嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基、8-氧代鸟嘌呤基、次黄嘌呤基(hypoxanthinyl)等)，其是在任意位置被任意1至3个取代基(例如，卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烷氧基烷基、羟基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基等)取代的核酸碱基。
此外，“氨基的保护基”包括具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基，可按照本身公知的方法或者与其类似的方法保护氨基。例如，它可通过使胸腺嘧啶基的嘧啶环上的氮原子与3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酰氯在碱存在下反应来保护。
在本说明书中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
在本说明书中，“烷基(基团)”的实例包括具有一个或多个碳原子的直链或支链烷基。当未特别限制碳数时，其优选地为C1-10烷基，更优选地为C1-6烷基。当未特别限制碳数时，优选地为例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，特别优选地为甲基和乙基。
在本说明书中，“芳烷基(基团)”是指C7-20芳烷基，优选地为C7-16芳烷基(C6-10芳基-C1-6烷基)。具体的优选实例包括苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、1-苯丙基、萘甲基、1-萘乙基、1-萘丙基等，特别优选地为苄基。
在本说明书中，“烷氧基(基团)”的实例包括具有一个或多个碳原子的烷氧基。当未特别限制碳数时，它优选地为C1-10烷氧基，更优选地为C1-6烷氧基。当未特别限制碳数时，优选地为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等，特别优选地为甲氧基和乙氧基。
在本说明书中，“酰基(基团)”的实例包括直链或支链C1-6烷酰基、C7-13芳酰基等。其具体实例包括甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、新戊酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘酰基、乙酰丙酰基(levulinyl)等，其每个任选地被取代。
在本说明书中，“烯基(基团)”的实例包括直链或支链C2-6烯基等。其实例包括乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基等。其中，优选的是C2-4烯基。
在本说明书中，“炔基(基团)”的优选实例包括C2-6炔基等。其实例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基等。其中，优选的是C2-4炔基。
在本说明书中，“环烷基(基团)”是指环状烷基，其实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。其中，优选的是C3-6环烷基如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等，特别优选地为环己基。
在本说明书中，“芳基(基团)”是指单环芳族烃基或多环(稠合)芳族烃基。其具体实例包括C6-14芳基如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基、2-蒽基等等。其中，更优选的是C6-10芳基，特别优选地为苯基。
在本说明书中，“烃基”的实例包括脂族烃基、芳族脂族烃基、单环饱和烃基、芳族烃基等，且其具体实例包括一价基团，例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基等和由它们衍生的二价基团。
在本说明书中，“具有烃基的有机基团”是指具有上述“烃基”的基团，并且“具有烃基的有机基团”中的除“烃基”之外的部分可任意设定。例如，有机基团任选具有作为连接基的如-O-、-S-、-COO-、-OCONH-、-CONH-等部分。
在本说明书中，“任选取代”的“取代基”包括上述卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烯基、炔基、环烷基、芳基以及羟基、硝基、氰基、胍基、羧基、烷氧基羰基(烷氧基部分与上述烷氧基相同)、磺基(sulfo group)、磷酰基(phospho group)、烷基硫基(烷基部分与上述烷基相同)、烷基亚硫酰基(烷基部分与上述烷基相同)、烷基磺酰基(烷基部分与上述烷基相同)、氨基、单烷基氨基(烷基部分与上述烷基相同)、二烷基氨基(烷基部分与上述烷基相同)、氧代基等。
[5’末端和/或核酸碱基任选被特定保护基保护且吗啉环氮原子任选被在酸性条 件下可除去的临时保护基保护的吗啉代核苷酸]
使用本发明中所用的5’末端(例如，5’位羟基或存在于5’位羟基的取代基上的羟基和/或氨基)和/或核酸碱基任选被特定保护基保护的吗啉代核苷酸，可以提供适合于液相合成的吗啉代寡核苷酸的制备方法。
由于目标吗啉代寡核苷酸的制备方法中可获得高效率和高收率，优选5’位羟基或存在于5’位羟基的取代基上的羟基和/或核酸碱基任选被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基(锚固物)保护的吗啉代核苷酸。
其中，由于目标吗啉代寡核苷酸的制备方法中可获得高效率和高收率，优选核酸碱基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护的吗啉代核苷酸。作为具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基，优选具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基，并且特别地，优选核酸碱基被具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基保护的吗啉代核苷酸。
“5’位羟基具有含羟基的取代基”是指5’位羟基的氢原子被具有羟基的取代基取代。“具有羟基的取代基(含羟基的取代基)”中的“取代基”不受特别限制，只要主链由1至20个原子构成即可。此处，“主链”是指将5’位羟基的氧原子与存在于取代基上的羟基的氧原子连接的最短原子链，该原子链任选进一步被取代。构成主链的原子选自碳原子、氧原子、氮原子、硫原子、磷原子等。“具有羟基的取代基”的具体实例包括在烷基、芳烷基、酰基、烯基、炔基、环烷基、芳基、烷氧基羰基等具有烃基的有机基团中，烃基上的氢原子被羟基取代的基团等。另外，可提及例如WO2008/008113中公开的下列5’位羟基的取代基等。当5’位羟基具有含氨基的取代基时，它意味着5’位羟基的氢原子被具有氨基的取代基取代，其它如上所定义。
“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的实例包括一价基团和由其衍生出的二价基团。其中，优选碳数10-40的烷基，特别优选碳数10-30的烷基。“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的烷基、烯基包括直链或支链烷基、直链或支链烯基。本发明的制备方法中，优选支链烷基、支链烯基，特别优选支链烷基。“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的具体优选实例包括：例如3，7，11，15-四甲基十六烷基、3，7，11-三甲基十二烷基、2，6，10，14-四甲基十五烷基、2，6，10-三甲基十一烷基、2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十一烷基、2，6，10-三甲基十一-1，5，9-三烯基、2，6-二甲基庚基、2，6-二甲基庚-5-烯基、2，6-二甲基庚-1，5-二烯基、9-十九烷基、12-甲基十三烷基、11-甲基十三烷基、11-甲基十二烷基、10-甲基十一烷基、8-十七烷基、7-十五烷基、7-甲基辛基、3-甲基辛基、3，7-二甲基辛基、3-甲基庚基、3-乙基庚基、5-十一烷基、2-庚基、2-甲基-2-己基、2-己基、3-庚基、4-庚基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2，4，4-三甲基戊基等支链烷基或支链烯基，或者，十八烷基、十七烷基、十六烷基、十五烷基、十四烷基、十三烷基、十二烷基、十一烷基、癸基、壬基、辛基、庚基、己基、戊基等直链烷基的一价脂族烃基、以及由它们衍生出的二价基团。
作为5’位羟基或存在于5’位羟基的取代基上的羟基和/或核酸碱基可被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护且吗啉环氮原子任选被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的吗啉代核苷酸，具体而言，可提及下式(I)所示的化合物(下文中有时称为本发明化合物)。
式(I)：
[式中，
m表示0以上的任意整数，
P1表示氢原子或在酸性条件下可除去的临时保护基，
P2表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基、或者在与针对P1的条件不同的条件下可除去的保护基，
碱基1表示任选被保护基保护的核酸碱基，
m个碱基2各自独立地表示任选被保护基保护的核酸碱基，
m个X各自独立地表示二C1-6烷基氨基、或者4位氮原子被保护基保护进而任选取代的1-哌嗪基，
m个W表示氧原子。]
本发明化合物在后述本发明的吗啉代寡核苷酸的制备方法中，与“5’位羟基被活化磷酰胺化、而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的p聚体吗啉代寡核苷酸(p表示1以上的任意整数)”键合，可形成m+1+p聚体吗啉代寡核苷酸(p表示1以上的任意整数)。
当m为0时，本发明化合物理解为“吗啉代核苷”，其为本发明的吗啉代寡核苷酸的合成中5’位末端的起始化合物。另外，本发明化合物中广义上还包括3’末端侧的吗啉环氮原子未保护(P1为氢原子)的化合物。
在上述式(I)中，m表示0以上的任意整数，优选为0。虽然m的上限没有特别限制，优选为49以下，更优选为29以下，进一步优选为19以下。
对可用作本发明化合物的3’末端的吗啉环氮原子的保护基的临时保护基P1没有特别限制，只要其可在酸性条件下脱保护并且可用作羟基的保护基即可。其实例包括三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、二(C1-6烷氧基)三苯甲基如1，1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、二甲氧基三苯甲基等、单(C1-18烷氧基)三苯甲基如1-(4-甲氧基苯基)-1，1-二苯基甲基、单甲氧基三苯甲基等，以及可提及的类似基团。其中，考虑到脱保护的容易程度和容易获得性，优选地为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基，更优选地为三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。
对可用作本发明的化合物的5’位羟基的保护基的保护基P2没有特别限制，只要其可在与针对P1的条件不同的条件下脱保护并且可用作羟基的保护基即可。例如，可提及可通过肼除去的乙酰丙酰基(levulinyl)，可通过光除去的光解除性保护基如o-硝基苄基，二苯甲酮衍生物、溴香豆素衍生物等、使用钯催化剂等通过催化还原可脱保护的烯丙氧基羰基(Alloc基)和苄基、和可通过氟离子除去的甲硅烷基系保护基。其中，优选甲硅烷基系保护基。甲硅烷基系保护基的实例包括叔丁基二甲基甲硅烷基、二异丙基苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基叔丁氧基甲硅烷基等。保护基P2也可为上述“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基”。
上述式(I)中的碱基1和m个碱基2各自独立地表示任选被保护的核酸碱基。“任选被保护的核酸碱基”是指，例如腺嘌呤基、鸟嘌呤基或胞嘧啶基(其为具有氨基的核酸碱基)中的氨基任选被保护，或者，具有环状酰亚胺基的胸腺嘧啶基或尿嘧啶基中的酰亚胺基任选被保护，优选核酸碱基的氨基被可耐受吗啉代核苷酸的吗啉环氮原子的脱保护条件的保护基保护的核酸碱基。上述“氨基的保护基”和“酰亚胺基的保护基”的保护基没有特别限制，例如可提及Greene的有机合成中的保护基，第4版，JOHN WILLY&SONS(2006)中所述的任何保护基等。这种“氨基的保护基”和“酰亚胺基的保护基”的具体实例包括新戊酰基、新戊酰氧甲基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、二甲基甲脒基、9-芴基甲氧羰基等。其中，优选苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基以及二甲基甲脒基。此外，核酸碱基的羰基任选被保护，例如可通过使苯酚、2，5-二氯苯酚、3-氯苯酚、3，5-二氯苯酚、2-甲酰基苯酚、2-萘酚、4-甲氧基萘酚、4-氯苯酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、4-乙酰基氨基苯酚、五氟苯酚、4-新戊酰氧基苯甲醇、4-硝基苯乙醇、2-(甲磺酰基)乙醇、2-(苯磺酰基)乙醇、2-氰基乙醇、2-(三甲基甲硅烷基)乙醇、二甲基氨基甲酰氯、二乙基氨基甲酰氯、乙基苯基氨基甲酰氯、1-吡咯烷碳酰氯、4-吗啉碳酰氯、二苯基氨基甲酰氯等反应来保护羰基。在一些情况下，不需要特别引入羰基的保护基。
“任选被保护的核酸碱基”包括上述“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基”。
在上述式(I)中，优选以下的化合物，其中
1)碱基1被保护基保护时的保护基、m个任意的碱基2被保护基保护时的任意的保护基、及P2所示的保护基中的至少一个为具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基，而且
2)当P2为具有碳数10以上且300以下的直链烷基和/或碳数10以上且300以下的直链烯基的保护基时，碱基1及m个任意的碱基2中的至少一个为被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护的核酸碱基。
在上述式(I)中，碱基1被保护基保护时的保护基、m个任意的碱基2被保护基保护时的任意的保护基中的至少一个优选为具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基。作为这种情况下的保护基P2，优选上述甲硅烷基系保护基。
在上述式(I)中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基优选为具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基。
在上述式(I)中，m个X各自独立地为二C1-6烷基氨基或4位氮原子被保护基保护进而任选取代的1-哌嗪基，优选二C1-6烷基氨基。
作为二C1-6烷基氨基，优选二甲基氨基、二乙基氨基、N-乙基-N-甲基氨基等，优选二甲基氨基。
作为哌嗪基的4位氮原子的保护基，优选酰基，例如更优选碳链中具有氟基的酰基，如一氟乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、2-氟丙酰基、2，2-二氟丙酰基、3，3，3-三氟丙酰基、2，3，3，3-四氟丙酰基、五氟丙酰基等。虽然该保护基通常在延伸反应完成后脱保护，哌嗪基(piperazino group)的氨基可进一步在脱保护后根据WO 2008/008113中所述的方法通过修饰基修饰。修饰基的实例包括卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烯基、炔基、环烷基、芳基、羟基、硝基、氰基、胍基、羧基、烷氧基羰基、磺基、磷酰基、烷基硫基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基等。作为哌嗪基的修饰基，优选任选取代的酰基，更优选任选被胍基取代的酰基(例如，6-胍基己酰基)。在该哌嗪基中，与哌嗪基的碳原子键合的氢原子可被取代，取代基的实例包括诸如甲基等的烷基(优选具有1-3个碳原子)等。
m个W表示氧原子。
上述式(I)中的P2所示的保护基和/或碱基1的保护基为“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基”时，作为该保护基优选为下式(II)所示的保护基：
Z-Y-L- (II)
L表示单键或者式(a1)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置；
**表示与待保护的氧原子或氮原子的键合位置；
L1表示任选取代的二价C1-22烃基；并且
L2表示C(＝O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**所示的基团(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基，或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键。)]，
Y表示单键、氧原子或NR(其中R表示氢原子、烷基或芳烷基。)，以及
Z表示式(a2)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置；
环A表示苯环或环己烷环；
R4表示氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团且环A和环B都是苯环时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基；
k个Q各自独立地表示单键、或者表示-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-；
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
k表示1至4的整数；
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子；
Rb表示氢原子或式(a3)所示的基团：
(式中，*表示键合位置；
环B表示苯环或环己烷环；
j表示0至4的整数；
j个Q表示与上述相同的含义；
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
R6表示氢原子，或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基；并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。)，或者
Ra和Rb一起形成羰基。]。
由上述式(a1)表示的连接基L的优选实施方案为这样的基团，其中在式(a1)中，
L1为亚乙基或CH2-O-1，4-亚苯基-O-CH2；且
L2为C(＝O)、或者为***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**所示的基团(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示C1-6亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-6烷基，或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-6亚烷基键。)。
由上述式(a1)表示的连接基L的另一个优选实施方案为这样的基团，其中在式(a1)中，
L1为亚乙基；且
L2为C(＝O)。
由上述式(a1)表示的连接基L的另一个优选实施方案为这样的基团，其中在式(a1)中，
L1为亚乙基；且
L2中的N(R3)-R1-N(R2)部分为亚哌嗪基(piperazinylene group)。
由上述式(a1)表示的连接基L的另一个优选实施方案为这样的基团，其中在式(a1)中，
L1为亚乙基；且
L2为由***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**表示的基团(式中**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1为亚戊基或亚己基，且R2和R3各自独立地为氢原子或甲基)。
上述连接基L的特别优选的实例为单键或易得且经济的琥珀酰基。
上述式(I)中的Y为单键、氧原子或NR(其中R为氢原子、烷基或芳烷基)。
在本说明书中，R所示的“烷基”为C1-30烷基，优选地为C1-10烷基，更优选地为C1-6烷基。其具体的优选实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等，并且特别优选地为甲基、乙基。
在本说明书中，R所示的“芳烷基”为C7-30芳烷基，优选地为C7-20芳烷基，更优选地为C7-16芳烷基(C6-10芳基-C1-6烷基)。其具体优选实例包括苄基，1-苯基乙基、2-苯基乙基、1-苯基丙基、α-萘基甲基，1-(α-萘基)乙基、2-(α-萘基)乙基、1-(α-萘基)丙基、β-萘基甲基、1-(β-萘基)乙基、2-(β-萘基)乙基、1-(β-萘基)丙基等，特别优选地为苄基。
R优选地为氢原子、C1-6烷基或C7-16芳烷基，更优选地为氢原子、甲基、乙基或苄基，特别优选地为氢原子。
Y优选地为单键、氧原子或NH。
Z的优选实施方案为式(a2)所示的基团。
上述式(I)中的Z的优选实施方案，即上述式(I)中Z的由式(a2)表示的基团包括：特定的苄基(在式(a2)中，环A为苯环，Ra和Rb均为氢原子，且R4为氢原子)；特定的苯甲酰基(在式(a2)中，环A为苯环，Ra和Rb一起形成氧原子，且R4为氢原子)；特定的二苯基甲基(在式(a2)中，环A是苯环，Ra为氢原子，R4为氢原子，k为1至3，且Rb为由式(a3)表示的基团(其中环B为苯环，R6为氢原子，j为0或1))；特定的芴基(在式(a2)中，环A为苯环，Ra为氢原子，k为1，Rb为由式(a3)表示的基团(其中环B为苯环，且j为0)，且R6与R4一起为单键、并与环A一起形成芴环)；特定的呫吨基(在式(a2)中，环A为苯环，Ra为氢原子，k为1，Rb为由式(a3)表示的基团(其中环B为苯环，且j为0)，且R6与R4一起表示-O-、并与环A一起形成黄嘌呤环)。
上述式(a2)中的环A为苯环或环己烷环，优选苯环。
在上述式(a2)中的k个QR5基团和式(a3)中的j个QR7基团中，Q为单键或者-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-，优选-O-。k个QR5基团和j个QR7基团可相同或不同。
在上述式(a2)中，“Ra和Rb一起形成氧原子”是指Ra和Rb一起形成羰基(C(＝O))。
针对R5或R7所述的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”表示在其分子结构中具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的一价有机基团。
“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的碳数优选为14-40，更优选为14-30。
“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的部分没有特别限制，可存在于末端(一价基团)或存在于其它位置(例如二价基团)。
作为“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”，可提及一价基团和由其衍生出的二价基团。其中，优选碳数14-40的烷基，特别优选碳数14-30的烷基。
“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的烷基、烯基包括直链或支链烷基、直链或支链烯基。在本发明的制备方法中，优选支链烷基或支链烯基，特别优选支链烷基。“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的具体优选实例包括：例如3，7，11，15-四甲基十六烷基、3，7，11-三甲基十二烷基、2，6，10，14-四甲基十五烷基、2，6，10-三甲基十一烷基、2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十一烷基、2，6，10-三甲基十一-1，5，9-三烯基、2，6-二甲基庚基、2，6-二甲基庚-5-烯基、2，6-二甲基庚-1，5-二烯基、9-十九烷基、12-甲基十三烷基、11-甲基十三烷基、11-甲基十二烷基、10-甲基十一烷基、8-十七烷基、7-十五烷基、7-甲基辛基、3-甲基辛基、3，7-二甲基辛基、3-甲基庚基、3-乙基庚基、5-十一烷基、2-庚基、2-甲基-2-己基、2-己基、3-庚基、4-庚基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2，4，4-三甲基戊基等支链烷基或支链烯基，或十八烷基、十七烷基、十六烷基、十五烷基、十四烷基、十三烷基、十二烷基、十一烷基、癸基、壬基、辛基、庚基、己基、戊基等直链烷基的一价脂族烃基，以及由它们衍生出的二价基团。
“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中，“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”以外的部分可任意设定。例如，它任选地具有诸如-O-、-S-、-COO-、-OCONH-和-CONH-和烃基(一价基团或二价基团)等的部分作为连接基。该“烃基”的实例包括脂族烃基、芳族脂族烃基、单环饱和烃基、芳族烃基等。具体而言，使用例如一价基团如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基等和由它们衍生的二价基团。作为“脂族烃基”以外的部分的“烷基”、“烯基”、“炔基”、“环烷基”、“芳基”或“芳烷基”，可提及与上述基团类似的那些。该“烃基”任选地被选自卤素原子(氯原子、溴原子、氟原子、碘原子)、任选地被一个或多个卤素原子取代的C1-6烷基、氧代基团等的取代基取代。
以构成上述式(I)中的Z的“R5(基团)”和/或“R7(基团)”表示的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”可包含由于支化等存在的多个“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”。当多个“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”存在于“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中时，它们可相同或不同。
以构成上述式(I)中的Z的“R5(基团)”和/或“R7(基团)”表示的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的总碳数的下限优选为10以上，更优选为12以上，进一步优选为14以上，更进一步优选为18以上，特别优选为30以上。另一方面，以“R5(基团)”和/或“R7(基团)”表示的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的总碳数的上限优选为200以下，更优选为150以下，进一步优选为120以下，进一步更优选为100以下，特别优选为80以下，特别更优选为60以下。该碳数越多时，即使吗啉代寡核苷酸具有长链时，本发明化合物在极性溶剂中的溶解性良好。
上述式(a2)所示的Z的优选实施方案为式(a2)所示的基团，其中，在式(a2)中，
环A为苯环；
Ra和Rb都为氢原子；
R4为氢原子，
k个Q为-O-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团(例如C10-40烷基)；并且
k表示1-3的整数。
上述式(a2)所示的Z的另一优选实施方案为以下基团，其中，在式(a2)中：
环A为苯环；
k表示1-3的整数；
Ra和Rb都为氢原子；
R4为氢原子，
k个Q为-O-，
k个R5各自独立地表示具有1-3个“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的苄基、或者具有1-3个“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的环己基；并且
环A除了具有k个QR5以外，任选进一步具有选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基以及任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基的取代基。
上述式(a2)所示的Z的另一优选实施方案为以下基团，其中，在式(a2)中：
环A为苯环；
Ra为氢原子；并且
R4为氢原子；
Rb表示上述式(a3)所示的基团(其中*表示键合位置；环B为苯环；j表示0至3的整数；j个Q表示-O-；j个R7各自独立地表示C10-40烷基；并且R6为氢原子。
上述式(a2)所示的Z的又一优选实施方案为以下基团，其中，在式(a2)中：
环A为苯环；
Ra为氢原子；
Rb为上述式(a3)所示的基团(其中*表示键合位置；环B为苯环；j表示0至3的整数；j个Q为-O-；j个R7各自独立地表示C10-40烷基；
R6与环A的R4一起形成单键或-O-，由此环A与环B一起表示芴基或呫吨基。
上述式(a2)所示的Z的另一优选实施方案为以下基团，其中，在式(a2)中：
环A为苯环；
Ra和Rb一起形成氧原子；
R4为氢原子，
k个Q为-O-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团(例如C10-40烷基)；并且
k表示1-3的整数。
上述式(a2)所示的Z的另一优选实施方案为以下基团，其中，在式(a2)中：
环A为苯环；
k表示1-3的整数；
Ra和Rb一起形成氧原子；
R4为氢原子；
k个Q为-O-，
k个R5各自独立地表示具有1-3个“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的苄基、或者具有1-3个“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的环己基；并且
环A除了具有k个QR5以外，任选进一步具有选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基以及任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基的取代基。
作为式(II)：Z-Y-L-所示的保护基，优选在可将3’末端的吗啉环氮原子的保护基P1除去的酸性条件下难以切断而在碱性条件下被切断的基团。
所述保护基的代表性实例包括这样的基团，其中，例如
L表示上述式(a1)所示的基团(优选琥珀酰基等)，并且
Z-Y表示以下基团：
3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氧基，
3，5-二(二十二烷基氧基)苄氧基，
3，5-二[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氧基，
3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氧基，
3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氨基，
2，4-二(二十二烷基氧基)苄氨基，
3，5-二(二十二烷基氧基)苄氨基，
二(4-二十二烷基氧基苯基)甲基氨基，
4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基，
4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)环己基甲氧基]苄氨基，
2，4-二(十二烷基氧基)苄氨基，
苯基(2，3，4-三(十八烷基氧基)苯基)甲氨基，
二[4-(12-二十二烷基氧基十二烷基氧基)苯基]甲氨基，
3，5-二[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基，或
3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基。
在所述保护基的另一代表性实例中，L为单键，且Z-Y-为以下基团：
3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酰基，或
3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯甲酰基。
作为保护基Z-Y-L-的另一实施方案，可提及以下苄基琥珀酰基或二苯基甲基琥珀酰基。
2-{2，4-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基；
3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基；
4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基；
2-{1-[(2-氯-5-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基)]苄氨基羰基}乙基羰基；
3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基；
2-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基；
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基；
2-{2-[3’，4’，5’-三(2”，3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄氨基羰基}乙基羰基；
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲氧基苄氨基羰基}乙基羰基；
4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄基琥珀酰基；
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄氨基羰基}乙基羰基；
4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰氨基]苄基琥珀酰基；
2-{4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰氨基]苄氨基羰基}乙基羰基；
4-(3，7，11-三甲基十二烷基氧基)苄基琥珀酰基；
2-{4-(3，7，11-三甲基十二烷基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基；
2-{3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基；
2-{1-[2，3，4-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]苄氨基羰基}乙基羰基；
2-{1-[4-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]-4’-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基；
3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄基琥珀酰基；以及
2-{3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄氨基羰基}乙基羰基。
式(II)：Z-Y-L-所示的保护基的另一优选实施方案为以下的基团，其中：
L和Y各自为单键，
Z表示式(a2)，
环A为苯环；
Ra和Rb一起形成氧原子；
R4为氢原子，
k个Q为-O-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团(例如C10-40烷基)；和
k表示1-3的整数。
式(II)：Z-Y-L-所示的保护基的另一优选实施方案为以下的基团，其中：
L表示式(a1)，
L2表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**(式中**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基，或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键)，
Y为单键，
Z表示式(a2)，
环A为苯环，
Ra和Rb一起形成氧原子；
R4为氢原子，
k个Q为-O-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团(例如C10-40烷基)；并且
k表示1-3的整数。
式(I)所示的本发明化合物的优选实施方案为式(I)的化合物，其中：
m为0，
P1为三苯甲基、二(C1-6烷氧基)三苯甲基或单(C1-6烷氧基)三苯甲基；
P2为叔丁基二甲基甲硅烷基、二异丙基苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基或二苯基叔丁氧基甲硅烷基；
碱基1为胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基、腺嘌呤基或鸟嘌呤基，其各自任选地被保护；且
碱基2为胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基、腺嘌呤基或鸟嘌呤基，其各自任选地被保护。
[本发明化合物的制备方法]
以m为0的式(I)(下文中称为“式(Ia)”)表示的本发明化合物的制备方法没有特别限制，可按照本身已知的方法(Richard T.Pon等，Nucleic Acids Research 2004，32，623-631)或与其类似的方法，由上述保护基的前体制备。
P2为式(II)Z-Y-L-(其中L为琥珀酰基，Y和Z如上所述)的上述式(Ia)的化合物的常规制备方法如下所示。
(其中各符号与上述含义相同。)
在碱的存在下使3’末端吗啉环氮原子被保护基P1保护的吗啉代核苷(a)与琥珀酸酐反应，得到向5’位羟基引入了琥珀酸的化合物(b)。通过在缩合剂存在下使化合物(b)与保护基的前体(Z-Y-H)(醇或胺)脱水缩合，由此可以获得式(Ia)所示的化合物。
上述吗啉代核苷(a)向化合物(b)的转化步骤有利地在对所述反应呈惰性的溶剂中进行。虽然对此类溶剂没有特别限制，只要反应进行即可，但优选地为卤代烃溶剂如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等、芳族烃溶剂如苯、甲苯、二甲苯等、脂族烃溶剂如戊烷、己烷、庚烷、辛烷等、醚溶剂如二乙醚、四氢呋喃、环戊基甲基醚等以及它们的混合溶剂。其中，特别优选地为二氯甲烷或氯仿。
虽然对碱没有特别限制，但可使用例如下文提及的有机碱，优选地为N，N-二甲氨基吡啶、三乙胺等。
上述脱水缩合步骤有利地在对所述反应呈惰性的溶剂中进行。虽然对此类溶剂没有特别限制，只要反应进行即可，但优选地为卤代烃溶剂如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等、芳族烃溶剂如苯、甲苯、二甲苯等、或脂族烃溶剂如戊烷、己烷、庚烷、辛烷等以及它们的混合溶剂。其中，特别优选地为二氯甲烷、氯仿。
化合物(b)与Z-Y-H的缩合反应所使用的缩合剂的实例包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺及其盐酸盐(EDC·HCl)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鳞六氟磷酸盐(PyBop)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓-3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)、O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)等。其中，优选的是HBTU、HCTU、N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺及其盐酸盐(EDC·HCl)。
缩合剂的使用量，相对于每1摩尔化合物(b)为1至10摩尔，优选地为1至5摩尔。Z-Y-H的使用量，相对于每1摩尔化合物(b)为1至10摩尔，优选地为1至5摩尔。虽然对反应温度没有特别限制，只要反应进行即可，但其优选地为-10℃至50℃，更优选地为0℃至30℃。反应时间为30分钟至70小时。
L不是琥珀酰基的上述式(Ia)的化合物也可用与上述制备方法类似的方法进行反应来制备，不同的是使用相应酸酐、相应二羧酸卤化物、相应二羧酸的活化酯或类似物来代替琥珀酸酐。
Y为单键的化合物可通过按照本身公知的方法使Z-Y-H的活化衍生物(卤化物、酰基卤、活化羧基等)与吗啉代核苷(a)反应、或在缩合剂存在下使Z-Y-H与吗啉代核苷(a)反应来制备。Z-Y-H和吗啉代核苷(a)的缩合反应可以与Z-Y-H和化合物(b)的缩合反应相同的方式进行。
m为1以上的式(I)所示的化合物可根据本发明的以下制备方法，使用式(Ia)所示的化合物作为起始材料，通过重复5’末端延伸过程来制备。
虽然上述保护基的前体(Z-Y-H)(醇、胺或羧酸)的制备方法没有特别限制，可以按照本身公知的方法(例如，Bull.Chem.Soc.Jpn.2001，74，733-738、JP-A-2000-44493、WO2006/104166、WO 2007/034812、WO 2007/122847、WO 2010/113939、JP-A-2010-275254、WO2012/157723等)或者与它们类似的方法由原料化合物进行制备。
用作原料化合物的化合物，例如构成式(I)中的Z的R5和R7所对应的卤化物等可为市售品而从商业获得，或者可按照本身公知的方法或者与它们类似的方法进行制备。
此外，如上所述，该保护基的前体(Z-Y-H)可以按照本身公知的方法或者与它们类似的方法进行制备。当原料化合物具有影响反应的取代基(例如，羟基、氨基、羧基)时，通常按照公知方法预先用适当的保护基保护原料化合物，然后再进行反应。这种保护基可以在反应后通过公知方法如酸处理、碱处理、催化还原等除去。
虽然3’末端吗啉环氮原子被保护基P1保护的吗啉代核苷(a)的制备方法没有特别限制，可以通过本身公知的方法(例如参见WO91/09033A1)或者与它们类似的方法由吗啉代核苷(1)进行制备。
例如，当P1为三苯甲基时，使吗啉代核苷(1)在碱如三乙胺等的存在下与氯化三苯甲基反应，由此可获得化合物(a)。
此外，P1为氢原子的化合物(a)可以通过使P1为临时保护基的化合物(a)进行后述脱保护步骤(1)而获得。
[本发明的制备方法]
对本发明的吗啉代寡核苷酸的制备方法(下文中也称为“本发明的制备方法”)进行说明。具体而言，对由被适当保护的n聚体吗啉代寡核苷酸制备被适当保护的n+p聚体吗啉代寡核苷酸的制备方法进行说明，例如，当n＝1时，n聚体吗啉代寡核苷酸应理解为“吗啉代核苷”，当p＝1时，p聚体吗啉代寡核苷酸应理解为“吗啉代核苷”，n+p聚体吗啉代寡核苷酸应理解为“吗啉代二核苷酸”。
本发明的制备方法包括以下步骤(2)。
(2)使p聚体吗啉代寡核苷酸(p表示1以上的任意整数)与n聚体吗啉代寡核苷酸(n表示1以上的任意整数)经由其吗啉环氮原子通过磷酰胺键或磷酰二胺键进行缩合后，使所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n+p聚体吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧的步骤，
所述p聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基被活化磷酰胺化，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，
所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’末端(5’位羟基，或者，当5’位羟基具有含羟基的取代基时、存在于该取代基上的羟基)和/或核酸碱基各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的临时保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护。
p聚体吗啉代寡核苷酸的核酸碱基可各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护。
n的上限没有特别限制，优选为50以下，更优选为30以下，进一步优选为20以下。
p的上限没有特别限制，优选为50以下，更优选为30以下，进一步优选为20以下，进一步更优选为5以下，特别优选为3以下。
本发明的制备方法优选还包括下列步骤(1)，其中制备步骤(2)中使用的n聚体吗啉代寡核苷酸。
(1)在步骤(2)之前，在非极性溶剂中，从n聚体吗啉代寡核苷酸除去吗啉环氮原子的临时保护基，该n聚体吗啉代寡核苷酸中，吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，而且5’末端(5’位羟基，或者，当5’位羟基具有含羟基的取代基时、存在于该取代基上的羟基)和/或核酸碱基各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，
使所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n聚体吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧的步骤。
由于n聚体吗啉代寡核苷酸的5’位羟基或存在于5’位羟基的取代基上的羟基和各核酸碱基、以及p聚体吗啉代寡核苷酸的各核酸碱基中的至少一个被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，所得的n+p聚体吗啉代寡核苷酸的脂溶性得以提高，并且n+p聚体吗啉代寡核苷酸可通过除去过量原料和副产物而简便且高效地纯化。
从纯化效率的角度出发，p聚体吗啉代寡核苷酸和n聚体吗啉代寡核苷酸所具有的核酸碱基中的至少一个优选被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护。
从纯化效率的角度出发，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基优选为具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基。
可通过在本发明的制备方法中进一步包括步骤(4)来分离和制备吗啉代寡核苷酸：
(4)除去所得n+p聚体吗啉代寡核苷酸的全部保护基的步骤。
以下对各步骤进行详细说明。
1.“n聚体吗啉代寡核苷酸”的说明
首先，对用作步骤(1)和(2)的原料的n聚体吗啉代寡核苷酸进行说明。
步骤(1)中使用的n聚体吗啉代寡核苷酸是，例如吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的n聚体吗啉代寡核苷酸，如通过例如下式(i)所示，步骤(2)中使用的n聚体吗啉代寡核苷酸是，例如，吗啉环氮原子未被保护的n聚体吗啉代寡核苷酸，如通过例如下式(ii)所示。
(式中，
m表示对应于n-1的0以上的任意整数，
P1’表示在酸性条件下可除去的临时保护基，并且
其它符号与式(I)中各定义相同。)
下面对式(i)和(ii)中的各符号进行说明。
m的上限没有特别限制，它通常为99以下，优选为74以下，更优选为49以下，进一步优选为29以下。
针对式(i)中的P1’所示的在酸性条件下可除去的临时保护基没有特别限制，只要它可在酸性条件下脱保护并且可用作羟基的保护基即可。其实例包括三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、二(C1-6烷氧基)三苯甲基如1，1-二(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、二甲氧基三苯甲基等、单(C1-18烷氧基)三苯甲基如1-(4-甲氧基苯基)-1，1-二苯基甲基、单甲氧基三苯甲基等，可提及类似保护基。其中，从脱保护容易性、获取容易性的观点出发，优选三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，更优选三苯甲基、二甲氧基三苯甲基。
2.“p聚体吗啉代寡核苷酸”的说明
首先，对用作步骤(2)的原料的p聚体吗啉代寡核苷酸进行说明。
步骤(2)中使用的“5’位羟基被活化磷酰胺化且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的p聚体吗啉代寡核苷酸(p表示1以上的任意整数)”没有特别限制，只要满足结构要求即可。
“5’位羟基被活化磷酰胺化”是指吗啉代寡核苷酸的5’位羟基被例如下式(c)所示的基团修饰：
(式中，
*表示键合于吗啉代寡核苷酸的5’末端羟基上的位置，
L1表示离去基团，
X表示二C1-6烷基氨基、或4位氮原子被保护基保护进而任选取代的1-哌嗪基，并且
W表示氧原子)。
“活化磷酰胺化”是指，上述式中，X表示二C1-6烷基氨基或4位氮原子被保护基保护进而任选取代的1-哌嗪基，并且W为氧原子。
针对L1所示的离去基团的实例包括卤素原子、甲磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基等，优选为氯原子。
X和W的定义、实例和优选实施方案如针对上述式(I)所说明。
“在酸性条件下可除去的临时保护基”的定义、实例和优选实施方案如针对上述式(I)所说明。
作为步骤(2)中使用的优选p聚体吗啉代寡核苷酸，可提及式(iii)所示的化合物。
(式中，
q表示对应于p-1的0以上的任意整数，
P1”表示在酸性条件下可除去的临时保护基，且
其它符号与式(I)和式(c)中各定义相同)。
式(iii)中的q优选为0。虽然q的上限没有特别限制，它通常为99以下，优选为74以下，更优选为49以下，进一步优选为29以下。
针对式(iii)中P1”所示的在酸性条件下可除去的临时保护基没有特别限制，只要它可在酸性条件下脱保护并且可用作羟基的保护基即可。其实例包括三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、二(C1-6烷氧基)三苯甲基如1，1-二(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、二甲氧基三苯甲基等、单(C1-18烷氧基)三苯甲基如1-(4-甲氧基苯基)-1，1-二苯基甲基、单甲氧基三苯甲基等，可提及类似保护基。其中，从脱保护容易性、获取容易性的观点出发，优选三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，更优选三苯甲基、二甲氧基三苯甲基。
式(iii)中的其它符号的优选实施方式如针对上述式(I)和(c)所说明的。
本发明的p聚体吗啉代寡核苷酸可以通过本身公知的方法(例如WO91/09033A1中描述的方法)或者与其类似的方法进行制备。例如，L1为氯原子的化合物可以通过使下式(iii’)的化合物(其为式(iii)所示的化合物，其中5’位羟基未被活化)与例如式(d)：Cl2P(＝W)(X)(式中，W和X如上所定义)代表的二氯氨基磷酸酯反应来进行制备。
式(d)所示的二氯氨基磷酸酯可以使用市售品，或者通过公知方法(例如WO91/09033、WO2008/008113等中描述的方法)或与其类似的方法进行制备。
式(iii’)的化合物可以通过例如WO91/09033等的公知方法进行制备。
3.步骤(1)-(3)的说明
以下为方便起见，参考式(i)、(ii)、(iii)等对步骤(1)-(3)进行说明，但它们并不限于此。
步骤(1)(脱保护步骤)
本步骤包括：在缩合步骤(2)之前，在非极性溶剂中，从n聚体吗啉代寡核苷酸(i)除去吗啉环氮原子的临时保护基，该n聚体吗啉代寡核苷酸(i)中，吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，而且5’末端(5’位羟基，或者，当5’位羟基具有含羟基的取代基时、存在于该取代基上的羟基)和/或核酸碱基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，
使所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)分离到有机层侧的步骤(脱保护步骤)，
所述n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)中，5’末端(5’位羟基，或者，存在于5’位羟基的取代基上的羟基)和/或核酸碱基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，且吗啉环氮原子未被保护。
上述临时保护基的除去优选通过使其在阳离子清除剂的存在下与酸反应来进行。
(式中每个符号如上所定义)。
此步骤在不影响反应的溶剂中进行。由于预期在溶剂中的较高溶解度可提供优异的反应性，因此优选地选择对本发明的n聚体吗啉代寡核苷酸(i)显示出高溶解性的非极性溶剂。具体而言，其实例包括卤系溶剂如氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷等；芳族系溶剂如苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯等；酯系溶剂如乙酸乙酯、乙酸异丙酯等；脂族系溶剂如己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、环己烷等；非极性醚系溶剂如二乙醚、环戊基甲基醚、叔丁基甲基醚等。其中，优选二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚等。这些溶剂的两种以上可以适当比例混合使用。
在此步骤中，对n聚体吗啉代寡核苷酸(i)在溶剂中的浓度没有特别限制，只要寡核苷酸溶解即可，其优选地为1至30质量％。
对用于此步骤中的酸没有特别限制，只要可获得良好的脱保护即可，优选使用三氟乙酸、氰基吡啶三氟乙酸盐和三氟乙醇、三乙胺三氟乙酸盐、氰基乙酸、乙酸、二氯乙酸、磷酸、甲磺酸、甲苯磺酸、盐酸等。
由于可良好地进行反应，更优选三氟乙酸、氰基吡啶三氟乙酸盐、三乙胺三氟乙酸盐、氰基乙酸，进一步优选氰基吡啶三氟乙酸盐、三乙胺三氟乙酸盐，特别优选三乙胺三氟乙酸盐。可以用上述非极性溶剂稀释这些酸。当使用上述酸时，其可在使用之前与特定的碱(例如，三乙胺等)组合以适当地调节酸度。
用于此步骤中的酸的量，相对于每1摩尔n聚体吗啉代寡核苷酸(i)，为1至100摩尔，优选地为1至40摩尔。
在本步骤中，可添加阳离子清除剂以防止由脱保护反应引起的保护基P1如三苯甲基阳离子的阳离子化物等导致的副反应。优选阳离子清除剂的实例包括：包含具有巯基和羧基的化合物的阳离子清除剂、或包含具有羧基的吲哚化合物的阳离子清除剂。阳离子清除剂的具体实例包括：具有一个巯基和一个或两个羧基的化合物如硫羟苹果酸、3-巯基丙酸、半胱氨酸、半胱氨酰(cisteinyl)谷氨酸等；以及，具有一个或两个羧基的吲哚化合物如吲哚甲酸、吲哚二甲酸、色氨酸、色氨酰谷氨酸、1-(1H-吲哚-5-基)丁二酸酯等。其中，优选硫羟苹果酸、3-巯基丙酸、1-(1H-吲哚-5-基)丁二酸酯。两种以上的阳离子清除剂可组合使用。
阳离子清除剂的使用量，可以考虑p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)相对于n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的过剩量(p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的摩尔数-n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的摩尔数)适当决定，相对于该过剩量(摩尔)，优选为1-20当量，更优选为1-10当量。
对此步骤中的反应温度没有特别限制，只要反应进行即可，但其优选地为-10℃至50℃，更优选地为0℃至40℃。反应时间根据待使用的n聚体吗啉代寡核苷酸的种类、酸的种类、溶剂的种类、反应温度等而不同，但其通常为5分钟至24小时。
当用作脱保护剂的酸存在于下一步骤的缩合步骤时，诱发p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的保护基P1”的脱保护。因此，需要除去处理或中和处理。为了在溶液中连续进行本脱保护步骤和随后的缩合步骤，优选在本步骤中除去3’末端吗啉环氮原子的临时保护基，然后用有机碱或无机碱进行中和，通过萃取操作如洗涤等将其除去。
对用于中和的有机碱没有特别限制，只要其可中和上述酸即可，并且获得的盐可作为缩合剂起作用。由于反应良好地进行，优选N，N-二异丙基乙胺、吡啶、4-氰基吡啶、三乙胺、碳酸钠、碳酸钾，更优选N，N-二异丙基乙胺、三乙胺，特别优选N，N-二异丙基乙胺。
用于此步骤中的有机碱的量，相对于每1摩尔所述酸，为1至10摩尔，优选地为1至3摩尔。
步骤(1’)：进而，在本步骤中，保护基P1的阳离子化物如三苯甲基阳离子等(其通过脱保护产生)与阳离子清除剂的加合物通过转移到水层来除去。即，所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n聚体吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧。当使用非极性溶剂作为反应溶剂时，可通过将水加入反应混合物中来进行萃取操作。此外，也可加入水和亲水有机溶剂的混合溶剂。例如，优选使用亲水有机溶剂如N，N-二甲基乙酰胺、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺等和水的混合溶剂，特别优选N，N-二甲基甲酰胺和水的混合溶剂。体系中将存在的水的量可合适地由本领域技术人员在常规萃取操作范围内确定，当使用混合溶剂时，按照此水量可合适地确定水和有机溶剂的量。
步骤(2)(缩合步骤)
本步骤包括：使p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)与n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)经由其吗啉环氮原子通过磷酰胺键或磷酰二胺键进行缩合后，使所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n+p聚体吗啉代寡核苷酸(iv)分离到有机层侧的步骤；所述p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)中，5’位羟基被活化磷酰胺化，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护；所述n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)中，5’末端(5’位羟基，或者，当5’位羟基具有含羟基的取代基时、存在于该取代基上的羟基)和/或核酸碱基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的临时保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护。在所述萃取操作之前，优选用包括具有仲氨基和羧基的化合物的猝灭剂处理所得反应混合物。
(其中，各符号如上定义)。
作为5’位羟基被活化磷酰胺化且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)，优选p为1的吗啉代核苷(即，其中5’位羟基被活化磷酰胺化且吗啉环氮原子被临时保护基P1”保护的吗啉代核苷)。
本步骤中，使用的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)没有特别限制，可以优选使用上述步骤(1)中所得的那种。在此情况下，仅需要将p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)直接加入步骤(1)后的反应混合物中，而不分离n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)。
本步骤在不影响反应的溶剂中进行。优先选择对本发明的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)显示高溶解性的非极性溶剂。其具体实例包括：卤系溶剂如氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷等；芳族系溶剂如苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯等；酯系溶剂如乙酸乙酯、乙酸异丙酯等；脂族系溶剂如己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、环己烷等；非极性醚系溶剂如二乙醚、环戊基甲基醚、叔丁基甲基醚等。其中，优选二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚等。这些溶剂的两种或更多种可以适当比例混合使用。另外，可以将极性溶剂以适当比例混合使用，只要n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)溶解。具体而言，可提及诸如乙腈、丙腈等的腈溶剂；诸如丙酮、2-丁酮等的酮溶剂；诸如1，4-二噁烷、四氢呋喃等的极性醚溶剂；诸如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮等的酰胺溶剂；诸如二甲亚砜等的亚砜溶剂等极性溶剂。
p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的使用量相对于1摩尔n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)为1-10摩尔，优选为1-5摩尔，进一步优选为1-2摩尔。
反应温度没有特别限制，只要反应进行即可，优选为0℃至100℃，更优选为20℃至50℃。反应时间根据缩合的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)和p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的种类、反应温度等而不同，它为30分钟至24小时。
在本缩合反应结束后、萃取操作之前，优选用猝灭剂处理反应混合物。通过使用该猝灭剂，可以将缩合反应中残留的p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)完全猝灭，能够避免下一循环的缩合反应中残留的活化吗啉代核苷酸引起双重加成，因此可防止目标吗啉代寡核苷酸的品质下降。
双重加成是指，上一循环的缩合反应中使用并残留的活化吗啉代核苷酸在下一循环的缩合反应中发生反应，对同一残基进行双重加成。
作为猝灭剂，优选包含具有仲氨基和羧基的化合物、或具有膦酰基的化合物的猝灭剂。作为包含具有仲氨基和羧基的化合物的猝灭剂，优选包含具有一个仲氨基和一个或两个羧基的化合物的猝灭剂。作为包含具有仲氨基和羧基的化合物的猝灭剂，具体而言，例如，可提及脯氨酰基谷氨酸、N-甲基β-丙氨酸、脯氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基甘氨酰基谷氨酸、脯氨酰基脯氨酸、脯氨酰基天冬氨酸等。其中，优选脯氨酰基谷氨酸和脯氨酰基脯氨酸。作为包含具有膦酰基的化合物的猝灭剂，可提及具有膦酰基的化合物如苯膦酸等。其中，优选苯膦酸。两种以上的猝灭剂可组合使用。
包含具有仲氨基和羧基的化合物的猝灭剂的使用量可以考虑p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)相对于n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的过剩量(p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的摩尔数-n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的摩尔数)适当决定，相对于该过剩量(摩尔)优选为0.1-10当量，更优选为0.3-3当量。
向反应混合物中添加包含具有仲氨基和羧基的化合物的猝灭剂后，通过使混合物在0℃-100℃、优选为20℃-50℃下，反应30分钟-24小时、优选为30分钟-5小时，能够将p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)完全猝灭。
使由猝灭剂进行了处理的反应混合物经受萃取操作，由此通过萃取操作可将基于原料单体的杂质高效地除去至水层侧。即，使反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n+p聚体吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧。当使用非极性溶剂作为反应溶剂时，可通过向反应混合物添加水进行萃取操作。另外，也可添加水和极性溶剂的混合溶剂。例如，优选使用极性溶剂如N，N-二甲基乙酰胺、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺等和水的混合溶剂，特别优选N，N-二甲基甲酰胺和水的混合溶剂。体系中存在的水的量可合适地由本领域技术人员在常规萃取操作范围内确定，当使用其混合溶剂时，按照此水量可合适地确定水和有机溶剂的量。
步骤(3)(萃取分离步骤)
本步骤包括通过萃取操作从包含步骤(2)中所得的n+p聚体吗啉代寡核苷酸(iv)的反应混合物分离和纯化n+p聚体吗啉代寡核苷酸(iv)的方法。
虽然萃取操作没有特别限制，优选如下进行：根据需要将非极性溶剂和/或水添加至步骤(2)中所得的反应混合物中以允许在非极性溶剂层-水层之间进行相分离，使n+p聚体吗啉代寡核苷酸转移到非极性溶剂。通过此萃取操作，可将残留的杂质如原料、试剂、副产物(例如，酸、猝灭剂、向其中加入猝灭剂的p聚体吗啉代寡核苷酸等)等消除在水相中。
作为在本步骤中根据需要加入以将n+p聚体寡核苷酸(iv)转移至非极性溶剂中的非极性溶剂，可提及与上述缩合反应中使用的那些相同的非极性溶。因此，当非极性溶剂用作缩合反应溶剂时，它本身可用作萃取用非极性溶剂。在需要的情况下，可添加极性溶剂。例如，可将水和极性溶剂的混合溶剂添加至非极性溶剂以进行相分离并且可进行萃取操作。根据需要加入的极性溶剂的实例包括醇溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇等，腈溶剂如乙腈、丙腈等，酮溶剂如丙酮、2-丁酮等，极性醚溶剂如1，4-二噁烷、四氢呋喃等，酰胺溶剂如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基哌啶酮等，亚砜溶剂如二甲基亚砜等，以及其中两种或更多种的混合溶剂。其中，优选地使用酰胺溶剂、腈溶剂及其组合，更优选地使用N，N-二甲基乙酰胺、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺及其组合。作为本发明中的极性溶剂，特别优选N，N-二甲基甲酰胺。
可通过在非极性溶剂层-水层之间相分离后除去水层来消除杂质。此外，通过在除去水层后向非极性溶剂中加入水或水与极性溶剂的混合溶剂，搅拌混合物，分离各层和除去水层(在本发明中这种萃取操作有时称为“洗涤”)，可进一步消除少量剩余的杂质。
对用极性溶剂洗涤的次数没有特别限制，但可重复洗涤直至在用薄层硅胶色谱法、高效液相色谱法等分析非极性溶剂时、非极性溶剂层中的杂质降低至不会阻碍下个循环的核苷酸延伸反应的程度。
虽然水和极性溶剂的混合溶剂中的水含量可由本领域普通技术人员适当地设定，优选例如1-10％(v/v)，更优选3-8％(v/v)。
通过对萃取操作后的非极性溶剂层进行浓缩，可分离n+p聚体吗啉代寡核苷酸(iv)。在这种情况下，可在浓缩后通过向反应容器中添加下一循环的溶剂和试剂来在一锅中重复进行核苷酸延伸。或者，萃取操作后的非极性溶剂层不进行浓缩，也可进行下一循环的核苷酸延伸。
本发明的吗啉代寡核苷酸的制备方法通过以(1)至(3)的顺序重复上述步骤所需次数，可以高纯度和高收率提供目标高聚合度的吗啉代寡核苷酸。
步骤(4)(脱保护、吗啉代寡核苷酸分离步骤)
在本发明的吗啉代寡核苷酸的制备方法中，在步骤(2)之后根据保护基的种类和性质进行脱保护，由此可分离吗啉代寡核苷酸。可根据Greene的有机合成中的保护基，第4版，Wiley-Interscience(2006)等中所述的脱保护方法来除去吗啉代寡核苷酸的所有保护基。具体而言，本发明的具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基以及在与针对吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基，全部可通过用氨水、氨水/乙醇溶液、或氨水和甲胺水溶液的混合液进行处理而除去。此外，通过用步骤(1)使用的酸或这种酸的适当稀释溶液进行处理，可除去吗啉代寡核苷酸的3’末端吗啉环氮原子的保护基。
可通过与常规液相有机合成反应类似的方法确定上述各步骤的反应进展。即，可利用薄层硅胶色谱法、高效液相色谱法等来跟踪反应。
通过进一步进行有机合成反应，由步骤(4)获得的吗啉代寡核苷酸还可产生所需的吗啉代寡核苷酸衍生物。
由本发明所制备的吗啉代寡核苷酸可用于各种用途，例如用于人或动物的各种药品(RNA、DNA、寡核酸药物、肽修饰的吗啉代寡核苷酸等)、功能性食品、特定保健用食品、食品、化学产品、生物体或工业用的高分子材料等。
实施例
下文通过参照实施例对本发明进行更详细地说明，这些实施例不应理解为限制本发明的范围。除非另外指明，本发明中使用的试剂、设备和材料可商购获得。在本说明书中，当以缩写表示时，除非特别指明，各表示基于IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclature的缩写或本领域的常规缩写。除非另外指明，混合溶剂(溶液)所示的比例表示体积比。除非另外指明，“％”表示“重量％”。
实施例中所使用的缩写如下。
mo：吗啉代核苷
moA：吗啉代腺苷
moG：吗啉代鸟苷
moC：吗啉代胞苷
moT：吗啉代胸苷
moU：吗啉代尿苷
PMO：磷酰二胺吗啉代寡核苷酸
例如，表示为PMO[A-G-C]时，是指左侧为5’末端，右侧为3’末端，从5’末端起依次为吗啉代腺苷、吗啉代鸟苷、吗啉代胞苷的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸。
bz：苯甲酰基
Bzl：苄基
cHx：环己基
pac：苯氧基乙酰基
ce：2-氰乙基
当吗啉代核苷的核酸碱基被保护时，保护基以上标示出在核酸碱基的缩写(A、G、C、T和U)的右侧。
例如，Cbz是指胞嘧啶的氨基被苯甲酰基保护，Gce/pac是指鸟嘌呤的氨基被苯氧基乙酰基保护、羰基被2-氰乙基保护。
OPhy：3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄氧基
Dpm：二苯基甲基
suc：琥珀酰基
Tr，Trt：三苯甲基
TBSO：叔丁基二甲基甲硅烷氧基
TOB：3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酰基
PhyTOB：3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯甲酰基
实施例1：使用在5’末端具有含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-的锚固物(anchor)的底物的 延伸反应
1)缩合-1
将Bzl(3，4，5-OPhy)-OH(1.00g，1.00mmol)溶解于氯仿(10mL)中，向其中添加suc-mo(Tr)Cbz(0.27g，0.40mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.09g，0.44mmol)和4-二甲基氨基吡啶(10mg，0.02mmol)，将混合物在室温搅拌17hr。减压蒸发溶剂，将环己烷(10mL)和庚烷(5mL)添加至残余物。向其中添加乙腈(10mL)，进行分配洗涤两次。减压蒸发上层溶剂，减压干燥混合物，得到油状Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(1.64g，99％)。
TOF-MS+(m/z)1652.0
2)三苯甲基的脱保护-1
将Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(1.60g，0.97mmol)溶解于氯仿(16mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(4.33mL，59.4mmol)和硫羟苹果酸(1.45g，9.68mmol)。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.88g，7.75mmol)和三乙胺(0.48g，4.84mmol)的氯仿溶液(13.7mL)，将混合物在15℃下搅拌2.5hr。之后，添加三氟乙酸(0.110g，0.97mmol)的氯仿溶液(1.0mL)，搅拌混合物1hr。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(3.15g，24.2mmol)的氯仿溶液(31mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，20mL×2)洗涤。将有机层用20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，20mL×5)、以及20％盐水(20mL)依次洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz的有机层，该有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1410.0。
3)缩合-2
将N，N-二异丙基乙胺(0.30mL，1.74mmol)和Cl-mo-(Tr)Cbz(1.01g，1.45mmol)添加至包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz(1.37g，相当0.97mmol)的有机层(85.9g)，将混合物在室温搅拌17hr。将反应混合物冰冷却，向其中添加N，N-二异丙基乙胺(0.42mL，2.42mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.59g，2.42mmol)和2，2，2-三氟乙醇(12.7mL，174mmol)，将混合物在室温搅拌3hr。进一步地，向其中添加脯氨酰基谷氨酸(0.12g，0.48mmol)，将混合物在室温搅拌30min。将反应混合物用5vol％2，2，2-三氟乙醇水溶液(70mL×3)洗涤。用氯仿(4mL)从水层再萃取目标化合物，与有机层合并。所得包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-sue-PMO[Cbz-Cbz]-Tr的有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)2071.1
4)三苯甲基的脱保护-2
将包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz]-Tr(2.01g，相当0.97mmol)的有机层(80.3g)冰冷却，滴加三氟乙酸(0.95g，8.36mmol)在氯仿中的溶液。接着，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(4.33mL，59.4mmol)和硫羟苹果酸(1.45g，9.68mmol)。进一步地，滴加三氟乙酸(0.88g，7.75mmol)和三乙胺(0.48g，4.84mmol)的氯仿溶液(13.7mL)，将混合物在15℃搅拌1.5hr。滴加N，N-二异丙基乙胺(3.00g，23.2mmol)的氯仿溶液(30mL)。将反应混合物用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，80mL)、20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，80mL)、以及20％盐水(80mL×2)依次洗涤。减压蒸发溶剂，所得的包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz]-H的有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)915.1(M+2H)+
按照上述3)和4)的方法，在一锅中依次进行缩合和三苯甲基的脱保护而不分离目标化合物以达到延伸至7聚体。
5)三苯甲基的脱保护-7
将包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac]-Tr(4.19g，相当0.97mmol)的有机层用5vol％2，2，2-三氟乙醇水溶液(50mL×2)洗涤，将有机层冰冷却后，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(9.8mL，135mmol)和硫羟苹果酸(0.44g，2.90mmol)。然后，滴加三氟乙酸(0.88g，7.75mmol)和三乙胺(0.48g，4.84mmol)的氯仿溶液(13.7mL)，将混合物在15℃搅拌1hr。进一步地，滴加N，N-二异丙基乙胺(1.25g，9.68mmol)的氯仿溶液(12.5mL)。将反应混合物用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，70mL)、20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，70mL×2)、以及20％盐水(80mL)依次洗涤。减压蒸发溶剂，所得的包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac]-H的有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1361.2(M+3H)+
6)缩合-8
将N，N-二异丙基乙胺(0.30mL，1.74mmol)和Cl-mo-(Tr)T(0.89g，1.45mmol)添加至包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac]-H(3.95g，相当0.97mmol)的有机层，将混合物在室温搅拌15hr。将反应混合物冰冷却，向其中添加N，N-二异丙基乙胺(2.08mL，12.1mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.59g，2.42mmol)和2，2，2-三氟乙醇(10mL，137mmol)，将混合物在室温搅拌4hr。将所得溶液用水(70mL×2)洗涤，包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T]-Tr的有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1552.0(M+3H)+
7)三苯甲基的脱保护-8
将包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T]-Tr(4.51g，相当0.97mmol)的有机层用5vol％2，2，2-三氟乙醇水溶液(50mL×2)洗涤，将有机层冰冷却，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(10mL，135mmol)和硫羟苹果酸(0.44g，2.90mmol)。接着，滴加三氟乙酸(0.88g，7.75mmol)和三乙胺(0.48g，4.84mmol)的氯仿溶液(13.7mL)，将混合物在15℃搅拌1hr。进一步地，滴加N，N-二异丙基乙胺(1.25g，9.68mmol)的氯仿溶液(12.5mL)。将反应混合物用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，90mL)、20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，90mL×2)、以及20％盐水(90mL)依次洗涤。减压浓缩溶剂，所得的包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T]-H的有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1471.3(M+3H)+
8)缩合-9
将N，N-二异丙基乙胺(0.30mL，1.74mmol)和Cl-mo-(Tr)T(0.89g，1.45mmol)添加至包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T]-H(4.27g，相当0.97mmol)的有机层，将混合物在室温搅拌15hr。将反应混合物冰冷却，向其中添加N，N-二异丙基乙胺(2.08mL，12.1mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.59g，2.42mmol)和2，2，2-三氟乙醇(10mL，137mmol)，将混合物在室温搅拌2hr。将三氟乙酸(1.60g，14.0mmol)在氯仿中的溶液滴加至所得溶液，用水(70mL×3)洗涤混合物。浓缩有机层，冰冷却下将乙腈(30mL)添加至所得残余物，通过过滤收集沉淀物并减压干燥，得到浅黄色粉末状的Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T-T]-Tr(3.57g，0.72mmol，相对Bzl(3，4，5-OPhy)-OH的收率72％)。
TOF-MS+(m/z)1662.0(M+3H)+
9)脱保护后的质谱测定
将乙醇(0.05mL)和28％氨水(0.15mL)添加至Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T-T]-Tr(5mg)，将混合物在55℃搅拌15hr。将乙腈(0.1mL)和环己烷(0.3mL)添加至反应混合物，将水层用环己烷(0.3mL×2)洗涤。将50％甲醇水溶液(0.7mL)添加至水层并通过过滤移走所得固体。对所得PMO[C-C-T-C-C-G-G-T-T]-Tr的水溶液进行质谱测定。
TOF-MS+(m/z)1039.0(M+3H)+
1’)缩合-1的另一方法
将Bzl(3，4，5-OPhy)-OH(3.0g，3.01mmol)溶解于氯仿(30mL)中，添加suc-mo(Tr)Cbz(2.43g，3.61mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.69g，3.61mmol)和4-二甲基氨基吡啶(22mg，0.18mmol)，将混合物在室温搅拌17hr。减压蒸发溶剂，将残余物溶解于环己烷(30mL)和庚烷(30mL)中。向其中添加乙腈(30mL)并将混合物分配洗涤两次。减压蒸发上层溶剂，将混合物减压干燥，得到油状Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(4.67g，99％)。
TOF-MS+(m/z)1652.0
2’)三苯甲基的脱保护-1的另一方法
将Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(0.30g，0.18mmol)溶解于氯仿(3mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(0.79mL，10.9mmol)和3-巯基丙酸(0.08mL，0.91mmol)。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.16g，1.45mmol)和三乙胺(0.10g，0.91mmol)在氯仿中的溶液，将混合物在室温搅拌1.5hr。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.19g，1.45mmol)在氯仿中的溶液。将所得溶液用10％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，3mL×2)、40％N，N-二甲基甲酰胺水溶液(5mL)、以及20％盐水(3mL)依次洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz的有机层，该有机层直接供于后续反应。
2”)三苯甲基的脱保护-1的另一方法
将Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(0.80g，0.48mmol)溶解于氯仿(6.4mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(2.1mL，29.0mmol)和硫羟苹果酸(0.22g，1.45mmol)。冰冷却后，向混合物滴加三氟乙酸(0.44g，3.87mmol)和三乙胺(0.24g，2.42mmol)的氯仿溶液(1.5mL)，将混合物在15℃搅拌90min。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.25g，1.94mmol)的氯仿溶液(1.7mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，8mL×2)、以及20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，8mL×3)依次洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz的有机层，该有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1410.1
3’)缩合-2的另一方法
向包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz(0.25g，相当0.18mmol)的有机层添加N，N-二异丙基乙胺(0.06mL，0.33mmol)和Cl-mo-(Tr)Cbz(0.19g，0.27mmol)，将混合物在室温搅拌17hr，向反应混合物添加N，N-二异丙基乙胺(0.01mL，0.04mmol)和Cl-mo-(Tr)Cbz(0.03g，0.04mmol)，将混合物在室温搅拌2hr。进一步地，将吗啉(0.022mL，0.25mmol)添加至反应混合物。所得的包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz]-Tr的有机层直接供于后续反应。
3”)缩合-2的另一方法
向包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz(相当0.24mmol)的有机层添加N，N-二异丙基乙胺(0.07mL，0.38mmol)和Cl-mo-(Tr)Cbz(0.22g，0.32mmol)，将混合物在室温搅拌52hr。反应后，添加N，N-二异丙基乙胺(0.32mL，1.82mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.09g，0.36mmol)和2，2，2-三氟乙醇(0.94mL)，将混合物在室温搅拌3hr。将混合物用2，2，2-三氟乙醇和0.1mM盐酸的混合溶液(1∶19，3.5mL×2)洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz]-Tr的有机层，该有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)2071.8
实施例2改变实施例1的3)中的猝灭剂(猝灭剂：L-脯氨酰基L-脯氨酸)
将Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(0.80g，0.48mmol)溶解于氯仿(6.4mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(2.1mL，29.0mmol)和硫羟苹果酸(0.22g，1.45mmol)。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.44g，3.87mmol)和三乙胺(0.24g，2.42mmol)的氯仿溶液(1.5mL)，将混合物在15℃搅拌90min。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.25g，1.94mmol)的氯仿溶液(1.7mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，8mL×2)、以及20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，8mL×3)依次洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz的有机层，该有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1410.1
向包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz(相当0.24mmol)的有机层添加N，N-二异丙基乙胺(0.07mL，0.38mmol)和Cl-mo-(Tr)CBz(0.22g，0.32mmol)，将混合物在室温搅拌52hr。将N，N-二异丙基乙胺(0.32mL，1.82mmol)、L-脯氨酰基L-脯氨酸(0.07g，0.36mmol)和2，2，2-三氟乙醇(0.94mL)添加至反应混合物，将混合物在室温搅拌3hr。将反应混合物用2，2，2-三氟乙醇和0.1mM盐酸的混合溶液(1∶19，3.5mL×2)洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-sue-PMO[Cbz-Cbz]-Tr的有机层。
TOF-MS+(m/z)2071.8
实施例3改变实施例1的2)中的阳离子清除剂(阳离子清除剂：1-(1H-吲哚-5-基) 丁二酸酯)
将Bzl(3，4，5-OPhy)-O-sue-mo(Tr)Cbz(0.80g，0.48mmol)溶解于氯仿(6.4mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(2.1mL，29.0mmol)和1-(1H-吲哚-5-基)丁二酸酯(0.34g，1.45mmol)。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.44g，3.87mmol)和三乙胺(0.24g，2.42mmol)的氯仿溶液(1.5mL)，将混合物在15℃搅拌90min。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.25g，1.94mmol)的氯仿溶液(1.7mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，8mL×2)、以及20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，8mL×3)依次洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz的有机层，该有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1410.1
向包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz(相当0.24mmol)的有机层添加N，N-二异丙基乙胺(0.07mL，0.38mmol)和Cl-mo-(Tr)Cbz(0.22g，0.32mmol)，将混合物在室温搅拌52hr。将N，N-二异丙基乙胺(0.32mL，1.82mmol)、L-脯氨酰基L-谷氨酸(0.09g，0.36mmol)和2，2，2-三氟乙醇(0.94mL)添加至反应混合物，将混合物在室温搅拌3hr。将反应混合物用2，2，2-三氟乙醇和0.1mM盐酸的混合溶液(1∶19，3.5mL×2)洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz]-Tr的有机层。
TOF-MS+(m/z)2071.8
实施例4改变实施例1的3)中的猝灭剂(猝灭剂：苯膦酸)
将Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(1.0g，0.61mmol)溶解于氯仿(8.0mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(2.6mL，36.3mmol)和硫羟苹果酸(0.27g，1.82mmol)。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.55g，4.84mmol)和三乙胺(0.31g，3.03mmol)的氯仿溶液(1.9mL)，将混合物在15℃搅拌120min。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.31g，2.42mmol)的氯仿溶液(2.1mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，10mL×2)、以及20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，10mL×3)依次洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz的有机层，该有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1410.1
向包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz(相当0.61mmol)的有机层添加N，N-二异丙基乙胺(0.16mL，0.94mmol)和Cl-mo-(Tr)Cbz(0.55g，0.79mmol)，将混合物在室温搅拌16hr。将N，N-二异丙基乙胺(0.79mL，4.54mmol)、苯膦酸(0.14g，0.91mmol)和2，2，2-三氟乙醇(2.33mL)添加至反应混合物，将混合物在室温搅拌2hr，向其中进一步添加苯膦酸(0.57g，3.63mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.78mL，4.50mmol)，将混合物在室温搅拌1hr。将反应混合物用2，2，2-三氟乙醇和0.1mM盐酸的混合溶液(1∶19，8.5mL×2)洗涤，得到包含Bzl(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz]-Tr的有机层。
TOF-MS+(m/z)2071.8
实施例5使用在5’末端具有含Dpm(4，4’-OPhy)-NH-的锚固物的底物的延伸反应
1)缩合-1
将Dpm(4，4’-OPhy)-NH2(0.30g，0.39mmol)溶解于氯仿(3mL)中，向其中添加suc-mo(Tr)Cbz(0.10g，0.15mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.04g，0.17mmol)，将混合物在室温搅拌21hr。将氯仿(10mL)添加至反应混合物，将混合物用20％盐水(10mL)洗涤，所得的包含Dpm(4，4’-OPhy)-suc-mo(Tr)Cbz的溶液直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1430.8
2)三苯甲基的脱保护-1
将Dpm(4，4’-OPhy)-suc-mo(Tr)Cbz(0.55g，0.39mmol)溶解于氯仿(6mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(1.9mL，26.1mmol)和硫羟苹果酸(0.58g，3.85mmol)。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.35g，3.08mmol)和三乙胺(0.19g，1.93mmol)的氯仿溶液(5.5mL)，将混合物在15℃搅拌1.5hr。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(1.20g，9.25mmol)的氯仿溶液(12mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，25mL)、20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，25mL×2)、以及20％盐水(25mL×2)依次洗涤，将有机层减压浓缩，得到Dpm(4，4’-OPhy)-suc-moCbz。
TOF-MS+(m/z)1188.8
实施例6使用在5’末端具有含cHxCH2(3，4，5-OPhy)-O-的锚固物的底物的延伸反 应
1)缩合-1
将cHxCH2(3，4，5-OPhy)-OH(1.0g，1.09mmol)溶解于氯仿(10mL)中，向其中添加suc-mo(Tr)Cbz(0.95g，1.41mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.27g，1.41mmol)和4-二甲基氨基吡啶(9mg，0.07mmol)，将混合物在室温搅拌23hr。减压蒸发溶剂。将残余物溶解于环己烷(30mL)和庚烷(30mL)中，将混合物用乙腈(30mL)分配洗涤两次。减压蒸发上层溶剂，将甲醇(10mL)添加至残余物，将固体浆洗(slurry-washed)，得到无色固体状的cHxCH2(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(1.62g，100％)。
TOF-MS+(m/z)1574.8
2)三苯甲基的脱保护-1
将cHxCH2(3，4，5-OPhy)-O-suc-mo(Tr)Cbz(1.00g，0.64mmol)溶解于氯仿(8.0mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(2.7mL，38.1mmol)和硫羟苹果酸(0.29g，1.90mmol)。在冰冷却后，将三氟乙酸(0.58g，5.08mmol)和三乙胺(0.32g，3.17mmol)的氯仿溶液(1.9mL)滴加至混合物，将混合物在15℃搅拌150min。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.33g，2.54mmol)的氯仿溶液(2.2mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，10mL×2)、以及20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，10mL×3)依次洗涤，得到包含cHxCH2(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz的有机层，该有机层直接供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1331.7
3)缩合-2
向包含cHxCH2(3，4，5-OPhy)-O-suc-moCbz(相当0.64mmol)的有机层添加N，N-二异丙基乙胺(0.17mL，0.99mmol)和Cl-mo-(Tr)Cbz(0.58g，0.83mmol)，将混合物在室温搅拌16hr。向反应混合物添加N，N-二异丙基乙胺(0.83mL，4.76mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.23g，0.95mmol)和2，2，2-三氟乙醇(2.36mL)，将混合物在室温搅拌2hr。将反应混合物用2，2，2-三氟乙醇和0.1mM盐酸的混合溶液(1∶19，8.5mL×2)洗涤，得到包含cHxCH2(3，4，5-OPhy)-O-suc-PMO[Cbz-Cbz]-Tr的有机层。
TOF-MS+(m/z)1993.7
实施例7使用不具有锚固物的底物的延伸反应
1)甲硅烷基系保护基的引入
将2-(N-苯甲酰基)胞嘧啶基-6-羟甲基-4-三苯甲基吗啉(4.00g，6.99mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(40mL)中。将混合物冰冷却，向其中添加咪唑(3.80g，55.9mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(4.21g，27.9mmol)，将混合物在40℃搅拌2hr。将反应混合物用水(300mL)、乙酸乙酯(150mL)和己烷(150mL)分配洗涤。回收上层并用水(100ml)分配洗涤。回收上层并减压蒸发溶剂，将残余物在40℃减压干燥，得到2-(N-苯甲酰基)胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(5.80g，120％)。
TOF-MS+(m/z)686.9
2)三苯甲基的脱保护-1
将2-(N-苯甲酰基)胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(0.10g，0.15mmol)溶解于氯仿(0.50mL)中，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(0.15mL，2.09mmol)和硫羟苹果酸(0.066g，0.44mmol)。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.13g，1.17mmol)和三乙胺(0.074g，0.73mmol)的氯仿溶液(0.35mL)，将混合物在15℃搅拌2hr。冰冷却后，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.75g，0.58mmol)的氯仿溶液(0.51mL)。所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，2.0mL×2)分配洗涤。回收下层，用20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，2.0mL×3)分配洗涤，回收下层。将包含2-(N-苯甲酰基)胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吗啉的有机层减压浓缩并供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)444.6
3)缩合-2
向包含2-(N-苯甲酰基)胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吗啉(0.065g，相当0.15mmol)的有机层(0.65mL)添加N，N-二异丙基乙胺(0.046mL，0.26mmol)和[2-(N-苯甲酰基)胞嘧啶基-4-三苯甲基吗啉-6-基]甲基二甲基磷酰胺氯化物(0.15g，0.22mmol)，将混合物在室温搅拌23hr。向反应混合物添加N，N-二异丙基乙胺(0.32mL，1.82mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.089g，0.36mmol)和2，2，2-三氟乙醇(0.14mL，1.93mmol)，将混合物在室温搅拌3.5hr。将混合物用水(2mL×2)分配洗涤，回收包含TBSO-PMO[Cbz-Cbz]-Trt的下层，减压浓缩并供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1106.3
4)三苯甲基的脱保护-2
将包含TBSO-PMO[Cbz-Cbz]-Trt(0.16g，相当0.15mmol)的有机层(1.61mL)冰冷却，滴加三氟乙酸(0.23g，2.28mmol)在氯仿(1.20ml)中的溶液。向混合物添加2，2，2-三氟乙醇(0.67mL，8.79mmol)和硫羟苹果酸(0.066g，0.44mmol)。接着，滴加三氟乙酸(0.13g，1.17mmol)和三乙胺(0.044g，0.44mmol)的氯仿溶液(1.00mL)，将混合物在15℃搅拌1hr，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.075g，0.58mmol)的氯仿溶液(0.50mL)。将混合物用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，3.00mL×2)、以及20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，3.00mL×3)依次分配洗涤，以回收包含TBSO-PMO[Cbz-Cbz]-H的下层，将下层减压浓缩并供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)864.0
5)缩合-3
向包含TBSO-PMO[Cbz-Cbz]-H(0.13g，相当0.15mmol)的有机层(1.26mL)添加N，N-二异丙基乙胺(0.046mL，0.26mmol)和(4-三苯甲基-2-胸苷基吗啉-6-基)甲基二甲基磷酰胺氯化物(0.13g，0.22mmol)，将混合物在室温搅拌16hr。向反应混合物添加N，N-二异丙基乙胺(0.32mL，1.82mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.089g，0.36mmol)和2，2，2-三氟乙醇(0.67mL，9.41mmol)，将混合物在室温搅拌2hr。将混合物用水(2mL×2)分配洗涤，回收包含TBSO-PMO[Cbz-Cbz-T]-Trt的下层，减压浓缩并干燥，得到包含目标化合物的晶体。
TOF-MS+(m/z)1436.6
实施例8使用仅在核酸碱基部分锚固(直链锚固物(具有十八烷基氧基的锚固物) 保护)的底物的延伸反应
1)甲硅烷基系保护基的引入
将2-胞嘧啶基-6-羟甲基-4-三苯甲基吗啉(4.00g，8.54mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(40mL)中。将混合物冰冷却，向其中添加咪唑(4.65g，68.3mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(5.15g，34.1mmol)，将混合物加热至40℃并搅拌2hr。将反应混合物用水(300mL)、乙酸乙酯(150mL)和己烷(150mL)分配洗涤。回收上层并用水(100ml)分配洗涤。回收上层，减压浓缩，在40℃减压干燥，得到2-胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(6.23g，125％)。
TOF-MS+(m/z)582.8
2)用直链锚固物锚固核酸碱基部分
将3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酸(1.00g，1.08mmol)溶解于氯仿(10mL)中，向其中加入N，N-二异丙基乙胺(0.56mL，3.23mmol)。将混合物冰冷却，向其中加入O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(0.61g，1.62mmol)，将混合物在室温搅拌30min。向反应混合物添加2-胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(1.26g，2.16mmol)和氯仿(1.0mL)，将混合物在40℃搅拌16hr。将乙腈(10mL)添加至反应混合物并将混合物减压浓缩。接着，向其中添加乙腈(10mL)并将混合物搅拌30min以进行结晶。通过减压过滤收集所得晶体，添加乙腈(10mL)并浆洗晶体。通过减压过滤收集所得的晶体，真空干燥，得到2-[N-{3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酰基}]胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(1.59g，99％)。
TOF-MS+(m/z)1492.4
3)三苯甲基的脱保护-1
将2-[N-{3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酰基}]胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(0.50g，0.34mmol)溶解于氯仿(3.25mL)中，将2，2，2-三氟乙醇(0.75mL，10.46mmol)和硫羟苹果酸(0.15g，1.01mmol)添加至混合物。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.31g，2.68mmol)和三乙胺(0.17g，1.68mmol)的氯仿溶液(1.00mL)，将混合物在15℃搅拌1.5hr。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.17g，1.34mmol)的氯仿溶液(1.20mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，10.0mL×2)分配洗涤。回收下层并用20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，10.0mL×3)分配洗涤，回收下层。将包含2-[N-{3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酰基}]胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吗啉的有机层减压浓缩，供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1250.0
4)缩合-2
向包含2-[N-{3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲酰基}]胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吗啉(0.42g，相当0.34mmol)的有机层(4.20mL)添加N，N-二异丙基乙胺(0.11mL，0.60mmol)和{2-(N-苯甲酰基)胞嘧啶基-4-三苯甲基吗啉-6-基}甲基二甲基磷酰胺氯化物(0.35g，0.50mmol)，将混合物在室温搅拌19.5hr。向反应混合物添加N，N-二异丙基乙胺(0.73mL，4.19mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.20g，0.84mmol)和2，2，2-三氟乙醇(0.90mL，12.5mmol)，将混合物在室温搅拌1hr。将混合物用水(6.30mL×2)分配洗涤，回收包含TBSO-PMO[CTOB-Cbz]-Trt的下层，减压浓缩，供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1911.7
5)三苯甲基的脱保护-2
将包含TBSO-PMO[CTOB-Cbz]-Trt(0.75g，相当0.34mmol)的有机层(7.50mL)冰冷却，滴加三氟乙酸(0.35g，3.43mmol)在氯仿(3.47ml)中的溶液。向混合物添加2，2，2-三氟乙醇(2.11mL，27.6mmol)和硫羟苹果酸(0.15g，1.01mmol)。接着，滴加三氟乙酸(0.31g，2.68mmol)和三乙胺(0.17g，1.68mmol)的氯仿溶液(1.00mL)，将混合物在15℃搅拌1.5hr。滴加N，N-二异丙基乙胺(0.17g，1.34mmol)的氯仿溶液(0.50mL)。将混合物用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，7.50mL×2)、以及20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，7.50mL×3)依次分配洗涤。回收包含TBSO-PMO[CTOB-Cbz]-H的下层，减压浓缩，供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1669.4
6)缩合-3
向包含TBSO-PMO[CTOB-Cbz]-H(0.56g，相当0.34mmol)的有机层(5.60mL)添加N，N-二异丙基乙胺(0.11mL，0.60mmol)和(4-三苯甲基-2-胸苷基吗啉-6-基)甲基二甲基磷酰胺氯化物(0.31g，0.50mmol)，将混合物在室温搅拌18hr。向反应混合物添加N，N-二异丙基乙胺(0.73mL，4.19mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.20g，0.84mmol)和2，2，2-三氟乙醇(2.71mL，37.8mmol)，将混合物在室温搅拌1hr。将混合物用水(11.2mL×2)分配洗涤，回收包含TBSO-PMO[CTOB-Cbz-T]-Trt的下层并减压浓缩。向其中添加乙腈(22.4mL)以进行沉淀，通过减压过滤收集沉淀物。将乙腈(11.2mL)添加至所得晶体，并将混合物浆洗。通过减压过滤收集晶体并真空干燥，得到目标化合物(0.63g，84％)。
TOF-MS+(m/z)2242.0
实施例9使用仅在核酸碱基部分锚固(支链锚固物(具有2’，3’-二氢植基氧基的锚 固物)保护)的底物的延伸反应
1)用支链锚固物锚固核酸碱基部分
将3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯甲酸(2.00g，1.98mmol)溶解于氯仿(16mL)中，向其中添加N，N-二异丙基乙胺(0.77mL，5.93mmol)。将混合物冰冷却，向其中添加O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(1.12g，2.97mmol)，将混合物在室温搅拌30min。向反应混合物添加2-胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(2.30g，3.95mmol)和氯仿(4.0mL)，将混合物在40℃搅拌17hr。将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(60mL)和氯仿(40mL)分配洗涤，将回收的下层用20％盐水(60mL×2)分配洗涤，将所得下层减压浓缩，用环己烷(60mL)、庚烷(20mL)和乙腈(60mL)分配洗涤。将回收的下层用环己烷(30mL)和庚烷(15mL)分配洗涤。将两次分配洗涤所得的上层混合，将混合物用乙腈(30mL)分配洗涤。回收上层，减压浓缩，在40℃减压干燥，得到2-[N-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯甲酰基氨基}]胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(3.47g，112％)。
TOF-MS+(m/z)1576.5
2)三苯甲基的脱保护-1
将2-[N-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯甲酰基氨基}]胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-4-三苯甲基吗啉(1.00g，0.63mmol)溶解于氯仿(6.50mL)中，将2，2，2-三氟乙醇(1.50mL，20.9mmol)和硫羟苹果酸(0.29g，1.90mmol)添加至混合物。将混合物冰冷却，滴加三氟乙酸(0.58g，5.07mmol)和三乙胺(0.32g，3.17mmol)的氯仿溶液(2.0mL)，将混合物在15℃搅拌1hr。将反应混合物冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.33g，2.54mmol)的氯仿溶液(2.2mL)。将所得溶液用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，20mL×2)分配洗涤。回收下层，用20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，20mL×3)分配洗涤，回收下层。将包含2-[N-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯甲酰基氨基}]胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吗啉的有机层减压浓缩，供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1334.2
3)缩合-2
向包含2-[N-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯甲酰基氨基}]胞嘧啶基-6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吗啉(0.85g，相当0.63mmol)的有机层(8.50mL)添加N，N-二异丙基乙胺(0.20mL，1.14mmol)和(4-三苯甲基-2-胸苷基吗啉-6-基)甲基二甲基磷酰胺氯化物(0.58g，0.95mmol)，将混合物在室温搅拌19hr。向其中添加N，N-二异丙基乙胺(1.38mL，7.93mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.39g，1.59mmol)和2，2，2-三氟乙醇(2.46mL，34.3mmol)，将混合物在室温搅拌2hr。将混合物用水(12.7mL×2)分配洗涤，回收包含TBSO-PMO[CPhyTOB-T]-Tr的下层。冰冷却后，滴加三氟乙酸(0.16g，1.40mmol)的氯仿溶液(0.80ml)。将所得溶液减压浓缩，供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1906.8
4)三苯甲基的脱保护-2
将包含TBSO-PMO[CPhyTOB-T]-Tr(1.21g，相当0.63mmol)的有机层(12.1mL)冰冷却，向其中添加2，2，2-三氟乙醇(2.73mL，38.1mmol)和硫羟苹果酸(0.29g，1.90mmol)。将三氟乙酸(0.58g，5.07mmol)和三乙胺(0.32g，3.17mmol)的氯仿溶液(1.00mL)滴加至混合物，将混合物在15℃搅拌1.5hr。滴加N，N-二异丙基乙胺(0.33g，2.54mmol)的氯仿溶液(0.50mL)。将混合物用5％碳酸钠水溶液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(4∶1，18.1mL×2)、以及20％盐水和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(3∶2，18.1mL×3)依次分配洗涤，回收包含TBSO-PMO[CPhyTOB-T]-H的下层，减压浓缩，供于后续反应。
TOF-MS+(m/z)1664.5
5)缩合-3
向包含TBSO-PMO[CPhyTOB-T]-H(1.06g，相当0.63mmol)的有机层(10.6mL)添加N，N-二异丙基乙胺(0.20mL，1.14mmol)和{2-(N-苯甲酰基腺嘌呤基)-4-三苯甲基吗啉-6-基}甲基二甲基磷酰胺氯化物(0.69g，0.95mmol)，将混合物在室温搅拌68.5hr。向反应混合物添加N，N-二异丙基乙胺(1.38mL，7.93mmol)、脯氨酰基谷氨酸(0.39g，1.59mmol)和2，2，2-三氟乙醇(5.12mL，71.3mmol)，将混合物在室温搅拌1hr。将混合物用水(21.1mL×2)分配洗涤，回收包含TBSO-PMO[CPhyTOB-T-Abz]-Tr的下层，减压浓缩，得到包含目标化合物的油状物。
TOF-MS+(m/z)2350.2
[产业适用性]
根据本发明，与固相方法相比，通过在液相中进行缩合反应，反应性显著提高，使用的单体当量可显著降低，通过反应后的萃取操作可简便地分离和纯化吗啉代寡核苷酸。因此，通过液相合成法可高效且高收率地制备具有可用作药品的链长的吗啉代寡核苷酸。
本申请以在日本申请(申请日：2014年10月14日)的专利申请号2014-210046作为基础，其内容全部包含于本说明书中。

Claims (37)

1.n+p聚体吗啉代寡核苷酸的制备方法，该方法包含下述步骤：
使p聚体吗啉代寡核苷酸与n聚体吗啉代寡核苷酸经由其吗啉环氮原子通过磷酰胺键或磷酰二胺键进行缩合后，使所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n+p聚体吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧的步骤，
所述p表示1以上的任意整数，所述n表示1以上的任意整数，
所述 p聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基被活化磷酰胺化，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，
所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’末端和/或核酸碱基各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的临时保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，n聚体吗啉代寡核苷酸的5’末端和核酸碱基、以及p聚体吗啉代寡核苷酸的核酸碱基中，至少一个被具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基保护。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，n聚体吗啉代寡核苷酸的5’末端被具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基保护。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，p聚体吗啉代寡核苷酸的核酸碱基各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在萃取操作之前，用猝灭剂处理反应混合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，猝灭剂包含具有仲氨基和羧基的化合物、或具有膦酰基的化合物。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其中，猝灭剂包含具有一个仲氨基和一个或两个羧基的化合物。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其中，猝灭剂为脯氨酰基谷氨酸。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其中，猝灭剂为脯氨酰基脯氨酸。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其中，猝灭剂包含具有膦酰基的化合物。
11.根据权利要求5所述的制备方法，其中，猝灭剂为苯膦酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的制备方法，该方法进一步包含下述步骤：
在权利要求1中所述的步骤之前，在非极性溶剂中，从n聚体吗啉代寡核苷酸除去吗啉环氮原子的临时保护基，该n聚体吗啉代寡核苷酸中，吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，而且5’末端和/或核酸碱基各自独立地被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护，
使所得反应混合物经受萃取操作，将作为产物的n聚体吗啉代寡核苷酸分离到有机层侧的步骤。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，在阳离子清除剂的存在下与酸反应而除去吗啉环氮原子的临时保护基。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，阳离子清除剂包含具有巯基和羧基的化合物、或具有羧基的吲哚化合物。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其中，阳离子清除剂包含具有一个巯基和一个或两个羧基的化合物。
16.根据权利要求13所述的制备方法，其中，阳离子清除剂为硫羟苹果酸或3-巯基丙酸。
17.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在与针对吗啉环氮原子的临时保护基的条件不同的条件下可除去的保护基为甲硅烷基系保护基。
18.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在与针对吗啉环氮原子的临时保护基的条件不同的条件下可除去的保护基为叔丁基二甲基甲硅烷基、二异丙基苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基或二苯基叔丁氧基甲硅烷基。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的制备方法，其中，p为1。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的制备方法，其中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基是下述式(II)所示的基团：
L表示单键或者式(a1)所示的基团：
式中，*表示与Y的键合位置；
**表示与待保护的氧原子或氮原子的键合位置；
L1表示任选取代的二价C1-22烃基；并且
L2表示C(=O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(=O)**所示的基团，式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1 表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基，或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键，
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基，以及
Z表示式(a2)所示的基团：
式中，*表示与Y的键合位置；
环A表示苯环或环己烷环；
R4表示氢原子，或者当 Rb为下述式(a3)所示的基团且环A和环B都是苯环时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基；
k个Q各自独立地表示单键、或者表示-O-、-S-、-OC(=O)-、-NHC(=O)-或-NH-；
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
k表示1至4的整数；
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子；
Rb表示氢原子或式(a3)所示的基团：
式中，*表示键合位置；
环B表示苯环或环己烷环；
j表示0至4的整数；
j个Q表示与上述相同的含义；
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
R6表示氢原子，或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基；并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者
Ra和Rb一起形成羰基。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的制备方法，该方法进一步包含下述步骤：
除去由权利要求1中所述的步骤得到的n+p聚体吗啉代寡核苷酸的全部保护基的步骤。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的制备方法，其中，在酸性条件下可除去的临时保护基为三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、或单甲氧基三苯甲基。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的制备方法，其中，非极性溶剂是选自卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂、脂族系溶剂、非极性醚系溶剂、以及它们的组合中的溶剂。
24.根据权利要求12至23中任一项所述的制备方法，其中，由权利要求12中所述的步骤得到的反应混合物直接用于权利要求1中所述的步骤，而不分离吗啉代寡核苷酸。
25.吗啉环氮原子未被保护的n聚体吗啉代寡核苷酸的制备方法，所述n为1以上的任意整数，该方法包含下述步骤：
在非极性溶剂中，在阳离子清除剂的存在下，使下述n聚体吗啉代寡核苷酸与酸反应而除去吗啉环氮原子的临时保护基的步骤，该n聚体吗啉代寡核苷酸中，吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，而且5’末端被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基或者在与针对前述吗啉环氮原子的保护基的条件不同的条件下可除去的保护基保护。
26.根据权利要求25所述的制备方法，其中，阳离子清除剂包含具有巯基和羧基的化合物、或具有羧基的吲哚化合物。
27.根据权利要求25所述的制备方法，其中，阳离子清除剂包含具有一个巯基和一个或两个羧基的化合物。
28.根据权利要求25所述的制备方法，其中，阳离子清除剂为硫羟苹果酸或3-巯基丙酸。
29.根据权利要求1所述的制备方法，其中，p聚体吗啉代寡核苷酸和n聚体吗啉代寡核苷酸所具有的核酸碱基中，至少一个被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护。
30.根据权利要求29所述的制备方法，其中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基为具有碳数10以上且300以下的支链烷基和/或碳数10以上且300以下的支链烯基的保护基。
31.吗啉代核苷酸，其由通式(I)表示：
式中，
m表示0以上的任意整数，
P1表示氢原子或在酸性条件下可除去的临时保护基，
P2表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基、或者在与针对P1的条件不同的条件下可除去的保护基，
碱基1表示任选被保护基保护的核酸碱基，
m个碱基2各自独立地表示任选被保护基保护的核酸碱基，
m个X各自独立地表示二C1-6 烷基氨基、或者4位氮原子被保护基保护进而任选取代的1-哌嗪基，
m个W表示氧原子，
其中，1)碱基1被保护基保护时的保护基、m个任意的碱基2被保护基保护时的任意的保护基、及P2所示的保护基中的至少一个为具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基，而且
2)当P2为具有碳数10以上且300以下的直链烷基和/或碳数10以上且300以下的直链烯基的保护基时，碱基1及m个任意的碱基2中的至少一个为被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护的核酸碱基。
32.根据权利要求31所述的吗啉代核苷酸，其中，m为0至19的整数。
33.根据权利要求31或32所述的吗啉代核苷酸，其中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基是下述式(II)所示的基团：
L表示单键或者式(a1)所示的基团：
式中，*表示与Y的键合位置；
**表示与待保护的氧原子或氮原子的键合位置；
L1表示任选取代的二价C1-22烃基；并且
L2表示C(=O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(=O)**所示的基团，式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基，或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键，
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基，以及
Z表示式(a2)所示的基团：
式中，*表示与Y的键合位置；
环A表示苯环或环己烷环；
R4表示氢原子，或者当 Rb为下述式(a3)所示的基团且环A和环B都是苯环时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基；
k个 Q各自独立地表示单键、或者表示-O-、-S-、-OC(=O)-、-NHC(=O)-或-NH-；
k个 R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
k表示1至4的整数；
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子；
Rb表示氢原子或式(a3)所示的基团：
式中，*表示键合位置；
环B表示苯环或环己烷环；
j表示0至4的整数；
j个Q表示与上述相同的含义；
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团；
R6表示氢原子、或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基；并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者
Ra和Rb一起形成羰基。
34.根据权利要求31或32所述的吗啉代核苷酸，其中，具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基选自
3,4,5-三(十八烷基氧基)苯甲酰基、和
3,4,5-三(2’,3’-二氢植基氧基)苯甲酰基。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的吗啉代核苷酸，其中，P2为甲硅烷基系保护基。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的吗啉代核苷酸，其中，P2为叔丁基二甲基甲硅烷基、二异丙基苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、或二苯基叔丁氧基甲硅烷基。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的吗啉代核苷酸，其中，P1为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、或二甲氧基三苯甲基。
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