CN102939096B - 用于预防和治疗流感病毒疾病的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含流感病毒血凝素部分的多肽，包括能在疫苗中被用作免疫原的这样的多肽的组合物，以及它们在受试者中对多种流感亚型产生免疫应答的应用方法。

Description

用于预防和治疗流感病毒疾病的疫苗
本申请要求2010年2月18日提交的美国临时申请No.61/305,898、2010年5月26日提交的美国非临时申请No.12/788,103、2010年6月11日提交的美国临时申请No.61/354,160、和2010年9月21日提交的美国临时申请No.61/385,083的优先权，其中每一篇的全部内容均结合于本文以供参考。
本发明是在美国政府的支持下在美国国家卫生研究院（NationalInstitutesofHealth：NIH）授予的基金号为U01AI070469-02和1RC1AI086061-01资助下做出的。美国政府在本发明中具有某些权利。
1.引言
本发明提供了包含流感病毒血凝素（influenzavirushemagglutinin）的部分的多肽、包含能够在疫苗中被用作免疫原的这样的多肽的组合物、以及利用它们以在受试者中对多种流感亚型产生免疫应答的方法。
2.背景技术
流感病毒是包膜RNA病毒，其属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）家族（Palese和Shaw(2007)Orthomyxoviridae:TheVirusesandTheirReplication,第5版.Fields'Virology,B.N.Fields、D.M.Knipe和P.M.Howley编著.WoltersKluwerHealth/LippincottWilliams&Wilkins,费城,USA,p1647-1689）。流感病毒的天然的宿主是鸟类，但是流感病毒（包括起源于鸟类的那些）在人类和其他动物宿主中（犬类、猪、马、海洋哺乳动物、和鼬科动物（mustelids））中也能够感染和致病。例如，已经在中国和印尼的猪中已经发现了在亚洲流行的H5N1禽流感病毒，并且也已将其宿主范围延伸至包括猫、豹、和虎，而通常认为这些动物不易感染A型流感（CIDRAP-AvianInfluenza:AgriculturalandWildlifeConsiderations）。在动物中发生流感病毒感染能够潜在地产生人类流行性感冒菌株。
A型和B型流感病毒是主要的人类病原体，其引起呼吸道疾病，严格来讲，其范围从亚临床感染到能够导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床影响随流感病毒株的毒性和宿主的暴露程度、病史、年龄、和免疫状况而有所不同。由于感染率相对较高，因此由季节性流行性感冒引起的累积发病率和死亡率较高。在正常的季节中，流行性感冒能够引起300万-500万严重疾病的病例，并且与全世界200,000到5000,000例死亡相关（世界卫生组织（2009年4月）流感（季节性）FactSheet211）。在美国，估计有10-15%的人口受到流感病毒感染（Glezen和CouchRB(1978)Interpandemicinfluenzainthe休斯顿area,1974-76.NEnglJMed298:587-592;Fox等人.(1982)influenzavirusinfectionsinSeattlefamilies,1975-1979.II.Patternofinfectionininvadedhouseholdsandrelationofageandpriorantibodytooccurrenceofinfectionandrelatedillness.AmJEpidemiol116:228-242），并且每年与大约30,000例死亡相关（ThompsonWW等人.(2003)MortalityAssociatedwithInfluenzaandRespiratorySyncytialVirusintheUnitedStates.JAMA289:179-186;Belshe(2007)Translationalresearchonvaccines:influenzaasanexample.ClinPharmacolTher82:745-749）。
除了每年的流行之外，流感病毒是罕见流感大流行的原因。例如，A型流感病毒能够引起例如在1918年、1957年和1968年发生的那些全球性的流行病。由于缺乏对主要病毒抗原，血凝素（HA），预先形成的免疫性，流行性感冒病毒在一年中就能够侵袭超过50%的人口，并且经常引起比季节性流感病毒更严重的疾病。显而易见的实例是1918年的流感大流行，在这次流行中估计有5千万至1亿人被夺去生命（Johnson和Mueller(2002)UpdatingtheAccounts:GlobalMortalityofthe1918-1920"Spanish"InfluenzaPandemicBulletinoftheHistoryofMedicine76:105-115）。自二十世纪九十年代末期出现高致病性禽流感病毒H5N1以来（Claas等人(1998)HumanInfluenzaAH5N1virusrelatedtoahighlypathogenicavianinfluenzavirus.Lancet351:472-7），人们就开始担心该病毒会变成可在人类之间传播，并引起大规模的流感大流行。
保护不受流感病毒感染的一种有效方式是通过接种疫苗；然而，目前的疫苗接种途径依赖于在流行性菌株与疫苗配方中包括的分离株之间实现良好匹配。由于多种因素的组合，经常很难达到这样的匹配。首先，流感病毒经常地经历变化：每隔3-5年，A型流感病毒的主要菌株就会被经过充分抗原性漂移从而逃避现有的抗体应答的变体取代。因此，每年都必需基于世界卫生组织（WHO）合作中心的密切监督努力来选择疫苗制品中包含的分离株。而且，为了给疫苗制备和分发留出足够的时间，必需在流感季节开始之前约六个月就选择菌株。有时候，疫苗菌株选择委员会的预测不准确，就会导致接种疫苗的功效的大幅下降。
A型流感病毒的新亚型进入人类种群的可能性也对当前的接种疫苗策略提出了重大挑战。因为预测是什么亚型和菌株的流感病毒将引起下一次流感大流行是因此不可能的，菌株-特异性的途径不能用于制备流行性感冒疫苗。
3.发明内容
本发明描述的多肽组合物（“flu多肽”）能够用于受试者（动物受试者，包括人类受试者）以产生与特定亚型的多个流感病毒菌株或来自不同的亚型的菌株交叉反应的免疫应答。尤其是，该flu多肽包含“核心多肽”、或修饰的核心多肽，其中所述核心多肽在氨基酸序列和/或结构中对应于本文中描述的流感血凝素的HA2亚单元的长α螺旋区域。
本发明部分地基于flu多肽的设计，其中flu多肽的设计模拟流感血凝素的HA2亚单元的长α螺旋区域的结构和功能/活性。出人意料的是，利用对应于特定流感亚型的HA2的长α螺旋的flu多肽的免疫作用诱导了与来自多种流感亚型的血凝素交叉反应的血清抗体。本文中描述的数据也证明，用对应于特定流感亚型的HA2的长α螺旋的flu多肽免疫的动物受到保护以免于以不同流感病毒亚型的致死流感病毒激发。因此，本发明提供的flu多肽可用于能够对多个不同的流感株和流感亚型产生免疫应答的免疫原性组合物（例如，疫苗）-换句话说，是“通用的”flu疫苗。
尽管不希望受到任何具体操作的理论的约束，但在不同的流感亚型中HA具有可变性，流感血凝素的HA2亚型的长α螺旋区域含有通过稀有的、交叉反应的抗体识别的（一个或多个）保守抗原表位/区域（例如，单克隆抗体12D1，其对H3流感病毒具有广泛的中和活性）。flu多肽存在于的构建体中的免疫系统中，该构建体被设计为将该抗原表位/区域暴露于适当的构造并且赋予交叉反应性或“通用的”抗原表位/区域增强的免疫原性，并且其能够被用于在受试者中对多种流感亚型产生血清抗体应答，并优选中和应答。
在其他方面中，本发明描述的是编码flu多肽的核酸、病毒和包含（一种或多种）flu多肽的免疫原性组合物和免疫的方法。
3.1术语
当使用涉及氨基酸位置时，术语“大约”或“近似的”是指序列中特定氨基酸位置或在N-末端方向或C-末端方向的该氨基酸位置的五个、四个、三个、两个或一个残基内的任何氨基酸。
如本文中所使用的，当与数字联合使用时，术语“大约”或“近似地”是指所引用数字的1%、5%或10%内的任何数字。
术语“氨基酸”或对于具体氨基酸的任何引用意在包括天然存在的可生成蛋白质的氨基酸和非天然存在的氨基酸，如氨基酸类似物。本领域技术人员将了解，除非另作特定的说明，该定义包括天然存在的可生成蛋白质的(L)-氨基酸、它们的光学(D)-异构体、以化学方法修饰的氨基酸，包括氨基酸类似物如青霉胺（3-巯基-D-缬氨酸）、天然存在的不可生成蛋白质的氨基酸，如正亮氨酸以及具有本领域已知的氨基酸特性的化学合成的氨基酸。另外，术语“氨基酸等价物”是指从天然存在的氨基酸的结构分离的化合物，但是其基本上具有氨基酸的结构，以使得它们在肽内能够被取代，并且即使取代也保留其生物活性。因此，例如，氨基酸等价物可包括具有侧链修饰或取代的氨基酸，并且也包括相关的有机酸、酰胺等等。术语“氨基酸”倾向于包括氨基酸等价物。
术语“氨基酸序列同一性”是指一对比对的氨基酸序列之间的同一性或相似性的程度，通常以百分数表示。如本文中使用的，关于氨基酸序列的术语“百分比同一性”、“百分比同一的”、“%同一性”和“%同一的”是指在比对序列和引入间隙之后，候选序列中的氨基酸残基与肽中相应的氨基酸残基一致（例如，在排列中特定位置上的氨基酸残基是相同残基）的百分数，如必要的话，达到最大的百分比序列同源。如本文中使用的，关于氨基酸序列的术语“百分比相似性”、“百分比相似的”、“%相似性”、和“%相似的”是指在比对序列和引入间隙之后，候选序列中的氨基酸残基与肽中相应氨基酸残基相似的（例如，如下文中讨论的，排列中特定位置上的氨基酸取代是保守取代）百分数，如必要的话，达到最大的百分比序列同源。利用本领域已知的序列比对技术，优选地为此目的设计的计算机运算法则，利用所述计算机运算法则的默认参数或含有它们的软件包，来确定包含序列同一性和相似性的百分数的序列同源。计算机运算法则和包含这样的运算法则的软件包的非限制性的实例包括以下。BLAST家族的程序举例说明了用于两个序列的比较关系的数学运算法则的具体的、无极限的实例（例如，Karlin&Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268(modifiedasinKarlin&Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877),Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410,(describingNBLASTandXBLAST),Altschul等人,1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402(describingGappedBLAST,andPSI-Blast），另一个具体的实例是Myers和Miller（1988CABIOS4:11-17）的运算法则，其包括在ALIGN程序（版本2.0）中，并且可用作部分GCG序列比对软件包。同样，另一个具体实例是FASTA程序（PearsonW.R.和LipmanD.J.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:2444-2448,1988），可用作WisconsinSequenceAnalysisPackage的部分。其他的实例包括BESTFIT，其使用Smith和Waterman（AdvancesinAppliedMathematics,2:482-489,1981）的“局部同源”运算法则以发现两个序列之间的相似性的最佳单一区域，且优选其中被比较的两个序列的长度不同；以及GAP，其依照Neddleman和Wunsch（J.Mol.Biol.48:443-354,1970）的运算法则，通过发现“最大相似性”比对两个序列，并且优选其中两个序列的长度近似相同，且期望在全长上比对。
“保守取代”是指利用同种类型的另一个氨基酸代替一种类型的氨基酸。在特定的实施方式中，保守取代不改变多肽的结构或功能，或两者都不改变。用于保守取代的目的的氨基酸种类包括疏水性氨基酸（Met、Ala、Val、Leu、Ile）、中性亲水的（Cys、Ser、Thr）、酸性氨基酸（Asp、Glu）、碱性氨基酸（Asn、Gln、His、Lys、Arg）、构型干扰物（conformationdisrupters）（Gly、Pro）和芳香氨基酸（Trp、Tyr、Phe）。
如本文中使用的，术语“核心多肽”是指对应于流感血凝素HA2多肽的一个区域的多肽片段，例如，如本文中所称的核心多肽不包含完整的流感血凝素HA2多肽。在一种具体实施方式中，该术语是指对应于流感血凝素HA2多肽的长α螺旋区域的区域的多肽片段。关于核心多肽的实例参考章节5.1.1。
如本文中使用的，术语“片段”是指具体多肽的一部分。在某些实施方式中，多肽片段（例如，核心多肽）的长度是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、40、35、40、45或50个氨基酸。在某些实施方式中，多肽片段（例如，核心多肽）的长度是8至15、8至20、8至25、8至30、8至40、10至15、10至20、10至25、10至30、10至40、10至45、10至50、15至20、15至25、15至30、15至35、15至40、15至45、15至50、25至30、25至40、25至45或25至50个氨基酸。
如本文中使用的，术语“修饰的核心蛋白”是指已经以某种方式修饰，从而延伸或增加核心多肽种体内的半衰期的核心多肽。修饰多肽以便延伸或增加核心多肽的半衰期的技术是本领域技术人员公知的。在某些实施方式中，可通过利用D-氨基酸取代末端L-氨基酸、多肽的聚乙二醇化（pegylation）、多肽C-末端的酰胺化、或通过多肽的N-末端的乙酰化作用来修饰核心多肽。关于修饰的核心多肽的实例参考章节5.1.2。
如本文中使用的，术语“flu多肽”是指包含核心多肽或修饰的核心多肽的多肽。在某些实施方式中，flu多肽由核心多肽组成。在某些实施方式中，flu多肽由修饰的核心多肽组成。在某些实施方式中，flu多肽包含聚乙二醇化的核心多肽。在某些实施方式中，flu多肽在其N-末端和/或C-末端被聚乙二醇化。在某些实施方式中，flu多肽包含在其N-末端和/或C-末端被乙酰化的核心多肽。在某些实施方式中，flu多肽在其N-末端和/或C-末端被乙酰化。在某些实施方式中，flu多肽包含核心多肽或修饰的核心多肽和接头。在某些实施方式中，flu多肽包含连接于载体的核心多肽或修饰的核心多肽。
在某些实施方式中，flu多肽包含一个、两个、三个或更多个核心多肽和/或修饰的核心多肽和以下种的一个、两个、三个或更多或全部：1）一个、两个、或更多个T细胞抗原表位（例如，CD8T细胞抗原表位）；2）一个、两个、或更多个免疫原性多肽；3）促进flu多肽的多聚化的多肽；4）一个、两个、或更多个促进flu多肽的纯化和/或溶解性的蛋白标签；5）一个、两个、或更多个载体；以及6）一个、两个、或更多个接头。
如本文中使用的，术语“有效量”在给予受试者进行治疗的上下文中是指具有预防疾病和/或治疗作用的治疗量。在某些实施方式中，“有效量”在给予受试者治疗的上下中是指足够达到以下效果种的一个、两个、三个、四个、或更多的治疗量：（i）减少或改善流感病毒感染、与之关联的疾病或症状的严重性；（ii）减少流感病毒感染、与之关联的疾病或症状的持续时间；（iii）预防流感病毒感染、与之关联的疾病或症状的的发展；（iv）引起流感病毒感染、与之关联的疾病或症状的消退；（v）预防流感病毒感染、与之关联的疾病或症状的的发展或发作；（vi）预防流感病毒感染、与之关联的疾病或症状的复发；（vii）减少或预防流感病毒从一个细胞到另一个细胞、一个组织到另一个组织、或一个器官到另一个器官的传播；（ix）预防或减少流感病毒从一个受试者到另一个受试者的传播；（x）减少流感病毒感染关联的器官衰退；（xi）减少受试者的住院治疗；（xii）缩短住院治疗的时间；（xiii）增加患有流感病毒感染或与之关联的疾病的受试者的生存；（xiv）消除流感病毒感染或与之关联的疾病；（xv）抑制或减少流感病毒复制；（xvi）抑制或减少宿主细胞的流感病毒的进入；（xviii）抑制或减少流感病毒基因组的复制；（xix）抑制或减少流感病毒蛋白质的合成；（xx）抑制或减少流感病毒颗粒的装配；（xxi）抑制或减少流感病毒颗粒从宿主细胞的释放；（xxii）减少流感病毒滴度；和/或（xxiii）增强或改进另外的治疗的预防疾病的或治疗的作用。
在某些实施方式中，有效量并不会引起流感病毒疾病的完全保护，但与未经治疗的受试者相比，可引起流感病毒较低滴度或数目减少。在某些实施方式中，相对于未经治疗的受试者，有效量可使得流感病毒的滴度为0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、1,000倍或更大的减少。在某些实施方式中，有效量使得相对于未经治疗的受试者近似地1对数或更多、近似地2对数或更多、近似地3对数或更多、近似地4对数或更多、近似地5对数或更多、近似地6对数或更多、近似地7对数或更多、近似地8对数或更多、近似地9对数或更多、近似地10对数或更多、1至3对数、1至5对数、1至8对数、1至9对数、2至10对数、2至5对数、2至7对数、2对数至8对数、2至9对数、2至10对数、3至5对数、3至7对数、3至8对数、3至9对数、4至6对数、4至8对数、4至9对数、5至6对数、5至7对数、5至8对数、5至9对数、6至7对数、6至8对数、6至9对数、7至8对数、7至9对数、或8至9对数流感病毒滴度的减少。流感病毒的滴度、数目或总量减少的益处包括，但不限于，感染的症状较不严重、感染的症状较少和感染相关疾病的持续时间缩短。
如本文中使用的，“血凝素”和“HA”是指本领域技术人员已知的任何血凝素。在某些实施方式中，血凝素是流感血凝素，如A型流感血凝素、B型流感血凝素或C型流感血凝素。目前存在流感病毒的16种血凝素亚型，将其分成两个不同的组：组1和组2。典型的血凝素包括本领域技术人员已知的结构域，包括信号肽（本文中可选的）、母体结构域（stemdomain）、球状头部结构域、内腔结构域（luminaldomain）（本文中可选的）、跨膜结构域（本文中可选的）和细胞质结构域（本文中可选的）。在某些实施方式中，血凝素由单一的多肽链组成，如HA0。在某些实施方式中，血凝素由超过一个多肽链以四价联合（quaternaryassociation）的形式组成，例如，HA1和HA2。本领域技术人员将认识到，可切割不成熟的HA0释放出信号肽（约20个氨基酸），从而产生成熟的血凝素HA0。可在另一个位点切割血凝素HA0可产生HA1多肽（约320个氨基酸，包括球状头部结构域和部分母体结构域）和HA2多肽（约220个氨基酸，包括母体结构域的剩余部分、内腔结构域、跨膜结构域和细胞质结构域）。在某些实施方式中，血凝素包含信号肽、跨膜结构域和细胞质结构域。在某些实施方式中，血凝素缺少信号肽，例如，血凝素是成熟的血凝素。在某些实施方式中，血凝素缺少跨膜结构域或细胞质结构域，或两者都缺少。如本文中使用的，术语“血凝素”和“HA”包含通过遗传翻译后加工修饰的血凝素多肽，如信号肽切割、二硫键形成、糖基化（例如，N-连接的糖基化）、蛋白酶切割和脂质修饰（例如，S-棕榈酰化）。
如本文中使用的，“HA2”是指对应于本领域技术人员已知的流感血凝素多肽的HA2结构域的多肽结构域。在某些实施方式中，HA2由母体结构域、内腔结构域、跨膜结构域和细胞质结构域组成（参见，例如，Scheiffle等人,2007,EMBOJ.16(18):5501-5508，其全部内容结合于本文以供参考）。在某些实施方式中，HA2由母体结构域、内腔结构域和跨膜结构域组成。在某些实施方式中，HA2由母体结构域和内腔结构域组成；在这种实施方式中，HA2是可溶解的。在某些实施方式中，HA2由母体结构域组成；在这样的结构域中，HA2是可溶解的。
如本文中使用的，术语“异源的”在多肽、核酸或病毒的上下文中分别是指通常不能在自然界中发现的，或通常性质上与所关注的多肽、核酸或病毒不相关的多肽、核酸或病毒。例如，“异源多肽”可以是指来源于不同病毒的多肽，例如，不同的流感菌株或亚型、或不相关的病毒或不同物种。
如本文中使用的，术语“结合”在给予受试者两种或更多治疗的上下文中，是指超过一种治疗的应用（例如，超过一种预防疾病的药剂和/或治疗剂）。术语“结合”的应用不限制给予受试者的治疗的顺序。例如，可在给予受试者第二治疗之前（例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之前），伴随地，或随后的（例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之后）给予第一治疗（例如，第一预防疾病的药剂或治疗剂）。
如本文中使用的，术语“感染”意指通过细胞或受试者中的病毒的繁殖和/或存在的入侵。在一种实施方式中，感染是“活性的”感染，例如，在细胞或受试者中复制病毒的感染。这种感染到特征在于通过病毒从最初地由病毒感染的细胞、组织、和/或器官到其他细胞、组织、和/或器官来传播。感染也可以是潜在的感染，例如，不能复制病毒的感染。在某些实施方式中，感染涉及由细胞或受试者中病毒的存在，或通过病毒对细胞或受试者的入侵而产生的病理状态。
如本文中使用的，术语“流感病毒疾病”是指由细胞或受试者中流感（例如，A型或B型流感病毒）病毒存在，或通过流感病毒对细胞或受试者的入侵产生的病理状态。在具体实施方式中，该术语是指由流感病毒引起的呼吸道疾病。
如本文中使用的，短语“IFN缺乏系统”或“IFN-缺乏底物”是指这样的系统，例如，细胞、细胞系和动物，如猪、小鼠、鸡、火鸡、兔、大鼠等，其不能产生的一种或多种类型干扰素（IFN）（例如，INF-γ）或产生低水平的IFN（例如，当与相同的条件下INF-充足的系统相比时，减少5-10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%或更多的IFN表达）、不响应或对一种或多种类型的IFN响应的有效性较差、和/或由一种或多种类型的IFN诱导的一种或多种抗病毒基因的活性不足。
如本文中使用的，数字的术语“对数”是指10的对数。
如本文中使用的，短语“多重感染”或“MOI”是每一个被感染的细胞的有传染性的病毒颗粒的平均数。通过加和的有感染性的病毒颗粒数目（加和的ml×PFU/ml）除以加和的细胞数目（加和的ml×细胞/ml）来确定MOI。
如本文中应用的，术语“核酸”倾向于包括DNA分子（例如，cDNA或染色体组DNA）和RNA分子（例如，mRNA）以及利用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。所述核酸可以是单链的或双链的。如本文中使用的，核酸可包括天然的（例如，A、G、C或T）或修饰的核苷酸碱基（6-二甲胺基嘌呤、5-氟胱氨酸、2-吡啶酮、7-去氮鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷酸，等等）。
“多肽”是指通过如本领域技术人员已知的酰胺键连接的氨基酸的聚合物。多肽可以是由共价的酰胺键连接的5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或更多个氨基酸的聚合物。在某些实施方式中，多肽是由共价的酰胺键连接的10至25、10至30、10至40、10至50或25至50个氨基酸的聚合物。在某些实施方式中，多肽是由共价的酰胺键连接的100至150、100至200、100至250、100至300、100至350、100至400、100至450、100至500、100至550、100至600、100至650、100至700或100至750个氨基酸的聚合物。在某些实施方式中，多肽是由共价的酰胺键连接的50至55、50至60、50至65、50至75、50至80、50至85、50至90、50至95、50至100、75至80、75至85、75至90、75至95、或75至100个氨基酸的聚合物。在某些实施方式中，多肽是由共价的酰胺键连接的55至60、55至65、55至70、55至75、55至80、55至85、55至90、55至95、55至100或60至75个氨基酸的聚合物。如本文中使用的，该术语可包括由共价的酰胺键连接的单一的多肽链。该术语也可包括由非共价的相互作用如离子接触、氢键、范德华力接触（VanderWaalscontacts）和疏水接触关联的多样的多肽链。本领域技术人员将认识到，该术语包括已经例如通过遗传翻译后的加工如信号肽切除、二硫键形成、糖基化（例如，N-连接的糖基化）、蛋白酶切除和脂质修饰（例如，S-棕榈酰化）修饰的多肽。
如本文中使用的，当在从天然来源，例如，细胞获得的多肽（包括抗体）的上下文中使用时，术语“纯化的”和“分离的”是指基本上不含天然来源的污染物的多肽，例如，来自环境的土壤颗粒、矿物、化学制品，和/或来自天然来源的细胞物质，如但不限于细胞碎片、细胞壁、膜、细胞器、核酸团块、碳水化合物、蛋白质、和/或细胞中存在的脂质。因此，分离的多肽包括具有小于约30%、20%、10%、5%、2%、或1%（按干重计算的）细胞物质和/或污染物的多肽的制品。如本文中使用的，当的上下文中使用以化学方法合成多肽（包括抗体）时，术语“纯化的”和“分离的”是指基本上不含涉及多肽的合成的化学前体或其他化学制品的多肽。因此，除了所关注的肽之外，多肽的这种制品具有小于约30%、20%、10%、或5%（按干重计算）化学前体或化合物。在一种具体实施方式中，合成flu多肽是以化学方法的。在另一种具体实施方式中，flu多肽被重组表达。在另一种具体实施方式中，flu多肽被分离。
如本文中使用的，术语“复制”、“病毒的复制”和“病毒复制”在病毒的上下文中是指导致病毒繁殖的病毒的生命周期的一个或多个，或所有的阶段。病毒的生命周期的步骤包括，但不限于，病毒附连到宿主细胞表面、穿过或进入宿主细胞（例如，通过受体介导的内吞作用或膜融合）、去被膜（通过病毒酶或宿主酶清除和降解病毒衣壳的加工，因而释放病毒的染色体组核酸）、基因组复制、病毒信使RNA（mRNA）的合成、病毒蛋白质合成、和与基因组复制的病毒核蛋白复合体的装配、病毒颗粒的装配、病毒蛋白质的遗传翻译后修饰、和通过细胞溶解或出芽从宿主细胞释放和包含内含的病毒糖蛋白类的磷脂包膜的获得。在某些实施方式中，术语“复制”、“病毒的复制”和“病毒复制”是指病毒基因组的复制。在其他实施例中，术语“复制”、“病毒的复制”和“病毒复制”是指病毒蛋白质的合成。在其他实施方式中，术语“复制”、“病毒的复制”和“病毒复制”是指新的病毒颗粒的合成。
如本文中使用的，可互换地使用的术语“受试者”或“患者”是指动物（例如，鸟、爬行动物、和哺乳动物）。在具体实施方式中，受试者是鸟。在另一种实施方式中，受试者是哺乳动物，其包括非灵长类动物（例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠、和小鼠）和灵长类动物（例如，猴、黑猩猩、和人）。在某些实施方式中，受试者是非人类动物。在某些实施方式中，受试者是农场动物或宠物（例如，狗、猫、马、山羊、绵羊、猪、驴、或鸡）。在另一种实施方式中，受试者是人。在另一种实施方式中，受试者是人类婴儿。在另一种实施方式中，受试者是人类儿童。在另一种实施方式中，受试者是人类成年人。在另一种实施方式中，受试者是老年人。在另一种实施方式中，受试者是未成熟的人类婴儿。
如本文中使用的，术语“未成熟的人类婴儿”是指少于37周妊娠年龄出生的人类婴儿。
如本文中使用的，术语“人类婴儿”是指新出生到1岁的人。
如本文中使用的，术语“人类初学走路的孩子”是指1岁到3岁的人。
如本文中使用的，术语“人类儿童”是指1岁至18岁的人。
如本文中使用的，术语“人类成人”是指18岁或年龄更大的人。
如本文中使用的，术语“老年人”是指65岁或年龄更大的人。
术语“三级结构”和“四级结构”具有本领域技术人员理解的含义。三级结构是指单一的多肽链的三维结构。四级结构是指具有多样的多肽链的多肽的三维结构。
如本文中使用的，术语“疗法”和“治疗”可包括可用于预防或治疗病毒感染或与之关联的疾病或症状的任何治疗方案、方法、化合物、组合物、配方、和/或试剂。在某些实施方式中，术语“疗法”和“治疗”涉及生物治疗、支持性治疗（supportivetherapy）、和/或在本领域技术人员已知的病毒感染或与之关联的疾病或症状的治疗或预防中有用的其他疗法。在某些实施方式中，术语“治疗”涉及编码flu多肽的核酸、或载体、或包括编码flu多肽的所述核酸的组合物。在某些实施方式中，术语“治疗”是指特异性地结合flu多肽的抗体。
如本文中使用的，在给予受试者治疗（疗法）以便防止流感病毒疾病的上下文中，术语“防止”、“预防”和“预防法”是指由治疗或疗法的结合的给予产生的以下效果种的一个或多个：（i）抑制流感病毒疾病或它的症状的发展或发作；（ii）抑制流感病毒疾病或与之关联的症状的复发；和（iii）减少或抑制流感病毒感染和/或复制。
如本文中使用的，在给予受试者治疗以便防止流感病毒感染的上下文中，术语“防止”、“预防”和“预防法”涉及抑制或减少流感病毒感染关联的一个或更多症状的发作或发展。
如本文中使用的，在给予受试者治疗（疗法）以便处理流感病毒疾病的上下文中，术语“治疗”、“对待”和“处理”是指获得治疗或疗法的结合的有益的或治疗的作用。在具体实施方式中，这样的术语涉及由给予治疗或疗法的结合产生下列作用种的一个、两个、三个、四个、五个或更多个：（i）减少或改善流感病毒感染或与之关联的疾病或症状的严重性；（ii）减少流感病毒感染、与之关联的疾病或症状的持续时间；（iii）消退流感病毒感染、与之关联的疾病或症状；（iv）减少流感病毒的滴度；（v）减少流感病毒感染、与之关联的疾病关联的器官衰退；（vi）减少受试者的住院治疗；（vii）缩短住院治疗的时间；（viii）增加受试者的生存；（ix）消除流感病毒感染或与之关联的疾病或症状；（x）抑制流感病毒感染、或与之关联的疾病或症状的的发展；（xi）预防流感病毒从细胞、组织、器官、或受试者到另一个细胞、组织、器官或受试者的传播；（xii）抑制或减少宿主细胞流感病毒的进入；（xiii）抑制或减少流感病毒基因组的复制；（xiv）抑制或减少流感病毒蛋白质的合成；（xv）抑制或减少流感病毒颗粒从宿主细胞的释放；和/或（xvi）增强或改善另一治疗的治疗作用。
如本文中使用的，在给予受试者治疗以便治疗流感病毒感染的背景中，术语“治疗”、“对待”和“处理”是指：（i）减少流感病毒复制；（ii）减少流感病毒滴度；（iii）减少流感病毒从一个细胞、器官或组织到另一个细胞、器官或组织的传播；（iv）减少流感病毒感染关联的症状的严重性和/或数目；（v）减少流感病毒感染关联的症状的持续时间；和/或（vi）抑制或减少流感病毒感染的发展。
如本文中使用的，在某些实施方式中，短语“野生型”在病毒的上下文中是指普遍的、自然地流通的和产生典型的疾病的爆发的病毒的类型。在其他实施方式中，术语“野生型”在病毒的上下文中是指亲代病毒。
附图说明
图1：MAb12D1通过免疫印记与截短的血凝素结构物反应。12D1主要与氨基酸30至106的区域中的HA2亚单元接触（H3编号方式（参见，例如，Wilson等人,Nature1981;289(5796):366-73)））。在HA276-184和HA291-184截短中减少的12D1结合而没有减少的GFP表达，连同与HA2106-184截短的结合的损失一起表明，结合抗原表位位于氨基酸HA276-106的区域中。这30个氨基酸属于HA2的长α-螺旋的远末端部分。
图2：单克隆抗体（mAb）12D1与HA2的长α-螺旋反应。利用mAb12D1孵育GFP或GFPHA76-130转染的293T细胞的裂解液，并利用蛋白质G珠拉下。利用mAb12D1或兔抗GFP对拉下的部分做图。抗-鼠HRP用于探测与拉下的部分（A）内鼠Ig重链和轻链结合反应的12D1。通过直接结合ELISA证实HApep-KLH结合物内12D1抗原表位的结构完整性。MAb36A7结合HA2（B）的76-130区域的外部。
图3：Flu多肽（76-130）-KLH（“HApep-KLH”）起到强效免疫原并且由HApep-KLH引出的血清抗体与多种血凝素亚型起反应的作用。首次和二次免疫作用后10天采取单独的小鼠的血清，并通过ELISA检验对H3或H1HA的结合（A）。利用纯化的H3或H1亚型流感病毒或利用新城疫病毒（Newcastlediseasevirus）（NDV），通过免疫印记检验利用HApep-KLH二次免疫作用后采取的聚集的血清的反应性（B）。通过ELISA检验聚集的血清对H2、H5或H7HA的结合活性（C）。核心蛋白（76-130）的百分比同一性/相似性在流感亚型之间（D）。
图4：利用flu多肽（76-130）-KLH（“HApep-KLH”）的免疫作用使小鼠免于致命的激发。以H3N2病毒的致死剂量感染的小鼠的平均体重变化（A）。利用HApep-KLH的接种疫苗使H3N2-感染的小鼠免于死亡（B）。HApep-KLH疫苗使80%的小鼠免于H1N1病毒的致死剂量（C）。抗-H1滴度与PR8激发之后的体重损失相关（D）。
图5：利用来自亚型H1、H2、H3、H5和H7的选择性的菌株在各种A型流感病毒亚型之间进行序列比对（A）。序列比对显示不同的亚型之间的保守的氨基酸（B）。
图6：在各种A型流感病毒亚型的菌株之间进行序列比对，包括H1N1(A)(SEQIDNOS:8-11)、H2N2(B)(SEQIDNOS:13和14)、H3N2(C)(SEQIDNOS:16和18)、H5N1(D)(SEQIDNO:22)、H7(E)(SEQIDNOS:31-35)、H4(F)(SEQIDNOS:20和21)、H6(G)(SEQIDNOS:24-29)、H8(H)SEQIDNOS:37和38)、H9(I)(SEQIDNOS:40和41)、H10(J)(SEQIDNOS:43和44)、H11(K)(SEQIDNOS:46和47)、H12(L)(SEQIDNOS:49和50)、H13(M)(SEQIDSNO:52-54)、H14(N)(SEQIDNO:55)、H15(O)(SEQIDNO:56)、和H16(P)(SEQIDNO:57)。
图7：单克隆抗体12D1与HA2的长α-螺旋反应。（A）血凝素单体。HA2的氨基酸76-130。（B）利用mAb12D1孵育来自pCAGGs-GFP或pCAGGs-GFPHA276-130转染的293T细胞的裂解液，且利用蛋白质G珠拉下。利用mAb12D1或兔抗-GFP印记拉下的部分。箭头指示76-130GFP融合蛋白的位置。抗-鼠HRP用于检测与拉下的部分内的鼠Ig重链和轻链结合的12D1。（C）通过直接的结合ELISA证实LAH-KLH结合物内的12D1抗原表位的结构完整性。血凝素特定的mAb36A7不在HA2的76-130区域内结合。
图8：LAH-KLH疫苗起到强力免疫原和引出的血清抗体与多种血凝素亚型反应的作用。（A,B）从首次和二次免疫作用后10天单独的小鼠采取血清，且通过ELISA检验对H3或H1血凝素的结合。（C）利用纯化的A/香港/1/1968（H3）或A/USSR/90/1977（H1）亚型流感病毒、纯化的A/加利福尼亚/04/09血凝素（缺少跨膜结构域）、或利用新城疫病毒，通过免疫印记检验从利用LAH-KLH二次免疫作用后采取的20只小鼠聚集的血清的反应性。（D）通过ELISA检验聚集的血清对H2、H5、或H7HA的结合活性。LAH-KLH抗-血清对所有的3HA亚型具有相当大的结合活性。使用的阳性血清来自组1流感病毒（关于H2和H5ELISAs）或组2病毒（关于H7ELISA）感染的小鼠（参考Steel(2010)mBio1(1):1-9）。（E）LAH氨基酸76-130来自不同的血凝素亚型的HA2。黑色加亮区/白色字母：所有的5HAs中的保守的残基。保守的残基属于四个组之一：1)D/N/E/Q2)I/L/V/M3)K/R4)S/T。灰色加亮区/白色字母：较少严格保守的4/5HAsOR中保守的残基（RvsH接近中间的保守电荷但是改变大小）。粗体原文，白色背景：较少严格的部分的保守（3/5）OR（LvsA在中间，或FvsM朝向左边）。（F）来自正常的小鼠、A/香港/1/1968(H3)感染的小鼠、或利用LAH-KLH免疫的小鼠，血清集合中的血凝素特定的抗体的统计数字的象征性图表。A/香港/1/1968的重组血凝素用于涂覆ELISA板。
图9：利用LAH-KLH的免疫作用体内保护小鼠。（A,B）在二次免疫作用之后两周，利用4×105pfu的X31，小鼠适合的H3流感病毒，激发小鼠，（C,D）500pfu的小鼠适合的H1病毒PR8，或（E,F）利用修饰以便清除病毒血凝素中的多碱基断裂位点的500pfuH5高致病性禽流感病毒（HAlo病毒）（参见SteelJ,等人(2009)JVirol83(4):1742-1753）。每一个实验组包括5只BALB/c小鼠。因为病原性的差异，以关于X31（H3）和PR8（H1）病毒的20%体重损失、VN/2004病毒（H5）的30%体重损失，来定义生存。
图10：抗体调节由利用LAH-KLH的免疫作用提供的保护。（A）PR8感染的小鼠的预激发血清的分析显示，血凝素-特定的抗体滴度和在感染后1-3天体重的增加之间的正相关关系。（B,C）将来自利用LAH-KLH免疫的小鼠、利用H1或H3病毒感染的小鼠、或来自利用单独的KLH免疫的小鼠的聚集的血清转移到在A/Georgia/81、季节性的人类H3病毒、或H1病毒PR8感染之前两小时的小鼠中。在感染后2天评价肺滴度。（D,E）评价利用TIV免疫作用之前或之后采取的人类血清与LAH多肽的结合活性。示出的数据来自以1:3000稀释的血清样品。（D）受试者对季节性接种疫苗做出的反复不定地响应和（E）血清证明对LAH肽的最小的结合活性。
图11：LAH-KLH抗血清与组1和组2血凝素蛋白反应，而HA2抗血清只与组2血凝素蛋白质反应。（A、B和C）对组2血凝素蛋白质的抗血清的活性。HA2和LAH-KLH血清集合证明对HK/68H3血凝素可比较的结合活性，但是对其他组2血凝素具有不同的结合活性。（D、E、F、G、和H）抗血清对组1红血球蛋白质的活性。LAH-KLH血清集合与检验的所有的组1血凝素蛋白质反应，而HA2抗血清不反应。阳性对照血清来自组2H3亚型X31病毒或组1H1亚型PR8病毒感染的小鼠。
5.具体实施方式
5.1flu多肽
本发明提供了flu多肽。尽管不希望受到任何具体的操作理论的约束，但应该认为，flu多肽可用于使HA2血凝素亚单位（例如，HA2血凝素亚单位长的α-螺旋）的一个或更多有关地保守的抗原区域存在于受试者的免疫系统中，以产生能够与来自单一的亚型或2、3、4或更多种不同亚型的流感病毒菌株交叉反应的免疫应答，并且优选地使受试者免于来自单一的亚型或2、3、4或更多种不同亚型的流感病毒菌株。
在某些实施方式中，flu多肽包括核心多肽或修饰的核心多肽。
在某些实施方式中，flu多肽在其N-末端和/或C-末端被乙酰化。在某些实施方式中，flu多肽被聚乙二醇化。
在某些实施方式中，flu多肽包含一个、两个、三个或更多个核心多肽和/或修饰的多肽。
在某些实施方式中，flu多肽包含一个、两个、三个或更多个核心多肽或修饰的多肽和一个、两个、三个或更多个T细胞抗原表位。
在某些实施方式中，flu多肽包含一个、两个、三个或更多个核心多肽或修饰的多肽和一个、两个、三个或更多个免疫原性多肽。
在某些实施方式中，flu多肽包含一个、两个、三个或更多个核心多肽或修饰的多肽和促进多聚化的多肽（例如，flu多肽的三聚作用）。
在某些实施方式中，flu多肽包括一个、两个、三个或更多个核心多肽或修饰的核心多肽和下列中的一个、两个、三个或更多、或全部：1）一个、两个、三个或更多个载体；2）一个、两个、三个或更多个T细胞抗原表位（例如，CD8T细胞抗原表位）；3）一个、两个、三个或更多个免疫原性多肽（例如，沙门氏菌鞭毛蛋白（Salmonellaflagellin），参见章节5.1.6）；4）一个、两个、三个或更多个蛋白标签（例如，His-或FLAG-标签，参见章节5.1.3）；5）促进flu多肽多聚化的一个或多个多肽（例如，T4折叠子结构域，参见章节5.1.8）。
在某些实施方式中，flu多肽包含连接于接头多肽的核心多肽或修饰的核心多肽。在某些实施方式中，flu多肽包含连接于载体蛋白的核心多肽或修饰的核心多肽。
5.1.1核心多肽
在某些实施方式中，flu多肽包含核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽包含HA2血凝素亚单位的长α-螺旋的一个或更多个相对保守的抗原区域。在一种具体实施方式中，核心多肽能够在受试者中产生免疫应答，即能够与来自单一的亚型的多个流感病毒株、或来自2、3、4或更多种亚型的病毒株交叉反应，并且优选地使受试者免于来自单一亚型的多个流感病毒株、或来自2、3、4或更多种亚型的病毒株。可利用本领域技术人员已知的和本文中描述（参见下文章节5.13和6）的方法来评价核心多肽在受实验者中产生免疫应答的能力，即能够与来自单一亚型的多个流感病毒株、或来自2、3、4或更多种亚型的病毒株交叉反应，并且优选使受试者免于感染来自单一亚型的多个流感病毒株、或来自2、3、4或更多种亚型的病毒株。在另一个具体实施方式中，核心多肽能够在受试者中产生免疫应答，即能够中和来自单一亚型的多个流感病毒株、或来自2、3、4或更多种亚型的病毒株。可利用本领域技术人员已知的和本文中描述（参见下文章节5.13和6）的方法来评价核心多肽产生免疫应答的能力，即能够中和来自单一亚型的多个流感病毒菌株、或来自2、3、4或更多种亚型的菌株。在另一种具体实施方式中，核心多肽能够在受试者中产生免疫应答，即能够抑制或减少来自单一亚型的多个流感病毒菌株、或来自2、3、4或更多种亚型的菌株的复制。可利用本领域技术人员已知的和本文中描述（参见下文章节5.13和6）的方法来评价核心多肽产生免疫应答的能力，即能够抑制或减少来自单一亚型的多个流感病毒菌株、或来自2、3、4或更多种亚型的菌株的复制。
在一种具体实施方式中，核心多肽包含流感病毒的HA2血凝素亚单位的长α-螺旋。在一种具体实施方式中，核心多肽包含流感病毒的HA2血凝素亚单位的部分长α-螺旋。在一种具体实施方式中，核心多肽包含HA2的部分长α-螺旋，其中保持部分的天然构造。在一种具体实施方式中，核心多肽包含HA2的长α-螺旋的部分，其中部分保持天然的α-螺旋结构。本领域技术人员能够利用本领域已知的任何方法来确定是否保持α-螺旋结构，例如，NMR、X-射线晶体学方法、或二级结构预测方法，如圆二向色性。
在具体实施方式中，核心多肽不包含全长流感病毒血凝素的氨基酸序列。在某些实施方式中，核心多肽包含或由25至50、50至55、50至60、50至65、50至70、50至75、50至80、50至85、50至90、50至95、50至100、100至150、100至200、或100至250个氨基酸组成。在其他实施方式中，核心多肽包含或由50至55、50至60、50至65、50至75、50至80、50至85、50至90、50至95、50至100、75至80、75至85、75至90、75至95、或75至100个氨基酸组成。
在具体实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸1(±5)至184(±5)、16(±5)至184(±5)、30(±5)至184(±5)、31(±5)至184(±5)、46(±5)至184(±5)、61(±5)至184(±5)、70(±5)至110(±5)、76(±5)至106(±5)、76(±5)至130(±5)或76(±5)至184(±5)的组成。在某些实施方式中，核心多肽包括或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸1(±5)至184(±5)、16(±5)至184(±5)、30(±5)至184(±5)、31(±5)至184(±5)、46(±5)至184(±5)、61(±5)至184(±5)、70(±5)至184(±5)、(70(±5)至110(±5)、76(±5)至106(±5)、76(±5)至130(±5)或76(±5)至184(±5)组成，其中核心多肽的长度小于300、275、250、200、190、185、或180个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽包含或由依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸76至106组成。
在另一种具体实施方式中，核心多肽包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸76至130。在某些实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸76至130组成，其中核心多肽的长度小于300、275、250、200、190、185、180、175、150、145、130、130、125、100或75个氨基酸。在另一种具体实施方式中，核心多肽由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸76至130组成。
在一种具体实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至125(±5)、80(±5)至115(±5)、90(±5)至105(±5)、或76(±5)至95(±5)组成。在某些实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至125(±5)、80(±5)至115(±5)、90(±5)至105(±5)、或76(±5)至95(±5)组成，其中核心多肽的长度小于300、275、250、200、190、185、180、175、150、145、130、130、125、100或75个氨基酸。
在一种具体实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至130(±5)、70(±5)至120(±5)、70(±5)至110(±5)、70(±5)至100(±5)、或70(±5)至95(±5)组成。在某些实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至130(±5)、70(±5)至120(±5)、70(±5)至110(±5)、70(±5)至100(±5)、或70(±5)至95(±5)组成，其中核心多肽的长度小于300、275、250、200、190、185、180、175、150、145、130、130、125、100、或75个氨基酸。
在一种具体实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至130(±5)、80(±5)至130(±5)、90(±5)至130(±5)、100(±5)至130(±5)、或110(±5)至130(±5)组成。在某些实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至130(±5)、80(±5)至130(±5)、90(±5)至130(±5)、100(±5)至130(±5)、或110(±5)至130(±5)组成，其中核心多肽的长度小于300、275、250、200、190、185、180、175、150、145、130、130、125、100、或75个氨基酸。
在一种具体实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸1-184、10(±5)至184、20(±5)至184、30(±5)至184、40(±5)至184、50(±5)至184、60(±5)至184、70(±5)至184或80(±5)至184组成。在某些实施方式中，核心多肽包含或由按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸1-184、10(±5)至184、20(±5)至184、30(±5)至184、40(±5)至184、50(±5)至184、60(±5)至184、70(±5)至184或80(±5)至184组成，其中核心多肽的长度小于300、275、250、200、190、185、180、175、150、145、130、130、125、100、或75个氨基酸。
在具体实施方式中，核心多肽包含或由流感病毒菌株A/香港/1/1968(H3)的HA2血凝素亚单位的长α-螺旋或其片段组成（例如，按照标准的H3亚型编号系统编号的氨基酸76-130或其片段），例如，核心多肽包含或由以下氨基酸序列：RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENA(SEQIDNO:2)或其片段组成。在某些实施方式中，核心多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:2，其包含至少56个氨基酸或更多。可在N-末端、C-末端，或两者上修饰与SEQIDNO:2一致的核心多肽。在某些实施方式中，在N-末端修饰核心多肽。在某些实施方式中，在C-末端修饰核心多肽。在一种具体实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在另一种具体实施方式中，在C-末端处将核心多肽连接于接头，如FLAG-标签。在另一种具体实施方式中，将核心多肽的C-末端连接于接头，例如，FLAG-标签，以及能够用于例如将核心多肽偶合/连接于载体（例如，KLH）的半胱氨酸残基。
在一种具体实施方式中，核心多肽包含或由流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的血凝素亚单位的区域，或对应于按照标准的H3亚型编号系统编号的氨基酸79-134或其片段的其片段组成（例如，核心多肽包含或由下列氨基酸序列：LEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMG或其片段组成）。
在一种具体实施方式中，将核心多肽连接于FLAG-标签和C-末端半胱氨酸残基上，且具有FLAG-标签和半胱氨酸残基的这样的多肽包含或由下列氨基酸序列组成：RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENADYKDDDDKC(SEQIDNO:1)。在某些实施方式中，这样的多肽在N-末端被乙酰化。
在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少50%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少60%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少65%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少70%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少75%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少80%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少85%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少90%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少95%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少98%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少99%的氨基酸序列同一性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。
在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少50%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少60%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少65%的氨基酸序列相似性，且保持，依照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少70%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少75%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少80%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少85%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少90%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少95%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有的构造。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少98%的氨基酸序列相似性，且保持按照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有的构造。在某些实施方式中，核心多肽与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列共有至少99%的氨基酸序列相似性，且保持，依照标准的H3亚型编号系统编号的，流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的氨基酸76-130的原有结构。
在具体实施方式中，核心多肽不包含流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的HA2血凝素亚单位的长α-螺旋（例如，依照标准的H3亚型编号系统编号的，氨基酸76-130），例如，核心多肽不包括下列氨基酸序列：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENA(SEQIDNO:2)。
在某些实施方式中，不将核心多肽连接于可用于，例如，偶合/连接核心多肽和载体（例如，KLH）的FLAG-标签和C-末端半胱氨酸残基。在某些实施方式中，本文中描述的核心多肽不包含以下氨基酸序列：RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENADYKDDDDKC(SEQIDNO:1)，其中由氨基酸序列DYKDDDDK代表FLAG-标签。在某些实施方式中，核心多肽未在N-末端被乙酰化。
在具体实施方式中，核心多肽不包括依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至125(±5)。在具体实施方式中，核心多肽不包括按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸80(±5)至115(±5)。在具体实施方式中，核心多肽不包括按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸90(±5)至105(±5)。在具体实施方式中，核心多肽不包括按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸76(±5)至95(±5)。
在一种具体实施方式中，核心多肽不包按依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至130(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包按依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至120(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包按依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至110(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包按依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至100(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包按依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至95(±5)。
在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至130(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸80(±5)至130(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸90(±5)至130(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸100(±5)至130(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸110(±5)至130(±5)。
在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸1-184。在具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸10(±5)至184。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸20(±5)至184。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸30(±5)至184。在具体实施方式中，核心多肽不包括依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸40(±5)至184。在具体实施方式中，核心多肽不包括依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸50(±5)至184。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸60(±5)至184。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至184。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸80(±5)至184。
在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸1(±5)至184(±5)。在具体实施方式中，核心多肽不包括依照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸16(±5)至184(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸30(±5)至184(±5)。在具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸31(±5)至184(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸46(±5)至184(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸61(±5)至184(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸70(±5)至184(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸76(±5)至106(±5)。在一种具体实施方式中，核心多肽不包含按照标准的H3亚型编号系统编号的血凝素多肽的氨基酸76(±5)至184(±5)。
在一种具体实施方式中，核心多肽是普通的核心多肽，其包含以下氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10DX11X12X13X14X15WX16YX17AELLVX18X19ENX20X21TX22DX23X24DSX25X26X27X28LX29X30X31X32X33X34QLX35X36NX37(SEQIDNO:3)，
其中X1是亲水的氨基酸；X2是疏水的氨基酸；X3是亲水的氨基酸；X4是亲水的氨基酸；X5是疏水的氨基酸；X6是N、E或I；X7是亲水的氨基酸；X8是K、R、Y或W；X9是M、V或T；X10是亲水的残基；X11是A、G、T或S；X12是F、I、K、L或M；X13是L、I或T；X14是亲水的、碱性氨基酸；X15是疏水的氨基酸；X16是亲水的氨基酸；氨基酸X17是亲水的氨基酸；X18是疏水的氨基酸；X19是疏水的氨基酸；X20是亲水的氨基酸；X21是亲水的、碱性氨基酸；X22是疏水的氨基酸；X23是疏水的氨基酸；X24是H、T或A；X25是亲水的氨基酸；X26是疏水的氨基酸；X27是亲水的氨基酸；X28是亲水的氨基酸；X29是疏水的氨基酸；X30是亲水的、碱性氨基酸；X31是亲水的、碱性氨基酸；X32是T或V；X33是亲水的、碱性氨基酸；X34是K、L、M、S或R；X35是亲水的、碱性氨基酸；X36是亲水的氨基酸和X37是疏水的氨基酸。
在具体实施方式中，X1是R或Q；X2是L、M或I；X3是E、D、Q或G；X4是D或N；X5是L、M或V；X6是N、E或I；X7是K或N；X8是K、R、Y或W；X9是M、V或T；X10是E、D、K或R；X11是A、G、T或S；X12是F、I、K、L或M；X13是L、I或T；X14是D或E；X15是V、I或L；X16是S或T；X17是N或Q；X18是A或L；X19是L或M；X20是E或Q；X21是R或H；X22是L或I；X23是F、V、M、Y或L；X24是H、T或A；X25是N或E；X26是V或M；X27是K、N、R或S；X28是K或N；X29是Y或F；X30是D或E；X31是K或R；X32是T或V；X33是K或R；X34是K、L、M、S或R；X35是K或R；X36是D、N、Q或E和X37是A或V。在某些实施方式中，核心多肽在其N-末端被乙酰化。
在某些实施方式中，核心多肽是普通的核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是普通的核心多肽的片段，其中该片段缺少来自普通的核心多肽的N-末端或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是普通的核心多肽的片段，其中该片段缺少来自它的C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是普通的核心多肽的片段，其中该片段缺少来自普通的核心多肽的N-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)或25(±5)个氨基酸和缺少来自普通的核心多肽的C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)或25(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的普通的核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的普通的核心多肽。
在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的普通的核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的普通的核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是普通的核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的普通的核心多肽，其中所述氨基酸连接到普通的核心多肽的N-末端或C-末端上，并且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是普通的核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有连接到普通的核心多肽的N-末端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸和连接到普通的核心多肽的C-末端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的普通的核心多肽，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是共有核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RIENLNKKX1EDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDX2HDSNVKNLYEKVRX3QLRX4NA(SEQIDNO:4)
其中X1是M、V、T；X2是疏水的氨基酸；X3是L、M、S、K、R；和X4是亲水的氨基酸。在一种具体实施方式中，X1是M、V、T；X2是F、Y或L；X3是L、M、S、K、R；和X4是D、N或E。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。
在某些实施方式中，核心多肽是共有核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是共有核心多肽的片段，其中片段缺少来自共有核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是共有核心多肽的片段，其中该片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是共有核心多肽的片段，其中该片段缺少来自共有核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5个或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的共有核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸的共有核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的共有核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的共有核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是共有核心多肽的衍生物，其中该衍生物包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的共有核心多肽，其中所述氨基酸连接于共有核心多肽的N-末端或C-末端，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是共有核心多肽的衍生物，其中该衍生物包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的共有核心多肽，其中所述氨基酸连接于共有核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是组1的核心多肽，其包含或由以下氨基酸序列组成：
RX1ENLNKKX2X3DGFLDX4WTYNAELLVLX5ENERTLDX6HDSNVKNLYX7KVRX8QLX9X10NX11(SEQIDNO:5)，
其中X1是疏水氨基酸；X2是疏水氨基酸；X3是亲水的氨基酸；X4是疏水氨基酸；X5是疏水氨基酸；X6是疏水氨基酸；X7是亲水的、碱性氨基酸；X8是L、M或S；X9是亲水的、碱性氨基酸；X10是亲水的氨基酸和X11是疏水氨基酸。在具体实施方式中，X1是L或I；X2是M或V；X3是E或D；X4是V或I；X5是M或L；X6是F或Y；X7是D或E；X8是L、M或S；X9是R或K；X10是D或N和X11是A或V。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能够用于对组1血凝素亚型的诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和2种或更多种流感病毒组1血凝素亚型。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。
在某些实施方式中，核心多肽是组1核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是组1核心多肽的片段，其中该片段缺少来自组1核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是组1核心多肽的片段，其中该片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是组1核心多肽的片段，其中该片段缺少来自组1核心多肽的N-和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的组1核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或0至25个氨基酸之间的组1核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的组1核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的组1核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是组1核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的组1核心多肽，其中所述氨基酸连接于组1核心多肽的N-末端或C-末端，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是组1核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的组1核心多肽，其中所述氨基酸连接到组1核心多肽的N-末端和C-末端，并且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是组2核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
X1IX2X3X4X5X6X7X8X9DX10X11X12X13X14WSYNAELLVAX15ENQHTIDLX16DSEMNKLX17EX18X19X20RQLRENA(SEQIDNO:6)，
其中X1是亲水的氨基酸；X2是亲水的氨基酸；X3是亲水的氨基酸；X4是疏水的氨基酸；X5是E或I；X6是亲水的氨基酸；X7是疏水的氨基酸；X8是V或T；X9是亲水的氨基酸；X10是亲水的氨基酸；X11是K或M；X12是I或T；X13是亲水的、碱性氨基酸；X14是疏水的氨基酸；X15是疏水的氨基酸；X16是T或A；X17是疏水的氨基酸；X18是亲水的、碱性氨基酸；X19是T或V，和X20是亲水的、碱性氨基酸。在具体实施方式中，X1是R或Q；X2是Q或G；X3是D或N；X4是L或V；X5是E或I；X6是K或N；X7是Y或W；X8是V或T；X9是E或R；X10是T或S；X11是K或M；X12是I或T；X13是D或E；X14是L或V；X15是L或M；X16是T或A；X17是F或Y；X18是K或R；X19是T或V和X20是K或R。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能用于对组2血凝素亚型诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和2种或更多种流感病毒组2血凝素亚型。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。
在某些实施方式中，核心多肽是组2核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是组2核心多肽的片段，其中该片段缺少来自组2核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是组2核心多肽的片段，其中该片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是组2核心多肽的片段，其中该片段缺少来自组2核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的组2核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至511、51至500、51至450、51至400、51至350、51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的组2核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的组2核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的组2核心多肽。
在具体实施方式中，核心多肽是组2核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的组2核心多肽，其中所述氨基酸连接到组2核心多肽的N-或C-末端上，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是组2核心多肽的衍生物，其中衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的组2核心多肽，其中所述氨基酸连接到组2核心多肽的N-和C-末端上，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H1核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RX1ENLNKKVDDGFX2DIWTYNAELLVLLENERTLDX3HDSNVX4NLYEKVX5SQLKNNA(SEQIDNO:7)，
其中X1是疏水的氨基酸；X2是疏水的氨基酸；X3是疏水的氨基酸；X4是亲水的、碱性氨基酸、和X5是亲水的、碱性氨基酸。在具体实施方式中，X1是M或I；X2是L或I；X3是F或Y；X4是K或R；和X5是K或R。这种序列对应于按照标准的H3亚型编号系统编号的H1亚型血凝素的氨基酸76-130。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，核心多肽包括图6A示出（SEQIDNOS:8-11）的任一氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H1的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感病毒亚型H1的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H1核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是H1核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H1核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H1核心多肽的片段，其中该片段缺少来自它的C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H1核心多肽的片段，其中片段缺少来自H1核心多肽的N-和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H1核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H1核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H1核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H1核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H1核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H1核心多肽，其中所述氨基酸连接到H1核心多肽的N-末端或C-末端上，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H1核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H1核心多肽，其中所述氨基酸连接到H1核心多肽的N-末端和C-末端上，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H2核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYXKVRMQLRDNV(SEQIDNO:12),
其中X是亲水的、酸性氨基酸。在一种具体实施方式中，X是D或E。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，核心多肽包含图6B（SEQIDNO:13或14）示出的任一氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能够用于对亚型H2的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H2的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H2核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H2核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H2核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H2核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是H2核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H2核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5个或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H2核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H2核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H2核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H2核心多肽。
在具体实施方式中，核心多肽是H2核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H2核心多肽，其中所述氨基酸连接到H2核心多肽的N-或C-末端上，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H2核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H2核心多肽，其中所述氨基酸连接到H1核心多肽的N-和C-末端上，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H3核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEX1TX2X3QLRENA(SEQIDNO:15)，
其中X1是亲水的、碱性氨基酸；X2是亲水的、碱性氨基酸；X3是亲水的、碱性氨基酸。在具体实施方式中，X1是K或R；X2是K或R；和X3是K或R。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，核心多肽包括图6C示出（SEQIDNOS:16-18）的任一氨基酸序列或它的片段。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化所述核心多肽。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H3的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H3的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H3核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是H3核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H3核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H3核心多肽的片段，其中该片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是H3核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H3核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H3核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H3核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H3核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H3核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H3核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H3核心多肽，其中所述氨基酸连接于H3核心多肽的N-末端或C-末端，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H3核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H3核心多肽，其中所述氨基酸连接于H3核心多肽的N-末端和C-末端，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H4核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDVTDSEMNKLFERVRX1QLRENA(SEQIDNO:19)，
其中X1是亲水的、碱性氨基酸。在一种具体实施方式中，X1是R或H。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，核心多肽包含括图6F示出（SEQIDNOS:20和21）的任一氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H4的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H4的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H4核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H4核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H4核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H4核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H4核心多肽的片段，其中片段缺少来自H4核心多肽的N-和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H4核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H4核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H4核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H4核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H4核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H4核心多肽，其中所述氨基酸连接于H4核心多肽的N-末端或C-末端，并且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H4核心多肽的衍生物，其中衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H4核心多肽，其中所述氨基酸连接到H4核心多肽的N-和C-末端上，并且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H5核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNA(SEQIDNO:22)。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在具体实施方式中，核心多肽包含图6D示出（SEQIDNO:22）的任一氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在具体实施方式中，这种核心多肽能够用于对亚型H5的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H5的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H5核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H5核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H5核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H5核心多肽的片段，其中该片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H5核心多肽的片段，其中片段缺少来自H5核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H5核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至511、51至500、51至450、51至400、51至350、51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H5核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H5核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H5核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H5核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H5核心多肽，其中所述氨基酸连接于H5核心多肽的N-或C-末端，并且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H5核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H5核心多肽，其中所述氨基酸连接于H5核心多肽的N-和C-末端，并且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H6核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RIX1NX2NKRMEDGFLDVWTYNAELLVLLENX3RTLDX4HDANVKX5LX6EKVKSX7LX8DNA(SEQIDNO:23)，
其中X1是G或D；X2是疏水的氨基酸；X3是亲水的氨基酸；X4是疏水的氨基酸；X5是亲水的氨基酸；X6是H或Y；X7是Q或L和X8是亲水的、碱性氨基酸。在具体实施方式中，X1是G或D；X2是L或M；X3是E或G；X4是L或M；X5是N或S；X6是H或Y；X7是Q或L和X8是R或K。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在具体实施方式中，核心多肽包含图6G示出（SEQIDNOS:24-29）的任一氨基酸序列或它的片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H6的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H6的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H6核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H6核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H6核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H6核心多肽的片段，其中片段缺少来自它的C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H6核心多肽的片段，其中片段缺少来自H6核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H6核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H6核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H6核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H6核心多肽。
在具体实施方式中，核心多肽是H6核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H6核心多肽，其中所述氨基酸连接于H6核心多肽的N-末端或C-末端，并且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H6核心多肽的衍生物，其中衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H6核心多肽，其中所述氨基酸连接到H6核心多肽的N-和C-末端上，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H7核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
QIGNVINWTRDX1MTEX2WSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMX3KLYERVX4KQLRENA(SEQIDNO:30),
其中X1是疏水的氨基酸或亲水的氨基酸；X2是疏水的氨基酸；X3是亲水的氨基酸，和X4是亲水的、碱性氨基酸。在一种具体实施方式中，X1是A或S；X2是V或I；X3是N或S；和X4是K或R。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在一种具体实施方式中，核心多肽包含图6E示出（SEQIDNOS:31-35）的任一氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H7的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H7的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H7核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是H7核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H7核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H7核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H7核心多肽的片段，其中片段缺少来自H7核心多肽的N-和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H7核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H7核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H7核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H7核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H7核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H7核心多肽，其中所述氨基酸连接于H7核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H7核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H7核心多肽，其中所述氨基酸连接于H7核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H8核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：RINMINDKIDDQIEX1LWAYNAELLVLLENQKTLDEHDSNVKNLFDEVKRRLSANA(SEQIDNO:36)，其中X1是亲水的氨基酸。在某些实施方式中，X1是D或N。在具体实施方式中，核心多肽包含图6H示出（SEQIDNOS:37和38）的任一氨基酸序列或其片段。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能够用于对亚型H8的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H8的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H8核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是H8核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H8核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H8核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是H8核心多肽的片段，其中片段缺少来自H8核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H8核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H8核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H8核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H8核心多肽。
在具体实施方式中，核心多肽是H8核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H8核心多肽，其中所述氨基酸连接于H8核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H8核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H8核心多肽，其中所述氨基酸连接于H8核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H9核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RLNMINNKIDDQIQDX1WAYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNA(SEQIDNO:39)，
其中X1是疏水的氨基酸。在具体实施方式中，X1是V或I。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，核心多肽包括图6I示出（SEQIDNOS:40和41）的任一氨基酸序列或它的片段。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H9的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H9的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H9核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H9核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H9核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H9核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H9核心多肽的片段，其中片段缺少来自H9核心多肽的N-和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H9核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H9核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H9核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H9核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H9核心多肽的衍生物，其中衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H9核心多肽，其中所述氨基酸连接于H9核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H9核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H9核心多肽，其中所述氨基酸连接到H9核心多肽的N-和C-末端上，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H10核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
QIGNVINWTKDSITDIWTYX1AELLVAMENQHTIDMADSEMLNLYERVRKQLRQNA(SEQIDNO:42)，其中X1是亲水的氨基酸。在具体实施方式中，X1是Q或N。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在具体实施方式中，核心多肽包括图6J示出（SEQIDNOS:43和44）的任一氨基酸序列或它的片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H10的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H10的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H10核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是H10核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H10核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H10核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H10核心多肽的片段，其中片段缺少来自H10核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H10核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H10核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H10核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H10核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H10核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H10核心多肽，其中所述氨基酸连接于H10核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H10核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H10核心多肽，其中所述氨基酸连接于H10核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H11核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RINQLSKHVDDSVX1DIWSYNAQLLVLLENEKTLDLHDSNVRNLHEKVRRMLKDNA(SEQIDNO:45)，
其中X1是疏水的氨基酸。在具体实施方式中，X1是V或I。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，核心多肽包括图6K示出（SEQIDNOS:46和47）的任一氨基酸序列或它的片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H11的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H11的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H11核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H11核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H11核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H11核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H11核心多肽的片段，其中片段缺少来自H11核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H11核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H11核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H11核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H11核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H11核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H11核心多肽，其中所述氨基酸连接于H11核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H11核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H11核心多肽，其中所述氨基酸连接于H11核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H12核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RIN明斯克IDDQITDIWAYNAELLVLLENQKTLDEHDANVRNLHDRVRRX1LX2ENA(SEQIDNO:48)，
其中X1是疏水的氨基酸和X2是亲水的、碱性氨基酸。在具体实施方式中，X1是V或I和X2是R或K。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在一种具体实施方式中，核心多肽包括图6L示出（SEQIDNOS:49和50）的任一氨基酸序列或它的片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H12的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H12的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H12核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H12核心多肽的片段，其中片段缺少来自H12核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H12核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H12核心多肽的片段，其中片段缺少来自H12核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H12核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H12核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H12核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H12核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H12核心多肽的衍生物，其中衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H12核心多肽，其中所述氨基酸连接于H12核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H12核心多肽的衍生物，其中衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H12核心多肽，其中所述氨基酸连接于H12核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H13核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RINMLADRIDDAVTDX1WSYNAKLLVLLENDKTLDMHDANVRNLHX2QVRRX3LKX4NA(SEQIDNO:51)，
其中X1是疏水的氨基酸；X2是亲水的、碱性氨基酸；X3是A、S或E和X4是亲水的氨基酸。在具体实施方式中，X1是V或I；X2是D或E；X3是A、S或E和X4是T或D。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。在具体实施方式中，核心多肽包括图6M示出（SEQIDNOS:52-54）的任一氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H13的流感病毒菌株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H13的菌株。
在某些实施方式中，核心多肽是H13核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H13核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H13核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H13核心多肽的片段，其中片段缺少来自它的C-末端的24(±5)个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽是H13核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H13核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H13核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H13核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H13核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H13核心多肽。
在具体实施方式中，核心多肽是H13核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H13核心多肽，其中所述氨基酸连接到H13核心多肽的N-或C-末端上，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H13核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H13核心多肽，其中所述氨基酸连接到H13核心多肽的N-于末端和C-末端上，和其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H14核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDVTDSEMNKLFERVRRQLRENA(SEQIDNO:55)。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，核心多肽包括图6N示出（SEQIDNO:55）的任一氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H14的流感病毒株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H14的病毒株。
在某些实施方式中，核心多肽是H14核心多肽的片段。在一种具体实施方式中，核心多肽是H14核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H14核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H14核心多肽的片段，其中该片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是H14核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H14核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H14核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H14核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H14核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H14核心多肽。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H14核心多肽的衍生物，其中衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H14核心多肽，其中所述氨基酸连接于H14核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H14核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H14核心多肽，其中所述氨基酸连接于H14核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H15核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
QIGNVINWTRDSLTEIWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMNKLYERVRRQLRENA(SEQIDNO:56)。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，核心多肽包含图6O示出的任一氨基酸序列或它的片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在一种具体实施方式中，这种核心多肽能用于对亚型H15的流感病毒株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H15的病毒株。
在某些实施方式中，核心多肽是H15核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H15核心多肽的片段，其中片段缺少来自H15核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H15核心多肽的片段，其中片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是H15核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H15核心多肽的N-和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H15核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H15核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H15核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H15核心多肽。
在具体实施方式中，核心多肽是H15核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H15核心多肽，其中所述氨基酸连接于H15核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H15核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H15核心多肽，其中所述氨基酸连接于H15核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在一种具体实施方式中，核心多肽是H16核心多肽，其包含或由所述氨基酸序列组成：
RINMLADRVDDAVTDIWSYNAKLLVLX1ENDRTLDLHDANVX2NLHX3QVKRALKX4NA(SEQIDNO:57)，
其中X1是疏水的氨基酸；X2是亲水的、碱性氨基酸；X3是亲水的、酸性氨基酸和X4是亲水的氨基酸。在具体实施方式中，X1是L或I；X2是K或R；X3是D或E和X4是S或N。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，核心多肽包含图6P示出（SEQIDNOS:58-60）的任一氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，这种核心多肽能够用于对亚型H16的流感病毒株诱导免疫应答。在某些实施方式中，诱导的免疫应答中和流感亚型H16的病毒株。
在某些实施方式中，核心多肽是H16核心多肽的片段。在具体实施方式中，核心多肽是H16核心多肽的片段，其中该片段缺少来自H16核心多肽的N-或C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(±5)、15(±5)、20(±5)、25(±5)、30(±5)或35(±5)个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽是H16核心多肽的片段，其中该片段缺少来自其C-末端的24(±5)个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽是H16核心多肽的片段，其中片段缺少来自H16核心多肽的N-末端和C-末端的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一种具体实施方式中，核心多肽具有α-螺旋结构。
在某些实施方式中，核心多肽是非全长的流感病毒HA的H16核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间的H16核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的H16核心多肽。在某些实施方式中，核心多肽是长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸的H16核心多肽。
在具体实施方式中，核心多肽是H16核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H16核心多肽，其中所述氨基酸连接于H16核心多肽的N-末端或C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，核心多肽是H16核心多肽的衍生物，其中该衍生物包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10(±5)个氨基酸的H16核心多肽，其中所述氨基酸连接于H16核心多肽的N-末端和C-末端，且其中核心多肽保持α-螺旋结构。
在具体实施方式中，所述核心多肽包含或由所述序列组成：EILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSA。在某些实施方式中，在N-末端乙酰化核心多肽。
在具体实施方式中，核心多肽包括或由图5A示出的任一氨基酸序列或它的片段组成。在某些实施方式中，核心多肽在N-末端被乙酰化。在具体实施方式中，核心多肽包含或由图5B示出的任一氨基酸序列或它的片段组成。在某些实施方式中，核心多肽的长度在51至300、51至275、51至250、51至225、51至200、51至175、51至150、51至125、51至100、或51至75、15至50、20至50、25至50、15至37、15至35、20至37、20至35、15至30、20至30或20至25个氨基酸之间。在某些实施方式中，核心多肽的长度小于500、450、400、350、300、275、250、225、200、175、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸。在某些实施方式中，核心多肽的长度小于150、125、95、90、85、80、75、65、60、55、50、45或40个氨基酸但是长度至少是15、20、25、30或35个氨基酸。
5.1.2具有增加的半衰期的flu多肽和核心多肽
在某些实施方式中，修饰本文中描述的flu多肽和核心多肽，以便在体内具有延长的（或增加的）半衰期（例如，修饰的核心多肽）。具体地，本发明提供了在受试者中具有从约3天到约180天（或更多）的半衰期的修饰的flu和核心多肽，和在某些实施方式中，大于3天、大于7天、大于10天、大于15天、大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于50天、至少大约60天、大于70天、大于90天、大于105天、大于120天、大于135天、大于150天、大于165天、或大于180天。
在某些实施方式中，通过flu或核心多肽的N-末端乙酰化作产生在体内具有增加的半衰期的flu或核心多肽。多肽的乙酰化是本领域技术人员公知的技术，且包含种多肽的N-末端加入乙酰基。核心多肽的乙酰化可使核心多肽更不容易受到肽链端解酶的降解。
在某些实施方式中，通过flu或核心多肽的C-末端的酰胺化作用产生在体内具有增加的半衰期的flu或核心多肽。
在某些实施方式中，通过聚乙二醇化产生在体内具有增加的半衰期的flu或核心多肽，例如，利用或不利用多功能的接头，通过PEG对flu或核心多肽的N-末端或C-末端的位置特定的结合，或通过赖氨酸残基上的ε-氨基基团，将惰性聚合物分子如高分子量的聚乙二醇（PEG）连接于flu或核心多肽。可使用各种平均分子量的PEG，如1000Da、4000Da、5000Da、8000Da、10000Da、120000Da或甚至更高的分子量。在一种具体实施方式中，flu或核心多肽的N-末端被聚乙二醇化。可使用导致生物活性最小损失的线性或支化的聚合物衍生作用。可通过SDS-PAGE和质谱分析精密地监视结合的程度，以便确保PEG分子与flu或核心多肽的适当的结合。可通过尺寸排阻色谱或通过离子交换色谱，从flu或核心多肽-PEG结合物中分离未反应的PEG。可利用本领域技术人员公知的方法，检验PEG-衍生的flu或核心多肽的体内功效，例如，通过本文中描述的动物模型系统。
在另一种实施方式中，为了使核心多肽在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期，可将flu或核心多肽结合于白蛋白。这样的技术是本领域已知的，参考，例如，国际出版物Nos.WO93/15199、WO93/15200、和WO01/77137；和欧洲专利No.EP413,622，其全部内容包括在此以供参考。
在某些实施方式中，通过利用D-氨基酸取代核心多肽的末端L-氨基酸，产生在体内具有增加的半衰期的flu或核心多肽。
5.1.3包含核心多肽和接头的flu多肽
在某些实施方式中，本文中描述的flu多肽包括连接到接头上的核心多肽或修饰的核心多肽。本文中包含的接头可以是本领域技术人员已知的任何接头，其不干扰接头联合的核心多肽的天然结构。在清蛋白具体实施方式中，本文中包含的接头是非疏水的。
可改变接头的长度，以便在本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽和所述核心多肽或修饰的核心多肽要连接到其上的基层（例如，载体蛋白、T细胞抗原表位、免疫原性多肽）之间提供最佳的连接。进一步地，可最佳化接头的长度，以便防止由于接头免疫原性响应。通常接头分子是本领域公知的，且在Denardo等人,1998,Clin.CancerRes.4:2483-90;Peterson等人,1999,Bioconjug.Chem.10:553;和Zimmerman等人,1999,Nucl.Med.Biol.26:943-50中描述，其每一篇的全部内容均结合于本文以供参考。
接头的长度可以是一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一、十二、十三、十四、十五、二十、或超过二十个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于20个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于15个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于10个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于9个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于8个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于7个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于6个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于5个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于4个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于3个氨基酸。在某些实施方式中，接头的长度小于2个氨基酸。
在某些实施方式中，接头的长度在1和50个氨基酸之间。在某些实施方式中，接头的长度在1至40个氨基酸、1至30个氨基酸、1至20个氨基酸、1至10个氨基酸、1至5个氨基酸、1至4个氨基酸、1至3个氨基酸、1至2个氨基酸之间或1个氨基酸。
在某些实施方式中，将接头共价地连接于核心多肽或修饰的核心多肽。在具体实施方式中，通过肽键将接头连接于核心多肽或修饰的核心多肽。在某些实施方式中，将接头连接于核心多肽或修饰的核心多肽的N-末端。在某些实施方式中，将接头连接于核心多肽或修饰的核心多肽的C-末端。
在某些实施方式中，接头包含一个或多个甘氨酸残基。在某些实施方式中，接头包含两个或更多个甘氨酸残基。在某些实施方式中，接头包含三个或更多个甘氨酸残基。在某些实施方式中，接头包括四个或更多个甘氨酸残基。在某些实施方式中，接头包含五个或更多个甘氨酸残基。在某些实施方式中，接头包括十个或更多甘氨酸残基。在某些实施方式中，接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10或更多个甘氨酸残基。在某些实施方式中，接头包含2至4、2至6、2至10、3至6、3至8、3至10、5至10、8至10、10至15或10至20个甘氨酸残基。在一种具体实施方式中，接头包含三个甘氨酸残基。
在某些实施方式中，接头包含一个或更多半胱氨酸残基。在某些实施方式中，接头包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10或更多半胱氨酸残基。在某些实施方式中，接头包括2至4、2至6、2至10、3至6、3至8、3至10、5至10、8至10、10至15或10至20个半胱氨酸残基。
在某些实施方式中，接头包括蛋白标签。蛋白标签可用于蛋白质复合体的分离、flu多肽的分析、亲和色谱法和/或定位研究。另外，蛋白标签包含，但不限于，His标签、StrepII标签、T7-标签、FLAG-标签、S-标签、HA标签、c-Myc标签、DHFR标签、和绿色荧光蛋白（GFP）。可将蛋白标签共价地连接于flu多肽的N-末端或C-末端。在某些实施方式中，接头包含FLAG-Tag蛋白标签，例如，接头包含氨基酸DYKDDDDK。在一种具体实施方式中，接头包含共价地连接于半胱氨酸残基的FLAG-Tag（例如，DYKDDDDKC）。在某些实施方式中，flu多肽包括1、2、3、4或更多个蛋白标签。在某些实施方式中，在flu多肽中，蛋白标签不能被用作接头。
5.1.4包含多种核心多肽的flu多肽
在某些实施方式中，本发明提供了包含两个或更多个核心多肽或修饰的核心多肽的flu多肽。两个或更多个核心多肽或修饰的核心多肽可直接地或间接地彼此连接/偶合。在没有任何具体的操作理论的约束的情况下，应该理解，在没有载体蛋白的联合给予下，给予包含两个、三个或更多个核心多肽或修饰的核心多肽的flu多肽可在受试者内产生具有广泛的反应性的血清抗体。在某些实施方式中，核心多肽或修饰的核心多肽通过如之前的章节5.1.3中描述的接头连接在一起。换句话说，在某些实施方式中，flu多肽可包含，例如，连接于接头的核心多肽或修饰的核心多肽，所述接头依次连接于核心多肽或修饰的核心多肽。
在一种具体实施方式中，flu多肽具有序列X-(L-X)n，其中X是本文中描述的任何核心多肽或修饰的核心多肽，L是本文中描述的任何接头，n＝1-20，和其中X共价地连接于L。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包括序列X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含有序列X-L-X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含序列X-L-X-L-X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含序列X-L-X-L-X-L-X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含序列X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含序列X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含序列X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含序列X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含序列X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X。在一种具体实施方式中，所述flu多肽包含序列X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X-L-X。
在某些实施方式中，缺少L。换句话说，flu多肽的每一个核心多肽或修饰的核心多肽直接地连接于一个或更多其他核心多肽（例如，X-X、X-X-X、X-X-X-X、X-X-X-X-X，等等）。
在某些实施方式中，flu多肽包含两个或更多个相同的核心多肽或修饰的核心多肽。在其他实施方式中，flu多肽包含两个或更多个不同的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包括两个或更多个相同的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包括三个或更多个相同的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包括四个或更多个相同的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包括五个或更多个相同的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽的每一个核心多肽或修饰的核心多肽是相同的。
在一种具体实施方式中，flu多肽包含两个或更多个不同的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包含三个或更多个不同的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包含四个或更多个不同的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包含五个或更多个不同的核心多肽或修饰的核心多肽。
在某些实施方式中，flu多肽包含序列X-L-X-L-X，其中X是包含以下氨基酸序列RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENA(SEQIDNO:2)的核心多肽，和L是由三个甘氨酸残基组成的接头。在其他实施例中，X不是RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENA(SEQIDNO:2)，和L相同或不同。
在某些实施方式中，除了包含两个或更多个修饰的核心多肽之外，flu多肽还包含下列种的一个、两个、三个或更多个或全部：T细胞抗原表位、促进多聚化的多肽（例如，T4折叠子结构域）、蛋白标签、或如本文中描述的免疫原性多肽。在具体实施方式中，flu多肽在其N-末端上包含His-标签。在具体实施方式中，flu多肽在其C-末端上包一种FLAG-标签。在一种具体实施方式中，flu多肽在它的N-末端包一种His-标签和在其C-末端包括FLAG-标签。在一种具体实施方式中，flu多肽在其C-末端包一种A型流感核心蛋白（NP）。在某些实施方式中，flu多肽在其C-末端包一种FljB鞭毛蛋白。
在某些实施方式中，flu多肽包含氨基酸序列H-X-L-X-L-X-F，其中H是促进flu多肽的纯化和/或溶解性的His标签或另外的蛋白标签，X是核心多肽或修饰的核心多肽，L是接头和F是不同于促进flu多肽的纯化和/或溶解性的H的FLAG-标签或另外的蛋白标签。在某些实施方式中，L是3个甘氨酸残基。在某些实施方式中，L是相同的，在其他实施方式中，L是不同的。
5.1.5包含T细胞抗原表位的flu多肽
在某些实施方式中，flu多肽包括本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽和T细胞抗原表位（例如，CD4或CD8T细胞抗原表位）。在具体实施方式中，flu多肽包括核心多肽或修饰的核心多肽和CD4T细胞抗原表位。在一种具体实施方式中，flu多肽包括核心多肽或修饰的核心多肽和CD8T细胞抗原表位。在另一种具体实施方式中，T-细胞抗原表位是流感病毒CD8T细胞抗原表位（例如，含有高度地保守的T细胞抗原表位的流感病毒蛋白）。T细胞抗原表位可通过修饰的核心多肽直接地或间接地连接于/偶合到核心多肽。
在没有任何具体的操作理论的约束的情况下，应该认为，包含核心多肽或修饰的核心多肽和CD8T细胞抗原表位的flu多肽可广泛地引出中和抗体，且为广谱的CD8T细胞响应做好准备。例如，在流感核蛋白（NP）、基质1（M1）、神经氨酸酶（NA）和聚合酶亚单位1（polymerasebasic-1）中发现了含有CD8T细胞抗原表位的高度地保守的流感病毒区域。参考Alexander等人,2010,HumImmunol71:468-74，其全部内容包括在此以供参考。在某些实施方式中，CD8T细胞抗原表位是核蛋白（NP）或它的片段。在其他实施方式中，CD8T细胞抗原表位多肽是基质1（M1）蛋白或片段或它的片段。
在一种具体实施方式中，flu多肽包括连接到T细胞抗原表位上的核心多肽或修饰的核心多肽。可利用本领域技术人员公知的任何技术将T细胞抗原表位（例如，CD8T细胞抗原表位）连接于本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽，包括，但不限于，利用胺对胺交联剂BS（双[巯基琥珀酰亚胺辛二酸酯（Bis[sulfosuccinimidyl]suberate）、胺-对-巯基NHS-PEG-顺丁烯二酰亚胺交联剂、或巯基-对-巯基BM(PEG)nPEG交联剂，将单一的点连接到伯氨基或巯基上。在其他实施方式中，T细胞抗原表位（例如，CD8T细胞抗原表位）共价地连接到flu多肽的N-或C-末端上。在其他实施例中，通过如上述章节5.1.3中本文中描述的接头将T细胞抗原表位（例如，CD8T细胞抗原表位）连接于核心多肽或修饰的核心多肽。
在某些实施方式中，除了包括一个或更多核心多肽或修饰的核心多肽和T细胞抗原表位之外，flu多肽还包含下列中的一个、两个、三个或更多个或全部：蛋白标签、免疫原性多肽、促进flu多肽多聚化的载体和/或多肽（例如，T4折叠子结构域）。
在某些实施方式中，flu多肽包含一个、两个、三个、四个或更多个核心多肽或修饰的核心多肽和T细胞抗原表位。在一种具体实施方式中，flu多肽包含式H-X-L-X-L-X-F-T，其中H（其是可选的）是His标签或促进纯化和/或溶解性的另外的蛋白标签，X是核心多肽或修饰的核心多肽，L是接头（如章节5.1.3中描述的），F（其是可选的）是不同于促进纯化和/或溶解性的H的FLAG-标签或另外的蛋白标签，和T是T细胞抗原表位。在某些实施方式中，多肽包含式H-X-L-X-L-X-T，其中H（其是可选的）是促进纯化和/或溶解性的His标签或另外的蛋白标签，X是核心多肽或修饰的核心多肽，L是接头（如章节5.1.3中描述的），和T是T细胞抗原表位。
在某些实施方式中，L是三个甘氨酸残基。在某些实施方式中，L在式中每一次出现都是相同的和在其他实施例中，L在式中每一次出现都是不同的或变化的。在某些实施方式中，在F和I之间存在接头。在其他实施例中，F直接地连接于T。在某些实施方式中，核心多肽或修饰的核心多肽在式中每一次出现都是相同的。在其他实施例中，核心多肽或修饰的核心多肽在式中每一次出现都是不同的或变化的。
在某些实施方式中，在X和T之间存在接头。在其他实施方式中，X直接地连接于T。
5.1.6包含免疫原性多肽的flu多肽
在本发明提供的某些实施方式中，flu多肽包括一个或更多核心多肽或修饰的核心多肽和免疫原性多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包含直接地或间接地连接/偶合于免疫原性多肽的核心多肽或修饰的核心多肽。免疫原性多肽可连接/偶合于核心多肽或修饰的核心多肽的N-末端和/或C-末端。在某些实施方式中，通过如上述章节5.1.3中描述的接头将免疫原性多肽连接于核心多肽或修饰的核心多肽。
免疫原性多肽的实例包括，但不限于，Toll样受体（TLR）配体，如沙门氏菌鞭毛蛋白（Toll样受体5配体）。参见，例如，Huleatt等人,2008,Vaccine26:201-14；Song等人,2009,Vaccine27:5875-84；和Wang等人,2010,PLosOne5:e13972。在一种具体实施方式中，flu多肽包含连接于来自肠道沙门氏菌的FljB鞭毛蛋白的核心多肽。
在某些实施方式中，flu多肽包含一个或多个核心多肽或修饰的核心多肽和免疫原性多肽。在某些实施方式中，除了包含一个或多个核心多肽或修饰的多肽和免疫原性多肽之外，flu多肽还包含下列种的一个、两个、三个、或更多或全部：促进flu多肽的纯化和/或增加flu多肽的溶解性的蛋白标签、促进flu多肽多聚化的T细胞抗原表位和/或多肽（例如，T4折叠子结构域）。
在某些实施方式中，flu多肽包括两个、三个、四个或更多个核心多肽或修饰的核心多肽和免疫原性多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包括H-X-L-X-L-X-F-I，其中H是促进纯化和/或溶解性的可选的His标签或另外的蛋白标签，X是核心多肽或修饰的核心多肽，L是可选的接头，如章节5.1.3中描述的，F是不同于促进flu的纯化和/或溶解性的H的可选的FLAG-标签或另外的蛋白标签，和I是免疫原性多肽。在某些实施方式中，L是三个甘氨酸残基。在某些实施方式中，遍及flu多肽L是相同的，和在其他实施例中，遍及所述多肽L是不同的。在某些实施方式中，在F和I之间存在接头。在其他实施方式中，F直接地连接于I。
在具体实施方式中，flu多肽包含H-X-L-X-L-X-I，其中H是促进纯化和/或溶解性的可选的His标签或另外的蛋白标签，X是核心多肽或修饰的核心多肽，L是可选的接头，如章节5.1.3中描述的，和I是免疫原性多肽。在某些实施方式中，L是三个甘氨酸残基。在某些实施方式中，遍及flu多肽L是相同的和在其他实施方式中，遍及所述多肽L是不同的。在某些实施方式中，在X和I之间存在接头。在其他实施例中，X直接地连接于I。
5.1.7包含载体的flu多肽
在某些实施方式中，flu多肽包括本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽和载体。在一种具体实施方式中，flu多肽包括偶合/连接于载体的核心多肽或修饰的核心多肽。核心多肽或修饰的核心多肽可直接地或间接地连接/偶合于载体。可利用本领域技术人员公知的方法将本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽偶合到/连接到（例如，通过接头直接地连接）载体上，其包括但不限于，破伤风类毒素（以化学方法-灭活的破伤风类毒素）、白喉毒素（例如，以化学方法-灭活的白喉毒素或CRM197-无毒的白喉毒素点突变体）、钥孔戚血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin）（KLH）、牛血白蛋白、卵白蛋白、甲状腺球蛋白或脑膜炎球菌外膜蛋白（meningococcaloutermembraneprotein）。在一种具体实施方式中，本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽连接于KLH。
在某些实施方式中，本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽直接地连接于载体蛋白，例如，在没有插入接头分子的情况下，所述核心多肽或修饰的核心多肽和载体蛋白彼此连接。在某些实施方式中，本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽通过接头连接于载体蛋白。在具体实施方式中，本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽通过上述章节5.1.3中描述的接头连接于载体蛋白。
在某些实施方式中，flu多肽包括偶合/连接到超过一个载体上的核心多肽或修饰的核心多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽包含偶合/连接于2、3、4、5、或更多个载体上的核心多肽或修饰的核心多肽。
在某些实施方式中，本文中描述的2种、3种、4种、5种、6种或更多种相同的核心多肽或修饰的核心多肽被连接于载体。在某些实施方式中，本文中描述的2种、3种、4种、5种、6种或更多种不同的核心多肽或修饰的核心多肽连接于载体。
在某些实施方式中，通过化学的交联将本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽偶合/连接于载体。例如，交联剂1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基羰基二胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）（“EDC”）或交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（Sulfosuccinimidyl4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate）（“Sulfo-SMCC”）可用于交联核心多肽和载体。其他交联剂包括戊二醛和双重氮化联苯胺（Bis-DiazotizedBenzidine）。交联的方法是本领域技术人员已知的和可在：www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=CE4D6C5C-5946-4814-9904-C46E01232683上发现普通的交联化学。
在具体实施方式中，flu多肽包含（i）流感病毒株A/香港/1/1968(H3)的HA2血凝素亚单位的长α-螺旋（例如，按照标准的H3亚型编号系统编号的，氨基酸76-130）；（ii）FLAG-标签；和（iii）可用于，例如，偶合/连接核心多肽与载体（例如，KLH）的C-末端半胱氨酸残基。在具体实施方式中，这样的flu多肽包含以下氨基酸序列：RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENADYKDDDDKC(SEQIDNO:1)，其中由氨基酸序列DYKDDDDK代表FLAG-标签。在某些实施方式中，乙酰化修饰的核心多肽的N-末端。
5.1.8多聚化多肽
在某些实施方式中，flu多肽包括本文中描述的核心多肽或修饰的核心多肽和促进多聚体（例如，三聚体）形成的多肽。在某些实施方式中，核心多肽或修饰的多肽偶合/连接到多肽上，如T4折叠子结构域上，以使得能够形成/促进三聚体形成。
在一种具体实施方式中，核心多肽或修饰的核心多肽在其C-末端上，间接地或直接地连接/偶合到促进多聚化（例如，三聚化，如通过T4折叠子结构域）的多肽上。Meier等人,2004,JMolBiol344:1051-69，其全部内容结合于本文以供参考。在没有任何具体的操作理论的约束的情况下，T4折叠子结构域可在天然的血凝素分子中观察到的A型流感长α螺旋的三聚体构造的形成。
在某些实施方式中，flu多肽包括两个或更多核心多肽或修饰的多肽和促进三聚体形成的多肽。在一种具体实施方式中，促进三聚体形成的多肽是T4折叠子结构域。
在某些实施方式中，通过接头，如上述章节5.1.3中描述的，将促进多聚体形成的多肽连接/偶合到核心多肽或修饰的核心多肽上。换句话说，在某些实施方式中，flu多肽包含核心多肽或修饰的核心多肽、接头和促进多聚体形成的多肽，如T4折叠子结构域。
在某些实施方式中，除了包括2、3、4或更多个核心多肽或修饰的核心多肽和促进多聚化的多肽，如T4折叠子结构域之外，flu多肽还包括下列中的一个、两个、三个或更多、或全部：促进flu多肽的纯化和/或溶解性的蛋白标签、免疫原性多肽、和/或如本文中描述的载体。在具体实施方式中，flu多肽包括促进纯化和/或溶解性的蛋白标签（例如，His标签）、核心多肽或修饰的核心多肽和促进三聚化的多肽，如T4折叠子结构域。
5.2编码flu多肽的核酸
本发明提供了编码本文中描述的flu多肽的核酸。由于遗传密码的简并性，编码本文中描述的flu多肽的任何核酸都包含于此。在某些实施方式中，与编码血凝素蛋白的HA2结构域（例如，长的α-螺旋区域）的区域的自然地存在的流感病毒核酸一致的核酸用于产生flu多肽。
本发明还提供了能够与编码flu多肽的核酸杂交的核酸。在某些实施方式中，本发明提供了能够与编码flu多肽的核酸的片段杂交的核酸。在其他实施方式中，本发明提供了能够与编码flu多肽的全长的核酸杂交的核酸。在Sambrook等人,MolecularCloning-ALaboratoryManual(2ndEd.),Vols.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork(1989),和Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,vol.2,CurrentProtocolsPublishing,NewYork(1994)中描述核酸杂交条件的一般参数。杂交可在高度严谨的条件、中度严谨的条件、或低度严谨的条件下进行。本领域技术人员将理解，低、中和高度严谨的条件视多种因素而定，它们均互相影响和所述的条件也取决于所讨论的核酸。例如，高严谨的条件可包括在核酸的5°C熔融温度内的温度、低盐浓度（例如，小于250mM）、和高助溶剂浓度（例如，1-20%的助溶剂，例如，DMSO）。另一方面，低度严谨的条件可包括大于10°C，但在核酸的熔融温度下的温度、高盐浓度（例如，大于1000mM）和不含助溶剂。
在某些实施方式中，分离编码流感病毒flu多肽的核酸，例如，分离本文中描述的flu多肽。在某些实施方式中，分离编码本文中描述的流感病毒核心多肽或修饰的核心多肽的核酸。在某些实施方式中，“分离的”核酸涉及从在核酸的天然来源中出现的其他核酸分子分开的核酸分子。换句话说，分离的核酸可包括与其在本质上不关联的异源的核酸。在其他实施例中，“分离的”核酸，如cDNA分子，当通过重组技术生产时，可充分地不含其他细胞材料，或培养基，或当以化学方法合成时，可基本上不含化学制品前体或其他化学制品。术语“基本上不含细胞材料”包含其中从分离核酸或重组地生产核酸的细胞的细胞成分中分离核酸的核酸制品。因此，基本上不含细胞材料的核酸包含具有小于大约30%、20%、10%、或5%（以干重计算）的其他核酸的核酸制品。术语“基本上不含培养基”包括其中表现小于大约50%、20%、10%、或5%的制品体积的培养基的核酸制品。术语“基本上不含化学制品前体或其他化学制品”包含其中从涉及核酸的合成的化学制品前体或其他化学制品分离核酸的制品。在具体实施方式中，除了所关注的核酸之外，这样的核酸制品具有小于大约50%、30%、20%、10%、5%（按干重计算）的化学制品前体或化合物。
在某些实施方式中，本发明提供的是编码flu多肽的核酸，其中所述flu多肽包括核心多肽和一种或多种另外的成分，例如，接头、载体、蛋白标签、和/或核心多肽关联的蛋白质。
5.3flu多肽的生产和纯化
可通过关于多肽的合成的本领域已知的任何方法生产本文中描述的flu多肽，具体地，通过化学合成法或通过重组表达技术。除非另作说明，本发明提供的方法包含，分子生物学、微生物学、遗传分析、重组子DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交、和本领域技术相关领域中的常规技术。在本文中应用的参考文献中描述这些技术，且在著作中充分地解释这些技术。参见，例如，Maniatis等人(1982)Molecular Cloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Sambrook等人(1989),MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Sambrook等人(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY;Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecular Biology,JohnWiley&Sons(1987andannualupdates);CurrentProtocolsin Immunology,JohnWiley&Sons(1987andannualupdates)Gait(ed.)(1984)OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IRLPress;Eckstein(ed.)(1991)OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,IRLPress;Birren等人(eds.)(1999)GenomeAnalysis:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress。
5.3.flu多肽的合成生产
可利用常规的逐步液相或固相合成方法来制备本文中描述的flu多肽（参见，例如，ChemicalApproachestotheSynthesisofPeptidesandProteins,Williams等人,Eds.,1997,CRCPress,BocaRatonFla.，和本文中引用的参考文献；SolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach,Atherton&Sheppard,Eds.,1989,IRLPress,Oxford,英格兰，和本文中引用的参考文献）。
可替换地，可通过如，Liu等人,1996,TetrahedronLett.37(7):933-936;Baca,等人,1995,J.Am.Chem.Soc.117:1881-1887;Tam等人,1995,Int.J.PeptideProteinRes.45:209-216;SchnolzerandKent,1992,Science256:221-225;LiuandTam,1994,J.Am.Chem.Soc.116(10):4149-4153;LiuandTam,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:6584-6588;YamashiroandLi,1988,Int.J.PeptideProteinRes.31:322-334中描述的片段缩合法（segmentcondensation）制备本文中描述的flu多肽。在Nakagawa等人,1985,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092中描述用于合成本文中描述的flu多肽的其他方法。
可通过在合成中的适当的步骤上将接头加入到核心多肽链中，合成包括核心多肽和接头的flu多肽。适当的保护方案和化学是已知的，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。
如果需要，通常在温和氧化剂的存在下形成二硫键。可使用化学氧化剂，或可仅将化合物暴露于空气中，以实现这些连接。各种方法是本领域已知的，包含，例如由Tam等人,1979,Synthesis955-957;Stewart等人,1984,SolidPhasePeptideSynthesis,第2版,PierceChemicalCompanyRockford,Ill.;Ahmed等人,1975,J.Biol.Chem.250:8477-8482;andPennington等人,1991Peptides1990164-166,GiraltandAndreu,Eds.,ESCOMLeiden,The荷兰描述的那些。由Kamber等人,1980,Hely.Chim.Acta63:899-915描述了另外的可替换方法。由Albericio,1985,Int.J.PeptideProteinRes.26:92-97描述了在固体载体上进行的方法，其全部内容结合于本文以供参考。
5.3.2flu多肽的重组表达
flu多肽的重组表达需要含有多聚核苷酸的表达载体的构建，其中所述多聚核苷酸编码flu多肽。一旦已经获得编码flu多肽的多聚核苷酸，就可通过重组DNA技术利用本领域已知的技术生产用于flu多肽的生产的载体。因此，本文中描述用于通过表达含有flu多肽的多聚核苷酸-编码核苷酸序列，制备flu多肽的方法。本领域技术人员已知的方法可用于构建含有flu译码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。因此，本发明提供的是包括编码flu多肽的核苷酸序列的可复制的表达载体，其中所述flu多肽可操作地连接于启动子。
表达载体包括以适于宿主细胞中的核酸表达的形式编码flu多肽的核酸。在具体实施方式中，宿主细胞是分离的宿主细胞。在一种具体实施方式中，表达载体包括以用于表达的宿主细胞为基础选择的一个或多个调控序列，其可操作地连接到要表达的核酸上。在表达载体内，“可操作地连接”是指，以允许核酸的表达的方式将所关注的核酸连接于调控序列（例如，当将载体引入宿主细胞中时，在体外转录/翻译系统或宿主细胞中）。调控序列包含启动子、增强子和其他表达控制元件（例如，多腺苷酸化作用信号）。调控序列包含在宿主细胞的很多类型中指导组成型表达核酸的那些，仅仅在某些宿主细胞中指导核酸的表达的那些（例如，组织特定的调控序列），和在利用具体的试剂的刺激上指导核酸的表达的那些（例如，可诱导的调控序列）。本领域技术人员应当清楚，表达载体的设计可取决于这样的因素，如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质的表达水平，等等。术语“宿主细胞”倾向于包含利用核酸转化的或转染的具体的受试者细胞和这样的细胞的后代或潜在的后代。由于可在以后的世代中出现的突变或环境影响或核酸到宿主细胞基因组的整合，这样的细胞的后代可不同于利用核酸转化的或转染的亲代细胞。在具体实施方式中，分离宿主细胞。
可通过传统的转化或转染技术将表达载体引入宿主细胞。这样的技术包括，但不限于，磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质体转染（lipofection）、电穿孔（electroporation）。可在Sambrook等人,1989,MolecularCloning-ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarborPress,NewYork，和其他实验室手册中发现用于转化或转染宿主细胞的适当的方法。在某些实施方式中，利用含有编码flu多肽的核酸的表达载体瞬时地转染宿主细胞。在其他实施例中，利用含有编码flu多肽的核酸的表达载体稳定地转染宿主细胞。因此，本发明提供的是含有编码本文中描述的flu多肽的多聚核苷酸的宿主细胞或依照本发明提供的方法产生的宿主细胞。
多种的宿主表达载体细胞可用于表达flu多肽。这样的宿主表达载体系统代表通过其可生产和随后纯化所关注的译码序列的媒介物，但是也代表，当利用适当核苷酸译码序列转化或转染时，可在原处表达flu多肽的细胞。这些包含但不限于微生物如利用含有flu多肽译码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转染的细菌（例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）；利用含有flu多肽译码序列的重组酵母表达载体转染的酵母（例如，毕赤酵母（SaccharomycesPichia））；利用含有flu多肽译码序列的重组病毒表达载体（例如，杆状病毒（baculovirus））感染的昆虫细胞系统；利用重组病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV）感染的或利用含有flu多肽译码序列的重组质粒表达载体（例如，Ti质粒）转化的植物细胞系统；或含有重组表达构造的哺乳动物细胞系统（例如，COS、CHO、BHK、293、NS0、和3T3细胞），其中所述重组表达构造含有来源于哺乳动物细胞的基因组（例如，亲金属蛋白启动子）或来源于哺乳动物病毒（例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子）的启动子。优选地，细菌细胞如大肠杆菌，和更优选地，真核细胞用于flu多肽的表达。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵细胞（CHO），结合载体如来自人类细胞肥大病毒的主要的媒介早期基因启动子元件是关于flu多肽的有效的表达系统（Foecking等人,1986,Gene45:101;andCockett等人,1990,Bio/Technology8:2）。在具体实施方式中，通过组成型启动子、诱导型启动子或组织特定的启动子调节编码本文中描述的flu多肽或依照本发明提供的方法产生的核苷酸序列的表达。
在细菌的系统中，可依赖用于被表达的flu多肽有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量的flu多肽时，关于flu多肽的药物学的组合物的生产，可期望指导容易地纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这样的载体包含，但不限于，大肠杆菌表达载体Pur278（Ruther等人,1983,EMBO12:1791），其中可在具有lacZ译码区域的框中单独地将flu多肽译码序列结合到载体上，以便生产融合蛋白；pIN载体（Inouye&Inouye,1985,NucleicAcidsRes.13:3101-3109;VanHeeke&Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503-5509）；等等。PGEX载体也可用于表达当作具有谷胱甘肽5-转移酶（GST）的融合蛋白的外源多肽。通常，这样的融合蛋白是可溶解的，且可通过吸收和结合基质谷胱甘肽琼脂糖珠上，之后在没有谷胱甘肽的情况下通过洗脱容易地纯化这样的融合蛋白。设计包括凝血酶或因子Xa蛋白酶断裂位点的pGEX载体，从而可从GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus）（AcNPV）被用作表达外源基因的载体。所述病毒在秋夜盗蛾细胞（Spodopterafrugiperdacells）中生长。可单独地将Flu多肽译码序列克隆到病毒的非必需的区域中（例如，多角体蛋白基因（polyhedringene））且在AcNPV启动子的控制下替代（例如，多角体启动子）。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒被用作表达载体的情况中，可将所关注的flu多肽译码序列结合到腺病毒转录/翻译控制复合体上，例如，晚期启动子（latepromoter）和三联体前导序列。然后可通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入到腺病毒基因组中。病毒基因组的不必需的区域中的插入（例如，区域E1或E3）将导致有生活力的和能够在感染的宿主细胞中表达flu多肽的重组病毒（例如，参见Logan&Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:355-359）。插入的flu多肽译码序列的有效的转录也可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。此外，起始密码子必需在对应于期望的译码序列的读码框的阶段中，以便确保完整的插入的翻译。这些外源性的翻译控制信号和起始密码子可以是许多来源的信号，自然的和合成的信号。可通过适当的转录增强子元件的内含物、转录终止密码子等增强表达效率（参见，例如，Bittner等人,1987,MethodsinEnzymol.153:51-544）。
另外，可选择调节插入的序列的表达，或以期望的特定的形式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。对于flu多肽的功能来说，蛋白质产物的这样的修饰（例如，糖基化）和加工（例如，分裂）是很重要的。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的遗传翻译后加工和修饰具有特有的和具体的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统，以便确保表达的异种蛋白的正确的修饰和加工。所以，可使用拥有适于基因产物的初级转录、糖基化、和磷酸化作用的正确的加工的细胞机器（cellularmachinery）的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包含但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、Vero、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D,NS0（不内源性地产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系）、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。
关于重组flu多肽的长期的、高产量生产，优选稳定的表达。例如，可设计稳定地表达flu多肽分子的细胞系。胜于利用含有病毒复制起点的表达载体，可利用由适当的表达控制元件（例如，启动子、增强子、序列、转录终止密码子、多聚腺苷酸化位点，等等），和可选择的标记物控制的DNA转化宿主细胞。在外源DNA的引入之后，可允许设计的细胞在富集的培养基中生长1-2天，然后转移到选择性的培养基上。重组质粒中的可选择的标记赋予选择性的抵抗，且允许细胞稳定地将质粒整合到它们的染色体中，以及培养细胞以便形成能依次被克隆和扩大为细胞系的聚集。这种方法可有利地用于设计表达flu多肽的细胞系。这样设计的细胞系可以是显著地用于组合物的筛选和评价，其中所述组合物直接地或间接地与flu多肽相互作用。通常本领域中已知的重组DNA技术的方法可常规地应用于选择期望的重组克隆，和例如，在Ausubel等人(eds.),CurrentProtocolsinMolecular Biology,JohnWiley&Sons,NY(1993);Kriegler,GeneTransferand Expression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990);和在Chapters12and13,Dracopoli等人(eds.),CurrentProtocolsinHumanGenetics,JohnWiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1中描述这样的方法，其全部内容结合于本文以供参考。
可通过载体扩增增加flu多肽的表达水平（对于评论，参见BebbingtonandHentschel,TheuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancellsinDNAcloning,Vol.3(AcademicPress,NewYork,1987)）。当在载体系统中表达flu多肽的标记物是可扩增的时，宿主细胞培养基中出现的抑制剂的水平的增加将增加标记基因拷贝的数目。因为扩增的区域与flu多肽联合，也会增加flu多肽的产物（Crouse等人,1983,Mol.Cell.Biol.3:257）。
当作利用宿主细胞的flu多肽的重组表达的可替换选项，利用，例如，T7启动子调控序列和T7聚合酶可在体外转录和翻译含有编码flu多肽的核酸的表达载体。在具体实施方式中，偶合的转录/翻译系统，如Promega或包括转录和翻译必需的成分的细胞裂解液或细胞提取物可用于生产flu多肽。
因此，本发明提供的是用于生产flu多肽的方法。在一种实施方式中，方法包括在适当的培养基中培养宿主细胞，以便生产多肽，其中所述宿主细胞含有编码多肽的核酸。在某些实施方式中，方法进一步包括从培养基或宿主细胞中分离多肽。
在某些实施方式中，可设计表达本文中描述的flu多肽的植物（例如，烟草类的植物）。在具体实施方式中，设计通过农杆菌渗入法（agroinfiltrationprocedure）利用本领域已知的方法表达本文中描述的flu多肽的植物。例如，可将编码所关注的基因的核酸，例如，编码本文中描述的flu多肽的基因引入农杆菌的菌株中。随后，在液体培养基中培养菌株且洗涤合成的细菌并将其悬浮于缓冲液中。然后将植物暴露于（例如，通过注射或浸没）包括编码本文中描述的flu多肽的核酸的农杆菌中，以便农杆菌将所关注的基因转变为植物细胞的部分。然后通过植物瞬时地表达flu多肽，且可利用本领域已知的和本文中描述的方法分离flu多肽。（对于具体的实例参考，Shoji等人,2008,Vaccine,26(23):2930-2934;和D’Aoust等人,2008,J.PlantBiotechnology,6(9):930-940）。在具体实施方式中，植物是烟草植物（例如，烟草（Nicotianatabacum））。在另一种具体实施方式中，植物是烟草植物的亲缘植物（例如，烟草本塞姆氏（Nicotianabenthamiana））。
在某些实施方式中，植物细胞培养系统用于flu多肽的表达。关于植物细胞和利用植物细胞培养系统生产蛋白质的方法，参见，例如，美国专利5,929,304;7,504,560;6,770,799;6,551,820;6,136,320;6,034,298;5,914,935;5,612,487;和5,484,719，美国专利申请Nos.2009/0208477、2009/0082548、2009/0053762、2008/0038232、2007/0275014和2006/0204487，以及Shoji等人,2008,Vaccine,26(23):2930-2934,andD’Aoust等人,2008,J.PlantBiotechnology,6(9):930-940（其全部内容结合于本文以供参考）。在具体实施方式中，设计表达flu多肽的胡萝卜细胞。在某些实施方式中，可设计表达flu多肽的海藻（例如，莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii））（参见，例如，Rasala等人,2010,PlantBiotechnologyJournal（在2010年3月7日发表，其全部内容结合于本文以供参考））。
5.3.3flu多肽的纯化
可通过本领域已知的关于多肽的纯化的任何方法，例如，通过色谱（例如，离子交换、亲和力、特别是在蛋白质A之后特定的抗原的亲和力，和筛分柱色谱）、离心过滤、微分溶解性、或通过关于蛋白质纯化的任何其他的标准的技术纯化本文中描述的和利用上述章节5.3.1和5.3.1中描述的途径产生的flu多肽。进一步地，可将flu多肽融合到本文中描述的异源的多肽序列或本领域中已知的以便促进纯化的其他多肽上。用于纯化具体的flu多肽的真实的条件将部分地取决于合成策略（例如，合成产品vs.重组产品）和取决于如flu多肽的静电荷、疏水性、和/或亲水性的因素，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。
5.4流感病毒载体
在一个方面中，本发明提供的是含有flu多肽的流感病毒。在具体实施方式中，flu多肽包括在流感病毒的病毒粒中。流感病毒可结合将病毒靶向特定的细胞类型的部分，如免疫细胞。在某些实施方式中，流感病毒的病毒粒已经包括在它们中，或除了flu多肽之外还表达异源的多肽。异源的多肽可以是具有免疫促进活性的多肽、或可以是将流感病毒靶向特定的细胞类型的多肽，如结合特定的细胞类型上的抗原的抗体或结合特定的细胞类型上的特定的受体的配体。
可通过在病毒粒的生产期间，利用本领域的每一个技术人员已知的技术，反向供应flu多肽生产含有flu多肽的流感病毒，如反向遗传学（reversegenetics）和无辅助质粒复原（helper-freeplasmidrescue）。可替换地，设计包括基因组的亲代的流感病毒，以便在易受病毒感染的细胞中表达flu多肽，其中反向提供血凝素功能，以便生产含有流感flu多肽的子代流感病毒。
在另一个方面中，本发明提供的是包括设计以便表达flu多肽的基因组的流感病毒。在具体实施方式中，设计编码flu多肽的亲代流感病毒的基因组，通过子代流感病毒表达所述基因组。在另一个具体实施方式中，设计编码flu多肽的亲代流感病毒的基因组，在子代流感病毒的病毒粒中表达所述基因组且包括所述基因组。因此，由亲代流感病毒的复制产生的子代流感病毒含有flu多肽。
在某些实施方式中，亲代病毒的病毒粒已经包括在异源性的多肽它们中。在某些实施方式中，设计编码异源多肽和流感病毒flu多肽的亲代流感病毒的基因组，通过子代流感病毒表达所述基因组。在具体实施方式中，流感flu多肽、异源的多肽或两者都包括在子代流感病毒的病毒粒中。
异源多肽可以是将流感病毒靶向特定的细胞类型的多肽，如识别特定的细胞类型上的抗原的抗体或结合特定的细胞类型上的特定的受体的配体。在某些实施方式中，靶向多肽取代病毒的靶细胞识别功能。在具体实施方式中，异源多肽将流感病毒靶向本质上感染流感病毒的相同的细胞类型。在其他具体实施方式中，异源多肽将子代流感病毒靶向免疫细胞，如B细胞、T细胞、巨噬细胞或树突细胞。在某些实施方式中，异源多肽识别和结合到抗原呈递细胞的的细胞特定的标记物上，如树突细胞（例如，如CD44）。在一种实施方式中，异源多肽是将病毒靶向树突细胞的DC-SIGN。在另一种实施方式中，异源多肽是将病毒靶向免疫细胞的抗体（例如，单链抗体），其可与另一个多肽的跨膜结构域融合，以便将其并入流感病毒病毒粒中。在某些实施方式中，抗体是CD20抗体、CD34抗体、或对DEC-205的抗体。用于设计表达具有靶向功能的多肽的病毒的技术是本领域已知的。参见，例如，Yang等人,2006,PNAS103:11479-11484和2008年1月24日公开的美国专利申请公开第20080019998号，以及2007年1月25日公开的美国专利申请公开第20070020238号，其中每一篇全部内容均结合于本文以供参考。
在另一种实施方式中，异源多肽是病毒吸附蛋白（viralattachmentprotein）。可用于这个方面的吸附蛋白的病毒的非限制性的实例选自组：拉沙热病毒（Lassafevervirus）、肝炎B病毒、狂犬病病毒（Rabiesvirus）、新城疫病毒（NDV）、逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒、蜱传脑炎病毒（tick-borneencephalitisvirus）、痘苗病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、甲病毒属（alphaviruses）如塞姆利基森林病毒（SemlikiForestvirus）、罗斯河病毒（RossRivervirus）、奥拉病毒（Auravirus）（其包括表面糖蛋白类如E1、E2、和E3）、玻那病毒（Bornadiseasevirus）、汉他病毒（Hantaanvirus）、泡沫病毒（foamyvirus）、和SARS冠状病毒的病毒。
在具体实施方式中，设计编码flu多肽和C型流感HEF蛋白的A型流感病毒，其中C型流感HEF蛋白取代A型流感神经氨酸酶（NA）蛋白质。
在一种实施方式中，可使用黄病毒属（flavivirus）表面糖蛋白类，如登革热病毒（DV）E蛋白质。在某些实施方式中，使用来自甲病毒属家族的辛德毕斯病毒（Sindbisvirus）糖蛋白类（K.S.Wang,R.J.Kuhn,E.G.Strauss,S.Ou,J.H.Strauss,J.Virol.66,4992(1992)）。在某些实施方式中，异源多肽来源于NDVHN或F蛋白；人类免疫缺陷病毒（HIV）gp160（或它的产物，如gp41或gp120）；肝炎B病毒表面抗原（HBsAg）；疱疹病毒的糖蛋白类（例如，gD，gE）；或脊髓灰质炎病毒的VP1。
在另一种实施方式中，异源多肽来源于本领域已知的任何非-病毒的靶向系统。在某些实施方式中，使用非-病毒病原体如细胞内细菌或原生动物的蛋白质。在某些实施方式中，由例如，衣原体、立克次氏体（Rikettsia）、立克次体（Coxiella）、李斯特菌（Listeria）、布鲁氏菌、或军团菌（Legionella）提供细菌多肽。在某些实施方式中，例如，由疟原虫种类（Plasmodiaspecies）、利什曼原虫、弓形虫、或美洲锥虫（Trypanosomacruzi）提供原生动物多肽。在Waehler等人,2007,“Engineeringtargetedviralvectorsforgenetherapy,”NatureReviewsGenetics8:573-587中描述其他典型的靶向系统，其全部内容包括在此以供参考。
在某些实施方式中，由流感病毒表达的异源多肽具有免疫增强（免疫刺激）活性。免疫增强多肽的非限制性的实例包含，但不限于，刺激分子、细胞因子、趋化因子、抗体和其他试剂如Flt-3配体。具有免疫增强活性的多肽的具体的实例包括：干扰素类型1、α、β、或γ干扰素、集落刺激因子如粒性白细胞-巨噬细胞集落-刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子（TNF）-β、TNFα.、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配体（CD40L）、和药物-可诱导的CD40（iCD40）（参见，例如，Hanks,B.A.,等人，2005.NatMed11:130-137，其全部内容结合于本文以供参考）。
因为A型和B型流感病毒的基因组由八个（8）单股的、负义片段（negativesensesegment）组成（C型流感病毒由七个（7）单股的、负义片段组成），可利用重组部分和本领域技术人员已知的技术，如反向遗传学和无辅助质粒复原设计表达flu多肽（和任何其他多肽，如异源多肽）的亲本流感病毒的基因组。一种实施方式中，重组部分包括编码flu多肽的核酸和vRNAs的正确的复制、转录和组装需要的3’和5’的掺入信号（Gao等人,2010,J.ofVirology84:8062-8074,Fujii等人,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:2002-2007;Zheng等人,1996,Virology217:242-251,和PCT/US2010/043697，其全部内容结合于本文以供参考）。在某些实施方式中，编码flu多肽的重组部分可取代亲本流感病毒的HA部分。在某些实施方式中，编码flu多肽的重组部分可取代亲本流感病毒的NS1基因。在某些实施方式中，编码flu多肽的重组部分可取代亲本流感病毒的NA基因。可用于表达flu多肽的典型的流感病毒株包含AnnArbor/1/50、A/PuertoRico/8/34、A/SouthDakota/6/2007、A/乌拉圭/716/2007、和B/Brisbane/60/2008。
在某些实施方式中，可利用双顺反子的重组部分设计表达flu多肽的亲本流感病毒的基因组。双顺贩子技术允许通过内部核糖体进入位点（IRES）序列将多种蛋白质的译码序列设计成为单一的mRNA。IRES序列指导RNA分子的核糖体的内部补充，和以帽型独立的方式允许下游的翻译。简要地，将一个蛋白质的译码区域插入到第二个蛋白质的开放阅读框（ORF）中。由IRES和正确的表达和/或功能必需的任何未翻译的信号序列位于插入的两侧。插入必需不能破坏第二个蛋白质的ORF、多聚腺苷酸化或转录启动子（参见，例如，García-Sastre等人,1994,J.Virol.68:6254-6261和García-Sastre等人,1994Dev.Biol.Stand.82:237-246，其每一个全部内容都包括在此以供参考）。还参见，例如，美国专利第6,887,699第、美国专利第6,001,634第、美国专利第5,854,037号和美国专利第5,820,871号，其每一篇的全部内容均结合于本文以供参考。根据本发明，可使用本领域已知的或本文中描述的任何IRES（例如，Bip基因的IRES、基因库数据库入口HUMGRP78的核苷酸372至592；或脑心肌炎病毒（EMCV）的IRES，基因库数据库入口CQ867238的核苷酸1430-2115.）。因此，在某些实施方式中，设计含有表达flu多肽和另外的多肽的双顺反子RNA部分的亲本流感病毒，如由亲本流感病毒表达的基因。
可利用本领域技术人员已知的技术来生产含有flu多肽的流感病毒和包括设计以便表达flu多肽的基因组的流感病毒。例如，反向遗传学技术可用于产生这样的流感病毒。简言之，反向遗传学技术通常涉及合成的重组病毒RNAs的制备，其含有对病毒聚合酶识别和产生成熟的病毒粒必需的组装信号必不可少的负链、病毒RNA的非译码区域。从重组DNA模板合成重组RNAs，和在体外利用纯化的病毒聚合酶复合体重组，以便形成可用于转染细胞的重组核蛋白（RNPs）。如果在体外或体内合成的RNAs的转录期间出现病毒聚合酶蛋白，则可达到更有效的转染。可感染性病毒颗粒复原合成的重组RNPs。1992年11月24日公开的美国专利第5,166,057号；1998年12月29日公开的美国专利第5,854,037号；1996年2月20日公开的欧洲专利申请EP0702085A1；美国专利继续申请第09/152,845号；1997年4月3日公开的国际专利公开PCTWO97/12032；1996年11月7日公开的WO96/34625；欧洲专利申请EPA780475；1999年1月21日公开的WO99/02657；1998年11月26日公开的WO98/53078中，1998年1月22日公开的WO98/02530；1999年4月1日公开的WO99/15672；1998年4月2日公开的WO98/13501；1997年2月20日公开的WO97/06270；以及1997年6月25日公开的EPO780475A1中均描述了前述技术，其全部内容结合于本文以供参考。
可替换地，无辅助质粒技术可用于生产含有flu多肽的流感病毒和/或包括设计以便表达flu多肽的基因组的流感病毒。简要地，以包含独特的限制性位点的引物，利用PCR扩增病毒部分的全长cDNAs，其允许PCR产物插入到质粒载体中（Flandorfer等人,2003,J.Virol.77:9116-9123;Nakaya等人,2001,J.Virol.75:11868-11873；两者的全部内容均结合于本文以供参考）。设计所述质粒载体，以便表达精确的负的（vRNA意义）转录。例如，可设计质粒载体，以便在截短的人类RNA聚合酶I启动子和肝炎δ病毒核糖核酸酶序列之间定位PCR产物，以便从聚合酶I启动子生产精确的负的（vRNA意义）转录。可将包括每一个病毒部分的单独的质粒载体和包括必要的病毒蛋白质的表达载体转染到引起重组病毒颗粒生产的细胞中。在另一种实施方式中，可使用病毒染色体组RNA和mRNA来自的质粒载体，其中所述染色体组RNA和mRNA编码表达必要的病毒蛋白质。关于无辅助质粒技术的详细的描述参见，例如，国际公开第WO01/04333号；美国专利6,951,754、7,384,774、6,649,372,和7,312,064；Fodor等人,1999,J.Virol.73:9679-9682；Quinlivan等人,2005,J.Virol.79:8431-8439；Hoffmann等人,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6108-6113；和Neumann等人,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9345-9350，其全部内容均结合于本文以供参考。
按根据本文描述的方法，可在允许病毒生长到准许它们的应用的滴度的任何培养基中繁殖本文中描述的流感病毒。在一种实施方式中，所述培养基允许病毒增长到可与为相应的野生型病毒测定的那些相比较的滴度。在某些实施方式中，所述培养基是生物学上与流感病毒有关的一种培养基。在具体实施方式中，可在IFN-缺乏的培养基中繁殖由于例如，NSI基因中的突变，使病毒减弱的流感病毒。例如，适当的IFN-缺乏的培养基可以是在生产或对干扰素响应的能力中有缺陷的一种培养基，或是IFN-缺乏的培养基可用于需要干扰素-缺乏的生长的环境的许多病毒的生长的一种培养基。参见例如，2003年6月3日公开的美国专利6,573,079、2005年2月8日公开的美国专利6,852,522、2009年2月24日公开的美国专利7,494,808，其中每一篇的全部内容均结合于本文以供参考。
可通过本领域技术人员已知的任何方法分离和纯化本文中描述的流感病毒。在一种实施方式中，一般通过已知的纯化程序，例如，梯度离心和柱色谱，从细胞培养基中清除病毒和从细胞成分中分离病毒，和如期望的，利用本领域技术人员已知的程序，例如，空斑试验（plaqueassays）可进一步纯化病毒。
在某些实施方式中，从A型流感病毒中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。在某些实施方式中，从A型流感病毒亚型或菌株中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。在其他实施例中，从两个或更多A型流感病毒亚型或菌株中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。
在某些实施方式中，从B型流感病毒中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。在某些实施方式中，从单一的B型流感病毒亚型或菌株中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。在其他实施例中，从两个或更多B型流感病毒亚型或菌株中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。在其他实施例中，从流感A和B型流感病毒亚型或菌株的组合中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。
在某些实施方式中，从流感C病毒中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。在某些实施方式中，从单一的流感C病毒亚型或菌株中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。在其他实施例中，从两个或更多流感C病毒亚型或菌株中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。在其他实施例中，从流感C病毒和A型流感病毒和/或B型流感病毒亚型或菌株的组合中获得或得到本文中描述的用于应用的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组部分。
A型流感病毒的非限制性实例包括亚型H10N4、亚型H10N5、亚型H10N7、亚型H10N8、亚型H10N9、亚型H11N1、亚型H11N13、亚型H11N2、亚型H11N4、亚型H11N6、亚型H11N8、亚型H11N9、亚型H12N1、亚型H12N4、亚型H12N5、亚型H12N8、亚型H13N2、亚型H13N3、亚型H13N6、亚型H13N7、亚型H14N5、亚型H14N6、亚型H15N8、亚型H15N9、亚型H16N3、亚型H1N1、亚型H1N2、亚型H1N3、亚型H1N6、亚型H1N9、亚型H2N1、亚型H2N2、亚型H2N3、亚型H2N5、亚型H2N7、亚型H2N8、亚型H2N9、亚型H3N1、亚型H3N2、亚型H3N3、亚型H3N4、亚型H3N5、亚型H3N6、亚型H3N8、亚型H3N9、亚型H4N1、亚型H4N2、亚型H4N3、亚型H4N4、亚型H4N5、亚型H4N6、亚型H4N8、亚型H4N9、亚型H5N1、亚型H5N2、亚型H5N3、亚型H5N4、亚型H5N6、亚型H5N7、亚型H5N8、亚型H5N9、亚型H6N1、亚型H6N2、亚型H6N3、亚型H6N4、亚型H6N5、亚型H6N6、亚型H6N7、亚型H6N8、亚型H6N9、亚型H7N1、亚型H7N2、亚型H7N3、亚型H7N4、亚型H7N5、亚型H7N7、亚型H7N8、亚型H7N9、亚型H8N4、亚型H8N5、亚型H9N1、亚型H9N2、亚型H9N3、亚型H9N5、亚型H9N6、亚型H9N7、亚型H9N8、和亚型H9N9。
A型流感病毒的菌株的具体实例包括，但不限于：A/sw/爱荷华州/15/30(H1N1);A/WSN/33(H1N1);A/eq/布拉格/1/56(H7N7);A/PR/8/34;A/野鸭/Potsdam/178-4/83(H2N2);A/herringgull/DE/712/88(H16N3);A/sw/香港/168/1993(H1N1);A/野鸭/阿尔伯塔/211/98(H1N1);A/shorebird/Delaware/168/06(H16N3);A/sw/荷兰/25/80(H1N1);A/sw/德国/2/81(H1N1);A/sw/汉诺威/1/81(H1N1);A/sw/Potsdam/1/81(H1N1);A/sw/Potsdam/15/81(H1N1);A/sw/Potsdam/268/81(H1N1);A/sw/Finistere/2899/82(H1N1);A/sw/Potsdam/35/82(H3N2);A/sw/Coted'Armor/3633/84(H3N2);A/sw/Gent/1/84(H3N2);A/sw/荷兰/12/85(H1N1);A/sw/Karrenzien/2/87(H3N2);A/sw/Schwerin/103/89(H1N1);A/turkey/德国/3/91(H1N1);A/sw/德国/8533/91(H1N1);A/sw/比利时/220/92(H3N2);A/sw/Gent/V230/92(H1N1);A/sw/Leipzig/145/92(H3N2);A/sw/Re220/92hp(H3N2);A/sw/Bakum/909/93(H3N2);A/sw/Schleswig-Holstein/1/93(H1N1);A/sw/Scotland/419440/94(H1N2);A/sw/Bakum/5/95(H1N1);A/sw/Best/5C/96(H1N1);A/sw/英格兰/17394/96(H1N2);A/sw/Jena/5/96(H3N2);A/sw/Oedenrode/7C/96(H3N2);A/sw/Lohne/1/97(H3N2);A/sw/Coted'Armor/790/97(H1N2);A/sw/Bakum/1362/98(H3N2);A/sw/意大利/1521/98(H1N2);A/sw/意大利/1553-2/98(H3N2);A/sw/意大利/1566/98(H1N1);A/sw/意大利/1589/98(H1N1);A/sw/Bakum/8602/99(H3N2);A/sw/Cotesd'Armor/604/99(H1N2);A/sw/Coted'Armor/1482/99(H1N1);A/sw/Gent/7625/99(H1N2);A/香港/1774/99(H3N2);A/sw/香港/5190/99(H3N2);A/sw/香港/5200/99(H3N2);A/sw/香港/5212/99(H3N2);A/sw/IlleetVillaine/1455/99(H1N1);A/sw/意大利/1654-1/99(H1N2);A/sw/意大利/2034/99(H1N1);A/sw/意大利/2064/99(H1N2);A/sw/Berlin/1578/00(H3N2);A/sw/Bakum/1832/00(H1N2);A/sw/Bakum/1833/00(H1N2);A/sw/Coted'Armor/800/00(H1N2);A/sw/香港/7982/00(H3N2);A/sw/意大利/1081/00(H1N2);A/sw/Belzig/2/01(H1N1);A/sw/Belzig/54/01(H3N2);A/sw/香港/9296/01(H3N2);A/sw/香港/9745/01(H3N2);A/sw/西班牙/33601/01(H3N2);A/sw/香港/1144/02(H3N2);A/sw/香港/1197/02(H3N2);A/sw/西班牙/39139/02(H3N2);A/sw/西班牙/42386/02(H3N2);A/瑞士/8808/2002(H1N1);A/sw/Bakum/1769/03(H3N2);A/sw/Bissendorf/IDT1864/03(H3N2);A/sw/Ehren/IDT2570/03(H1N2);A/sw/Gescher/IDT2702/03(H1N2);A/sw/Haselünne/2617/03hp(H1N1);A/sw//IDT2530/03(H1N2);A/sw/IVD/IDT2674/03(H1N2);A/sw/Nordkirchen/IDT1993/03(H3N2);A/sw/Nordwalde/IDT2197/03(H1N2);A/sw/Norden/IDT2308/03(H1N2);A/sw/西班牙/50047/03(H1N1);A/sw/西班牙/51915/03(H1N1);A/sw/Vechta/2623/03(H1N1);A/sw/Visbek/IDT2869/03(H1N2);A/sw/Waltersdorf/IDT2527/03(H1N2);A/sw/Damme/IDT2890/04(H3N2);A/sw/Geldern/IDT2888/04(H1N1);A/sw/Granstedt/IDT3475/04(H1N2);A/sw/Greven/IDT2889/04(H1N1);A/sw/Gudensberg/IDT2930/04(H1N2);A/sw/Gudensberg/IDT2931/04(H1N2);A/sw/Lohne/IDT3357/04(H3N2);A/sw/Nortrup/IDT3685/04(H1N2);A/sw/Seesen/IDT3055/04(H3N2);A/sw/西班牙/53207/04(H1N1);A/sw/西班牙/54008/04(H3N2);A/sw/Stolzenau/IDT3296/04(H1N2);A/sw/Wedel/IDT2965/04(H1N1);A/sw/BadGriesbach/IDT4191/05(H3N2);A/sw/Cloppenburg/IDT4777/05(H1N2);A/sw//IDT3780/05(H1N2);A/sw//IDT4735/05(H1N2);A/sw/Egglham/IDT5250/05(H3N2);A/sw/Harkenblek/IDT4097/05(H3N2);A/sw/Hertzen/IDT4317/05(H3N2);A/sw/Krogel/IDT4192/05(H1N1);A/sw/Laer/IDT3893/05(H1N1);A/sw/Laer/IDT4126/05(H3N2);A/sw/Merzen/IDT4114/05(H3N2);A/sw/Muesleringen-S./IDT4263/05(H3N2);A/sw/Osterhofen/IDT4004/05(H3N2);A/sw/Sprenge/IDT3805/05(H1N2);A/sw/Stadtlohn/IDT3853/05(H1N2);A/sw/Voglarn/IDT4096/05(H1N1);A/sw/Wohlerst/IDT4093/05(H1N1);A/sw/BadGriesbach/IDT5604/06(H1N1);A/sw/Herzlake/IDT5335/06(H3N2);A/sw/Herzlake/IDT5336/06(H3N2);A/sw/Herzlake/IDT5337/06(H3N2);和A/野猪/德国/R169/2006(H3N2)。
A型流感病毒的病毒株的其他具体实例包括，但不限于：A/Toronto/3141/2009(H1N1)；A/Regensburg/D6/2009(H1N1);A/Bayern/62/2009(H1N1);A/Bayern/62/2009(H1N1);A/Bradenburg/19/2009(H1N1);A/Bradenburg/20/2009(H1N1);A/DistritoFederal/2611/2009(H1N1);A/MatoGrosso/2329/2009(H1N1);A/SaoPaulo/1454/2009(H1N1);A/SaoPaulo/2233/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/37/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/41/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/45/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-1/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-14/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-2/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-21/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-22/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-23/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-24/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-25/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-3/2009(H1N1);A/swine/阿尔伯塔/OTH-33-7/2009(H1N1);A/北京/502/2009(H1N1);A/Firenze/10/2009(H1N1);A/香港/2369/2009(H1N1);A/意大利/85/2009(H1N1);A/SantoDomingo/572N/2009(H1N1);A/Catalonia/385/2009(H1N1);A/Catalonia/386/2009(H1N1);A/Catalonia/387/2009(H1N1);A/Catalonia/390/2009(H1N1);A/Catalonia/394/2009(H1N1);A/Catalonia/397/2009(H1N1);A/Catalonia/398/2009(H1N1);A/Catalonia/399/2009(H1N1);A/SaoPaulo/2303/2009(H1N1);A/Akita/1/2009(H1N1);A/Castro/JXP/2009(H1N1);A/Fukushima/1/2009(H1N1);A/以色列/276/2009(H1N1);A/以色列/277/2009(H1N1);A/以色列/70/2009(H1N1);A/Iwate/1/2009(H1N1);A/Iwate/2/2009(H1N1);A/Kagoshima/1/2009(H1N1);A/大阪/180/2009(H1N1);A/PuertoMontt/Bio87/2009(H1N1);A/SaoPaulo/2303/2009(H1N1);A/Sapporo/1/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/30/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/31/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/32/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/33/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/34/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/35/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/36/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/38/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/39/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/40/2009(H1N1;)A/斯德哥尔摩/42/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/43/2009(H1N1);A/斯德哥尔摩/44/2009(H1N1);A/Utsunomiya/2/2009(H1N1);A/WRAIR/0573N/2009(H1N1);和A/浙江/DTID-ZJU01/2009(H1N1)。
B型流感病毒的非限制性实例包括Aichi/5/88株、Akita/27/2001株、Akita/5/2001株、阿拉斯加/16/2000株、阿拉斯加/1777/2005株、Argentina/69/2001株、Arizona/146/2005株、Arizona/148/2005株、曼谷/163/90株、曼谷/34/99株、曼谷/460/03株、曼谷/54/99株、Barcelona/215/03株、北京/15/84株、北京/184/93株、北京/243/97株、北京/43/75株、北京/5/76株、北京/76/98株、比利时/WV106/2002株、比利时/WV107/2002株、比利时/WV109/2002株、比利时/WV114/2002株、比利时/WV122/2002株、波昂/43株、巴西/952/2001株、Bucharest/795/03株、BuenosAires/161/00株、BuenosAires/9/95株、BuenosAires/SW16/97株、BuenosAires/VL518/99株、加拿大/464/2001株、加拿大/464/2002株、Chaco/366/00株、Chaco/R113/00株、Cheju/303/03株、Chiba/447/98株、重庆/3/2000株、SA1泰国/2002临床分离株、SA10泰国/2002临床分离株、SA100菲律宾/2002临床分离株、SA101菲律宾/2002临床分离株、SA110菲律宾/2002临床分离株、SA112菲律宾/2002临床分离株、SA113菲律宾/2002临床分离株、SA114菲律宾/2002临床分离株、SA2泰国/2002临床分离株、SA20泰国/2002临床分离株、SA38菲律宾/2002临床分离株、SA39泰国/2002临床分离株、SA99菲律宾/2002临床分离株、CNIC/27/2001株、科罗拉多州/2597/200株、Cordoba/VA418/99株、捷克/16/89株、捷克/69/90株、Daeku/10/97株、Daeku/45/97株、Daeku/47/97株、Daeku/9/97株、B/Du/4/78株、B/德班/39/98株、德班/43/98株、德班/44/98株、B/德班/52/98株、德班/55/98株、德班/56/98、英格兰/1716/2005、英格兰/2054/2005、英格兰/23/04株、芬兰/154/2002株、芬兰/159/2002株、芬兰/160/2002株、芬兰/161/2002株、芬兰/162/03株、芬兰/162/2002株、芬兰/162/91株、芬兰/164/2003株、芬兰/172/91株、芬兰/173/2003株、芬兰/176/2003株、芬兰/184/91株、芬兰/188/2003株、芬兰/190/2003株、芬兰/220/2003株、芬兰/WV5/2002株、福建/36/82株、Geneva/5079/03株、Genoa/11/02株、Genoa/2/02株、Genoa/21/02株、日内瓦/54/02株、日内瓦/55/02株、广东/05/94株、广东/08/93株株、广东/5/94株、广东/55/89株、广东/8/93株、广州/7/97株、广州/86/92株、广州/87/92株、Gyeonggi/592/2005株、汉诺威/2/90株、哈尔滨/07/94株、夏威夷/10/2001株、夏威夷/1990/2004株、夏威夷/38/2001株、夏威夷/9/2001株、河北/19/94株、河北/3/94株、河南/22/97株、广岛/23/2001株、香港/110/99株、香港/1115/2002株、香港/112/2001株、香港/123/2001、香港/1351/2002、香港/1434/2002株、香港/147/99株、香港/156/99株、香港/157/99株、香港/22/2001株、香港/22/89株、香港/336/2001株、香港/666/2001株、香港/9/89株、休斯顿/1/91株、休斯顿/1/96株、休斯顿/2/96株、湖南/4/72株、伊比利亚/2/85株、ncheon/297/2005株、印度/3/89株、印度/77276/2001株、以色列/95/03株、以色列/WV187/2002株、日本/1224/2005株、江苏/10/03株、约翰内斯堡/1/99株、约翰内斯堡/96/01株、Kadoma/1076/99株、Kadoma/122/99株、Kagoshima/15/94株、堪萨斯州/22992/99株、Khazkov/224/91、Kobe/1/2002株、Kouchi/193/99株、Lazio/1/02株、Lee/40株、列宁格勒/129/91株、Lissabon/2/90株、洛杉矶/1/02株、卢萨卡/270/99、Lyon/1271/96、马来西亚/83077/2001株、Maputo/1/99株、MardelPlata/595/99株、马里兰州/1/01株、孟斐斯/1/01株、Memphis/12/97-MA株、密歇根州/22572/99株、Mie/1/93株、米兰/1/01、明斯克/318/90、莫斯科/3/03、Nagoya/20/99株、南昌/1/00株、Nashville/107/93、Nashville/45/91株、内布拉斯加州/2/01株、荷兰/801/90株、荷兰/429/98株、纽约/1/2002、NIB/48/90株、宁夏/45/83株、挪威/1/84株、阿曼/16299/2001株、大阪/1059/97株、大阪/983/97-V2株、奥斯陆/1329/2002株、Oslo/1846/2002株、巴拿马/45/90株、巴黎/329/90株、Parma/23/02株、Perth/211/2001株、秘鲁/1364/2004株、菲律宾/5072/2001株、釜山/270/99株、魁北克/173/98株、魁北克/465/98株、魁北克/7/01株、Roma/1/03、Saga/S172/99株、首尔/13/95、首尔/37/91株、山东/7/97、上海/361/2002株、Shiga/T30/98株、四川/379/99、新加坡/222/79株、西班牙/WV27/2002株、斯德哥尔摩/10/90、瑞士/5441/90株、台湾/0409/00、台湾/0722/02、台湾/97271/2001株、德黑兰/80/02株、东京/6/98、Trieste/28/02株、UlanUde/4/02、英国/34304/99、USSR/100/83、维多利亚/103/89、维也纳/1/99、武汉/356/2000、WV194/2002株、宣武/23/82株、Yamagata/1311/2003株、Yamagata/K500/2001株、阿拉斯加/12/96株、GA/86株、长崎/1/87株、东京/942/96株、和罗切斯特/02/2001株。
流感C病毒的非限制性实例包括Aichi/1/81株、AnnArbor/1/50株、Aomori/74株、加利福尼亚/78株、英格兰/83株、希腊/79株、广岛/246/2000株、广岛/252/2000株、Hyogo/1/83株、约翰内斯堡/66株、神奈川/1/76株、菌京都/1/79株、密西西比/80株、Miyagi/1/97株、Miyagi/5/2000株、Miyagi/9/96株、Nara/2/85株、新泽西/76株、猪/北京/115/81株、Saitama/3/2000株、Shizuoka/79株、Yamagata/2/98株、Yamagata/6/2000株、Yamagata/9/96株、BERLIN/1/85株、菌英格兰/892/8株、GREATLAKES/1167/54株、JJ/50株、猪/北京/10/81株、猪/北京/439/82株、TAYLOR/1233/47株、和C/YAMAGATA/10/81株。
在某些实施方式中，发明提供的是已经减毒的表型流感病毒。在具体实施方式中，减毒的流感病毒是以A型流感病毒为基础的。在其他实施例中，减毒的流感病毒是以B型流感病毒为基础的。在还有的其他实施例中，减毒的流感病毒是以C型流感病毒为基础的。在其他实施例中，减毒的流感病毒可包括来自A型流感、B型流感、和/或C型流感病毒的一个或更多菌株或亚型的基因或基因组部分。在某些实施方式中，减毒的骨架病毒包括来自A型流感病毒和B型流感病毒的基因。
在具体实施方式中，期望流感病毒的减毒，以便病毒，至少部分地保留感染性的且可在体内复制，但是只产生低的滴度，其导致临床症状不显的非病原的感染的水平。这样的减毒的病毒特别适合于本文中描述的实施例，其中将病毒或它的免疫原性的组合物给予受试者，以便诱导免疫应答。可依照本领域已知的任何方法实现流感病毒的减毒，如，例如，由化学诱变产生的选择性的病毒突变体、通过遗传工程产生的基因组的突变、包含具有减毒的功能的部分的选择性的重配株病毒（reassortantviruses）、条件选择性的病毒突变体（例如，适应寒冷的病毒）。可替换地，可将天然存在的减毒的流感病毒用作流感病毒载体的流感病毒骨架。
在某些实施方式中，可通过设计流感病毒，以便表达突变的NS1基因，至少部分地使流感病毒的毒性减弱，其中突变的NS1基因削弱病毒对抗细胞干扰素（IFN）响应的能力。可引入流感病毒NS1基因的突变的类型的实例包含缺失、取代、插入和它们的组合。可将一个或更多个突变引入遍及NS1基因的任何地方（例如，N-末端、C-末端或之间的某些地方）和/或NS1基因的调控元件中。在一种实施方式中，减毒的流感病毒包括在流感病毒NS1基因中具有突变的基因组，导致由来自NS1的C-末端的5个，优选地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基组成的缺失，或来自C-末端的5-170、25-170、50-170、100-170、100-160、或105-160个氨基酸残基的缺失。在另一种实施方式中，减毒的流感病毒包括在流感病毒NS1基因中具有突变的基因组，以便其编码氨基酸残基1-130、氨基酸残基1-126、氨基酸残基1-120、氨基酸残基1-115、氨基酸残基1-110、氨基酸残基1-100、氨基酸残基1-99、氨基酸残基1-95、氨基酸残基1-85、氨基酸残基1-83、氨基酸残基1-80、氨基酸残基1-75、氨基酸残基1-73、氨基酸残基1-70、氨基酸残基1-65、或氨基酸残基1-60的NS1蛋白质，其中N-末端氨基酸是数字1。在另一种实施方式中，基于PR8病毒计算NS1的氨基酸残基。关于NS1突变体和包括突变的NS1的流感病毒的实例，参见，例如，美国专利第6,468,544号和第6,669,943号；以及Li等人,1999,J.Infect.Dis.179:1132-1138，其中每一篇的全部内容均结合于本文以供参考。
5.5非流感病毒载体
在一个方面，本发明提供的是含有flu多肽的非流感病毒。在具体实施方式中，非流感病毒的病毒粒包含flu多肽。非流感病毒可结合将病毒靶向特定的细胞类型的部分，例如免疫细胞。在某些实施方式中，它们包括非流感病毒的病毒粒，或除了flu多肽之外表达异源多肽。异源多肽可以是具有免疫增强活性的多肽，或可以是将非流感病毒靶向具体的细胞类型的多肽，如识别特定的细胞类型上的抗原的抗体或结合特定的细胞类型上的特定的受体的配体。关于这样的异源多肽的实例，参见上述的章节5.4。
可利用本领域的一个技术人员已知的技术，在病毒粒的生产期间，通过反向（intrans）提供flu多肽生产含有flu多肽的非流感病毒。可替换地，亲代非流感病毒包括设计以便在易于感染病毒的细胞中表达flu多肽的基因组，其中反向提供血凝素功能，以便生产含有流感flu多肽的子代病毒。
包含，但不限于，天然地存在的菌株、变体或突变体、诱变处理的病毒、基因重组体（reassortants）和/或遗传地修饰的病毒的任何病毒类型、亚型或菌株可被用作非流感病毒载体。在具体实施方式中，亲本非流感病毒不是天然地存在的病毒。在另一种具体实施方式中，亲本非流感病毒是遗传工程的病毒。在某些实施方式中，关于本文中描述的膜结合的flu多肽的表达，优选包膜的病毒。
在一种典型的实施方式中，非流感病毒载体是新城疫病毒（NDV）。在另一种实施方式中，非流感病毒载体是痘苗病毒。在其他典型的、非限制性的实施例中，非流感病毒载体是腺病毒、腺相关病毒（AAV）、肝炎B病毒、逆转录酶病毒（如，例如，γ逆转录病毒如鼠干细胞病毒（MSCV）染色体组或鼠白血病病毒（MLV），例如，莫洛尼鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus）、致癌反转录病毒（oncoretrovirus）、或慢病毒（lentivirus））、甲病毒属（例如，委内瑞拉马脑炎病毒）、杆状病毒，如，疱疹性口炎病毒或乳头瘤病毒（papillomaviruses）、痘病毒（如，例如，痘苗病毒、MVA-T7载体、或鸟痘）、间质肺炎病毒（metapneumovirus）、麻疹病毒（measlesvirus）、疱疹病毒，如单纯疱疹病毒、或泡沫病毒。参见，例如，LawrieandTumin,1993,Cur.Opin.Genet.Develop.3,102-109（反转录病毒载体（retroviralvectors））；Bett等人,1993,J.Virol.67,5911（腺病毒载体）；Zhou等人,1994,J.Exp.Med.179,1867（腺病毒伴随的病毒载体）；Dubensky等人,1996,J.Virol.70,508-519（来自包括痘苗病毒和鸟类痘病毒的痘家族的病毒载体和来自甲状病毒属如来源于辛德毕斯病毒和塞姆利基森林病毒（SemlikiForestViruses）的病毒载体）；美国专利第5,643,576号（委内瑞拉马脑炎病毒）；WO96/34625（VSV）；Ohe等人,1995,HumanGeneTherapy6,325-333；Woo等人,WO94/12629；Xiao&Brandsma,1996,NucleicAcids.Res.24,2630-2622（乳突病毒）；和BukreyevandCollins,2008,CurrOpinMolTher.10:46-55（NDV），其中每一篇的全部内容均结合于本文以供参考。
在具体实施方式中，非流感病毒载体是NDV。可用作设计以便表达flu多肽的骨架的任何NDV类型、亚型或菌株包含，但不限于，天然地存在的菌株、变体或突变体、诱变处理的病毒、基因重组体和/或遗传工程病毒。在具体实施方式中，用作遗传工程的骨架的NDV是天然地存在的菌株。在某些实施方式中，用作遗传工程的骨架的NDV是溶胞菌株。在其他实施例中，用作遗传工程的骨架的NDV是非溶胞菌株。在某些实施方式中，用作遗传工程的骨架的NDV是轻毒性菌株（lentogenicstrain）。在某些实施方式中，用作遗传工程的骨架的NDV是中毒性株（mesogenicstrain）。在其他实施例中，用作遗传工程的骨架的NDV是强毒性菌株（velogenicstrain）。NDV菌株的具体的实例包含，但不限于，73-T菌株、Ulster菌株、MTH-68菌株、Italien菌株、Hickman菌株、PV701菌株、HitchnerB1菌株、LaSota菌株、YG97菌株、MET95菌株、和F48E9菌株。在具体实施方式中，用作遗传工程的骨架的NDV是HitchnerB1菌株。在另一个具体实施方式中，用作遗传工程的NDV是LaSota菌株。
在一种实施方式中，作为非流感病毒主要载体的NDV，设计用于表达修饰的F蛋白质，其中利用含有一个或两个额外的精氨酸残基的一个残基取代F蛋白的断裂位点，允许通过普遍地表达的弗林蛋白酶家族（furinfamily）的蛋白酶激活突变断裂位点。表达这样的修饰的F蛋白质的NDVs的具体的实例包括，但不限于，rNDV/F2aa和rNDV/F3aa。关于利用突变的断裂位点将突变引入NDVF蛋白质以便生产修饰的F蛋白质的描述，参见，例如，Park等人(2006)“Engineeredviralvaccineconstructswithdualspecificity:AvianinfluenzaandNewcastledisease.”PNASUSA103:8203-2808，其全部内容结合于本文以供参考。
在一种实施方式中，非流感病毒载体是痘病毒。痘病毒载体可以痘病毒科的任何成员为基础，具体地，为疫苗载体提供适当的序列的痘苗病毒或禽痘病毒（例如，金丝雀痘（canarypox）、鸟痘等等）。在一种具体实施方式中，痘病毒载体是痘苗病毒载体。适当的痘苗病毒包括，但不限于，哥本哈根（VC-2）菌株（Goebel等人,Virol179:247-266,1990;Johnson等人,Virol.196:381-401,1993）、修饰的哥本哈根菌株（NYVAC）（美国专利No.6,265,189）、WYETH菌株和修饰的安卡拉（MVA）菌株（Antoine等人,Virol.244:365-396,1998）。其他适当的痘病毒包含鸟痘菌株如ALVAC和TROVAC载体，其具有期望的性能且高度地使病毒毒性减弱（参见，例如，美国专利No.6,265,189；Tartaglia等人,InAIDSResearchReviews,Koff,等人,eds.,Vol.3,MarcelDekker,N.Y.,1993;和Tartaglia等人,1990,ReviewsinImmunology10:13-30,1990）
设计表达flu多肽的非流感病毒的方法是本领域已知的，如用于减弱病毒、繁殖、和分离和纯化这样的病毒的方法。对于关于NDV载体的这样的技术，参见，例如，国际出版物No.WO01/04333；美国专利第7,442,379号、第6,146,642号、第6,649,372号、第6,544,785号和第7,384,774号；Swayne等人(2003).AvianDis.47:1047-1050；和Swayne等人(2001).J.Virol.11868-11873，其种每一篇的全部内容均结合于本文以供参考。对于关于痘病毒的技术，参见，例如，Piccini等人,MethodsofEnzymology153:545-563,1987；国际公开第WO96/11279号；美国专利第4,769,330号；美国专利第4,722,848号；美国专利第4,769,330号；美国专利第4,603,112号；美国专利第5,110,587号；美国专利第5,174,993号；EP83286；EP206920；Mayr等人,Infection3:6-14,1975；和SutterandMoss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10847-10851,1992，在某些实施方式中，使非流感病毒毒性减弱。
关于非流感病毒载体的选择的典型的需要考虑的事项，具体地用于给予受试者的组合物是安全、低毒性、稳定性、细胞类型特异性、和免疫原性、具体地，由非流感病毒载体表达的flu多肽的抗原性。
5.6病毒样颗粒和病毒颗粒
在病毒样颗粒（VLP）载体中可包含Flu多肽。通常VLPs包括通常来源于病毒的结构蛋白的病毒多肽。在某些实施方式中，不能复制VLPs。在某些实施方式中，VLPs可缺少病毒的完整的基因组或可包括病毒的部分基因组。在某些实施方式中，VLPs不能感染细胞。在某些实施方式中，VLPs在它们的表面上表达本领域的一个技术人员已知的或本文中描述的一个或更多病毒（例如，病毒表面糖蛋白类）或非病毒（例如，抗体或蛋白质）靶向部分。在某些实施方式中，VLP包括flu多肽和病毒结构蛋白如HIVgag。
已经基于几个病毒描述了生产和表征重组地生产的VLPs的方法，包含流感病毒（Bright等人(2007)Vaccine.25:3871）、人类乳突病毒类型1（Hagnesee等人(1991)J.Virol.67:315）、人类乳突病毒类型16（Kirnbauer等人Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:12180）、HIV-1（Haffer等人,(1990)J.Virol.64:2653）、和肝炎A（Winokur(1991)65:5029），其每一篇的全部内容均结合于本文作为参考。由Pantua等人(2006)J.Virol.80:11062-11073，和在2009年3月12日出版的，美国专利申请公开第20090068221号中提供用于表达含有NDV蛋白质的VLPs的方法，其每一个的全部内容都包括在此。
在具体实施方式中，病毒颗粒可包括flu多肽。可利用本领域技术人员已知的技术生产含有flu多肽的病毒颗粒。例如，可通过破坏纯化的病毒、提取基因组、和利用病毒蛋白质（例如，flu多肽）和脂质重新组装颗粒，从而形成含有病毒蛋白质的脂质颗粒以便生产病毒颗粒。
5.7细菌载体
在具体实施方式中，可设计表达本文中描述的flu多肽的细菌。用于flu多肽的表达的适当的细菌包含，但不限于，李斯特氏杆菌、沙门氏菌、贺氏菌（Shigellasp.）、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitides）、流产布鲁氏菌（Brucellaabortus）、马耳他布鲁氏菌（Brucellamelitensis）、莱姆病原菌（Borreliaburgdorferi）、土拉热弗朗西丝氏菌（Francisellatularensis）。在具体实施方式中，使设计以便表达flu多肽的细菌的毒性减弱。用于设计以便表达异源多肽的细菌的生产的技术是本领域已知的和可应用于flu多肽的表达。参见，例如，2008年10月9日公开的美国专利申请公开第20080248066号，和2007年9月6日公开的美国专利申请公开第20070207171号，其每一篇的全部内容均结合于本文以供参考。
5.8产生抗flu多肽的抗体
Flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包括这样的核酸或本文中描述的多肽的载体可用于引出抵御流感的中和抗体，例如，抗flu多肽的HA2结构域的长α-螺旋区域。在具体的实施方式中，可将flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包括这样的核酸或本文中描述的多肽的载体给予非人类受试者（例如，鼠、兔、大鼠、豚鼠，等等），以便诱导免疫应答，其包含利用本领域的一个技术人员已知的技术（例如，免疫亲和力色谱、离心过滤、沉淀，等等）可被分离的抗体的生产。
可替换地，本文中描述的flu多肽可用于从抗体库中筛选抗体。例如，可将包括flu多肽的分离的flu多肽固定到固体的支撑物上（例如，硅胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、聚苯乙烯珠、氧化铝凝胶、或多聚糖、磁性珠），和筛选结合的抗体。作为可替换的，可将抗体固定到固体支撑物上和筛选结合分离的flu多肽的抗体。任何筛选试验，如平移试验（panningassay）、ELISA、表面等离子共振技术，或本领域已知的其他抗体筛选试验可用于筛选结合flu多肽的抗体。筛选的抗体库可以是商业上可用的抗体文库、体外产生的文库、或从流感感染的个体通过识别和克隆或分离抗体获得文库。在具体实施方式中，从流感病毒爆发的生还者产生抗体文库。可依照本领域已知的方法产生抗体文库。在一种具体实施方式中，通过克隆抗体产生抗体文库，并在噬菌体展示文库或噬菌粒展示文库使用它们。
可利用本领域已知的或本文中描述的生物试验，检验在本文中描述的方法中识别的抗体的中和活性和自身反应性的缺失。在一种实施方式中，从非人类动物或抗体库分离的抗体中和来自超过一个流感亚型的血凝素多肽。在某些实施方式中，利用flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或编码这样的核酸或多肽的载体引出的或识别的抗体，中和流感H3病毒。在某些实施方式中，利用flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包括这样的核酸或多肽的载体引出或识别的抗体，中和流感病毒的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16种或更多个亚型或菌株。在一种实施方式中，中和抗体中和一种或多种A型流感病毒和一个或更多B型流感病毒。在具体实施方式中，中和的抗体不是Wang等人(2010)“BroadlyProtectiveMonoclonalAntibodiesagainstH3InfluenzaVirusesfollowingSequentialImmunizationwithDifferentHemagglutinins,”PLOSPathogens6(2):1-9中描述的抗体。
利用flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包含这样的核酸或多肽的载体识别或引出的抗体包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学上地活性部分，例如，含有特异性地结合flu多肽的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型的免疫球蛋白分子（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、免疫球蛋白分子的种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或子类。抗体包含，但不限于，单克隆抗体、多效性抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体（chimericantibodies）、单链Fvs（scFv）、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fvs（sdFv）、和抗个体基因型（抗-Id）抗体（包括，例如，抗个体基因型抗体与利用本文中描述的方法引出的或识别的抗体）、和上述的任何的抗原表位结合片段。在具体实施方式中，利用flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包括这样的核酸或多肽的载体引出的或识别的抗体是人类或人源化的单克隆抗体。
利用flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包括这样的核酸或多肽的载体引出或识别的抗体可用于监视治疗的功效和/或疾病发展。可用于这种目的的本领域已知的任何免疫分析系统包含，但不限于，利用技术如放射性免疫分析、ELISA（酶连免疫吸附测定）、“三明治式”免疫分析、沉淀反应、琼脂凝胶扩散沉淀反应（geldiffusionprecipitinreactions）、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫放射测定、荧光免疫分析、蛋白质A免疫分析和免疫电泳分析，仅举几例，的竞争性和非竞争性测定系统。
利用flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包括这样的核酸或多肽的载体的抗体可用于，例如，从来自单一的亚型或2种、3种、4种或更多种不同亚型的多个流感病毒菌株探测流感病毒，和/或通过，例如，来自单一的亚型或2种、3种、4种或更多种不同的亚型的多个流感病毒菌株诊断流感病毒感染。
利用flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包括这样的核酸或多肽的载体引出或识别的抗体可用于生产抗遗传性型抗体。然后抗遗传性型抗体又能用于免疫作用，以便生产结合流感的具体的抗原的抗体的亚群，例如，flu多肽（Jerne,1974,Ann.Immunol.(巴黎)125c:373;Jerne等人,1982,EMBOJ.1:234，其全部内容结合于本文以供参考）。
在某些实施方式中，依照本文中描述的方法，给予flu多肽、编码这样的多肽的核酸、或包含这样的核酸或多肽的载体以便产生抗体的非人类受试者是能够生产人类抗体的转基因动物（例如，转基因小鼠）。可利用不能表达功能性的内源性的免疫球蛋白，但是能表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠生产人类抗体。例如，可随意地或通过同源重组将人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合体引入鼠胚胎干细胞中。可替换地，除了人类重链和轻链基因以外，可将人类可变区、恒定区、和多变区（diversityregion）引入鼠胚胎干细胞中。通过同源重组，利用人类免疫球蛋白基因座的引入非功能的单独地或同时地表现小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因。具体的，JH区域的纯合子缺失阻止内源性抗体生产。扩大修饰的胚胎干细胞，且将其显微注射到胚泡中，以便产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合的小鼠，以便生产表达人类抗体的纯合子后代。在B细胞分化期间重排由转基因小鼠包含的人类免疫球蛋白转基因，和随后经历种类转变和细胞体突变。因此，利用这样的技术，可能生产治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于生产人类抗体的这样的技术的概述，参见Lonberg和Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。关于用于生产人类抗体和人类单克隆抗体的这样的技术和生产这样的抗体的方案的详细讨论，参见，例如，PCT公开WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；欧洲专利No.0598877；美国专利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，它们的全部内容均结合于本文以供参考。可利用公司如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.),Genpharm(SanJose,Calif.),andMedarex,Inc.(Princeton,N.J.)，提供已选择的抗原针对的人类抗体。
5.9利用flu多肽刺激细胞
在另一个方面，本发明提供了利用本文中描述的flu多肽在体外刺激细胞的方法。可在体外使用这样的细胞，例如，树突细胞，以便产生抵御flu多肽的抗体，或通过，例如本领域已知的可采用的转移技术将它们自己给予受试者。关于可采用的转移技术的描述，参见，例如，2008年1月24日公开的美国专利申请公开第20080019998号，其全部内容结合于本文以供参考。在某些实施方式中，当将利用本文中描述的flu多肽在体外刺激的细胞给予受试者时，该细胞不是哺乳动物细胞（例如，CB-1细胞）。在某些实施方式中，当将利用本文中描述的flu多肽在体外刺激的细胞给予受试者时，该细胞是哺乳动物细胞（例如，CB-1细胞）。
在一种非限制性实施方式中，可使用设计以便表达本文中描述的flu多肽的载体，例如，流感病毒载体，产生表达flu多肽和展示针对flu多肽的免疫刺激性能的树突细胞（DCs）。这样的DCs可用于扩大记忆T细胞且这样的DCs是T细胞的有效的刺激物，包含流感flu多肽-特定的细胞毒素T淋巴细胞克隆。参见Strobel等人,2000,HumanGeneTherapy11:2207-2218，其全部内容结合于本文以供参考。
可以使多肽接触靶细胞，例如，DC的任何方式将本文中描述的flu多肽输送到靶细胞上，并将多肽输送至靶细胞。在某些实施方式中，如本文中描述的，将flu多肽运送给受试者。在某些这样的实施方式中，可分离和繁殖与多肽接触的细胞。
在某些实施方式中，将flu多肽运送给体外的靶细胞。可利用本领域技术人员已知的技术将多肽输送至靶细胞。例如，靶细胞可与组织培养皿、试管或其他容器中的多肽接触。可在培养基中悬浮多肽，且将其加入到培养皿、管或其他容器的孔中。可在细胞的平铺之前或在已经平铺细胞之后添加含有多肽的的培养基。优选地利用多肽孵育靶细胞足够的时间，以便允许多肽接触细胞。在某些实施方式中，利用多肽赋予细胞约1小时或更长、大约5小时或更长、约10小时或更长、约24小时或更长、约48小时或更长、约1小时至约12小时、约3小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约24小时、或约24小时至约48小时。在某些实施方式中，其中flu多肽是在病毒中，靶细胞的接触包括利用病毒感染细胞。
靶细胞可以来自任何种类的靶细胞，包含，例如，人、小鼠、小大鼠、兔和豚鼠。在有些实施方式中，靶细胞是从健康的受试者或需要治疗的受试者中获得的DCs。在某些实施方式中，靶细胞是从其中期望对于多肽刺激免疫应答的受试者中获得的DCs。从受试者获得细胞的方法是本领域已知的。
5.10组合物
组合物包含本文中描述的flu多肽、核酸、载体、细菌、抗体、或细胞（有时本文中称为“活性化合物”）。在一种具体实施方式中，组合物是药物组合物，如免疫原性组合物（例如，疫苗配方）。本发明提供的药物组合物可在允许将组合物给予受试者的任何形式中。在具体实施方式中，药物组合物适于兽医和/或人类给予。可在预防或治疗流感病毒疾病的方法中使用组合物。
在一种实施方式中，药物组合物以具有药学上可接受的载体的混合物的形式，包括flu多肽。在另一种实施方式中，药物组合物以具有药学上地可接受的载体的混合物的形式，包含编码本文中描述的flu多肽的核酸。在另一种实施方式中，药物组合物以具有药学上可接受的载体的混合物的形式，包括表达载体，其中所述表达载体包括编码flu多肽的核酸。在另一种实施方式中，药物组合物以具有药学上可接受的载体的混合物的形式，包括流感病毒或非流感病毒，其中所述流感病毒或非流感病毒含有flu多肽。在另一种实施方式中，药物组合物以具有药学上可接受的载体的混合物的形式，包括流感病毒或非流感病毒，其中所述流感病毒或非流感病毒具有设计以便表达flu多肽的基因组。在另一种实施方式中，药物组合物以具有药学上可接受的载体的混合物的形式，包括病毒样颗粒或病毒颗粒，其中所述病毒样颗粒或病毒颗粒含有flu多肽。在另一种实施方式中，药物组合物以具有药学上可接受的载体的混合物的形式，包括细菌，其中所述细菌表达或设计以便表达flu多肽。在另一种实施方式中，药物组合物以具有药学上可接受的载体的混合物的形式，包括利用flu多肽刺激的细胞。
在某些实施方式中，除了活性化合物之外，药物组合物可包括一种或多种其他治疗剂。
如本文中使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦或政府的管理机构批准的或在美国药典中或其他通常识别的药典列出的，用于动物并且更具体地用于人类。术语“载体”涉及与利用其给予药物组合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂、或载体。盐溶液和葡萄糖和甘油的水溶液也可被用作液体载体，具体地用作可注射的溶液。适当的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、米、面粉、石灰石、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。在E.W.Martin的“Remington'sPharmaceuticalSciences”中描述适当的药用载体的实例。配方应该与给药的方式相匹配。
在具体实施方式中，配制适合于以预期的途径给予受试者的药物组合物。例如，可配制适合于皮下、肠胃外、口头、皮内、经皮、结肠直肠、腹膜内、和直肠给药的药物组合物。在具体实施方式中，可配制适合于静脉、口服、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌肉、局部的、皮内、经皮或肺部的给药的药物组合物。
在某些实施方式中，生物可降解的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物（ethylenevinylacetate）、聚酸酐、聚乙二醇（PEG化）、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、聚交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)（poly(lactide-co-glycolides)）、聚乙醇酸、骨胶原、聚原酸酯（polyorthoesters）、和聚乳酸，可被用作载体。在某些实施方式中，利用载体制备活性化合物，其中所述载体增加化合物对抗从身体的迅速的排除的保护，如可控释放配方，包括灌输和装入微胶囊的运送系统。关于这样的配方的方法将是本领域技术人员显然可见的。脂质体或微胞也可被用作药物学上可接受的载体。可按照本领域技术人员已知的方法制备这些化合物，例如，如美国专利第4,522,811号中描述的。在某些实施方式中，该药物组合物包含一种或多种佐剂。
在具体实施方式中，本文中描述的免疫原性的组合物是单价的配方。在其他实施方式中，本文中描述的免疫原性的组合物是多价的配方。在一种实方式中，多价的配方包括表达来源于A型流感病毒的flu多肽的一个或更多载体和表达来源于B型流感病毒的flu多肽的一个或更多载体。在另一种实施方式中，多价的配方包括表达来源于H3A型流感病毒的flu多肽的载体和表达来源于H1A型流感病毒的flu多肽的载体，在另一种实施方式中，多价的配方包括表达来源于H3A型流感病毒的flu多肽的载体、表达来源于H1A型流感病毒的flu多肽的载体、和表达来源于B型流感病毒的flu多肽的载体。在某些实施方式中，多价的配方可包括利用单一的载体表达的一种或多种不同的flu多肽。
在某些实施方式中，本文中描述的药物组合物还包括防腐剂，例如，衍生自汞的水杨乙汞。在具体实施方式中，本文中描述的药物组合物包括0.001%至0.01%的水杨乙汞。在其他实施例中，本文中描述的药物组合物不包括防腐剂。在一种具体实施方式中，在本文中描述的药物组合物的制备期间使用水杨乙汞，且在药物组合物的生产之后通过纯化步骤清除水杨乙汞，例如，药物组合物含有痕量的水杨乙汞（例如，在纯化之后，每剂量小于0.3μg的汞；这样的药物组合物被认为是不含水杨乙汞的产品）。
在某些实施方式中，本文中描述的药物组合物还包括鸡蛋蛋白（例如，卵白蛋白或其他鸡蛋蛋白）。本文中描述的药物组合物中的鸡蛋蛋白的量的范围是1ml的药物组合物中含有从约0.0005至约1.2μg的鸡蛋蛋白。在其他实施例中，本文中描述的药物组合物不包含鸡蛋蛋白。
在某些实施方式中，本文中描述的药物组合物还包括一个或更多抗菌剂（例如，抗生素）包含，但不限于庆大霉素、新霉素、多粘菌素（例如，多粘菌素B）、和卡那霉素、链霉素。在其他实施方式中，本文中描述的药物组合物不包含任何抗生素。
在某些实施方式中，本文中描述的药物组合物还包含用于灭活病毒的一种或多种组分，例如，福尔马林或甲醛或去垢剂如脱氧胆酸钠、辛苯聚醇-9（TritonX-100）、和辛苯聚醇-10。在其他实施方式中，本文中描述的药物组合物不包括用于灭活病毒的任何成分。
在某些实施方式中，本文中描述的药物组合物还包括凝胶。在其他实施方式中，本文中描述的药物组合物不包括凝胶。
在某些实施方式中，本文中描述的药物组合物还包含一种或多种缓冲液，例如，磷酸盐缓冲液和磷酸蔗糖谷氨酸盐缓冲液。在其他实施方式中，本文中描述的药物组合物不包含缓冲液。
在某些实施方式中，本文中描述的药物组合物还包括一个或更多盐，例如，氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸钠、和铝盐（例如，氢氧化铝、正磷酸铝、明矾（硫酸铝钾（potassiumaluminumsulfate））、或这样的铝盐的混合物）。在其他实施方式中，本文中描述的药物组合物不包含盐。
在具体实施方式中，本文中描述的药物组合物是低添加剂流感病毒疫苗，例如，药物组合物不包括通常在流感病毒疫苗中发现的一种或多种添加剂。已经描述了低添加剂的流感疫苗（参见，例如，国际公开第WO09/001217号公开的国际申请PCT/IB2008/002238，其全部内容结合于本文以供参考）。
本文中描述的药物组合物可与用于给药的用法说明一起包括在容器、包装、或分配器中。
可在使用之前存储本文中描述的药物组合物，例如，可冷冻存储药物组合物（例如，约-20°C或约-70°C）；在冷藏的条件中存储（例如，约4°C）；或在室温下存储（关于存储包括不需要冷藏的流感疫苗的组合物的方法，参见如国际公开第WO07/110776号公开的国际申请PCT/IB2007/001149，其全部内容均结合于本文以供参考）。
在某些实施方式中，当本文中描述的药物组合物中的活性化合物是设计以便表达flu多肽的细胞时，药物组合物中的细胞不是哺乳动物细胞（例如，CB-1细胞）。在某些实施方式中，当本文中描述的药物组合物中的活性化合物是设计以便表达flu多肽的细胞时，药物组合物中的细胞是哺乳动物细胞。
5.10.1亚单位疫苗
在具体实施方式中，本发明提供的是包括本文中描述的核心多肽的亚单位疫苗。在某些实施方式中，亚单位疫苗包括flu多肽和一个或更多表面糖蛋白类（例如，流感病毒神经氨酸酶）、其他靶向部分或佐剂。在具体实施方式中，亚单位疫苗仅包括的流感flu多肽。在其他实施方式中，亚单位疫苗包括两种、三种、四种、或更多种流感flu多肽。在具体实施方式中，在亚单位疫苗中使用的流感flu多肽是非膜结合的，例如，它是可溶的。
在某些实施方式中，本发明提供的是每剂量包括约10μg至约60μg的本文中描述的一种或多种flu多肽、约0.001%至0.01%的水杨乙汞、约0.1μg至约1.0μg鸡的蛋蛋白、约1.0μg至约5.0μg的多粘菌素、约1.0μg至约5.0μg的新霉素、约0.1μg至约0.5μg的β-丙内酯，以及约0.001至约0.05%w/v的壬基酚聚氧乙烯醚（nonylphenolethoxylate）的亚单位疫苗。
在一种具体实施方式中，本发明提供的亚单位疫苗包括或由0.5ml剂量组成，其中所述0.5ml剂量包含45μg本发明提供的flu多肽、≤1.0μg的汞（来自水杨乙汞）、≤1.0μg鸡蛋蛋白（例如，卵白蛋白）、≤3.75μg的多粘菌素、和≤2.5μg的新霉素。在某些实施方式中，本发明提供的亚单位疫苗每剂量还包括或由不超过0.5μg的β-丙内酯、和不超过0.015%w/v壬基酚聚氧乙烯醚组成。在某些实施方式中，以预灌注注射器（pre-filledsyringe）的形式包装0.5ml剂量的亚单位。
在一种具体实施方式中，本发明提供的亚单位疫苗由5.0ml多次剂量瓶（每剂量0.5ml）组成，其中所述多次剂量瓶包括45μg本发明提供的flu多肽、25.0μg汞（来自水杨乙汞）、≤1.0μg鸡蛋蛋白（例如，卵白蛋白）、≤3.75μg多粘菌素、和≤2.5μg新霉素。在某些实施方式中，本发明提供的亚单位疫苗每剂量还包括或由不超过0.5μg的β-丙内酯、以及不超过0.015%w/v的壬基酚聚氧乙烯醚组成。
在一种具体实施方式中，利用在含有胚胎的鸡蛋中繁殖的流感病毒制备亚单位疫苗（例如，从在含有胚胎的鸡蛋中繁殖的病毒中分离亚单位疫苗的成分（例如，flu多肽））。在另一种具体实施方式中，利用不是在含有胚胎的鸡蛋中繁殖的流感病毒制备亚单位疫苗（例如，从不是在含有胚胎的鸡蛋中繁殖的病毒中分离亚单位疫苗的成分（例如，flu多肽））。在另一种具体实施方式中，利用在哺乳动物细胞中繁殖的流感病毒制备亚单位疫苗，例如，永生化人类细胞（参见，例如，国际公开第WO07/045674号公开的国际申请PCT/EP2006/067566，其全部内容结合于本文以供参考），或犬肾细胞如MDCK细胞（参将，例如，国际公开第WO08/032219号公开的国际申请PCT/IB2007/003536，其全部内容结合于本文以供参考）（例如，从在哺乳动物细胞中繁殖的病毒中分离亚单位疫苗的成分（例如，flu多肽））。在另一个具体实施方式中，利用表达载体，例如，病毒载体、植物载体或细菌载体制备亚单位疫苗中的flu多肽（例如，从表达载体中获得/分离亚单位疫苗中的flu多肽）。
5.10.2活病毒疫苗
在一种实施方式中，本发明提供的是包括活病毒的免疫原性组合物（例如，疫苗），其中所述活病毒含有flu多肽。在另一种实施方式中，本发明提供的是包括活病毒的免疫原性的组合物（例如，疫苗），其中设计所述活病毒以便编码flu多肽，通过在给予组合物的受试者中产生的子代病毒表达所述免疫原性组合物。在具体实施方式中，flu多肽是膜结合的。在其他具体实施方式中，流感病毒flu多肽是非膜结合的，例如，可溶解的。在一种具体实施方式中，活病毒是如上述章节5.4中描述的流感病毒。在其他实施方式中，活病毒是如上述章节5.5中描述的非流感病毒。在某些实施方式中，使活病毒的毒性减弱。在某些实施方式中，免疫原性组合物包含两种、三种、四种或更多种活病毒，其含有或设计为表达两种、三种、四种或更多种不同的flu多肽。
在某些实施方式中，本发明提供了免疫原性组合物（例如，疫苗），其每剂量包括含有本文中描述的一个或更多flu多肽的约105至约1010的荧光转化灶单位（fluorescentfocusunits）的活的毒性减弱的流感病毒、约0.1至约0.5mg谷氨酸钠、约1.0至约5.0mg的水解明胶、约1.0至约5.0mg的精氨酸、约10mg至约15mg的蔗糖、约1.0至约5.0mg的磷酸二氢钾、约0.5mg至约2.0mg的磷酸氢二钾、以及约0.001至约0.05μg/ml的硫酸庆大霉素。在某些实施方式中，以含有单一的0.2ml剂量的预灌注注射器的形式包装免疫原性组合物（例如，疫苗）。
在具体实施方式中，本发明提供的是免疫原性组合物（例如，疫苗），其每剂量包括含有本文中描述的一个或更多flu多肽的106.5至107.5FFU的活的毒性减弱的流感病毒、0.188mg的谷氨酸钠、2.0mg的水解明胶、2.42mg的精氨酸、13.68mg的蔗糖、2.26mg的磷酸二氢钾、0.96mg的磷酸一钾、以及小于0.015μg/ml的硫酸庆大霉素。在某些实施方式中，以含有单一的0.2ml剂量的预灌注注射器的形式包装免疫原性组合物（例如，疫苗）。
在一种具体实施方式中，在活病毒被用于本文中描述的免疫原性的组合物之前，在含有胚胎的鸡蛋中繁殖含有flu多肽的活病毒。在另一个具体实施方式中，在活病毒被用于本文中描述的免疫原性的组合物之前，不在含有胚胎的鸡蛋中繁殖含有flu多肽的活病毒。在另一种具体实施方式中，在活病毒被用于本文中描述的免疫原性的组合物之前，在哺乳动物细胞中，例如，永生化的人类细胞（参见，例如，国际公开第WO07/045674号公开的国际申请PCT/EP2006/067566，其全部内容结合于本文以供参考）或犬肾细胞如MDCK细胞（参见，例如，国际公开第WO08/032219号公开的的国际申请PCT/IB2007/003536，其全部内容结合于本文以供参考）中繁殖含有flu多肽的活病毒。
由于受试者中病毒的增殖可导致自然的感染中出现的病毒的相似种类的延长的刺激和量级，可优选包括用于给予受试者的活病毒的免疫原性的组合物，因此，赋予了真实的、长期持久的免疫性。
5.10.3灭活的病毒疫苗
在一种实施方式中，本发明提供的包括灭活的病毒的免疫原性的组合物（例如，疫苗），其中所述灭活的病毒含有flu多肽。在一种具体实施方式中，flu多肽是膜结合的。在一种具体实施方式中，灭活的病毒是如上述章节5.4中描述的流感病毒。在其他实施方式中，灭活的病毒是如上述章节5.5中描述的非流感病毒。在某些实施方式中，该免疫原性组合物包含两种、三种、四种或更多种灭活的病毒，其含有两种、三种、四种或更多种不同的flu多肽。在某些实施方式中，灭活的病毒免疫原性组合物包含一种或多种佐剂。
本领域的一个技术人员已知的技术可用于灭活含有flu多肽的病毒。一般的方法使用福尔马林、加热、或去垢剂用于灭活。参见，例如，美国专利6,635,246，其全部内容结合于本文以供参考。其他方法包含美国专利5,891,705；5,106,619和4,693,981中描述的那些，其全部内容结合于本文以供参考。
在某些实施方式中，本发明提供的是包括灭活的流感病毒的免疫原性组合物（例如，疫苗），以便免疫原性组合物的每一个剂量包括约15至约60μg的本文中描述的flu多肽、约1.0至约5.0mg的氯化钠、约20至约100mg的磷酸二氢钾、约5至约30μg的磷酸氢二钾、约5μg至约30μg的氯化钾、以及约0.5至约3.0μg的氯化钙。在某些实施方式中，以单一的0.25ml或单一的0.5ml剂量的形式包装免疫原性组合物（例如，疫苗）。在其他实施例中，以多剂量配方的形式包装免疫原性组合物（例如，疫苗）。
在某些实施方式中，本发明提供的是包括灭活的流感病毒的免疫原性的组合物（例如，疫苗），以便免疫原性组合物的每剂量包含约15μg至约60μg本文中描述的flu多肽、约0.001%至0.01%的水杨乙汞、约1.0mg至约5.0mg氯化钠、约20μg至约100μg的磷酸二氢钠、约100μg至约500μg磷酸氢二钠、约5μg至约30μg磷酸二氢钾、约5μg至约30μg氯化钾、以及约0.5μg至约3.0μg的氯化钙每剂量。在某些实施方式中，以单一的0.25ml或单一的0.5ml剂量的形式包装免疫原性的组合物（例如，疫苗）。在其他实施例中，以多剂量配方的形式包装免疫原性组合物（例如，疫苗）。
在一种具体实施方式中，以单一的0.25ml剂量的形式包装本发明提供的免疫原性的组合物（例如，疫苗）且每剂量包含22.5μg本文中描述的flu多肽、2.05mg的氯化钠、40μg的磷酸二氢钠、150μg的磷酸氢二钠、10μg的磷酸二氢钾、10μg的氯化钾、以及0.75μg的氯化钙。
在一种具体实施方式中，以单一的0.5ml剂量的形式的形式包装本发明提供的免疫原性组合物（例如，疫苗）且每剂量包括45μg本文中描述的flu多肽、4.1mg的氯化钠、80μg的磷酸二氢钠、300μg的磷酸氢二钠、20μg的磷酸二氢钾、20μg的氯化钾、和1.5μg的氯化钙。
在一种具体实施方式中，以包括或由5.0ml疫苗（0.5ml每剂量）组成的多剂量配方的形式包装免疫原性组合物（例如，疫苗）且每剂量包括24.5μg汞（来自水杨乙汞）、45μg本文中描述的flu多肽、4.1mg的氯化钠、80μg的磷酸二氢钠、300μg的磷酸氢二钠、20μg的磷酸二氢钠、20μg的氯化钾、和1.5μg的氯化钙。
在具体实施方式中，在活病毒灭活之前，在含有胚胎的鸡蛋中繁殖含有flu多肽的活病毒，和随后用于本文中描述的免疫原性的组合物。在另一种具体实施方式中，在活病毒灭活之前，不在含有胚胎的鸡蛋中繁殖含有flu多肽的活病毒，和随后用于本文中描述的免疫原性的组合物。在另一种具体实施方式中，在活病毒灭活之前，在哺乳动物细胞中，例如，永生化的人类细胞（参见，例如，国际公开第WO07/045674号公开出版的国际申请PCT/EP2006/067566，其全部内容结合于本文以供参考）或犬肾细胞如MDCK细胞（参见，例如，国际公开第WO08/032219公开的国际申请PCT/IB2007/003536，其全部内容结合于本文以供参考）中繁殖含有flu多肽的活病毒，和随后用于本文中描述的免疫原性的组合物。
5.10.4裂解病毒疫苗
在一种实施方式中，包括flu多肽的免疫原性组合物是裂解病毒疫苗。在某些实施方式中，裂解病毒疫苗含有两个、三个、四个或更多不同的flu多肽。在某些实施方式中，flu多肽是膜结合的。在某些实施方式中，裂解病毒疫苗包括一个或更多佐剂。
用于生产裂解病毒疫苗的技术是本领域技术人员已知的。依靠非限制性的实例，可使用利用去垢剂破坏的灭活的颗粒制备流感病毒裂解疫苗。依照本文中描述的方法，可适于应用的裂解病毒疫苗的一个实例是用于肌肉应用的流感病毒疫苗(ZonalPurified,Subvirion)，以来自在含有胚胎的鸡蛋中繁殖的流感病毒制备的消过毒的悬浮液的形式配制所述疫苗。收获含有病毒的液体且利用甲醛灭活。利用连续流离心机（continuousflowcentrifuge），在线性蔗糖密度梯度溶液中浓缩和纯化流感病毒。然后利用非离子表面活性剂、辛苯聚醇-9（UnionCarbide,Co.的X-100–A注册商标）以化学方法破坏病毒，以产生“裂解病毒”。然后进一步通过化学手段纯化裂解病毒，并将裂解病毒悬浮于磷酸钠-缓冲的等张的氯化钠溶液中。
在某些实施方式中，本发明提供的是裂解病毒疫苗，其包括大约10μg至大约60μg本文中描述的一种或多种flu多肽、约0.01至大约1.0mg辛苯聚醇-10（TRITON）、约0.5mg至0.5mg的α-生育酚氢琥珀酸、约0.1至1.0mg的聚山梨醇酯80（Tween80）、约0.001μg至约0.003μg的肾上腺皮质素、约0.05至约0.3μg的硫酸庆大霉素、约0.5至约2.0μg的鸡蛋蛋白（卵白蛋白）、约25至75μg的甲醛、以及约25μg至75μg的脱氧胆酸钠。
在一种具体实施方式中，本发明提供的裂解病毒疫苗包含或由0.5ml剂量组成，所述0.5ml剂量包括45μg本文中描述的flu多肽、≤0.085mg辛苯昔醇-10（TRITON）、≤0.1mgα-生育酚氢琥珀酸、≤0.415mg聚山梨醇酯80（Tween80）、≤0.0016μg肾上腺皮质素、≤0.15μg硫酸庆大霉素、≤1.0μg鸡蛋蛋白（卵白蛋白）、≤50μg甲醛、以及≤50μg脱氧胆酸钠。在某些实施方式中，以预灌注注射器的形式包装0.5ml剂量亚单位疫苗。
在一种具体实施方式中，利用在含有胚胎的鸡蛋中繁殖的流感病毒制备裂解病毒疫苗。在另一种具体实施方式中，利用不是在含有胚胎的鸡蛋中繁殖的流感病毒制备裂解病毒疫苗。在另一种具体实施方式中，利用在哺乳动物细胞中，例如，永生化的人类细胞（参见，例如，国际公开第WO07/045674号公开的国际申请PCT/EP2006/067566，其全部内容结合于本文呢以供参考）或犬肾细胞如MDCK细胞（参见，例如，国际公开第WO08/032219号的的国际申请PCT/IB2007/003536，其全部内容结合于本文以供参考）中繁殖的流感病毒制备裂解病毒疫苗。
5.10.5佐剂
在某些实施方式中，本文中描述的组合物包含佐剂，或与佐剂联合给予本文描述的组合物。可在给予所述组合物的之前、同时、或之后给予结合本文中描述的组合物给予的佐剂。在某些实施方式中，术语“佐剂”是指当结合或作为本文中描述的组合物的部分时，能够增加、增强和/或提高对flu多肽的免疫应答，但是当单独给予时不对多肽产生免疫应答的化合物。在某些实施方式中，佐剂对多肽产生免疫应答且不产生过敏反应或其他有害反应。佐剂可通过几个机制，包括，例如，淋巴细胞补充、B和/或T细胞的刺激、和巨噬细胞的刺激增强免疫应答。
在某些实施方式中，佐剂增加对flu多肽的内在的响应，而不引起多肽的构象的改变，其中所述多肽影响响应的定性的形式。佐剂的具体的实例包含，但不限于，铝盐（明矾）（如氢氧化铝、正磷酸铝、和硫酸铝），3De-O-乙酰化的单磷酰酯A（MPL）（参见GB2220211）、MF59（Novartis）、AS03（GlaxoSmithKline）、AS04（GlaxoSmithKline）、聚山梨醇酯80（Tween80;ICLAmericas,Inc.）、咪唑并吡啶类化合物（imidazopyridinecompounds）（参见，例如国际专利公开第WO2007/109812号公开的国际申请PCT/US2007/064857）、咪唑并喹噁啉化合物（参见，例如国际专利申请第WO2007/109813号）和皂角苷，如QS21（参见，Kensil等人,inVaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach(Powell&Newman编著,PlenumPress,NY,1995);U.S专利第5,057,540号）。在某些实施方式中，佐剂是氟氏佐剂（完全或不完全氟氏佐剂）。其他佐剂是可选地结合免疫刺激物，如单磷酰酯A（参见，Stoute等人,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997)）的油水乳剂（如鲨烯或花生油）。另外的佐剂是CpG（BioworldToday,Nov.15,1998）。这样的佐剂可与或不与其他特异性免疫刺激试剂一起使用，如MPL或3-DMP、QS21，聚合的或单体的氨基酸如多聚谷氨酸或多聚赖氨酸，或上述章节5.4中描述的其他免疫增强剂。应该理解，flu多肽的不同配方可包括不同的佐剂或可包括相同的佐剂。
5.11预防疾病的和治疗的应用
在一个方面中，本发明提供的是在利用活性化合物，例如，本文中描述的flu多肽、编码这样的多肽的核酸、含有或表达这样的多肽的载体（例如，病毒载体、或细菌）、或利用这样的多肽刺激的细胞，用于在受试者中诱导免疫应答的方法。在具体实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者有效量的flu多肽或它的免疫原性组合物。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者有效量的编码flu多肽的核酸或它的免疫原性组合物。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者有效量的含有或表达flu多肽的病毒载体或它的免疫原性的组合物。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括它的需要的形式给予受试者有效量的利用flu多肽刺激的细胞或它的药物组合物。在某些实施方式中，方法中使用的flu多肽是来源于哺乳动物细胞、植物细胞、或昆虫细胞的纯化的flu多肽。
在具体实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的亚单位疫苗。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的活病毒疫苗。在具体实施方式中，活病毒疫苗包括减毒的病毒。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的灭活的病毒疫苗。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的裂解病毒疫苗。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的病毒样颗粒疫苗。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的病毒粒。在另一种实施方式中，用于在受试者中对流感病毒诱导免疫应答的方法包括以它的需要的形式给予受试者表达或设计以便表达flu多肽的细菌或它的组合物。在某些实施方式中，方法中使用的flu多肽是来源于哺乳动物细胞、植物细胞、或昆虫细胞的纯化的flu多肽。
在某些实施方式中，由本文中描述的化合物或组合物诱导的免疫应答有效地预防和/或治疗由流感病毒的任何亚型或菌株引起的流感病毒感染。在某些实施方式中，由本文中描述的活性化合物或组合物诱导的免疫应答有效地预防和/或治疗由属于一个HA组（例如，组1，其包括H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、和H16）而不属于其他HA组（例如，组2，其包括H3、H4、H7、H10、H14、和H15）的流感病毒的亚型引起的流感病毒感染。例如，诱导的免疫应答可有效地预防和/或治疗由属于由H11、H13、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5和H2组成的HA组的流感病毒引起的流感病毒感染。可替换地，诱导的免疫应答可有效地预防和/或治疗由属于由H3、H4、H14、H10、H15和H7组成的HA组的流感病毒引起的流感病毒感染。在某些实施方式中，由活性的化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由流感病毒的一种、两种、三种、四种或五种亚型引起的流感病毒感染。在某些实施方式中，由活性化合物或本文所述的组合物诱导的免疫应答有效地预防和/或治疗由流感病毒的六种、十种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种或十五种亚型引起的流感病毒感染。在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由流感病毒的相同亚型内的一种或多种变体引起的流感病毒感染。
在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由H1N1和H2N2两种亚型引起的流感病毒感染。在其他实施例中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答不能有效地预防和/或治疗由H1N1和H2N2两种亚型引起的流感病毒感染。在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由H1N1、H2N2、和H3N2亚型引起的流感病毒感染。在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由H3N2亚型引起的流感病毒感染。在其他实施例中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答不能有效地预防和/或治疗由H3N2亚型引起的流感病毒感染。
在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由流感病毒的任何亚型或菌株引起的流感病毒疾病。在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由属于一种HA组而不属于其他HA组的流感病毒的亚型引起的流感病毒疾病。例如，诱导的免疫应答可有效地预防和/或治疗由属于由H11、H13、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5和H2组成的HA组的流感病毒引起的流感病毒疾病。可替换地，诱导的免疫应答可有效地预防和/或治疗由属于由H3、H4、H14、H10、H15和H7组成的HA组的流感病毒引起的流感病毒疾病。在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由流感病毒的一个、两个、三个、四个或五个亚型的任一亚型引起的流感病毒疾病。在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由流感病毒的六个、七个、八个、九个、十个、十一、十二、十三、十四或十五个亚型的任一亚型引起的流感病毒疾病。在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地预防和/或治疗由流感病毒的相同的亚型内的一个或更多变体引起的流感病毒疾病。
在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地减少由流感病毒疾病/感染产生的症状。流感病毒疾病/感染的症状包括，但不限于，身体疼痛（特别是关节和喉咙）、发热、恶心、头痛、刺激眼睛、疲劳、喉咙痛、红眼或皮肤、和腹部疼痛。
在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地减少经受流感病毒疾病/感染的受试者的住院治疗。在某些实施方式中，由活性化合物或本文中描述的组合物引起的免疫应答有效地缩短经受流感病毒疾病/感染的受试者的住院治疗的时间。
在另一个方面中，本发明提供了利用本文中描述的活性化合物（例如，本文中描述的flu多肽、编码这样的多肽的核酸、含有或表达这样的多肽的载体、或利用这样的多肽刺激的细胞）或组合物用于在受试者中预防和/或治疗流感病毒感染的方法。在一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒感染的方法包括以它的需要的形式给予受试者flu多肽、编码这样的多肽的核酸、含有或表达这样的多肽的载体、或前述的任何一个的组合物。在具体实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒感染的方法包括以它的需要的形式给予受试者亚单位疫苗、活病毒疫苗、灭活的病毒疫苗、裂解病毒疫苗或病毒样颗粒疫苗。在具体实施方式中，由A型流感病毒引起流感病毒感染。在其他实施例中，由B型或C型流感病毒引起流感病毒感染。
在另一个方面，本发明提供了利用本文中描述的flu多肽、编码这样的多肽的核酸、含有或表达这样的多肽的载体、或利用这样的多肽刺激的细胞，用于在受试者中预防和/或治疗流感病毒疾病。在具体实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者有效量的flu多肽或它的免疫原性组合物。在另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者有效量的编码flu多肽的核酸或它的免疫原性组合物。在另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者有效量的含有或表达flu多肽的病毒载体或它的免疫原性的组合物。在还有的另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者有效量的利用flu多肽刺激的细胞或它的药物组合物。
在具体实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的亚单位疫苗。在另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的活病毒疫苗。在具体实施方式中，活病毒疫苗包括减毒的病毒。在另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的灭活的病毒疫苗。在另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的裂解病毒疫苗。在另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的病毒样颗粒疫苗。在另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的病毒颗粒。在另一种实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者表达或设计以便表达flu多肽的细菌或它的组合物。在具体实施方式中，由或联合A型流感病毒的出现引起流感病毒疾病。在其他实施例中，由或联合B型流感病毒的出现引起流感病毒疾病。
另一个方面，本发明提供了通过给予本文中描述的中和抗体，在受试者中预防和/或治疗流感病毒疾病的方法。在一种具体实施方式中，用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病的方法包括以它的需要的形式给予受试者本文中描述的中和抗体，或它的药物组合物。在具体实施方式中，中和抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，中和抗体不是Wang等人(2010)“BroadlyProtectiveMonoclonalAntibodiesagainstH3InfluenzaVirusesfollowingSequentialImmunizationwithDifferentHemagglutinins,”PLOSPathogens6(2):1-9中描述的抗体。在某些实施方式中，中和抗体不是PCT/US2010/036170中描述的抗体。
在某些实施方式中，如通过本领域技术人员已知的和本文所述的体内和体外分析测量的，本发明提供的用于在受试者中预防或治疗流感病毒疾病或感染的方法导致受试者中流感病毒复制的减少。在某些实施方式中，通过近似地1对数或更多、近似地2对数或更多、近似地3对数或更多、近似地4对数或更多、近似地5对数或更多、近似地6对数或更多、近似地7对数或更多、近似地8对数或更多、近似地9对数或更多、近似地10对数或更多、1至3对数、1至5对数、1至8对数、1至9对数、2至10对数、2至5对数、2至7对数、2对数至8对数、2至9对数、2至10对数、3至5对数、3至7对数、3至8对数、3至9对数、4至6对数、4至8对数、4至9对数、5至6对数、5至7对数、5至8对数、5至9对数、6至7对数、6至8对数、6至9对数、7至8对数、7至9对数、或8至9对数减少流感病毒的复制。
5.11联合治疗
在各种实施方式中，可将一种或多种其他治疗剂（例如，抗病毒剂、抗细菌剂、或免疫调节治疗剂）与本文所述的flu多肽、编码这样的多肽的核酸、含有或表达这样的多肽的载体（例如，病毒载体或细菌）、利用这样的多肽刺激的细胞、或中和抗体联合给予受试者。在某些实施方式中，可将一种或多种治疗剂与本文所述的药物组合物（例如，免疫原性组合物）联合给予受试者。一种或多种其他治疗剂可有益于流感病毒疾病的治疗或预防或改善流感病毒疾病关联的症状或病状。在某些实施方式中，一种或多种其他治疗剂是疼痛缓解剂、抗发热的药物、或减轻或帮助呼吸的治疗剂。在某些实施方式中，以小于5分钟间隔、小于30分钟间隔、1小时间隔、约1小时间隔、约1至约2小时的间隔、约2至约3小时间隔、约3至约4小时间隔、约4至约5小时间隔、约5至约6小时间隔、约6至约7小时间隔、约7至约8小时间隔、约8至约9小时间隔、约9至约10小时间隔、约10至约11小时间隔、约11至约12小时间隔、在约12至约18小时间隔、约18至约24小时间隔、24小时至36小时间隔、36小时至48小时间隔、48小时至52小时间隔、52小时至60小时间隔、60小时至72小时间隔、72小时至84小时间隔、84小时至96小时间隔、或96小时至120小时间隔给予治疗剂。在一种具体实施方式中，在相同专利访问（patentvisit）内给予两种或更多种治疗剂。
本文中描述的活性化合物或药物组合物可与本领域技术人员已知的任何抗病毒试剂联合使用。抗病毒试剂的非限制性实例包含括，蛋白质、多肽、肽、融合蛋白抗体、核酸分子、有机分子、无机分子、和抑制和/或减少病毒与它的受体的连接、进入细胞的病毒的内在化、病毒的复制、或病毒从细胞的释放的小分子。具体地，抗病毒试剂包括，但不限于，核苷类似物（例如，叠氮胸苷（zidovudine）、无环鸟苷（acyclovir）、环鸟苷（gangcyclovir）、阿糖腺苷（vidarabine）、碘苷、三弗尿苷（trifluridine）、和三氮唑核苷）、膦甲酸（foscarnet）、三环癸胺、帕拉米韦（peramivir）、金刚乙胺（rimantadine）、沙奎那韦（saquinavir）、吲地那韦（indinavir）、利托那韦（ritonavir）、α-干扰素和其他干扰素、AZT、托那米韦（zanamivir）和奥司他韦（oseltamivir）。其他抗病毒试剂包括流感疫苗，例如，（GlaxoSmithKline）、(MedImmuneVaccines)、(ChironCorporation)、(GlaxoSmithKline)、(CSLBiotherapiesInc.)、(Novartis)或(AventisPasteur)。
在具体实施方式中，抗病毒试剂是病毒抗原特定的免疫调节试剂。在具体实施方式中，除了血凝素多肽之外，病毒抗原还是流感病毒多肽。在其他实施例中，病毒抗原是flu多肽。
可联合本文中描述的活性化合物或药物组合物使用本领域的一个技术人员已知的任何抗细菌试剂。抗细菌试剂的非限制性的实例包括丁胺卡那霉素、阿莫西林（Amoxicillin）、阿莫西林-克拉维酸（Amoxicillin-clavulanicacid）、两性霉素B（Amphothericin-B）、氨苄青霉素、氨苄西林钠-舒巴坦钠（Ampicllin-sulbactam）、阿拉伯霉素、阿奇霉素（Azithromycin）、氨曲南（Aztreonam）、枯草杆菌抗生素、青霉素G、卡泊芬净（Caspofunngin）、头孢克洛（Cefaclor）、头孢羟氨苄（Cefadroxil）、头孢氨苄（Cefalexin）、头孢噻吩钠（Cefalothin）、头孢唑林（Cefazolin）、头孢地尼（Cefdinir）、头孢吡肟（Cefepime）、头孢克肟（Cefixime）、头孢甲肟（Cefmenoxime）、头孢哌酮（Cefoperazone）、头孢哌酮-舒巴坦（Cefoperazone-sulbactam）、头孢噻肟（Cefotaxime）、头孢西丁（Cefoxitin）、头孢匹罗（Cefpirome）、头孢泊肟（Cefpodoxime）、头孢泊肟-克拉维酸（Cefpodoxime-clavulanicacid）、头孢泊肟-舒巴坦、头孢罗齐（Cefprozil）、头孢喹肟（Cefpuinome）、头孢他啶（Ceftazidime）、头孢丁烯（Ceftbutin）、头孢噻呋（Ceftiofur）、头孢托罗（Ceftobiprole）、头孢曲松（Ceftiaxon）、头孢呋辛（Cefuroxime）、氯霉素、弗本尼考（Florfenicole）、环丙沙星（Ciprofloxacin）、克拉霉素（Clarithromycin）、克林沙星（Clinafloxacin）、氯林可霉素、林氯青霉素、粘菌素、复方新诺明（Cotrimoxazol）（甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异噁唑（Trimthoprim/sulphamethoxazole））、达贝万星（Dalbavancin）、达福普丁/奎奴普丁（Dalfopristin/Quinopristin）、达托霉素（Daptomycin）、地贝卡星（Dibekacin）、双氯西林（Dicloxacillin）、多尼培南（Doripenem）、强力霉素（Doxycycline）、恩诺沙星（Enrofloxacin）、尼他培南（Ertapenem）、红霉素（Erythromycin）、氟氯西林（Flucloxacillin）、弗康唑（Fluconazol）、氟胞嘧啶（Flucytosin）、磷霉素（Fosfomycin）、梭链孢酸（Fusidicacid）、加雷沙星片（Garenoxacin）、加替沙星（Gatifloxacin）、吉米沙星（Gemifloxacin）、庆大霉素（Gentamicin）、亚胺培南（Imipenem）、伊曲康唑（Itraconazole）、卡那霉素（Kanamycin）、酮康唑（Ketoconazole）、左氧氟沙星片（Levofloxacin）、林肯霉素（Lincomycin）、利奈唑胺（Linezolid）、氯拉卡比（Loracarbef）、美西林（Mecillnam）（氮卓西林（amdinocillin））、美罗培南（Meropenem）、灭滴灵（Metronidazole）、美洛西林（Mezlocillin）、美洛西林-舒巴坦（Mezlocillin-sulbactam）、二米诺环素,（Minocycline）、莫西沙星（Moxifloxacin）、莫匹罗星（Mupirocin）、萘啶酸（Nalidixicacid）、新霉素、奈替米星（Netilmicin）、呋喃妥因（Nitrofurantoin）、诺氟沙星（Norfloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、苯唑西林（Oxacillin）、培氟沙星（Pefloxacin）、青霉素V、哌拉西林（Piperacillin）、哌拉西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦（Piperacillin-tazobactam）、利福平（Rifampicin）、罗红霉素（Roxithromycin）、司氟沙星（Sparfloxacin）、奇放线菌素、螺旋霉素、链霉素、舒巴克坦（Sulbactam）、磺胺甲基异噁唑（Sulfamethoxazole）、替考拉宁（Teicoplanin）、特拉万星（Telavancin）、泰利霉素（Telithromycin）、替莫西林（Temocillin）、四环素（Tetracyclin）、替卡西林（Ticarcillin）、替卡西林-克拉维酸、替格环素（Tigecycline）、托普霉素、甲氧苄氨嘧啶、曲伐沙星（Trovafloxacin）、泰乐菌素（Tylosin）、万古霉素、维及霉素和伏立康唑（Voriconazole）。
在某些实施方式中，联合治疗包括给予章节5.4-5.7中描述的两个或更多不同的载体。在一种实施方式中，联合给予表达来源于A型流感病毒的flu多肽的一个或更多载体和表达来源于B型流感病毒的flu多肽的一个或更多载体。在某些实施方式中，联合治疗包括给予表达来源于H3A型流感病毒的flu多肽的载体和表达来源于H1A型流感病毒的flu多肽的载体。在某些实施方式中，联合治疗包括给予表达来源于H3A型流感病毒的载体、表达来源于H1A型流感病毒的flu多肽的载体、和表达来源于B型流感病毒的flu多肽的载体。
在某些实施方式中，联合治疗包括利用对一个HA组（例如，组1）中的一个、两个、三个、或更多的HA亚型诱导免疫应答的活性化合物，联合对其他HA组（例如，组2）中的一个、两个、三个、或更多的HA亚型诱导免疫应答的活性化合物的活性免疫作用。
在某些实施方式中，联合治疗包括利用章节5.1中描述的两个或更多flu多肽的活性免疫作用。
在某些实施方式中，联合治疗包括具有来源于A型流感病毒的一个、两个、或更多flu多肽和来源于B型流感病毒的一个或更多flu多肽的活性免疫作用。
5.11.2患者种群
在某些实施方式中，可将本文中描述的活性化合物或组合物给予自然的受试者，例如，没有患过由流感病毒感染引起的疾病或还没有患有和目前没有感染流感病毒感染的受试者。在一种实施方式中，将本文中描述的活性化合物或组合物给予处于获得流感病毒感染的危险之中的自然的受试者。在一种实施方式中，将本文中描述的活性化合物或组合物给予受试者，其中所述受试者没有患过由特异性流感病毒引起的疾病，或过去没有和现在也没有感染特异性流感病毒，其中flu多肽对特异性的流感病毒诱导免疫应答。也可将本文中描述的活性化合物或组合物给予受试者，其中所述受试者感染和/或已经感染过流感病毒或流感病毒的另一个类型、亚型或菌株，和其中flu多肽对所述流感病毒诱导免疫应答。
在某些实施方式中，将本文中描述的活性化合物或组合物给予已经被诊断患有流感病毒感染的患者。在某些实施方式中，在症状显现或症状变得严重之前（例如，在病人需要住院治疗之前），将本文中描述的活性化合物或组合物给予流感病毒感染的病人。在某些实施方式中，流感病毒来源的与活性化合物或组合物的flu多肽的给予比较，将本文中描述的活性化合物或组合物给予感染或已经被诊断具有流感病毒的不同类型的患者。
在某些实施方式中，将本文中描述的活性化合物或组合物给予可能是或感染流感病毒的患者，其中所述流感病毒属于与流感flu多肽相同的HA组。在某些实施方式中，将本文中描述的活性化合物或组合物给予患者，其中所述患者可能是或感染与流感flu多肽相同的亚型的流感病毒。
在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是动物。在某些实施方式中，动物是鸟。在某些实施方式中，动物是狗。在某些实施方式中，动物是猫。在某些实施方式中，动物是马。在某些实施方式中，所述动物是牛。在某些实施方式中，动物是哺乳动物，例如，马、猪、小鼠、或灵长目动物，优选人。
在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是人类成年人。在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是超过50岁的人类成年人。在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是老年的人类受试者。
在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是人类儿童。在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是人类婴儿。在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是未成熟的人类婴儿。在某些实施方式中，依照本发明提供的方法治疗或预防的患者是人类初学走路的孩子。在某些实施方式中，将本文中描述的活性化合物或组合物给予不是小于6个月大的婴儿受试者。在具体实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是2岁的或更小的儿童。
在具体实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是年龄超过6个月大的任何婴儿或儿童和年龄超过50岁的任何成年人。在其他实施例中，受试者是怀孕的个体。在另一种实施方式中，受试者是在流感季节期间（例如，十一月至第二年四月）可能或即将怀孕的个体。在具体实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者是已经较早地生产1、2、3、4、5、6、7、或8周的女性。
在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的人类受试者是在由流感病毒感染产生的流感病毒感染或疾病的增加的风险上的任何个体（例如，免疫缺失的或免疫缺陷的个体）。在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的人类受试者是与具有由流感病毒感染产生的流感病毒感染或疾病的增加的风险的个体紧密接触的任何个体（例如，免疫缺失的或免疫缺陷的个体）。
在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的人类受试者是任何条件侵袭的个体，其中所述任何条件是对由流感病毒感染产生的流感病毒感染或并发症或疾病增加敏感性的条件。在其他实施例中，将本文中描述的活性化合物或组合物给予受试者，其中流感病毒感染有可能增加另一个条件的并发症，其中另一个条件是由流感病毒侵袭的个体，或他们在另一个条件的风险上的个体。在具体实施方式中，对流感病毒并发症增加敏感性或对于流感病毒增加所述条件关联的并发症的这样的条件是，例如，侵袭肺部的条件，如囊肿性纤维化、肺气肿、哮喘、或细菌感染（例如，由流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）、肺炎链球菌、嗜肺性军团菌（Legionellapneumophila）、和沙眼衣原体）；心血管病（例如，先天性心脏病、充血性心脏衰竭、和冠心病）；内分泌紊乱（例如，糖尿病）、神经病学的和神经元-发展条件（例如，脑、脊髓、外周神经、和肌肉的紊乱（如大脑性麻痹、癫痫症（痉挛疾病）、中风、智障（intellectualdisability）（例如，智力迟钝）、肌肉萎缩症、和脊髓损伤）。
在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的人类受试者是居住在团体住宅中的个体，如疗养院。在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的人类受试者是工作在、或度过大量的时间在团体住宅中，例如，疗养院中的个体。在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的人类受试者是卫生保健工作者（例如，医生或护士）。在某些实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的人类受试者是吸烟者。在具体实施方式中，要给予本文中描述的活性化合物或组合物的人类受试者是免疫缺失的或免疫抑制的个体。
另外，可被给予本文中描述的活性化合物或组合物，在流感并发症的增加的风险上的受试者包括：可将流感病毒传播给在并发症的高风险上的人的任何个体，如，例如，具有高危险的个体的家庭的成员，包含这些家庭，其将包含小于6个月大的婴儿、接触到年龄小于6个月的婴儿的个体、或将接触居住于疗养院或其他长期护理设施中的个体的个体；具有长期的肺部、心脏、或循环紊乱的个体；具有新陈代谢性疾病的个体（例如，糖尿病）；具有肾病的个体；具有血液紊乱的个体（包含贫血或镰刀形红细胞贫血病）；具有虚弱的免疫系统的个体（包含由药物、恶性肿瘤如癌症、器官移植、或HIV感染引起的抑制免疫反应）；接收长期的阿司匹林治疗的儿童（和因此如果感染流感，具有更高的发展雷尔氏综合征的机会）。
在其他实施例中，关于给予本文中描述的活性化合物或组合物的受试者包含年龄6个月大或更大的健康的个体，其：计划到可能发生flu爆发的外国和区域旅行，例如，从四月到九月的热带和南半球；作为可包括来自流行流感病毒的世界的区域的个人的大组织的旅行团的部分旅游；上中学或大学和居住于宿舍，或居住于机构设置中；或希望减少他们的患流感疾病的风险。
在某些实施方式中，给予本文中描述的活性化合物或组合物显示治疗不当的受试者包括流感接种疫苗显示治疗不当的任何个体，如：年龄小于六个月的婴儿；和对鸡蛋、鸡蛋产品、或在免疫原性配方的生产中使用的其他成分具有过敏反应（引起呼吸困难的过敏反应，其之后经常是休克）的个体。在某些实施方式中，当由于在免疫原性配方的生产中使用的一个或更多成分（例如，由于鸡蛋或鸡蛋产品的存在），显示本文中描述的活性化合物或组合物的给予治疗不当时，可通过不包括引起显示活性化合物或组合物的给予治疗不当的成分的方式生产活性化合物或组合物（例如，可不使用鸡蛋或鸡蛋产品生产活性化合物或组合物）。
在某些实施方式中，可取的是，不将活病毒疫苗给予一个或更多下列患者种群：老年人；小于6个月大的婴儿；孕妇；在1岁的年龄下的婴儿；在2岁的年龄下的儿童；在3岁的年龄下的儿童；在4岁的年龄下的儿童；在5岁的年龄下的儿童；在20岁的年龄下的成人；在25岁的年龄下的成人；在30岁的年龄下的成人；在35岁的年龄下的成人；在40岁的年龄下的成人；在45岁的年龄下的成人；在50岁的年龄下的成人；超过70岁的年龄的老年人；超过75岁的年龄的老年人；超过80岁的年龄的老年人；超过85岁的年龄的老年人；超过90岁的年龄的老年人；超过95岁的年龄的老年人；因为在这个年龄组中阿司匹林和野生型流感病毒感染关联的并发症，接收阿司匹林或含有阿司匹林的药物的儿童和青少年（年龄2-17岁）；具有哮喘或其他反应性呼吸道疾病的历史的个体；具有可能使他们倾向于患有严重的流感感染的慢性潜在的医学条件的个体；具有格林-巴利综合征（Guillain-Barresyndrome）的历史的个体；具有急性严重的发热疾病的个体；或中度地或严重地有病的个体。对于这样的个体，可优选给予本文中描述的灭活的病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、病毒颗粒、病毒样颗粒或非病毒载体。在慢性实施例中，优选地给予活病毒疫苗的受试者可包括健康的儿童和青少年，年龄2-17岁，和健康的成年人，年龄18-49岁。
在慢性实施例中，包括活病毒载体的免疫原性配方不能与其他活病毒疫苗一起同时地给予。
5.12给药的方式
5.12.1递送的途径
可依据各种途径将本文中描述的活性化合物或组合物递送给受试者。这些途径包括，但不限于，鼻内的、气管内的、口服的、皮内的、肌肉的、腹膜内的、经皮的、静脉内的、结膜的和皮下的途径。在具体实施方式中，依据皮下的途径将本文中描述的活性化合物或组合物递送给受试者。在某些实施方式中，配制适于局部给药的组合物，例如，适于皮肤。在具体实施方式中，给药的途径是鼻的途径，例如，作为鼻喷雾的部分。在某些实施方式中，配制适于肌肉给药的组合物。在某些实施方式中，配制适于皮下给药的组合物。在某些实施方式中，不能配制关于通过注射器给药的组合物。在关于活病毒疫苗的具体实施方式中，配制关于除了通过注射之外的途径给药的疫苗。
在其中抗原是病毒载体、病毒样颗粒载体、或细菌载体的情形中，例如，可优选的通过载体来源的骨架病毒或细菌的感染的天然的途径引入免疫原性组合物。可替换地，可优选的通过多肽来源的流感病毒的感染的天然的途径引入flu多肽。可有利地利用抗原，具体地病毒载体，诱导强劲的分泌腺和细胞的免疫应答的能力。例如，通过病毒载体的呼吸道的感染，例如，可在泌尿生殖系统中，诱导强烈的分泌型免疫应答，同时具有针对流感病毒的保护。另外，在优选的实施例中，可期望通过任何适当的途径将药物组合物引入肺部。例如，也可通过吸入器或喷雾器，以及具有用作喷雾的雾化剂的配方的使用，采取肺部给药。
在具体实施方式中，鼻内地给予亚单位疫苗。在具体实施方式中，肌肉地给予亚单位疫苗。在另一个具体实施方式中，皮下地给予亚单位疫苗。在另一个具体实施方式中，皮内地给予亚单位疫苗。
在具体实施方式中，鼻内地给予活病毒疫苗。在具体实施方式中，肌肉地给予活病毒疫苗。在另一个具体实施方式中，皮下地给予活病毒疫苗。在另一个具体实施方式中，皮内地给予活病毒疫苗。
在具体实施方式中，鼻内地给予灭活的病毒疫苗。在具体实施方式中，肌肉地给予灭活的病毒疫苗。在另一个具体实施方式中，皮下地给予灭活的病毒疫苗。在另一个具体实施方式中，皮内地给予灭活的病毒疫苗。
在具体实施方式中，鼻内地给予裂解病毒疫苗。在具体实施方式中，肌肉地给予裂解病毒疫苗。在另一个具体实施方式中，皮下地给予裂解病毒疫苗。在另一个具体实施方式中，皮内地给予裂解病毒疫苗。
在具体实施方式中，鼻内地给予病毒样颗粒或它的组合物。在具体实施方式中，肌肉地给予病毒样颗粒或它的组合物。在另一个具体实施方式中，皮下地给予病毒样颗粒或它的组合物。在另一个具体实施方式中，皮内地给予病毒样颗粒或它们的组合物。
在某些实施方式中，可利用本领域的一个技术人员已知的技术，将在体外利用flu多肽刺激的细胞引入（或再引入）受试者中。在某些实施方式中，可将细胞引入真皮中、真皮下、或引入外周血中。在某些实施方式中，优选地引入受试者的细胞是来源于同一个受试者的细胞，从而避免有害的免疫应答。在其他实施例中，也可使用来源于具有相似的免疫背景的供者主人的细胞。也可使用其他细胞，包含设计以便避免有害的免疫原性响应的那些细胞。
5.12.2给药的剂量和频率
有效地治疗和/或预防流感病毒感染或流感病毒疾病的活性化合物或组合物的量将取决于疾病的种类，且可通过标准的临床技术确定所述活性化合物或组合物的量。
在配方中采用的精确的剂量也将取决于给药的途径，以及由其引起的感染或疾病的严重性，且应该依据医师的判断和每一个受试者的情况决定所述剂量。例如，也可依赖给药的手段、靶位置、患者的生理学上的状态（包括年龄、体重、健康）、患者是人类或动物、给予的其他药物、和治疗是预防疾病的或治疗改变有效的剂量。通常，也可治疗人类或包含转基因哺乳动物的非人类哺乳动物的患者。最佳地用滴定法测量治疗剂量，从而最佳化安全性和功效。
在某些实施方式中，采用有助于识别最佳剂量范围的体外分析。可从来源于体外或动物模型试验系统的剂量响应曲线推断有效的剂量。
关于编码flu多肽的核酸的典型的剂量范围是每一个患者，从大约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg、或30-300μg核酸，例如，DNA。
在某些实施方式中，关于flu多肽的典型的剂量（例如，当作在裂解病毒疫苗和亚单位疫苗中提供的）范围是从约5μg至100mg、15μg至50mg、15μg至25mg、15μg至10mg、15μg至5mg、15μg至1mg、15μg至100μg、15μg至75μg、5μg至50μg、10μg至50μg、15μg至45μg、20μg至40μg、或25至35μg每千克的患者体重。在其他实施方式中，关于flu多肽的典型的剂量范围是从约1μg至50mg、5μg至50mg、1μg至100mg、5μg至100mg、15μg至50mg、15μg至25mg、15μg至10mg、15μg至5mg、15μg至1mg、15μg至100μg、15μg至75μg、5μg至50μg、10μg至50μg、15μg至45μg、20μg至40μg、或25至35μg的flu多肽每剂量。在某些实施方式中，关于flu多肽的典型的剂量包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50μg的flu多肽每剂量。在某些实施方式中，关于flu多肽的典型的剂量包括50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100μg的flu多肽每剂量。
可从10-100，或更多，病毒颗粒每剂量改变关于有传染性的病毒载体的剂量。在某些实施方式中，病毒载体的适当的剂量是102、5x102、103、5x103、104、5x104、105、5x105、106、5x106、107、5x107、108、5x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010、1x1011、5x1011或1012pfu，且每当需要时能一次、两次、三次或更多次间隔的给予受试者。
在某些实施方式中，关于VLPs的典型的剂量范围是从约0.01μg至约100mg,约0.1μg至约100mg、约5μg至约100mg、约15μg至约50mg、约15μg至约25mg、约15μg至约10mg、约15μg至约5mg、约15μg至约1mg、约15μg至约100μg、约15μg至约75μg、约5μg至约50μg、约10μg至约50μg、约15μg至约45μg、约20μg至约40μg、或约25至约35μg每千克患者。在其他实施例中，关于flu多肽的典型的剂量范围是从约1μg至约50mg、约5μg至约50mg、约1μg至约100mg、约5μg至约100mg、约15μg至约50mg、约15μg至约25mg、约15μg至约10mg、约15μg至约5mg、约15μg至约1mg、约15μg至约100μg、约15μg至约75μg、约5μg至约50μg、约10μg至约50μg、约15μg至约45μg、约20μg至约40μg、或约25至约35μgflu多肽每剂量，且每当需要时能一次、两次、三次或更多次间隔的给予受试者。
在一种实施方式中，配制灭活的疫苗，以便使其含有约5μg至约50μg、约10μg至约50μg、约15μg至约100μg、约15μg至约75μg、约15μg至约50μg、约15μg至约30μg、约20μg至约50μg、约25μg至约40μg、约25μg至约35μgflu多肽。这样的疫苗可含有一个或更多不同的flu多肽的组合，例如，来自A型流感病毒的一个或更多flu多肽和来自B型流感病毒的一个或更多flu多肽。在一种实施方式中，配制活的毒性减弱的流感疫苗（LAIV），以便使0.2-mL剂量含有106.5-7.5荧光转化灶单位的活的毒性减弱的流感病毒，其中所述活的毒性减弱的流感病毒来自表达至少一个流感flu多肽的三个菌株。
在某些实施方式中，将活性化合物或组合物作为单一剂量一次给予受试者。在某些实施方式中，将作为单一剂量，其次是3至6周稍后的第二剂量的活性化合物或组合物给予受试者。依照这些实施方式中，可在二次接种之后，以6至12个月的间隔，给予受试者加强接种。在某些实施方式中，加强接种可利用不同的活性化合物或组合物。在某些实施方式中，可重复给予相同的活性化合物或组合物，且可通过至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月、或至少6个月分开给药。在某些实施方式中，将活性化合物或组合物作为单一的剂量每年一次给予受试者。
在关于儿童的给药的具体实施方式中，假设相隔至少一个月，将活性化合物或组合物的两剂量给予儿童。在关于成人的给药的具体实施方式中，给出单一的剂量。在另一种实施方式中，假设相隔至少一个月，将活性化合物或组合物的两剂量给予成年人。在另一种实施方式中，在假设相隔一个月的两剂量中，首次将活性化合物或组合物给予幼儿（六个月至九岁大）。在具体实施方式中，在他们的接种疫苗的第一年中只接收一个剂量的孩子应该在后面的年龄中接收两个剂量。在某些实施方式中，对于第一次给予流感疫苗，例如，本文中描述的免疫原性配方的年龄2-8岁的儿童，优选在相隔4周时给予两个剂量。在某些实施方式中，与关于年龄超过三岁的受试者可优选的0.5ml剂量相比，对于年龄6-35个月的儿童，可优选一半的剂量（0.25ml）。
在具体实施方式中，在秋季或冬季，例如，在每一个半球中的流感季节之前或期间，将活性化合物或组合物给予受试者。在一种实施方式中，在季节的初期，例如，九月下旬或十月上旬，给予儿童他们的第一剂量，所以可在流感季节的高峰期之前给予第二剂量。
在某些实施方式中，在相隔2周、3周、4周、5周或6周以2、3、4、5或更多的剂量将活性化合物或它的组合物给予受试者。在某些实施方式中，将2、3、4、5或更多剂量的活性化合物或组合物以1μg至20mg、10μg至20mg、500μg至20mg、1mg至20mg或5mg至20mg的剂量，相隔2、3、4、5或6周给予受试者。在某些实施方式中，给予的活性化合物或组合物每一次都是相同的。在某些实施方式中，给予的flu多肽或它的组合物每一次都是不同的。
关于利用结合flu多肽的抗体的被动免疫，剂量范围是从大约0.0001至100mg/kg，和更通常地0.01至5mg/kg的患者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内，换句话说，对于70kg的患者分别是70mg或700mg或在70-700mg的范围内。典型的治疗方式要求每隔两周给药一次或每月给药一次，或关于一年或超过几年的时期，或超过几年的时间间隔每隔3-6个月给药一次。在某些方法中，同时地给予具有不同的结合特异性的两个或更多单克隆抗体，其中给予的每一个抗体的剂量的情形符合指出的范围。通常在多种场合给予抗体。单一的剂量之间的时间间隔可以是每星期的、每月的或每年的。如通过在患者中测量抗体对flu多肽的血液水平指示的，时间间隔也可能是无规律的。
5.13生物学试验
5.13.1用于检验流感flu多肽的活性的试验
可利用本领域已知的任何试验指导试验，其中所述试验用于检验flu多肽在本文中公开的载体中的表达。例如，用于掺入病毒载体的试验包括培养这个章节或章节5.4或5.5中描述的病毒，依据离心法通过蔗糖垫（sucrosecushion）来纯化病毒颗粒，和随后的通过免疫分析，如免疫印记，利用本领域已知的方法，分析flu多肽表达。
在一种实施方式中，通过利用本领域已知的关于抗体-抗原相互作用的任何试验，检验flu多肽特异性地结合flu多肽关注的抗体的能力，分析本文中公开的flu多肽的正确的折叠和功能性。用于这样的分析的抗体包含，例如，在Wang等人(2010)“BroadlyProtectiveMonoclonalAntibodiesagainstH3InfluenzaVirusesfollowingSequentialImmunizationwithDifferentHemagglutinins,”PLOSPathogens6(2):1-9、国际公开PCT/US2010/036170和美国专利第12/778,103号中描述的中和抗体。
在另一种实施方式中，利用本领域已知的任何方法，例如，NMR、X-射线晶体学方法、或二级结构预测方法，例如，圆二向色性，通过flu多肽的结构或构象的测定，分析本文中公开的flu多肽的正确的折叠。
5.13.2用于检验利用流感flu多肽产生的抗体的活性的试验
可以本领域的一个技术人员已知的多种方法表征本文中描述的抗体（例如，ELISA、表面等离子共振展示（BIAcore）、免疫印记、免疫荧光、免疫染色和/或免疫中和分析）。在某些实施方式中，分析抗体特异性地结合flu多肽，或包括所述多肽的载体的能力。可在溶液中（例如，Houghten,1992,Bio/Techniques13:412421）、在磁性珠上（Lam,1991,Nature354:8284）、在芯片上（Fodor,1993,Nature364:555556）、在细菌上（美国专利第5,223,409号）、在孢子上（美国专利5,571,698；5,403,484；和5,223,409）、在质粒上（Cull等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:18651869）或在噬菌体上（Scott和Smith,1990,Science249:386390;Cwirla等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:63786382；和Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301310）进行这样的分析（这些参考文献中每一篇的全部内容均结合于本文以供参考）。
可通过本领域已知的任何方法评价抗体对flu多肽的特异性的结合和与其他抗原的交叉反应。可用于分析特异性的结合和交叉反应的免疫试验包含，但不限于，利用技术如免疫印记、放射性免疫试验、ELISA（酶连免疫吸附试验）、“三明治式”免疫试验、免疫沉淀反应试验、沉淀素试验、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集试验、补体结合试验、免疫放射测定、荧光免疫试验、蛋白质A免疫试验，仅列举这些，的竞争性和非竞争性试验系统。这样的试验是常规的和本领域已知的（参见，例如，Ausubel等人编著,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1,JohnWiley&Sons,Inc.,纽约，其全部内容结合于本文以供参考）。
可通过竞争性结合试验测定抗体对flu多肽的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的解离速率（off-rate）。竞争性结合试验的一个实例是包括在增加未标记的抗原的量的情况下，利用所关注的抗体孵育标记的抗原（例如，3H或125I），和探测结合标记的抗原的抗体的放射性免疫试验。可从依据斯卡查德图试验的数据确定抗体对flu多肽的亲和力和结合解离速率。也可利用放射性免疫试验确定与第二抗体的竞争。在这个情形中，在增加未标记的第二抗体的量的情况下，利用标记的化合物（例如，3H或125I）结合的检验抗体孵育flu多肽。
在某些实施方式中，利用KinExA3000系统（SapidyneInstruments,Boise,ID）测量抗体结合亲和力和比率常数。在某些实施方式中，表面的等离子共振（例如，BIAcore动力学的）分析用于测定抗体对flu多肽的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括，分析来自芯片的flu多肽的结合和分离，其中在所述芯片在它们的表面上具有相对于flu多肽固定的抗体。典型的BIAcore动力学研究涉及，将在含有0.005%Tween-20的HBS缓冲液中的不同浓度的250μL抗体反应物（mAb，Fab）注射到传感器芯片表面上，已经在所述传感器芯片表面上固定了flu多肽。将流量保持在75μL/min的常数。收集15min或如果必要更长的时间的分离数据。尽管其他再生剂被当作环境保护，在每一次注射/分离循环之后，利用简短的，稀酸，一般是10-100mMHCl的1min脉冲，从flu多肽表面上清除结合的抗体。更具体地，关于结合率Kon和分离率Koff的测量，通过标准的胺耦联化学的应用，即EDC/NHS方法（EDC=N-二乙氨基丙基）-碳二亚胺），直接地将多肽固定到传感器芯片表面上。简单地说，在pH4或pH5的10mMNaOAc中，制备5-100nM的多肽溶液，且经过EDC/NHS-激活的表面，直到固定近似地30-50RU的值的多肽。在这个之后，利用注射1MEt-NH2除去未反应的活性酯。为了参考目的，在同样的固定条件下，制备不含多肽的空白的表面。一旦已经制备了适当的表面，在HBS/Tween-20中制备每一个抗体反应物的适当的稀释系列，且经过串联连接的多肽和参考细胞表面。取决于要评价的平衡结合常数KD改变制备的抗体浓度的范围。如上述描述的，在每一个注射/分离循环之后，利用适当的再生剂清除结合的抗体。
可利用本领域技术人员已知的任何试验测定抗体的中和活性。可利用本领域技术人员已知的技术，分析本文中描述的抗体他们抑制流感病毒与它的宿主细胞受体（唾液酸）的结合的能力。例如，在有或缺乏抗体的情况下，表达流感病毒受体的细胞可与包括流感病毒的组合物接触，且可测量抗体抑制流感病毒的结合的能力。可替换地，在无细胞的试验中，可测定抗体抑制流感病毒结合它的受体的能力。
在其他实施方式中，适用于本文中描述的方法中的抗体不抑制流感病毒受体结合，还有在本文中描述的试验中仍然发现中和。在某些实施方式中，在本领域已知的或本文中描述的试验中，依照本文中描述的方法使用的，适当的抗体减少或抑制病毒-宿主膜融合。
在一种实施方式中，利用含有报告的流感病毒和能够被病毒感染的宿主细胞在体外试验中分析病毒宿主膜融合。与阴性对照相比，如果抑制或减少报告活性，则抗体抑制融合（例如，在有对照抗体的情况下或在缺乏抗体的情况下的报告活性）。
5.13.3用于检验刺激的细胞的活性的试验
依照本文中描述的方法，可分析刺激的细胞的，例如，所关注的多聚核苷酸或基因的整合、转录和/或表达、整合的基因的拷贝的数、和整合的位置。可在任何时间上实现这样的分析且可通过本领域已知的任何方法实现这样的分析。在其他实施例中，利用本领域已知的或本文中描述的方法，通过探测相对于flu多肽的中和抗体的生产，确定利用本文中描述的flu多肽靶细胞的成功的刺激。
在某些实施方式中，可分析，给予刺激的细胞，例如，DCs的受试者中的所述细胞的位置、载体-运送的多聚核苷酸或编码flu多肽的基因的表达、免疫应答的刺激（例如，相对于flu多肽的中和抗体的生产）、和/或通过本领域已知的或本文中描述的任何方法监视流感病毒感染关联的症状或与其关联的疾病。
报告试验可用于确定flu多肽的靶向特异性。例如，可从受试者获得骨髓细胞的混合种群，且可在体外培养。可将flu多肽给予骨髓细胞的混合种群，和可在培养的细胞中分析flu多肽关联的报告基因的表达。在某些实施方式中，混合的细胞种群中的至少大约50%、更优选地至少大约60%、70%、80%或90%，还有更优选地至少大约95%的刺激的细胞是树突细胞。
5.13.4病毒活性试验
可在体外评价本文中描述的抗体或它的组合物的抗病毒的活性。在一种实施方式中，在体外检验抗体或它的组合物对流感病毒的生长的影响。可通过本领域已知的或本文中描述的任何方法评价流感病毒的生长（例如，在细胞培养中）。在具体实施方式中，在0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、0.1和1、或1和10的MOI上，或0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10的MOI上感染细胞，且利用补充的无血清培养基孵育所述细胞。通过血凝素空斑或本文中描述的任何其他病毒试验确定悬浮液中的病毒滴度。其中可评价病毒滴度的细胞包含，但不限于，EFK-2细胞、猴肾细胞（Verocells）、MDCK细胞、初级人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、H292人上皮细胞系和Hela细胞。体外试验包括在体外培养的细胞中，利用本领域已知的或本文中描述的方法，测量改变的病毒复制（例如，通过空斑形成确定，）或病毒蛋白质的生产（例如，通过免疫印记分析确定）或病毒RNAs（例如，通过RT-PCR或RNA印记分析确定）。
在一种非限制性实施方式中，靶哺乳动物细胞系的单层感染不同的量的（例如，3空斑形成单位（plaqueformingunits）（pfu）或5pfu的多重性）病毒（例如，流感），且随后在有或缺乏抗体的各种稀释物的情况下（例如，0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、或10μg/ml）培养所述单层。在感染后48小时或72小时收获感染的培养，且在适当的靶细胞系上（例如，猴肾细胞）通过本领域已知的标准的空斑试验测量滴度。
在血凝反应试验的非限制性的实例中，细胞接触抗体，且同时地或随后地感染病毒（例如，在1的MOI上），且在允许病毒复制的条件下孵育病毒（例如，20-24小时）。优选地，在遍及感染的过程中出现抗体。然后，利用0.5%鸡红血细胞，通过血凝反应试验确定病毒复制和病毒颗粒的释放。参见，例如，Kashyap等人,PNASUSA105:5986-5991。在某些实施方式中，如果它至少2井的HA减少病毒复制，其近似地等于病毒滴度中的75%的减少，则认为该化合物是病毒复制的抑制剂。在具体实施方式中，抑制剂通过50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多减少在这种试验中的病毒滴度。在其他具体实施方式中，抑制剂导致受试者中的流感病毒滴度近似地1对数或更多、近似地2对数或更多、近似地3对数或更多、近似地4对数或更多、近似地5对数或更多、近似地6对数或更多、近似地7对数或更多、近似地8对数或更多、近似地9对数或更多、近似地10对数或更多、1至3对数、1至5对数、1至8对数、1至9对数、2至10对数、2至5对数、2至7对数、2对数至8对数、2至9对数、2至10对数、3至5对数、3至7对数、3至8对数、3至9对数、4至6对数、4至8对数、4至9对数、5至6对数、5至7对数、5至8对数、5至9对数、6至7对数、6至8对数、6至9对数、7至8对数、7至9对数、或8至9对数的减少。流感病毒滴度中的对数的减少可以是与阴性对照相比的减少、可以是与另一个治疗相比的减少、或可以是与给予抗体之前的患者的滴度相比的减少。
5.13.5细胞毒性试验
本领域已知的很多试验可用于评价暴露于活性化合物或它的组合物之后，细胞（感染的或未感染的）或细胞系的生存能力，因此，确定化合物或组合物的细胞毒性。例如，可通过测量溴脱氧尿苷（BrdU）掺入（参见，例如，Hoshino等人,1986,Int.J.Cancer38,369;Campana等人,1988,J.Immunol.Meth.107:79）、（3H）胸腺嘧啶脱氧核苷掺入（参见，例如，Chen,J.,1996,Oncogene13:1395-403;Jeoung,J.,1995,J.Biol.Chem.270:1836773），通过直接的细胞计数，或通过探测已知的基因如原癌基因（例如，fos、myc）的转录、翻译或活性的改变，或细胞周期标记物（Rb、cdc2、cyclinA、D1、D2、D3、E等等）分析细胞增殖。可通过本领域已知的任何方法，确定这样的蛋白质和mRNA和活性的水平。例如，可通过已知的免疫诊断方法如ELISA、免疫印记或利用抗体，包括商业上可用的抗体的免疫沉淀反应测定蛋白质的量。可利用本领域已知的和常规的方法，测定mRNA的量，例如，利用RNA分析、核糖核酸酶保护、或结合逆转录的聚合酶链式反应。可通过利用台盼蓝染色或本领域已知的其他细胞死亡或生存能力标记物，评价细胞生存能力。在具体实施方式中，测量细胞ATP的水平，从而确定细胞生存能力。
在具体实施方式中，在三天和七天周期中，利用本领域的分析标准，如测量细胞内ATP的水平的CellTiter-GloAssayKit（Promega），测量细胞生存能力。细胞ATP的减少是细胞毒素影响的指示。在另一个具体实施方式中，可以中性红吸收法（neutralreduptakeassay）测量细胞生存能力。在其他实施例中，形态改变的目视观测可包含放大、颗粒度、具有参差不齐的边的细胞、薄膜状的外观、变圆、从细胞壁的表面脱离，或其他改变。遵照看到的细胞毒性的程度，给出这些改变的名称，其是T（100%有毒的）、PVH（部分地有毒的-很重-80%）、PH（部分地有毒的-重-60%）、P（部分地有毒的-40%）、Ps（部分地有毒的-轻微的-20%）、或0（无毒性-0%）。通过这些数据的衰退分析确定50%细胞抑制的（细胞毒素的）浓度（IC50）。
在具体实施方式中，在细胞毒性试验中使用的细胞是动物细胞，包括初级细胞和细胞系。在某些实施方式中，细胞是人类细胞。在某些实施方式中，在一个或更多下列细胞系中评价细胞毒性：U937，人类单核细胞系；初级外周血单核细胞（PBMC）；Huh7，人类肝胚细胞瘤细胞系；293T，人类胚肾细胞系；和THP-1，单核细胞。在某些实施方式中，在一个或更多下列细胞中评价细胞毒性：MDCK、MEF、Huh7.5、Detroit、或人类气管支气管上皮（HTBE）细胞。
可在动物模型中检验活性化合物或它的组合物的体内毒性。例如，本文中描述的和/或本领域已知的其他，用于检验活性化合物的活性的动物模型也可用于确定这些化合物的体内毒性。例如，给予动物浓度范围的活性化合物。随后，随着时间的过去监视动物的致死率、体重损失或无法增加体重、和/或可以是组织损伤的指示的血清标记物（例如，被看作普通组织损伤的指示物的肌氨酸磷酸激酶水平，被看作可能的肝损伤的指示物的谷氨酸草酸转氨酶或丙酮酸转氨酶的水平）。除了剂量之外，这些体内试验也可适于检验各种给药模式和/或方式的毒性。
也可在细胞培养中或实验动物中，通过标准的药物学程序确定活性化合物的毒性和/或功效，例如，确定LD50（50%的种群的剂量致死）和ED50（在50%的种群中剂量治疗有效）。有毒的和治疗的作用之间的剂量比是治疗指数，且可将其表示成比率LD50/ED50。优选表现大的治疗指数的活性化合物。在可使用表现毒性副作用的活性化合物时，应该采取康复，从而设计将这样的试剂靶向被感染的组织的位置的运送系统，以便最小化对未被感染的细胞的潜在的损伤，和因此，减少副作用。
从细胞培养试验和动物研究获得数据可用于配制适用于人类的活性化合物的剂量范围。优选地，这些试剂的剂量位于循环的浓度的范围内，其包括具有小的或无毒性的ED50。可取决于采用的剂量形式和利用的给药途径，在这个范围内改变剂量。关于在本文中描述的方法中使用的任何活性化合物，最初可从细胞培养试验中估计有效的剂量。可在动物模型中配制剂量，从而达到循环血浆浓度范围，其包含如细胞培养中确定的IC50（例如，达到症状的最大抑制的一半的检验化合物的浓度）。这样的信息可用于更精确地确定人类中有用的剂量。例如，可通过高效液相色谱测量血浆中的水平。本文中提供关于剂量测定的附加信息。
进一步地，本领域已知的任何试验可用于评价本文中描述的活性化合物和组合物的预防疾病的和/或治疗的效用，例如，通过测量病毒感染或与之关联的条件或症状。
5.13.6用于评价flu多肽诱导免疫应答的能力的试验
可利用本领域技术人员已知的或本文中描述的任何途径评价flu多肽在受试者中产生免疫应答的能力，其中所述免疫应答能够与多个流感病毒菌株交叉反应，和优选地使受试者免于多个流感病毒菌株。在某些实施方式中，可通过利用本文中描述的flu多肽免疫受试者（例如，鼠）或一组受试者，和利用对照（PBS）免疫另外的受试者（例如，鼠）或一组受试者，评价flu多肽在受试者中产生免疫应答的能力，其中所述免疫应答能够与多个流感病毒菌株交叉反应，和优选地使受试者免于多个流感病毒菌株。随后可利用多个剧毒的流感病毒菌株激发受试者或一组受试者，且可确定剧毒的流感病毒菌株在受试者或一组受试者中引起流感病毒疾病的能力。本领域技术人员将识别，如果利用对照免疫，随后利用剧毒的流感病毒菌株激发的受试者或一组受试者经受流感病毒疾病，但是利用本文中描述的flu多肽免疫的受试者或一组受试者不经受流感病毒疾病，则flu多肽可在受试者中产生能够与多个流感病毒菌株交叉反应的免疫应答。进一步地，在某些实施方式中，如果与利用对照免疫的受试者比较，利用flu多肽免疫的受试者或一组受试者经受较短期的流感病毒疾病，接收较少的住院治疗时间，表现减少/缺乏流感病毒疾病关联的一个或更多症状或具有表现他们自己较短期的症状，那么本文中描述的flu多肽可产生免疫应答，其能够与多个流感病毒菌株交叉反应。用于确定受试者是否经受流感病毒疾病的方法是本领域已知的和本文中描述的。参见，例如，下文的章节5.13.7和6.3。可通过免疫试验，如ELISA检验flu多肽诱导抗血清的能力，其中所述抗血清仅仅与多个流感病毒菌株或与多种血凝素亚型交叉反应。
5.13.7在动物中试验流感活性的方法
在用于人类之前，优选地在体内试验活性化合物和它的组合物期望的治疗或预防疾病的活性。例如，体内试验可用于确定给予活性化合物或它的组合物和/或另外的治疗剂是否是优选的。例如，为了评价活性化合物或它的组合物预防流感病毒疾病的应用，可在动物感染流感病毒之前给予组合物。可替换地，或另外，可在动物感染流感病毒的同时给予活性化合物或它的组合物。为了评价活性化合物或它的组合物治疗流感病毒感染或与之关联的疾病的应用，可在利用流感病毒感染动物之后给予化合物或组合物。在具体实施方式中，将活性化合物或它的组合物超过一次地给予动物。
可在包括，但不限于，大鼠、小鼠、鸡、牛、猴子、猪、山羊、绵羊、狗、兔、豚鼠，等等，动物模型系统中，检验活性化合物和它的组合物的抗病毒活性。在具体实施方式中，在鼠模型系统中检验活性化合物和它的组合物。这样的模型系统被广泛地应用且是技术人员所熟知的。在具体实施方式中，在鼠模型系统中检验活性化合物和它的组合物。在这个章节中提供关于流感病毒的动物模型的非限制性的实例。
通常，利用流感病毒感染动物和同时地或随后利用活性化合物或它的组合物，或无效对照药治疗动物。可替换地，利用活性化合物或它的组合物或无效对照药处理动物，和随后利用流感病毒感染动物。可通过本领域已知的方法，例如，测量改变的病毒滴度的那些（例如，通过空斑形成确定），病毒蛋白质的生产（例如，通过免疫印记、ELISA、或流式细胞仪分析（flowcytometryanalysis）确定）或病毒核酸的生产（例如，通过RT-PCR或RNA印记分析确定），检验从这些动物获得的样品（例如，血清、尿、痰、精液、唾液、血浆、或组织样品）的病毒复制。对于组织样品中的病毒的定量，在磷酸盐-缓冲的盐（PBS）中使组织样品均匀化，且在细胞（例如，Vero、CEF或MDCK细胞）的单层上在37℃吸附澄清的匀浆的稀释液1小时。在其他试验中，在感染之后进行组织病理学评价，优选地，已知靶向感染的器官病毒的评价。可利用病毒-特定的单克隆抗体进行病毒免疫组织化学。
也可利用体内试验确定活性化合物或它的组合物对病毒的毒性的作用，其中，评价给予活性化合物或它的组合物的被感染的受试者中的病毒的滴度，给予活性化合物或它的组合物的被感染的受试者的生存的时间长度，给予活性化合物或它的组合物的被感染的受试者中的免疫应答，给予活性化合物或它的组合物的被感染的受试者中的症状的数目、持续时间和/或严重性，和/或给予活性化合物或它的组合物的被感染的受试者中的一个或更多症状的发作之前的时期。可使用本领域技术人员已知的技术来测量这样的影响。在某些实施方式中，相对于未处理的受试者，活性化合物或它的组合物在流感病毒的滴度中导致0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、或1,000倍或更大的减少。在某些实施方式中，相对于未处理的受试者，活性化合物或它的组合物在流感病毒的滴度中导致近似地1对数或更多、近似地2对数或更多、近似地3对数或更多、近似地4对数或更多、近似地5对数或更多、近似地6对数或更多、近似地7对数或更多、近似地8对数或更多、近似地9对数或更多、近似地10对数或更多、1至3对数、1至5对数、1至8对数、1至9对数、2至10对数、2至5对数、2至7对数、2对数至8对数、2至9对数、2至10对数、3至5对数、3至7对数、3至8对数、3至9对数、4至6对数、4至8对数、4至9对数、5至6对数、5至7对数、5至8对数、5至9对数、6至7对数、6至8对数、6至9对数、7至8对数、7至9对数、或8至9对数的减少。
已经描述了发展的流感病毒动物模型，如雪豹、鼠、豚鼠、松鼠、猴、短尾猿、和鸡，以便用于检验对流感病毒的抗病毒试剂。参见，例如，Sidwell等人,AntiviralRes.,2000,48:1-16；LowenA.C.等人PNAS.,2006,103:9988-92；和McCauley等人,AntiviralRes.,1995,27:179-186和Rimmelzwann等人,AvianDiseases,2003,47:931-933。关于流感的鼠模型，可用于分析给予流感-感染的小鼠的活性化合物的抗病毒活性的参数的非限制性的实例包括肺炎-有关的死亡、血清α1-酸糖蛋白类增加、动物体重、通过血凝素分析的肺病毒、通过空斑试验分析的肺病毒、和肺中的组织病理学的改变。执行统计分析，以便计算显著性（例如，0.05或更少的P值）。
在其他分析中，在动物模型受试者的感染之后进行组织病理学评估。可检查鼻甲骨和气管的上皮改变和上皮下炎症。可在大的、中间的、和小的或末端的细支气管中检查肺的细支气管上皮改变和细支气管周的炎症。也可评价肺泡的炎性改变。在如下的0至3＋等级上将中间的细支气管分级：0（正常的：由具有纤毛的顶端边界和基底假核的中间的至高的柱形上皮细胞排列的；最小的炎症）；1＋（柱形的上皮层和甚至在外形中只具有些微地增加的增殖；在很多细胞上仍然可见纤毛）；2＋（在从衰减至显著的增殖的范围的上皮层中的显著的改变；在内腔边界（luminalborder）上紊乱的细胞和无规律的层外形）；3＋（关于官腔内可见的具有坏死的细胞显著地破坏的和紊乱的上皮层；衰弱的某些细支气管和显著的反应增殖中的其他）。
在如下的0至2.5＋等级上将气管分级：0（正常的：由具有纤毛顶端边界、基底的和假层的核的中间的至高的柱形上皮细胞排列的。顶端的边界和核之间明显的细胞质。具有鳞状上皮细胞的偶然的小病灶）；1＋（上皮层的局灶性鳞状转化）；2＋（许多上皮层的散布的鳞状转变，可明显病灶性地纤毛）；2.5＋（具有很少纤毛明显的散布鳞状转变）。
利用病毒-特定的单克隆抗体进行病毒免疫组织化学（例如，NP-、N-或HN-特定的单克隆抗体）。如下0至3＋将染色分级：0（未感染的细胞）；0.5＋（少数的感染的细胞）；1＋（少数的感染的细胞，如广泛地分开的单独的细胞）；1.5＋（少数的感染的细胞，如广泛地分开的单个的和小的细胞群）；2＋（中等数目的感染的细胞，在上皮层排列的细支气管的部分中，或肺泡中的小叶下病灶中，通常影响一群邻近的细胞）；3＋（许多感染的细胞，在细支气管中影响大多数的上皮层，或在肺泡中的大叶下病灶中广泛分布）。
在一种实施方式中，在病毒感染的动物模型中，利用野生型病毒和拟病毒比较诱导肺损伤和引起感染的能力。如可通过视觉检查健康的肺叶的百分比评价肺损伤。处死通过戊巴比妥的静脉给药p.i.5天的动物，且完全清除它们的肺。真实地评估由肉眼可见的损伤侵袭的每一个肺叶的表面的百分比。均分百分比，从而获得每一个动物的7个肺叶的平均值。在其他试验中，可检验鼻腔分泌物，从而确定病毒负担或滴度。可在尸体剖检期间采取鼻腔分泌物，从而确定感染后的病毒负担。
在一种实施方式中，在组织样品中定量病毒。例如，在磷酸盐缓冲的盐（PBS）中使组织样品均匀化，且将澄清的匀浆的稀释液在细胞（例如，MDCK细胞）的单层上在37℃吸收1h。然后利用最小基础培养基的溶液覆盖感染的单层，其中所述培养基含有0.1%的牛血白蛋白（BSA）、0.01%DEAE-葡聚糖、0.1%NaHCO3，和1%琼脂。孵育器皿2至3天，直到可显现空斑。如下进行组织培养感染剂量（TCID）试验，从而滴定来自PR8-感染的样品的病毒。利用介质中澄清的组织匀浆的对数稀释液孵育96-孔板中的细胞（例如，MDCK细胞）融合单层。在接种之后的两至三天，通过血凝反应试验（HA试验）评价每孔的0.05-ml等分试样的病毒生长。
5.13.8在人类中分析流感活性的方法
在一种实施方式中，在感染的人类受试者中评价活性化合物或它的组合物。依照这种实施方式，将活性化合物或它的组合物给予人类受试者，且通过，例如，分析生物样品（例如，血清或血浆）中病毒或病毒核酸的水平，确定活性化合物或组合物对病毒复制和/或生存的影响。可通过比较利用对照处理的受试者或一组受试者中的病毒复制和/或生存的水平，与利用活性化合物或它的组合物处理的受试者或一组受试者中的病毒复制和/或生存的水平，识别改变病毒复制和/或生存的活性化合物或它的组合物。可替换地，可通过比较在活性化合物或它的组合物的给予之前与之后的受试者或一组受试者中的病毒复制和/或生存的水平，识别病毒复制和/或生存中的改变。本领域技术人员已知的技术可用于获得生物样品和分析mRNA或蛋白质表达。
在另一种实施方式中，在感染的受试者中，评价活性化合物或它的组合物对流感病毒感染/疾病关联的一个或更多症状的严重性的影响。依照这种实施方式，将活性化合物或它的组合物或对照给予经受流感病毒感染的人类受试者，且确定活性化合物或组合物对病毒感染的一个或更多症状的影响。可通过比较利用对照处理的受试者与利用活性化合物或组合物处理的受试者，识别减少一个或更多症状的活性化合物或它的组合物。在另一种实施方式中，将活性化合物或它的组合物给予健康的人类受试者，且监视所述活性化合物或组合物作为疫苗的功效（例如，监视受试者流感病毒感染的症状的发作；住院治疗的减少，流感病毒感染受试者的能力；和/或一个或更多症状的减少/缺乏和/或流感病毒感染关联的症状的持续时间）。熟知传染病的医师已知的技术可用于测定活性化合物或它的组合物是否减少流感病毒疾病关联的一个或更多症状。
5.14试剂盒
本发明提供的是药物学上的包装或试剂盒，其包括利用本文中描述的药物组合物的一个或更多成分装填的一个或更多容器，如本发明提供的一个或更多活性化合物。可选地这些容器关联的可以是在通过政府机构调节的医药品或生物产品的制造应用或出售规定的形式中的提示，其提示反应制造机构的批准，关于人类给药的应用或出售。
可在上述方法中使用本文中包含的试剂盒。在一种实施方式中，在一个或更多容器中，试剂盒包括本文中描述的活性化合物，优选地一个或更多流感flu多肽。在某些实施方式中，试剂盒包括本文中描述的疫苗，例如，裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、灭活的流感病毒疫苗、或活流感病毒疫苗。
6实施例
6.1单克隆抗体12D1
本实例以与HA2的长的α-螺旋反应的抗流感病毒抗体，单克隆抗体12D1为例。
6.1.1材料和方法
6.1.1.1截短的血凝素亚单位2（HA2）
逆转录A/HK/1/68HA的完全的译码区域，且从病毒RNA扩增，随后亚克隆到pCAGGs表达载体中。通过来自pCAGGs-HK68HA的PCR扩增产生HA2部分的截短的形式，且进一步亚克隆到pCAGGs-绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒中。因此，将由编码GFP的表达载体组成的合成的质粒融合到截短的HA2的部分上。所有的构造都进行测序和证实。
6.1.1.2免疫印记
通过先前描述的方法产生印记（Towbin等人,ProcNatlAcadSciUSA,1979.76(9):4350-4）。在含有SDS和0.6MDTT的上样缓冲液中，在100℃将样品煮沸5分钟。在4-20%Tris-HClSDS-PAGE凝胶体中（Bio-Rad,Inc.）分辨免疫沉淀反应的复合体、细胞裂解液或纯化的病毒，且将样品印记到Protran硝化纤维薄膜上（Whatman）。利用兔抗-GFP（SantaCruzBiotechnology,Inc）和/或mAb12D1探测GFP和融合GFP-HA截短的肽。二抗是抗-兔IgGHRP（Dako）和抗-鼠Ig（GEHealtchare,Inc.）。
6.1.1.3免疫沉淀反应
利用Lipofectamine2000（Invitrogen,Inc），以编码GFP-截短的HA2融合蛋白的各种pCAGGs转染293T细胞。在转染后24小时，利用放射免疫沉淀测定法（radioimmuno-precipitationassay）（RIPA）缓冲液裂解细胞，且截短的融合肽与1至5μgmAb12D1在4℃过夜，进行免疫沉淀反应，其中所述mAb12D1结合到蛋白质G-琼脂糖上（Roche,Inc）。在还原和变性的条件下，通过免疫印记分析免疫沉淀反应。
6.1.1.4ELISA
以2ug/mlHApep-KLH结合物（图2B）或纯化的HA（图2A、C）涂覆96孔板（NuncImmulon2），在PBS中4℃过夜。以1%BSA/PBS在室温下封闭板30分钟，且以PBS/.025%Tween洗涤板两次。连续地在1%BSA/PBS中稀释抗体或抗血清，将其加入到板中，之后在37℃孵育3小时。洗涤板三次，将1：2000稀释的抗-鼠-AP（SouthernBiotech）加入到孔中，之后在37℃孵育3小时。然后将对硝基苯磷酸二钠底物（P-nitrophenylphosphate(PNPP)substrate）加入到孔中，且允许在室温下显影20-30分钟。在405nm下采取光学密度测量。
6.1.2结果
如图1中证明的，mAb12D1在HA2分子的氨基酸76-130的区域内反应；这个区域包括HA2的“长的α-螺旋”。同样地已知mAb12D1在体内对H3病毒感染具有保护活性（通过病毒激发之前的mAb12D1的被动转移证明）。
6.2flu多肽的设计和生产
应该假设，利用HA2的76-130区域的免疫作用可对H3亚型的或多个亚型的流感病毒引出相似的保护性免疫应答。
为了增加HA2的76-130肽的免疫原性，设计具有C-末端空间结构域的构造，其由八个氨基酸，之后跟随半胱氨酸残基组成，其促进调节的初级胺偶合到载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白（KLH）上。为了增加血清半衰期，在N-末端乙酰化肽。
为了证实KLH结合物内的长的α-螺旋的结构的整体性，通过直接的结合ELISA检验mAb12D1与结合物的结合，且发现，12D1结合区域是完整无缺的（图1B）。
6.2.1mAb12D1的HA2结合区域
检查H3血凝素的区域的识别，其中所述H3血凝素可引出相似于12D1单克隆抗体（mAb）的抗体。在有抗-H3mAb的情况下，A/HK/1968病毒的十六次传代不产生逃逸变体，其可有助于结合抗原表位的识别。在空斑试验中，对在利用50ug/mlmAb12D1孵育A/HK/1968病毒之后，出现的六个空斑的血凝素进行测序，但是没有发现野生型血凝素的变化。因为mAb12D1在体内调节对流感疾病的保护，且与病毒血凝素的连续的抗原表位（非必需的三聚体结构）反应，同样地通过免疫印记与变性的血凝素单体的反应证明，集中12D1结合抗原表位。产生融合到GFP上的截短的血凝素构造，其由各种长度的血凝素片段组成。GFP表达用于评价在转染的293T细胞中构造的表达。通过截短的血凝素构造的分析，确定，在氨基酸30-106的区域中，12D1抗体结合部位主要与HA2亚单位的进行相互作用。在76-184和91-184截短中减少的12D1结合而没有减少的GFP表达连同与106-184截短的结合的损失一起表明，12D1结合取决于与HA276-106区域中的氨基酸的接触（图1）。设计且构造附加的截短的HAs，以便进一步缩小12D1的最小的结合位点。那些之中，不仅在免疫印记中通过12D1，而且也通过免疫沉淀正面的探测从aa76至aa130生成的区域－代表HA2的长的α-螺旋。
这些30个氨基酸符合HA2的长的α-螺旋的膜末端部分。12D1抗体结合部位可与在这个区域（HA1或HA2中）外面的氨基酸具有另外的接触，但是不是免疫印记结合必需的。
6.3通过fLu多肽与多种HA亚型反应诱导的血清抗体
6.3.1材料和方法
如上述章节中描述的进行免疫印记和ELISA。
6.3.2结果
如图3证明的，fLu多肽（76-130）-KLH（“HApep-KLH”）担当由HApep-KLH引出的强大的免疫原和血清抗体，其中HApep-KLH与多种血清素亚型反应。
为了评价作为免疫原的HApep-KLH构造的功效，从初级和二次免疫作用后10天的小鼠采取血清。检验这些血清与重组地表达的、纯化的不同的亚型的血凝素的反应性。首先，应该注意，HApep-KLH疫苗构造确实引出与纯化的血凝素蛋白起反应的血清抗体。第二，二次免疫作用之后，抗-HA滴度的显著的增加是明显的，指示，构造确实在小鼠中引出强大的体液免疫应答。最后，关注HApep-KLH抗-血清的异源亚型反应性。来自免疫的小鼠的血清证明与H3、H1、H2、H9和H7亚型的血凝素的结合活性。
6.4利用fLu多肽的免疫作用保护小鼠使之免于致命的病毒激发
6.4.1.材料和方法
利用25ugHApep-KLH或氟氏完全佐剂（CompleteFreund'sadjuvant）（Sigma）中单独的KLH，通过皮下的给药免疫6-8周大的BALB/C小鼠（JacksonLaboratories）。在初级免疫作用后三周，利用25ugHApep-KLH或氟氏完全佐剂中单独的KLH加强小鼠。在加强后两至三周，利用病毒激发小鼠。在病毒感染之前，通过克他命（75mg/g体重）/甲苯噻嗪（15mg/kg体重）混合物的腹膜内给药麻痹小鼠。以50ug总的PBS鼻内地给予病毒；激发剂量由40,000pfuX31或500pfuPR8组成。每日监视体重。
6.4.2.结果
如图4证明的，利用flu多肽(76-130)-KLH（“HApep-KLH”）的免疫作用使小鼠免于致命的激发。
在初级-加强的免疫作用进度表中，利用25ugHApep-KLH通过皮下给药免疫小鼠。以3周相隔分开免疫作用，且在第二次免疫作用之后2-3周，利用病毒激发小鼠。在病毒激发之后，被当作疾病严重性的读出每日测量小鼠体重。发现利用HApep-KLH的免疫作用保护100%的小鼠免于X31的致命的激发，来自香港/1/1968(H3)（图3B）的小鼠适合的表达HA和NA的病毒。在所有的天数上，来自利用HApep-KLH构造免疫的小鼠或接收PBS的小鼠的平均体重显著地不同。
在相似的激发实验中，小鼠接受小鼠适合的PR/8病毒（H1）的致死的剂量。通过激发后七天，接受PBS的所有的小鼠都已经患有疾病，而接受HApep-KLH疫苗保护了80%的小鼠（图4A）。发现对H1亚型血凝素的血清抗体滴度与病毒激发后的每天的体重改变相互关联（图4B）。
6.5利用flu多肽的接种疫苗对不同的病毒亚型提供保护
这个实验证明，flu多肽可在小鼠中对结构上分歧的亚型H3N2、H1N1和H5N1的流感病毒提供保护。
6.5.1材料和方法
6.5.1.1病毒和纯化的血凝素
使用的病毒是：X31病毒（A/香港/1/1968血凝素和来自PR8的具有剩余的6个片段的神经氨酸酶）、A/PuertoRico/8/34（PR8）病毒、A/USSR/90/1977病毒、A/Georgia/81病毒、HAlo病毒（利用血凝素修饰的以便清除多碱断裂位点的A/VietNam/4/2005病毒）。使用的纯化的血凝素来自：A/香港/1/1968；A/Brisbane/10/2007；A/VietNam/1203/2004(H5)；A/新加坡/1/57(H2)；A/Teal/HK/312/97(H6)；A/荷兰/219/2003(H7)；A/HK/1073/99(H9)；和A/加利福尼亚/04/2009(H1)。
6.5.1.2免疫印记
通过先前描述的方法产生印记（参见Towbin等人,(1979)ProcNatlAcadSciUSA76(9):4350-4354）。在含有SDS和0.6MDTT的上样缓冲液中将样品在100,℃煮沸5分钟。在4-20%Tris-HClSDS-PAGE凝胶体（Bio-Rad,Inc.）中分辨免疫沉淀的复合体、细胞裂解液或纯化的病毒，且将样品印记到Protran硝化纤维膜上（Whatman）。利用兔抗-GFP（SantaCruzBiotechnology,Inc）和/或mAb12D1探测GFP和融合GFP-HA截短的肽。二抗是抗-兔IgGHRP（Dako）和抗-鼠Ig-HRP（GEHealtchare,Inc.）。
6.5.1.3免疫沉淀反应
通过病毒RNA的PCR扩增产生A/HK/1/68HA2的76-130（LAH）区域，且亚克隆到pCAGG-绿色荧光蛋白（GFP）质粒中（参见Basler等人,(2001)ProcNatlAcadSciUSA98(5):2746-2751）。在HA2截短的N-末端上出现GFP。利用Lipofectamine2000（Invitrogen,Inc）以GFP-LAH构造转染293T细胞。在转染后24小时上，利用放射免疫沉淀测定法（RIPA）缓冲液裂解细胞，且GFP-LAH融合蛋白与1至5μg的mAb12D1在4℃过夜进行免疫沉淀反应，其中所述mAb12D1结合到蛋白质G-琼脂糖（Roche,Inc）上。
6.5.1.4长-α螺旋-KLH疫苗
使用的A/HK/1/68HA2LAH多肽（氨基酸76-130）的序列是：Ac-RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENADYKDDDDKC。在N-末端乙酰化构造，且构造由H3A/香港/1/1968HA2分子的氨基酸76-130，之后跟随FLAG-标签（DYKDDDDK），之后跟随半胱氨酸组成。通过关于初级胺偶合的硫醇，将多肽偶合到载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白（KLH）上。由CHIScientific,Inc.,Maynard,MAUSA生产这种结合物。
6.5.1.6ELISA
以2μg/mlLAH-KLH结合物（图7B）、纯化的血凝素（图7A、C）、或表面抗原纯化的流感病毒疫苗（FLUVIRON(R)，从BEI资源获得的）涂覆96-孔板（NuncImmulon2），在PBS中，4℃过夜。利用1%BSA/PBS在室温下封闭板30分钟，且利用PBS/.025%Tween洗涤板两次。在1%BSA/PBS中连续地稀释抗体、抗-血清或来自利用2008-2009三价灭活的流感病毒疫苗（TIV）进行预防接种的个体的血清，且将其加入到板中，之后在37℃孵育3小时。在利用LAH-KLH涂覆的孔中，抗-ga抗体（Sigma）被用作阳性对照。洗涤板三次，和将1：2000稀释的抗-鼠-碱性磷酸酯酶（AP）（SouthernBiotech）加入到孔中，之后在37℃孵育3小时。关于人类血清，在1：500稀释上使用抗-人类IgG（Fc特定的）-AP（Sigma）抗体。在1：500稀释上的抗-兔IgG-AP（SouthernBiotech）被用作抗-flag抗体的二抗。然后将对硝基苯磷酸二钠底物加入到孔中，且允许在室温下显影20-30分钟。在405nm下采取光学密度测量。
6.5.1.6鼠免疫作用和激发实验
利用25μgLAH-KLH、HA2、单独的KLH或氟氏完全佐剂（Sigma）中的PBS，通过皮下给药免疫6-8周大的BALB/C小鼠（JacksonLaboratories）。在初级免疫作用之后的三周，利用25μg相同的免疫原或氟氏完全佐剂中的PBS加强小鼠。在加强之后的两至三周，利用病毒激发小鼠。在病毒感染之前，通过可他命（75mg/g体重）/甲苯噻嗪（15mg/g体重）混合物的腹膜内给药麻痹小鼠。以50μl总的PBS鼻内地给予病毒；激发剂量由4×105pfuX31或500pfuPR8或HAlo病毒组成。每日监视体重。关于被动转移实验，在利用KLH或LAH-KLH持续免疫作用之后两周，或在利用PR8病毒或A/香港/1/1968病毒感染之后的三周，抽取小鼠的血液。依照接种疫苗抗原或病毒感染聚集小鼠的血清，且在利用50pfuPR8病毒或3700pfuGeorgia/81病毒感染之前，通过腹膜内给药2小时，将200μl血清转移到每一个受体小鼠中。通过感染后2天的空斑实验评价肺滴度。
6.5.2结果
小鼠单克隆抗体12D1结合HA2分子的连续部分，且对H3亚型的流感病毒具有广泛的中和活性。通过为表达HA2分子的短区域而设计产生的构建体可以确定mAb12D1在蛋白质的高度地保守的‘长的α-螺旋’（LAH）区域内结合氨基酸。最初通过利用各种长度的多种HA2截短的结合数据的分析识别与mAb12D1相互作用的血凝素的部分。基于积累的截短数据可确定，mAb12D1在HA2的76-106区域内结合（参见Wang等人,(2010)PLoSPathog6(2):e1000796）。然而，后来的工作显示，代表H3病毒A/香港/1/1968的全部的LAH（氨基酸76-130）的肽，通过mAb12D1为最大的结合提供必需的结构元素（图7A）。在293T细胞中表达这个区域，HA2的氨基酸76-130，且通过mAb12D1拉下这个区域（图7B）。因此确定，利用HA2的76-130区域的免疫作用是否可获得具有功能相似于mAb12D1的抗体所有组成部分，以及对H3亚型或多种亚型的流感病毒提供保护。
通过设计由LAH加上八个氨基酸的C-末端空间结构域（FLAG-标签），之后是半胱氨酸组成的结合疫苗增强76-130多肽的抗原性（LAH），其中所述半胱氨酸促进硫醇到调节后的偶合于载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白（KLH）上伯胺。为了延长血清半衰期，在N-末端乙酰化LAH肽（参见Werle和Bernkop-Schnurch,(2006)AminoAcids30(4):351-367）。通过直接结合的ELISA证实结合物内的mAb12D1结合区域的结构完整性（图7C）。
为了在体内检验该构建体，在初级-加强（prime-boost）的进度表中，以免疫作用之间的三周的时间流逝，利用LAH-KLH结合物免疫小鼠。在初级和二次免疫作用后10天的小鼠上采集血清。为了评价结合物引出有关的特异性的抗体的产品的能力，检验抗血清与不同的亚型的纯化的血凝素蛋白的反应性。首先应该注意，通过ELISA和免疫印记，证明LAH抗血清与血凝素蛋白起反应（图8A-C）。第二，在二次免疫作用之后，抗-HA滴度的显著的增加证明，构造在小鼠中担当生产性的免疫原（图8A和8B）。最后，来自免疫的小鼠的血清具有大量的异源亚型的结合活性。通过ELISA证明抗-LAH血清具有来自1968全国流行的H3病毒A/香港/1/1968、2009全国流行的H1病毒A/加利福尼亚/04/09的血凝素，和H2、H5和H7亚型的血凝素的活性（图8D）。这些亚型的血凝素的76-130的比对证明氨基酸序列和氨基酸类型的高度的保守性（图8E）。进一步的血清学分析证明，在LAH-KLH接种疫苗中产生的抗体加强病毒血凝素特定的血清IgM和IgG亚型。IgG亚型的重要的加强指示出T-细胞依赖的抗体生产和表明亲和力成熟的抗-血凝素响应（图8F）（参见Jumper等人,(1994)JImmunol152(2):438-445）。
在二次免疫作用之后两至三周，利用4×105pfu的X31，小鼠适合的表达血凝素的抗体，和1968年全国流行的H3流感病毒的神经氨酸酶，通过鼻内给药激发小鼠。在所有的时间点上，利用LAH-KLH构造免疫的小鼠体重损失显著地比接收具有佐剂的PBS的小鼠体重损失小。另外，所有免疫的小鼠幸免于激发，而对照的小鼠在第4天经受感染（图9A和9B）。
接下来，利用引起人类流感疾病，但是属于不同于H3亚型病毒的系统发生的类别的其他病毒亚型激发免疫的小鼠（参见，FieldsBN,KnipeDM,&HowleyPM(2007)Fields'virology(LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia)5thEdpp2v.(xix,3091,I-3086p.)）。利用500pfu（10-15mLD50）PR8，小鼠适应的H1病毒，或利用修饰从而清除病毒血凝素中的多碱性断裂位点的500pfu的H5高度地-致病的禽流感病毒感染小鼠（参见Steel等人,(2009)JVirol83(4):1742-1753）。利用LAH-KLH结合物的接种疫苗对由H1和H5流感疾病引起的体重损失具有保护性，其中所述疾病事实上在感染期间每天都达到高度地重要的程度。感染PR8的接种疫苗过的小鼠在体重损失的动力学中显示重要的延迟，而60%感染H5禽流感接种疫苗过的小鼠在感染后10天幸免于致死的激发（图9C-F）。
来自随后感染PR8的小鼠的预激发的血清的分析显示血凝素-特定的抗体滴度和在感染之后的每天的体重的增加之间的正相关（图10A）。有结果地免疫的动物（利用抗-H1血清抗体）在感染后的1-3天期间增加体重，而没有H1-特定的抗体的动物在这个关键的时期损失体重。这些数据表明，由LAH-KLH接种疫苗的抗体是保护小鼠免受疾病中的必需的成分。
为了进一步研究抗-LAH抗体在保护中的作用，进行体内被动转移实验。在感染之前两小时，将来自供体小鼠的200μl血清，通过腹膜内给药给予受体小鼠，其中所述供体小鼠是已经感染了H1或H3病毒、已经接种了单独的KLH或已经接种了LAH-KLH疫苗的小鼠。然后，受体小鼠感染人类季节性的H3病毒、A/Georgia/81、或H1病毒PR8。在感染之后的两天，评价肺滴度。发现了LAH-KLH抗血清的转移显著地减少感染人类季节性的H3病毒（p=.0009）或H1（p=.0008）病毒的动物中的肺滴度（图10B和10C）。这种转移实验表明，LAH构造在进行预防接种的小鼠中诱导中和抗体。
接下来，研究季节性的流感接种疫苗在人类中是否诱导血凝素的LAH区域特定的抗体。为了探究这种可能性，评价人类血清中的结合活性，其中在利用2008-2009三价的灭活的流感病毒疫苗（TIV）的免疫作用之前或之后采取所述人类血清。这种季节性的疫苗组合物含有A/Brisbane/59/2007（H1N1）-类病毒、A/Brisbane/10/2007（H3N2）-类病毒和B/Florida/4/2006-类病毒（参见AdministrationUFaD(2010)InfluenzaVirusVaccineforthe2008-2009季）。作为疫苗响应的测量，评价来自人类患者的血清样品在IgG抗体滴度中对季节性TIV组合物的后接种疫苗的加强。甚至在证明对季节性接种疫苗的最高的响应的受试者中探测到LAH肽特定的最小的血清抗体（图10D和10E）。
如图8D证明的，在LAH-KLH抗血清中看到的反应性的范围比已经在血凝素杆状疫苗构造的研究中描述的那些大（参见，Bommakanti等人,(2010)ProcNatlAcadSciUSA;andSteel,(2010)mBio1(1):1-9）。为了查明结合复合体的设计在引出这种广泛的响应中的重要性，将通过利用LAH-KLH构造的接种疫苗引出的血清活性与利用完整的HA2分子的接种疫苗引出的血清活性比较。如先前描述的重组表达A/香港/1/1968HA2蛋白的胞外域（参见，Chen等人,(1999)ProcNatlAcadSciUSA96(16):8967-8972）。利用纯的、未偶合的、HA2蛋白，通过与利用LAH-KLH用于接种疫苗的小鼠相同的方法，进行免疫小鼠。评价聚集的抗血清对一组重组表达的血凝素的结合活性，其中所述血清是从利用LAH-KLH或HA2蛋白二次接种疫苗后10天的20只小鼠中采取的。在检验LAH-KLH抗血清与所有的血凝素亚型反应时，含有抗体的HA2抗血清只与组2血凝素蛋白反应（图11A-H和表格1）。因为在HA2蛋白中出现LAH结构，在LAH-KLH抗血清中看到的广泛的反应性必须是LAH在结合复合体内作为抗原出现的方式的结果。HA2的免疫显性区域的排除可引起LAH-KLH疫苗诱导更聚集的抗-LAH免疫应答，其介导血凝素亚型之间的广泛的反应性。可替换地，广泛地反应性的抗体的诱导可能是LAH在C-末端瞄定到载体蛋白上的结果，因此在完整的HA2蛋白的背景中，表现另外的抗原沉默的LAH免疫原性的区域。
6.5.3结论
这种连接到KLH上的LAH核心多肽对抗原分歧的流感病毒亚型具有保护活性，其中所述亚型目前在人类中引起季节性和全国流行的疾病。另外，连接到KLH上的LAH核心多肽对H5N1禽病毒具有保护活性，具有潜在的引起人类全国流行的流感疾病的亚型。因此，连接到KLH上的LAH核心多肽代表肽基础的流感病毒疫苗，这将是廉价的和简单的制造。
表1
正如特别和单独地指出每一篇单独的专利公开或专利申请要结合于本文以供参考一样，本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均结合于本文以供参考。尽管已经借助于图表和实施例详细描述了前述发明，但这些图表和实施例仅仅是出于清楚理解的目的提供的，在不背离所附权利要求的精神或范围的前提下，可根据本发明的教导做出另外的改变和修饰，这些对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。

Claims (91)

1.一种分离的核心多肽，包含下式：
X1IX2X3X4X5X6X7X8X9DX10X11X12X13X14WSYNAELLVAX15ENQHTIDLX16DSEMNKLX17EX18X19X20RQLRENA(SEQIDNO:6)，其中：
X1是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X2是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X3是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X4是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X5是E或I；
X6是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X7是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X8是V或T；
X9是E或R；
X10是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X11是K或M；
X12是I或T；
X13是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性、酸性氨基酸取代；
X14是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X15是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X16是T或A；
X17是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X18是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性、碱性氨基酸取代；
X19是T或V；
以及X20是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性、碱性氨基酸取代；
并且其中所述核心多肽的长度小于100个氨基酸。
2.一种分离的核心多肽，由下式组成：
X1IX2X3X4X5X6X7X8X9DX10X11X12X13X14WSYNAELLVAX15ENQHTIDLX16DSEMNKLX17EX18X19X20RQLRENA(SEQIDNO:6)，其中：
X1是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X2是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X3是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X4是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X5是E或I；
X6是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X7是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X8是V或T；
X9是E或R；
X10是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性氨基酸取代；
X11是K或M；
X12是I或T；
X13是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性、酸性氨基酸取代；
X14是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X15是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X16是T或A；
X17是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守疏水性氨基酸取代；
X18是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性、碱性氨基酸取代；
X19是T或V；
以及X20是相对于在SEQIDNO:2中相同位置处的氨基酸的保守亲水性、碱性氨基酸取代。
3.根据权利要求1或2所述的分离的核心多肽，其中，X1是R或Q；X2是Q或G；X3是D或N；X4是L或V；X5是E或I；X6是K或N；X7是Y或W；X8是V或T；X9是E或R；X10是T或S；X11是K或M；X12是I或T；X13是D或E；X14是L或V；X15是L或M；X16是T或A；X17是F或Y；X18是K或R；X19是T或V以及X20是K或R。
4.根据权利要求1所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列组成。
6.一种分离的核心多肽，包含下式：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEX1TX2X3QLRENA(SEQIDNO:15)，其中，X1、X2、和X3是亲水的、碱性氨基酸，并且其中所述核心多肽的长度小于100个氨基酸。
7.一种分离的核心多肽，由下式组成：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEX1TX2X3QLRENA(SEQIDNO:15)，其中，X1、X2、和X3是亲水的、碱性氨基酸。
8.根据权利要求6或7所述的分离的核心多肽，其中X1是K或R；X2是K或R，和X3是K或R。
9.根据权利要求6所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽包含SEQIDNO:16、SEQIDNO:17或SEQIDNO:18的氨基酸序列。
10.根据权利要求7所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽由SEQIDNO:16、SEQIDNO:17或SEQIDNO:18的氨基酸序列组成。
11.一种分离的核心多肽，包含下式：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDVTDSEMNKLFERVRX1QLRENA(SEQIDNO:19)，其中，X1是亲水的、碱性氨基酸，并且其中所述核心多肽的长度小于100个氨基酸。
12.一种分离的核心多肽，由下式组成：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDVTDSEMNKLFERVRX1QLRENA(SEQIDNO:19)，其中，X1是亲水的、碱性氨基酸。
13.根据权利要求11或12所述的分离的核心多肽，其中，X1是R或H。
14.根据权利要求11所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽包含SEQIDNO:20或SEQIDNO:21的氨基酸序列。
15.根据权利要求12所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽由SEQIDNO:20或SEQIDNO:21的氨基酸序列组成。
16.一种分离的核心多肽，包含下式：
QIGNVINWTRDX1MTEX2WSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMX3KLYERVX4KQLRENA(SEQIDNO:30)，
其中，X1是疏水的氨基酸或亲水的氨基酸；
X2是疏水的氨基酸；
X3是亲水的氨基酸；
X4是亲水的、碱性氨基酸；
并且其中所述核心多肽的长度小于100个氨基酸。
17.一种分离的核心多肽，由下式组成：
QIGNVINWTRDX1MTEX2WSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMX3KLYERVX4KQLRENA(SEQIDNO:30)，
其中，X1是疏水的氨基酸或亲水的氨基酸；
X2是疏水的氨基酸；
X3是亲水的氨基酸；
X4是亲水的、碱性氨基酸。
18.根据权利要求16或17所述的分离的核心多肽，其中，X1是A或S；X2是V或I；X3是N或S；和X4是K或R。
19.根据权利要求16所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽包含SEQIDNOS:31-35中任一个的氨基酸序列。
20.根据权利要求17所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽由SEQIDNOS:31-35中任一个的氨基酸序列组成。
21.一种分离的核心多肽，包含下式：
QIGNVINWTKDSITDIWTYX1AELLVAMENQHTIDMADSEMLNLYERVRKQLRQNA(SEQIDNO:42)，其中，X1是亲水的氨基酸，并且其中所述核心多肽的长度小于100个氨基酸。
22.一种分离的核心多肽，由下式组成：
QIGNVINWTKDSITDIWTYX1AELLVAMENQHTIDMADSEMLNLYERVRKQLRQNA(SEQIDNO:42)，其中，X1是亲水的氨基酸。
23.根据权利要求21或22所述的分离的核心多肽，其中，X1是Q或N。
24.根据权利要求21所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽包含SEQIDNO:43或SEQIDNO:44的氨基酸序列。
25.根据权利要求22所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽由SEQIDNO:43或SEQIDNO:44的氨基酸序列组成。
26.一种分离的核心多肽，包含下式：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDVTDSEMNKLFERVRRQLRENA(SEQIDNO:55)，并且其中所述核心多肽的长度小于100个氨基酸。
27.一种分离的核心多肽，由下式组成：
RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDVTDSEMNKLFERVRRQLRENA(SEQIDNO:55)。
28.一种分离的核心多肽，包含下式：
QIGNVINWTRDSLTEIWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMNKLYERVRRQLRENA(SEQIDNO:56)，并且其中所述核心多肽的长度小于100个氨基酸。
29.一种分离的核心多肽，由下式组成：
QIGNVINWTRDSLTEIWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMNKLYERVRRQLRENA(SEQIDNO:56)。
30.根据权利要求1、6、11、16、21、26或28中任一项所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽的长度为75至95个氨基酸。
31.根据权利要求1、6、11、16、21、26或28中任一项所述的分离的核心多肽，其中，所述核心多肽的长度小于75个氨基酸。
32.一种flu多肽，其包含权利要求1-31中任一项所述的核心多肽，其中，所述flu多肽在其N-末端处被乙酰化。
33.一种flu多肽，其包含权利要求1-31中任一项所述的核心多肽，其中，所述flu多肽在其N-末端和/或C-末端处被连接于聚乙二醇。
34.一种flu多肽，其包含权利要求1-31中任一项所述的核心多肽，其中，所述核心多肽在其N-末端和/或C-末端处被直接地或间接地连接于一个或多个蛋白标签。
35.根据权利要求34所述的flu多肽，其中，所述蛋白标签是His-标签。
36.根据权利要求34所述的flu多肽，其中，所述蛋白标签是FLAG-标签。
37.一种flu多肽，其包含权利要求1-31中任一项所述的核心多肽，其中，所述核心多肽在其N-末端和/或C-末端处被直接地或间接地连接于T细胞抗原表位。
38.根据权利要求37所述的flu多肽，其中，所述T细胞抗原表位是CD8T细胞抗原表位。
39.根据权利要求38所述的flu多肽，其中，CD8T细胞抗原表位是流感A核蛋白(NP)或基质1(M1)蛋白或它们的片段。
40.一种flu多肽，其包含权利要求1-31中任一项所述的核心多肽，其中，所述核心多肽在其N-末端和/或C-末端处被直接地或间接地连接于Toll样受体配体。
41.根据权利要求40所述的flu多肽，其中，所述Toll样受体配体是沙门氏菌鞭毛蛋白。
42.一种flu多肽，其包含权利要求1-31中任一项所述的核心多肽，其中，所述分离的核心多肽在其N-末端和/或C-末端处被直接地或间接地连接于T4折叠子结构域或其片段。
43.一种flu多肽，其包含权利要求1-31中任一项所述的核心多肽中的任一种，所述核心多肽在其N-末端处被连接于His-标签并且在其C-末端处被接连于T4折叠子结构域或其片段。
44.一种flu多肽，包含下式：
X-L-X-L-X，其中
X是权利要求1-31中任一项所述的任一种核心多肽；并且
L是接头或不存在。
45.根据权利要求44所述的flu多肽，其中，所述核心多肽是相同的。
46.根据权利要求44所述的flu多肽，其中，所述flu多肽在其N-末端或C-末端处被直接地或间接地连接于一个或多个蛋白标签。
47.根据权利要求46所述的flu多肽，其中，所述蛋白标签是His-标签或FLAG-标签。
48.根据权利要求44所述的flu多肽，其中，所述flu多肽在其N-末端或C-末端处被直接地或间接地连接于CD8T-细胞抗原表位。
49.根据权利要求48所述的flu多肽，其中，所述CD8T细胞抗原表位是流感A核蛋白(NP)或基质1(M1)蛋白。
50.根据权利要求44所述的flu多肽，其中，所述flu多肽在其N-末端或C-末端处被直接地或间接地连接于Toll样受体配体。
51.根据权利要求50所述的flu多肽，其中，所述Toll样受体配体是沙门氏菌鞭毛蛋白。
52.根据权利要求44所述的flu多肽，其中，所述flu多肽在其N-末端处被直接地或间接地连接于His-标签，在其C-末端处被直接地或间接地连接于FLAG-标签，并且其中L是甘氨酸残基。
53.根据权利要求44所述的flu多肽，其中，所述flu多肽在其N-末端处被直接地或间接地连接于His-标签，并且在其C-末端处被直接地或间接地连接于沙门氏菌鞭毛蛋白。
54.根据权利要求44所述的flu多肽，其中，所述flu多肽在其N-末端处被直接地或间接地连接于His-标签，并且在其C-末端处被直接地或间接地连接于流感A核蛋白(NP)或其片段。
55.根据权利要求1-31中任一项所述的分离的核心多肽或根据权利要求32-54中任一项所述的flu多肽，其选择性地结合能够结合流感血凝素的中和抗血清。
56.一种组合物，包含连接于载体蛋白的权利要求1-31中任一项所述的核心多肽或权利要求32-54中任一项所述的flu多肽。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中，所述的分离的核心多肽或flu多肽通过1至50个氨基酸的接头连接于载体蛋白。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中，所述接头的长度为1至40个氨基酸、1至30个氨基酸、1至20个氨基酸、1至10个氨基酸、1至5个氨基酸、1至4个氨基酸、1至3个氨基酸、1至2个氨基酸或1个氨基酸。
59.根据权利要求56所述的组合物，其中，所述载体蛋白是钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。
60.一种flu多肽，其包含具有氨基酸序列RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENA的核心多肽，其中，所述核心多肽在其C-末端处被连接于具有序列DYKDDDDKC的多肽。
61.根据权利要求60所述的flu多肽，进一步包含乙酰化的N-末端。
62.一种分离的核酸，其编码权利要求1-55、60、或61中任一项所述的核心多肽或flu多肽。
63.一种分离的细胞，其表达权利要求62所述的核酸。
64.一种分离的病毒，其包含被设计为表达权利要求62所述的核酸的基因组。
65.一种分离的病毒，其包含根据权利要求1-55、60、或61中任一项所述的核心多肽或flu多肽。
66.根据权利要求64或65所述的分离的病毒，其中，所述病毒是流感病毒。
67.根据权利要求66所述的分离的病毒，其是A型流感病毒。
68.根据权利要求66所述的分离的病毒，其是B型流感病毒。
69.根据权利要求64或65所述的分离的病毒，其中，所述病毒是新城疫病毒(NDV)、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或逆转录酶病毒。
70.根据权利要求65所述的分离的病毒，其是灭活的病毒或裂解病毒。
71.一种病毒样颗粒，其包含根据权利要求1-55、60、或61中任一项所述的核心多肽或flu多肽。
72.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-55、60、或61中任一项所述的核心多肽或flu多肽。
73.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求64所述的分离的病毒和药学上可接受的载体。
74.根据权利要求73所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂。
75.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求65所述的分离的病毒和药学上可接受的载体。
76.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求66、67、或68所述的分离的病毒和药学上可接受的载体。
77.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求69所述的分离的病毒和药学上可接受的载体。
78.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求70所述的分离的病毒和药学上可接受的载体。
79.根据权利要求74、75、77、或78所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂。
80.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求71所述的病毒样颗粒和药学上可接受的载体。
81.有效量的根据权利要求72-80中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于对受试者进行针对流感病毒的免疫的药物中的应用。
82.根据权利要求81所述的应用，其中，所述受试者是人类。
83.根据权利要求81所述的应用，其中，将所述免疫原性组合物皮下地、肌肉地、或鼻内地给予受试者。
84.有效量的根据权利要求72-80中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于预防受试者中的流感病毒疾病的药物中的应用。
85.有效量的根据权利要求72-80中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于治疗受试者中的流感病毒感染或流感病毒疾病的药物中的应用。
86.根据权利要求84所述的应用，其中，所述受试者是人类。
87.根据权利要求85所述的应用，其中，所述受试者是人类。
88.有效量的根据权利要求56所述的组合物在制备用于对受试者进行针对流感病毒的免疫的药物中的应用。
89.有效量的根据权利要求56所述的组合物在制备用于预防受试者中的流感疾病的药物中的应用。
90.有效量的根据权利要求56所述的组合物在制备用于治疗受试者中流感病毒疾病或流感病毒感染的药物中的应用。
91.根据权利要求88、89或90所述的应用，其中，所述受试者是人类。
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