CN102823638A

CN102823638A - 基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法

Info

Publication number: CN102823638A
Application number: CN2012103327571A
Authority: CN
Inventors: 颜辉; 吴琼英; 江明珠; 贾俊强
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2012-09-10
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2012-12-19

Abstract

基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，步骤为：用水溶解丝胶蛋白，浓度为0.5～10％（质量体积分数，g/mL）；用0.5～1.5mol/L NaOH溶液调pH 7.0～9.0，保持温度20～40℃；加入胰蛋白酶（胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=10000U～40000U：1g），酶解反应0.5～4h；酶解结束后，将溶液加热到80～100℃，并保持5～10min进行灭酶处理；将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。本发明所得的新型抗冻剂属非糖类物质，应用于蛋白类食品的冷冻保鲜，不会增加这些食品的能量，糖尿病患者可以食用此类冻存的蛋白类食品。

Description

基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗冻剂的制备方法，特别涉及一种来源于丝胶蛋白的抗冻剂，用于防止肉类冻藏过程中发生蛋白冷冻变性。

背景技术

鱼糜是机械去骨的鱼肉经水洗后加入冷冻保护剂以保持较长的冷冻货架期的鱼肉制品，是生产鱼糜制品的主要原料。目前日本、美国、俄罗斯、泰国和韩国都十分重视冷冻鱼糜的生产，并成为世界冷冻鱼糜生产大国。近年来，以淡水鱼为原料生产冷冻鱼糜及鱼糜制品引起国内外食品科技工作者的兴趣。

鱼类的蛋白可分为三种，分别是肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和基质蛋白。其中肌浆蛋白是水溶性蛋白，肌原纤维蛋白是盐溶性的蛋白，基质蛋白则是既不溶于水也不溶于盐溶液的不溶性蛋白。肌原纤维蛋白占到了鱼类蛋白的65-75％，是鱼蛋白最重要的组分，鱼肉蛋白在冻藏过程中发生变性的主要是肌原纤维蛋白。

已有的研究结果表明，添加抗冻剂是有效的抗鱼肉蛋白冷冻变性的方法。常用的抗冻变性剂为糖类，盐类、蛋白及水解物等。

目前应用最多的商业抗冻剂的配方是蔗糖和山梨醇混合物、多聚磷酸盐，以及糖和多聚磷酸盐的混合物。蔗糖和山梨糖醇因其价格低廉、抗冻效果较好且不易发生美拉德反应产生褐变而受广泛应用于实际生产中。但此类抗冻剂带来较重的甜味和热量，一些人因疾病（如糖尿病）不能使用，这在一定程度上限制了糖类抗冻剂在鱼糜中的使用。因此低热量的抗冻剂成为目前的研究方向。

研究发现某些蛋白酶解物含有较大比例的亲水性氨基酸，能与水作用形成氢键，增强冻结过程中水的稳定性，减少巨大冰晶体的形成，从而避免鱼肉蛋白空间构象变化而引起的变性。因此，寻找新型蛋白及水解物，提高鱼糜冷冻变性，是本领域研究的一项重要内容。

发明内容

解决的技术问题：

本发明提供一种基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，丝胶蛋白中含有大量亲水性的丝氨酸，以丝胶蛋白为原料，经酶解，最终得到一种非糖类抗冻剂。

技术方案：

基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，步骤为：用水溶解丝胶蛋白，质量体积比浓度为0.5～10％（g/mL）；用0.5～1.5mol/LNaOH溶液调pH 7.0～9.0，保持温度20～40℃；加入胰蛋白酶，加入量为胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=10000U～40000U：1g，酶解反应0.5～4h；酶解结束后，将溶液加热到80～100℃，并保持5～10min进行灭酶处理；将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。

上述的基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，优化步骤为：1.用水将丝胶蛋白溶解，质量体积浓度为3％（g/mL）；2.用1mol/L的NaOH调pH值到8.5，保持温度37℃；3.加入胰蛋白酶，加入量为胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=30000U：1g，酶解反应时长3h；4.酶解结束后，将溶液加热到95℃，并保持6min进行灭酶处理，将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。

有益效果：

1.本发明所得的新型抗冻剂属非糖类物质，应用于蛋白类食品的冷冻保鲜，不会增加这些食品的能量，糖尿病患者可以食用此类冻存的蛋白类食品。

2.我国是养蚕大国，每年生产大量的蚕茧，丝胶产量巨大。本发明可以充分利用丝胶，达到废物利用的目的。

具体实施方式

实施例1

1.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为0.5％（质量体积分数，g/mL）；

2.用1.5mol/L的NaOH调pH值到9，保持温度20℃。

3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=40000U：1g)，酶解反应时长0.5h；

4.酶解结束后，将溶液加热到80℃，并保持10min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，得到丝胶源酶解蛋白抗冻剂。

实施例2

1.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为10％（质量体积分数，g/mL）；

2.用1mol/L的NaOH调pH值到7.5，保持温度30℃。

3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=10000U：1g)，酶解反应时长2h；

4.酶解结束后，将溶液加热到100℃，并保持5min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。

实施例3

1.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为7.5％（质量体积分数，g/mL）；

2.用0.5mol/L的NaOH调pH值到8，保持温度40℃。

3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=20000U：1g)，酶解反应时长4h；

4.酶解结束后，将溶液加热到90℃，并保持7min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。

实施例4

1.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为3％（质量体积分数，g/mL）；

2.用1mol/L的NaOH调pH值到8.5，保持温度37℃。

3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=30000U：1g)，酶解反应时长3h；

4.酶解结束后，将溶液加热到95℃，并保持6min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。

实施例5

1.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为8％（质量体积分数，g/mL）；

2.用1mol/L的NaOH调pH值到7.5，保持温度40℃。

3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=40000U：1g)，酶解反应时长1.5h；

4.酶解结束后，将溶液加热到100℃，并保持7min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。

丝胶源性抗冻剂对鲢鱼糜的冷冻变性的保护作用

按实施例4方法，制备得到丝胶源性抗冻剂，进行抗鲢鱼糜的冷冻变性试验。

1.将鲢鱼清洗、去鳞、去头、去内脏，并经第二次清洗。然后采肉。漂洗4次及以上，最后一次漂洗水中加入0.15％的食盐（以使肌球蛋白收敛，容易脱水）。脱水；

2.向脱水完毕的鱼糜中添加酶解后的丝胶蛋白粉（或与糖类抗冻剂联合应用），分别为无抗冻剂、1％(酶解产物与鱼糜的质量分数，下同)丝胶蛋白酶解产物、0.5％丝胶蛋白酶解产物、4％蔗糖+4％山梨醇、1％丝胶蛋白酶解产物+2％蔗糖+2％山梨醇，混匀，-20℃保存；

3.每周检测鱼糜保水性、盐溶性蛋白含量、Ca²⁺-ATPase活性、巯基含量、表面疏水性。同时以未加任何抗冻剂的鲢鱼糜为对照，评价酶解丝胶蛋白抗冻剂的效果。

鱼糜质量检测方法如下：

(1)保水性

称取鱼糜5.0g，加入0.65mL的10％NaCl溶液，擂溃6min，装入已经称重的干燥离心管，4000r/min离心5min，使其充填结实，4℃保存2h。水浴加热至内部温度90℃，取出，5000r/min离心5min，用滤纸吸干水分后称重。保水性计算公式如下：

(2)盐溶性蛋白含量

第一步：用牛血清蛋白为对照，制作595nm处吸光度标准曲线：

牛血清蛋白标准曲线的制作采用考马斯亮蓝法。首先配制100μg/mL的牛血清白蛋白和10mg/mL考马斯亮蓝G250溶液，按照表1添加各物质于试管中。用紫外分光光度计在595nm处测定其吸光度，根据所得数据绘制标准曲线。

表1牛血清蛋白标准曲线的制作

实验号	牛血清白蛋白(mL)	蒸馏水（mL）	考马斯亮蓝(10mg/mL)	总体积(mL)
					0	0	1	5	6
1	0.2	0.8	5	6
					2	0.4	0.6	5	6
3	0.6	0.4	5	6
					4	0.8	0.2	5	6
5	1	0	5	6

第二步：称取鱼糜5.0g，然后加入20mL冰冷的0.6mol/L KCl溶液，在研钵中研磨、匀浆，4℃静置1.5h，10000r/min离心30min，取上清液1mL，加入5mL考马斯亮蓝试剂，于595nm处测定吸光度，用0.6mol/L KCl做空白对照。根据所得的吸光度和所绘制的标准曲线计算出盐溶蛋白的含量。

(3)肌原纤维蛋白溶液的测定

取5g鱼肉样品，添加10倍量的20mmol/L Tris-maleate缓冲液（pH7.0，内含0.05mol/L KCl），充分匀浆，然后在9000r/min下低温离心10min，以洗去鱼糜样品中残留水溶性蛋白质。弃去上清液，在沉淀中加入10倍量的20mmol/L Tris-maleate缓冲液（pH7.0，内含0.6mol/L KCl），充分匀浆后在4℃下提取盐溶性蛋白质1h，然后在9000r/min下低温离心10min，上清液即为实验用肌原纤维蛋白溶液。

用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量，所得肌原纤维蛋白溶液用0.6mol/L KCl调节浓度在4mg/mL，供属性（Ca2+-ATPase活性、巯基含量、表面疏水性）测定。

(4)Ca²⁺-ATPase活性测定

测定的试剂体系如表2所示：

表2Ca²⁺-ATPase活性测定时添加的试剂

反应液的种类	反应液的添加量（mL）
		0.50m Tris-马来酸缓冲液(pH值7.0)	0.10
0.10mol/L CaCL₂	0.10
		2.00mol/L KCl	0.44

肌原纤维蛋白溶液	0.20
		蒸馏水	1.06
20mmol/L ATP溶液(pH值7.0)	0.10
		总计	2.00

按反应混合液组成加入试剂，25℃水浴5min，加入lmL 15％TCA终止反应，空白对照在反应前加入TCA使蛋白质变性。反应结束后，取反应液lmL，分别加入1mL定磷试剂(20％抗坏血酸、3mol/L硫酸、3％钼酸铵)，0.5mL3％Elon试剂，2.5mL水，充分混匀后室温下发色45min，在640nm波长下测吸光值。标准曲线绘制用0.5mmol/L的KH₂PO₄作标准。

Ca²⁺-ATPase计算公式为：活性=（A－B）/（t×酶蛋白质量)

式中：A-1mL反应液生成的磷酸量(μmoL)

B-空白值（μmoL）

t为反应时间（min）

酶蛋白量-1mL反应液所含有的酶量（mg）

(5)巯基含量的测定

取上面步骤中提取好的肌原纤维蛋白溶液1mL于试管中，加入9mL的0.2M的Tris-HCl缓冲混合液（pH 6.8，含8mol/L尿素，2％的SDS，10mM EDTA）。混合完全后，取4mL，并加入0.4mL的0.1％的DTNB。混合完全后，40℃水浴25min。紫外分光光度计检测412nm下测定吸光值，0.6M的KCL为空白对照。

巯基含量的计算公式为：-SH＝A×D/(ε×C)

式中：A表示412nm处得吸光度

D表示稀释倍数

ε表示分子吸光系数13600（mol·cm/L）

C表示蛋白质浓度（mg/mL）

(6)表面疏水性的测定

表面疏水性测定时采用8苯胺-1-萘磺酸（ANS）作探针。用pH6.010mmol/L的磷酸缓冲溶液（含0.6M的氯化钠）将肌原纤维球蛋白分别稀释成0.125，0.25，0.5和1mg/mL。用0.1M的磷酸缓冲溶液配成8mmol/L的8苯胺-1-萘磺酸，pH7.0。取4mL的稀释蛋白溶液，加入20μl的ANS。用960MC型荧光分光光度计，在激发波长为365nm和发射波长为500nm的条件下检测其荧光强度。表面疏水性以荧光强度与蛋白质浓度对应的曲线的斜率来表示。

结果，如表3～7所示，丝胶蛋白粉酶解产物单用、或与糖类抗冻剂联用，能够发挥抗冻作用，改善鱼糜的品质。

冷冻鱼糜由于在储藏过程中肌肉蛋白质易变性而收缩脱水，致使鱼糜制品嫩度差、口感粗糙、肉质较硬。因此，保水性对鱼糜产品的品质起着举足轻重的作用。如表3所示，所有样品鱼糜的保水性整体上都随着冷冻储存时间的增加而不断下降。但未添加任何抗冻剂的样品组的鱼糜保水性的下降趋势最为显著。在冷冻5个星期后，未加入任何抗冻剂的鱼糜保水性下降了23.47％，含1％酶解丝胶蛋白产物的样品的鱼糜保水性下降了3.38％，含0.5％酶解丝胶蛋白产物的样品的鱼糜保水性下降了2.20％，加入糖类抗冻剂的样品的鱼糜保水性下降了11.19％，加入酶解丝胶蛋白产物与糖类抗冻剂的混合物的样品的鱼糜保水性下降了1.77％。从以上数据可以看出添加了酶解丝胶蛋白产物的样品具有良好的保水性，效果比糖类抗冻剂好。酶解丝胶蛋白产物与糖类抗冻剂合用时，效果更好。

冷冻鱼糜质量下降主要是因为蛋白变性。蛋白质的盐溶性是反映鱼肉或鱼糜蛋白变性的常用指标。盐溶蛋自主要是肌原纤维蛋白，在冻藏过程中由于氢键、疏水键、二硫键、盐键的形成往往会导致蛋白质盐溶性的下降。如表4所示，所有样品鱼糜的盐溶性蛋白含量整体上都随着冷冻储存时间的增加而不断下降。但是未添加任何抗冻剂的样品组的鱼糜盐溶性蛋白含量的下降趋势最为显著。在冷冻5个星期后，未加入任何抗冻剂的鱼糜盐溶性蛋白含量下降了38.68％，含1％酶解丝胶蛋白产物的样品的鱼糜盐溶性蛋白含量下降了14.41％，含0.5％酶解丝胶蛋白产物的样品的鱼糜盐溶性蛋白含量下降了13.11％，加入糖类抗冻剂的样品的鱼糜盐溶性蛋白含量下降了15.48％，联合应用酶解丝胶蛋白产物与糖类抗冻剂时，鱼糜盐溶性蛋白含量下降了11.51％。由此可见，酶解丝胶蛋白产物能够加强冷冻鱼糜的盐溶性蛋白含量，具有抗冷冻变性作用。

巯基是蛋白质分子中最具反应活性的基团。鱼肉肌球蛋白分子中含有活性巯基，这些巯基在冻藏过程中的氧化及聚集变性都会导致其含量下降；冻藏易导致鱼糜蛋白发生变性，使其构型发生改变而暴露其活性巯基基团，而暴露的巯基易发生氧化形成二硫键；抗冻剂的加入可较好地抑制其蛋白质构型的变化，防止巯基的暴露，进而抑制巯基氧化成二硫键。如表5所示，所有样品鱼糜的巯基含量整体上都随着冷冻储存时间的增加而有所不断下降。但是未添加任何抗冻剂的样品组的鱼糜巯基含量的下降趋势最为显著。含1％（或0.5％）丝胶蛋白酶解产物比4％蔗糖+4％山梨醇的抗冻效果要好，鱼糜巯基含量下降解少。

新鲜鱼糜蛋白的疏水性氨基酸残基一般位于蛋白质分子内部，具有较低的表面疏水性。在冻藏过程中，蛋白质因变性而发生构型转化，使原先位于蛋白质分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，导致蛋白质表面疏水性增加。所以表面疏水性的改变能够反映鱼糜蛋白冷冻变性。如表6所示，所有样品鱼糜的表面疏水性整体上都随着冷冻储存时间的增加而不断上升。其中未添加任何抗冻剂的样品组的鱼糜的表面疏水性上升程度最为显著，5个星期后，未加入任何抗冻剂的鱼糜表面疏水性上升146.05％，含1％酶解丝胶蛋白产物的样品的鱼糜表面疏水性上升了94.20％，含0.5g酶解丝胶蛋白产物的样品的鱼糜表面疏水性上升了92.59％，加入4％蔗糖+4％山梨醇的样品的鱼糜表面疏水性上升了97.81％，加入1％酶解丝胶蛋白产物与2％的蔗糖和2％的山梨醇的混合物的样品的鱼糜表面疏水性上升了83.33％。

Ca²⁺-ATPase活性是反应鱼糜肌球蛋白或肌动球蛋白中肌球蛋白部分结构完整性的一个重要指标。肌球蛋白的头部负责其Ca²⁺-ATPase活性。冻藏过程中肌球蛋白尤其是肌球蛋白头部的变性，会导致其Ca²⁺-ATPase的活性下降。如表7所示，所有样品鱼糜的Ca²⁺-ATPase的活性都随冷冻储存时间的增加而下降。其中未添加任何抗冻剂的样品组的鱼糜的Ca²⁺-ATPase活性下降的程度最为显著。冷冻5个星期后，Ca²⁺-ATPase活性为0.175μmol/(mg·min），加入1％酶解丝胶蛋白产物的样品的鱼糜蛋白Ca²⁺-ATPase活性为0.347μmol/（mg·min），加入0.5％酶解丝胶蛋白产物的样品的鱼糜蛋白Ca²⁺-ATPase活性为0.369μmol/（mg·min），加入4％蔗糖+4％山梨醇的样品的鱼糜蛋白Ca²⁺-ATPase活性为0.311μmol/（mg·min），加入1g酶解丝胶蛋白产物与2％的蔗糖和2％的山梨醇的混合物的样品的Ca²⁺-ATPase活性为0.392μmol/（mg·min），其活性分别下降了55.01％、21.67％、17.82％、28.99％和13.66％。由此可见，酶解丝胶蛋白具有很的抗蛋白冷冻变性作用。

表3鱼糜的保水性

表4鱼糜样品的盐溶性蛋白含量（mg/g）

表5鱼糜样品的巯基含量测定值（mol/10⁵g）

表6鱼糜样品的表面疏水性测定值

表7鱼糜样品的Ca²⁺-ATPase活性

Claims

1.基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，其特征在于步骤为：用水溶解丝胶蛋白，质量体积比浓度为0.5～10％（g/mL）；用0.5～1.5mol/L NaOH溶液调pH 7.0～9.0，保持温度20～40℃；加入胰蛋白酶，加入量为胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=10000U～40000U：1g，酶解反应0.5～4h；酶解结束后，将溶液加热到80～100℃，并保持5～10min进行灭酶处理；将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。

2.根据权利要求1所述的基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，其特征在于步骤为：1.用水将丝胶蛋白溶解，质量体积浓度为3％（g/mL）；2.用1mol/L的NaOH调pH值到8.5，保持温度37℃；3.加入胰蛋白酶，加入量为胰蛋白酶活力：丝胶蛋白质量=30000U：1g，酶解反应时长3h；4.酶解结束后，将溶液加热到95℃，并保持6min进行灭酶处理，将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。