JP4882074B2

JP4882074B2 - オリゴヌクレオチド誘導体、遺伝子検出用プローブ及びｄｎａチップ

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Publication number: JP4882074B2
Application number: JP2007505962A
Authority: JP
Inventors: 光雄関根; 康志清尾; 章寛大窪; 一石坂本; 武志佐々見
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2026-02-28
Also published as: US7851157B1; WO2006093157A1; EP1860115A1; JPWO2006093157A1; EP1860115A4

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド誘導体、遺伝子検出用プローブ等に関する。更に詳細には、プローブが脱落する等問題が発生することなく用いることのできる、オリゴヌクレオチド誘導体、遺伝子検出用プローブ等に関する。

一塩基遺伝子多型（ＳＮＰｓ）を含む遺伝子型解析は、いわゆる「テーラーメイド医療」の根拠を提供する拠点ともいえ、その必要性が急速に高まってきている。医薬品の副作用を低減させるという観点から、米国医薬品局は新薬の申請の際に薬剤の効果に関するＳＮＰｓの情報の添付を義務付ける方向に推移しており、我が国においてもＳＮＰｓの解析の必要性が高まりつつある。

現在汎用されているＳＮＰｓ解析用ＤＮＡチップは、検出プローブとして合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いており、そのＤＮＡチップの製造方法としては、大きく分けて２種類の方法が知られている。第一に、既に合成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドをスライドガラス等の基板表面に固定化する方法（coupling合成法、非特許文献１参照）である。第二に、オリゴヌクレオチドをスライドガラス等の基板上で合成する方法（in situ合成法、非特許文献２参照）である。

Coupling合成法においては、まず反応性の高い官能基をＤＮＡオリゴヌクレオチドに付加してＤＮＡプローブを得る。次いで、得られたＤＮＡプローブをスライドガラス等の基板表面にスポットすることで、ＤＮＡプローブと基板表面に存在する官能基とを化学反応させ、共有結合を介してプローブ分子を基板に固定化する。この方法は、ＤＮＡプローブのスポッティング技術の煩雑さのために、基板表面への固定化効率を制御することが非常に困難であり、品質管理にも影響を及ぼすこととなる。

一方、in situ合成法においては、光リソグラフィーやバブルジェット技術を利用して、スライドガラス等の基板表面でプローブを合成していく。この方法は、特定の位置でＤＮＡ合成を行う技術であるため、ＤＮＡプローブの基板表面への固定化反応を省略することができ、ＤＮＡチップ合成のハイスループット化が可能になる。しかし、このin situ合成法は基板表面におけるＤＮＡ鎖の伸長反応効率が低く、ＤＮＡプローブ純度が悪くなり、そのために正確性が低いという欠点がある。たとえば、光リソグラフィーを用いた合成においては、鎖伸長反応の効率が最高でも９５％程度であり、例えば２０塩基長のプローブを合成した場合の有効プローブは４０％以下となる。すなわち、不正確な配列を有するプローブが６０％以上存在することとなる。

Ange wandte Chemie international edition, 2002, 41, 1276-1289 B iopolymer, 2004, 73, 579-596

不正確な配列を有するプローブが多く存在することは、正確性が求められるＳＮＰ解析等においては結果の正確性を欠く原因となるという問題がある。
従来は、プローブを作成する際に、核酸塩基部に保護基を結合し、最終的に、この保護基をアンモニア処理により除去する必要があったが、アンモニア処理を行うことにより、アンカー部分のＳｉ−Ｏ結合が切断され、９０％程度のＤＮＡプローブが担体上から脱落するという問題があった。
従って、本発明の目的は、ＳＮＰ等に用いる場合に、上記問題が発生することなく用いることができるオリゴヌクレオチド誘導体を提供することにある。
また、本発明は上記オリゴヌクレオチド誘導体を用いた遺伝子検出法における利用法を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、特定のオリゴヌクレオチドを用いることにより、上記目的を達成し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、下記一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を提供するものである。

（上記式中、Ａ^１及びＡ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素、水酸基、アルキル基、リン酸基又は置換基を結合していてもよいトリチル基であり、ｎは１０〜５０の整数であり、Ｙ^２は水素、水酸基、アルコキシ基又は２−シアノエトキシ基であるか、又はＹ^２とリボース4'位炭素とが結合し、環を形成していてもよく、Ｂ^２は天然又は非天然の核酸塩基であり、Ｒ^２は、核酸塩基のアミノ基に結合した置換基であり、水素、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、アルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、又はアルキル基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はフェニル基と結合したものを含む）であり、Ｂ^１は下記一般式（２）で表わされる置換基を表す。）

（上記式中、Ｂは天然又は非天然の核酸塩基であり、Ｒは、核酸塩基のアミノ基に結合した置換基であり、水素、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、アルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、又はアルキル基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はフェニル基と結合したものを含む）であり、Ｘは酸素原子^-、硫黄原子^-、ＢＨ_３、ＯＣＨ_３、又はＣＨ_３であり、Ｙは水素、水酸基、アルコキシ基又は２−シアノエトキシ基であるか、又はＹとリボースの４’位炭素とが結合し、環を形成していてもよい。また、Ｒ及びＲ^２は、少なくとも１個が水素でない。）

また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド誘導体の少なくとも１つ以上を担体に固定化させてなる、遺伝子検出用マイクロアレイを提供する。
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド誘導体の少なくとも１つ以上を担体に固定化させてなる、ＤＮＡチップを提供する。

また、本発明は、下記一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を、試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程：及びハイブリダイズ産物を検出する工程を有する、標的核酸中のヌクレオチドの同定方法を提供する。

また、本発明は、下記一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、遺伝子の発現を抑制する、遺伝子発現制御方法を提供する。

また、本発明は、一般式（１７）で表わされるヌクレオチド誘導体を提供する。

（上記式中、Ｒ^３はリン酸保護基を表し、Ｒ^４は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表し、Ｒ^５は、水素、アルコキシ基または炭素数１から１０の同一または異なるアルキル基を有するトリアルキルシリルオキシ基、トリアルキルシリルオキシメトキシ基もしくはシアノエチル基であるか、又はリボースの４’位炭素と結合して環を形成しており、Ｒ^６は水酸基の保護基を表し、Ｒ^７は、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、アルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、又はアルキル基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はフェニル基と結合したものを含む）であり、Ｘ^２は窒素原子もしくは置換基を有してもよい炭素原子を表わす。）

また、本発明は、一般式（１８）で表わされるヌクレオチド誘導体を提供する。

（上記式中、Ｒ^３はリン酸保護基を表し、Ｒ^４は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表し、Ｒ^５は、水素、アルコキシ基または炭素数１から１０の同一または異なるアルキル基を有するトリアルキルシリルオキシ基、トリアルキルシリルオキシメトキシ基もしくはシアノエチル基であるか、又はリボースの４’位炭素と結合して環を形成しており、Ｒ^６は水酸基の保護基を表し、Ｒ^７は、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、アルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、又はアルキル基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はフェニル基と結合したものを含む）であり、Ｒ^８は、ジフェニルカルバモイル基もしくは、ケイ素上に同一又は異なるアリール基もしくはアルキル基を合計３つ有するシリル基であり、Ｘ^３は窒素原子又はメチンを表す。）

また、本発明は、一般式（１９）で表わされるヌクレオチド誘導体を提供する。

（上記式中、Ｒ^３はリン酸保護基を表し、Ｒ^４は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表し、Ｒ^５は、水素、アルコキシ基または炭素数１から１０の同一または異なるアルキル基を有するトリアルキルシリルオキシ基、トリアルキルシリルオキシメトキシ基もしくはシアノエチル基であるか、又はリボースの４‘位炭素と結合して環を形成しており、Ｒ^６は水酸基の保護基を表し、Ｒ^７は、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、アルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、又はアルキル基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はフェニル基と結合したものを含む）であり、Ｘ^４は窒素原子もしくはメチンであり、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子である。）

本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、保護基を残したまま塩基の識別を行うことのできるものである。
本発明のプローブ、マイクロアレイ、ＤＮＡチップは、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いているので、感度よく、遺伝子の検出を行うことができる。
本発明のヌクレオチド誘導体は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造するための原料として用いられる。

以下、先ず本発明のオリゴヌクレオチド誘導体について説明する。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、下記一般式（１）で表わされる。

上記一般式（１）において、Ａ^１及びＡ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素、水酸基、アルキル基、リン酸基又は置換基を結合していてもよいトリチル基である。アルキル基としては、炭素数が１〜２０個であるアルキル基が好ましい。炭素数が２０個を超えると、二重鎖形成能及び塩基識別能が低下する場合がある。また、トリチル基に結合するアルキル基としては、炭素数が１〜２０個のアルキル基等が挙げられる。
ｎは１０〜５０である。ｎが１０未満であると二重鎖形成能が低下し、一方、ｎが５０を超えると塩基識別能が低下する。
Ｙ^２は水素、水酸基、アルコキシ基又は２−シアノエトキシ基エチル基であるか、又はＹ^２とリボース4’位炭素とが結合し、環を形成していてもよい。アルコキシ基としては、炭素数が１〜２０個のアルコキシ基が好ましい。

Ｂ^２は天然又は非天然の核酸塩基である。具体的には、天然のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのほかに人工塩基である７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、8位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたシトシン、シュードイソシトシン、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードイソシトシン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたウラシル、シュードウラシル、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードウラシル等が挙げられる。

Ｒ^２は、核酸塩基のアミノ基に結合した置換基である。従って、Ｂ^２がアミノ基を有しない核酸塩基である場合にはＲ^２は存在しない。具体的には、Ｒ^２は、水素、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、アルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、又はアルキル基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はフェニル基と結合したものを含む）である。アルキル基としては、炭素数が１〜３０個のアルキル基が好ましい。また、このアルキル基と結合するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基としては、炭素数が１〜３０個のものが好ましい。
Ｂ^１は下記一般式（２）で表わされる置換基を表す。

上記一般式（２）において、Ｂは天然又は非天然の核酸塩基である。具体的には、天然のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのほかに人工塩基である７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入された７−デアザグアニン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたシトシン、シュードイソシトシン、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードイソシトシン、５位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基等）が導入されたウラシル、シュードウラシル、１位に種々の官能基（アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル基、水酸基等）が導入されたシュードウラシル等が挙げられる。

Ｒは、核酸塩基のアミノ基に結合した置換基である。従って、Ｂがアミノ基を有しない核酸塩基である場合にはＲ^２は存在しない。具体的には、Ｒは、水素、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、アルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、又はアルキル基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はフェニル基と結合したものを含む）である。アルキル基としては、炭素数が１〜３０個のアルキル基が好ましい。また、このアルキル基と結合するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基としては、炭素数が１〜３０個のものが好ましい。カルバモイル基、チオカルバモイル基に結合するアルキル基としては、炭素数が１〜１０個程度のものが好ましい。

Ｘは酸素原子^-、硫黄原子^-、ＢＨ_３、ＯＣＨ_３、又はＣＨ_３である。Ｙは水素、水酸基、アルコキシ基又は２−シアノエトキシ基エチル基であるか、又はＹとリボース４’位炭素とが結合し、環を形成していてもよい。
また、上記一般式（１）及び（２）において、Ｂ及びＢ_２は、少なくとも１個は、アミノ基を有する核酸塩基であり、Ｒ及びＲ_２は、少なくとも１個が水素でない。

本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、プローブとして用いることができる。プローブとして使用することにより、試料中に含まれる標的核酸の特定位置の特定位置の塩基の種類を決定する等に用いることができる。

本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、従来公知の方法を組み合わせて製造することができる。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造するには、まず、オリゴヌクレオチド誘導体を構成するユニット（ホスホロアミダイト）毎の製造を行い、その後、連結することにより実施することができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法によって製造することができる。
オリゴヌクレオチド誘導体を構成するユニットの製造は、従来公知の方法を組み合わせて行うことができる。また、オリゴヌクレオチド誘導体を構成するユニット（ホスホロアミダイト）としては、市販されているものを用いてもよい。

次に、本発明のＤＮＡチップについて説明する。
本発明のＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）は、上述した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の少なくとも１つ以上を固定化させてなる。固定化とは、吸着も含む概念であり、また共有結合等による結合も含まれる。

ＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）を作成する際の基板表面へのＤＮＡのスポット径に特に制限はないが、通常は５０〜２００μｍ程度である。また、スポットピッチに特に制限はなく、通常は１００〜５００μｍ程度である。

本発明のＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）は、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体のＡ_１又はＡ_２が担体と結合してなる。用いられる担体としては、例えば、微小多孔質ガラス、ポーラスガラス等のガラス、ポリスチレン、金属、フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ等が挙げられる。また、担体の形状は、板状（基板状）、ビーズ状等、どのような形状のものであってもよい。

ＤＮＡチップは、ブローブオンキャリア法を用いたものであってもよい。プローブオンキャリア法とは、ＤＮＡ合成に最も適した素材とされる微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）上でＤＮＡプローブを合成した後、プローブ分子をＣＰＧ担体から切り離すことなく、ＣＰＧに結合したＤＮＡプローブを用いてＳＮＰｓ検出に用いる手法のことを意味する。用いられるＣＰＧのサイズは、好ましくは粒径が５００Åから５，０００Åである。このプローブオンキャリア法を用いることにより、ＤＮＡプローブの基板への固定化操作を省略することができるため、ＤＮＡチップ合成のハイスループット化が可能になる。また、ＤＮＡ鎖伸長反応効率が９９．８％以上と非常に高いため、ＤＮＡプローブの純度を高くすることができ、ＤＮＡチップの正確性が大幅に向上するという利点を有する。また、必要なＤＮＡプローブを有するＣＰＧは、大量生産が可能であり、コストの低減や、より質の高い品質管理が可能となる。更に、従来のＤＮＡチップは、ほとんどがスライドガラス平面上で二次元的に検出を行っていたのに対し、プローブオンキャリア法では、ＣＰＧを用いているため、三次元的な検出が可能となり、ＤＮＡプローブの高密度な配置が可能となり、高い感度の検出が可能である。

上述した、プローブオンキャリア法に、既存のＤＮＡ合成システムを適用した場合、核酸塩基部の保護基を除去する過程（アンモニア処理）で、リンカー部分のＳｉ−Ｏ結合が切断されてしまい、約９０％のＤＮＡプローブが担体表面から脱離してしまうという現象が見られる。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体をプローブオンキャリア法に適用した場合、保護基を除去する必要がないので、上記問題が解消される。

担体表面に、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を固定化する場合には、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体のＡ_１又はＡ_２を、適当なリンカーを介して、例えば金属−硫黄結合等の方法によって結合させる方法が挙げられる。また、担体表面に固定化させるオリゴヌクレオチド誘導体は１種類のみならず、２種類以上であってもよい。なお、Ａ_１又はＡ_２の中で、担体と結合していない方の置換基は、ＤＮＡチップ等として用いた際の検出に用いるために、蛍光分子、消光分子等を結合させてもよい。

本発明のＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）は、試料中の核酸の同定方法等に用いることができる。
方法としては、まず、試料と、本発明のＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）とをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズに際しては、ＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）に固定されたオリゴヌクレオチド誘導体に対し、試料を例えば０．１μＭ〜１００μＭ程度添加することができる。また、ハイブリダイズの条件は、ポリヌクレオチド誘導体の種類によって異なるが、例えば０〜６０℃の温度で、例えば１〜３０時間程度である。

ハイブリダイズ終了後は、チップの種類に適した洗浄液で２〜５回洗浄を行う。このように、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、核酸の同定方法や遺伝子検出に用いることができる。遺伝子検出の手法としては、上述した、ＤＮＡチップ、マイクロアレイに加え、リアルタイムＰＣＲが挙げられ、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、上述した手法に用いることができる。

次に、本発明の標的核酸中のヌクレオチドの同定方法について説明する。
本発明の標的核酸中のヌクレオチドの同定方法は、上記一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を、試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程：及び
ハイブリダイズ産物を検出する工程を有する。
本発明の標的核酸中のヌクレオチドの同定方法においては、先ず、上記一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を、試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる。用いられる試料としては、特に制限はなく、核酸を含むものであればよく、例えば、細胞抽出液、血液等の体液、ＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。ハイブリダイズの条件は上述した通りである。

本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、遺伝子の発現を抑制する、遺伝子発現制御方法に用いることができる。本発明の遺伝子発現制御方法は、発現を制御しようとする遺伝子の目的部位と結合するように設計し、細胞に投与することによって実施する。投与は、オリゴヌクレオチド誘導体を単独で投与してもよく、担体に結合させた状態で投与してもよい。投与方法は、経口的又は非経口的方法、いずれであってもよく、非経口的投与としては、例えば局所に静脈内、筋肉内、皮下、経皮的に投与することができる。また、所望の組織を標的としてアンチセンスオリゴヌクレオチドを輸送するための手段や、標的細胞への導入を容易にするための手段、例えば薬理学的に許容されるカチオン性脂質等によるリポソームの利用等も可能である。投与されたオリゴヌクレオチドは、発現を制御しようとする遺伝子の目的部位と結合し、その遺伝子の発現が制御される。

次に、本発明のヌクレオチド誘導体について説明する。
まず、本発明の第１の実施の形態にかかるヌクレオチド誘導体について説明する。
本発明の第１の実施の形態にかかるヌクレオチド誘導体は下記一般式（１７）で表わされる。

上記一般式（１７）において、Ｒ^３はリン酸保護基を表す。リン酸保護基としては、ホスホロアミダイト法に用いられるものであれば、特に制限なく用いることができ、例えば、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基等が挙げられる。

Ｒ^４は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表す。なお、２個のアルキル基が互いに結合して環を形成していてもよい。このようなジアルキルアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が挙げられる。

Ｒ^５は、水素、アルコキシ基または炭素数１から１０の同一または異なるアルキル基を有するトリアルキルシリルオキシ基、トリアルキルシリルオキシメトキシ基もしくはシアノエチル基であるか、又はリボースの４‘位炭素と結合して環を形成していてもよい。アルコキシ基としては、炭素数が１〜６個のアルコキシ基が好ましく、このようなアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられ、また、２−プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基等のように分枝したアルコキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルメチルオキシ基等の、側鎖の一部もしくは全部が環化したアルコキシ基も含む。

また、Ｒ^６は水酸基の保護基を表す。水酸基の保護基としては、ホスホロアミダイト法で用いられるものであれば特に制限はなく、例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等が挙げられる。

Ｒ^７は、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、アルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、又はアルキル基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はフェニル基と結合したものを含む）である。アルキル基としては、炭素数が１〜３０個のアルキル基が好ましい。また、このアルキル基と結合するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基としては、炭素数が１〜３０個のものが好ましい。
また、Ｘ^２としては、窒素原子又は置換基を有してもい炭素原子を表わす。

一般式（１７）で表わされる、本発明のヌクレオチド誘導体の具体例としては、下記式（２０）で表わされる化合物（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシ−６Ｎ−アセチル−７−デアザアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド）及び下記式（２１）で表わされる化合物（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシ−６Ｎ−アセチル−８−アザ−７−デアザアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド）等が挙げられる。

式（２０）及び（２１）において、ＤＭＴｒはジメチルトリチル基を表す（以下、本明細書において同様である）。
次に、本発明の第２の実施の形態にかかるヌクレオチド誘導体について説明する。
本発明の第２の実施の形態にかかるヌクレオチド誘導体は下記一般式（１８）で表わされる。

上記一般式（１８）において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６及びＲ^７は、上記式（１７）において説明したのと同様である。Ｘ^３は、窒素原子又はメチンを表す。また、一般式（１８）で表わされるヌクレオチド誘導体は、１以上のジフェニルカルバモイル基が結合していてもよい。また、Ｒ^８は、ジフェニルカルバモイル基もしくは、ケイ素上に同一又は異なるアリール基もしくはアルキル基を合計３つ有するシリル基である。Ｒ^８の具体例としては、例えば、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。上記一般式（１８）で表わされる、本発明のヌクレオチド誘導体の具体例としては、下記式（２２）で表わされる化合物（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２Ｎ−メチルカルバモイルデオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド）、下記式（２３）で表わされる化合物（２−Ｎ−カルバモイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル））−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド）、及び下記式（２４）で表わされる化合物（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２Ｎ−メチルチオカルバモイルデオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド）等が挙げられる。

次に、本発明の第３の実施の形態にかかるヌクレオチド誘導体について説明する。
本発明の第３の実施の形態にかかるヌクレオチド誘導体は下記一般式（１９）で表わされる。

上記一般式（１９）において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６及びＲ^７は、上記式（１７）において説明したのと同様である。また、一般式（１９）において、Ｘは窒素原子もしくはメチンであり、Ｘ^１は酸素原子又は硫黄原子であり、Ｘ^４は窒素原子又はメチンであり、また、一般式（１９）で表わされるヌクレオチド誘導体は、１以上のジフェニルカルバモイル基が結合していてもよい。一般式（１９）で表わされる、本発明のヌクレオチド誘導体の具体例としては、下記式（２５）で表わされる化合物（２−Ｎ−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−３−デアザグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド）等が挙げられる。

本発明のヌクレオチド誘導体は、上述した、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造するための原料として用いることができる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
デオキシグアノシン(1.33g 5mmol)をピリジン共沸で脱水し、３０ｍｌの無水メタノールに溶解した後、ジメトキシジメチルアミノメタン（１．８１ｍｌ、1.78g 15mmol)を加え、55℃で15時間、撹拌を行った。撹拌終了後、室温まで反応溶液を冷却し、沈殿物をろ過して回収し、白色粉末の生成物を得た。次に、得られた白色粉末をピリジン共沸で脱水し、５０ｍｌの無水ピリジンに溶解した。得られた溶液にジメトキシトリチルクロライド(1.86g 5.5mmol)を加え、室温で12時間撹拌した後、反応溶液に１０ｍｌのメタノールを加え、さらに5分間撹拌した。次いで、この反応溶液を２００ｍｌのクロロホルムで希釈し、5質量％炭酸水素ナトリウム水溶液200mlで3回抽出操作を行った。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させた。得られた粗生成物をジイソプロピルエーテルを用いて結晶化させ、ろ過し、白色粉末の生成物を回収した。

次いで、得られた白色粉末の生成物に、１００ｍｌのピリジン−アンモニア水溶液(1:1 v/v)に加え、室温で15時間、撹拌を行った。撹拌終了後、アンモニアを減圧留去し、２００ｍｌのクロロホルムで希釈し、５質量％炭酸水素ナトリウム水溶液200mlで3回抽出操作を行った。次いで、有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させた。得られた粗生成物を、ジイソプロピルエーテルを用いて結晶化させろ過し、白色粉末の5’-O-(ジメトキシ)トリチル-2’-デオキシグアノシンを回収した(1.65g、収率：58%)。
¹H NMR (CDCl₃): 2.22 - 2.31( m, 1H ), 2.57 - 267( m, 1H ), 3.09 - 3.15( m, 2H ), 3.71( s, 6H ), 3.81 - 3.91( m, 1H ), 4.32 - 4.35( m, 1H ), 5.28( d, 1H, J = 4.4 Hz ), 6.12( dd, 1H, J = 6.3, 6.8 Hz ), 6.42(br s, 2H), 6.81(dd, 4H, J = 6.8, 8.8 Hz ), 7.17-7.34( m, 9H ), 7.76( s, 1H ), 10.58( br s, 1H )

上述のようにして得られた5’-O-(ジメトキシ)トリチル-2’-デオキシグアノシン(2.85g 5mmmol)をピリジン、トルエン、ジクロロメタンの順で共沸して脱水後、１０ｍｌの無水テトラヒドロフラン（THF）に溶解させた後、ジイソプロピルエチルアミン(1.23ml 7.5mmol)を加えた。この溶液を-78℃まで冷却し、(２−シアノエトキシ基エチル)(N,N-ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.23ml 5.5mmol)を加えてから、徐々に室温まで戻した。1時間撹拌した後、反応溶液を２０ｍｌの水に注ぎ、２００ｍｌのクロロホルムで希釈し、５質量％炭酸水素ナトリウム水溶液200mlで3回抽出操作を行った。有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させた。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(1% トリエチルアミン)により精製し、ヘキサン−クロロホルム（クロロホルムを５０〜１００％に変化させる）、次いで、クロロホルム−メタノール（メタノールを０〜３％に変化させる）を用いて溶出し、溶媒を留去し、白色固体の5’-O-(ジメトキシ)トリチル-2’-デオキシグアノシン 3’-O-(２−シアノエトキシ基エチル N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)（下記式（３）で表わされる化合物）を得た。3.35g、収率：92%)。
³¹P NMR (CDCl₃): 149.4 149.2
¹H NMR (CDCl₃): 1.01 - 1.25(m, 12H ), 2.41( t, 1H, J = 10.5 Hz ), 2.43 - 2.77( m, 3H ), 3.31 - 3.80( m, 12H), 4.11 - 4.18( m, 1H ), 4.55 - 4.61( m, 1H ), 6.43 - 6.49( m 1H ), 6.74 - 6.80( m, 4H ), 7.10 - 7.36( m, 11H ), 760 - 7.69( m, 1H )

実施例２
2’-デオキシアデノシン一水和物（4g, 15mmol）を酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.3）75mlに懸濁させた。この溶液に、臭素（0.92ml, 18mmol）を溶解させた酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.3）75mlを滴下し、室温で２時間撹拌した。次いで、5%チオ硫酸ナトリウム水溶液を50ml加え、次いで、2M水酸化ナトリウム水溶液を50ml加えた。得られた沈殿物をろ過することにより回収し、水、エタノールで十分に洗浄し、8-ブロモ-2’-デオキシアデノシンを得た（4.2g, 収率：83%）。
¹H NMR (DMSO): 2.08 - 2.16(m, 1H ), 3.05 - 3.15(m, 1H ), 3.41 - 3.48(m, 1H), 3.54 - 3.61( m, 1H ), 3.78 - 3.83(m, 1H), 4.40 - 4.41(m, 1H), 4.91(s, 1H), 5.29(s,1H), 5.43(brs, 2H), 6.13(t, 1H, J = 7.25 Hz), 8.12(s, 1H )

上述のようにして得られた8-ブロモ-2’-デオキシアデノシン（4.2g, 12.5mmol）を80%酢酸−無水酢酸（1 : 1, v/v, 250ml）に溶解し、この溶液に酢酸ナトリウム(18.5g, 225mmol)を加えた。次いで、120℃で3時間撹拌した後、酢酸エチル−水（500ml/500ml）で抽出操作をおこない、有機層を回収し溶媒を減圧下留去した。得られた組成生物を28%アンモニア水−ピリジン（1 : 1, v/v, 250ml）に溶解し、室温で5時間撹拌した。次いで、この反応溶媒を減圧下留去し、得られた固体をエタノールで十分に洗浄・ろ過し、2’-デオキシ-7,8-ジヒドロ-6-N-アセチルアデノシン-8-オンを得た (1.9g, 収率：55%)。
¹H NMR (DMSO): 2.05 - 2.12(m, 1H ), 2.21(s,3H), 3.03 - 3.16(m, 1H ), 3.45 - 3.48(m, 1H), 3.55 - 3.60( m, 1H ), 3.78 - 3.80(m, 1H), 4.38 (brs, 1H), 4.81(brs, 1H), 5.22(s,1H), 6.15(t, 1H, J = 7.25 Hz), 8.12(s, 1H ), 10.20(brs, 1H), 10.83(brs,1H).

上述のようにして得られた2’-デオキシ-7,8-ジヒドロ-6-N-アセチルアデノシン-8-オン (1.5g, 5mmol) をピリジン共沸で脱水し、５０ｍｌの無水ピリジンに溶解した後、この溶液にジメトキシトリチルクロライド(1.86g 5.5mmol)を加えた。次いで、この溶液を室温で4時間撹拌した後、反応溶液に１０ｍｌのメタノールを加え、さらに5分間撹拌した。次いえ、この反応溶液を２００ｍｌのクロロホルムで希釈し、５質量％炭酸水素ナトリウム水溶液200mlで3回抽出操作を行った。有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させた。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、クロロホルム(0.5% ピリジン)に0〜3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し、白色個体の2’-デオキシ-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-7,8-ジヒドロ-6-N-アセチルアデノシン-8-オンを得た (2.45g,収率：80%)。
¹H NMR (CDCl₃): 2.11 - 2.15( m, 1H ), 2.21( s, 3H ), 3.04 - 3.15( m, 1H ), 3.70( s, 6H ), 3.81 - 3.91( m, 1H ), 4.32 - 4.35( m, 1H ), 6.13( dd, 1H, J = 6.2, 6.7 Hz ), 6.81(dd, 4H, J = 6.8, 8.8 Hz ), 7.10 - 7.28( m, 9H ), 8.20( s, 1H ), 10.20( br s, 1H), 10.82(brs, 1H).

上述のようにして得られた2’-デオキシ-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-7,8-ジヒドロ-6-N-アセチルアデノシン-8-オン (3.06g 5mmmol)をピリジン、トルエン、ジクロロメタンの順で共沸して脱水後、１０ｍｌの無水THFに溶解させた後、ジイソプロピルエチルアミン(1.23ml 7.5mmol)を加えた。この溶液を-78℃まで冷却し、(２−シアノエトキシ基エチル)(N,N-ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.23ml 5.5mmol)を加えてから、徐々に室温まで戻した。1時間撹拌した後、反応溶液を２０ｍｌの水に注ぎ、２００ｍｌのクロロホルムで希釈し、５質量％炭酸水素ナトリウム水溶液200mlで3回抽出操作を行った。有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(１％トリエチルアミン)により精製し、ヘキサン−クロロホルム（クロロホルムを50〜100%に変化させる）、クロロホルム−メタノール（メタノールを0〜3%に変化させる）グラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し、2’-デオキシ-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-7,8-ジヒドロ-6-N-アセチルアデノシン-8-オン3’-O-(２−シアノエトキシ基エチル N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（下記式（４）で表わされる化合物）白色固体を得た(3.57g, 収率：88%)。

上記式（３）で表わされる化合物（ホスホロアミダイト）、上記式（４）で表わされる化合物（ホスホロアミダイト）、下記式（５）で表わされる化合物、及び下記式（６）で表わされる化合物を用いてプローブの作成を行った。なお、下記式（５）で表わされる化合物及び下記式（６）で表わされる化合物は市販のものを用いた。下記式（５）で表わされる化合物としては、GLEN RESERCH社製、商品名「P/N 10-1015-02 Ac-dC-CE Phosphoramidite」を、下記式（６）で表わされる化合物としては、GLEN RESERCH社製、商品名「P/N 10-1030-02 dT-CE Phosphoramidite」を用いた。

プローブの合成は、Applied Biosynthesis Incの自動合成機、商品名「DNA/RNA Synthesizer 392」を用いて行い、配列GCCTCCGGTTCAT（配列番号：１）で表わされるプローブを作成した。プローブの自動合成機による合成は、末端に１６−ヒドロキシヘキサデカン酸を導入した微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）固相担体（１０ｍｇ、１０μｍｏｌ／ｇ）を用いて行った。合成各鎖伸長サイクルは、以下の表１に示す通りであり、縮合反応では、ベンゾイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）を用いた。

次いで、鎖伸長後に、５’末端の４，４’−ジメトキシトリチル基を残したままで、１分間の1,8-ジアザビシクロ〔５，４，０〕ウンデセン（ＤＢＵ）−アセトニトリル（１：９，ｖ／ｖ）処理により、リン酸部のシアノエチル基を除去した。次いで、４，４’−ジメトキシトリチル基を１分間の３％濃度のトリクロロ酢酸の塩化メチレン溶液（２ｍｌ）で除去し、塩化メチレン（１ｍｌ×３回）、アセトニトリル（１ｍｌ×３回）及び０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液の淳で固相担体の洗浄を行い、プローブが結合したＣＰＧを得た。

上述のようにして得られたプローブが結合したＣＰＧを十分に乾燥させた後、ATGAACCGGAGGC（配列番号：２）、ATGAACCAGAGGC（配列番号：３）及びATGAACTGGAGGC（配列番号：４）の配列を有する３種類の蛍光オリゴヌクレオチドを準備した。なお、それぞれのオリゴヌクレオチドは、３’末端がフルオレセインで標識されたものである。このオリゴヌクレオチド溶液（２５０ｎMオリゴヌクレオチド、１００ｍMリン酸バッファー、１M NaCl、ｐH７．０）０．２５ｍｌに、上記プローブが結合したＣＰＧを浸漬させた。５０℃の温度で１０時間撹拌した後、オリゴヌクレオチド溶液を除去し、リン酸バッファー（１００ｍMリン酸バッファー、１M NaCl、ｐH７．０）０．２５ｍｌを加え、５０℃の温度で１時間撹拌した後、リン酸バッファーを除去し、ＣＰＧの蛍光測定を行った。

蛍光測定は、OLYMPUS社製、落射蛍光システムを用いて、４７０〜４９０ｎｍの光を照射し、５１０ｎｍ以上の光を、浜松ホトニクス社製デジタルCCDカメラ（ORCA-ER）を用いて撮影し、蛍光輝度を測定した。結果は、配列番号：２のオリゴヌクレオチドを用いた場合のみが高い蛍光輝度を示した。すなわち、露光時間３００μＳで測定した場合、平均の蛍光輝度は、配列番号：２のオリゴヌクレオチドを用いた場合が２３７５、配列番号：３のオリゴヌクレオチドを用いた場合が３３７、配列番号：４のオリゴヌクレオチドを用いた場合が７１４であり、配列番号：２で表わされるオリゴヌクレオチドの特異性が示された。

上記の結果から、上記プローブが結合したＣＰＧは、遺伝子の検出に用いることが明らかである。特に、１塩基のみが異なっているオリゴヌクレオチドを区別することができることがわかり、ＳＮＰｓの解析にも使用し得るものであることがわかった。

実施例３
７９０ｍｇの３−デアザグアノシン（下記式（７）で表わされる化合物）を１ｍｌの無水DMFで供沸し、次いで、２０ｍｌの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、室温にした後、１．８７ｍｌのN，Nジメチルホルムアミドジメチルアセタールを加え、５時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、メタノールを加え、沈殿を生じさせた。この沈殿を濾過により精製し、よく乾燥させ、２−N-((ジメチルアミノ)メチレン)−３−デアザグアノシン（下記一般式（８）で表わされる化合物）を得た（７８９ｍｇ、収率：８３％）。
¹H NMR （DMSO-d６）δ２．９-３．１（６H，NCH_３），３．５-４．４（５H，２’H，３’H，４’H ，５’H），５．０-６．１（５H，１’H，２’OH，３’OH，５’OH，３H），７．９-８．０（２H，８H，NCHN），１０．６-１０．７（１H，１H）

次いで、得られた２−N-((ジメチルアミノ)メチレン)−３−デアザグアノシン（３３７ｍｇ）を、１ｍｌの無水ピリジンで共沸(×3)し、次いで、６ｍｌの無水ピリジンに溶解し、０℃で３４２μｌの1,1,3,3テトライソプロピルジシロキサンジクロライド１，３−ジイルを加え、４時間撹拌した。４時間撹拌した後、１ｍｌの水及び１ｍｌのメタノールを加え反応を停止させた。反応溶液を５０ｍｌの酢酸エチル／食塩水（１／１）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（N６０球状中性シリカゲル）を用いてメタノール／クロロホルム（メタノール濃度を２％→４％に変化させる）で精製し、３’,５’-O-(1,1,3,3テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2-Ｎ-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（下記式（９）で示される化合物）を得た（３８２ｇ、収率：６６％）。
¹H NMR （DMSO-d６）δ０．６，１．３（２８H，CCH_３，SiCHC_２），２．９-３．１（６H，NCH_３），３．９-４．４（５H，２’H，３’H，４’H ，５’H），５．６-６．０（３H，１’H，２’OH，３H），７．９-８．０（２H，８H，NCHN），１０．６-１０．７（１H，１H）

上記式（９）において、Ｒ^１０はテトライソプロピルジシロキサンである。
次いで、上述のようにして得られた、３’,５’-O-(1,1,3,3テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2-Ｎ-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（１００ｍg）を、１ｍｌの無水ピリジンで共沸(×3)し、３ｍｌの無水ピリジンに溶解し、３１μｌのイソプロピルエチルアミン、及び４８ｍｇのジフェニルカルバモイルクロライドを加え、室温で4.5時間撹拌した。４．５時間の撹拌後、２０ｍｌの重曹水を加え反応を停止させた。反応溶液を２０ｍｌの酢酸エチル／重曹水（１／１）で1回抽出した後、２０ｍｌの酢酸エチル／食塩水（１／１）で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いてヘキサン／酢酸エチル（ヘキサン濃度を50％→80％に変化させる）で精製し、3’,5’-O-(1,1,3,3テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（下記式（１０）で表わされる化合物）を得た（１０５ｍｇ、収率：７９％）。
¹H NMR （DMSO-d６）δ０．６，１．３（２８H，CCH_３，SiCHC_２），２．９-３．１（６H，NCH_３），３．９-４．４（５H，２’H，３’H，４’H ，５’H），５．７-５．９（２H，１’H，２’OH），６．９-７．０（１H，３H），７．２-７．６（１０H，C_６H_５），８．２-８．５（２H，８H，NCHN）

上記式（１０）において、Ｒ^１０はテトライソプロピルジシロキサンである。
次いで、上述のようにして得られた、3’,5’-O-(1,1,3,3テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（１５５ｍｇ）を、１ｍｌの無水トルエンで共沸(×2)し、５ｍｌの無水DMFに溶解し、６２μｌのヨウ化メチル、及び１２ｍｇの水素化ナトリウムを加え、-20℃で３時間撹拌した。３時間撹拌した後、５０ｍｌの酢酸エチルを加え、リン酸緩衝液（pH７．０）に注いで反応を停止させた。反応溶液を酢酸エチル／リン酸緩衝液（ｐH：７．０）で1回抽出した後、５０ｍｌの酢酸エチル／食塩水（１／１）で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いてヘキサン／酢酸エチル（ヘキサン濃度を７０％→７５％に変化させる）で精製し2’-O-メチル-3’,5’-O-(1,1,3,3テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（下記式（１１）で表わされる化合物）を得た（１１８ｍｇ、収率：７５％）。
¹H NMR （DMSO-d６）δ０．６，１．３（２８H，CCH_３，SiCHC_２），２．９-３．１（６H，NCH_３），３．５-３．６（３H，OCH_３），３．９-４．６（５H，２’H，３’H，４’H ，５’H），６．０-６．１（１H，１’H），６．８-６．９（１H，３H），７．２-７．６（１０H，C_６H_５），８．２-８．５（２H，８H，NCHN）

上記式（１１）において、Ｒ^１０はテトライソプロピルジシロキサンである。
上述のようにして得られた、2’-O-メチル-3’,5’-O-(1,1,3,3テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（７０ｍｇ）を１ｍｌの無水テトラヒドロフラン（THF）で共沸(×2)し、２．２ｍｌの無水THFに溶解し、３６μｌのトリエチルアミン３フッ化水素を加え、室温で３時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて酢酸エチル／メタノール（酢酸エチル濃度を２％→４％に変化させる）で精製し、2’-O-メチル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（下記式（１２）で表わされる化合物）を得た（４１ｍｇ、収率：８３％）。

また、カラム中で化合物が結晶化した場合、酢酸エチル／メタノール（（酢酸エチル濃度を２％→４％に変化させる）で副精製物を除去した後、シリカゲルを回収し、水／メタノール１：１（v/v）の溶液を用いて、室温で１時間撹拌した。その後濾過をおこないシリカゲルを取り除いた後、濾液を減圧下濃縮し、水相／クロロホルムで抽出を３０回行い、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去し、2’-O-メチル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシンを得た。
¹H NMR （DMSO-d６）δ２．９-３．１（６H，NCH_３），３．２-３．４（３H，OCH_３），３．５-４．４（５H，２’H，３’H，４’H ，５’H），５．１-５．４（２H，３’OH，５’OH），５．９-６．０（１H，１’H），６．９-７．１（１H，３H），７．２-７．６（１０H，C_６H_５），８．３-８．５（２H，８H，NCHN）

上述のようにして得られた、2’-O-メチル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（３７ｍｇ）を１ｍｌの無水ピリジンで共沸（×３）し、８００μｌの無水ピリジンに溶解し、２７．５ｍｇの4,4’-ジメトキシトリチルクロライドを加え室温で３時間撹拌した。３時間撹拌した後、２０ｍｌの重曹水（濃度：５質量％）を加え反応を停止した。反応溶液を４０ｍｌの酢酸エチル／重曹水（１／１）で1回抽出した後、４０ｍｌの酢酸エチル／食塩水（１／１）で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて１％トリエチルアミンを添加したヘキサン／酢酸エチル（ヘキサン濃度を６０％→８０％に変化させる）で精製し、2’-O-メチル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（下記式（１３）で表わされる化合物）を得た（３３ｍｇ、収率：５７％）。
¹H NMR （DMSO-d６）δ２．８-３．１（６H，NCH_３），３．１-３．３（２H，５’H），３．３-３．４（３H，OCH_３），３．６-３．７（６H，OCH_３），４．０-４．４（３H，２’H，３’H，４’H），５．２-５．４（１H，３’OH），５．９-６．１（１H，１’H），６．７-７．６（２４H，３H ，C_６H_４，C_６H_５），８．２-８．４（２H，８H，NCHN）

上記式（１３）において、Ｒ^９は４，４’−ジメトキシトリチル基である。
上述のようにして得られた、
2’-O-メチル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-3-デアザグアノシン（２９０ｍｇ）を２８％アンモニア水：４０％メチルアミン：ピリジン（２：２：１）の混合溶液３．５ｍｌに溶解させた後、５０℃で６時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて１％トリエチルアミンを添加したヘキサン／酢酸エチル（１／１）で精製し、2’- O -メチル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)- 3-デアザグアノシン（下記式（１４）で表わされる化合物）を得た（５０ｍｇ、収率：７４％）。

上記式（１４）において、Ｒ^９は４，４’−ジメトキシトリチル基である。
上述のようにして得られた、2’- O -メチル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)- 3-デアザグアノシン（１８ｍｇ）を１ｍｌの無水ピリジンで共沸(×3)し、３００μｌのアセトニトリルに溶解させた後、室温で３１μｌのヘキサメチルジシラザンを加え2時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、残渣を３００μｌの無水ピリジンに溶解させた。０℃で８μｌのアセチルクロライドを加え、その後室温に戻し3時間撹拌した。１ｍｌの水を加え反応を停止させた。次いで、５００μｌのアンモニア水を加えて、１５分撹拌した後、４０ｍｌの酢酸エチル／食塩水（１／１）で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて１％トリエチルアミンを添加したヘキサン／酢酸エチル（１／１）で精製し、2’-O-メチル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2-N-アセチル- 3-デアザグアノシン（下記式（１５）で表わされる化合物）を得た（１４．３ｍｇ、収率：７０％）。

上記式（１５）において、Ｒ^９は４，４’−ジメトキシトリチル基である。
上述のようにして得られた、2’-O-メチル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2-N-アセチル- 3-デアザグアノシン（５９９ｍｇ）を、１ｍｌの無水トルエンで共沸(×3)し、１０ｍｌの無水塩化メチレンに溶解し、２６０μｌのイソプロピルエチルアミン、及び２３０μｌの２-シアノジイソプロピルホスホロアミドクロリダイトを加え、室温で4.5時間撹拌した。撹拌した後、１ｍｌの水を加え反応を停止させた。反応溶液２００ｍｌの塩化メチレン／５％重炭酸ナトリウム水（１／１）で５回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて１％トリエチルアミンを添加したヘキサン／クロロホルム（ヘキサン濃度を50％→80％に変化させる）で精製し、2’-O-メチル-3’-O-(２−シアノエトキシ基エチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2-N-アセチル-3-デアザグアノシン（下記式（１６）で表わされる化合物）を得た（４６０ｍｇ、収率：６２％）。

上記式（１６）において、Ｒ^９は４，４’−ジメトキシトリチル基である。
実施例４
２’−デオキシ−７−デアザ−アデノシン(1g、4mmol)を無水ピリジンで3回共沸脱水をおこなった後、無水ピリジン(40 mL)に溶解した。得られた溶液にトリエチルアミン(559 μL, 4 mmol)、ジクロロ酢酸(329μL, 4 mmol)、及び４，４’−ジメトキシトリチルクロライド (1.48g, 4.4 mmol)を、この順で加え、室温で4時間撹拌した。次いで反応溶液をCHCl_３（８０ｍL）で希釈した。CHCl₃層を飽和食塩水で3回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(20g, 1%ピリジン) により精製し、ヘキサンに50〜100%クロロホルム、次いで、クロロホルムに0〜3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の固体（５’−Ｏ− ( 4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシ−7−デアザ−アデノシン）を得た。 (1.5 g, 68%)
¹H NMR (CDCl₃) δ 2.31 -2.49 (m, 2H), 2.25 (s, 1H), 3.66 (s, 6H), 4.08 (d, 1H, 2.97 Hz), 4.54 -4.56 (m, 1H), 5.55 (brs, 2H), 6.19 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 6.66 (d, 4H, J = 8.9 Hz), 7.05 - 7.22 (m, 9H), 7.33 (d, 2H, J = 1.4 Hz), 8.13 (s, 1H), 8.46 (d, 1H, J = 4.3 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃) δ 40.8, 55.2, 64.1, 72.2, 83.4, 85.6, 86.4, 99.1, 103.6, 113.6, 121.9, 123.9, 125.3, 126.9, 127.9, 128.3, 129.1, 130.1, 135.9, 136.3, 144.7, 149.6, 150.3, 151.5, 156.9, 158.5.

上述のようにして得られた５’−Ｏ− ( 4,4’−ジメトキシトリチル )−2’−デオキシ−7−デアザ−アデノシン(1.37g, 2.5mmol)を無水ピリジンで3回共沸脱水をおこなった後、無水ピリジン(25mL)に溶解した。得られた溶液にトリメチルシリルクロライド (935μL, 7.45mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、アセチルクロライド(531μＬ, 7.45 mmol )を加えてさらに3.5時間撹拌を行った。次いで、反応溶液に28%アンモニア水（12 mL）を加えて10分間撹拌し、CHCl₃（５０ｍL）で希釈した。有機層を飽和食塩水で3回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させた。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (25g,1% ピリジン) により精製し、ヘキサンに50〜100%クロロホルム、次いで、クロロホルムに0〜3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の固体（5’−Ｏ− ( 4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシ−6N−アセチル−7−デアザアデノシン）を得た。 (1.4 g, 95%)
¹H NMR (CDCl₃) : 2.30 (s, 3H), 2.39 -2.46 (m, 1H), 2.52-2.57 (m, 1H), 3.33-3.39 (m, 2H), 3.75 (s, 6H), 4.06 (d, 1H, 4.3 Hz), 4.59 (dd, 1H, 6.2 Hz, 9.9 Hz), 6.77 (d, 4H, J = 8.6 Hz), 6.86 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 7.18 - 7.31 (m, 9H), 7.39 (d, 2H, J = 6.75 Hz), 8.46 (s, 1H), 8.63 (s, 1H); ¹³C NMR (CDCl₃) : 24.6, 40.4, 55.2, 63.9, 72.7, 77.2, 83.1, 85.2, 86.6, 108.6, 113.2, 123.5, 126.9, 127.9, 128.1, 130.0, 135.6, 135.7, 144.5, 149.9, 150.3, 158.5

上述のようにして得られた5’−Ｏ− ( 4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシ−6N−アセチル−7−デアザアデノシン(1.4g, 2.4mmol)を無水アセトニトリルで3回共沸脱水を行った後、無水ジクロロメタン(25 mL)に溶解した。得られた溶液にエチルジイソプロピルアミン (575μL, 3.5mmol )、クロロ( 2−シアノエトキシ) (−N,N’−ジイソプロピルアミノ)ホスフィン( 571μＬ,2.6mmol )を、この順で加え、室温で30分間撹拌した。次いで、反応溶液に水（1mL）を加えて5分間撹拌し、次いでCHCl₃（２５ｍL）で希釈した。有機層を飽和食塩水で3回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(25g, 1% トリエチルアミン) により精製し、ヘキサンに50〜100%クロロホルム、次いで、クロロホルムに0〜3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の固体（下記式（２０）で表わされる化合物、5’−Ｏ−( 4,4’−ジメトキシトリチル )−2’−デオキシ−6N−アセチル−7−デアザアデノシン−3’−(2−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト)を得た。 (1.7 g, 91%)
¹H NMR (CDCl₃) : 1.01-1.12 (m, 12H), 2.36 (s, 3H), 2.39 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 3.23-3.27 (m, 2H), 3.49-4.16 (m, 10H), 4.16 (s, 1H), 4.65 (s, 1H), 6.77 (dd, 4H, J = 4.3 Hz, J = 7.8 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.11 - 7.36 (m, 11H), 8.43 (s, 1H), 9.37 (s, 1H); ¹³C NMR (CDCl₃) : 20.1, 20.2, 20.3, 20.4, 22.8, 24.5, 24.6, 24.7, 29.7, 39.8, 43.1, 43.1, 43.3, 43.3, 55.2, 58.1, 58.2, 58.4, 58.5, 63.4, 63.6, 68.3, 73.3, 73.6, 73.9, 74.2, 77.3, 83.4, 84.9, 85.0, 85.1, 85.2, 86.4, 104.2, 109.0, 113.1, 117.4, 117.5, 123.7, 126.9, 127.8, 128.2, 128.2, 130.1, 130.5, 135.7, 135.7, 144.6, 150.2, 152.8, 152.8, 158.5, 169.0; ³¹P NMR (CDCl₃) :149.2, 149.4.

実施例５
5’, 3’-ビストルオイル2’−デオキシ−6−クロロ-7-デアザプリン(2.0 g, 4mmol)を飽和アンモニア-MeOH(40mL)に溶解し、得られた溶液を密封可能な容器に入れ、密封した状態で60℃の温度で、3日間撹拌した。３日間撹拌を行った後、溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテル（50 mL）及び水（40 mL）を用いて抽出操作を行った。水層を回収し、溶媒を減圧留去した残留物を無水ピリジンで3回共沸脱水を行い、無水ピリジン(40 mL)に溶解した。次いで、反応溶液にトリエチルアミン(559μL, 4 mmol)、ジクロロ酢酸(329μL, 4 mmol)、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド(1.48 g, 4.4 mmol )を、この順で加え室温で4時間撹拌した。次いで、反応溶液をCHCl₃（８０ｍL）で希釈した。CHCl₃層を飽和食塩水で3回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(20g,1% ピリジン) により精製し、ヘキサンに50〜100%クロロホルム、続いてクロロホルムに0〜3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の固体（5’−Ｏ−( 4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシ−8−アザ−7−デアザ-アデノシン）を得た(1.9 g, 85%)。
¹H NMR (CDCl₃) : 2.35 -2.49 (m, 1H), 3.02 -3.11 (m, 1H), 3.22 (dd, 1H, J = 6.2 Hz, J = 9.2 Hz), 3.32 (dd, 1H, J = 5.1 Hz, J = 9.7 Hz), 3.79 (s, 6H), 4.03 (dd, 1H, J = 5.1 Hz, J = 11.1 Hz), 4.86 (dd, 1H, J = 6.1 Hz, J = 11.5 Hz), 5.55 (brs, 2H), 6.73 (d, 4H, J = 8.1 Hz), 6.76 - 6.83 (m, 1H), 7.16 - 7.34 (m, 9H), 7.39 (d, 2H, J = 1.6 Hz), 7.82 (s, 1H), 8.38 (s, 1H); ¹³C NMR (CDCl₃) : 21.2, 38.0, 54.9, 64.2, 72.3, 77.2, 84.0, 85.6, 86.0, 100.9, 112.8, 123.8, 125.1, 126.5, 127.5, 127.6, 127.7, 128.0, 128.0, 129.0, 129.9, 132.0, 135.9, 136.3, 144.7, 149.0, 153.8, 155.3, 157.4, 158.1, 158.2, 158.3.

上述のようにして得られた5’−Ｏ−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシ−8−アザ−7−デアザ-アデノシン(1.62g, 2.9mmol)を無水ピリジンで3回共沸脱水を行った後、無水ピリジン(30 mL)に溶解した。得られた溶液にトリメチルシリルクロライド(2.97mL, 8.8 mmol )を加え、室温で30分間撹拌した後、アセチルクロライド( 627μＬ, 8.8 mmol )を加えてさらに3.5時間撹拌を行った。次いで、反応溶液に28%アンモニア水（15mL）を加えて10分間撹拌し、次いでCHCl₃（６０ｍL）で希釈した。有機層を飽和食塩水で3回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(25g, 1%ピリジン) により精製し、ヘキサンに50〜100%クロロホルム、次いでクロロホルムに0〜3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の固体（5’-O- ( 4,4’- ジメトキシトリチル) -2'-デオキシ-6N-アセチル-8-アザ-7-デアザアデノシン）を得た(1.4 g, 85%)。
¹H NMR (CDCl₃) : 2.30 (s, 3H), 2.38 -2.48 (m, 1H), 3.01-3.10 (m, 1H), 3.20-3.35 (m, 2H), 3.76 (s, 6H), 4.06 (dd, 1H, J = 5.1 Hz, J = 11.3 Hz), 4.84 (m, 1H), 6.72-6.83 (m, 5H), 7.15 - 7.35 (m, 9H), 7.36 (d, 2H, J = 6.48 Hz), 8.22 (s, 1H), 8.56-8.65 (s, 2H);

上述のようにして得られた5’-O- ( 4,4’- ジメトキシトリチル) -2'-デオキシ-6N-アセチル-8-アザ-7-デアザ-アデノシン(560mg, 0.9 mmol)を無水アセトニトリルで3回共沸脱水を行った後、無水ジクロロメタン(10mL)に溶解した。得られた溶液にエチルジイソプロピルアミン (230μL, 1.4 mmol )、クロロ(２−シアノエトキシ)(-N,N’-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン( 228μl ,1.0 mmol )を、この順で加え、室温で30分間撹拌した。次いで、反応溶液に水（1mL）を加えて5分間撹拌し、次いでCHCl₃（２０ｍL）で希釈した。有機層を飽和食塩水で3回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(25g,1%トリエチルアミン) により精製し、ヘキサンに50〜100%クロロホルム、次いでクロロホルムに0〜3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の固体（下記式（２１）で表わされる化合物、5’-O- ( 4,4’- ジメトキシトリチル ) -2'-デオキシ-6N-アセチル-8-アザ-7-デアザアデノシン-3'- (2- シアノエチル -N,N- ジイソプロピルホスホロアミダイト)を得た(672 mg, 90%)。
¹H NMR (CDCl₃) : 1.07-1.28 (m, 12H), 2.30 (s, 3H), 2.42-2.62 (m, 3H), 3.14-3.29 (m, 3H), 3.56-3.81 (m, 10H), 4.22 (s, 1H), 4.82-4.97 (m, 1H), 6.67-6.73 (m, 4H), 6.83 (t, 1H, J = 4.1 Hz), 7.12 - 7.37 (m, 11H), 8.22 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.58 (s, 1H); ³¹P NMR (CDCl₃) :149.2, 149.4.

実施例６
実施例４で得られた、上記式（２０）で表わされる化合物又は上記（２１）で表わされる化合物と、実施例５で得られた、上記式（３）で表わされる化合物、上記式（５）で表わされる化合物、上記式（６）で表わされる化合物とを用いてプローブの合成を行った。
プローブの合成は、Applied Biosynthesis Incの自動合成機、商品名「DNA/RNA Synthesizer 392」を用いて行い、配列TACCTAXATACCATA（配列番号：５、Ｘは、デオキシ−６Ｎ−アセチル−７−デアザアデノシン（上記式（２０）で表わされる化合物を用いた場合）又は２’−デオキシ−６Ｎ−アセチル−８−アザ−７−デアザアデノシン（上記式（２１）で表わされる化合物を用いた場合）で表わされるプローブを作成した。プローブの自動合成機による合成は、シリルリンカーを介してチミジンを導入したハイリークロスリンクポリスチレン（ＨＣＰ）固相担体（１μmol、２４μmol/g）を用いて行った。合成各鎖伸長サイクルは、以下の表２に示す通りであり、縮合反応では、６−ニトロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HoⁿBt）及びベンゾイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）を用いた。

次いで、２ｍｌDMTｒ基を３％トリクロロ酢酸溶液（CH₂Cl₂）で除去し、１ｍｌのCH₂Cl₂で３回、次いで、１ｍｌのCH₂CNで３回、固相担体を洗浄した。次いで、10% ジアザビシクロウンデセン（DBU）のCH₃CN溶液(500iL)を用いてシアノエチル基を除去した。CH₃CN (1 mL x 3)で固相担体を洗浄した後に、TBAF (131 mg, 0.5 mmol)及び酢酸 (24iL, 0.5mmol) を無水THF 500μLに溶解した反応溶液で固相担体を1時間処理し、DNAオリゴマーの切り出しを行った。得られた混合溶液をSep-Pak C18カートリッジを用いて、脱塩後、さらに水で希釈し、陰イオン交換HPLCを用いて精製を行った。

上述のようにして作製した、配列番号：５で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの二重鎖形成能及び塩基識別能を調べた。コントロールとして、配列番号：５で表わされる塩基配列のＸがアデニンであるものについても調べた。上述のオリゴヌクレオチドと、別途合成を行った相補鎖（ATGGTGTYTAGGTA、配列番号：６、Yはチミジン、2'-デオキシシチジン、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシンのいずれかを表わす）とを混和し、溶液中二重鎖形成時に、二重鎖の濃度が２μＭの濃度となるように、５００μＬのリン酸バッファー（１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解させた測定試料を調整した。測定には、ＰｈａｒｍａＳｐｅｃＵＶ−１７００（島津製作所（株）製）を用いた。測定は、まず試料を８０℃の温度に３０分間保持し、オリゴヌクレオチドをランダムコイル状態とした後、１．０℃／分で温度を５℃まで変化させてアニーリングを行い、次いで、１．０℃／分の速度で昇温させて、１．０℃毎にＵＶ吸光度を測定することにより行った。

測定により得られたＵＶ吸光度を温度変化に対してプロットし、二重鎖融解曲線とした。Ｓｔａｖｉｌｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法（２５point）を用いて融解曲線をスムージングした後、曲線を一次微分することにより変曲点を求め変曲点を二重鎖融解温度（Ｔｍ値）とした。なお、二重鎖のアニーリング時の曲線から得られる値と二重鎖融解時の曲線から得られる値において、１．０℃以上値のずれが観測された場合には、各測定温度における系内の平衡が不完全であるとみなし、変温レートを０．５℃／分に変更する等、適宜条件を変更して再度測定を行った。また、塩基識別能を調べるため、一塩基ミスマッチ配列を有するオリゴヌクレオチドとの二重鎖融解温度を測定した。測定は、0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA を含む150 mM リン酸ナトリウム緩衝液中で(pH 7.0) 各オリゴヌクレオチド濃度2.0 mMにて行った。
測定結果を表３に示す。なお、表においては、ΔＴｍは、配列番号：６のＹの位置がチミジンである相補鎖の場合のＴｍと、最も安定なミスマッチである、2'-デオキシアデノシンである場合のTmとの差を表わす。

表３から下記のことがわかる。
配列番号：５で表わされる塩基配列のＸの位置に、２’−デオキシ−6N−アセチル−8−アザ−7−デアザアデノシン(8aza7deazaA)を含むオリゴヌクレオチド（実施例５で得られたものから製造されたもの）は、Xの位置に２’−デオキシ−アデノシン（A)を含むオリゴヌクレオチドにくらべ、配列番号：６のＹの位置がチミジンである相補鎖に対するＴｍが同等（４５℃）であった。また、配列番号：５のＸの位置に2'-デオキシ-6N-アセチル-8-アザ-7-デアザアデノシン(8aza7deazaA)を含むオリゴヌクレオチド（実施例４）は、Ｘの位置に2'-デオキシ-アデノシン（A)を含むオリゴヌクレオチド（実施例５）に比べ、配列番号：６のＹの位置にチミジンがある相補鎖に対するTmが同等（４５℃）であった。一方、最も安定なミスマッチである、配列番号：６のＹの位置が2'-デオキシアデノシンである場合のTmは、配列番号：５のXの位置が8aza7deazaAを含む場合（３１℃）の方がXがAの場合（３２℃）よりも塩基識別能１℃低かった。この結果、8aza7deazaAを含むオリゴヌクレオチドはミスマッチ塩基識別能が向上していることが明らかである。

実施例７
実施例５で得られた化合物（式（２１）で表わされる化合物）、及び２’−デオキシ−４Ｎ−アセチルシチジンを用い、合成各鎖伸長サイクルを、以下の表４に示す通りに行った以外は、実施例６と同様に操作を行い、TA*C*C*TA*A*A*TA*C*C*A*TA*（配列番号：７、A*は２’−デオキシ−６Ｎ−アセチル−８−アザ−７−デアザデアノシンを表し、C*は２’−デオキシ−４N−アセチルシチジンを表す）の配列を有するオリゴヌクレオチドを得た。

実施例８
実施例７で得られたオリゴヌクレオチドと、その相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（ATGGTGTYTAGGTA、配列番号：８、Yはチミジン、2'-デオキシシチジン、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシンのいずれかを表わす）との二重鎖融解温度を、実施例６と同様にして測定し、また、実施例６と同様にして塩基識別能を調べた。また、コントロールとして、配列番号：７で表わされるオリゴヌクレオチド（実施例５で得られた化合物（式（２１）で表わされる化合物）、及び２’−デオキシ−４Ｎ−アセチルシチジンを用いないで製造したもの、すなわち修飾されていないオリゴヌクレオチド）を用いて同様に実験を行った。

結果は、図示しないが、実施例７で得られたオリゴヌクレオチドを用いた場合、その二重鎖形成能は＋１５．２℃上昇し、ΔＴｍ_Ａ−Ｇは１７．５℃であった。これに対し、コントロールとして用いたオリゴヌクレオチドにおいては、ΔＴｍ_Ａ−Ｇは１２．７℃であった。従って、塩基識別能は４．８℃上昇したことがわかった。

実施例９
2-N-((ジメチルアミノ)メチレン)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2’-O-メチル-3-デアザグアノシン(290mg,0.342mmol)を５５℃で２８％アンモニア水：４０％メチルアミン／メタノール溶液：ピリジン（２：２：１, v/v/v）(3.5ml)に溶解し、５時間撹拌した。撹拌を行った後、クロロホルム( 100 ml )／５％食塩水( 70 ml )で２回抽出した。有機層を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル) を用いて１％トリエチルアミンを添加したメタノール／クロロホルム4％で精製し、5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メチル-3-デアザグアノシンを得た(150mg,73%)。
¹H NMR（DMSO-d6）σ3.39 ( 3H, s ), 3.72 ( 6H, s ), 4.01 ( 1H, d, J = 3.4 Hz ), 4.14 ( 1H, t, J = 4.9 Hz ), 4.21 ( 1H, t, J = 5.6 Hz ), 5.27 ( 1H, d, J = 6.4 Hz ), 5.45 ( 1H, s ), 5.56 ( 2H, d, J = 8.3 Hz ), 5.66 ( 1H, d, J = 4.6 Hz ), 6.82 - 6.84 ( 4H, m ) 7.18 - 7.32 ( 9H, m ), 7.77 ( 1H, s ), 10.32 ( 1H, s br ) : MS m/z calcd for C₃₃ H₃₅ N₄ O₇ ⁺: 599.2506, found 599.2550

上述のようにして得られた5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メチル-3-デアザグアノシン(170mg,0.284mmol)を無水ピリジンで3回共沸し、無水アセトニトリル(2.8 ml) に溶解させた後、室温でヘキサメチルジシラザンを加え２時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、残渣を無水ピリジン ( 2.8 ml ) に溶解させた。０℃でアセチルクロライド(44μl, 0.65 mmol)を加え、次いで、反応溶液を室温に戻し、３時間撹拌した。水を加え反応を停止した。アンモニア水を加えて、一晩撹拌した後、酢酸エチル(100ml)／食塩水(70ml)で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて１％トリエチルアミンを添加したメタノール／クロロホルム2％〜4％で精製し、2-N-アセチル- 5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メチル-3-デアザグアノシンを得た(120mg, 65 %)。
¹H NMR（DMSO-d6）σ2.09 ( 3H, s ), 3.14 - 3.20 ( 2H, m ), 3.41 ( 3H, s ), 3.71 ( 6H, s ), 4.06 ( 1H, dd, J = 5.1 Hz, J = 8.6 Hz), 4.20 ( 1H, t, J = 4.7 Hz ), 4.24 ( 1H, dd, J = 5.4 Hz, J = 11.5 Hz ), 5.31 ( 1H, d, J = 6.4 Hz ), 5.86 ( 1H, d, J = 4.4 Hz ), 6.45 ( 1H, s br ), 6.80 - 6.83 ( 4H, m ), 7.15 - 7.29 ( 9H, m ), 8.07 ( 1H, s ), 10.54 ( 1H, s br ), 11.28 ( 1H, s br ) : MS m/z calcd for C₃₅ H₃₇ N₄ O₈ ⁺: 641.2611, found 641.2642

上述のようにして得られた2-N-アセチル- 5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メチル-3-デアザグアノシン(119 mg, 0.185mmol)を無水トルエンで３回共沸し、無水塩化メチレン(1.9ml)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(54μl,0.27mmol)を加え、クロロ(2-シアノエトキシ)(-N,N’-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(57μl,0.259mmol)を加え、室温で4.5時間撹拌した。次いで、水を加え反応を停止した後、反応溶液を塩化メチレン(40ml)／５％重炭酸ナトリウム水(50 ml)で５回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をゲル濾過カラムクロマトグラフィー(アセトニトリル)を用いて精製し、2-N-アセチル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メチル -3-デアザグアノシン-3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)
を得た(47mg,30%)。
¹H NMR ( CDCl_３-d1 ) σ1.03 - 1.05 ( 4H, m ), 1.17 - 1.29 ( 8H, m ), 2.02 ( 3H, m ), 2.37, 2.68 ( 2H, m ), 3.36 - 3.67 ( 7H, m ), 3.77 ( 6H, m ), 3.87 - 3.98 ( 1 H, m ), 4.13 -4.16 ( 1 H, m ), 4.32 - 4.38 ( 1 H, m ), 4.47 - 4.50 ( 1 H, m ), 5.85 ( 1 H, m ), 6.80 ( 4 H, m ), 7.20 - 7.49 ( 9H, m ), 7.96 ( 1 H, m ), 10.21 ( 1 H, s br ), 11.80 ( 1 H, s br ) : ³¹P NMR ( CDCl_３-d1 ) σ151.6, 152.2

実施例１０
3’,5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル ) デオキシグアノシン ( 1.5 g, 3.02 mmol ) を無水ピリジンで３回共沸し、無水ピリジン(15 ml) に溶解し、トリメチルシリルクロライド(576μl,4.53 mmol)を加え、室温で１時間撹拌した。次いで、クロロギ酸フェニル(569μｌ,3.93mmol)を加え、室温で４時間撹拌した。４０％メチルアミンのメタノール溶液 ( 1.8 ml, 15.1 mmol ) を加え室温で２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル( 200 ml )／水( 150 ml )で1回抽出した後、酢酸エチル( 200 ml )／食塩水( 150 ml )で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてメタノール／クロロホルム５０％〜８０％で精製し、3’,5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2-N-メチルカルバモイルデオキシグアノシンを得た(1.38g,78%)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ0.01 ( 6H, d ), 0.08 ( 6H, s ), 0.84 ( 9H, s ), 0.86 ( 9H, s ), 2.26 - 2.30 ( 1H, m ), 2.61 - 2.67 ( 1H, m ), 2.70 ( 3H, d, J = 3.9 Hz ), 3.62- 3.71 ( 2H, m ), 3.81 ( 1H, m ), 4.48 ( 1H, m ), 6.15 ( 1H, t, J = 6.5 Hz ), 7.02 ( 1H, s br ), 8.05 ( 1H, s ), 10.26 ( 1H, s br ), 11.98 ( 1H, s br ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ-5.6, -5.6, -5.0, -4.9, 17.6, 17.9, 25.6, 25.7, 26.1, 62.6, 71.9, 82.5, 87.1, 119.1, 136.2, 148.9, 149.2, 155.5 : MS m/z calcd for C₂₄ H₄₄N₆ O₅Si₂ ⁺: 553.2990, found 553.3027

上述のようにして得られた、3’,5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2-N-メチルカルバモイルデオキシグアノシン(889mg,1.61mmol)を無水ピリジンで３回共沸し、無水ピリジン(16ml)に溶解した。次いで、ジイソプロピルエチルアミン( 421μl,2.41 mmol )を加え、ジフェニルカルバモイルクロライド(424 mg, 1.93 mmol)を加え、室温で０.5時間撹拌した。次いで、酢酸エチル(10 ml)を加えた後、重曹水(10 ml )を加え反応を停止した。反応溶液を酢酸エチル( 150 ml )／重曹水( 150 ml )で1回抽出した後、酢酸エチル( 150 ml )／食塩水( 100 ml )で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( C200 ) を用いて酢酸エチル／ヘキサン４０％〜５０％で精製し、3’, 5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルカルバモイルデオキシグアノシンを得た(1.13 g, 94 %)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ0.00 ( 6H, s ), 0.10 ( 6H, s ), 0.83 ( 9H, s ), 0.88 ( 9H, s ), 2.34 - 2.39 ( 1H, m ), 2.77 ( 3H, d, J = 4.6 Hz ), 2.79 - 2.84 ( 1H, m ), 3.65 - 3.76 ( 2H, m ), 3.86 ( 1H, m ), 4.55 ( 1H, m ), 6.39 ( 1H, t, J = 6.5 Hz ), 7.29 - 7.50 ( 10H, m), 8.36 ( 1H, dd, J = 4.6 Hz, J = 9.2 Hz ), 8.49 ( 1H, s ), 9.87 ( 1H, s br ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ-5.5, -4.9, -4.7, 17.6, 17.9, 25.6, 25.7, 26.3, 62.5, 71.7, 83.3, 87.3, 118.6, 127.4, 129.4, 141.6, 142..8, 153.4, 154.0, 154.0, 155.2 : MS m/z calcd for C₃₇ H₅₄N₇ O₆Si₂ ⁺: 748.3674, found 748.3677

上述のようにして得られた3’, 5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルカルバモイルデオキシグアノシン(1.13g,1.52mmol)を無水テトラヒドロフランで３回共沸し、無水テトラヒドロフラン(15 ml)に溶解し、トリエチルアミン３フッ化水素(743μl,4.56mmol)を加え、室温で１晩撹拌した。次いで、トルエン(5 ml)を加え、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー( C200 )を用いてメタノール／クロロホルム５％〜６％で精製した残渣に、酢酸エチル(5 ml)及びジエチルエーテル(15ml)を加えて再沈殿を行い、濾過により精製を行い、6-O- ジフェニルカルバモイル -2-N- メチルカルバモイルデオキシグアノシンを得た(643 mg, 81%)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ2.33 - 2.36 ( 1H, m ), 2.67 ( 1H, m ), 2.79 ( 3H, d, J = 3.4 Hz ), 3.50 - 3.60 ( 2H, m ), 3.85 ( 1H, d, J = 2.7 Hz ), 4.41 ( 1H, s ), 4.93 ( 1H, s ), 5.34 ( 1H, d, J = 3.2 Hz ), 6.39 ( 1H, t, J = 6.0 Hz ), 7.31 - 7.48 ( 10H, m), 8.39 ( 1H, d, J = 3.4 Hz ), 8.56 ( 1H, s ), 9.87 ( 1H, s br ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ26.4, 61.3, 70.3, 83.4, 87.8, 118.7, 127.4, 129.4, 141.6, 143.2, 150.0, 153.4, 154.0, 154.1, 155.1 : MS m/z calcd for C₂₅ H₂₅N₇ O₆ ⁺: 520.1945, found 520.1945

上述のようにして得られた6-O- ジフェニルカルバモイル -2-N- メチルカルバモイルデオキシグアノシン(643mg,1.24mmol)を無水ピリジンで３回共沸し、無水ピリジン(12ml)に溶解し、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド(629mg,1.86mmol)を加え、室温で３時間撹拌した。次いで、重曹水(5ml)を加えて反応を停止した。反応溶液を酢酸エチル( 100 ml )／重曹水(100 ml )で1回抽出した後、酢酸エチル(100 ml )／食塩水(80 ml)で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて１％トリエチルアミンを添加した酢酸エチル／ヘキサン５０％〜６０％で精製し、5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル) -6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルカルバモイルデオキシグアノシンを得た(889 mg,87 %)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) σ2.37 - 2.42 ( 1H, m ), 2.76 ( 3H, d, J = 4.6 Hz ), 2.80 - 2.84 ( 1H, m ), 3.12 - 3.19 ( 2H, m ), 3.65 ( 6H, d, J = 8.5 Hz ), 3.96 ( 1H, d, J = 2.4 Hz ), 4.43 ( 1H, s ), 5.36 ( 1H, d, J = 3.7 Hz ), 6.43 ( 1H, t, J = 6.0 Hz ), 6.73 - 6.78 ( 4H, m), 7.08 - 7.49 ( 19H, m), 8.42 ( 1H, d, J = 4.6 Hz ), 8.46 ( 1H, s ), 9.88 ( 1H, s ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ26.4, 64.0, 70.2, 83.5, 85.4, 85.9, 113.0, 113.0, 118.9, 126.5, 127.6, 127.6, 129.4, 129.6, 129.7, 135.4, 135.6, 141.6, 143.2, 144.9, 149.9, 153.4, 153.9, 154.1, 155.2, 158.0 : MS m/z calcd for C₄₆ H₄₃N₇ Na O₈ ⁺: 844.3071, found 844.3075

上述のようにして得られた5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル) -6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルカルバモイルデオキシグアノシン(760 mg,0.925mmol)を無水トルエンで３回共沸し、無水アセトニトリルで３回共沸し、無水塩化メチレン(9.2ml)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(410μl,2.35mmol)を加え、クロロ(2-シアノエトキシ)(-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(410μl,1.85mmol)を加え、室温で２時間撹拌した。水(1ml)を加え反応を停止した。反応溶液を酢酸エチル( 150 ml )／５％重炭酸ナトリウム水(100 ml)で５回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をゲル濾過クロマトグラフィー(アセトニトリル) を用いて精製し、下記式（２２）で表わされる化合物、5’-O-( 4,4’-ジメトキシトリチル))-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルカルバモイルデオキシグアノシン-3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)を得た(644mg, 68%)。
¹H NMR (CDCl_３-d1 ) δ1.13 - 1.27 ( 14H, m ), 2.43 ( 1H, m ), 2.58 - 2.76 ( 3H, m ), 2.94 (3H, m ), 3.35 ( 2H, m ), 3.61 - 3.84 ( 4H, m), 3.73 ( 6H, m ), 4.29 - 4.33 ( 1 H, m ), 4.71 (1 H, m ), 6.35 ( 1 H, m ), 6.80 ( 4 H, m ), 7.18 - 7.43 ( 19H, m ), 7.63 ( 1 H, m ), 8.09 (1 H, m ), 8.61 (1 H, s ) : ¹³C NMR ( CDCl_３-d1 ) σ20.1, 20.2, 20.3, 20.4, 24.5, 24.5, 24.6, 26.7, 39.5, 39.7, 43.2, 43.3, 55.1, 55.1, 58.1, 58.1, 58.2, 58.3, 63.3, 63.4, 73.4, 73.6, 74.0, 74.1, 84.4, 85.7, 85.8, 86.0, 86.5, 113.1, 117.4, 117.5, 119.8, 126.9, 126.9, 127.8, 128.0, 128.0, 129.2, 129.9, 130.0, 130.0, 135.4, 135.5, 141.7, 144.4, 150.1, 153.0, 154.4, 154.5, 155.6, 155.6, 158.5 : ³¹P NMR ( CDCl_３-d1 ) σ150.0, 150.3 : MS m/z calcd for C₅₅ H₆₀N₉ Na O₉P⁺: 1044.4149, found 1044.3683

実施例１１
3’,5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)デオキシグアノシン(2.8g,5.83mmol)を無水ピリジンで３回共沸し、無水ピリジン ( 60 ml ) に溶解し、トリメチルシリルクロライド(1.11 ml, 8.75 mmol )を加え室温で１時間撹拌した。次いで、クロロギ酸フェニル(1.10 ml, 8.75mmol )を加え室温で４時間撹拌した。次いで、２８％アンモニア水 (4.1 ml,29.1mmol )を加え室温で２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル(250 ml )／水(200 ml )で1回抽出した後、酢酸エチル( 250 ml )／食塩水( 150 ml )で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィー (25g)を用いてメタノール／クロロホルム６％〜３０％で精製し、3’, 5’-ビス- O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2-N-カルバモイルデオキシグアノシンを得た(2.12g, 68 %)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ0.02 ( 6H, d ), 0.10 ( 6H, s ), 0.86 ( 9H, s ), 0.88 ( 9H, s ), 2.26 - 2.35 ( 1H, m ), 2.62 - 2.68 ( 1H, m ), 3.62 - 3.71 ( 2H, m ), 3.82 ( 1H, m ), 4.48 ( 1H, m ), 6.15 ( 1H, t, J = 6.8 Hz ), 6.41 ( 1H, s br ), 7.23 ( 1H, s br ), 8.07 ( 1H, s ), 10.07 ( 1H, s br ), 12.03 ( 1H, s br ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ-5.5, -5.5, -5.0, -4.8, 17.7, 18.0, 25.7, 25.8, 62.6, 71.9, 82.6, 87.1, 119.2, 136.4, 148.9, 1491, 156.2 : MS m/z calcd for C₂₃ H₄₃N₆O₅Si₂ ⁺: 539.2834, found 539.2809

上述のようにして得られた3’, 5’-ビス- O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2-N-カルバモイルデオキシグアノシン(1.23g,2.29mmol)を無水ピリジンで３回共沸し、無水ピリジン(23 ml ) に溶解した。次いで、ジイソプロピルエチルアミン(797μl,4.58mmol)を加え、ジフェニルカルバモイルクロライド(689mg,2.98mmol)を加え、室温で０.5時間撹拌した。次いで、重曹水( 5 ml )を加え反応を停止した。反応溶液を酢酸エチル( 180 ml )／重曹水(150 ml)で1回抽出した後、酢酸エチル( 180 ml )／食塩水( 100 ml )で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(C200)を用いて酢酸エチル／ヘキサン５０％〜６０％で精製し、3’, 5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2-N-カルバモイル-6-O-ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシンを得た(1.53g,91%)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ0.00 ( 6H, s ), 0.10 ( 6H, s ), 0.82 ( 9H, s ), 0.88 ( 9H, s ), 2.33 - 2.35 ( 1H, m ) 2.62 - 2.67 ( 1H, m ), 3.65 - 3.74 ( 2H, m ), 3.84 ( 1H, m ), 4.55 ( 1H, m ), 6.34 ( 1H, t, J = 6.5 Hz ), 7.05 ( 1H, s br ) 7.11 - 7.48 ( 10H, m), 8.36 ( 1H, dd, J = 4.6 Hz, J = 9.2 Hz ), 7.98 ( 1H, s br ), 8.49 ( 1H, s ), 9.71 ( 1H, s ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ-5.5, -5.5, -5.0, -4.7, 17.7, 18.0, 25.7, 25.8, 62.5, 71.6, 83.2, 87.3, 118.6, 127.3, 129.4, 141.6, 142.8, 149.9, 153.4, 154.2, 154.3, 155.1 : MS m/z calcd for C₃₆H₅₂N₇ O₆Si₂ ⁺: 734.3518, found 734.3581

上述のようにして得られた3’, 5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2-N-カルバモイル-6-O-ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシン(1.53g,2.09mmol)を無水テトラヒドロフランで３回共沸し、無水テトラヒドロフラン( 10 ml ) に溶解し、トリエチルアミン３フッ化水素(1.02ml,6.27mmol )を加え、室温で１晩撹拌した。トルエン(10 ml)を加え、溶媒を減圧下留去した。次いで、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いてメタノール／クロロホルム４％〜１０％で精製し、2-N-カルバモイル-6-O- ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシンを得た(1.21g,quant)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ2.31 - 2.35 ( 1H, m ), 2.65 - 2.70 ( 1H, m ), 3.49 - 3.58 ( 2H, m ), 3.85 ( 1H, dd, J = 4.5 Hz, J = 7.6 Hz ), 4.44 ( 1H, , dd, J = 3.2 Hz, J = 5.4 Hz ), 4.92 ( 1H, s ), 5.33 ( 1H, d, J = 3.9 Hz ), 6.35 ( 1H, t, J = 6.7 Hz ), 7.12 ( 1H, s br ) 7.29 - 7.48 ( 10H, m), 8.06 ( 1H, s br ), 8.57 ( 1H, s ), 9.75 ( 1H, s ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ61.4, 70.5, 83.4, 88.0, 118.7, 127.4, 129.4, 141.6, 143.2, 150.0, 153.4, 154.2, 154.3, 155.2 : MS m/z calcd for C₂₄H₂₄N₇ O₆ ⁺: 506.1788, found 506.1796

上述のようにして得られた2-N-カルバモイル-6-O- ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシン(1.19g,2.35mmol)を無水ピリジンで３回共沸し、無水ピリジン(23ml)に溶解し、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド(917mg,2.70mmol)を加え室温で２時間撹拌した。重曹水(8 ml)を加え反応を停止した。次いで、反応溶液を酢酸エチル(150 ml )／重曹水(120 ml )で1回抽出した後、酢酸エチル(150 ml)／食塩水(100ml)で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて１％トリエチルアミンを添加したメタノール／クロロホルム２％〜３％で精製し、2-N-カルバモイル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-6-O- ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシンを得た(1.45 g, 76 %)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ2.35 - 2.40 ( 1H, m ), 2.78 - 2.83 ( 1H, m ), 3.11 - 3.16 ( 2H, m ), 3.65 ( 6H, d, J = 7.8 Hz ), 3.95 ( 1H, dd, J = 4.4 Hz , J = 9.5 Hz), 4.43 ( 1H, m ), 5.35 ( 1H, d, J = 4.9 Hz ), 6.39 ( 1H, t, J = 6.1 Hz ), 6.73 - 6.79 ( 4H, m), 7.09 - 7.48 ( 19H, m), 7.48 ( 1H, s br ), 8.46 ( 1H, s ), 9.73 ( 1H, s ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ54.9, 54.9, 63.9, 70.2, 79.2, 83.4, 85.4, 86.0, 113.0, 113.0, 118.8, 126.5, 127.6, 127.6, 129.4, 129.6, 129.7, 135.4, 135.6, 141.6, 143.0, 144.9, 149.6, 153.5, 154.2, 154.3, 155.2, 158.0 : MS m/z calcd for C₄₅ H₄₁N₇ Na O₈ ⁺: 830.2914, found 830.2907

上述のようにして得られた2-N-カルバモイル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-6-O- ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシン(250mg,0.309mmol)を無水トルエンで３回共沸し、無水アセトニトリルで３回共沸し、無水塩化メチレン(3.0 ml)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(27μl, 0.145 mmol)を加え、１H-テトラゾール(11 mg,0.145mmol)を加え、 (2-シアノエトキシ)ジ(-N,N’-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(410μl,1.85mmol)を加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル(50ml)／０．２M水酸化ナトリウム水溶液(40ml)で５回抽出した。次いで、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をゲル濾過クロマトグラフィー(アセトニトリル) を用いて精製し、酢酸エチル( 50 ml )／０．２M水酸化ナトリウム水溶液(70 ml )で５回抽出し、下記式（２３）で表わされる化合物、2-N-カルバモイル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル))-6-O-ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシン -3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)を得た(245 mg, 75 %)。
¹H NMR ( CDCl_３-d1 ) δ1.11 - 1.33 ( 14H, m ), 2.46 ( 1H, m ), 2.55 - 2.74 ( 3H, m ), 3.32 - 3.40 ( 2H, m ), 3.57 - 3.87 ( 4H, m), 3.75 ( 6H, m ), 4.26 - 4.32 ( 1 H, m ), 4.67 - 4.72 ( 1 H, m ), 5.36 ( 1 H, s br ), 6.35 ( 1 H, m ), 6.79 ( 4 H, m ), 7.17 - 7.50 ( 19H, m ), 8.07 ( 1 H, m ), 8.53 ( 1 H, s br ) : ¹³C NMR ( CDCl_３-d1 ) δ20.6, 20.7, 20.8, 20.9, 24.9, 25.0, 25.0, 40.2, 43.6, 43.6, 43.7, 43.7, 55.6, 55.6, 58.5, 58.6, 58.6, 58.7, 63.7, 63.8, 73.9, 74.0, 74.4, 74.5, 84.7, 84.8, 86.2, 86.2, 86.4, 86.9, 113.6, 117.8, 117.9, 120.5, 127.3, 127.4, 128.3, 128.4, 128.5, 129.6, 130.3, 130.4, 130.4, 135.8, 135.8, 135.9, 135.9, 142.1, 144.7, 150.4, 153.1, 154.8, 154.9, 155.0, 156.2, 159.0 : ³¹P NMR ( CDCl_３-d1 ) σ149.9 : MS m/z calcd for C₅₄ H₅₉N₉ Na O₉P⁺: 1030.3993, found 1033.4001

実施例１２
3’, 5’-ビス-O- (tert-ブチルジメチルシリル)デオキシグアノシン(3.0g,6.05 mmol) を無水トルエンで３回共沸し、無水ジメチルホルムアミド(30ml) に溶解し、水素化ナトリウム(199mg,7.86mmol)を加え、７０℃の温度で１時間撹拌した。次いで、反応溶液を室温に戻しメチルチオイソシアネート(1.24ml,18.2mmol ) を加え、７０℃の温度で３６時間撹拌した。反応溶液を０．５M酢酸アンモニウム緩衝液 (150 ml )に注ぎ、酢酸エチル(200 ml )／０．５M酢酸アンモニウム緩衝液 ( 150 ml )で1回抽出した後、酢酸エチル(200ml )／水(150 ml)で2回抽出した。有機層を減圧下留去した後、残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてメタノール／クロロホルム５％で原料を除き、ゲルを回収してメタノール／クロロホルム８０％で４０回溶出し、濃縮し、3’, 5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシンを得た(1.65g,48 %)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ0.01 ( 6H, d ), 0.09 ( 6H, s ), 0.84( 9H, s ), 0.87 ( 9H, s ), 2.30 - 2.34 ( 1H, m ), 2.58 - 2.63 ( 1H, m ), 3.07 ( 3H, s ), 3.63 - 3.74 ( 2H, m ), 3.83 ( 1H, dd, J = 4.4 Hz, J = 8.5 Hz ), 4.51 ( 1H, m ), 6.30 ( 1H, t, J = 6.5 Hz ), 8.06 ( 1H, s ), 10.73 ( 2H, s br ), 11.98 ( 1H, s br ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ-5.6, -5.5, -5.0, -4.8, 17.6, 17.9, 25.6, 25.7, 25.7, 31.7, 62.4, 71.5, 82.7, 86.9, 119.8, 136.6, 147.4, 179.0 : MS m/z calcd for C₂₄ H₄₄N₆ O₄S Si₂ ⁺: 569.2762, found 569.2750

上述のようにして得られた、3’, 5’-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシン(1.0 g,1.76 mmol)を無水ピリジンで３回共沸し、無水ピリジン(17ml)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(511μl,3.16mmol)を加え、ジフェニルカルバモイルクロライド(489mg,2.11mmol)を加え、室温で０．５時間撹拌した。重曹水(5 ml)を加え反応を停止した。次いで、反応溶液を酢酸エチル(150 ml )／重曹水(120ml)で1回抽出した後、酢酸エチル(150 ml)／食塩水(100ml)で2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (N60球状中性シリカゲル)を用いて酢酸エチル／ヘキサン４０％〜５０％で精製し、3’, 5’- ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシンを得た(1.09g, 81%)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ0.00 ( 6H, s ), 0.11 ( 6H, s ), 0.82 ( 9H, s ), 0.89 ( 9H, s ), 2.34 - 2.39 ( 1H, m ), 2.81 - 2.87 ( 1H, m ), 3.11 ( 3H, d, J = 4.6 Hz ), 3.65 - 3.78 ( 2H, m ), 3.86 ( 1H, dd, J = 4.5 Hz, J = 8.8 Hz ), 4.55 ( 1H, m ), 6.42 ( 1H, t, J = 6.4 Hz ), 7.29 - 7.50 ( 10H, m), 8.56 ( 1H, s ), 10.59 ( 1H, dd, J = 4.5 Hz, J = 9.1 Hz ), 10.78 ( 1H, s ) :¹³C NMR ( DMSO-d６) δ-5.5, -5.5 -5.0, -4.8, 17.7, 17.9, 25.6, 25.7, 31.9, 62.4, 71.6, 83.6, 87.3, 119.1, 127.3, 129.4, 141.5, 143.5, 149.7, 15.0, 153.6, 155.0, 179.7: MS m/z calcd for C₃₇ H₅₄N₇ O₅ SSi₂ ⁺: 764.3446, found 764.3432

上述のようにして得られた3’, 5’- ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシン(900mg,1.17mmol) を無水テトラヒドロフランで３回共沸し、無水テトラヒドロフラン(6.0 ml)に溶解し、トリエチルアミン３フッ化水素(574μl,3.51mmol)を加え、室温で１晩撹拌した。次いで、トルエン(5 ml )を加え、溶媒を減圧下留去した。残渣に、メタノール(5 ml)及びヘキサン(25 ml)を加え,再沈殿をおこない濾過して精製し、6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシンを得た(504mg, 80%)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ2.32 - 2.37 ( 1H, m ), 2.70 - 2.75 ( 1H, m ), 3.12 ( 3H, d, J = 4.4 Hz ), 3.48 - 3.61 ( 2H, m ), 3.85 ( 1H, dd, J = 4.2 Hz, J = 8.1 Hz ), 4.42 ( 1H, dd, J = 3.8, Hz, J = 5.9 Hz ), 4.92 ( 1H, t, J = 5.4 Hz ), 5.34 ( 1H, d, J = 4.2 Hz ), 6.41 ( 1H, t, J = 6.5 Hz ), 7.30 - 7.50 ( 10H, m), 8.62 ( 1H, s ), 10.56 ( 1H, dd, J = 4.4 Hz, J = 9.1 Hz ), 10.80 ( 1H, s ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ32.1, 61.2, 70.2, 83.8, 87.8, 119.3, 127.3, 129.4, 141.5, 144.0, 149.8, 152.0, 153.6, 155.0, 179.7 : MS m/z calcd for C₂₅ H₂₆N₇ O₅ S ⁺: 536.1716, found 536.1546

上述のようにして得られた6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシン(400mg,0.744mmol) を無水ピリジンで３回共沸し、無水ピリジン(8.0 ml)に溶解し、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド(278 mg,0.818mmol)を加え室温で３時間撹拌した。次いで、重曹水(3 ml)を加え反応を停止した。反応溶液を酢酸エチル(150ml)／重曹水(120 ml)で1回抽出した後、酢酸エチル(150ml)／食塩水(100 ml)で2回抽出した。次いで、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(N60球状中性シリカゲル)を用いて１％トリエチルアミンを添加メタノール／クロロホルム３％〜４％で精製し、5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル) -6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシンを得た(570mg,78 %)。
¹H NMR ( DMSO-d6 ) δ2.37 - 2.42 ( 1H, m ), 2.84 -2.89 ( 1H, m ), 3.01 ( 3H, d, J = 4.4 Hz ), 3.11- 3.21 ( 2H, m ), 3.65 ( 6H, d, J = 10.2 Hz ), 3.97 ( 1H, m ), 4.46 ( 1H, t, J = 5.5 Hz ), 5.35 ( 1H, d, J = 4.6 Hz ), 6.45 ( 1H, t, J = 5.4 Hz ), 6.72 - 6.77 ( 4H, m), 7.06 - 7.50 ( 19H, m), 8.53 ( 1H, s ), 10.62 56 ( 1H, dd, J = 4.4 Hz, J = 8.8 Hz ), 10.82 ( 1H, s ) :¹³C NMR ( DMSO-d6 ) δ32.0, 40.0, 54.9, 55.0, 64.0, 70.2, 84.0, 85.3, 86.1, 113.0, 113.0, 119.5, 126.5, 127.6, 127.6, 129.4, 129.6, 129.7, 135.3, 135.7, 141.6, 144.2, 144.9, 149.8, 152.0, 153.5, 155.0, 158.0, 179.8 : MS m/z calcd for C₄₆ H₄₃N₇ Na O₇ S ⁺: 860.2842, found 860.2859

上述のようにして得られた5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル) -6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシン(250mg,0.298mmol)を無水トルエンで３回共沸し、無水アセトニトリルで３回共沸し、次いで、無水塩化メチレン(3.0ml)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(83μl,0.477mmol) を加え、クロロ(2−シアノエトキシ)(-N,N’-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(86μl , 0.387 mmol ) を加え、室温で２時間撹拌した。次いで、水(1 ml )を加えて反応を停止した。反応溶液を酢酸エチル(50 ml)／５％重炭酸ナトリウム水(50ml)で５回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残渣をゲル濾過クロマトグラフィー(アセトニトリル)を用いて精製し、次いで、酢酸エチル(50 ml )／０．２M水酸化ナトリウム水溶液(50 ml )で５回抽出し、下記式（２４）で表わされる化合物、5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル))-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシン-3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)を得た(144 mg,47%)。
¹H NMR ( CDCl_３-d1 ) δ1.12 - 1.29 ( 14H, m ), 2.46 ( 1H, m ), 2.57 - 2.75 ( 3H, m ), 2.25 ( 3H, m ), 3.30 - 3.38 ( 2H, m ), 3.58 - 3.88 ( 4H, m), 3.75 ( 6H, m ), 4.27 - 4.33 ( 1 H, m ), 4.67 ( 1 H, m ), 6.32 ( 1 H, m ), 6.79 ( 4 H, m ), 7.16 - 7.43 ( 19H, m ), 8.10 ( 1 H, m ), 8.52 ( 1 H, s ), 10.59 ( 1 H, m ) : ¹³C NMR ( CDCl_３-d1 ) δ20.3, 20.4, 20.6, 20.6, 24.7, 24.7, 24.8, 32.6, 39.8, 43.4, 43.4, 43.5, 55.3, 58u.2, 58.3, 58.4, 58.4, 63.4, 63.6, 73.6, 74.1, 74.2, 84.8, 84.8, 86.1, 86.1, 86.3, 86.7, 113.3, 113.3, 117.5, 117.6, 120.2, 120.3, 127.1, 127.1, 128.0, 128.2, 128.2, 129.4, 130.1, 130.1, 130.2, 135.5, 135.6, 135.7, 141.7, 142.4, 144.5, 150.0, 151.8, 158.7, 158.7, 180.0 : ³¹P NMR ( CDCl_３-d1 ) σ150.0, 150.2 : MS m/z calcd for C₅₅ H₆₀N₉ Na O₈P S ⁺: 1060.3921, found 1060.3889

実施例１３
実施例３で得られた2’-O-メチル-3’-O-(２−シアノエトキシ基エチル-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2-N-アセチル-3-デアザグアノシンを用い、2'-O-メチルRNAである、2'-O-Me-5'-(CGGCXGAGGAG)（配列番号：９、X＝2'-O-メチル-2-N- アセチル 3-デアザグアノシン）を合成した。合成は、Applied Biosystem Inc.(ABI) のDNA/RNA Synthesizer 392を使用して行った。2'-O-メチルRNAオリゴマーの自動合成機による合成は、Glen Researchより購入した2'-O-メチルグアニンを担持した固相担体(1μmol)を用いて行った。Xに相当するヌクレオチド残基以外は上記自動合成装置の典型的なRNA合成プロトコールに従って行い、Xの残基のみは以下のプロトコール１）〜３）に従い、各ステップの間にはアセトニトリルによる洗浄を行いマニュアル合成にて鎖伸長を行った。
１）カップリング
アミダイトユニット20μmol 1H-テトラゾール 80 μmol アセトニトリル−塩化メチレン（２００ μL-５０μL）５分間
２）酸化
０．１ Mヨウ素／ピリジン−水（１８０μL-２０μL）２分間
３）３％トリクロロ酢酸／塩化メチレン（１ｍＬ）×３

鎖伸長反応終了後、アンモニア水で上記自動合成装置のオートクリベージ機能を用いて切り出しを行い、ここにアンモニア水−エタノール（１．５ｍＬ〜０．５ｍＬ）を加え、室温で２４時間放置した。得られた溶液を C18カートリッジに通し、不純物を除去した後、２％ＴＦＡ水でカラム内でＤＭＴｒ基を切断した後、２０％アセトニトリルを含む水で目的物を溶出した。得られた溶液を凍結乾燥し、次いで、陰イオン交換HPLCを用いて精製をおこなった。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマスｃａｌｃｄ．３４５６．６ｆｏｕｎｄ３４５６．７。

上述のようにして得られたオリゴヌクレオチドと、それに相補鎖であるRNA、 5'-CUCCYCGCCG-3' (配列番号：１０、Y=アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンのいずれかを表わす）もしくはDNA 5'-CTCCYCGCCG-3' (配列番号：１１、Y=2'−デオキシアデノシン、2'−デオキシグアノシン、2'−デオキシシチジン、チミジンのいずれかを表わす）との二本鎖の融解温度(Tm)を測定した。方法は、実施例６に記載された方法で行った。コントロールとして、配列番号：９で表わされる塩基配列のＸがグアノシンであるものについても調べた。
測定条件は０．１M NaCl、０．１ｍM EDTAを含む１０ｍM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐH ７．０）中、各オリゴヌクレオチド濃度２μMで測定した。

配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＲＮＡとの試験の結果（測定結果１）を表５に、配列番号：１１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとの試験（測定結果２）の結果を表６に示す。

測定結果１結果Xの位置に2'-O-メチル-2N-アセチル-3-デアザグアノシン(ad3G)を含むオリゴヌクレオチドは、Xの位置に2'-O-メチル-グアノシン（Ｇ）を含むオリゴヌクレオチドにくらべ、Y=Ｃである相補鎖に対するTmが同等（７１℃と７０℃）であった。
一方、最も安定なミスマッチである場合のTmはXがad3Gを含む場合（57℃, Y=G）の方がXがGの場合（６２℃, Y=U）よりも5℃低かった。この結果、ad3Gを含むオリゴヌクレオチドはミスマッチ塩基識別能が向上していることが明らかになった。
また、測定結果２の結果Xの位置に2'-O-メチル-2N-アセチル-3-デアザグアノシン(ad3G)を含むオリゴヌクレオチドは、Xの位置にデオキシグアノシン（Ｇ）を含むオリゴヌクレオチドにくらべ、Y=Ｃである相補鎖に対するTmが同等（５９℃と６０℃）であった。
一方、最も安定なミスマッチである場合のTmはXがad3Gを含む場合（４６℃, Y=Ｔ）の方がXがGの場合（５０℃, Y=Ｔ）よりも４℃低かった。この結果、ad3Gを含むオリゴヌクレオチドはミスマッチ塩基識別能が向上していることが明らかになった。

実施例１４
実施例１１で得られた2-N-カルバモイル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル))-6-O-ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシン -3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)を得た(245 mg, 75 %)を用いて、2'-デオキシ-2-N-カルバモイルグアノシンを含むオリゴヌクレオチドを合成した。合成したＤＮＡは５’−ＣＧＧＣＸＡＧＧＡＧ−３’（配列番号：１２、Ｘは2'-デオキシ-2-N-カルバモイルグアノシンを表わす）の配列を有するＤＮＡである。合成には、Applied Biosystem Inc.のDNA/RNA synthesizer 392を使用した。天然型ホスホロアミダイトユニットおよびその他の必要な試薬は、Glen Research Inc.より購入して用いた。原料合成例（追加１６）で合成したホスホロアミダイトユニットは無水アセトニトリル ( 0.1 M ) に溶解し、DNA自動合成機に適用した。塩基部の脱保護は、アンモニア水（２ｍＬ）を加え、室温で１２時間放置することで行い、その後の精製は実施例１３と同様に行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマスｃａｌｃｄ．３１５８．４ｆｏｕｎｄ３１５８．６。

実施例１５
実施例１０で得られた5’-O-( 4,4’-ジメトキシトリチル))-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルカルバモイルデオキシグアノシン-3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)を用いて、2'-デオキシ-2-N- メチルカルバモイルグアノシンを有するオリゴヌクレオチドを合成した。合成したＤＮＡは５’−ＣＧＧＣＸＡＧＧＡＧ−３’（配列番号：１３、Ｘは2'-デオキシ-2-N- メチルカルバモイルグアノシンを表わす）の配列をもつＤＮＡである。Applied Biosystem Inc.のDNA/RNA synthesizer 392を使用した。天然型ホスホロアミダイトユニットおよびその他の必要な試薬は、Glen Research Inc.より購入した。用いたホスホロアミダイトユニットは無水アセトニトリル (0.1 M)に溶解し、DNA自動合成機に適用した。塩基部の脱保護は、アンモニア水（２ｍＬ）加え、室温で１２時間放置することで行い、その後の精製は実施例１４と同様に行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマスｃａｌｃｄ．３１７２．５ｆｏｕｎｄ３１７２．６。

実施例１６
実施例１２で得られた5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル))-6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-メチルチオカルバモイルデオキシグアノシン-3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)を用いて、2'-デオキシ-2-N- メチルチオカルバモイルグアノシンを含むオリゴヌクレオチドを合成した。合成したＤＮＡは５’−ＣＧＧＣＸＡＧＧＡＧ−３’（Ｘは2'-デオキシ-2-N- メチルチオカルバモイルグアノシンを表わす）の配列をもつＤＮＡである。Applied Biosystem Inc.のDNA/RNA synthesizer 392を使用した。天然型ホスホロアミダイトユニットおよびその他の必要な試薬は、Glen Research Inc.より購入した。用いた合成したホスホロアミダイトユニットは無水アセトニトリル ( 0.1 M ) に溶解し、DNA自動合成機に適用した。塩基部の脱保護は、アンモニア水（２ｍＬ）を加え、室温で１２時間放置することで行い、その後の精製は実施例１４と同様に行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマスｃａｌｃｄ．３１８８．８ｆｏｕｎｄ３１８８．６。

得られたオリゴヌクレオチドと、それに相補鎖と、それに相補的な鎖であるＤＮＡ、5'-CTCCYCGCCG-3'（配列番号：１４、Y=2'−デオキシアデノシン、2'−デオキシグアノシン、2'−デオキシシチジン、チミジンのいずれかを表わす）との二本鎖の融解温度(Tm)を測定した。測定条件は０．１M NaCl、０．１ｍM EDTAを含む１０ｍM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐH ７．０）中、各オリゴヌクレオチド濃度２μMで測定した。

Xの位置に2'-デオキシ-2-N- カルバモイルグアノシン(cmG)を含むオリゴヌクレオチドは、Xの位置に2'-デオキシグアノシン（Ｇ）を含むオリゴヌクレオチドにくらべ、Y=Ｃである相補鎖に対するTmが同等（52℃）であった。
一方、最も安定なミスマッチである場合のTmはXがcmGを含む場合（36℃, Y=G, T）の方がXがGの場合（39℃, Y=T）よりも3℃低かった。この結果、cmGを含むオリゴヌクレオチドはミスマッチ塩基識別能が向上していることが明らかになった。

Claims

下記一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体。

（上記式中、Ａ^１及びＡ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素、アルキル基、リン酸基又は置換基を結合していてもよいトリチル基であり、ｎは１０〜５０の整数であり、Ｙ^２は水素、水酸基、アルコキシ基又は２−シアノエトキシ基であるか、又はＹ^２とリボース4'位炭素とが結合し、環を形成していてもよく、Ｂ^２は、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、8位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニンであり、Ｒ^２は、核酸塩基のアミノ基に結合した置換基であり、水素、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、又はアルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基であり、Ｂ^１は下記一般式（２）で表わされる置換基を表す。）

（上記式中、Ｂは、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、8位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニンであり、Ｒは、核酸塩基のアミノ基に結合した置換基であり、水素、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、又はアルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基であり、Ｘは酸素原子^-、硫黄原子^-、ＢＨ_３、ＯＣＨ_３、又はＣＨ_３であり、Ｙは水素、水酸基、アルコキシ基又は２−シアノエトキシ基であるか、又はＹとリボースの４’位炭素とが結合し、環を形成していてもよい。また、Ｒ及びＲ^２は、少なくとも１個が水素でない。）
プローブとして用いるための請求項１に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド誘導体の少なくとも１つ以上を担体に固定化させてなる、遺伝子検出用マイクロアレイ。
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド誘導体の少なくとも１つ以上を担体に固定化させてなる、ＤＮＡチップ。
担体が、微小多孔質ガラスである、請求項４に記載のＤＮＡチップ。
下記一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体を、試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程：及び
ハイブリダイズ産物を検出する工程を有する、
標的核酸中のヌクレオチドの同定方法。

（上記式中、Ａ^１及びＡ^２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素、アルキル基、リン酸基又は置換基を結合していてもよいトリチル基であり、ｎは１０〜５０の整数であり、Ｙ^２は水素、水酸基、アルコキシ基又は２−シアノエトキシ基であるか、又はＹ^２とリボース4'位炭素とが結合し、環を形成していてもよく、Ｂ^２は、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、8位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニンであり、Ｒ^２は、核酸塩基のアミノ基に結合した置換基であり、水素、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、又はアルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基であり、Ｂ^１は下記一般式（２）で表わされる置換基を表す。）

（上記式中、Ｂは、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、３−デアザアデニン、６−チオグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入されたアデニン、８位に種々の置換基（アルキル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、７位及び８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、３−デアザグアニン、７位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニン、８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）を導入したグアニン、8位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニン、７位と８位に種々の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ニトロ基、アシル基、水酸基）が導入された７−デアザグアニンであり、水素、アシル基、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、又はアルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基であり、Ｘは酸素原子^-、硫黄原子^-、ＢＨ_３、ＯＣＨ_３、又はＣＨ_３であり、Ｙは水素、水酸基、アルコキシ基又は２−シアノエトキシ基であるか、又はＹとリボースの４’位炭素とが結合し、環を形成していてもよい。また、Ｒ及びＲ^２は、少なくとも１個が水素でない。）
一般式（１７）で表わされるヌクレオチド誘導体。

（上記式中、Ｒ^３はリン酸保護基を表し、Ｒ^４は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表し、Ｒ^５は、水素、アルコキシ基または炭素数１から１０の同一または異なるアルキル基を有するトリアルキルシリルオキシ基、トリアルキルシリルオキシメトキシ基もしくはシアノエチル基であるか、又はリボースの４’位炭素と結合して環を形成しており、Ｒ^５は、水素、アルコキシ基または炭素数１から１０の同一または異なるアルキル基を有するトリアルキルシリルオキシ基、トリアルキルシリルオキシメトキシ基もしくはシアノエチル基であるか、又はリボースの４‘位炭素と結合して環を形成していてもよく、Ｒ^６は水酸基の保護基を表し、Ｒ^７は、アシル基（ただし、ベンゾイル基を除く）、チオアシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシチオカルボニル基、アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、又はアルキル基で置換されていてもよいチオカルバモイル基であり、Ｘ^２は窒素原子もしくは置換基を有してもよい炭素原子を表わす。）
式（２２）で表わされる５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２Ｎ−メチルカルバモイルデオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド、式（２３）で表わされる２−Ｎ−カルバモイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル））−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイルデオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド、又は式（２４）で表わされる５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２Ｎ−メチルチオカルバモイルデオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド。
一般式（２５）で表わされる２−Ｎ−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−３−デアザグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイド。