CN102670498B - 一种缓释型西罗莫司眼用制剂 - Google Patents

Abstract

本发明为一种眼科外用的缓释型西罗莫司眼用制剂，它是以西罗莫司为药效原料，以白芨多糖胶作缓释剂，配以适当辅料制作，白芨多糖胶用量为：西罗莫司∶白芨多糖胶=1.0∶0.5～5.0。本发明以白芨多糖胶作为粘膜粘附性聚合物释药系统，解决了西罗莫司在单纯水溶液中溶解性和稳定性差的问题，又利用白芨收敛、止血、清热利湿、消肿生肌的功效，增强西罗莫司的免疫抑制效果和眼组织穿透性。

Description

一种缓释型西罗莫司眼用制剂

技术领域

本发明涉及医用配制品，尤其涉及治疗眼科疾病所用的眼局部外用制剂。

背景技术

西罗莫司（Sirolimus，SRL），即雷帕霉素，是由潮链霉菌素（Streptomyces hygroscopicus）产生的大环内酯类抗生素，对各种非T细胞，如B细胞、巨噬细胞、粒细胞和内皮细胞等细胞的增殖以及细胞功能都有一定的作用。临床试验表明，西罗莫司应用于器官移植患者具有显著的免疫抑制作用。

在当代眼科医疗中，涉及中度到重度的眼内炎症，特别如葡萄膜炎等眼科自身免疫性疾病亟需效果良好的免疫抑制剂。有研究发现在角膜及视网膜组织中FK506结合蛋白（FKBP）存在高表达，提示西罗莫司应用于眼部的免疫抑制的潜在价值。

对于眼部疾病而言，局部用药较之全身用药具有诸多好处。结膜下和玻璃体内注射用药可以在眼组织内达到有效的药物浓度，但眼内注射给药毕竟是一种创伤性的给药方法，多次重复注射给药会大大增加感染性眼内炎的发生率。眼科局部用药的最佳方式是滴眼液，对于西莫罗司的眼科应用也是如此。但西罗莫司难溶于水，而且在水溶液中很容易降解，使得制作一种临床使用方便的西罗莫司成为一件困难的事情。

发明内容

本发明的目的在于提供一种辅料配方，用其与主药西罗莫司制作成适当剂型，既方便临床使用，又能够保留西罗莫司的药效。

本发明缓释型西罗莫司眼用制剂，是以西罗莫司为药效原料，以白芨多糖胶作为粘膜粘附性聚合物释药系统，配以眼局部可以接受的药剂学上所说的制剂辅料所制备成的缓释型制剂，每100重量份药剂中西罗莫司的含量为0.01～1.0重量份，西罗莫司与白芨多糖胶的用量按其重量比表示为：西罗莫司∶白芨多糖胶=1∶0.5～5.0。

其中，白芨多糖胶是由中药材白芨[Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.]提取的，是白芨的有效成分。白芨作为一种传统中药材，有收敛、止血、清热利湿、消肿生肌的功效。其提取物白芨多糖胶具有相同的药性，将其用于制备西罗莫司滴眼液，有助于增强西罗莫司的免疫抑制效果和眼组织穿透性。

应用以上药用原料和辅料制备的缓释型西罗莫司眼用制剂包括滴眼液、眼用凝胶、眼药膏或药剂学上所说的任何一种适于眼局部外用的剂型。就其功能，属于缓释型眼科免疫抑制剂。

制备本发明缓释型西罗莫司眼用制剂的辅料包括渗透压调节剂、pH调节剂、抑菌剂、增稠剂、助溶剂。它们的品种选择和用量分别叙述如下。

当所制作的剂型为滴眼液或眼用凝胶时，原料组分还包括抑菌剂。所述抑菌剂为硫柳汞、季铵盐类、杜米芬、冼必泰、三氯叔丁醇、尼泊金类、三梨酸中任何一种或所述品种的任意组合；抑菌剂的用量以与西罗莫司的重量比表示为，西罗莫司:抑菌剂=1.0:0.002～0.5。

当所制作的剂型为滴眼液时，原料组分还包括增稠剂。所述增稠剂为羟丙甲纤维素、甲基纤维素、玻璃酸钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚卡波非、羧甲基纤维素、卡波姆、硫酸软骨素中的任何一种或所述品种的任意组合；增稠剂的用量以与西罗莫司的重量比表示为，西罗莫司:增稠剂=1.0: 0.1～1.0。可采用不同聚合度，最终使滴眼液达到合适黏度。

当所制作的剂型为眼用凝胶时，原料组分还包括增稠剂；所述增稠剂选自羟丙甲纤维素、甲基纤维素、玻璃酸钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、卡波姆、硫酸软骨素、聚卡波非中的一种或所述品种的任意组合；增稠剂的用量以与西罗莫司的重量比表示为，西罗莫司:增稠剂= 1.0:0.5～5.0。

当所制作的剂型为滴眼液或眼用凝胶时，使用pH调节剂调节成品药剂的pH值为5.5～7.5；所述pH调节剂为氢氧化钠、盐酸、枸橼酸钠、枸掾酸、硼酸、硼砂中的任何一种或所述品种的任意组合。

当所制作的剂型为滴眼液时，使用渗透压调节剂调节滴眼液的渗透压摩尔浓度为250～350mOsmol/kg。所述渗透压调节剂为氯化钠、甘露醇的一种或两品种的任意组合。

当所制作的剂型为滴眼液或眼用凝胶时，使用助溶剂促进西莫罗司溶解，所述助溶剂为聚山梨酯-80、氢化蓖麻油的一种或两品种的任意组合。

当所制作的剂型为眼药膏时，原料组分还包括以下品种和用量的辅料：每1重量份西罗莫司配以无水羊毛脂8～15重量份、液状石蜡2～10重量份、黄凡士林75～95重量份。

本发明使用白芨多糖胶作为粘膜粘附性聚合物释药系统，将水和活性分子西罗莫司包埋在其中，形成稳定的水性凝胶状滴眼液，解决西罗莫司在单纯水溶液中溶解性和稳定性差的问题。另外，该系统可使治疗水平的活性药物在眼表滞留时间延长，显著减少给药次数，有助于增加患者的依从性和治疗成功率。

按本发明方法制备的西罗莫司滴眼剂眼局部外用具有良好的眼内穿透性，眼内生物利用度较高，毒副作用小，治疗及预防自身免疫性葡萄膜视网膜炎、同种异体兔角膜缘移植排斥反应、眼过敏性炎症反应等眼部免疫相关性疾病。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

 实施例1-3  制备缓释型西罗莫司滴眼液原料组分和用量

      所述白芨多糖胶可用市售品，也可用醇-水提取方法获得：先将白芨原料采用80% 乙醇流提取5h，药渣回收乙醇后用废水提取3 次，提取液减压浓缩后进行醇沉回收多糖。粗白芨多糖胶纯度一般低于80%，色泽略黄，且带有药味，作为药用还需要精制。一般采用乙醇多次沉淀、乙醚和丙酮类有机溶剂洗涤等措施提高其纯度。乙醇沉淀结合溶剂洗涤可使白芨多糖胶纯度达到90%～95%。进一步提高纯度可应用层析技术、酶法精制或特殊化学处理手段来实现。

按本发明技术方案，配制西罗莫司滴眼液可选用的辅料不限于上表所列品种，还可以有多种选择，例如抑菌剂，可以使用药剂学上所称的任何抑菌剂，其用量按药剂学上常规剂量。如，①0.002%～0.005%硫柳汞；②季铵盐类（包括苯扎氯铵、苯扎溴铵）、杜米芬、冼必泰等，有效浓度为0.002%～0.01%；③醇类，常用0.3～0.6%三氯叔丁醇；④尼泊金类，常用0.03～0.06%羟苯乙酯；⑤酸类，如0.01～0.08%三梨酸。以上各物质浓度均为容积-重量百分比，即每百毫升含有克数。

制备方法为，用白芨多糖胶溶解西罗莫司全量，将增稠剂用注射用水使其分散放冷，另用注射用水溶解pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂，搅匀过滤，合并二液，再加入已溶解好的西罗莫司，加注射用水至全量，过滤，分装，即得。使用pH调节剂调节成品滴眼液的pH值为5.5～7.5。

实施例4-6  制备缓释型西罗莫司眼用凝胶原料组分和用量

 按本发明技术方案，配制西罗莫司眼用凝胶可选用的辅料品种不限于上表所列品种，还可以有以下多种选择：

其中，抑菌剂的品种选择和用量同实施例1～3。

所述增稠剂与西罗莫司的用量比为0.5～5.0:1.0。

制备方法为，用白芨多糖胶溶解西罗莫司全量，用注射用水溶解增稠剂使其分散放冷，另用注射用水溶解pH调节剂、抑菌剂，再加已溶解好的增稠剂和西罗莫司，补加注射用水至所需体积，无菌分装，即得。使用pH调节剂调节成品滴眼液的pH值为5.5～7.5。

实施例7-9  制备缓释型西罗莫司眼药膏原料组分和用量

原料品种	实施例7	实施例8	实施例9
				西罗莫司	0.2克	0.5克	1.0克
白芨多糖胶	1克	2.0克	0.5克
				无水羊毛脂	10克	15克	12克
液状石蜡	2克	8克	6克
				黄凡士林	88克	76克	81克
药剂规格	0.2%西罗莫司眼药膏	0.5%西罗莫司眼药膏	1%西罗莫司眼药膏

 制备方法：用白芨多糖胶溶解西罗莫司全量，加入适量经灭菌、冷却的液状石蜡，研磨成细糊状，过200目筛，再逐渐加入无菌、滤过的羊毛脂、黄凡士林混合物，混匀，即得。所用制备器具及包装容器均须灭菌。

实验例 1  缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的稳定性比较

按本发明实施例2记载的方法所制备的药剂作为试验品，采用普通方法（不选用粘膜粘附性聚合物释药系统）制备的西罗莫司滴眼剂作为对照品，通过加速稳定性试验比较缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的稳定性。

因为本品对高温敏感，故确定本品的加速试验条件为温度25℃±2℃、相对湿度20%±5%。分别将三批缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂中试样品（批号：20110901、20110902、20110903），在市售包装条件下，放入恒温恒湿箱，在温度25℃±2℃、相对湿度20%±5%的条件下放置，分别于第1、2、3、6个月按时取样，按照实验前拟定的质量标准草案进行测定。测定结果与0月测定结果比较，结果见附表。

缓释型西罗莫司滴眼剂在温度25℃±2℃，相对湿度20%±5%的条件下经6个月考察，单个杂质及总杂质含量没有明显改变，前3个月西罗莫司含量没有明显变化，6个月时有所降低；而普通型西罗莫司滴眼剂单个杂质及总杂质含量明显增加，西罗莫司含量明显降低。以上试验结果均表明：缓释型西罗莫司滴眼剂稳定性较好。结果见下表。

加速稳定性试验结果

 实验例 2  缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的释放度比较

按本发明实施例2记载的方法所制备的药剂作为试验品，采用普通方法（不选用粘膜粘附性聚合物释药系统）制备的西罗莫司滴眼剂作为对照品。采用白芨多糖胶作为粘膜粘附性聚合物释药系统可使治疗水平的活性药物（西罗莫司）在眼表滞留时间延长，显著减少给药次数。通过测定滴眼液的释放度，从而可以预测缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂在眼表的滞留时间。

照释放度测定法（《中国药典》2010年版二部附录Ⅹ D）进行缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的释放度检查。采用紫外可见分光光度法（UV法）进行释放度测定。量取滴眼液10g，置烧杯底，小心加入100ml生理盐水，置37℃保温，作为释放度测定溶液。分别于1、3、7、12小时取上清液5ml进行释放度测定，同时补充等量体积的生理盐水。测定方法：取上清液5ml置于50ml容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液摇匀并定容。再次精密量取该溶液各5ml分别置于10ml容量瓶中，加硫酸溶液（75→100）5ml摇匀，于室温静置30min。取上述显色后的溶液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法，在482nm的波长处测定吸收度，计算西罗莫司的含量和释放度。结果见下表。

释放度测定结果（%）

批号	1小时	3小时	7小时	12小时
					缓释型西罗莫司滴眼剂	48	65	79	93
普通型西罗莫司滴眼剂	85	95	96	97

 结果表明，普通型西罗莫司滴眼剂释放较快，1小时就释放了约85%，而缓释型西罗莫司滴眼剂释放比较缓慢，而且是逐渐释放，可以在眼表面长时间保持较高的药物浓度，从而大大提高西罗莫司在眼部的生物利用度。

实验例3  缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂在眼部的药代动力学比较

按本发明实施例2记载的方法所制备的药剂作为试验品，采用普通方法（不选用粘膜粘附性聚合物释药系统）制备的西罗莫司滴眼剂作为对照品。

给予受试药缓释型西罗莫司滴眼剂或普通型西罗莫司滴眼剂，兔左右眼同时给药，给药剂量为50μL（采用移液枪精确给药)。分别于给药后的0.0833、0.5、2、6、12、24、48、72、96、120 h各取1小组(4只动物，雌雄各半)动物的泪液。泪液采集完后立即空气栓塞法处死兔子，按顺序取房水、角膜、视网膜。测定眼组织中西罗莫司的药物浓度，计算药动学参数。结果见下表。

新西兰兔单剂量给予缓释型西罗莫司滴眼剂后，120h后眼组织中仍然可以测到西罗莫司，在房水、角膜、视网膜中的半衰期均可达到30多个小时，故每天给药一次即可在眼组织中达到有效的药物浓度。

新西兰兔单剂量给予普通型西罗莫司滴眼剂48h后，眼组织中基本测不到西罗莫司，在房水、角膜、视网膜中的半衰期约8个小时，单剂量给予普通型西罗莫司滴眼剂的达峰浓度和曲线下面积均明显低于缓释型西罗莫司滴眼剂。为了维持有效的药物浓度，一天需给药2-3次。

新西兰兔单剂量给予缓释型西罗莫司滴眼剂后眼组织中西罗莫司的浓度

 新西兰兔单剂量给予普通型西罗莫司滴眼剂后眼组织中西罗莫司的浓度

 新西兰兔眼部单剂量给予缓释型西罗莫司滴眼剂后眼组织内的药动学参数

新西兰兔眼部单剂量给予普通型西罗莫司滴眼剂后眼组织内的药动学参数

 实验例4  缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的药效学比较

本发明缓释型西罗莫司滴眼剂主要用于治疗葡萄膜炎，故观察其对实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）的治疗作用，并与普通型西罗莫司滴眼剂进行药效学比较。按本发明实施例2记载的方法所制备的药剂作为试验品，采用普通方法（不选用粘膜粘附性聚合物释药系统）制备的西罗莫司滴眼剂作为对照品。

1  牛视网膜可溶性抗原( soluble ant igen, S-Ag ) 的提取

新鲜牛视网膜50只，匀浆、盐析、透析、离心，取上清液，使用二乙基胺乙基-琼脂糖凝胶(DEAESepharose FF, Pharmacia,Sweden)，C柱(2.6cm×10.0cm) ，置4℃低温层析装置(LKB, 瑞典)行离子交换层析分离纯化S-Ag。装柱(填充约85 ml凝胶)，用pH7. 5 的含三羟基氨基甲烷的盐酸层析缓冲液流洗平衡凝胶柱后, 加入牛视网膜上清液样品。继续层析缓冲液洗柱( 流速50 ml/ h) 至杂蛋白峰回落基线。0～0. 4mol/L NaCl 线性洗脱，10个柱体积( 100 ml/ h)，每5 ml 收集一管(紫外线280 nm 监测)。S-Ag峰样品4℃双蒸水透析24 h，移入玻璃瓶中, 置- 30℃保存。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色显示S-Ag为一主带，相对分子质量52×103。等电聚焦电泳S-Ag一条带，等电点6. 2。抗原分析结束后冻干，-30℃保存。

2  EAU动物模型建立

封闭群Wistar 大鼠，雄性，体重150g 左右，健康无眼病。随机数字表法随机分为实验组和对照组。将福氏完全佐剂(complete freund’s adjuvant, CFA, Gibco) 与等量牛视网膜S-Ag混匀，制成乳剂，S-Ag 终浓度1. 35 mg/ ml，大鼠双后足底部各注射0.1 ml，计270mg/只。前期实验分别用100、200、300mg S-Ag 免疫大鼠诱发EAU，经比较S-Ag 200～300 mg为最佳免疫剂量。

同时，每只大鼠尾静脉注射10×10⁹个菌体的灭活百日咳杆菌溶液；腹腔注射0. 1ml大肠杆菌超声粉碎液离心后的上清液。

3  给药方案

缓释型西罗莫司滴眼剂，每天给药1次，每次1-2滴。

普通型西罗莫司滴眼剂，每天给药3次，每次1-2滴。

4  观察指标及组织学检查

大鼠免疫后常规饲养，免疫后第2天起每日散瞳，用检眼镜、裂隙灯显微镜进行临床检查，记录临床表现。大鼠免疫后第12天至第23天，可观察到炎症反应。可见晶状体前囊散在炎性细胞沉着，晶状体中心区点状混浊，多在持续2～4 d后消退；或瞳孔对散瞳药反应差，晶状体前囊轻中度炎性细胞沉着，玻璃体内局灶性尘状混浊；或前房明显房水闪辉，晶状体前囊大量炎性细胞沉着，晶状体中心区明显混浊，玻璃体明显混浊；或球结膜高度水肿，睫状充血，虹膜血管扩张，虹膜后粘连甚至瞳孔闭锁，眼内无法窥入，有的大鼠病程中可见局限性视网膜脱离并迅速发生全视网膜脱离。对于出现明显EAU 临床表现的大鼠，10%水合氯醛过量腹腔注射处死，其它大鼠免疫后第23天同样方法处死。处死后立即摘除眼球，2.5%戊二醛固定24h以上，将眼球按子午线方向切开，分成两部分，除去晶状体，常规梯度酒精固定脱水，石蜡包埋，3～4mm切片，HE染色，光学显微镜观察，进行组织学炎症反应评分。

5  迟发型变态反应

为了评价迟发型变态反应(DTH)，大鼠免疫后第15天, 将20mg S-Ag 溶于10ml 0. 01mol/L 磷酸盐缓冲液( phosphate buffer saline, PBS)，注入右耳缘；左耳缘注入10mlPBS作为对照。分别于注射前和注射后24、48、72、96 h，使用微米尺测量双侧耳缘增厚度。其中每组各有6 只大鼠左耳同时在另一部位注射含有20mg 牛血清白蛋白的10ml PBS 作为对照。耳肿胀反应程度用以下公式计算: 注射后24h特异性耳肿胀= (注射后24h右耳量测值-注射前右耳测量值)/ ( 注射后24h左耳测量值-注射前左耳测量值)，48、72、96 h 特异性耳肿胀测量计算方法类推。

6  结果

6.1  组织学改变

S-Ag 免疫后，2 组大鼠大部分均有光感受器外段( receptor outer segment , ROS) 破坏，正常梳状纹理消失，甚者ROS 变薄、消失；此外，炎性细胞浸润的种类、数量和部位、组织结构改变和破坏程度不等。其中，轻者视网膜内界膜增厚, 炎症反应性均质样粉染物质沉积和( 或) 伴有局部空泡形成；神经节细胞和视网膜内丛状层空泡样变；视网膜色素上皮( ret inal pigment epithelium, RPE ) 细胞肿胀、空泡样变性，结构紊乱；虹膜或睫状体充血, 脉络膜增厚( 类上皮细胞浸润) ，偶见炎性细胞浸润( 主要为淋巴细胞) 。中度者在上述改变基础上可见虹膜、睫状体或玻璃体腔内少量炎性细胞浸润；内界膜、内丛状层、内核层可见局限性炎症灶( 炎性细胞聚集)；脉络膜血管管壁增厚，血管炎样反应。重度者在上述改变基础上, 虹膜、睫状体、脉络膜和视网膜各层组织中炎性细胞浸润数量增多，玻璃体弥漫性炎性细胞渗出；有的眼脉络膜明显炎症性增厚，以淋巴细胞浸润为主；眼组织结构可见破坏。极重度者眼内大量炎性细胞浸润( 中性白细胞为主) ，浸润部位广泛，甚至累及结膜、角膜、巩膜、眼肌；眼组织结构完全破坏：尤其视网膜各层组织弥漫性炎性细胞、炎性渗出物质、坏死组织，可见神经上皮层视网膜脱离、全视网膜脱离或脉络膜脱离。此外，许多无临床表现者组织学检查可见轻度异常，证明实际发生了EAU 。缓释型西罗莫司滴眼剂组EAU组织学炎症反应评分低于普通型西罗莫司滴眼剂组，二者差异具有显著性意义( P < 0. 001) (见下表) 。

二组大鼠EAU组织学及DT H评分

6.2  DT H反应

2组大鼠右耳均发生了S-Ag 诱导的DT H 反应，全耳明显红肿；左耳没有DT H 反应，局部轻度肿胀，不累及全耳，不发红，且消退迅速。以PBS为对照的2组大鼠特异性耳肿胀值差异无显著性的意义( P > 0. 05) 。各时间点比较，24 h特异性耳肿胀最明显，48 h开始消退，至96 h 基本恢复正常。

加用牛血清白蛋白作对照者，缓释型西罗莫司滴眼剂组特异性耳肿胀值均低于普通型西罗莫司滴眼剂组，但差异无显著性的意义( P >0. 05) ，各时间点耳肿胀规律与PBS 作对照时相同(见下表) 。

　二组大鼠牛血清白蛋白对照DT H 评分

7 结论

在整体水平上，缓释型西罗莫司滴眼剂（每天给药1次）和普通型西罗莫司滴眼剂（每天给药3次）均能够抑制大鼠EAU 的发生和减轻EAU 的病情，但缓释型西罗莫司滴眼剂每日给药次数较少，而且疗效明显优于普通型西罗莫司滴眼剂。

本发明人还对西罗莫司眼用凝胶和西罗莫司眼膏进行了稳定性、释放度、药代动力学和药效学验证，其稳定性、释放度、在眼部的药代动力学特征和参数，以及对葡萄膜炎等眼部免疫性疾病的治疗效果与西罗莫司滴眼液相比，结果相似，没有明显差异。

Claims (1)

1.一种治疗葡萄膜炎的滴眼液，其特征在于，它是0.1%西罗莫司滴眼液，其组分是以西罗莫司为药效原料，以白芨多糖胶作为粘膜粘附性聚合物释药系统，配以辅料甘露醇作渗透压调节剂，枸橼酸钠作PH调节剂，苯扎氯铵作抑菌剂，羟丙甲纤维素作增稠剂，氢化蓖麻油作助溶剂；各组分用量按100毫升药液中的含量表示为，西罗莫司0.1克、白芨多糖胶0.2克、甘露醇0.85克、枸橼酸钠0.1克、苯扎氯铵0.01克、羟丙甲纤维素0.1克、氢化蓖麻油2.0g，加注射用水至100毫升；其制备方法为，用白芨多糖胶溶解西罗莫司全量，将增稠剂用注射用水使其分散放冷，另用注射用水溶解pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂，搅匀过滤，合并二液，再加入已溶解好的西罗莫司，加注射用水至全量，过滤，分装，即得；使用pH调节剂调节成品滴眼液的pH值为5.5～7.5。