JP2002510507A

JP2002510507A - ハイブリダイゼーション及び不一致識別のための、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン含有オリゴヌクレオチド

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Publication number: JP2002510507A
Application number: JP2000542486A
Authority: JP
Inventors: マイーヤー，リッチ，ビー，ジュニア; アフォニナ，イリーナ，エイ; クトゥヤヴィン，イゴール，ヴィ
Original assignee: エポック・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-04-05
Publication date: 2002-04-09
Anticipated expiration: 2019-04-05
Also published as: WO1999051775A1; US6127121A; EP1068358B1; AU759944B2; AU3472499A; DE69930379D1; JP4558932B2; US6485906B2; US20100228017A1; ATE320508T1; CA2327547A1; US20030143602A1; EP1068358A1; CA2327547C; US20020146690A1; DE69930379T2

Abstract

(57)【要約】単数又は複数のプリン残基が、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドは、改善されたハイブリダイゼーション特性を示す。ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類似体を有するオリゴヌクレオチドは、同一配列の非置換オリゴヌクレオチドよりも高い溶解温度を有する。従って、標的ポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを含むアッセイにおいて、より高い信号が得られる。更に、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン含有オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブとして使用された場合、不一致識別性が向上し、それらを、ハイブリダイゼーション、増幅及び配列決定手順、特に、単一、又は複数、ヌクレオチドの不一致識別が必要とされるもののためのプローブ及びプライマーとして有用なものとする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、オリゴヌクレオチドをプローブ及びプライマーとしての利用するこ
とに関する分子生物学の分野に関連する。本発明は、更に、プローブ及びプライ
マーとして使用されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性及び識
別能力を改善するための改変核酸塩基の利用にも関する。

【０００２】背景分子生物学に現在使用されている多くの技術は、プローブ及び／又はプライマ
ーとしてオリゴヌクレオチドを利用している。これらの技術を実施するに当たっ
て、互いに関連してはいるが単数又は複数のヌクレオチドが異なる二つ又はそれ
以上の配列間を識別可能であることが有利であることが多い。例えば、臨床的に
有意の多くの変異は、野生タイプの配列から一つのヌクレオチドのみが異なる。
哺乳類ゲノムの多型は、一つ又は少数のヌクレオチドの配列相違によって特徴付
けられることが多い。そのような区別をする能力は、不一致識別として知られて
いる。実際には、不一致識別は、それによって、所与のストリンジェンシにおい
て、所定の配列オリゴヌクレオチドが、それに対してその全長に渡って相補的な
（完全ハイブリッド又は完全一致）標的配列に対しては強くハイブリダイズする
が（その一つの表現は、それらのハイブリッドが高い溶解温度を有していること
である）、一つ又は少数のヌクレオチドでそのオリゴヌクレオチドの配列に対し
て非相補的である標的配列に対しては弱く検出可能な状態でしかハイブリダイズ
しない（不一致）という特性を述べるものである。ハイブリダイゼーション強度
の違いは、特定のストリンジェンシにおいて、完全一致だとハイブリッドとして
検出可能で、不一致ではハイブリッドを形成することができない、ということで
ある。

【０００３】核酸デュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）において、各塩基対が安定性に寄与して
いる。従って、そのデュプレックスが短いほど、各塩基対のそのデュプレックス
の安定性に対する相対的貢献度は大きなものとなる。その結果、オリゴヌクレオ
チドが短くなるほど、完全一致と不一致の間の安定性の相違は大きくなる。しか
しながら、短いオリゴヌクレオチドは、完全に相補的な配列に対してさえ弱くし
かハイブリダイズせず、従って、低いストリンジェント条件でハイブリダイズさ
れなければならない。それにより、短いオリゴヌクレオチドの潜在的識別力は、
その識別能力にとって不利な、低いストリンジェント条件以外では容易に利用す
ることができない。もしも、特に単一ヌクレオチド不一致において、高いストリ
ンジェント条件下、例えば、大半の増幅反応の昇温特性、で不一致識別が達成さ
れれば、当該技術においてそれは大きな進歩となるであろう。

【０００４】ピラゾロピリミジン塩基類似体（ｐｙｒａｚｏｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｂ
ａｓｅａｎａｌｏｇｕｅｓ）によるデュプレックスの安定化は既に報告されて
いる。シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７
１：１１９１−１１９８；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８）Ｈｅｌｖ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ．７１：１８１３−１８２３；及びシーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１
９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：９０１−９１０。オリゴ
ヌクレオチド中のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基は、又、様々なペンダ
ント基（ｐｅｎｎｄａｎｔｇｒｏｕｐｓ）をオリゴヌクレオチドに付着させる
ための部位としても有用である。共有のＰＣＴ公報ＷＯ９０／１４３５３、１９
９０年１１月２９日を参照。更に、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，
４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、ベロウ
ソフ（Ｂｅｌｏｕｓｏｖ）他（１９９８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ
．２６：１３２４−１３２８に記載されているように、より高いトリプレックス
形成能力を示す。ピラゾロピリミジンは、オリゴヌクレオチド中に組み込まれた
時、デュプレックス及びトリプレックス形成の向上を提供することができる。米
国特許５，５９４，１２１。

【０００５】発明の開示本発明の課題は、ハイブリダイゼーションと不一致識別に関連する特性を改善
する新規なオリゴヌクレオチド組成物を提供することにある。本発明の別の課題
は、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、加水分解可能プローブアッセイ
、ＰＣＲ，単一ヌクレオチド不一致識別、ヌクレオチド配列分析、アレイ分析及
び、ヌクレオチドのプローブ及び／又はプライマーとしての使用を含むそれらに
関連する技術のための改善された方法を提供することにある。

【０００６】従って、一態様において、本発明は、少なくとも一つのプリンが単数又は複数
のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類似体によって置換された、改変オリ
ゴヌクレオチド組成物を提供する。好適実施例において、グアニン類似体である
６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（
６−ａｍｉｎｏ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−
４（５Ｈ）−ｏｎｅ）（ｐｐＧ）が、グアニンに置換され、及び／又は、アデニ
ン類似体である４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４−ａ
ｍｉｎｏ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）（ｐｐ
Ａ）がアデニンに置換される。他の実施例において、グアニン類似体である１Ｈ
−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（１Ｈ−ｐｙｒａｚｏ
ｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４（５Ｈ）−ｏｎｅ）（ｐｐＩ）が、
グアニンに置換される。前記ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン置換オリゴヌク
レオチドは、更に、検出可能標識及び／又は浅溝バインダ（ｍｉｎｏｒｇｒｏ
ｏｖｅｂｉｎｄｅｒｓ）及び／又はその他のタイプの改変塩基又は塩基類似体
等の他のモアエティ（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むことができる。

【０００７】本発明の更に別の態様は、核酸のハイブリダイゼーションの方法であって、前
記核酸の少なくとも一つが、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ
］ピリミジン残基類似体によって置換された改変核酸である方法に関する。この
方法によって、高い溶解温度と改善された不一致検出とが提供される。本発明に
よって改善されたハイブリダイゼーション方法は、これらのものに限定されるも
のではないが、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、単一ヌクレオチド多
型検出、加水分解可能プローブアッセイ、ｃＤＮＡ合成、ヌクレオチド配列決定
、増幅反応、及び、当業者に知られているもの等のその他の技術に使用すること
ができる。

【０００８】オリゴヌクレオチド中のグアニン塩基が前記グアニン類似体ｐｐＧによって置
換されると、これら類似体を含有するプローブのＴ_m値は、グアニンを含有するオリゴヌクレオチドプローブのそれらよりも僅かに高くなる。従って、Ｇ含有及
びｐｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて
類似の性能を有する。しかしながら、ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドが加水分解
可能プローブとして使用された場合（後述するように、又、米国特許５，２１０
，０１５を参照）、二つの特性が大幅に向上する。第１に、完全一致ハイブリッ
ドから得られる蛍光信号と、単一ヌクレオチド不一致を含むハイブリッドから得
られるものとを比較した場合より高いＳ／Ｎ比として測定されるように、ｐｐＧ
置換プローブは、不一致識別においてより効果的である。更に、ｐｐＧ置換プロ
ーブは、完全一致標的からより高い絶対値の信号を提供する。

【０００９】発明を実施する態様本発明の実施は、特に銘記されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオ
チド合成及び改変、バイオコンジュゲートケミストリ（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物
学、遺伝学、組換えＤＮＡ、及び当該技術範囲内に於ける関連分野に於ける従来
の技術を使用する。これらの技術は文献に完全に説明されている。例えば、マニ
アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９
８２）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）お
よびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ
；ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（
１９８９）；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，ＣＵＲＲＥＥＮＴＰＲＯＴＯ
ＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ（１９８７，１９８８，１９８９，１９９０，１９９１，１９９２，
１９９３，１９９４，１９９５，１９９６）；Ｇａｉｔ（編集），ＯＬＯＧＯＮ
ＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳＹＳＴＨＥＳＩＳ；ＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰ
ＲＯＡＣＨ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編集），
ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳＡＮＤＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：ＡＰＲＡ
ＣＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９９１）を参照。

【００１０】単数又は複数のプリン残基（即ち、アデニン及び／又はグアニン）が、これら
のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類似体によって置換された改変オリゴヌク
レオチドは、非改変オリゴヌクレオチドによって形成されるものよりも強力なハ
イブリッド（即ち、デュプレックス）を形成する。ハイブリダイゼーション強度
は通常、ハイブリッドデュプレックスの溶解温度（Ｔ_m）の測定によって評価される。これは、溶液中のデュプレックスを徐々に上昇する温度にさらし、そのデ
ュプレックスの変性を、例えば、変性に伴う塩基対の分離を増加させる紫外線光
の吸収率をモニタすることによって達成される。Ｔ_mは、一般に、完全デュプレックス構造から完全な変性状態（即ち、二つの単離された１本鎖ストランドの形
成）への遷移の中間点の温度として定義される。単数又は複数のプリン残基がピ
ラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドによっ
て形成されたハイブリッドは、非置換オリゴヌクレオチドによって形成されたも
のよりも高い（Ｔ_m）を有する。

【００１１】同時に、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによ
って置換された改変オリゴヌクレオチドは、非置換オリゴヌクレオチドと比較し
てより高い不一致識別力を有する。なんら特定の理論によって限定されることを
望むものではないが、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン改変オリゴヌクレオチ
ドの改善された識別力に対する一つの貢献は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジ
ン塩基が、自己対合又は非標準的塩基対合パートナーとの対合に関与する傾向が
少なくなることから生じている可能性がある（即ち、Ｇは、Ｇ及びＴと塩基対合
可能であるのに対して、ｐｐＧ及びｐｐＧ−Ｔ塩基対はその可能性が遥かに少な
い）。

【００１２】ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオチドの構造と合成本発明の改変オリゴヌクレオチドの好適実施例において、すべて又は実施的に
すべての、グアニン含有ヌクレオチドユニットが、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ
［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン含有ヌクレオチド（ｐｐＧ）に
よって置換される。オリゴヌクレオチドのｐｐＧ含有部分が化１に示されている
。より好適性の低い実施例において、全部ではないが、複数のグアニン含有ヌク
レオチドユニットがｐｐＧによって置換される。

【００１３】

【化１】

【００１４】

【化２】

【００１５】オプションとして、前記オリゴヌクレオチドのアデニン含有ユニットを、対応
のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類似体、即ち、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾ
ロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換することもできる。このアデニン類似
体を含むヌクレオチドユニットをｐｐＡと称し、オリゴヌクレオチドのｐｐＡ−
含有部分が化２に示されている。従って、少なくとも一つのグアニン塩基がｐｐ
Ｇによって置換され、かつ、ｐｐＡ類似体を全く含まないオリゴヌクレオチド、
更に、ｐｐＧに加えて、いくつか若しくは可能であればすべてのアデニンがｐｐ
Ａによって置換されたオリゴヌクレオチド、更に、少なくとも一つのｐｐＡ類似
体を有し、ｐｐＧは有さないオリゴヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。

【００１６】ｐｐＧとｐｐＡの２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシド（２−ｄｅｏｘｙ−
β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅｓ）、即ち、６−アミノ−１−（２´−
デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペンタフラノシル−（１Ｈ）−ピラゾロ［３，４
−ｄ］ピリミジン−４−５（Ｈ）−オン（６−ａｍｉｎｏ−１−（２´−ｄｅｏ
ｘｙ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｅｎｔａｆｕｒａｎｏｓｙｌ−（１Ｈ）−ｐ
ｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４（５Ｈ）−ｏｎｅ）及び
４−アミノ−１−（２´−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペンタフラノシル−１
Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４−ａｍｉｎｏ−１−（２´−ｄｅｏ
ｘｙ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｐｅｎｔａｆｕｒａｎｏｓｙｌ−１Ｈ−ｐｙｒａ
ｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）が、合成され、最新の自動オリゴ
ヌクレオチド合成装置でのオリゴヌクレオチド合成に適した対応の活性燐酸塩含
有類似体（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）は、シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（
１９８６ａ）ＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ６９：１６０２−
１６１３；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８ａ）ＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉ
ｍｉｃａＡｔａ７１：１１９１−１１９８；シーラ（Ｓｅｅｌａ）（１９８
８ｂ）ＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ７１：１８１３−１８２
３；及びシーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲ
ｅｓｅａｒｃｈ１７：９０１−９１０に従って得られる。

【００１７】本発明の前記改変オリゴヌクレオチド中に存在する塩基の更に別の改変として
、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジ
ン−４（５Ｈ）−オン（ｐｐＩ）を単数又は複数のプリン塩基に置換させること
ができる。ｐｐＩとそれに対応のヌクレオチドとヌクレオチドとは、これら記載
されたものに関連する方法によって得ることができる。シーラ（Ｓｅｅｌａ）他
（１９８６ｂ）Ｌｉｅｂｉｇｓ，Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ：１２１３−１２２１；シー
ラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８６ａ）前出；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８ａ
）前出；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８ｂ）前出及び、シーラ（Ｓｅｅｌａ
）他（１９８９）前出。

【００１８】本発明の改変オリゴヌクレオチドの現在において好適な実施例において、糖又
はグリコシドモアエティは、２−デオキシリボフラノシド（２−ｄｅｏｘｙｒｉ
ｂｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅｓ）であり、全てのヌクレオチド間結合は、自然発生
的ホスフォジエステル結合である。しかし、別の実施例においては、２−デオキ
シ−β−Ｄ−リボフラノースの代りに、その他の糖、例えば、β−Ｄ−リボフラ
ノースを含ませることができる。更に、β−Ｄ−リボフラノースを含ませて、リ
ボースモアエティの２−ＯＨが、Ｃ_1-6アルキル基（２−（Ｏ−Ｃ_1-6アルキル）
リボース）又は、Ｃ_2-6アルキル基（２−（Ｏ−Ｃ_2-6アルキル）リボース）によ
ってアルキル化されるか、若しくは、フルオロ基によって置換される（２−フル
オロリボース）。当業者に知られているもののような、前記オリゴヌクレオチド
のハイブリダイゼーションに使用可能ないかなる糖モアエティも、使用可能であ
る。

【００１９】一実施例において、本発明の前記改変オリゴヌクレオチドの糖−燐酸塩バック
ボーンは、自然発生核酸に見られるもののような、ホスフォジエステル結合であ
る。しかし、この糖−燐酸塩バックボーンは、これらに限定されるものではない
が、α−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２´−デオキシリボフラノシド又は２´
，３´−ジデオキシ−３´−アミノリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドの
ハイブリダイゼーションに使用可能ないかなる構造のものであってもよい。α−
Ｄ−アラビノフラノシドを含有するオリゴヌクレオチドは、米国特許５，１７７
，１９６の教示に従って得ることができる。２´，３´−ジデオキシ−３´−ア
ミノリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドは、チェン（Ｃｈｅｎ）他（１９
９５）ＮｕｃｅｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：２６６１−２６６８の方
法に従って得ることができる。本発明の改変オリゴヌクレオチドの燐酸塩バック
ボーンは、又、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合及び／又はメチル
ホスホネートを含むようにも改変可能である。その他のバックボーン改変は、当
業者に公知である。

【００２０】本発明の改変オリゴヌクレオチドは、更に、単数又は複数の内部に位置するヌ
クレオチド塩基の３´末端、５´末端、若しくはそれらの両方、又は、内部及び
片方又は両方の末端に、例えば、インターカレータ、脂肪親和性基、浅溝バイン
ダ、レポーター基、キレート剤、架橋剤等のペンダント基を付加することも可能
である。インターカレータ、脂肪親和性基、浅溝バインダ、レポーター基、キレ
ート剤、架橋剤の性質と、それらのオリゴヌクレオチドへの付着は周知であり、
例えば、米国特許５，５１２，６６７、５，４１９，９６６及び公報ＷＯ９６／
３２４９６に開示されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、又、その３´末
端、又は５´末端又はそれらの両方に付着た比較的低分子量の「尾モアエティ」
（ｔａｉｌｍｏｉｅｔｙ）を有するものとすることができる。例えば、その尾
モアエティは、燐酸塩、燐酸エステル、アルキル基、アミノアルキル基、又は脂
肪親和基とすることができる。この尾モアエティは、又、インターカレータ、脂
肪親和基、浅溝バインダ、レポーター基、キレート剤、架橋剤を本発明のオリゴ
ヌクレオチドに結合させることができる。

【００２１】これら尾モアエティの性質と、様々な尾モアエティを備えたオリゴヌクレオチ
ドを得る方法とも、上述の米国特許５，５１２，６６７及び５，４１９，９６６
に記載されている。

【００２２】一好適実施例において、グアニンの代りにｐｐＧ及び／又はアデニンの代りに
ｐｐＡを含有する本発明の改変オリゴヌクレオチドは、更に、共役結合した浅溝
バインダ（ＭＧＢ）を有する。例４及び５に示され後述されているように、グア
ニンの代りにｐｐＧを含有するＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドを使用した場
合に、最適な単一ヌクレオチド不一致識別が得られる。好適ＭＧＢモアエティと
しては、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ
］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ₃）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ₅）がある。本発明の実施に使用可能なその他のＭＧＢモアエティは、ＷＯ９６／３２４９６に開示さ
れている。

【００２３】ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンの反応性前駆体は、上述した手順に従って
得ることができ、これらの前駆体は、自動オリゴヌクレオチド合成の技術に使用
可能である。そのような技術はルーチンであり、当業者には周知である。

【００２４】本発明の使用方法本発明は、非改変オリゴヌクレオチドと比較して、優れた不一致識別の新規で
驚異的な特性を有する改変オリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明の
改変オリゴヌクレオチドは、プローブとして使用され、ここで、その標的配列に
対するハイブリダイゼーションが、検出され、又は、プライマーとしてはその標
的配列に対するハイブリダイゼーション後に改変オリゴヌクレオチドの３´末端
から開始されるポリヌクレオチド合成が行われ、その合成生成物が（即ち、伸長
生成物）が検出される。

【００２５】標的配列とは、プローブ又はプライマーのためのハイブリダイゼーションの部
位を有するヌクレオチド配列である。標的配列は、非限定的に、ゲノムＤＮＡ，
ｃＤＮＡ及びＲＮＡを含むすべての核酸に見られ、野生タイプの遺伝子配列、変
異遺伝子配列、非コード配列、調節配列等を含むことができる。標的配列の長さ
は、通常は、１００ヌクレオチド以下、好ましくは５０ヌクレオチド以下、最も
好ましくは２１ヌクレオチド以下である。

【００２６】オリゴヌクレオチドは、通常、その長さが、２００ヌクレオチド以下、好まし
くは１５０ヌクレオチド以下、より好ましくは５０以下、最も好ましくは２１ヌ
クレオチド以下の短いヌクレオチドポリマーである。ポリヌクレオチドは、当該
技術において、一般に、オリゴヌクレオチドより長いヌクレオチドのポリマーで
あるとみなされているが、オリゴヌクレオチドの上限とポリヌクレオチドの下限
との間ではオーバラップがあることが認識されている。本発明に関しては、「オ
リゴヌクレオチド」とは、一般に、プローブ又はプライマーとして使用される、
検出可能標識を有する核酸を意味し、ポリヌクレオチドとは、標的配列を含む核
酸を意味するものとする。その結果、本発明の目的のためには、「オリゴヌクレ
オチド」と「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリマの長さに関して限定的に
解釈してはならない。

【００２７】標的配列に対するプローブ及び／又はプライマーのハイブリダイゼーションは
、周知の塩基対合特性、即ち、アデニンはチミン又はウラシルと対合し、グアニ
ンはシトシンと対合するという特性に従って行われる。ヌクレオチドが第２のヌ
クレオチドとの対合を可能にすることを、ヌクレオチドの特性を相補性と称する
。従って、アデニンはチミンとウラシルとに対して相補的であり、その逆も真で
あり、同様にグアニンはシトシンに対して相補的であり、その逆も真である。標
的配列に対してその全長に渡って相補的なオリゴヌクレオチドは、完全相補的、
完全一致、又は、その標的配列に対して完全相補的であるといわれ、その逆も真
である。オリゴヌクレオチドとその標的配列は、これら二つの配列中の塩基の大
半が相補的でありながらも一つ又は複数の塩基が非相補的又は不一致である関連
する配列を有することがある。そのような場合、それらの配列は、実施的に相補
的と呼ばれる。もしもオリゴヌクレオチドと標的配列との配列が、それらが一つ
の塩基を除いて全てのヌクレオチド部分において相補的である場合、そのオリゴ
ヌクレオチドと標的配列とは、互いに単一ヌクレオチド不一致を有する。

【００２８】本発明の改変ヌクレオチドは、その自然発生類似体の塩基対合特異性、即ち、
ｐｐＧがシトシンに対して相補的であり、ｐｐＡがチミン及びウラシルに対して
相補的である、という性質を保持している。ｐｐＧ及びｐｐＡの類似体は、グア
ニン及びアデニンと比較して、非相補的塩基に対する所謂「揺らぎ（ｗｏｂｂｌ
ｅ）」対合の傾向が低い。

【００２９】ハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知であり、比較的広い範囲で変化
可能である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシとは、ハイブリダイゼー
ション条件が、不一致ヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成には不利であ
り、これによって、完全一致ハイブリッド、又はより少数の不一致を有するハイ
ブリッドの形成が促進される程度のことであり、より高いストリンジェンシは、
不一致ハイブリッドに対する許容度が低いことに関連付けられている。ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシに影響する要因としては、非限定的に、温度
、ｐＨ、イオン強度、フォルムアミドやジメチルスルホキシド等の有機溶剤の濃
度が挙げられる。当業者に周知であるが、ハイブリダイゼーションストリンジェ
ンシは、温度上昇、イオン強度低下、溶剤濃度低下に従って高くなる。例えば、
オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、前出；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他
、前出；エム・エイ・イニス（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ）他（編集）ＰＣＲＰｒｏ
ｔｏｃｌｓ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９０；
ビー・ディ・ヘイムズ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）他（編集）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄＨｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃ
ｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５及びファン・ネス（ｖａｎ
Ｎｅｓｓ）他，（１９９１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：４１
４３−５１５１を参照。

【００３０】従って、オリゴヌクレオチドとその標的配列間のハイブリッド（デュプレック
ス）の形成において、オリゴヌクレオチドは、溶液中で、ハイブリダイゼーショ
ンに適した温度、イオン強度、ｐＨ等の条件下、即ち、ハイブリダイゼーション
条件下で、標的配列を含むポリヌクレオチドとともにインキュベートされる。ハ
イブリダイゼーション条件は、状況に依っては、そのハイブリダイズさせる配列
に単数又は複数の不一致を有する二つの核酸対と比較して、完全一致配列を有す
る二つの核酸間のハイブリダイゼーションに有利となるように選択される。その
他の場合においては、ハイブリダイゼーション条件は、不一致配列間のハイブリ
ダイゼーションを許容し、より少数の不一致を有する核酸間でのハイブリダイゼ
ーションに有利となるように選択される。

【００３１】ハイブリダイゼーション強度としても知られている、標的配列に対するオリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーション度は、周知の方法によって測定される。
一つの好適な方法は、ハイブリッドデュプレックスのＴ_mを測定する方法である。これは、前述したように、溶液中のデュプレックスを、徐々に上昇する温度に
さらし、例えば、変性に伴う塩基対の分離とともに増加する紫外線光の吸収率に
よつて、そのデュプレックスの変性をモニタすることによって行われる。Ｔ_mは、一般に、変性に伴う紫外線吸収度の変化の中間の温度として定義される。或い
は、もしもＴ_mが既知の場合には、ハイブリダイゼーション温度（一定のイオン強度、ｐＨ及び溶剤濃度に於ける）は、目的とするデュプレックスのＴ_m以下で、目的としないデュプレックスのＴ_m以上となるように選択することができる。この場合、ハイブリダイゼーション度の測定は、単にハイブリダイズされたプロ
ーブの存在をテストすることによって達成される。

【００３２】もしもプローブが検出可能標識を含む場合には、ハイブリダイズしたプローブ
のアッセイは、通常、デュプレックス材中の標識の存在を検出するように構成さ
れる。これは、例えば、特にデュプレックス材を選択すること、特に一本鎖材を
破壊すること、又は、これらの方法のなんらかの組み合わせを利用することに、
によって達成できる。例えば、ハイブリダイゼーション反応混合物を、高ストリ
ンジェンシ条件及び／又は一本鎖特異的ヌクレアーゼに晒すことができ、或いは
、デュプレックスを、一本鎖核酸にではなく二本鎖核酸に対して特異的な親和性
法によって精製することができる。本発明の一好適実施例において、プローブが
デュプレックスに取り込まれた場合にのみ、標識が放出される条件において、前
記標識が前記プローブから放出されることによって、デュプレックスが検出され
る。

【００３３】核酸プローブに使用されるのに適した検出可能標識又はタグは当業者に周知で
あり、具体的には、非限定的に、放射性同位元素、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏ
ｒｅｓ）、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）、蛍光化学発光及び電
子化学発光剤、磁気標識、免疫学的標識、リガンド及び酵素標識がある。適当な
標識として、更に、質量標識、及び、コンビナトリアルケミストリライブラリの
逆重畳（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）に使用されるもの、例えば、高速液体ク
ロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ、質量スペクトル分析等に
よって認識可能なタグがある。

【００３４】オリゴヌクレオチドを標識化する方法は、当業者にとって周知であり、具体的
には、非限定的に、化学的及び酵素的方法がある。例えば、反応性化学基をオリ
ゴヌクレオチドの特定部位に導入することは当業者に周知である。特定部位に位
置する反応性化学基を含むオリゴヌクレオチドは、化学的方法によって標識をプ
ローブに結合させるために、相補的反応基に取り付けられた標識と結合させるこ
とができる（例えば、求核性反応基を含むオリゴヌクレオチドを求電子性反応基
に取り付けられた標識と反応させることができる）。標識の具体例と標識をオリ
ゴヌクレオチドに取り付けるための具体的な方法は、例えば、米国特許５，２１
０，０１５；Ｋｅｓｓｌｅｒ（編集），ＮｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅＬａｂ
ｅｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９２；Ｋｒｉｃｋａ（編
集）ＮｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃＤＮＡＰｒｏｂｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９２；Ｈｏｗａｒｄ（
編集）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＮｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉ
ｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，１９９３に開示されて
いる。オリゴヌクレオチドの非特異的化学標識化は、オリゴヌクレオチドを、例
えば、ヌクレオチド塩基の特異的な官能基反応する試薬と結合させて、同時又は
その後に、そのオリゴヌクレオチドを標識と反応させることによって達成するこ
とができる。例えば、ドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ）他（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ１９：１７７４−１７８１を参照。標識のオリゴヌクレオチドへの
酵素的導入は、標識した前駆体を用いた酵素的改変又はオリゴヌクレオチドの重
合により、或いは、既存のオリゴヌクレオチドに標識を酵素的に付加することに
よって、達成可能である。例えば、米国特許５，４４９，７６７を参照。改変酵
素の具体例としては、非限定的に、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポ
リメラーゼ等がある。既存のオリゴヌクレオチドに標識を付加することが可能な
酵素の具体例としては、非限定的に、リン酸化酵素（ｋｉｎａｓｅｓ）、末端転
移酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）、リガーゼ、グリコシ
ラーゼ等がある。

【００３５】もしもオリゴヌクレオチドがプライマーとして作用することが可能な場合、オ
リゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション度は、そのプライマーの伸長生成物
のレベルを測定することによっても測定することができる。その場合、プライマ
ーが標識化されるか、もしくは、重合化のための単数又は複数の前駆体（通常は
、ヌクレオシド三燐酸塩）を標識化することができる。伸長生成物は、例えば、
サイズ（例えば、ゲル電気泳動）、親和性法、又は、当業者に知られているその
他の方法によって検出することができる。

【００３６】単数又は複数の反応基を含むヌクレオチド単量体を、自動合成中にオリゴヌク
レオチドに導入することができ、これらのヌクレオチドは、標識付着のポイント
として使用することができる。例えば、後述する例１を参照。又、ピラゾロ［３
，４−ｄ］ピリミジン含有リンカーアームを、自動合成によってオリゴヌクレオ
チドに導入することができ、種々の標識の付着のための部位として作用すること
ができる。例えば、後述する例１とＷＯ９０／１４３５３を参照。

【００３７】本発明のいくつかの実施例において、蛍光標識（フルオロフォア）及び／又は
蛍光クエンチング剤を有するオリゴヌクレオチドが使用される。一好適実施例に
おいて、オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアと、クエンチング剤との両方を
含有する。蛍光標識としては、非限定的に、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｉｎｓ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ）、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ
ｓ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎｓ）、その他、当業者に
公知のフルオロホアがある。クエンチング剤は、放出された量の蛍光を減少させ
るべく（即ち、蛍光標識の放出をクエンチする）、フルオロホアによって放出さ
れたエネルギを吸収することが可能な物質である。異なるフルオロホアは、異な
るクエンチング剤によって消光される。一般に、特定のフルオロホア／クエンチ
ング剤対のスペクトル特性は、クエンチング剤の単数又は複数の吸収波長がフル
オロホアの単数又は複数の放出波長とオーバラップするものである。好適なフル
オロホア／クエンチング剤対は、フルオレセイン／テトラメチルローダミンであ
り、上述した放出及び励起波長を比較することによって、当業者により、その他
のフルオロホア／クエンチング剤対を選択することも可能である。

【００３８】ポリメラーゼ連鎖反応等の昇温で行われる増幅アッセイ、又は、熱安定酵素を
利用するその他の操作での使用のために、前記標識は、昇温において安定的なも
のとされる。重合化を含むアッセイのためには、標識は、その重合化酵素の活動
の障害とならないものとされる。標識は、オリゴヌクレオチドの５´及び／又は
３´末端に含ませることができ、及び／又は、その内部に含ませることができる
。この標識は、前記オリゴヌクレオチドの塩基、糖又は燐酸塩モアエティのいず
れか、又は、それ自身がこれらモアエティの一つに付着したなんらかのリンカー
基に付着させることができる。

【００３９】適用例本発明の方法及び組成物は、標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーションが利用される、現在使用中及び今後開発される、様々な技術に使
用可能である。これらのものとしては、非限定的に、１）標的配列に対するオリ
ゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが最終到達点である技術、２）オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用し標的配列をテンプレートとして使用する
単数又は複数のポリメラーゼ介在伸長工程の前に、標的配列に対する単数又は複
数のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが行われる技術、３）標的配
列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、別のプライマーの
伸長を阻止するために使用する技術、４）標的配列に対するオリゴヌクレオチド
のハイブリダイゼーション後に、そのオリゴヌクレオチドを加水分解して取り付
けられた標識を放出する技術、そして、５）単数又は複数のオリゴヌクレオチド
が標的配列にハイブリダイズされ、それら複数のオリゴヌクレオチド間の相互作
用を測定する技術等がある。

【００４０】ハイブリダイゼーションプローブ本発明の一態様において、単数又は複数の改変オリゴヌクレオチドを、プロー
ブ（単数又は複数）と核酸との間でハイブリダイゼーションアッセイすることに
よって前記核酸の標的配列を同定するためのプローブとして使用することができ
る。プローブは、如何なる検出可能な標識で標識化されていてもよく、又は、標
的とのハイブリダイゼーションの前或いは後に二次標識化プローブとハイブリダ
イズすることによって、若しくは、標識と結合可能な反応基を備えることによっ
て、ハイブリダイゼーションの前或いは後に標識化することができる。核酸プロ
ーブのハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知である。例えば、サムブル
ック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出；
イニス（Ｉｎｎｉｓ）他，前出、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）他，前出、ファン・ネ
ス（ｖａｎＮｅｓｓ）他，前出を参照。

【００４１】ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の複数の方法のいずれかを使用して
、遊離プローブからハイブリダイズされたプローブを識別することによってアッ
セイすることができる（即ちハイブリダイズされた核酸を同定することができる
）。これらの方法には、非限定的に、直接的又は（第２の支持体結合プローブへ
のハイブリダイゼーションによって）間接的に支持体に対して標的核酸を付着さ
せ、その後プローブによって直接又は間接ハイブリダイゼーションを行い、ハイ
ブリダイズしなかったプローブを除去するべく洗浄するものであったり、ヌクレ
アーゼ抵抗の測定であったり、浮遊密度測定であったり、核酸デュプレックスに
対して特異的な親和法（例えば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ）で
あったり、同じ標的核酸に対してハイブリダイズされた複数のプローブ間の相互
作用等がある。例えば、ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）他，米国特許４，３５８，
５３５；アーディア（Ｕｒｄｅａ）他，米国特許４，８６８，１０５及び５，１
２４，２４６、Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，ＰｈｙｓｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，サンフランシスコ，１９８２
；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）
他，前出、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）他，前出、及びその他関連の参考資料を参照
。

【００４２】ここに開示される改変オリゴヌクレオチドは、特に、関連標的配列グループ中
の一つの配列を識別するのに有用である。関連標的配列は、その配列が単数又は
複数のヌクレオチド位置において異なるが、その長さの大きな部分に渡って相補
的であるものである。本発明の一好適実施例において、改変オリゴヌクレオチド
は、一つのヌクレオチドのみが異なる関連標的配列を識別可能である。例えば、
完全一致配列は検出可能なハイブリッドを形成するが、一つのヌクレオチド不一
致を有する二つの配列は検出可能なハイブリッドを形成しないハイブリダイゼー
ション条件を選択することが可能である。後述する例５を参照。

【００４３】増幅プライマー増幅手順は、標的核酸配列の多くコピーが、連続重合及び／又は連結反応によ
って、通常は指数関数的に産出されるものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）等の多くの増幅反応は、反復したプライマー−依存重合反応を利用している
。プライマーとは、第２のテンプレート核酸にハイブリダイズ可能で、ハイブリ
ダイズされると、その第２核酸をテンプレートとして使用して、重合化酵素によ
って（ヌクレオチド基質の存在下において）伸長されることが可能な核酸である
。重合化酵素としては、非限定的に、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写
酵素等がある。熱安定性ポリメラーゼは、増幅反応において好ましい。異なる重
合化酵素による重合化に好適な条件は当業者に周知である。例えば，サムブルッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出，オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出、イ
ニス（Ｉｎｎｉｓ）他，前出を参照。一般に、重合化酵素によって伸長可能とな
るためには、プライマーは、ブロックされない３´末端、好ましくは、遊離の３
´ヒドロキシ基を有さなければならない。増幅反応の生成物は、プライマーが重
合化酵素によって伸長された伸長プライマーである。

【００４４】従って、本発明の一実施例においてここに開示され請求項されている方法及び
組成物は、ＰＣＲ等の改良された増幅反応に有用である。例えば、米国特許４，
６８３，２０２；４，６８３，１９５及び４，８００，１５９を参照。本発明の
実施は、特に、不要な配列と、単数又は少数のヌクレオチドが異なる特定の配列
とを選択的に増幅する事を望む状況において有用である。

【００４５】本発明によって提供される改善は、ＰＣＲ又は、非限定的に、対立遺伝子特異
的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）でのプライミング、フラグメント長多型性分
析、単一ヌクレオチドポリモリフィズム（ＳＮＰ）分析、マイクロサテライト分
析等を含む、それに関連の増幅技術が使用されるすべてのタイプのアッセイ又は
手続きに適用可能である。これら及びその他の技術は、そのうちの少数の用途を
挙げると、遺伝子マッピング、疾患関連遺伝子の同定及びスクリーニング、及び
薬物遺伝学に有用である。

【００４６】標識化プローブを利用したアッセイ；加水分解可能プローブアッセイを含む改変オリゴヌクレオチドのその他の利用法は、標識化プローブが標的及び／又
は標的を含む伸長生成物にハイブリダイズされ、そのハイブリダイゼーションの
結果として、標識の物理的状態が変化するアッセイに見られる。例えば、この種
のアッセイの一例として、前記加水分解可能プローブアッセイは、ＤＮＡポリメ
ラーゼ等の多くの重合化酵素は、固有の５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有
するという事実を利用する。従って、プローブが、重合化のためのテンプレート
として作用することが可能な配列にハイブリダイズされると（例えば、増幅反応
中に、プローブが二つの増幅プライマー間に位置するＤＮＡ領域にハイブリダイ
ズされると）、上流側増幅プライマーで重合化を開始した重合化酵素は、そのプ
ローブを末端から（エキソヌクレオリティックに）分解する（ｅｘｏｎｕｃｌｅ
ｏｌｙｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）。前述したプローブのエキソヌクレオリテ
ィックな分解によって、このようなプローブに付けられた如何なる標識は放出さ
れる。放出された標識は、その標識の性質に応じて、当業者に周知の方法によっ
て標識化プローブから分離され、検出される。例えば、放射性標識化されたフラ
グメントは、薄層クロマトグラフィによって分離され、オートラジオグラフィに
よって検出可能であり、一方、蛍光標識化されたフラグメントは、適当な励起波
長での照射と適当な放射波長での観察によって検出可能である。米国特許５，２
１０，０１５を参照。

【００４７】一好適実施例において、プローブは、蛍光標識と、前記蛍光標識の蛍光放出を
停止させるクエンチング剤との両方を含む。この場合、前記蛍光標識は、例えば
蛍光標識がプローブからエキソヌクレオリティックに解離することによって、そ
のクエンチング剤に対する空間関係が変化するまでは検出不能である。従って、
その標的配列へのハイブリダイゼーションの前に、前記フルオロホア／クエンチ
ング剤で二重に標識したプローブは蛍光を発しない。フルオロホア／クエンチン
グ剤標識化プローブがハイブリダイゼーションした後、それは、上流側プライマ
ーで重合化を開始した重合化酵素の有するエキソヌクレアーゼ活性の基質となる
。プローブのエキソヌクレオリティックな分解によって、プローブから、従って
クエンチング剤の近傍から、蛍光標識が遊離し、適当な励起波長での照射による
蛍光信号の検出を可能にする。この方法は、遊離した標識を、無傷のプローブか
ら分離する必要が無いという利点を有する。複合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）アプロ
ーチは、それぞれが異なる標的配列に対して相補的であって識別可能な標識を備
えた複数のプローブを利用し、複数の標的配列のアッセイを同時に可能にする。

【００４８】この種のアッセイは、それが、その結果をリアルタイムでモニタすることが可
能なホモゲナスアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓａｓｓａｙ）である（即ち
、生成物分離工程が不要）である為、特に臨床用途において益々重要となってき
ている。例えば、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７）ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ２２：１３０−１３８を参照。高速、蛍光ベースの分子アッセイ
は、例えば、リアルタイムの外科及び治療用途にも利用される。

【００４９】関連標的配列間を識別する改変オリゴヌクレオチドの高い能力によって、例え
ば、単一ヌクレオチド多型性の同定等において加水分解可能プローブアッセイを
使用することが容易になる。後述する例４及び５は、加水分解可能プローブアッ
セイにおける改変オリゴヌクレオチドの使用を開示している。

【００５０】蛍光クエンチングの原理を使用するその他のアッセイ、又、それらのアッセイ
に改変オリゴヌクレオチドを使用することの利点も、当業者には明白であろう。
又、蛍光標識化改変オリゴヌクレオチドが、すべてのタイプのハイブリダイゼー
ションアッセイにおいて識別力の向上を提供するものであるとも当業者にとって
明白であろう。

【００５１】蛍光エネルギ転移本発明の更に別の実施例において、改変オリゴヌクレオチドは、複数の蛍光標
識化プローブを使用する様々な技術に利用可能である。これらのアッセイのいく
つかにおいて、蛍光及び／又は蛍光標識の特性の変化は、ハイブリダイゼーショ
ンをモニタするのに使用される。例えば、蛍光共鳴エネルギ転移（ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲ
ＥＴ）が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのインジケータとして使
用された。この技術の一実施例において、それぞれが別の蛍光標識を含む二つの
プローブが使用される。これら標識の一つは、蛍光ドナーであり、他方は蛍光ア
クセプタであり、前記蛍光ドナーからの放出波長と前記蛍光アクセプタの吸収波
長とがオーバーラップする。これらのプローブの配列は、標的が存在する場合に
、それらが標的配列の隣接する領域にハイブリダイズし、これによって、蛍光ド
ナーと蛍光アクセプタとを互いに近接配置させるように選択される。標的核酸の
存在時に、前記蛍光ドナーの吸収波長に対応する波長での照射によって、蛍光ア
クセプタから放出が起こる。これらのタイプのアッセイはホモゲナスアッセイで
あって、無反応プローブを除去する必要なくポジティブな信号を提供するという
利点を有する。その詳細及びその他の具体例については、例えば、ヨーロッパ特
許０７０６８５及びカルドゥッロ（Ｃａｒｄｕｌｌｏ）他（１９８８）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９０−８７９４を参照。

【００５２】本発明の更に別の実施例は、同じ標的核酸にハイブリダイズした二つの異なる
オリゴヌクレオチド間の相互作用を測定するこれら及びそれに関連の技術に関す
るものである。適当な蛍光ドナー／蛍光アクセプタ対の選択は、所与の対につい
て、蛍光ドナーの放出波長が蛍光アクセプタの吸収波長とオーバラップするとい
う原理に基づき、当業者にとって明らかであろう。関連標的配列間を識別する改
変オリゴヌクレオチドの高い能力によって、単一ヌクレオチド多型等の同定にお
いてＦＲＥＴに基づく技術を使用することが容易になる。

【００５３】オリゴヌクレオチド連結反応を利用するアッセイ改変オリゴヌクレオチドは、標的核酸上の隣接する部位に対して相補的な、二
つ以上のオリゴヌクレオチドがその標的核酸の隣接部位にハイブリダイズされ、
互いに連結されるアッセイにおいて有用である。例えば、ヨーロッパ特許３２０
，３０８、ヨーロッパ特許公報３３６，７３１及び米国特許４，８８３，７５０
を参照。連結反応のための条件は当業者に周知である。例えば、サムブルック（
Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出、イニス
（Ｉｎｎｉｓ）他，前出、を参照。連結された核酸は、例えば、出発オリゴヌク
レオチドとの比較に於ける生成物のサイズの増加、によって同定可能である。ハ
イブリダイゼーションアッセイと同様、連結反応アッセイに改変オリゴヌクレオ
チドを使用することによって、関連標的配列間、特にオリゴヌクレオチド連結反
応アッセイにおいて重要である、完全ハイブリッドと単一塩基不一致との間のよ
り効率的な識別が可能となる。

【００５４】ｃＤＮＡ合成ｃＤＮＡ合成は、一般的に行われているように、ｍＲＮＡテンプレートをｃＤ
ＮＡにコピーするために逆転写酵素を利用する。逆転写用のプライマーは、通常
は、オリゴデオキシチミデレート（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｙｌａｔ
ｅ）であり、これは、大半のｍＲＮＡ分子の３´末端に見られるポリアデニレー
ト尾に対して相補的である。しかしながら、ｃＤＮＡ合成が、テンプレートｍＲ
ＮＡ分子の５´末端までずっと行われることはめったにない。従って、大半のｃ
ＤＮＡライブラリは、ｍＲＮＡの３´末端近傍の配列は豊富であるが、５´末端
の近傍の配列は不足している。その結果、ｍＲＮＡ配列の完全なｃＤＮＡ表示を
得るためには、ｍＲＮＡの内部領域からプライミングされる単数又は複数の追加
の合成反応が行われなければならない。改変オリゴヌクレオチドは、これらの内
部プライミング工程に使用することができ、一つの遺伝子ファミリの異なるメン
バーに見られるもののような、互いに密接に関連したｍＲＮＡ配列間の識別を可
能にする。

【００５５】更に、ｃＤＮＡの合成は、多くの場合、オリゴデオキシチミデレートプライマ
ーのポリアデニレート尾に対するハイブリダイゼーションを促進するために、低
ストリンジェント条件下で行われる。そのような条件下では、ｍＲＮＡは、分子
間二次構造を容易にとることが知られており、その構造は逆転写酵素による伸長
を阻害し、短い部分ｃＤＮＡ分子の生成をもたらす。これに対して、改変オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用したｃＤＮＡ合成は、ｍＲＮＡテンプレー
ト中の二次構造の最小化をもたらす、より高いストリンジェント条件下で行われ
、これによって、より長いｃＤＮＡ生成物が得られる。

【００５６】核酸配列決定システム本発明の一実施例において、ｎ量体としてとりうる全てのオリゴヌクレオチド
の集合体（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（ｎは約１０以下の整数）が、ヌクレオチド
配列を決定するための加水分解可能プローブアッセイに使用される。各オリゴヌ
クレオチドは、固有に標識化され、解離した標識の分析によって、それらオリゴ
ヌクレオチドのどれが標的配列にハイブリダイズしたかが示される。ハイブリダ
イズしたオリゴヌクレオチドの配列のアライメントによって、ヌクレオチド配列
が提供される。高い識別能力を有する改変オリゴヌクレオチドは、この技術にお
いて特に有用である。

【００５７】改変オリゴヌクレオチドは、又、最初サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７によって記
載された、鎖終結法（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）及
びその派生方法等のＤＮＡ配列決定のプライマー依存方法にも有用である。鎖終
結法に改変オリゴヌクレオチドを使用することによって、配列決定中のより高い
不一致識別性が可能となり、これによって、例えば、二つ以上の互いに密接に関
連した配列間を識別するための改良手段が提供される。

【００５８】オリゴヌクレオチドアレイ本発明の別実施例において、改変オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーシ
ョンと遺伝子発現のアレイベース分析による配列決定等の、オリゴヌクレオチド
のアレイを利用する操作に使用される。ハイブリダイゼーションによる配列決定
において、異なる既知の配列のオリゴヌクレオチドの所定のアレイを、単数又は
複数のポリヌクレオチド、核酸又は核酸集団へのハイブリダイゼーションのため
のプラットフォームとして使用する。ハイブリダイズしたその既知の配列のアラ
イメントを判定することによって、テストポリヌクレオチドの配列を再構築する
ことが可能である。或いは、野生タイプの配列と、対象遺伝子の所与の配列とし
てとりうるすべての変異配列とを有するオリゴヌクレオチドを、アレイ上に置く
ことができる。前記アレイを対象体又は生物学的標本から得たＤＮＡ又はＲＮＡ
に、ハイブリダイゼーション条件下において露出させることによって、その対象
遺伝子のための野生タイプ又は変異状態を判定することができる。例えば、米国
特許５，４９２，８０６；５，５２５，４６４及びＰＣＴ公報ＷＯ９２／１０５
８８及びＷＯ９６／１７９５７を参照。これら両方の技術は、関連配列、特に、
単一ヌクレオチドレベルで関連する配列間の識別を必要とし、従って、本発明の
改変ヌクレオチドの高い識別特性によってこれらの技術において改良が提供され
るであろう。アレイを構築するための材料には、非限定的に、ニトロセルロース
、ガラス、シリコーンウエハ、光ファイバ、当業者に公知のもの等のアレイ構築
に適したその他の材料が挙げられる。

【００５９】アレイ技術に対する本発明の更に別の用途は、特定の細胞又は組織中に於ける
遺伝子発現パターンの試験である。この場合、異なる遺伝子に対応するオリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドが、表面上に配置され、例えば、特定の細胞又
は組織タイプからの核酸サンプルが、ハイブリダイゼーション条件下でそのアレ
イとインキュベートされる。ハイブリダイゼーションが発生するそのアレイ上の
部位を検出することによって、どのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか
、従って、そのサンプルが採取された特定細胞又は組織中においてどの遺伝子が
活性であるか、を判定することができる。

【００６０】アレイ方法は、野生タイプと変異配列とを表面上の整列アレイ中に配置して、
変異の同定のためにも使用可能である。ポリヌクレオチドサンプルをアレイと共
にストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションし、そのアレイ中のどのオ
リゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズするかを判定することに
よって、どのポリヌクレオチドが野生タイプ又は変異配列を有するか否かを判定
することができる。臨床的に関連する遺伝子の多くの変異配列は一つ又は少数の
ヌクレオチド位置においてのみその野生タイプと異なっているので、本発明の改
変オリゴヌクレオチドの高い識別能力は変異検出において改良を提供するであろ
う。

【００６１】上述したアレイ技術のすべてにおいて、改変オリゴヌクレオチドの高い識別力
は、感度と分解能とに於ける大幅な改良を提供するものである。

【００６２】例下記の例は、本発明を例示するものであって、限定するものではない。

【００６３】加水分解可能プローブアッセイにおいて、標識化プローブをＰＣＲ反応に添加
する。プローブは、二つのＰＣＲプライマー間の領域に対して相補的であり、そ
の内の一つが他方の蛍光を消光する、二つのフルオロホアによって標識化される
。前記プローブは、ＰＣＲにおいて通常使用されるストランド伸長温度（５５〜
５７℃）で、又はそれ以上で、そのＰＣＲ生成物ストランドの一つのその相補的
標的配列にハイブリダイズするように構成される。ＰＣＲに通常使用される重合
化酵素（特に、Ｔａｑポリメラーゼ）は、固有の５´エキソヌクレアーゼ活性を
有する。ＰＣＲ反応の伸長段階に於ける新しいストランドの合成中、この５´エ
キソヌクレアーゼ活性がテンプレートに結合した相補的ストランドに対して作用
する。もしも、上述したように標識化されたプローブがテンプレートに結合した
ならば、前記重合化酵素の前記５´エキソヌクレアーゼ活性によって結合された
フルオロホアは開放される。開放されると、その蛍光は、もはや消光されず、蛍
光信号が得られる。例えば、米国特許５，２１０，０１５；リヴァック（Ｌｉｖ
ａｋ）他（１９９５）ＰＣＲＭｅｔｈ．Ａｐｐ．４：３５７−６３２及びハイ
ド（Ｈｅｉｄ）他（１９９６）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．６：９８６−９９４を参
照。

【００６４】例１：二重標識化ＭＧＢ共役結合加水分解可能プローブの作成５´レポータ色素を有するオリゴヌクレオチドプローブの合成［（３´，６´− ジピバロイルフルオレシニル）−６−カルボキサミドヘキシル］−１−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−フォス
フォラミダイト（［（３´，６´− ｄｉｐｉｖａｌｏｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌ）−６−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏｈｅｘｙｌ］−１−Ｏ−（２−ｃｙａ
ｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｕｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ａｍｉｄｉｔｅ）（６−ＦＡＭ）及び３´−ＣＤＰＩ₃−尾（スキーム１）。共役結合ＣＤＰＩ₃尾を有するオリゴヌクレオチドを、ＣＤＰＩ₃−ＣＰＧ支持体（
〜２０−５０ｍｇ）上で標準３´−フォスフォラミダイト試薬（３´−ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して１μｍｏｌスケールで
作成した。ＣＤＰＩ₃−ＣＰＧ支持体の作成は、ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．６：４１８−４２６に開示され
ている。共役結合ＭＧＢのないオリゴヌクレオチドは、標準的な方法で合成した
。合成は、一つの例外、即ち、ＣＤＰＩ₃共役結合オリゴヌクレオチドが合成されている時に、ＣＤＰＩ₃モアエティのヨウ素化を避けるために、酸化工程において、（標準が０．１Ｍであるのに対して）０．０１Ｍのヨウ素溶液を使用した
ことを除き、製造業者によって供給されているプロトコルに従ってＡＢＩ３９４
によって行われた。ＴＡＭＲＡ色素の合成後導入のためのアミノリンカー（下記
参照）は、自動オリゴヌクレオチド合成の所望の工程において、Ｇ又はＡの代り
に、保護アミノプロピルｐｐＧ又はアミノプロピルｐｐＡｐｈｏｓｐｈｏｒａｍ
ｉｄｉｔｅを導入することによってオリゴヌクレオチドの３´末端の近傍に導入
された（共有で、既に許可されている米国特許出願０８／３３４，４９０を参照
）。前記プローブの５´末端にＦＡＭ色素を導入するために、オリゴヌクレオチ
ドの合成の最後の工程において、５´−フルオレセインフォスフォラミダイト（
６−ＦＡＭ，ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．＃１０−５９０１）を使用
した。アンモニア処理（３０％アンモニア、１２〜１５時間，５０℃）による固
体支持体からの開裂と完全な脱保護後、反応物を、濾過し、ロータリーエバポレ
ーションによって乾燥させた。ＣＤＰＩ₃尾を含むプローブを、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．４）中のアセトニトリルのリニア
勾配（０→６０％，２０分間、２ｍＬ／分）で４．６ｘ２５０ｍｍ，Ｃ−１８，
Ｄｙｎａｍａｘ３００Ａカラム（Ｒａｉｎｉｎ）でＲＰ−ＨＰＬＣによって分離
した。ＣＤＰＩ₃尾を含むプローブの画分を、ブタノールと共に、１．５ｍｌのプラスチック管中の６０〜１００μｌの容量に濃縮し、アセトン中の２％ＮａＣ
ｌＯ₄（又はＬｉＣｌＯ₄，１．５ｍＬ）中で沈殿させ、アセトンで洗浄し、真空
乾燥させた。これらＨＰＬＣ精製プローブを、（ｉ）ＴＡＭＲＡ色素の導入用と
して直接的、又は（ｉｉ）更に、８％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って精製して（下記）、使用した。

【００６５】ＴＡＭＲＡ残基の合成後導入（スキーム２）テトラメチルローダミンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−ｈｙ
ｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）（ＴＡＭＲＡＮＨＳエステ
ル，ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃５０−５９１０）を、製造業者によ
って提供されたプロトコルに従って、前記５´−ＦＡＭ，３´−ＣＤＰＩ₃尾オリゴヌクレオチドプローブ（上述したように合成）のアミノプロピルｐｐＧ又は
アミノプロピルｐｐＡ残基に導入した。この反応溶液を、次に、尿素（〜４００
μｌ）で飽和させ、８％変性ポリアクリルアミドゲル（１．５ｘ２７ｍｍパケッ
ト、３８ｘ５０ｃｍプレート、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ゲ
ル緩衝液は７Ｍ尿素、２ｍＭＥＤＴＡ，９０ｍＭトリス−ボレート，ｐＨ８．
３を含有していた）上に載せた。ゲル精製を、一定の電力設定（１００ワット、
５０〜５５℃）で行った。所望の共役結合生成物（即ち、６−ＦＡＭ，ＴＡＭＲ
Ａ及びＣＤＰＩ₃残基を含有するプローブ）がＴＡＭＲＡ特異的色によって検出され、これらをゲルから切り出した。ゲルスライスを、４〜６ｍｌの１００ｍＭ
トリスＨＣｌ，１０ｍＭトリメチルアンモニウムアセテート，１ｍＭＥＤＴＡ
，ｐＨ７．８中で３７℃で一晩インキュベートした。最後に、前記共役結合物を
、（ｉ）上述した逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣ、又は（ｉｉ
）製造業者（ＡｌｌｔｅｃｈＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）によって供給
されたプロトコルに従ってＭＡＸＩ−ＣＬＥＡＮＣ１８カートリッジを使用し
て、ゲル抽出物から分離した。いずれのケースにおいても、プローブをブタノー
ルで濃縮し、２％ＮａＣｌＯ₄アセトン溶液中で沈殿させ、純粋アセトンで洗浄し、真空乾燥し、１００〜４００μｌの水中で溶解させ、−２０℃で保存した。

【００６６】前記オリゴヌクレオチドプローブ中の共役結合モアエティの存在を、特定ＵＶ
及び可視波長での吸収率によって確認した。次の波長を使用した。核酸検出用と
して２５５〜２６５ｎｍ，ＣＤＰＩ₃検出用として３５０ｎｍ，６−ＦＡＭ検出用として４６０〜４８０ｎｍ，ＴＡＭＲＡ検出用として５７０ｎｍ。

【００６７】例２：標的、プライマー、及びプローブ配列ストラテジー標的配列は、プラスミドｐＳＰ１８９に含まれるＥ．ｃｏｌｉｓｕｐＦ遺伝
子に位置する（図１，配列識別番号１）。パーリス（Ｐａｒｒｉｓ）他（１９９
２）Ｇｅｎｅ１１７：１〜５を参照。増幅に使用されるプライマーの結合部位
は、プライマー１及びプライマー２として示され、プライマー１は、図１に図示
されたものと同一の配列と極性を有し、プライマー２は、図１に図示されたもの
に対して逆相補的である配列と極性を有する。それぞれ５´末端がＦＡＭで標識
化され、３´末端がクエンチング剤ＴＡＭＲＡで標識化されたオーバラップする
配列を有する三つのプローブ、即ち、１２量体、１５量体、及び１８量体が合成
された。１２量体と１５量体とは、更に、オリゴヌクレオチドの３´末端近傍に
共役結合浅溝バインダ（ＣＤＰＩ₃）を含んでいた。最後に、各プローブは、正常なグアニン残基（表中Ｇによって示す）を有していたか、もしくは、そのすべ
てのグアニン残基が、ｐｐＧによって置換されていた（表中ｐｐＧで示す）。こ
れらのプローブを使用して、ハイブリダイゼーション強度と不一致識別に対する
ＧのｐｐＧによる置換の効果を判定した。

【００６８】プライマー配列順増幅プライマーは次の配列を有している： 5'-CTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC-3' 配列識別番号２逆増幅プライマーは次の配列を有している： 5'-TGTGATGCTCGTCAGGGGGG-3' 配列識別番号３

【００６９】プローブの配列前記１２量体は次の配列を有している： 5'-TTCCCGAGCGGC 配列識別番号４前記１５量体は次の配列を有している： 5'-GGGTTCCCGAGCGGC 配列識別番号５前記１８量体は次の配列を有している： 5'-GTGGGGTTCCCGAGCGGC 配列識別番号６

【００７０】テンプレート配列この研究に使用されたプローブに対して相補的な前記テンプレートの１８ヌク
レオチド領域を、改変して、図１に図示する一連の点変異を作り出した。これら
変異テンプレートのそれぞれを、前記三つのプローブでの別々のアッセイでに使
用した。テンプレートのこの領域内の変異配列は、次の通りであった。尚、不一
致ヌクレオチドは、太文字と下線によって示されている。 5'-GTGGGGTTCCCGAGCGGC (完全一致) 配列識別番号：7 5'-GTGGAGTTCCCGAGCGGC (32 G-A不一致) 配列識別番号：8 5'-GTGGGGTTTCCGAGCGGC (36 C-T不一致) 配列識別番号：9 5'-GTGGGGTTGCCGAGCGGC (36 C-G不一致) 配列識別番号：10 5'-GTGGGGTTACCGAGCGGC (36 C-A不一致) 配列識別番号：11 5'-GTGGGGTTCTCGAGCGGC (37 C-T不一致) 配列識別番号：12 5'-GTGGGGTTCACGAGCGGC (37 C-A不一致) 配列識別番号：13 5'-GTGGGGTTCCCCAGCGGC (39 G-C不一致) 配列識別番号：14 5'-GTGGGGTTCCCGTGCGGC (40 A-T不一致) 配列識別番号：15 5'-GTGGGGTTCCCGAACGGC (41 G-A不一致) 配列識別番号：16 5'-GTGGGGTTCCCGACCGGC (41 G-C不一致) 配列識別番号：17 5'-GTGGGGTTCCCGAGCAGC (43 G-A不一致) 配列識別番号：18 5'-GTGGGGTTCCCGAGCTGC (43 G-T不一致) 配列識別番号：19 5'-GTGGGGTTCCCGAGCGTC (44 G-T不一致) 配列識別番号：20

【００７１】例３：加水分解可能プローブアッセイ蛍光モニタリングを使用した加水分解可能プローブアッセイを、Ｉｄａｈｏ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販のライトサイクラ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ
）を使用して行った。ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７ａ）Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１３０〜１３８、及びウィットワー（Ｗｉｔｔ
ｗｅｒ）他（１９９７ｂ）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１７６〜１８
１。各反応混合物は以下を含んでいた。４０ｍＭＮａＣｌ２０ｍＭトリス−Ｃｌ，ｐＨ８．９５ｍＭＭｇＳＯ₄ ０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン１２５μＭ各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ０．５μＭ各プライマー０．５μＭプローブ０．５Ｕ／１０μＬＴａｑポリメラーゼ

【００７２】９４℃で０秒、４０サイクルの増幅を行った（即ち、温度は９４℃に昇温され
、その後すぐにアニーリング／伸長温度にまで下げられた）、その後、アニーリ
ング／伸長温度（これは、それぞれの実験において５５〜７５℃範囲で変化した
；詳細については下記及び図中の凡例を参照）で１５秒であった。蛍光放出は、
前記ライトサイクラと共に供給される製造者のソフトウエアにより解析され、５
１５〜５６０ｎｍ（フルオレセイン）の蛍光と、５６０〜６３０ｎｍ（ローダミ
ン）の蛍光の比で表わされた。

【００７３】溶解温度（表３）は、ＰＥＣＳＳソフトウエアパッケージを使用して、ＰＴＰ
−６温度コントローラを備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ λ２ＳＵＶ／ＶＩ
Ｓ分光計によって測定された。

【００７４】例４：ｐｐＧ置換の、Ｔ_mと単一ヌクレオチド不一致識別に対する作用同じ標的配列領域に渡ってまたがる１２，１５又は１８ヌクレオチドのオリゴ
ヌクレオチドを、加水分解可能プローブとして使用して、完全一致標的配列と、
異なる単一ヌクレオチド不一致標的配列とに対するハイブリダイゼーションにつ
いてテストした（図１）。各プローブが、すべてのＧのｐｐＧによる置換有りと
、無しとでテストされた。前記１２量体及び１５量体オリゴヌクレオチドは、更
に、共役結合ＭＧＢを含んでいた。共通対のプライマーを使用して、標的配列を
含むテンプレートのセグメントを増幅した。表１において蛍光値は、プローブが
完全に一致した野生タイプ配列と（表において「一致」として示されている）、
前記不一致変異配列の一つがテンプレートとして使用されたアッセイについて示
されている。表１は、任意の蛍光単位で、４０サイクルのＰＣＲ後に発生された
蛍光信号の量を示している。この値は、元のサンプル中に存在する標的のコピー
数の推定値を提供し（ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他，前出）、又、初期標
的の等価量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）については、そのアッセイ中の加水分解可
能プローブの有効性のおよその測定値を提供している。これらの結果を二つの方
法で示す。表１は、４０サイクルの増幅後にアッセイ中で測定された蛍光量の絶
対値を示している。表２においては、各不一致プローブ／テンプレートハイブリ
ッドの蛍光量値（４０サイクル後）は、完全一致ハイブリッドについて得られた
値の百分率として示されている。

【００７５】表１及び２に示されたデータから、ｐｐＧ置換を使用することの二つの利点が
明らかである。第１に、プローブ中のＧをｐｐＧによって置換することによって
、そのプローブで得られる測定信号の強度が増加する。いかなる特定のプローブ
からの信号も、アッセイに使用される条件に依存するものではあるが、ｐｐＧの
追加が常に信号を増大させるという事実は、ｐｐＧ含有オリゴヌクレオチドによ
って形成されたハイブリッドが高いＴ_m値を有するということを暗示している。表３は、これがまさにその通りであることを示している。テストされたすべての
ケースにおいて、ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドを含有するハイブリッドのＴ_m は、非置換オリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドのそれよりも１
〜４℃高い。

【００７６】ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドを使用することの第２の利点は、プローブ中の
ｐｐＧの存在によって、単一ヌクレオチド不一致検出力が大幅に高まることであ
る。所与のプローブ／テンプレート対によって得られる蛍光量が、完全一致プロ
ーブ／テンプレート対を使用するアッセイで得られる蛍光量の百分率として表わ
された場合（表２）、一般に、Ｇ残基の代りにｐｐＧを含むことによって、完全
一致標的から得られる信号に対する不一致標的から得られる信号の比率が減少す
ることが判る。なんら特定の理論によって限定されることを望むものではないが
、ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドによって得られる高い不一致識別力は、グアニ
ンが、普通と異なる塩基対（即ち、シトシン以外の塩基との）を形成する傾向と
いう、ｐｐＧがもっていない特性に関連するものであることが示唆される。

【００７７】例５：単一ヌクレオチド不一致識別に対するｐｐＧ置換の作用図２は、アニーリング／伸長がＭＧＢ−共役結合１５量体プローブと７２℃で
行われた時の、加水分解可能プローブアッセイ（例３に記載したもの）の蛍光放
出の時間変化を示している。完全一致（図中において「一致」として示される）
によって最も高いレベルの信号が提供されているが、標的との単一ヌクレオチド
不一致を含むプローブの多くからも検出可能な信号が得られる。しかしながら、
もしもアッセイを、ＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドプローブ中のすべてのグ
アニン残基がｐｐＧによって置換されていることを除いて同一条件で行ったなら
ば、単一塩基不一致を含むプローブによる信号の発生は大幅に低減し、これに対
して、完全一致プローブによって発生される信号の量は影響されない（図３）。
更に、もしも、ｐｐＧ改変ＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドプローブが、その
アニーリング／伸長温度が７５℃にまで昇温されたアッセイで使用されるならば
、単一塩基不一致を有するプローブによる信号の発生は、完全に抑制され、これ
にたいして、ここでも、完全一致プローブによって発生される信号のレベルには
影響がない（図４）。

【００７８】従って、ＭＧＢ共役結合、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類似体によ
る置換、及び適当な反応条件によって、高ストリンジェンシに於ける、完全一致
ハイブリッドと、単一ヌクレオチド不一致を含むハイブリッドとの間の識別が容
易となり、短いオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション反応にお
いて、かつて比類のない特異性レベルが可能となる。

【００７９】

【表１】

【００８０】

【表２】

【００８１】

【表３】

【００８２】以上、本発明を、理解を明瞭にする目的で、図示と具体例によっていくらか詳
細に説明したが、当業者においては、本発明の精神から離脱することなく、様々
な変更及び改変を行うことが可能であることは明らかであろう。従って、以上の
説明及び具体例は、本発明の範囲を限定するものと見なされてはならない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドｐＳＰ１８９中に含まれるＥ．ｃｏｌｉｓｕｐＦ遺伝子の
ヌクレオチド配列（配列識別番号１）を図示している。増幅プライマーのための
標的配列の位置は、「プライマー１」及び「プライマー２」として表示されてい
る。又、前記プローブの標的配列（「１２量体」、「１５量体」及び「１８量体
」として示されている）と、これらプローブ標的配列に導入された単一ヌクレオ
チド置換（プローブ標的配列の下に図示）も図示されている。

【図２】図２は、浅溝バインダ（ＭＧＢ）−共役結合１５量体をプローブとして使用した
加水分解可能プローブアッセイの結果を図示している。標的は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｓｕｐＦ遺伝子であった。アニーリング／伸長は、各サイクル２０秒間で７２℃
で行われた。

【図３】図３は、ＭＧＢ共役結合１５量体をプローブとして使用した、加水分解可能プロ
ーブアッセイの結果を示している。この実験において、これらプローブ中の全て
のグアニン塩基は、グアニン類似体ｐｐＧによって置換された。すべてのプロー
ブは、更に、共役結合ＭＧＢも含んでいた。標的は、Ｅ．ｃｏｌｉｓｕｐＦ遺
伝子であった。アニーリング／伸長は、各サイクル２０秒間で７２℃で行われた
。

【図４】図４は、ＭＧＢ共役結合１５量体をプローブとして使用した、加水分解可能プロ
ーブアッセイの結果を示している。この実験において、これらプローブ中の全て
のグアニン塩基は、グアニン類似体ｐｐＧによって置換された。標的は、Ｅ．ｃ
ｏｌｉｓｕｐＦ遺伝子であった。アニーリング／伸長は、各サイクル２０秒間
で７５℃で行われた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アフォニナ，イリーナ，エイアメリカ合衆国ワシントン 98012 ミル・クリーク 114ス・コートサウス・イースト 2717 (72)発明者クトゥヤヴィン，イゴール，ヴィアメリカ合衆国ワシントン 98021 ボセル 48ス・アベニューノース・イースト 23611 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR42 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】関連配列を有するポリヌクレオチドを識別する方法であって
、該方法は以下の工程を有する、（ａ）所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する、ここで、該オリゴ
ヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基はピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン
によって置換されている、（ｂ）それぞれが標的配列を有する少なくとも二つのポリヌクレオチドを提供
する、ここで、前記ポリヌクレオチドの内の一つは前記オリゴヌクレオチドに対
して完全に相補的な標的配列を有し、前記ポリヌクレオチドの少なくとももう一
つは、関連標的配列を有する、（ｃ）夫々の前記ポリヌクレオチドを、別々に、前記オリゴヌクレオチドと共
にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして（ｄ）前記オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドのそれぞれとの間のハ
イブリダイゼーション度を測定する。
【請求項２】請求項１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、更に
、検出可能標識を有する。
【請求項３】請求項２の方法であって、前記検出可能標識は、蛍光標識で
ある。
【請求項４】請求項３の方法であって、前記標識は、フルオレセインであ
る。
【請求項５】請求項３の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、複数
の蛍光標識を有する。
【請求項６】請求項５の方法であって、前記蛍光標識のうちの一つの蛍光
標識の放出波長は、前記蛍光標識のうちの他の蛍光標識の吸収波長とオーバラッ
プしている。
【請求項７】請求項３の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、更に
、前記蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチング剤を有する。
【請求項８】請求項７の方法であって、前記蛍光標識はフルオレセインで
ある。
【請求項９】請求項８の方法であって、前記クエンチング剤は、テトラメ
チルローダミンである。
【請求項１０】請求項７の方法であって、更に、ハイブリダイゼーション
後に、前記蛍光標識と、前記クエンチング剤との空間関係を変化させる工程を有
する。
【請求項１１】請求項１０の方法であって、前記蛍光標識と前記クエンチ
ング剤との空間関係の変化は、前記オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ加
水分解によって行われる。
【請求項１２】請求項１１の方法であって、エキソヌクレアーゼ加水分解
の結果として標識の放出が起こる。
【請求項１３】請求項１２の方法であって、前記オリゴヌクレオチドと前
記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度は、ハイブリダイゼーショ
ン後に前記オリゴヌクレオチドから放出される標識の量によって測定される。
【請求項１４】請求項１の方法であって、前記複数のポリヌクレオチドは
、一つのヌクレオチドが異なる。
【請求項１５】請求項１２の方法であって、前記複数のポリヌクレオチド
は、一つのヌクレオチドが異なる。
【請求項１６】請求項１の方法であって、単数又は複数のグアニン残基が
、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン
によって置換されている。
【請求項１７】請求項１の方法であって、単数又は複数のアデニン残基が
、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されてい
る。
【請求項１８】請求項１の方法であって、単数又は複数のプリン残基が、
１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換さ
れている。
【請求項１９】請求項１の方法であって、単数又は複数のプリン残基が、
ヒポキサンチンによって置換されている。
【請求項２０】請求項１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、更
に、単数又は複数の浅溝バインダ（ＭＧＢ）モアエティを有する。
【請求項２１】請求項２０の方法であって、前記浅溝バインダモアエティ
は、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］イ
ンドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ₃）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ₅）とから成るグループから選択される。
【請求項２２】請求項１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、そ
の長さが２１ヌクレオチド以下である。
【請求項２３】請求項１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドと前記
各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度は、前記オリゴヌクレオチド
のプライミング能力によって測定される。
【請求項２４】請求項２３の方法であって、プライミングは増幅反応の一
部として起こる。
【請求項２５】請求項２４の方法であって、前記増幅反応はポリメラーゼ
連鎖反応である。
【請求項２６】請求項３の方法であって、一つ以上のオリゴヌクレオチド
が使用される。
【請求項２７】請求項２６の方法であって、二つのオリゴヌクレオチドが
使用される。
【請求項２８】請求項２７の方法であって、前記二つのオリゴヌクレオチ
ドの第１は、蛍光ドナーを含み、前記二つのオリゴヌクレオチドの第２は蛍光ア
クセプタを含み、更に、前記蛍光ドナーの放出波長は前記蛍光アクセプタの吸収
波長とオーバラップしている。
【請求項２９】ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出する方法であ
って、該方法は以下の工程を有する、（ａ）前記標的配列の存在をテストされるべきポリヌクレオチドを提供する、（ｂ）前記標的配列に対して実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを提供する、（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼー
ション条件下でインキュベートし、（ｄ）ハイブリダイズされた核酸を同定する、ここで、前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［
３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項３０】請求項２９の方法であって、複数のポリヌクレオチドが前
記標的配列の存在に関してテストされ、これらポリヌクレオチドは関連標的配列
を有する。
【請求項３１】請求項３０の方法であって、前記複数のポリヌクレオチド
は、前記標的配列中の一つのヌクレオチドが互いに異なる。
【請求項３２】請求項３１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、
更に、浅溝バインダモアエティを有する。
【請求項３３】請求項３２の方法であって、前記浅溝バインダモアエティ
は、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］イ
ンドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ₃）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ₅）とから成るグループから選択される。
【請求項３４】請求項２９の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、
伸長可能な３´−ヒドロキシ基を有するプライマーである。
【請求項３５】請求項３４の方法であって、ハイブリダイズされた核酸が
、前記プライマーを重合化酵素によって伸長することによって同定される。
【請求項３６】請求項３５の方法であって、前記重合化酵素は熱安定酵素
である。
【請求項３７】請求項３４の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、
増幅反応のプライマーである。
【請求項３８】請求項３７の方法であって、前記増幅反応はポリメラーゼ
連鎖反応である。
【請求項３９】プライマー伸長方法であって、該方法は以下の工程を有す
る、（ａ）標的配列を含むポリヌクレオチドを提供する、（ｂ）前記標的配列に対して相補的な単数又は複数のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを提供する、（ｃ）重合化酵素とヌクレオチド基質とを提供する、そして（ｄ）前記ポリヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドプライマーと、前記
酵素と、前記基質とを、重合化に適した条件下でインキュベートする、ここで、前記単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの単数又は複数の
プリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項４０】請求項３９の方法であって、該方法は、増幅反応の一部で
ある。
【請求項４１】請求項４０の方法であって、前記増幅反応はポリメラーゼ
連鎖反応である。
【請求項４２】請求項３９の方法であって、該方法は、ｃＤＮＡ分子の合
成に使用される。
【請求項４３】ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であ
って、該方法は以下の工程を有する、（ａ）互いに異なる既知の配列を有するオリゴヌクレオチドのアレイを提供す
る、（ｂ）前記ポリヌクレオチドを前記アレイと共にハイブリダイゼーション条件
下でインキュベートする、そして（ｃ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドに前記ポリヌクレオチドがハイ
ブリダイズするかを判定する、ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾ
ロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項４４】ポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列を決定
する方法であって、該方法は以下の工程を有する、（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，
４−ｄ］ピリミジンによって置換され、かつ、前記少なくとも二つのオリゴヌク
レオチドの一つが、前記標的配列に対して完全相補的な配列を有し、前記オリゴ
ヌクレオチドの少なくとも他方が関連標的配列を有する、既知の配列の少なくと
も二つのオリゴヌクレオチドを提供する、（ｃ）前記夫々のオリゴヌクレオチドを、別々に、前記ポリヌクレオチドと共
にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして（ｄ）前記各オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼ
ーション度を測定する。
【請求項４５】請求項４４の方法であって、前記少なくとも一つの他方の
オリゴヌクレオチドは、前記標的配列に対して単一ヌクレオチド不一致を有する
。
【請求項４６】細胞中の遺伝子発現を調べる方法であって、該方法は以下
の工程を有する、（ａ）前記細胞中で発現される前記遺伝子を表わすポリヌクレオチドの集団を
提供する、（ｂ）互いに異なる配列のオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、（ｃ）前記ポリヌクレオチドの集団を前記アレイとハイブリダイゼーション条
件下でインキュベートする、そして（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズされたかを判定する、ここで、前記各オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ
［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。
【請求項４７】対象の遺伝子の標的配列中の変異を同定する方法であって
、該方法は以下の工程を有する、（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、（ｂ）互いに配列の異なるオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、ここで、
これらの異なる配列は、野生タイプの標的配列と、異なる変異標的配列とを含む
、（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記アレイとをハイブリダイゼーション条件下
でインキュベートする、そして（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズされたかを判定する、ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾ
ロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている。