CN102954961A

CN102954961A - 一种花椒麻味素类物质含量快速检测方法

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Publication number: CN102954961A
Application number: CN2012104104621A
Authority: CN
Inventors: 李孟楼; 李菲菲; 聂勋良; 聂勋杰
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2012-10-09
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2032-10-09
Also published as: CN102954961B

Abstract

本发明公开了一种花椒麻味素类物质含量快速检测方法，包括以下步骤：1)总酰胺浸膏的提取；2)酰胺转变为铵态氮；3)铵态氮含量测定。本发明建立了花椒麻味素类物质含量的快速检测技术、即甲醛滴定法，与目前国内外的测定方法相比较，本方法所使用的设备易得、检测成本较低廉，操作简单、快捷，且能够准确检测出花椒所含的总酰胺含量。

Description

一种花椒麻味素类物质含量快速检测方法

技术领域

本发明属于化学技术领域，涉及一种花椒麻味素类物质含量快速检测方法。

背景技术

花椒(Zanthoxylum spp.)系芸香科、花椒属植物，全世界约250种，分布于亚洲、美洲、非洲及大洋洲的热带和亚热带地区。研究表明，花椒(这里指花椒果实的果皮，以下与此同意)的化学成分主要有挥发油、生物碱、脂肪酸酰胺、木质素、香豆素和脂肪酸等；以花椒素为代表的链状不饱和脂肪酸酰胺是花椒特有的辛麻味成分，该类具有麻味的酰胺有8种、并统称为麻味素(以下简称总酰胺或麻味素)。长期以来，花椒品质的界定没有一个统一、科学的标准，其原因就在于未能找到一种快速、准确的麻味素类物质检测方法。因此，研究花椒麻味素含量的快速检测方法，并针对不同产地不同花椒品种麻味素含量特征建立数据库，对建立花椒的质量评价体系、质量标准及品质的地理区划有着重要意义。

花椒麻味素类(总酰胺)物质的测定和分析方法包括高效液相色谱分析、分光光度法、反相高效液相色谱法、GC-MC测定法、红外光谱法、薄层层析法、色差仪技术、微生物法等。但或因需要8种麻味酰胺的标准样、或分析仪器昂贵、或提取与检测操作繁琐、或稳定性与可靠性差等原因，而难以在花椒质量的常规检测中使用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种花椒麻味素类物质含量快速检测方法，该方法是一种快速、准确的麻味素检测方法。

其具体技术方案为：

一种花椒麻味素类物质含量快速检测方法，包括以下步骤：

1)总酰胺浸膏的提取

粉碎待测花椒，提取溶剂用95％乙醇。称取花椒粉末10.00g，放入500ml三角瓶中，提取时间为1～4h，液料比为1∶5～1∶15，提取温度为30～50℃，提取物用布氏漏斗抽滤，旋转蒸发器浓缩，称重所得浸膏留用。

2)酰胺转变为铵态氮

取步骤1)所得浸膏3.00g，加入球型冷凝器的锥形瓶中后用15ml乙醇溶解，再加入20ml的50％浓H2SO4、120℃下用磁力搅拌器搅拌，硝化反应25min，反应完全后加2g颗粒状活性炭，100℃下用球型冷凝器加热回流脱色30min，趁热过滤，滤液用蒸馏水定容至250ml留用。

3)铵态氮含量测定

取步骤2)所得滤液50ml放入250ml锥形瓶，加入2～3滴甲基红指示剂，用1mol/L NaOH溶液滴定至呈现黄色，PHS-3B计酸度测定使pH≈6，以除去滤液中的剩余酸；然后加入10ml的18％(1+1)除酸甲醛，2～3滴酚酞指示剂后充分摇匀，静置5min后用准确标定0.0982mol/L NaOH溶液滴定至橙红色，并保持0.5min内不褪色即为终点，PHS-3B酸度计测定使pH≈9，记录所用0.1mol/L NaOH溶液体积，该测定重复3次。

步骤1)中所述提取时间为2.5h，液料比为1∶10，提取温度为50℃。与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明建立了花椒麻味素类物质含量的快速检测技术、即甲醛滴定法，与目前国内外的测定方法相比较，本方法所使用的设备易得、检测成本较低廉，操作简单、快捷，且能够准确检测出花椒所含的总酰胺含量。

附图说明

图1为液相色谱测定值q与滴定法测定值W′拟合曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1)材料与方法

测定原理

花椒中含氮的成分有麻味素酰胺、蛋白质、游离氨基酸、生物碱等，在提取麻味素酰胺时为避免或减少同时提取出其他含氮成分，应选用乙醇作为提取溶剂。提取出浸膏后，用浓硫酸进行硝化反应可将酰胺态氮转变为能够使用滴定法检测的铵态氮NH4⁺，而浸膏中其他含氮成分如氨基酸、蛋白质中的氮则被浓硫酸分解为N3⁺，不会对下一步测定花椒总酰胺含量产生影响。但由于NH₄ ⁺酸性太弱(Ka＝5.6×10^-10)，不能用NaOH标准溶液直接滴定，而应采用甲醛法进行测定。

样品、主要试剂和仪器

仪器CHJ-1磁力恒温搅拌器，KQ-100数控超声波清洗器，万分之一电子天平，RE-52旋转蒸发器，PHS-3B酸度计，300ml/14*2球型冷凝器一套。LC-10A分析型高效液相色谱仪(日本岛津公司)。

试剂邻苯二甲酸氢钾(KHC₈H₄O₄，分子量204.23)，1mol/L NaOH溶液，95％乙醇，18％甲醛溶液，50％浓H₂SO₄(浓硫酸是指浓度大于或等于70％的硫酸溶液)，准确标定0.0982mol/L的NaOH溶液，18％(1+1)除酸甲醛，酚酞指示剂，甲基红指示剂，pH＝5.0～7.0的颗粒状活性炭，蒸馏水。

样品花椒麻味素粗品(江津、兰州、茂汶)由重庆四面山花椒公司提供。产自江津、茂汶、兰州的花椒样品及14种产地的花椒。花椒麻味物质标准品由西南大学食品科学学院提供。

2)花椒中总酰胺含量的测定

总酰胺浸膏的提取粉碎待测花椒，提取溶剂用95％乙醇，每处理称取花椒粉末样T₁＝10.00g、放入500ml三角瓶中，设置9个处理的L⁹(3⁴)正交设计，即提取时间A(1h、2.5h、4h)，液料比B(1∶5、1∶10、1∶15)，提取温度C(30℃、40℃、50℃)，以选择最佳的超声波提取条件。提取物用布氏漏斗抽滤、旋转蒸发器浓缩，称重所得浸膏T₂(g)留用。试验结果采用方差分析方法及SPASS统计软件分析。

酰胺转变为铵态氮取上述浸膏T₃＝3.00g，加入球型冷凝器的锥形瓶中后用15ml乙醇溶解，再加入20ml的50％浓H₂SO₄、120℃下用磁力搅拌器搅拌、硝化反应25min。反应完全后加2g颗粒状活性炭，100℃下用球型冷凝器加热回流脱色30min，趁热过滤，滤液用蒸馏水定容至V1＝250ml留用。

铵态氮含量测定取上述滤液V2＝50ml放入250ml锥形瓶，加入2～3滴甲基红指示剂，用1mol/L NaOH溶液滴定至呈现黄色(PHS-3B计酸度测定使pH≈6)，以除去滤液中的剩余酸；然后加入10ml的18％(1+1)除酸甲醛、2～3滴酚酞指示剂后充分摇匀，静置5min后用准确标定0.0982mol/L NaOH溶液滴定至橙红色，并保持0.5min内不褪色即为终点(PHS-3B酸度计测定使pH≈9)，记录所用0.1mol/L NaOH溶液体积V₃。该测定重复3次。

3)验证实验

分别对重庆四面山花椒公司提供麻味素粗品(由江津、兰州、茂汶花椒所提取)，采用液相色谱和滴定法检测其总酰胺含量，以验证和校正滴定法检测结果。

液相色谱检测以花椒麻味素标准品为标样，采用高效液相色谱法检测。

滴定法检测称取花椒麻味素粗品(江津、兰州、茂汶)T₄≈0.5g，加入45ml乙醇溶液，待溶解完全后，滤除不溶性杂质。加入20ml的50％浓H₂SO₄，在120℃下消化反应25min，反应完成后加入约1g活性炭，加热回流脱色30min，滤纸过滤，定容至V₁＝250ml。取V₂′＝25ml溶液3份，各加入2～3滴甲基红指示剂，其余方法与铵态氮含量测定方法相同，该方法也适宜测定花椒油中酰胺类麻味物质的含量。

4)花椒中酰胺类麻味物质含量计算

滴定法测定每克花椒粉末样品中总酰胺含量Q(mg/g)＝a[(∑V_3i/3)×C×14.0067×b×T₂]/(T₁×T₃)；滴定法测定时，验证实验中每克样品中花椒麻味素粗品的总酰胺含量Q′(mg/g)＝a[V_NaOH-i×C×14.0067×b′]/T₄，该式也适宜计算花椒油中酰胺类麻味物质的含量。

式中，V_3i为铵态氮含量测定中消耗的NaOH溶液体积(ml)，C为NaOH溶液的准确标定浓度，T₁为花椒粉末样重(g)，T₂为T₁花椒粉末样所得浸膏重(g)，T₃为酰胺转变为铵态氮时的浸膏重(g)，T₄为验证实验中花椒麻味素粗品用量(g)，V_NaOH-i为验证实验中消耗的NaOH溶液体积(ml)，14.0067为N的分子量，a为系统误差矫正系数，b＝V₁/V₂，b′＝V₁/V₂′。

5)结果与分析

花椒总酰胺超声波提取条件

花椒总酰胺超声波提取的L⁹(3⁴)正交实验结果如表1。方差分析表明，A因素的显著值P-value＝0.318，B因素的显著值P-value＝0.341，C因素的显著值P-value＝0.046^※。即，时间和料液比对花椒总酰胺的提取效果无显著影响，而温度对提取效果影响显著。且影响次序为：C＞A＞B。

通过直观分析，A因素应选水平2，B因素应选水平2，C因素应选水平3，即，最佳提取组合为A₂B₂C₃，因此，超声波提取花椒酰胺的最佳条件为：50℃，料液比为1∶10，提取2.5h。

表1花椒总酰胺超声波提取条件试验方案及结果

验证实验结果

滴定法与用液相色谱测定的花椒麻味素类物质含量如表2。由图1可知，滴定法测定值W′与液相色谱测定值q之间存在系统误差，其线型关系符合q＝2.2696W′(R²＝0.9781)，即采用滴定法检测花椒总酰胺含量时，应使用校正系数2.2696对其测定值进应校正。分别对滴定法校正值、液相色谱测定值采用一个样本的K-S检验表明，滴定法校正值的显著值P-value＝0.626，液相色谱测定值的显著值P-value＝0.268，所以两者都服从泊松分布(表示单位时间内随机时间发生的次数)。再对滴定法校正值与液相色谱测定值进行配对样本T检验，得到显著值P-value＝0.866，即液相色谱测定值与滴定法校正值间无差异。

表2滴定法与液相色谱测定结果比较

不同产地花椒麻味素类物质含量

来自全国各地14种花椒中的总酰胺含量测定结果如表3。从表3可以看出，不同花椒产区的花椒总酰胺的含量是有较大差异，但花椒麻味物质即总酰胺的含量在高山区红椒(韩城、山东青岛崂山、甘肃陇南康县、陕西洛南、西藏朗县)较高于低山区(山西芮城、云南昆明、宝鸡凤县、湖北恩施来凤县、山东淄博博山)及青花椒，青花椒的总酰胺含量也以高山区的较高。

表3不同产地花椒中的总酰胺含量

花椒总酰胺浸膏的提取有常规溶剂、微波、超临界CO₂等技术，但其提取率多在7.3％～2.4.2％；而采用50℃、料液比为1∶10、提取2.5h超声波提取时，提取率达53.50％。甲醛法与液相色谱法测定花椒总酰胺相比较，甲醛法与液相色谱法间的系统误差系数为2.2696。用甲醛法对来自全国14种花椒的酰胺含量测定说明，高山区红花椒的总酰胺含量＞青花椒＞低山区红花椒。本研究的优势在于样品来源比部分文献报道中的样品来源范围较大，因而有差别。

花椒的麻味物质为其所含的8种酰胺，目前在花椒麻味物质总含量的测定主要采用高效液相色谱、气质联用和分光光度法，但均需要提取和分离技术较复杂8种酰胺作标准品，因此该3种方法难以在花椒及其产品的质量检验中广泛使用。本研究建立了花椒麻味物质(酰胺类)总含量的快速检测技术、即甲醛滴定法，与目前国内外的测定方法相比较，本方法所使用的设备易得、检测成本较低廉，操作简单、快捷，且能够准确检测出花椒所含的总酰胺含量。

甲醛法常用于测定铵盐的含氮量，而采用甲醛法滴定花椒总酰胺的原理在于，甲醛与弱酸性酰胺的NH₄ ⁺(Ka＝5.6×10^-10)相作用，生成质子化的六亚甲基四胺和H⁺，即4NH₄ ⁺+6HCHO＝(CH₂)₆N₄H⁺+3H⁺+6H₂O。在反应中4mol NH₄ ⁺生成了4mol的铵盐(CH₂)₆N₄H⁺，而(CH₂)₆N₄H⁺的Ka为7.1×10^-10、酸性得到了强化，故(CH₂)₆N₄H⁺可被NaOH准确滴定。因(CH₂)₆N₄H⁺中的氮与NaOH的化学计量数比为1，即NaOH所滴定出的(CH₂)₆N₄H⁺量与花椒中总酰胺的含量相等。由于所提取的样品中可能含有游离酸和H⁺，在加入甲醛滴定之前应先以甲基红为指示剂，用NaOH将溶液中和至甲基红变为黄色(pH≈6)，然后在提取液中加入甲醛，以酚酞为指示剂后方可用NaOH标准溶液滴定。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种花椒麻味素类物质含量快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)总酰胺浸膏的提取

粉碎待测花椒，提取溶剂用95％乙醇，称取花椒粉末10.00g，放入500ml三角瓶中，提取时间为1～4h，液料比为1∶5～1∶15，提取温度为30～50℃，提取物用布氏漏斗抽滤，旋转蒸发器浓缩，称重所得浸膏留用；

2)酰胺转变为铵态氮

取步骤1)所得浸膏3.00g，加入球型冷凝器的锥形瓶中后用15ml乙醇溶解，再加入20ml的50％浓H2SO4、120℃下用磁力搅拌器搅拌，硝化反应25min，反应完全后加2g颗粒状活性炭，100℃下用球型冷凝器加热回流脱色30min，趁热过滤，滤液用蒸馏水定容至250ml留用；

3)铵态氮含量测定

取步骤2)所得滤液50ml放入250ml锥形瓶，加入2～3滴甲基红指示剂，用1mol/L NaOH溶液滴定至呈现黄色，PHS-3B计酸度测定使pH≈6，以除去滤液中的剩余酸；然后加入10ml的18％(1+1)除酸甲醛，2～3滴酚酞指示剂后充分摇匀，静置5min后用准确标定0.0982mol/L NaOH溶液滴定至橙红色，并保持0.5min内不褪色即为终点，PHS-3B酸度计测定使pH≈9，记录所用0.1mol/L NaOH溶液体积。

2.根据权利要求1所述的花椒麻味素类物质含量快速检测方法，其特征在于，步骤1)中所述提取时间为2.5h，液料比为1∶10，提取温度为50℃。

3.根据权利要求1所述的花椒麻味素类物质含量快速检测方法，其特征在于，花椒麻味素(总酰胺)含量的计算式为Q(mg/g)＝a[(∑V_3i/3)×C×14.0067×b×T₂]/(T₁×T₃)；花椒油中麻味素(总酰胺)含量的计算式为Q′(mg/g)＝a[V_NaOH-i×C×14.0067×b′]/T₄；

式中，V_3i为铵态氮含量测定中消耗的NaOH溶液体积(ml)，C为NaOH溶液的准确标定浓度，T₁为花椒粉末样重(g)，T₂为T₁花椒粉末样所得浸膏重(g)，T₃为酰胺转变为铵态氮时的浸膏重(g)，T₄为验证实验中花椒麻味素粗品用量(g)，V_NaOH-i为验证实验中消耗的NaOH溶液体积(ml)，14.0067为N的分子量，a＝2.2696、为系统误差矫正系数，b＝V₁/V₂，b′＝V₁/V₂′。