CN104280474A - 同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法，先将烟用香精香料用乙醇进行振荡萃取，静置后过0.45μm有机相滤膜，得到待测样品溶液；同时配制4种禁限用添加剂的标准溶液，再采用高效液相色谱荧光检测仪分别对待测样品溶液和标准溶液进行检测分析，然后以外标法进行定量分析，计算出烟用香精香料中4种禁限用添加剂的含量；所述4种禁限用添加剂为芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素。本发明实现了烟用香精香料中4种禁限用添加剂的同时测定。由于使用了酚类专用色谱柱，检测时间更短；采用荧光检测器，选择性也较高，基质干扰较小，检出限更低；且前处理不需要除水，操作更为简单。

Description

同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法

技术领域

本发明涉及烟用香精香料中4种禁限用添加剂的检测方法，具体地指一种同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法。

背景技术

在卷烟中添加香精香料，其作用在于改善卷烟的理化特性、圆润香气、修饰烟香味、改善吸味、确立产品的风格。烟用香精香料是从带香物质中提取或以人工合成方法得到并且用于烟草中的致香物质的总称。通常情况下，烟用香精香料是由多种香料和适量溶剂及其他添加剂按照一定的比例和工艺调配而成。在添加剂中，由于芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素均有致癌作用，因此被禁止或限制使用。

目前，烟草行业分别颁布了β-萘酚、β-细辛醚的检测标准，均采用气相色谱-质谱联用(GC/MS)方法；李晶等利用超高效液相色谱-紫外检测(UPLC-UV)方法测定了香精香料中芝麻酚，而黄樟素的测定方法则主要采用GC/MS。GC/MS测定β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素所需时间较长，UPLC-UV方法专一性较差且易受基质干扰，而液相色谱-荧光检测(HPLC-FD)方法具有检测速度快、灵敏度高、选择性好等优点。由于芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素均具有较强的荧光响应，且采用HPLC-FD法检测烟用香精香料中上述4种禁限用物质的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的就是要克服现有技术所存在的不足，提供一种同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法，旨在为烟用香精香料的质量安全控制提供参考。

为实现上述目的，本发明所提供的同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FD)：先将烟用香精香料用乙醇进行振荡萃取，静置后过0.45μm有机相滤膜，得到待测样品溶液；同时配制4种禁限用添加剂的标准溶液，再采用高效液相色谱荧光检测仪分别对待测样品溶液和标准溶液进行检测分析，然后以外标法进行定量分析，计算出烟用香精香料中4种禁限用添加剂的含量；所述4种禁限用添加剂为芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素；其中，高效液相色谱荧光检测仪的检测条件：

采用色谱柱为Phenomenex Luna C18柱，其规格为150mm×4.6mm i.d.，5μm，柱温为30℃；

采用梯度洗脱，流动相A为水，流动相B为乙腈；以体积百分比计算，梯度洗脱程序如下：0～5min，60％流动相A线性降至5％流动相A，并保持7min；12～14min，5％流动相A线性升至60％流动相A，并保持1min；流速为1mL/min；进样量：20μL；总分析时间为15min；

荧光检测条件：

0.00min，激发波长为280nm，发射波长为340nm；

4.50min，激发波长为331nm，发射波长为353nm；

5.50min，激发波长为265nm，发射波长为365nm；

6.50min，激发波长为288nm，发射波长为325nm；

15.00min，激发波长为280nm，发射波长为340nm。

本发明将烟用香精香料用萃取溶剂进行振荡萃取时，所述萃取溶剂为甲醇、乙醇和乙腈，振荡萃取的速率为200r/min，振荡萃取时间20～30min；优选地，萃取溶剂为乙醇，所述烟用香精香料与萃取溶剂的萃取比例为0.05g/mL，振荡萃取时间20min。

本发明的有益效果在于：本发明由于使用了酚类专用色谱柱，检测时间更短；采用荧光检测器，选择性也较高，基质干扰较小，检出限更低；且前处理不需要除水，操作更为简单。本发明实现了烟用香精香料中芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素的同时测定，灵敏度高，重现性好，可为烟用香精香料添加剂监督检验工作提供方法参考。

附图说明

图1为不同萃取时间下4种目标物的萃取效率的变化曲线图。

图2为4种添加剂标准溶液的液相色谱图。

图3为样品溶液的液相色谱图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明构成限定。

实施例

本实施例所采用的材料、试剂与仪器如下：

甲醇、乙醇、乙腈(色谱纯，德国CNW公司)；芝麻酚(纯度≥98.0％，上海诗丹德生物技术有限公司)；β-萘酚(纯度≥99.0％)、β-细辛醚(纯度≥71.0％；德国Dr.Ehrenstorfer公司；黄樟素(纯度99.4％，美国ChemService公司)。

Dionex P680高效液相色谱仪(配有RF2000荧光检测器，美国Dionex公司)；AL204电子天平(感量：0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q Advantage A10超纯水仪(美国Millipore公司)；HY-5A回旋式振荡器(金坛市城东新瑞仪器厂)；0.45μm有机相滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)。

测定方法如下：

先称取0.5g烟用香精香料样品于50mL锥形瓶中，准确加入10mL乙醇，在振荡器上以200r/min速率振荡萃取20min，静置后过0.45μm有机相滤膜，得到待测样品溶液；同时配制4种禁限用添加剂的标准溶液，再采用高效液相色谱荧光检测仪分别对待测样品溶液和标准溶液进行检测分析，然后以外标法进行定量分析，计算出烟用香精香料中4种禁限用添加剂的含量；其中，高效液相色谱荧光检测仪的检测条件：

采用色谱柱为Phenomenex Luna C18柱，其规格为150mm×4.6mm i.d.，5μm，柱温为30℃；

采用梯度洗脱，流动相A为水，流动相B为乙腈；以体积百分比计算，梯度洗脱程序如下：0～5min，60％流动相A线性降至5％流动相A，并保持7min；12～14min，5％流动相A线性升至60％流动相A，并保持1min；流速为1mL/min；进样量：20μL；总分析时间为15min；

荧光检测条件：

0.00min，激发波长为280nm，发射波长为340nm；

4.50min，激发波长为331nm，发射波长为353nm；

5.50min，激发波长为265nm，发射波长为365nm；

6.50min，激发波长为288nm，发射波长为325nm；

15.00min，激发波长为280nm，发射波长为340nm。

采用本发明的方法检测了湖北省烟草产品质量监督检验站接受的委托检测样留样，19个烟用香精香料样品中均未检出芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素这4种添加剂，如图3所示。说明烟草行业对禁限用添加剂的控制非常严格，4种禁限用添加剂在烟草行业中的使用比较规范。

样品前处理条件的选择及优化

1、萃取溶剂的选择

为选择合适的萃取溶剂，通过在同一样品中加标的方法，选择甲醇、乙醇、乙腈为萃取溶剂进行实验，测定结果如表1所示。

表1 不同萃取溶剂对4种目标物的萃取效率(mg/kg)

溶剂	芝麻酚	β-萘酚	β-细辛醚	黄樟素
					甲醇	4.21	4.16	3.89	3.96
乙醇	4.09	4.16	3.91	3.96
					乙腈	4.17	4.13	3.84	3.94

由表1可看出，甲醇、乙醇和乙腈的萃取效率相当，考虑到甲醇和乙腈的毒性较大，本发明优选乙醇为萃取溶剂。

2、萃取体积的选择

取同一种样品4份，分别加入5，10，15和20mL乙醇进行萃取，并进行HPLC-FD分析。结果发现，选择5mL乙醇时，萃取液必须离心，操作较繁琐，而萃取体积较大时，目标物的信号值较小，易受基线噪声的影响，因此，兼顾样品萃取完全和检测准确度，本发明优选萃取剂体积为10mL。

3、萃取方式的选择

烟用香精香料中添加剂萃取方式较多，本发明在实验中考察了超声和振荡两种方式的萃取效果。结果表明，在25℃下振荡和超声萃取效果相当，考虑到超声萃取的温度不易控制，因此，本发明选择振荡萃取的方式。

4、萃取时间的选择

在其他条件不变的情况下，本发明在实验中考察了振荡时间分别为10、15、20、25和30min时的提取效率，结果如图1所示。随着振荡时间的增加，被检出的添加剂的浓度逐渐增大，当振荡时间达到20min后，继续增加时间提取效率没有明显变化。因此，本发明选择振荡时间为20min。

检测方法的优化

由于芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素的最大激发波长相差较大，因此，采用梯度方法改变最大激发波长和发射波长，在此条件下，标准样品中的4种添加剂响应值较高。实验还考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-乙酸水溶液等不同体系及比例流动相下样品的分离情况，发现当流动相体系选择乙腈-水为体系梯度洗脱时，标准样品及实际样品中4种添加剂的分离效果最佳，标准溶液和典型样品的色谱图分别如图2、3所示，1为芝麻酚，2为β-萘酚，3为β-细辛醚，4为黄樟素。图2中，β-细辛醚由于异构体的存在，图形为双峰。由图2还可以看出，采用荧光检测方法的基质干扰小。

工作曲线及检测限

以乙醇为溶剂，配制4种添加剂浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10μg/mL的系列标准混合溶液，并分别对其进行HPLC-FD分析，采用外标法定量，以各目标物的峰面积(Y)对其相应浓度(X，μg/ml)进行回归分析，得到各目标物的回归方程及相关系数，如表2所示。

表2 4种添加剂的工作曲线及检测限

由表2可知，4种添加剂的标准曲线的线性关系良好，r＝0.9996～0.9998。将最低浓度的标准溶液稀释并进行HPLC-FD分析，以3倍信噪比(S/N)和10S/N确定各目标物的定性检出限(LOD)和定量检出限(LOQ)，则4种添加剂的LOD为0.01～0.09mg/kg，LOQ为0.04～0.29mg/kg。综上可知，在优化的实验条件下4种添加剂得到了良好的分离，方法的灵敏度较高，适合于定量分析。

重复性和回收率

按照低、中、高3个含量水平(0.05、0.2和2μg/mL)分别在样品中加入4种添加剂的标准溶液，每种添加浓度进行6次平行实验，根据分析结果计算方法的加标回收率及其相对标准偏差(RSD)，如表3所示。表3的结果表明，本发明的方法回收率高、重复性好。

表3 方法的回收率及重复性(n＝6)(％)

本发明的方法与现有方法的对比

烟用香精香料中芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素4种禁限用添加剂的检测方法大多是是GC/MS法，与YC/T 361—2010中β-细辛醚、YC/T 376—2010中β-萘酚、文献中芝麻酚以及黄樟素的GC/MS检测相比，本发明的方法的检测时间更短、检出限更低，且前处理不需要除水，操作更为简单。与HPLC-UV法检测香精香料中芝麻酚、β-萘酚和黄樟素的文献及药品中β-细辛醚的HPLC-UV检测方法相比，本发明方法的检出限更低，并且由于使用了酚类专用色谱柱，检测时间更短。

本发明的方法与GC/MS和HPLC-UV方法的结果比较，如表4所示。

表4 本发明的方法与现有方法的结果比较

表4的结果表明，本发明的荧光检测法除灵敏度较高的优点外，选择性也较高，基质干扰较小，并且还实现了4种禁限用添加剂的同时检测。

Claims (3)

1.一种同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法，其特征在于：先将烟用香精香料用萃取溶剂进行振荡萃取，静置后过0.45μm有机相滤膜，得到待测样品溶液；同时配制4种禁限用添加剂的标准溶液，再采用高效液相色谱荧光检测仪分别对待测样品溶液和标准溶液进行检测分析，然后以外标法进行定量分析，计算出烟用香精香料中4种禁限用添加剂的含量；所述4种禁限用添加剂为芝麻酚、β-萘酚、β-细辛醚和黄樟素；其中，高效液相色谱荧光检测仪的检测条件：

采用色谱柱为Phenomenex Luna C18柱，其规格为150mm×4.6mm i.d.，5μm，柱温为30℃；

采用梯度洗脱，流动相A为水，流动相B为乙腈；以体积百分比计算，梯度洗脱程序如下：0～5min，60％流动相A线性降至5％流动相A，并保持7min；12～14min，5％流动相A线性升至60％流动相A，并保持1min；流速为1mL/min；进样量：20μL；总分析时间为15min；

荧光检测条件：

0.00min，激发波长为280nm，发射波长为340nm；

4.50min，激发波长为331nm，发射波长为353nm；

5.50min，激发波长为265nm，发射波长为365nm；

6.50min，激发波长为288nm，发射波长为325nm；

15.00min，激发波长为280nm，发射波长为340nm。

2.根据权利要求1所述的同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法，其特征在于：将烟用香精香料用萃取溶剂进行振荡萃取时，所述萃取溶剂为甲醇、乙醇和乙腈，振荡萃取的速率为200r/min，振荡萃取时间20～30min。

3.根据权利要求1所述的同时测定烟用香精香料中4种禁限用添加剂的高效液相色谱荧光检测法，其特征在于：将烟用香精香料用萃取溶剂进行振荡萃取时，所述萃取溶剂为乙醇，所述烟用香精香料与萃取溶剂的萃取比例为0.05g/mL，振荡萃取的速率为200r/min，振荡萃取时间20min。