CN102574852B

CN102574852B - Akt抑制剂

Info

Publication number: CN102574852B
Application number: CN201080046941.9A
Authority: CN
Inventors: D·W·贝特; T·P·伯克霍德尔; J·R·克莱顿; M·埃根; K·J·J·亨利; D·M·琼斯; S·帕塔萨拉蒂; 裴华兴; M·E·莱帕拉; J·S·索耶
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2009-10-23
Filing date: 2010-10-20
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2030-10-20
Also published as: ES2465094T3; EP2491032B1; CA2778291A1; CN102574852A; JP5581390B2; WO2011050016A1; AU2010310786A1; EA020151B1; MX2012004780A; EA201270590A1; AU2010310786B2; KR101398268B1; US20120149684A1; BR112012011328A2; EP2491032A1; JP2013508382A; KR20120068941A; CA2778291C; US8436002B2

Abstract

本发明提供了式I的AKT抑制剂。本发明还提供了包含式I的化合物的药物组合物、式I的化合物的用途和式I的化合物的使用方法。

Description

AKT抑制剂

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT/雷帕霉素(mTOR)途径的哺乳动物靶标包括许多信号传导点，它们在控制细胞生长和存活中是关键。AKT、也称作蛋白激酶B是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，其在这种途径中具有关键作用。AKT活化由PI3K介导。PI3K生成结合AKT的磷脂类。在结合时，AKT被补充到质膜中并且通过磷酸化被活化。AKT活化和信号传导促进细胞存活、生长和增殖。AKT活化增加牵连各种癌症。

具有AKT抑制活性的一系列取代的哌啶化合物公开在WO2008/075109中。公开这些化合物是为了治疗疾病或病症，它们包含或来源于异常细胞生长或异常停止的细胞死亡，包括癌症。

对提供可选择的AKT抑制剂仍然存在需求，它们可以用于治疗增殖性障碍，例如癌症。本发明提供了可选择的AKT抑制剂。本发明的一些化合物是比本领域公知的那些化合物更有效的AKT抑制剂。

本发明的一些化合物与本领域公知的抑制剂相比具有低激酶2(ROCK2)活性。本发明的一些化合物与本领域公知的AKT抑制剂相比具有改善的口服效力。

本发明提供了下式的化合物：

其中：

A是

R¹是CH₃、CH₂CH₃或CF₃；

R²是H、CF₃、CH₂CF₃、CH₂CH₂CF₃、C₁-C₄烷基、C₃-C₆环烷基、CN、Cl、Br、CH＝CH₂、CH₂CH₂OCH₃、C(CH₃)₂CH₂OCH₃或四氢吡喃-4-基，其中C₃-C₆环烷基任选在1-位上被甲基取代，四氢吡喃-4-基任选在4-位上被甲基取代，R³是H；或R²和R³都是Cl；R⁴是H，R⁵是CH₃、C(CH₃)₃、CH(CH₃)₂、环丁基、环戊基、CH₂-环丙基、C(CH₃)₂CH₂CH₃或四氢吡喃-4-基；或R⁴和R⁵都是CH₃；或R⁴和R⁵与所连接的N一起形成任选在3-位上被羟基取代的吡咯烷或氮杂环丁烷；或其药学可接受的盐。

本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学可接受的盐和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明提供了用于疗法的本发明的化合物或其药学可接受的盐。

本发明提供了用于治疗肺癌、乳腺癌或胶质母细胞瘤的本发明化合物或其药学可接受的盐。本发明还提供了治疗哺乳动物肺癌、乳腺癌或胶质母细胞瘤的方法，包括对有这种治疗需要的哺乳动物施用有效量的本发明的化合物或其药学可接受的盐。本发明还提供了本发明的化合物或其药学可接受的盐在制备用于治疗肺癌、乳腺癌或胶质母细胞瘤的药物中的用途。本发明还提供了用于疗法的药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学可接受的盐，本发明提供了用于治疗肺癌、乳腺癌或胶质母细胞瘤的药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学可接受的盐。

本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物与药学可接受的载体和任选的另外的治疗剂。

用于上述通式的一般化学术语具有其通常的含义。例如，术语“C₁-C₄烷基”指1-4个碳原子的直链或支链一价饱和脂族链，包括、但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基是优选的烷基。特别优选乙基。

本发明的化合物是碱且由此与许多任意数量的有机酸和无机酸反应，形成药学可接受的盐，本发明包括式I化合物的药学可接受的盐。本文所用的术语″药学可接受的盐″指式I化合物的盐，它们对活生物体而言基本上是无毒性的。这种盐包括Journal of Pharmaceutical Science，66，2-19(1977)中举出的药学可接受的盐，它们是本领域技术人员公知的。在一个实施方案中，本发明的化合物是游离碱或盐酸盐。特别地，它是游离碱。

本发明的一些化合物具有一个或多个手性中心且可以以各种立体异构体构型存在。作为这些手性中心的结果，本发明的化合物作为外消旋物、对映体混合物和各对映体以及非对映异构体和非对映异构体混合物存在。所有这种外消旋物、对映体和非对映异构体均属于本发明的范围。本领域技术人员可以使用众所周知的技术和方法制备式I化合物的具体立体异构体和对映体，例如J.Jacques等人″Enantiomers，Racemates，andResolutions″，John Wiley和Sons，Inc.，1981和E.L.Eliel和S.H.Wilen，”Stereochemistry of Organic Compounds”，(Wiley-Interscience 1994)；和欧洲专利申请号EP-A-838448，1998年4月29日公布中公开的那些方法。拆分实例包括重结晶技术或手性色谱法。

本文所用的术语″R″和″S″通常用于有机化学以表示手性中心的具体构型。术语″R″(右旋)指当沿向最低优先基团的方向的键观察时具有基团优先(最高至第二低)的顺时针方向关系的手性中心的构型。术语″S″(左旋)指当沿向最低优先基团的方向的键观察时具有基团优先(最高至第二低)的逆时针方向关系的手性中心的构型。基团的优先性基于其原子数(减少的原子数的顺序)。优先性的部分清单和立体化学讨论在″Nomenclature ofOrganic Compounds：Principles and Practice″(J.H.Fletcher等人，eds.，1974)103-120页中得到。

名称

指向页面外突出的键。名称指向页面外反向突出的键。

术语″富含对映体”指一种对映体与另一种对映体相比的量增加。所得到的表示富含对映体的便利方法是对映体过量或″ee″的概念，其可以使用下列方程找到：

％ee＝E¹-E²

其中E¹是第一种对映体的百分比量，E²是第二种对映体的百分比量。富含对映体易于由本领域技术人员使用标准技术和方法测定，例如气相色谱法或使用手性柱的高效液相色谱法。

优选R¹所连接的碳为R构型：

本文所用的术语“R对映体”指存在大于90％、优选大于95％且更优选大于98％的％ee R对映体。

本领域技术人员还可以理解式I的化合物作为互变体存在，例如：

尽管互变体在结构上不同，但是本领域技术人员可以理解它们以平衡方式存在且易于和快速地在常规条件下互变(参见March，Advanced Organic Chemistry，第3版，Wiley Interscience，New York，New York(1985)，66-70页；和Allinger，Organic Chemistry，第2版，Worth Publishers，New York，New York，(1976)，173页)。照此，单一互变体形式的式I的化合物的代表关注单个及其混合物形式的互变体形式。

使用Chem Draw Ultra v10版或Chem Bio Viz Ultra v11版中的命名程序命名典型化合物。

在一个实施方案中，本发明包含式I的化合物，其中A是：

特别地，A是：

在一个实施方案中，R¹是CH₃或CF₃。特别地，R¹是CH₃。

在一个可替代选择的实施方案中，本发明包含式I的化合物，其中A是：

在一个实施方案中，本发明包含式I的化合物，其中R²是CF₃、CH₂CF₃、CH₂CH₂CF₃、C₁-C₄烷基、C₃-C₆环烷基、CN、Cl、Br、CH＝CH₂、CH₂CH₂OCH₃、C(CH₃)₂CH₂OCH₃或四氢吡喃4-基，其中C₃-C₆环烷基任选在1-位上被甲基取代，四氢吡喃-4-基任选在4-位上被甲基取代，R³是H；或R²和R³都是Cl。特别地，R²是CF₃、CH₂CF₃、CH₂CH₂CF₃、CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂CH(CH₃)₂、C₃-C₆环烷基、Cl、Br、CH＝CH₂、CH₂CH₂OCH₃、C(CH₃)₂CH₂OCH₃或四氢吡喃4-基，其中C₃-C₆环烷基任选在1-位上被甲基取代，四氢吡喃-4-基任选在4-位上被甲基取代，R³是H；或R²和R³都是Cl。更具体地，R²是CF₃、CH₂CF₃、CH₂CH₃或四氢吡喃-4-基，R³是H。甚至更具体地，R²是四氢吡喃-4-基，R³是H。

在另一个实施方案中，本发明包含式I的化合物，其中R²是CF₃、CH₂CF₃、CH₂CH₂CF₃、CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、环丙基、Br、CH₂CH₂OCH₃或四氢吡喃-4-基，R³是H。特别地，R²是CH₂CF₃、CH₂CH₂CF₃或CH₂CH₃，R³是H。

在一个实施方案中，本发明包含式I的化合物，其中R⁴是H，R⁵是CH₃、C(CH₃)₃、CH(CH₃)₂、环丁基、环戊基或CH₂-环丙基；或R⁴和R⁵都是CH₃；或R⁴和R⁵与所连接的N一起形成任选在3-位上被羟基取代的吡咯烷或氮杂环丁烷。特别地，R⁴是H和R⁵是CH₃、C(CH₃)₃、CH(CH₃)₂、环丁基、环戊基或CH₂-环丙基；或R⁴和R⁵与所连接的N一起形成吡咯烷或氮杂环丁烷。更具体地，R⁴和R⁵与所连接的N一起形成吡咯烷。

在另一个实施方案中，本发明包含式I的化合物，其中R⁴是H和R⁵是C(CH₃)₃；或R⁴和R⁵与所连接的N一起形成吡咯烷或氮杂环丁烷。特别地，R⁴和R⁵与所连接的N一起形成吡咯烷或氮杂环丁烷。

在另一个实施方案中，本发明包含式I的化合物，其中：

A是

R¹是CH₃或CF₃；

R²是CF₃、CH₂CF₃、CH₂CH₂CF₃、CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃，、CH(CH₃)₂、CH₂CH(CH₃)₂、C₃-C₆环烷基、Cl、Br、CH＝CH₂、CH₂CH₂OCH₃、C(CH₃)₂CH₂OCH₃或四氢吡喃-4-基，其中C₃-C₆环烷基任选在1-位上被甲基取代，四氢吡喃-4-基在4-位上被甲基取代，R³是H；或R²和R³都是Cl；且

R⁴是H，R⁵是CH₃、C(CH₃)₃、CH(CH₃)₂、环丁基、环戊基或CH₂-环丙基；或R⁴和R⁵与所连接的N一起形成吡咯烷或氮杂环丁烷；或其药学可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明包含下式的化合物：

其中：

R²是CF₃、CH₂CF₃、CH₂CH₃或四氢吡喃-4-基；或其药学可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明包含式I的化合物，其中：

A是

R¹是CH₃、CF₃或CH₂CH₃；

R²是CF₃、CH₂CF₃、CH₂CH₂CF₃、CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、环丙基、Br、CH₂CH₂OCH₃或四氢吡喃-4-基，R³是H；

R⁴是H，R⁵是C(CH₃)₃；或R⁴和R⁵与所连接的N一起形成吡咯烷或氮杂环丁烷；或其药学可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明包含下式的化合物：

其中：

R¹是CH₃或CF₃；

R²是CH₂CF₃、CH₂CH₂CF₃或CH₂CH₃；

R⁴和R⁵与所连接的N一起形成吡咯烷或氮杂环丁烷；或其药学可接受的盐。

在另一个实施方案中，提供了下列化合物或其药学可接受的盐：

(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮；

(R)-4-(4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮；和

(R)-4-(4-(1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮。

在一个实施方案中，本发明的化合物是(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学可接受的盐。特别地，化合物是(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮。更具体地，化合物是(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮晶型III。(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮晶型III的特征在于X-射线粉末衍射图案(CuKα射线，

)，其包含在8.53(2θ±0.1°)的峰和任选的一个或多个选自17.06、7.97和14.17(2θ±0.1°)的峰。优选特征在于包含在8.53、17.06、7.97和14.17(2θ±0.1°)的峰的X-射线粉末衍射图案。

本发明的化合物是AKT抑制剂且由此用于治疗癌症。特别地，治疗癌症，其中PI3K/AKT/mTOR途径活化，包括乳腺癌(Carpten等人，448：439-444(2007))，特别是HER2阳性乳腺癌(Yakes等人，Cancer Research，62：4132-4141(2003))；结直肠癌(Parsons等人，Nature，436：792(2005)；Carpten等人，448：439-444(2007))；卵巢癌(Carpten等人，448：439-444(2007))；肺癌，特别是鳞状细胞肺癌(Malanga等人，Cell Cycle，7：5：665-669(2008))；胃癌(Byun等人，Int.J.Cancer，104：318-327(2003))；胰腺癌(Ruggeri等人，Molecular Carcinogenesis，21：81-86(1998))；头颈鳞状细胞癌(Pedrero等人，Int.J.Cancer，114：242-248(2005))；黑素瘤(Stahl等人，Cancer Research，64：7002-7010(2004))；胶质母细胞瘤(The CancerGenome Atlas Research Network，455：1061-1068(2008))；前列腺癌(Sasaki等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，399(1)：79-83(2010))；膀胱癌(Ching等人，Lab.Invest.，Epub.26 July 2010)；间皮瘤(Mohiuddin等人，Annals ofSur.Oncol.，9(3)：310-316(2002))；肉瘤，特别是软组织肉瘤(Zhu等人，Cancer Res.，68(8)：2895-2903(2008))；和肾癌(Hara等人，Annals of Oncol.，16：928-933(2005))。

本发明的化合物或其药学可接受的盐可以用于治疗哺乳动物癌症的方法中，所述的癌症特别是上述癌症，该方法包括对有这种治疗需要的哺乳动物施用有效量的本发明的化合物或其药学可接受的盐。还提供了本发明的化合物或其药学可接受的盐，其用于治疗癌症，特别是上述癌症。此外，本发明的化合物或其药学可接受的盐可以用于制备治疗癌症、特别是上述癌症的药物。还提供了用于治疗癌症、特别是上述癌症的药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学可接受的盐。

本发明的化合物可以与另外的治疗剂组合使用，所述另外的治疗剂特别是mTOR(雷帕霉素哺乳动物靶标)抑制剂、EGFR(表皮生长因子受体)抑制剂、吉西他滨(Gemzar

)、顺铂、他斯索兰(N-[(5-溴噻吩-2-基)磺酰基]-2，4-二氯苯甲酰胺钠)、培美曲塞(Alimta

)、多西他赛(Taxotere

)、多柔比星(Doxil

)、伊立替康(Campto；Camptosar

)、紫杉醇(Taxol

)或他莫昔芬。优选的mTOR抑制剂包括雷帕霉素(也称作西罗莫司)及其类似物，例如依维莫司(42-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素；EP 1 413 581中公开)、西罗莫司脂化物(丙酸42-(3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲酯)-雷帕霉素；ToriselWO 95/28406中公开)和deforolimus(42-(亚膦酸二甲酯)雷帕霉素；WO 03/64383中公开)。优选的EGFR抑制剂包括厄洛替尼(Tarceva

)、西妥昔单抗(Erbitux

EP 0 359 282中公开)、帕尼单抗(Vectibix

EP 0 359 282中公开)和吉非替尼(IressaEP 0 566 226中公开)。

在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明化合物或其药学可接受的盐和选自如上述举出的合并用于同时、单独或依次应用于疗法中的那些治疗剂的产品。本发明还提供了本发明的化合物或其药学可接受的盐，其用于同时、单独和依次与治疗剂联用，所述的治疗剂选自如上述举出的那些，它们用于治疗乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、间皮瘤、肉瘤和肾癌。本发明还提供了治疗癌症的方法，所述的癌症选自乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、间皮瘤、肉瘤和肾癌，该方法包括对有此需要的患者施用本发明的化合物或其药学可接受的盐和选自上述举出的那些治疗剂，其用量在组合中是有效的。

在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物与药学可接受的载体和任选的另外的治疗剂。特别地，治疗剂选自如上所举出的那些。

优选本发明化合物的口服施用。根据情况的不同，可以使用乃至优选其他的施用途径，例如静脉内。透皮施用对易忘或对口服药物难以接受的患者而言可能是极为期望的。在具体的情况中，还可以通过经皮、肌内、鼻内或直肠内途径施用本发明的化合物。施用途径可以以任何方式改变，受限于药物的物理特性、患者和看护者的便利性和其他相关情况(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(1990))。

本领域技术人员可以根据公认的技术和方法制备式I的化合物。更具体地，可以如下反应路线、制备和实施例中所举出的制备式I的化合物。本领域技术人员公认下列反应路线中的各个步骤可以改变以提供式I的化合物。试剂和原料是本领域技术人员易于得到的。除非另有指定，否则全部取代基如上文所定义。

反应路线1

在反应路线1中，可以通过化合物(1)的哌啶环的胺基与化合物(2)离去基氯基之间的亲核取代反应制备式I的化合物。将化合物(1)和化合物(2)溶于适合的溶剂例如N-甲基吡咯烷酮、甲醇或正-丙醇与适合碱例如二异丙基乙胺、三乙胺或1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯。将该反应体系在烧瓶或微波试管内加热。可以通过本领域公知的方法分离式I的化合物，例如水后处理，其可以包括用磷酸水溶液进行酸洗涤，然后用氢氧化钠水溶液进行碱水洗涤，进一步例如使用硅胶色谱法或高效液相色谱法(HPLC-手性AD)纯化。或者，在水后处理后，可以通过从溶剂例如75％甲基叔丁基醚和己烷的混合物中重结晶分离式I的化合物。

可以通过将式I的化合物溶于适合的酸水例如4M盐酸制备式I的化合物的盐，并且可以通过减压浓缩分离。或者，式I的化合物的酸性反相色谱可以用于得到二盐酸盐或三氟乙酸盐。

反应路线2

在反应路线2中，可替代选择的途径如对制备式I的化合物所述(A如上述所定义)。该合成途径包括化合物(16)与适合的胺之间的胺取代反应，得到如对式I的化合物所定义的-NR⁴R⁵取代基。将化合物(16)溶于适合的溶剂例如二甲基甲酰胺或二甲亚砜。加入适合的碱例如三乙胺。加入可以产生对式I的化合物所定义的-NR⁴R⁵取代基的适合的胺。将该反应体系在约50℃加热至反应完成。通过传统的方式分离式I的化合物，例如水后处理、浓缩和有机萃取物的色谱。

通过将化合物(17)溶于适合的溶剂例如二氯甲烷、加入适合的碱例如三乙胺、冷却至约0℃制备化合物(16)。滴加甲磺酰氯。此后，用饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止，然后进行本领域公知的传统方法以分离化合物(16)。化合物(16)可以无需纯化用于制备式I的化合物。可以通过反应路线1中所述的方法由化合物(18)(n＝1-2)和化合物(2)制备化合物(17)。化合物(17)可以无需纯化用于制备化合物(16)。

如果得到的式I的化合物是外消旋物，则可以通过本领域公知的方法例如手性色谱法将其分离成各对映体。

可以通过用HPLC(Chiralpak AD-H)和超流体色谱法(手性AD-H)比较两种对映体测定式I的化合物的各对映体的手性纯度。

反应路线3

在反应路线3中，可以通过由化合物(5)和化合物(6)开始的一系列反应制备化合物(2a)即4-氯-5-R¹-6，8-二氢-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的外消旋混合物的对映体化合物(2b)和(2c)。通过合并化合物(3)与氢氧化铵水溶液(20-30％)或通过加热氨气在异丙醇中的溶液制备化合物(2a)。可以通过冷却后过滤、然后用冷水洗涤分离化合物(2a)。通过手性色谱法进一步拆分化合物(2a)得到化合物(2b)和化合物(2c)。在反应路线1或反应路线2中的合成途径后，化合物(2a)、(2b)或(2c)可以用于形成式I的化合物的外消旋物或各对映体。

或者，可以使用叔丁氧羰基叔丁基碳酸酯和4-(二甲基氨基)吡啶在溶剂例如二氯甲烷中用氮保护基例如叔丁氧羰基(BOC)部分保护化合物(2a)。然后通过手性色谱法分离外消旋物得到氮BOC-保护的化合物(2b)和(2c)。通过本领域公知的方法例如使BOC-保护的化合物(2b，2c)与盐酸的二噁烷溶液反应脱保护得到期望的单一对映体。

可以通过化合物(4)的卤素取代反应制备化合物(3)。将化合物(3)在适合的碱例如N，N-二乙基苯胺和氯化试剂例如磷酰氯的存在下溶于适合的溶剂例如乙腈或甲苯。回流该反应混合物后，可以通过传统方式分离化合物(3)，例如用3M磷酸氢二钾水溶液进行水后处理，用适合的溶剂例如甲基叔丁基醚萃取，用水洗涤有机层，真空浓缩。

或者，可以合成包括氮保护基例如2，4-二甲氧基苄基的化合物(2a)。首先将化合物(3)溶于适合的溶剂例如二甲基甲酰胺。加入碱例如二异丙基乙胺和试剂2，4-二甲氧基苄胺。通过本领域公知的方法例如水后处理分离2，4-二甲氧基苄基中间体。将该中间体在碱例如二异丙基乙胺的存在下进行加热，形成2，4-二甲氧基苄基保护的化合物(3)。可以将该化合物进行反应路线1中的合成，形成2，4-二甲氧基苄基保护的式I的化合物。通过传统方式使2，4-二甲氧基苄基保护的式I化合物脱保护，得到外消旋物，然后进行手性色谱，以分离各对映体。

可以通过Michael加成反应、然后进行原位成环反应制备化合物(4)。将丙二酸二甲酯(化合物(5))和化合物(6)加入到甲醇钠的甲醇溶液和醋酸甲脒的混合物中。可以通过传统方式即通过将反应体系的pH调整至约3、过滤、用冷溶剂混合物例如甲醇/水洗涤产物分离化合物(4)。

反应路线4

在反应路线4中，可以通过一系列反应制备化合物(2d)，所述的一系列反应由商购原料例如胺(10)、2，2，2-三氟乙胺与商购醛4-氨基-6-氯嘧啶-5-醛(7)之间的还原氨基化反应开始，在溶剂混合物例如四氢呋喃和甲醇中在四异丙醇钛的存在下形成亚胺(8)。通过将化合物(8)溶于溶剂例如二氯甲烷、在氮气气氛中冷却、加入甲磺酸和适合的还原剂例如硼烷叔丁基胺还原亚胺。通过碱水后处理、真空干燥有机层分离胺(9)。化合物(9)可以无需进一步纯化直接用于下一步反应。可以通过使化合物(9)与三光气在碱例如三乙胺的存在下、在适合的溶剂例如二氯甲烷中反应、在氮气气氛中冷却至约0℃、然后将该反应混合物过夜加热至约40℃制备化合物(2d)。通过本领域公知的方法例如水后处理、浓缩、有机萃取物的色谱分离化合物(2d)。可以通过作为反应路线1和2中使用化合物(2d)得到式I的化合物。

反应路线5

在反应路线5中，可以通过用传统方式使相应的叔丁氧羰基化合物(15)脱保护制备化合物(1)，所述的传统方式例如加入到任选溶于适合的溶剂例如二氯甲烷、甲醇或异丙醇、氯化氢的二噁烷溶液、异丙醇、甲醇或乙醇中的化合物(15)中。使反应在室温-约50℃的温度下进行约2小时-18小时。传统的后处理可以包括蒸发挥发性物质，然后任选用碱例如2M氢氧化钠水溶液的碱化步骤，用溶剂例如乙酸乙酯萃取，真空浓缩，得到化合物(1)，其为游离碱n HCl或n乙酸盐。

可以通过在反应路线2中与由化合物(16)制备式I化合物所述相同的反应由化合物(14)或制备化合物(15)。

可以通过在反应路线2中由化合物(17)制备化合物(16)所述相同的反应由化合物(13)制备化合物(14)。

可以通过根据合成途径A酸催化的脱保护反应由化合物(12)制备化合物(13)。将化合物(12)溶于适合的溶剂例如四氢呋喃。加入酸催化剂例如1N盐酸。可以通过本领域公知的方法例如水后处理分离化合物(13)。

将化合物(12)描绘为区域异构体，但也可以表示区域异构体混合物。区域异构体(12a)和(12b)的合成和分离如反应路线6中所示。可以通过将化合物(11)溶于适合的溶剂例如二甲亚砜与碱例如氢氧化钾或叔丁醇钾制备化合物(12)。可以任选加入碘化钠。将2-(2-卤代乙氧基)四氢吡喃加入到反应体系中。将该反应维持在室温约4小时，或可以加热至约45℃-50℃约1小时-12小时。可以通过本领域公知的方法例如水后处理、真空浓缩、通过色谱法纯化分离化合物(12)。

可替代选择途径B后得到化合物(1)，其中R⁴和R⁵与所连接的N一起形成吡咯烷。可以通过使用上述涉及化合物(11)转化成化合物(12)的反应条件使化合物(11)与1-(2-氯乙基)-吡咯烷盐酸盐反应制备化合物(15a)。将化合物(15a)描绘为区域异构体，但也可以表示区域异构体混合物。区域异构体(15b)和(15c)的合成和分离如反应路线6中所示。可以通过如上所述的传统方式除去BOC保护基。

反应路线6

当化合物(11)如在反应路线5中烷基化时，可以分别形成如反应路线6中所示不同比例的化合物(12)的区域异构体(12a)和(12b)和化合物(15a)的区域异构体(15b)和(15c)。在一些情况中，仅得到期望的异构体(12a)或(15b)。在其他情况中，该合成产生有利于期望的化合物(12a)或(15b)的比例。在这种情况中，任选进一步纯化，在随后的步骤中除去少量杂质。然而，如果化合物(12a)与化合物(12b)或化合物(15b)与化合物(15c)之比并非期望的异构体占优，则纯化是必要的。纯化以分离期望的异构体(12a)或(15b)包括柱色谱或从适合的溶剂例如异丙醇与丁酸或1M或3M盐酸的甲醇或甲醇/乙醇混合物与乙酸乙酯中重结晶。

反应路线7

在反应路线7中，可以通过化合物(12c)与卤化试剂例如N-溴琥珀酰亚胺之间的卤代反应引入R²和R³，得到二卤代(12d)或一卤代(12e)化合物。化合物(12d)和(12e)可以进行例如在反应路线5中的合成。此外，当R²和R³是溴时，可以通过在降温下、在适合的溶剂例如四氢呋喃中使化合物与正丁基锂反应、然后加入异丙醇将化合物(12d)转化成化合物(12e)。

化合物(12e)可以接触Suzuki偶合反应条件，例如乙酸钯、三环己基膦、磷酸三钾N-水合物和取代的硼酸。例如，就环丙基硼酸而言，溴将被环丙基取代。

反应路线8

在反应路线8中，可以通过化合物(11a)与卤化试剂例如N-氯琥珀酰亚胺、N-碘琥珀酰亚胺或碘之间的卤代反应引入R²和R³，当R²和R³为氯或碘时，在通常在文献中找到的反应条件下得到二卤代(11b或11d)或一卤代(11c)化合物。可以通过柱色谱法从相同反应混合物中分离化合物(11b)和(11c)。可以通过将该反应混合物倾倒在硫酸氢钠水溶液上形成黄色混悬液、过滤、洗涤固体分离化合物(11d)。可以根据在反应路线5中发现的合成由相应化合物(11)制备化合物(15d、15e和15f)。

可以在氯化异丙基镁和2-甲基四氢呋喃的存在下使化合物(15f)一脱卤化，形成化合物(15g)。化合物(15g)可以接触Suzuki偶合反应条件，例如乙酸钯、三叔丁基磷鎓四氟硼酸盐和取代的硼酸酯例如2-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷(化合物(38)，其可以根据反应路线16)在适合的溶剂例如二甲亚砜与碱例如碳酸钠中制备。可以在氢气气氛中、在钯/活性炭的存在下、在适合的溶剂例如乙醇中还原得到的3，6-二氢-2H-吡喃-4-基取代的化合物，形成化合物(15)，其中R²＝四氢-2H-吡喃-4-基。

反应路线9

在反应路线9中，化合物(15h)可以接触Suzuki偶合反应条件，例如合并硼酸酯4，4，5，5-四甲基-2-乙烯基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷，在碱的存在下，典型地是磷酸三钾N-水合物，和钯催化剂，典型地是双(二亚苄基丙酮)钯(0)或乙酸钯，和二环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]正膦。得到的化合物(15i)可以如反应路线5中进行，形成化合物(1)。

或者，该反应可以对羟基-乙基取代的化合物(13)而非吡咯烷-乙基取代的化合物进行。得到的烯化合物可以接触氢化条件，包括10％钯/碳，在适合的溶剂例如乙醇中，在氢气气氛中，形成烷基取代的化合物。可以通过经Celite

过滤分离化合物、然后用甲醇洗涤、真空浓缩。

反应路线10

在反应路线10中，可以通过传统的脱保护方法制备化合物(18)。将化合物(12)溶于适合的溶剂例如甲醇，加入4M盐酸的二噁烷溶液，搅拌过夜。可以通过本领域公知的方法例如真空浓缩分离化合物(18)，得到化合物(18)，为nHCl盐。化合物(18)可以用于反应路线2，形成式I的化合物。

反应路线11

在反应路线11中，可以通过两步法制备化合物(11e)，包括酮(22)或醛(26)氧化反应得到化合物(23)和氨化合物(23)和化合物(24)的醛部分之间的缩合反应。在适合的溶剂混合物例如1，4-二噁烷和水与酸例如乙酸中合并二氧化硒。将酮(22)或醛(26)加入到氧化剂中，加热至约90℃，搅拌约2-18小时，过滤，得到化合物(23)。任选的后处理可以包括通过Celite

过滤，真空浓缩，将残余物溶于溶剂例如甲醇。将化合物(24)溶于甲醇与氢氧化铵或乙酸铵，任选冷却至约0℃。滴加化合物(23)，将该反应体系搅拌过夜。可以通过本领域公知的方法例如过滤、水后处理和硅胶色谱法纯化分离化合物(11e)。任选的后处理可以包括用甲基叔丁基醚和水稀释残余物，通过添加磷酸水溶液将pH调整至约2，分离水层，用甲基叔丁基醚洗涤水层，用碳酸钠将pH调整至约10，最终用乙酸乙酯萃取。合并有机层，用饱和氯化钠洗涤，过滤，真空浓缩，得到化合物(11e)。

如果不商购，则可以通过一系列由化合物(25)或(26)开始的氧化反应制备化合物(23)。将3，3，3-三乙酰氧基-3-碘四氯苯酞溶于适合的溶剂，例如二氯甲烷。将化合物(25)溶于相同溶剂，滴加到氧化试剂中。约4小时后，可以通过本领域公知的方法例如通过Celite

过滤、涉及用硫代硫酸钠和氢氧化钠水洗涤的水后处理、过滤和真空浓缩分离化合物(26)。

反应路线12

在反应路线12中，可以通过Weinreb酮合成制备化合物(22)，所述的Weinreb酮合成包括形成Weinreb酰胺，然后与有机金属亲核体反应、水解形成期望的酮。将酯(27)溶于适合的溶剂例如甲醇，加入碱例如氢氧化钠。可以通过传统方式分离酸(28)，例如用甲基叔丁基醚的水后处理，用盐酸水溶液进行酸洗涤。可以使固体无需纯化进行下一步反应。通过在适合的溶剂例如二氯甲烷中、在1，1’-羰基二咪唑的存在下搅拌酸(28)、加入N，O-二甲基羟基胺盐酸盐制备Weinreb酰胺(29)。通过水后处理包括用氯化铵和饱和氯化钠水溶液洗涤、真空浓缩分离Weinreb酰胺。化合物(29)无需进一步纯化用于下一步。下一步包括将Weinreb酰胺溶于溶剂例如四氢呋喃，冷却至约0℃，加入有机金属亲核体氯化甲基镁。通过将该反应混合物倾入冰/水混合物或氯化铵水溶液水解该复合物。水后处理包括甲基叔丁基醚和真空浓缩得到化合物(22)。化合物(22)可以无需纯化用于下一步或在通过硅胶色谱法纯化后用于下一步。

可替代选择得到化合物(22)的方法包括使化合物(27)与氯化异丙基镁和N，-O-二甲基羟基胺盐酸盐在溶剂例如四氢呋喃在降温下反应，形成Weinreb酰胺。

反应路线13

在反应路线13中，还可以通过使化合物(30)与乙酸钠水溶液在升温下反应、然后与化合物(24)在适合的溶剂例如甲醇和氢氧化铵水溶液反应制备化合物(11e)。可以通过本领域公知的方法例如水后处理分离化合物(11e)，可以无需进一步纯化使用。

反应路线14

在反应路线14中，制备化合物(30)从1，1-二溴甲烷(32)的阴离子形成开始。形成阴离子包括通过文献中通常找到的方法由二异丙基胺和正丁基锂制备二异丙基氨基锂。在形成二异丙氨基锂后，在适合的溶剂例如四氢呋喃中、在降温下搅拌化合物(31)和化合物(32)，滴加二异丙基氨基锂，同时维持降温。用盐酸水溶液使反应停止，然后用溶剂例如甲基叔丁基醚和庚烷进行水后处理。

反应路线15

在反应路线15中，化合物(11f)的合成如以酸酐(33)开始的所示。该合成通过形成(E)-(二甲基亚肼基)-1，1，1-三氟-丙-2-酮进行，其中通过使N-甲基-N-(亚甲基氨基)-甲胺与碱例如2，6-卢剔啶反应、在降温下加入三氟乙酸酐生成(E)-(二甲基亚肼基)-1，1，1-三氟-丙-2-酮。使中间体与化合物(24)在乙酸和乙酸铵中反应，形成化合物(11f)。可以通过经在氢氧化铵中加热化合物(11f)、冷却、过滤以分离固体将三氟甲基取代物转化成氰基取代物将化合物(11f)进一步转化成化合物(11g)。

反应路线16

在反应路线16中，可以通过一系列反应制备化合物(38)，所述的一系列反应由化合物(34)与(35)之间在碱例如氢化钠和溶剂例如甲基叔丁基醚的存在下的Williamson醚合成开始，形成醚(36)。化合物(36)接触标准反应条件，形成硼酸酯(37)。这些试剂可以包括氯化锂、一氯化亚铜和双(频哪酸)二硼和适合的溶剂例如二甲基甲酰胺。可以通过使用第2代Grubbs’催化剂、在适合的溶剂例如二氯甲烷中通过钌催化剂的烯置换制备化合物(38)。化合物(38)可以如反应路线8中所述用于合成式I的化合物。

本领域技术人员可以理解，并非全部式I化合物上的取代基都可以耐受用于合成所述化合物的一些反应条件。这些部分可以在合成中被引入便利的点或可以被保护，然后根据需要或期望脱保护。本领域技术人员还可以理解，可以在合成本发明化合物的任意便利点除去保护基。引入和除去氮保护基的方法是本领域众所周知的；例如，参见Greene和Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第3版，John Wiley和Sons，New York，Chapter 7(1999)。此外，本领域技术人员可以理解在许多情况中，引入部分的次序并非关键。产生式I化合物所需的步骤的特定次序依赖于所合成的具体化合物、原料化合物和取代的中间体和产物的相对倾向性。

制备1

(E，Z)-6-氯-5-((2，2，2-三氟乙基亚氨基)甲基)嘧啶-4-胺

将4-氨基-6-氯嘧啶-5-醛(0.31g，1.94mmol)在四氢呋喃(4mL)中的溶液加入到四(异丙醇)钛(0.85mL，1.5eq)、2，2，2-三氟乙胺(0.76mL，4.9eq)和甲醇(3.8mL)的混合物中。将该反应体系在室温搅拌过夜。加入2∶1氢氧化铵∶水至反应混合物中，然后用乙酸乙酯稀释。分离各层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为白色固体(0.44g，96％)。MS(ES)m/z＝239[M]⁺。

制备2

6-氯-5-((2，2，2-三氟乙基氨基)甲基)嘧啶-4-胺

合并(E，Z)-6-氯-5-((2，2，2-三氟乙基亚氨基)甲基)嘧啶-4-胺(3.42g，14.35mmol)和二氯甲烷(34.8mL)。在氮气气氛中冷却至0℃。通过注射器滴加甲磺酸(2.30mL，2.4eq)，维持温度低于5℃。通过注射器滴加硼烷叔丁胺复合物(1.86g，1.5eq)在二氯甲烷(10mL)中的溶液，维持温度低于5℃。将该反应混合物在0℃搅拌1小时。加入2∶1氢氧化铵∶水，然后用二氯甲烷稀释。分离各层。用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为黄色固体(2.39g，69％)。MS(ES)m/z＝241[M]⁺。

制备3

5-氯-3-(2，2，2-三氟乙基)-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2(1H)-酮

合并6-氯-5-((2，2，2-三氟乙基氨基)甲基)嘧啶-4-胺(9.57g，39.78mmol)、三乙胺(5.50mL，2.0eq)和二氯甲烷(795mL)。在氮气气氛中冷却至0℃。加入三光气(11.85g，1.0eq)的二氯甲烷(228mL)溶液。在0℃搅拌30min，温至室温。将该反应混合物加热至40℃过夜。加入碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用9∶1二氯甲烷∶甲醇洗脱，得到标题化合物(4.50g，42％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.83(s，1H)，8.41(s，1H)，4.20(m，2H)，3.25(s，2H)。

制备4

3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)丁酸甲酯

将甲醇钠(14.69g，0.85eq)加入到甲醇(70mL)中。在15分钟内回流加热，同时加入丙二酸二甲酯(36.64mL，320.00mmol)和巴豆酸甲酯(34.01mL，1.0eq)。将该混合物回流40分钟，然后将该混合物冷却至室温。加入甲醇钠(19.02g，1.1eq)、甲醇(70mL)和醋酸甲脒(39.98g，1.2eq)的混合物。在室温搅拌过夜。用冰浴冷却该混合物，加入5M盐酸水溶液，调整pH至3。过滤，得到标题化合物(41.00g，60％)。MS(ES)m/z＝213[M]⁺。

基本上如对3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)丁酸甲酯所述制备下列化合物：

制备	化合物名称	MS(ES)m/z[M]⁺
			5	3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)戊酸甲酯	227
6	3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯	267

制备7

3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)丁酸甲酯

将3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)丁酸甲酯(41.00g，193.21mmol)加入到乙腈(95mL)中。在10分钟内滴加磷酰氯(39.50mL，2.2eq)(放热明显)。将该混合物搅拌10分钟，在10分钟内滴加N，N-二乙基苯胺(34.00mL，1.1eq)(放热明显)。回流加热该混合物过夜。用冰浴冷却该混合物。缓慢加入到二碱式磷酸钾水溶液(336.52g的500mL水溶液，10eq)的预冷却混合物中。用乙酸乙酯萃取水层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用10％乙酸乙酯的己烷溶液至40％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到标题化合物(44.00g，55％)。MS(ES)m/z＝249[M]⁺。

基本上如对3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)丁酸甲酯所述制备下列化合物：

制备	化合物名称	MS(ES)m/z[M]⁺
			8	3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯	304
9	3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)戊酸甲酯	263

制备10

(R)-4-氯-5-乙基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

将3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)戊酸甲酯(10.00g，38.01mmol)溶于28％氢氧化钠铵的水(95mL)溶液，用350mL试管密封。将该反应混合物加热至200℃持续2小时。用冰浴冷却该反应混合物，然后过滤，用冷水洗涤。真空干燥固体，得到外消旋物。手性分离(Chiralpak AS-H，100％乙醇w/0.2％二甲基乙胺)得到标题化合物，为对映体2(3.19g，40％)(＞99％ee)。MS(ES)m/z＝212[M]⁺。

基本上如对(R)-4-氯-5-乙基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮所述制备下列化合物：

制备12和13

4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

和

(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

在密封试管内将3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)丁酸甲酯(24.00g，96.35mmol)加入到30％氢氧化铵水溶液(100.00mL，7.5eq)中。密封，在60℃搅拌该混合物过夜。用冰浴冷却该混合物。过滤固体，用冷水洗涤，得到4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(11.35g，60％)。MS(ES)m/z＝198[M]⁺。

手性分离(Chiralpak AS，含0.2％二甲基乙胺的乙醇)得到(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为对映体2(4.20g，＞99％ee)。MS(ES)m/z＝198[M]⁺。

制备14

4-氯-8-(2，4-二甲氧基苄基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

合并3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯(0.71g，1.98mmol)、二异丙基乙胺(0.38mL，1.1eq)、2，4-二甲氧基苄胺(0.32mL，1.05eq)和二甲基甲酰胺(6mL)。在50℃加热过夜。使其冷却至室温。用水稀释，用甲基叔丁基醚萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物和3-(4-氯-6-(2，4-二甲氧基苄基氨基)嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯的混合物，为油状物。合并粗混合物(0.78g)、二异丙基乙胺(0.63mL)和乙醇(7.8mL)。回流加热4小时。使其冷却至室温。过滤，用乙醇冲洗，得到标题化合物，为白色固体(0.43g，55％)。

制备15

5，5，5-三氟戊醛

合并3，3，3-三乙酰氧基-3-碘四氯苯酞(17.91g，1.2eq)和二氯甲烷(95mL)。在氮气气氛中滴加在二氯甲烷(238mL)中的5，5，5-三氟-1-戊醇(5.00g，35.18mmol)。4小时后，使该反应混合物通过Celite

真空浓缩滤液；与50mL二氯甲烷合并，用1∶110％硫代硫酸钠∶氢氧化钠水溶液(1N)洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为无色油状物(2.13g，43％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.61(s，1H)，2.50(m，2H)，2.21(m，2H)，1.66(m，2H)。

制备16

5，5，5-三氟-2-氧代戊醛

合并5，5，5-三氟戊醛(2.01g，14.35mmol)、1，4-二噁烷(10mL)、二氧化硒(1.62g，1.0eq)、水(0.51mL)和乙酸(0.69mL)。在90℃加热该混合物，搅拌过夜。将该反应混合物冷却至室温。过滤，用二噁烷洗涤固体。合并滤液和洗涤液，得到标题化合物(2.21g，100％)。GCMS m/z＝154。

基本上如对5，5，5-三氟-2-氧代戊醛所述制备下列化合物：

制备	化合物名称	MS(ES)m/z[M]⁺或[M+18]⁺
			17	2-环丁基-2-氧代乙醛	112
18	2-氧代戊醛	119
			19	4-甲氧基-2-氧代丁醛	117
20	4-甲氧基-3，3-二甲基-2-氧代丁醛	145
			21	4-甲基-2-氧代戊醛	115

制备22

1-甲基环丁烷甲酸

在0℃将2.5M正丁基锂的己烷(281.91mL，2.4eq)溶液加入到二异丙基胺(99.70mL，2.4eq)在四氢呋喃(900mL)中的溶液中。搅拌15分钟，然后滴加环丁酸(28.65mL，293.66mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液，维持温度低于5℃。将该混合物在5℃搅拌5分钟。滴加碘甲烷(18.47mL，1.0eq)。2天后，将该混合物冷却至0℃，用10％盐酸水溶液酸化。用醚萃取水相。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到黄色油状物。通过硅胶色谱法纯化，用5％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到标题化合物，为无色油状物(15.77g，47％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ11.84(bs，1H)，2.47(m，2H)，1.86(m，4H)，1.42(s，3H)。

制备23

1-(1-甲基环丁基)乙酮

在0℃在2小时内将1.6M甲基锂的乙醚溶液(176.15mL，2.0eq)滴加到1-甲基环丁烷甲酸(15.77g，138.16mmol)在乙醚(500mL)中的溶液中。将该混合物温至室温，搅拌5小时。将该混合物倾入冰冷3M盐酸水溶液。用饱和碳酸氢钠水溶液、然后用氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为无色油状物(11.70g，76％收率)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃-d3)：δ2.38(m，2H)，1.90(m，2H)，1.70(m，2H)，1.38(s，3H)，1.10(s，3H)。

基本上如对1-(1-甲基环丁基)乙酮所述制备下列化合物：

制备25

1-(四氢-吡喃-4-基)-乙酮

在二甲基甲酰胺(861mL)中加入丁酸，3-氧代-，甲酯(18.60mL，172.20mmol)、双(2-氯乙基)醚(20.20mL，1.0eq)、碳酸钾(52.42g，2.2eq)和碘化钠(25.88g，1.0eq)。将该反应混合物在80℃加热过夜。冷却至室温。再加入碳酸钾(23.78g)和碘化钠(25.88g)。将该反应混合物在80℃加热2小时，然后将该混合物冷却至室温。通过Celite过滤，用乙酸乙酯洗涤。用水和盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到4-乙酰基四氢-2H-吡喃-4-甲酸甲酯(23.06g)。

合并4-乙酰基四氢-2H-吡喃-4-甲酸甲酯(23.06g，123.84mmol)与异丙醇(124mL)和水(124mL)。加入硫酸(33.00mL，5.0eq)。将该反应混合物在100℃加热2夜。冷却，将该反应混合物缓慢加入到碳酸氢钠(136g)在水(1L)中的混合物中。用二氯甲烷萃取。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-25％乙酸乙酯的己烷溶液-50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到标题化合物(7.39g，34％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.79(m，2H)，3.27(m，2H)，2.54(m，1H)，2.05(s，3H)，1.66(m，2H)，1.38(m，2H)。

制备26

4-(4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

合并二氧化硒(10.45g，94.15mmol)、1，4-二噁烷(60mL)、乙酸(5mL)和水(5mL)。在氮气气氛中加热至80℃，然后缓慢滴加4，4，4-三氟丁-2-酮(9.01mL，1.0eq)。在90℃、在氮气气氛中加热12小时，然后在氮气气氛中冷却至室温。过滤该反应混合物，得到橙-红色滤液。向单独的烧瓶中加入在甲醇(150mL)和氢氧化铵(117.84mL，10.0eq)中的4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(20.08g，1.0eq)。在氮气气氛中冷却至0℃。通过加液漏斗滴加滤液。温至室温，在氮气气氛中搅拌过夜。真空浓缩至干。加入水，用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-4∶1己烷∶乙酸乙酯-2∶1己烷∶乙酸乙酯-1∶1己烷∶乙酸乙酯-1∶2己烷∶乙酸乙酯-乙酸乙酯洗脱，得到标题化合物，为淡棕色固体(8.06g，26％)。MS(ES)m/z＝334[M]⁺。

基本上如对4-(4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯所述制备下列化合物：

制备35

4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

合并二氧化硒(5.72g，51.54mmol)、1，4-二噁烷(52mL)、乙酸(2.4mL，0.81eq)、水(2.4mL)和1-(四氢-吡喃-4-基)-乙酮(6.28g，1.0eq)。在90℃搅拌过夜。冷却，过滤，然后用1，4-二噁烷洗涤。在0℃将该滤液加入到4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(10.47g，1.0eq)、甲醇(78mL)和30％氢氧化铵水溶液(30.8mL)的溶液中。将该混合物温至室温，搅拌过夜。真空浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠水溶液。分离各层。再用9∶1二氯甲烷∶异丙醇萃取水层。

合并二氧化硒(0.91g，8.17mmol)、1，4-二噁烷(8.3mL)、乙酸(0.4mL，0.81eq)、水(0.41mL)和1-(四氢-吡喃-4-基)-乙酮(1.00g，1.0eq)。在90℃搅拌过夜。冷却，过滤，然后用1，4-二噁烷洗涤。在0℃将该滤液加入到4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.66g，1.0eq)、甲醇(12.4mL)和30％氢氧化铵水溶液(4.9mL)的溶液中。将该混合物温至室温，搅拌过夜。真空浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠水溶液。分离各层。再用9∶1二氯甲烷∶异丙醇萃取水层。

用无水硫酸钠干燥从两次反应合并的有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-乙酸乙酯-5％甲醇的乙酸乙酯溶液-10％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到标题化合物(6.68g，35％)。MS(ES)m/z＝336[M]⁺。

制备36

N-甲基-N-(亚甲基氨基)甲胺

合并二甲基肼(10.63mL，139.77mmol)和多聚甲醛(4.20g，0.33eq)。将该反应体系搅拌1小时。加入庚烷(20mL)和硫酸钠(20g)。搅拌5分钟，然后过滤出硫酸钠。用短路径蒸馏器蒸馏滤液，采集标题化合物，为75％w/w含有庚烷的溶液(10.3g，77％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.10(m，2H)，2.80(s，6H)。

制备37

4-(4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

将N-甲基-N-(亚甲基氨基)甲胺(1.30g，18.03mmol)加入到氯仿(100mL)中，然后加入2，6-卢剔啶(3.2mL，1.5eq)。将该反应混合物冷却至0℃，在1分钟内加入三氟乙酐(3.9mL，1.5eq)。使反应在0℃搅拌10分钟。依次用0.5M HCl水溶液、水和0.1M碳酸钠水溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到粗(E)-3-(二甲基亚肼基)-1，1，1-三氟-丙-2-酮(1.80g)。

在乙酸(8mL)和乙酸铵(3.0g)中加入部分中间体(0.21g，1.25mmol)和4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.33g，1.24eq)。在80℃加热12小时，然后将该混合物冷却至室温。用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。搅拌10分钟，然后用二氯甲烷萃取2次。真空浓缩有机层，通过硅胶色谱法纯化，得到标题化合物(0.19g，28％)。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.40(s，1H)，4.15(m，2H)，2.90(m，3H)，1.90(m，2H)，1.65(m，2H)，1.40(s，9H)。

制备37(可选)

4-(4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在30℃将乙酸钠(360.8g，2.0eq)加入到水(3.54L)中。滴加1，1-二溴-3，3，3-三氟丙酮(653.01g，1.10mol)。将该混合物在90℃在氮气气氛中加热1小时。在30℃在另一烧瓶中将4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(470.00g，2.0eq)加入到甲醇(10L)中。将28％氢氧化铵水溶液(2.53L，8.18eq)加入到甲醇溶液中。冷却第一种混合物至30℃，在45分钟内滴加到甲醇溶液中。在氮气气氛中搅拌过夜。从反应混合物中除去溶剂。加入水(2L)和二氯甲烷(6L)，在25℃搅拌15分钟。用二氯甲烷将水层萃取3次(1L x3)。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥，真空浓缩。加入5L 2％乙酸乙酯的己烷溶液，在30℃搅拌30分钟。过滤固体，用己烷洗涤，真空浓缩，得到标题化合物，为白色固体(618.0g，88％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ10.5(s，1H)，7.4(s，1H)，4.18(s，2H)，2.98(m，1H)，2.80(m，2H)，2.01(m，2H)，1.71(m，2H)，1.45(s，9H)。

基本上如对4-(4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯所述制备下列化合物：

制备	化合物名称	MS(ES)m/z[M]⁺
			38	4-(4-叔丁基-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯	308

制备39

4-(4-氰基-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

合并4-(4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.50g，4.70mmol)和氢氧化铵(90mL)。将该反应混合物在60℃加热2天。冷却至室温，然后通过布氏漏斗过滤。用水和己烷洗涤固体，得到标题化合物，为白色固体(1.08g，83％)。MS(ES)m/z＝221[M]⁺。

制备40

4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

合并氢氧化铵(150mL)、4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(29.82g，139.81mmol)和甲醇(600mL)。在氮气气氛中加入乙二醛(16.10mL，1.0eq)(40％的水溶液)。搅拌过夜。然后真空浓缩以除去甲醇。用水稀释，然后用二氯甲烷萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物(33.30g，95％)。MS(ES)m/z＝252[M]⁺。

基本上如对4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯所述制备下列化合物：

制备48和49

4-(4，5-二氯-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

和

4-(4-氯-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在二氯乙烷(200mL)中加入4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.00g，23.87mmol)。加入N-氯琥珀酰亚胺(3.19g，1.0eq)。在室温在氮气气氛中搅拌14小时。真空浓缩该反应混合物。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-9∶1己烷∶乙酸乙酯-4∶1己烷∶乙酸乙酯-2∶1己烷∶乙酸乙酯-1∶1己烷∶乙酸乙酯洗脱，得到两个主要的斑点。真空浓缩包含较高R_f斑点的级分，得到4-(4，5-二氯-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.25g，29％)。MS(ES)m/z＝321[M]⁺。真空浓缩包含较低斑点的级分。将得到的固体搅拌入乙醚/氯仿成为淤浆，然后过滤。真空浓缩滤液，得到4-(4-氯-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.16g，17％)。MS(ES)m/z＝286[M]⁺。

制备50

4-(4-异丁基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在二甲亚砜(30mL)中合并4-(4-异丁基-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.50g，4.88mmol)和氢氧化钾(1.65g，6.0eq)(新粉末化的)。将该反应混合物在氮气气氛中加热至45℃。5分钟后，加入1-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(1.08g，1.3eq)。2小时后终止加热。加入水，用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为黄色油状物(2.11g，100％)。MS(ES)m/z＝405[M]⁺。

基本上如对4-(4-异丁基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯所述制备下列化合物(注意1：可以得到4-和5-取代的烷基化异构体的混合物。在一些情况中，通过正向色谱法纯化可以得到期望的异构体。注意2：试剂2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃或2-(2-氯乙氧基)四氢-2H-吡喃的应用可以得到2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基化合物)：

制备78

4-(1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在二甲亚砜(30mL)中合并4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(5.84g，17.40mmol)和氢氧化钾(5.91g，6.0eq)(新粉末化的)。将该反应混合物在氮气气氛中加热至45℃。15分钟后，加入2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(2.90mL，1.1eq)。持续加热该反应体系过夜。加入水，用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷至50％乙酸乙酯的己烷溶液至乙酸乙酯至10％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到标题化合物，为浓稠黄色油状物(6.94g，86％)。MS(ES)m/z＝464[M]⁺。

制备79

4-(4-(三氟甲基)-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯琥珀酸盐

将1-(2-氯-乙基)-吡啶鎓氯化物(73.50g，1.15eq)加入到4-(4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(120.00g，375.79mmol)和氢氧化钾(54.82g，2.60eq)在二甲亚砜(1.1L)中的混合物中。将得到的混悬液在50℃搅拌过夜。将该反应混合物冷却至室温，加入冰/水(1.50l)。用乙酸乙酯(3x500mL)萃取。用水(2x 300mL)和饱和氯化钠水溶液(300mL)洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法纯化，用5％-15％异丙醇的二氯甲烷溶液洗脱，得到4-(4-(三氟甲基)-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(122.00g，78％)和4-(5-(三氟甲基)-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(14.00g，9％)的混合物。加入异丙醇(470mL)，加热至70℃。加入在75℃预加热的丁二酸(35g，1eq)在异丙醇(350mL)中的溶液。停止加热，在室温搅拌过夜。过滤固体，用异丙醇(300mL)洗涤。将该固体混悬于异丙醇(500mL)，搅拌15分钟。过滤，在异丙醇(500mL)中将该固体搅拌15分钟1次以上，然后过滤，得到标题化合物(124.00g，82％)，为白色固体。MS(ES)m/z＝417[M]⁺。

制备80

4-(4，5-二溴-1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在二氯甲烷(1750mL)中加入4-(1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(121.70g，320.69mmol)。加入N-溴琥珀酰亚胺(114.15g，2.0eq)。在室温在氮气气氛中搅拌。90分钟后停止反应。用水稀释该反应混合物，用二氯甲烷萃取。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷至1∶1己烷∶乙酸乙酯至乙酸乙酯洗脱，得到标题化合物，为淡橙色粘性油状物(125.40g，73％)。MS(ES)m/z＝538[M]⁺。

制备81

4-(4-溴-1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在四氢呋喃(1L)中加入4-(4，5-二溴-1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(46.00g 85.61mmol)。在氮气气氛中冷却至-78℃。在15分钟内滴加1.6M丁基锂的己烷(90.97mL，1.7eq)溶液。维持内部温度低于-65℃。65分钟后，加入异丙醇(50mL)。在2hr内温至室温。用饱和氯化铵水溶液稀释，然后用乙酸乙酯萃取3次。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物(43.00g，100％)。MS(ES)m/z＝460[M]⁺。

制备82

4-(4-环丙基-1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在甲苯(18mL)和水(0.9mL)中加入4-(4-溴-1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.82g，3.97mmol)、环丙基硼酸(0.44g，1.3eq)、三环己膦(0.11g，0.1eq)和磷酸钾(2.95g，3.5eq)。用氮气脱气5分钟。加入乙酸钯(0.045g，0.05eq)，在90℃加热过夜。12hrs后终止加热。用水稀释，然后用乙酸乙酯萃取3次。用无水硫酸镁干燥和真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用0-20-50％乙酸乙酯/己烷、然后用1-3-5-7％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到标题化合物(0.61g，37％)。MS(ES)m/z＝420[M]⁺。

制备83

2-(4-乙基-2-(哌啶-4-基)-1H-咪唑-1-基)乙醇二盐酸盐

合并4-(4-乙基-1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.70g，11.53mmol)、二氯甲烷(100mL)和甲醇(50mL)。缓慢加入氯化氢(20mL)(4M的二噁烷溶液)。在氮气气氛中搅拌过夜。真空浓缩，得到标题化合物(3.40g，100％)。MS(ES)m/z＝224[M]⁺。

基本上如对2-(4-乙基-2-(哌啶-4-基)-1H-咪唑-1-基)乙醇二盐酸盐所述制备下列化合物：

制备91

4-(4-溴-1-(2-羟基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

合并4-(4-溴-1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(5.00g，10.91mmol)、四氢呋喃(150mL)和1M盐酸水溶液(50mL)；在室温搅拌过夜。用乙酸乙酯稀释。用过量1M氢氧化钠水溶液、然后用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸镁洗涤有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为黄色泡沫(3.84g，94％)。MS(ES)m/z＝376[M]⁺。

基本上如对4-(4-溴-1-(2-羟基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯所述制备下列化合物：

制备102

4-(1-(2-羟基乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

合并4-(1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.88g，14.84mmol)、四氢呋喃(136mL)和1N盐酸水溶液(25mL)。将该反应体系在室温搅拌过夜。用乙酸乙酯稀释，用饱和氯化钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。用9∶1二氯甲烷∶异丙醇萃取合并的水层。用无水硫酸钠干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-50％乙酸乙酯的己烷溶液-乙酸乙酯-10％甲醇的乙酸乙酯溶液-10％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱，得到标题化合物，为白色固体(4.48g，79％)。MS(ES)m/z＝380[M]⁺。

制备103

4-(4-乙烯基-1-(2-羟基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在1，4-二噁烷(400mL)和水(200mL)中加入4-(4-溴-1-(2-羟基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(42.00g，112.22mmol)。磷酸三钾N-水合物(47.64g，2.0eq)和二环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]正膦(5.76g，0.12eq)。用氮气脱气5分钟。加入4，4，5，5-四甲基-2-乙烯基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷(30.25mL，1.5eq)，然后再脱气10分钟。加入乙酸钯(1.26g，0.05eq)，在120℃回流过夜。12小时后终止加热。通过Celite

过滤。用二氯甲烷和甲醇洗涤。真空浓缩至干。用饱和氯化钠水溶液稀释，然后用乙酸乙酯萃取3次。用无水硫酸钠干燥，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用50-90％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到标题化合物，为黄色泡沫(20.50g，56％)。MS(ES)m/z＝322[M]⁺。

制备104

4-(4-乙基-1-(2-羟基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在乙醇(50mL)中加入10％钯/碳(2.10g)。然后加入4-(1-(2-羟基乙基)-4-乙烯基-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(20.00g，62.22mmol)在乙醇(200mL)中的溶液。通过氮气和真空循环3次，然后氢气和真空循环3次。在室温在1个氢气大气压下搅拌。2小时后，通过Celite

过滤。用甲醇洗涤。真空浓缩滤液，得到淡黄色固体，为标题化合物(20.00g，99％)。MS(ES)m/z＝324[M]⁺。

制备105

5-(4-(4-乙基-1-(2-羟基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-3-(2，2，2-三氟乙基)-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2(1H)-酮

将5-氯-3-(2，2，2-三氟乙基)-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2(1H)-酮(0.28g，1.05mmol)、2-(4-乙基-2-(哌啶-4-基)-1H-咪唑-1-基)乙醇二盐酸盐(0.38g，1.3eq)、甲醇(15mL)和二异丙基乙胺(0.91mL，5.0eq)加入到20mL微波小瓶中。密封试管，在微波反应器中加热至150℃持续1小时。通过硅胶过滤，用10％氨-甲醇/二氯甲烷洗脱。真空浓缩滤液。通过硅胶色谱法纯化，用3∶1乙酸乙酯/甲醇洗脱，得到标题化合物，为黄色泡沫(0.67g，70％)。MS(ES)m/z＝454[M]⁺。

基本上如对5-(4-(4-乙基-1-(2-羟基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-3-(2，2，2-三氟乙基)-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2(1H)-酮所述制备下列化合物：

制备116

4-(4-溴-1-(2-(甲基磺酰基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

合并4-(4-溴-1-(2-羟基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.84g，10.26mmol)、二氯甲烷(60mL)和三乙胺(4.29mL，3.0eq)。放入氮气气氛中，冷却至0℃。滴加甲磺酰氯(0.95mL，1.2eq)。15分钟后，用饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物(4.45g，96％)。MS(ES)m/z＝452[M]⁺。

基本上如对4-(4-溴-1-(2-(甲基磺酰基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯所述制备下列化合物：

制备139

4-(1-(2-(甲基磺酰基氧基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在二氯甲烷(72mL)中合并4-(1-(2-羟基乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.40g，11.60mmol)和三乙胺(4.9mL，3.0eq)。冷却至0℃，加入甲磺酰氯(1.1mL，1.2eq)。1小时后，再用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。分离各层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为淡黄色固体(5.05g，95％)。MS(ES)m/z＝458[M]⁺。

制备140

4-(4-溴-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在氮气气氛中合并4-(4-溴-1-(2-(甲基磺酰基氧基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.45g，9.84mmol)、二甲基甲酰胺(25mL)和吡咯烷(2.46mL，3.0eq)。将该反应混合物在50℃加热过夜，然后冷却至室温。用乙酸乙酯稀释。用水、然后用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到标题化合物(4.12g，98％)。MS(ES)m/z＝427[M]⁺。

基本上如对4-(4-溴-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯所述制备下列化合物：

制备164

4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

合并4-(1-(2-(甲基磺酰基氧基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.02g，4.42mmol)、吡咯烷(1.1mL，3.0eq)和二甲基甲酰胺(19mL)。将该反应混合物加热至50℃过夜。用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。分离各层。用水洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-乙酸乙酯-10％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱，得到标题化合物，为黄色油状物(1.79g，93％)。MS(ES)m/z＝433[M]⁺。

制备165

4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-乙烯基-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯

在1，4-二噁烷(4mL)和水(1mL)中加入4-(4-溴-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.26g，0.60mmol)。加入磷酸三钾N-水合物(0.26g，2.0eq)和二环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]正膦(0.036g，0.15eq)。加入4，4，5，5-四甲基-2-乙烯基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷(0.22mL，2.05eq)，脱气10分钟。加入双(二亚苄基丙酮)钯(0)(0.03g，0.06eq)，在150℃回流1小时。通过Celite

过滤。用二氯甲烷洗涤。真空浓缩滤液至干。通过硅胶色谱法纯化，用25％甲醇/乙酸乙酯洗脱，得到标题化合物，为黄色泡沫(0.14g，38％)。MS(ES)m/z＝375[M]⁺。

制备166

4-(4-溴-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三盐酸盐

在氮气气氛中合并4-(4-溴-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.80g，1.87mmol)、二氯甲烷(20mL)、甲醇(8mL)和4M盐酸的二噁烷溶液(9.36mL，20.0eq)，在室温搅拌。1.5小时后，真空浓缩，得到标题化合物(0.82g，100％)。MS(ES)m/z＝327[M]⁺。

基本上如对4-(4-溴-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三盐酸盐所述制备下列化合物(在一些情况中基本的后处理得到游离碱)：

制备201

4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶

合并4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.74g，4.03mmol)、二氯甲烷(53mL)和甲醇(21mL)。加入4M盐酸的1，4-二噁烷溶液(10.4mL，10.3eq)。1小时后，真空浓缩。真空干燥得到的残余物，得到标题化合物，为白色固体(1.67g，94％)。MS(ES)m/z＝333[M]⁺。

制备202

4-(4-三氟甲基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶

在室温将在甲醇(720mL)中的4-(4-(三氟甲基)-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯琥珀酸盐(120g，224.48mmol)加入到37％盐酸水溶液(76.08mL，4eq)中。在50℃搅拌该溶液。浓缩该反应混合物。加入500mL水，用甲基叔丁基醚(200mL)洗涤。在0℃用6M氢氧化钠水溶液碱化该水溶液。用乙酸乙酯(4x 200mL)萃取。用无水硫酸钠干燥有机层，真空浓缩，得到标题化合物(68g，96％)。MS(ES)m/z＝317[M]⁺。

实施例1

(R)-4-(4-(1-(2-(叔丁基氨基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

加入在二甲基甲酰胺(5mL)中的(R)-2-(2-(1-(5-甲基-7-氧代-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-1-基)乙基甲磺酸酯(0.50g，0.99mmol)、叔丁胺(0.52mL，7.1eq)和三乙胺(0.69mL，5.0eq)。在密封试管内加热至50℃持续48小时。用饱和氯化钠水溶液稀释该溶液。将该混合物加入到乙酸乙酯中。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用20％乙醇/丙酮洗脱，得到标题化合物(0.27g，55％)。MS(ES)m/z＝480[M]⁺。

基本上如对(R)-4-(4-(1-(2-(叔丁基氨基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮所述制备下列化合物(实施例3的可替代选择纯化；浓缩该反应混合物，从异丙醇中过滤，得到期望的产物，为甲磺酸盐)：

实施例19

(R)-4-(4-(4-异丁基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

在微波试管中加入(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(0.23g，1.18mmol)、4-(4-异丁基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三盐酸盐(0.64g，1.3eq)、N-甲基吡咯烷酮(10mL)和二异丙基乙胺(1.65mL，8.0eq)。用螺纹帽密封。在微波反应器中在200℃加热40分钟。用水稀释该反应混合物，用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过正向色谱法纯化，用己烷-乙酸乙酯-5％甲醇/乙酸乙酯-3％-5％-7％-10％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到标题化合物(0.13g，23％)。MS(ES)m/z＝466[M]⁺。

基本上如对(R)-4-(4-(4-异丁基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮所述制备下列化合物(或纯化；用4M盐酸的1，4-二噁烷溶液处理游离碱，然后真空浓缩，得到二盐酸盐。第二种可替代选择进一步用酸性反相色谱法纯化了游离碱；真空浓缩澄清级分，得到二盐酸盐或三氟乙酸盐)：

实施例73

(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

将4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三盐酸盐(300g，1.0当量)、(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(146.2g，1.0当量)和正丙醇(3.0L)加入到12-L反应烧瓶中。搅拌该反应混合物，在10分钟内加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(394.3g，3.5当量)。将该反应体系加热至90℃8小时，在12小时内冷却至室温。用乙酸正丁酯替代正丙醇至总体积达到3-L，残留正丙醇含量为11％(w/w)。将该有机溶液加热至50-60℃，用盐水(2.25L)洗涤。用乙酸正丁酯(1.5L)反萃取水相，合并有机层。在50-60℃用水(2x 450mL)洗涤合并的有机层。分离有机层，加入活性炭(75g，0.25当量)，在50-60℃搅拌30min。过滤淤浆，用乙酸正丁酯(1.5L)冲洗固体。用水(1L)洗涤，分离有机相，共沸干燥有机层以除去水。在50-60℃加入庚烷(3.0L)，冷却至40℃，加入晶种。将该淤浆在～12h内冷却至室温。冷却至0-5℃，过滤淤浆，用庚烷(2x900mL)洗涤。真空干燥，分离(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为白色固体(365.3g，64％)。MS(ES)m/z＝494[M]⁺。

实施例74和75

4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

和

(R)-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

在密封容器内合并4-氯-8-(2，4-二甲氧基苄基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(0.65g，1.62mmol)、4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三盐酸盐(0.76g，1.1eq)、N-甲基吡咯烷酮(20mL)和二异丙基乙胺(1.69mL，6.0eq)。在220℃加热30分钟。用水稀释该反应混合物，用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过正相色谱法纯化，用1-10％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到粗8-(2，4-二甲氧基苄基)-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(粗品)。

在微波试管中合并粗的被保护的中间体(1.10g，理论值)和三氟乙酸(5.00mL，41eq)。密封试管，在微波反应器中在100℃加热10分钟。真空浓缩。用水稀释该反应混合物，用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过正相色谱法纯化，用5-20％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为外消旋物(0.70g，82％)。MS(ES)m/z＝532[M]⁺。

手性分离(Chiralpak AD-H，30％乙醇/70％CO₂w/0.2％异丙基胺)得到对映体1(＞99％ee)；和(R)-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为对映体2(＞99％ee)。两种化合物的MS(ES)m/z＝532[M]⁺。

实施例76和77

5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

和

(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

在微波试管中加入4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(0.22g，1.11mmol)、4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三盐酸盐(0.57g，1.2eq)、N-甲基吡咯烷酮(10mL)和二异丙基乙胺(1.16mL，6.0eq)。密封试管，在微波反应器中在200℃加热30分钟。用水稀释该反应混合物，用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过正向色谱法纯化，用1-10％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为外消旋物(0.19g，36％)。MS(ES)m/z＝478[M]⁺。手性分离(ChiralpakAD-H，30％乙醇/70％CO₂w/0.2％异丙基胺)得到对映体1(＞99％ee)；和(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为对映体2(＞99％ee)。两种化合物的MS(ES)m/z＝478[M]⁺。

实施例78

在N-甲基吡咯烷酮(86mL)中加入(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(28.30g，143.20mmol)、4-(4-三氟甲基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶(49.83g，1.10eq)和三乙胺(43.47g，3.0eq)。将该反应混合物加热至130℃。2小时后将该反应混合物冷却至室温。将该反应混合物在搅拌的同时倾倒在冰/水(500mL)上。用乙酸乙酯(4x200mL)萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥，真空浓缩。将固体混悬于己烷，搅拌30分钟。过滤，真空干燥。加入75％甲基叔丁基醚的己烷溶液(800mL)，加热至回流。将该混合物冷却至室温。过滤，用75％甲基叔丁基醚的己烷溶液(200mL)洗涤，在40℃真空干燥，得到标题化合物(48.00g，70％)。MS(ES)m/z＝478[M]⁺。

实施例79

(R)-4-(4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮盐酸盐

在室温将4M盐酸的二噁烷(28.57μL，1.0eq)溶液加入到(R)-4-(4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(50.00mg，0.11mmol)在二氯甲烷(1mL)中的溶液中，搅拌15分钟。真空浓缩，得到标题化合物(54.00mg，100％)。MS(ES)m/z＝438[M]⁺。

基本上如对(R)-4-(4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮盐酸盐所述制备下列化合物：

实施例83

(R)-4-(4-(1-(2-(叔丁基氨基)乙基)-4-乙基-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

在氮气气氛中合并4-(1-(2-(叔丁基氨基)乙基)-4-乙基-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(440.00mg，1.16mmol)、二氯甲烷(20mL)、甲醇(8mL)和4M盐酸的二噁烷(3.00mL，12.0eq)溶液，在室温搅拌过夜。真空浓缩，得到300mg N-[2-[4-乙基-2-(4-哌啶基)咪唑-1-基]乙基]-2-甲基-丙-2-胺。在N-甲基吡咯烷酮(10mL)中合并这种胺与(R)-4-氯-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(300.00mg，1.0eq)，加入二异丙基乙胺(1.66mL，8.0eq)。用螺纹帽密封。在微波反应器中在200℃加热40分钟。用水稀释该反应混合物，用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-乙酸乙酯-5％甲醇/乙酸乙酯-3％-5％-7％-10％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到标题化合物(0.08g，14％)。MS(ES)m/z＝494[M]⁺。

基本上如对(R)-4-(4-(1-(2-(叔丁基氨基)乙基)-4-乙基-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮所述制备下列化合物：

实施例92

a.3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)丁酸甲酯：

向烧瓶中加入无水甲醇(50mL)，然后加入甲醇钠(5.4g，0.1mol，0.3当量)，将该混合物加热至65-70℃。滴加加入丙二酸二甲酯(44g，0.33mol，1.0当量)，将该混合物在65-70℃搅拌10-30min。在1-2h内滴加加入巴豆酸乙酯(33.4g，0.33mol，1.0当量)，将该混合物在65-70℃搅拌1-1.5h。将该反应混合物冷却至-20℃--10℃。在单独的烧瓶中，在无水甲醇(180mL)中溶解甲醇钠(54g，1.0mol，3.0当量)，将该混合物搅拌20-30min。将该混合物冷却至-20℃--10℃，加入醋酸甲脒(40g，0.4mol，1.2当量)。在1h期限内将该溶液滴加到第一种溶液中，同时维持温度在-20℃--10℃。搅拌1-2h，然后将该混合物在3-4h内温至20-25℃。将该混合物搅拌2-8h，然后加入浓HCl(110-130g)水(330g-390g)溶液，同时保持反应温度＜10℃。将该混悬液在＜10℃搅拌30-60min，过滤。用水(70mL)洗涤滤饼，将滤饼与甲醇(56g)一起搅拌呈淤浆。过滤，收集3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)丁酸甲酯(55.6g，72％)。MS(ES)m/z＝213[M]⁺。

b.3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)丁酸甲酯：

将3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)丁酸甲酯(59.4g，0.28mol，1.0当量)溶于甲苯(600mL)，将该溶液搅拌10-20min，然后在50-60℃真空浓缩，以共沸除去水。将该混合物冷却至20-30℃，依次加入磷酰氯(91.4g，2.13当量)和N，N’-二乙基苯胺(45.7g，1.1当量)，同时维持温度＜40℃。将该反应混合物搅拌10-30min，然后温至80-85℃，搅拌18-20h。将该混合物冷却至20-30℃，在30-40℃加入溶于水(500-600g)的Na₂HPO₄·12H₂O(60g，0.17mol)溶液。将该溶液搅拌30-60分钟，使各层分离。用甲基叔丁基醚(220-300g)萃取水层，合并有机层。用水(500-600g)洗涤有机相，在50-60℃真空浓缩有机相至～2.5-3溶剂体积。加入异丙醇(140-160g)，再浓缩该溶液。使用IPA溶液用于下一步(3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)丁酸甲酯的原位收率是85％)。MS(ES)m/z＝249[M]⁺。

c.4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

共沸干燥如(b)所制备的溶液，该溶液包含3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)丁酸甲酯(500g，2mol)，加入到氨气(408g)在异丙醇(6L)中的溶液。将该混合物加热至58-62℃，搅拌40-45h。将该混合物冷却至20-25℃，浓缩至该混合物的pH≤9。加入水(3.75L)，将该混悬液冷却至0-10℃，搅拌2-3h。过滤该混悬液，用冷异丙醇(320mL)洗涤滤饼。真空干燥产物，得到4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(255g，64％)。MS(ES)m/z＝198[M]⁺。

d.(R)-叔丁基4-氯-5-甲基-7-氧代-6，7-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-8(5H)-甲酸酯：

将4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(233.6g，1.18mol)、4-(二甲基氨基)吡啶(7.2g，0.05eq)和二氯甲烷(880mL)加入到反应器中，搅拌10-20min。在1.5-2h内加入碳酸叔丁氧羰基酯叔丁酯(284.1g，1.1eq)溶于二氯甲烷(200mL)的溶液。将该混合物在室温搅拌1.5-2h，加入庚烷(1100mL)。真空浓缩该混合物，以除去二氯甲烷至≤2wt％。将该混合物冷却至5-10℃，在该温度搅拌0.5-1h。过滤该混悬液，将湿滤饼与庚烷(200mL)一起搅拌成淤浆。过滤，真空干燥，得到外消旋化合物(341.8g，96％)。通过手性分离进行对映体拆分(Chiralpak AD，9∶1己烷(0.2％二甲基乙胺)：异丙醇)。合并采集的级分，真空浓缩该混合物。加入庚烷(1000mL)，将该溶液真空浓缩至～2体积。重复该过程至残留异丙醇水平＜1％(w/w)。将该混合物冷却至0-5℃，搅拌2-3h。过滤得到的混悬液，用冷庚烷(180-mL)洗涤滤饼。真空干燥滤饼，得到(R)-叔丁基4-氯-5-甲基-7-氧代-6，7-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-8(5H)-甲酸酯，为对映体1(165g，99.8％ee，92％收率)。MS(ES)m/z＝298[M]⁺。

e.(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

将(R)-叔丁基4-氯-5-甲基-7-氧代-6，7-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-8(5H)-甲酸酯(36g，1.0当量)加入到水(120mL)中，搅拌形成混悬液。在20-30℃滴加12N HCl(120g，10当量)，将该混合物搅拌6-8h。溶液逐步形成。将该溶液冷却至5-10℃，加入浓氢氧化铵(86.4g，2.4当量)，形成混悬液。将该混悬液搅拌2-3h，过滤。用冷水(36mL)洗涤滤饼，然后与冷异丙醇(28g)一起搅拌成淤浆。过滤该淤浆，真空干燥滤饼，得到(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(21g，87％)。MS(ES)m/z＝198[M]⁺。

f.1-(四氢-吡喃-4-基)-乙酮-方法A：

在15分钟过程中、在-20℃、在氮气气氛中将2M氯化异丙基镁的四氢呋喃溶液(520.22mL，3.0eq)加入到四氢-2H-吡喃-4-甲酸甲酯(46.30mL，346.81mmol)和N，O-二甲基羟基胺盐酸盐(52.44g，1.6eq)在四氢呋喃(2.43L)中的混合物中。30min后，在-20℃将饱和氯化铵水溶液(400mL)加入到该反应体系中。用甲基叔丁基醚(250mL x 3)萃取水溶液。用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸镁干燥，真空浓缩。加入二氯甲烷(500mL)，通过Celite过滤，真空浓缩。加入四氢呋喃(700mL)，然后在7℃在15分钟内滴加3M氯化甲基镁的四氢呋喃(231.21mL，2.0eq)溶液。40分钟后，将饱和氯化铵水溶液(250mL)加入到反应体系中。用甲基叔丁基醚(250mLx 2)萃取水溶液。用无水硫酸镁干燥，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用2∶1己烷∶乙酸乙酯-1∶1己烷∶乙酸乙酯洗脱，得到1-(四氢-吡喃-4-基)-乙酮(33.18g，75％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ3.98(m，2H)，3.42(m，2H)，2.52(m，1H)，2.15(s，3H)，1.74(m，4H)。

g.1-(四氢-吡喃-4-基)-乙酮-方法B：

将40％w/w氢氧化钠的水(264.5mL，1.15eq)溶液加入到四氢-2H-吡喃-4-甲酸甲酯(500g，3.47mol)在甲醇(2.26L)中的溶液中。在50℃搅拌7小时。蒸发溶剂，将残余物溶于水(2L)，用甲基-叔丁基醚(2x1.2L)洗涤。将35％盐酸水溶液加入到水层中(调整pH至4)，用甲基叔丁基醚(2x1.2L)萃取。用无水硫酸镁干燥，真空浓缩。当物质仍然包含水时，将固体溶于二氯甲烷，弃去水层。用无水硫酸钠干燥有机层，真空浓缩，得到四氢-2H-吡喃-4-甲酸(312.76g，69％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.21(br s，1H)，3.97(m，2H)，3.44(m，2H)，2.56(m，1H)，1.81(m，4H)。

在15分钟内分部分将1，1′-羰基二咪唑(333.41g，1.2eq)加入到四氢-2H-吡喃-4-甲酸(223g，1.71mol)在二氯甲烷(2.23L)中的溶液中。搅拌2小时。分部分加入N，O-二甲基羟基胺盐酸盐(183.86g，1.1eq)，搅拌3小时。用饱和氯化铵水溶液、然后用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。用无水硫酸镁干燥有机层，真空浓缩，得到N-甲氧基-N-甲基-四氢吡喃-4-甲酰胺(339g，114％)，为粗物质，照此用于下一步反应。¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ4.02(m，2H)，3.71(s，3H)，3.46(m，2H)，3.19(s，3H)，2.91(m，1H)，1.86(m，2H)，1.65(m，2H)。

在0℃在1小时内将3M溴化甲基镁在乙醚(1.14L，2.0eq)的溶液加入到N-甲氧基-N-甲基-四氢吡喃-4-甲酰胺(296g，1.71mol)在四氢呋喃(2.96L)中的溶液中。再搅拌2小时，然后将内含物倾入冰/水混合物。用甲基叔丁基醚萃取。用无水硫酸镁干燥有机层，真空浓缩，得到1-(四氢-吡喃-4-基)-乙酮(105g，48％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ3.98(m，2H)，3.42(m，2H)，2.52(m，1H)，2.15(s，3H)，1.74(m，4H)。h.4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

合并二氧化硒(181.80g，1.64mol)、1，4-二噁烷(630mL)、乙酸(31.5mL，0.67eq)和水(31.5mL)。加热至90℃，滴加1-(四氢-吡喃-4-基)-乙酮(105.0g，1.0eq)。在90℃搅拌过夜。冷却后，通过硅胶垫/Celite

过滤，用四氢呋喃(2.5L)洗涤。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩。将粗物质溶于甲醇(500mL)，在0℃加入到4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(174.72g，1.0eq)和乙酸铵(315.74g，5.0eq)在甲醇(1.45L)中的溶液中。搅拌过夜。通过硅胶/Celite

过滤，用乙酸乙酯和甲醇洗涤。真空浓缩滤液。用甲基叔丁基醚(400mL)和水(400mL)稀释，然后通过添加85％磷酸水溶液将pH调整至2。分离各层，用甲基叔丁基醚(200mL)洗涤有机相。用固体碳酸钠碱化得到的水相至pH 10，用乙酸乙酯(3x 200mL)萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。用无水硫酸镁干燥有机相，过滤，真空浓缩，得到4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(105.1g，38％)。MS(ES)m/z＝336[M]⁺。

i.4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

在二甲亚砜(500mL)中合并4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(101.10g，301.39mmol)和新近磨碎的氢氧化钾(50.73g，3.0eq)。搅拌15分钟，然后加入碘化钠(49.69g，1.1eq)。加入1-(2-氯-乙基)-吡啶鎓氯化物(66.64g，1.3eq)在二甲亚砜(1.01L)中的溶液，在室温搅拌4小时。将反应内含物倾入冰/水混合物(～1L)，用甲基叔丁基醚萃取。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过HPLC纯化(Chiralpak AD碱性，己烷/乙醇9∶1)，得到4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(82.0g，63％)。MS(ES)m/z＝433[M]⁺。

j.4-(1-(2-吡咯烷-1-基-乙基)-4-(四氢-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)-哌啶

将5M氯化氢的异丙醇溶液(112.7mL，5.0eq)加入到4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(132.0g，274.61mmol)在异丙醇(549mL)中的溶液中。将该反应混合物在50℃搅拌6小时。真空浓缩。用水(1L)稀释，用2M氢氧化钠水溶液将pH调整至12。用乙酸乙酯和二氯甲烷萃取。用无水硫酸镁干燥有机层，真空浓缩，得到4-(1-(2-吡咯烷-1-基-乙基)-4-(四氢-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)-哌啶(81.9g，90％)。MS(ES)m/z＝333[M]⁺。

k.(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

合并(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(53.55g，270.96mmol)、三乙胺(37.77mL，1.1eq)、4-(1-(2-吡咯烷-1-基-乙基)-4-(四氢-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)-哌啶(81.9g，1.0eq)和N-甲基吡咯烷酮(246mL)。在110℃搅拌过夜。将该反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯(400mL)和水(1200mL)稀释。用2M氢氧化钠水溶液将pH调整至10，分离各层。用乙酸乙酯(2x 200mL)洗涤有机相。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。将水(1L)加入到有机相中并用85％磷酸水溶液将pH调整至3。分离各层，用乙酸乙酯(2x 200mL)洗涤得到的酸性水相。用2M氢氧化钠水溶液将水相的pH调整至10。用乙酸乙酯(3x 200mL)萃取。用饱和氯化钠水溶液(250mL)洗涤有机相，用无水硫酸镁干燥，真空浓缩。通过HPLC纯化残余物(Chiralpak AD，70/30己烷/异丙醇w/0.2％二甲基乙胺)，得到最终化合物(51.0g，42％)。MS(ES)m/z＝494[M]⁺。

通过使用不同条件与相对的对映体比较测定(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮的手性纯度：

HPLC：Chiralpak AD-H(4.6x 150mm；5um)100％乙醇w/0.2％二甲基乙胺

SFC：Chiralpak AD-H(4.6x 100mm；5um)65/35CO₂/乙醇w/0.2％二甲基乙胺

在两种方法中，对映体百分比是99％(R)，1％(S)ee＝98％。

实施例93

a.2，2-二溴-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酮：

如下制备二异丙基氨基锂(LDA)：将二异丙基胺(316.8g，2.5当量)和甲基叔丁基醚(1.25L)加入到反应器中，将反应容器冷却至-10℃-0℃。加入正丁基锂的己烷(748g，2.2当量)溶液，同时维持温度-10℃-0℃。将该混合物搅拌30-60min。在单独的容器中，加入甲基叔丁基醚(1.8L)、二溴甲烷(471.6g，2.2当量)和四氢-2H-吡喃-4-甲酸甲酯(180g)，冷却至-90℃--70℃。缓慢加入LDA溶液，维持温度-90℃--70℃。30-90min后，将该反应混合物转入维持在0-10℃的1N HCl溶液(5.58kg)。在添加完成时，将该混合物温至15℃-25℃，在该温度搅拌15-20min。分离，弃去水层。用水(1.8L)洗涤有机层，直到水层达到pH 6-7为止，真空浓缩有机层至低于35℃的～2.2-2.5体积。加入正庚烷(720mL)，冷却至-10℃--5℃，搅拌1-2h。过滤，用冷庚烷(90mL)冲洗滤饼，真空干燥，得到2，2-二溴-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酮，为淡黄色固体(203.6g，55％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ5.87(s，1H)，4.02(m，2H)，3.48(m，2H)，3.34(m，1H)，1.86(m，4H)。

b.4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

在反应器中合并2，2-二溴-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙酮(100g，1.0当量)、4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(75g，1.0eq)、甲苯(800mL)。在20-30℃搅拌15min，加入25-28％氢氧化铵的水(800mL，8.0当量)溶液，在68℃-72℃加热16-20小时。将该反应混合物冷却至20℃-30℃，加入甲基叔丁基醚(300mL)。在20℃-30℃搅拌15-20min，分离水层。用水(500mL)洗涤有机层至pH≤8。真空浓缩有机层至2体积，加入甲苯(200mL)。再浓缩至～2体积，通过卡尔·费歇尔滴定测定含水量(wt％水≤0.1％)。将温度调整至20℃-30℃，加入异丙醇(50mL)和庚烷(600mL)。在20℃-30℃搅拌4-16h，冷却至0℃-5℃，再搅拌2-5h。过滤，真空干燥，得到4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(40g，35％)。MS(ES)m/z＝336[M]⁺。

c.4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三盐酸盐：

将脱气的二甲亚砜(750mL)加入到烧瓶中，然后加入4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(150g，1.0当量)、碘化钠(87.2g，1.3当量)、氢氧化钾(15g，0.6当量)和叔丁醇钾(95.3g，1.9当量)，同时维持温度20-35℃。将该混合物加热至30-35℃。在单独的反应器中，将1-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(83.7g，1.1当量)溶于二甲亚砜(750mL)，在30-35℃转入第一个反应器。调整温度至40-45℃，搅拌2-3h。将该混合物冷却至20-30℃，加入甲基叔丁基醚(3L)。用水(1.5L)洗涤有机相，用甲基叔丁基醚(3L)反萃取水层。合并有机层，用水(1.5L)洗涤，分离，在40-45℃用活性炭(7.5g，0.05当量))处理有机层1-2h。过滤出活性炭，用甲基叔丁基醚(150mL洗涤。真空浓缩至3-v体积，加入甲醇(1.05L)。再浓缩至3-4体积。加入2N盐酸的甲醇(1.1L，5.0当量)溶液，在50℃-60℃加热2h。真空浓缩至3-4体积，在50℃-60℃温度滴加乙酸乙酯(1.35L)，在该温度搅拌1-2h。将该反应混合物冷却至20℃-30℃，在该温度搅拌1-2h。过滤，用3∶1乙酸乙酯∶MeOH(300mL)冲洗滤饼，得到4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三盐酸盐，为单一区域异构体(130g，58％)。MS(ES)m/z＝333[M]⁺。

d.(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

根据实施例92的步骤k制备。

实施例94

a.(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

根据实施例92的步骤a-e制备。

b.4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

将28％氢氧化铵的水(372.66mL，5.0eq)溶液加入到4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(127g，595.47mmol)在甲醇(508mL)中的溶液中，搅拌15分钟。滴加乙二醛(108.74g，1.0eq)，用冰/水浴维持该混合物的温度低于25℃，搅拌1小时。在45分钟内滴加水(1.14L)，在室温将得到的混悬液搅拌16小时。过滤该混悬液，得到4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，为白色固体(113g，76％)。再过滤上述滤液，又得到物质(15g，10％)。MS(ES)m/z＝252[M]⁺。

c.4-(4，5-二碘-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

方法1：

在15分钟内将碘(104g，2.05eq)逐步加入到4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(50g，198.94mmol)在二甲亚砜(200mL)中的溶液中(温度升至45℃)。将该溶液搅拌30分钟，然后加入氢氧化钾(85％，19.70g，1.5eq)，搅拌16小时。将该混合物缓慢倾入0.15M亚硫酸氢钠水溶液(1.25L)，得到黄色混悬液。搅拌45分钟，过滤，用水洗涤固体，干燥，得到4-(4，5-二碘-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，为淡黄色固体(98g，98％)。MS(ES)m/z＝504[M]⁺。

方法2：

将N-碘琥珀酰亚胺(46.81g，2.0eq)逐步加入到4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(25g，99.47mmol)在N-甲基吡咯烷酮(75mL)中的溶液中，维持温度低于30℃。搅拌15分钟，然后将该混合物缓慢倾入0.07M亚硫酸氢钠水溶液(0.75L)，得到黄色混悬液。搅拌30分钟，过滤，用水洗涤固体，干燥，得到4-(4，5-二碘-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，为淡黄色固体(49g，98％)。MS(ES)m/z＝504[M]⁺。

d.4-[4，5-二碘-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯：

在25分钟内将氢氧化钾(45.13g，4.0eq)逐步加入到4-(4，5-二碘-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(86g，170.9mmol)在N-甲基吡咯烷酮(258mL)中的溶液中，维持温度低于40℃。将该混合物搅拌25分钟，然后逐步加入1-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(47.5g，1.6eq)。将得到的混合物在40℃搅拌16小时，然后冷却至室温。将该反应体系倾入水(3.1L)，加入15％磷酸水溶液以调整pH至7.5-8。在0-5℃将得到的混悬液搅拌1小时。过滤，用水洗涤，在50℃真空干燥，得到4-[4，5-二碘-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(102g，99％)。MS(ES)m/z＝601[M]⁺。

e.4-[4-碘-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯：

合并4-[4，5-二碘-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(39g，64.97mmol)和2-甲基四氢呋喃(273mL)，然后冷却至-15℃。在45分钟内滴加2M氯化异丙基镁的四氢呋喃(32.48mL，1.0eq)溶液，维持温度低于-10℃，再搅拌30min。滴加乙酸(7.45mL)、然后滴加水(120mL)。用甲基叔丁基醚(2x 50mL)洗涤有机相。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。用无水硫酸镁干燥有机相，真空浓缩。使得到的油状物从己烷/甲基叔丁基醚中结晶，得到4-[4-碘-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯，为白色固体(29g，94％)。MS(ES)m/z＝475[M]⁺。

f.4-烯丙氧基丁-1-炔：

合并烯丙基溴(124.27g，1.03mol)和甲基叔丁基醚(504mL)，然后冷却至-5/0℃。加入氢化钠(49.30g，1.19eq)，然后在10分钟内滴加3-丁炔-1-醇(78mL，1.0eq)。将该混合物在-5/0℃搅拌15分钟，然后在室温搅拌16小时。加入十水合硫酸钠(36g，0.1eq)，搅拌30分钟。用压力通过Celite

过滤，用甲基叔丁基醚(200mL)洗涤，得到4-烯丙氧基丁-1-炔，为甲基叔丁基醚的溶液。推定定量收率。

g.2-(3-烯丙氧基-1-亚甲基-丙基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷：

将氯化锂(44.90g，1.05eq)加入到一氯化亚酮(104.85g，1.05eq)在二甲基甲酰胺(770mL)中的混悬液中。将该混合物搅拌1小时，加入双(频哪酸)二硼(271.70g，1.05eq)和乙酸钾(103.95g，1.05eq)。将得到的黑色混悬液冷却至0℃，滴加4-烯丙氧基丁-1-炔(甲基叔丁基醚溶液，110g，998.58mmol)。搅拌16小时，然后用2M氯化铵水溶液(1L)、甲基叔丁基醚(500mL)和己烷(500mL)稀释。将该混悬液搅拌30分钟，通过Celite

过滤，用己烷(1L)洗涤。用己烷(2x 200mL)洗涤水相。用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。真空浓缩得到粗油状物(218g)。通过硅胶色谱法纯化部分(45g)，用己烷-70/30己烷/甲基叔丁基醚洗脱，得到2-(3-烯丙氧基-1-亚甲基-丙基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷(27g，131g推断为其余油状物，55％，2步)。¹H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.93(m，2H)，5.69(m，1H)，5.26(dq，J＝17.2，1.7Hz，1H)，5.15(m，1H)，3.97(dt，J＝5.8，1.4Hz，2H)，3.51(t，J＝7.0Hz，2H)，2.44(t，J＝7.1Hz，2H)，1.26(s，12H)。h.2-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷：

将第2代Grubbs催化剂(亚苄基-[1，3-双(2，4，6-三甲基苯基)咪唑烷-2-基亚基]-二氯(三环己膦)钌，2.58g，0.03eq)加入到2-(3-烯丙氧基-1-亚甲基-丙基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷(23.4g，98.26mmol)在二氯甲烷(280mL)中的溶液中，搅拌16小时。真空浓缩，向残余物中加入己烷(120mL)。搅拌1小时，过滤。真空浓缩滤液，得到2-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷，为黄褐色固体(20.4g，99％)。¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ6.50(m，1H)，4.17(q，J＝2.7Hz，2H)，3.73(t，J＝5.4Hz，2H)，2.20(m，2H)，1.24(s，12H)。

i.4-[4-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯：

合并2-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷(19.1g，1.6eq)、4-[4-碘-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(27g，56.9mmol)、碳酸钠(120.6g，3.0eq)和二甲亚砜(135mL)。搅拌5分钟。加入三叔丁基磷鎓四氟硼酸盐(1.7g，0.1eq)和乙酸钯(II)(645.4mg，0.05eq)。在75-80℃在氮气气氛中搅拌得到的混悬液45分钟。将该混合物冷却至室温，然后用水(190mL)和甲基叔丁基醚(80mL)稀释。用甲基叔丁基醚(3x 54mL)洗涤水层。用水(60mL)、然后用10％w/w磷酸水溶液(60mL，20mL)洗涤有机层。合并这些水层，用甲基叔丁基醚(60mL)洗涤。加入碳酸钠至酸性水层中以调整pH至12。用甲基叔丁基醚(120mL，30mL)洗涤碱性水层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥，真空浓缩，得到4-[4-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(23.6g，96％)。MS(ES)m/z＝431[M]⁺。

j.4-[1-(2-吡咯烷-1-基乙基)-4-四氢吡喃-4-基-咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯：

将钯/活性炭(3.0g，50％湿，0.1g/g限制试剂)加入到4-[4-(3，6-二氢-2H-吡喃-4-基)-1-(2-吡咯烷-1-基乙基)咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(30g，69.67mmol)在乙醇(210mL)中的溶液中。在氢气气氛中在Parr系统(200psi，65-70℃)中搅拌27小时。再加入钯/活性炭(0.6g，50％湿，0.02g/g限制试剂)，在氢气气氛中在Parr系统(200psi，65-70℃)中搅拌5小时。用Celite

过滤，用乙醇洗涤。真空浓缩滤液，将残余物溶于乙醇(150mL)。加入钯/活性炭(0.6g，50％湿，0.02g/g限制试剂)，在氢气气氛中在Parr系统(250psi，70℃)中搅拌16小时。用Celite

过滤，用乙醇洗涤。真空浓缩滤液，得到4-[1-(2-吡咯烷-1-基乙基)-4-四氢吡喃-4-基-咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯，为棕色油状物(29.5g，98％)。MS(ES)m/z＝433[M]⁺。

k.4-[1-(2-吡咯烷-1-基-乙基)-4-(四氢-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基]-哌啶：

将35％盐酸水溶液(23.20mL，4.7eq)加入到4-[1-(2-吡咯烷-1-基乙基)-4-四氢吡喃-4-基-咪唑-2-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(29.0g，60.33mmol)在异丙醇(120mL)中的溶液中，在50℃搅拌6小时。真空浓缩。加入水(1L)和2M氢氧化钠水溶液以调整pH至12。用乙酸乙酯(3x 200mL)和二氯甲烷(3x 200mL)萃取。用无水硫酸镁干燥有机层，真空浓缩，得到4-(4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶(21.5g，100％)。MS(ES)m/z＝333[M]⁺。

l.(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

合并(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(15.69g，1.2eq)、三乙胺(10.14mL，1.1eq)、4-[1-(2-吡咯烷-1-基-乙基)-4-(四氢-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基]-哌啶(22g，66.17mmol)和N-甲基吡咯烷酮(66mL)。在110℃搅拌16小时，然后冷却至室温。用乙酸乙酯(110mL)和水(220mL)稀释。加入5M氢氧化钠水溶液以调整pH至12。用乙酸乙酯(2x 200mL)萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。加入水(220mL)至有机层中，加入85％磷酸水溶液以调整pH至3。用乙酸乙酯(2x 100mL)洗涤得到的酸性水层。加入5M氢氧化钠水溶液以调整pH至12。用乙酸乙酯(3x 70mL)萃取。用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤有机层。用无水硫酸镁干燥有机层，真空浓缩，得到最终化合物，为淡棕色固体(21.5g，64％)。MS(ES)m/z＝494[M]⁺。

实施例95

(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮晶型III

将约100mg无定形(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮加入到小瓶中，与5mL异丙基醚和100μL丁酸丁酯混合。得到固体淤浆。加入晶种，在室温将样品搅拌成淤浆，以1000rpm在搅拌盘上过夜。得到白色固体的浓稠淤浆。通过真空过滤分离固体，放入65℃真空烘箱干燥。

X-射线粉末衍射：用安装CuKα源

)和Vantec检测器的在50kV和40mA下运转的Bruker D8 Advance X-射线粉末衍射计得到晶体的XRD图案。以2θ扫描4-40°之间的每一样品，其中步长为0.02°2θ，扫描速率为9.0秒/步，发散和接收狭缝为1mm，检测器狭缝为0.1mm。将干燥粉末填充入凹陷的顶部-上样试样架，使用载玻片得到光滑面。在环境温度和相对湿度采集晶型的衍射图案。

在晶体学领域众所周知，对任意指定的晶型而言，衍射峰的相对强度可以因由例如晶态和结晶惯态这样的因素产生的优选方向的不同而改变。如果优选方向的效应存在，则峰强度改变，而多晶型物的特征峰位不变。例如，参见The United States Pharmacopeia #23，National Formulary #18，1843-1844页，1995。此外，在晶体学领域还众所周知，对任意指定的晶型而言，角度峰位可以适度改变。例如，峰位可以因分析样品时的温度或湿度、样品置换或存在或不存在内标的变化而移动。在目前的情况中，2θ±0.1的峰位变异性考虑到了这些内在的变换，而不会阻碍的指示的晶型的不明确鉴定。

晶型的证实可以基于任意独特的区别峰的组合进行(以°2θ的单位)，典型地是更多的主峰。因此，所制备的(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮晶型III的样品的特征在于如下表1中所述的使用CuKα射线作为衍射峰(2θ值)的XRD图案，且特别具有在8.53的峰与一个或多个选自17.06、7.97和14.17的峰的组合；其中衍射角的容忍值为0.1度。

表1：(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮晶型III的X-射线粉末衍射峰

峰角度(+/-0.1°2-θ)	相对强度(％主峰)
		7.97	52
8.53	100
		14.17	57
15.97	27
		16.56	32
17.06	97
		17.81	57
19.03	25
		19.36	26
21.73	34

实施例96

(R)-4-(4-(1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

a.3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯：

在62℃加热25％甲醇钠的甲醇溶液(1.49L，0.86eq)。在2小时内滴加丙二酸二甲酯(1.00kg，7.57mol)和4，4，4-三氟巴豆酸乙酯(1.27kg，1.0eq)的混合物。在62℃将该混合物加热2小时。将该混合物冷却至30℃。加入25％甲醇钠的甲醇溶液(2.34L，1.35eq)和醋酸甲脒(867.2g，1.1eq)。在30℃搅拌过夜。将该混合物冷却至0℃，加入5M盐酸水溶液，调整pH至4.5。过滤，用水(2L)洗涤。向湿固体中加入甲基叔丁基醚(5L)。过滤，再用甲基叔丁基醚(2L)洗涤，在50℃干燥，得到3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯(1.05kg，52％)。

b.3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯：

将磷酰氯(3.15L，8.6eq)冷却至0℃。滴加3-(4，6-二羟基嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯(1.05kg，3.94mol)。在1小时内滴加N，N-二乙基苯胺(0.69L，1.1eq)。将该混合物缓慢温至100℃，加热过夜。将该混合物冷却至室温，真空浓缩。用乙腈(4L)稀释，滴加至预先冷却至-2℃的3M磷酸氢二钾水溶液(6.86kg，10eq)中。过滤，用二氯甲烷洗涤不需要的固体。分离滤液的各层。再用二氯甲烷洗涤水相。用2M盐酸水溶液、水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，真空浓缩，得到3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯(1.15kg，97％)。

c.(R)-4-氯-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

在加压反应器中合并3-(4，6-二氯嘧啶-5-基)-4，4，4-三氟丁酸甲酯(501.0g，1.57mol)和2M氨的异丙醇溶液(1.57L，2.0eq)。在120℃加热7小时。将该混合物冷却至室温，然后真空浓缩。用己烷(1L)稀释。过滤，得到粗产物。将该固体与10％异丙醇的水(600mL)溶液和水(1.3L)一起研磨。过滤，在70℃干燥，得到4-氯-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(328.9g，83％)，为外消旋物。MS(ES)m/z＝252[M]⁺。

手性分离(Chiralpak AS，乙醇(0.2％二甲基乙胺))得到(R)-4-氯-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为对映体2(＞99％ee)。MS(ES)m/z＝252[M]⁺。

d.4-(4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

合并二氧化硒(8.80g，79.32mmol)、1，4-二噁烷(50mL)、乙酸(2mL)和水(2mL)。在氮气气氛中回流加热，然后缓慢滴加4，4，4-三氟丁-2-酮(7.59mL，1.0eq)。在氮气气氛中回流加热15小时。然后冷却至室温。过滤该反应混合物，得到橙-红色滤液。向单独的烧瓶加入在甲醇(125mL)中的4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(16.92g，1.0eq)和乙酸胺(15.28g，2.5eq)。通过漏斗滴加滤液。在室温在氮气气氛中搅拌过夜。真空浓缩至干。加入水，用28％氢氧化铵水溶液使其呈碱性。用二氯甲烷萃取。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过正向色谱法纯化，用己烷-10％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到粗产物，为黄色油状物。用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。分离各层。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到4-(4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，为黄色固体(16.38g，62％)。MS(ES)m/z＝334[M]⁺。

e.4-(1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

在二甲亚砜(35mL)中合并4-(4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.52g，10.56mmol)、氢氧化钾(1.91g，3.2eq)(新粉末化的)和2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(1.90mL，1.2eq)。将该反应混合物在50℃加热过夜，然后使其冷却至室温。用乙酸乙酯稀释。用水、然后用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。

在二甲亚砜(43mL)中合并4-(4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.34g，13.02mmol)、氢氧化钾(2.33g，3.2eq)(新粉末化的)和2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(2.40mL，1.2eq)。将该反应混合物在50℃加热过夜，然后使其冷却至室温。用乙酸乙酯稀释。用水、然后用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。

合并来自上述反应的两固体。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-9∶1己烷∶乙酸乙酯-3∶1己烷∶乙酸乙酯-1∶1己烷∶乙酸乙酯-1∶3己烷∶乙酸乙酯-乙酸乙酯洗脱，得到4-(1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.19g，30％)。MS(ES)m/z＝462[M]⁺。

f.2-(2-(哌啶-4-基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-1-基)乙醇二盐酸盐：

合并4-(1-(2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.12g，6.76mmol)、二氯甲烷(88mL)和甲醇(35mL)。缓慢加入氯化氢(17.3mL，10.2eq)(4M的二噁烷溶液)。在氮气气氛中搅拌过夜。真空浓缩，得到2-(2-(哌啶-4-基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-1-基)乙醇二盐酸盐(2.37g，100％)。MS(ES)m/z＝278[M]⁺。

g.(R)-4-(4-(1-(2-羟基乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

在微波试管内加入(R)-4-氯-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(0.70g，2.78mmol)、2-(2-(哌啶-4-基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-1-基)乙醇二盐酸盐(1.17g，1.2eq)、N-甲基吡咯烷酮(10mL)和二异丙基乙胺(2.20mL，5.7eq)。用螺纹帽密封。在150℃在微波反应器中加热1小时。用饱和碳酸氢钠水溶液稀释该反应混合物，用乙酸乙酯萃取。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过正向色谱法纯化，用5％甲醇/二氯甲烷-10％甲醇/二氯甲烷-10％2M氨的甲醇/二氯甲烷溶液洗脱，得到(R)-4-(4-(1-(2-羟基乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(0.93g，68％)。MS(ES)m/z＝493[M]⁺。

h.(R)-2-(2-(1-(7-氧代-5-三氟甲基-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-1-基)乙基甲磺酸酯

合并(R)-4-(4-(1-(2-羟基乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(0.93g，1.88mmol)、二氯甲烷(14mL)和三乙胺(0.79mL，3.0eq)。放入氮气气氛中，冷却至0℃。滴加甲磺酰氯(0.17mL，1.2eq)。30分钟后，用二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止。分离各层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到(R)-2-(2-(1-(7-氧代-5-三氟甲基-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-1-基)乙基甲磺酸酯，为黄色固体(1.07g，96％)。MS(ES)m/z＝571[M]⁺。

i.(R)-4-(4-(1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

在氮气气氛中合并(R)-2-(2-(1-(7-氧代-5-三氟甲基-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-1-基)乙基甲磺酸酯(1.04g，1.82mmol)、二甲基甲酰胺(9.3mL)和氮杂环丁烷(1.11mL，9.0eq)。将该反应混合物在50℃加热过夜，然后使其冷却至室温。用乙酸乙酯稀释。用水洗涤有机层。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过正向色谱法纯化，用10％甲醇/二氯甲烷-10％2M氨的甲醇/二氯甲烷溶液洗脱，得到标题化合物(R)-4-(4-(1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-4-(2，2，2-三氟乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为白色固体(0.49g，51％)。MS(ES)m/z＝532[M]⁺。

实施例97

(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

a.(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

根据实施例92的步骤a-e制备。

b.5，5，5-三氟戊醛：

合并3，3，3-三乙酰氧基-3-碘四氯苯酞(17.91g，1.2eq)和二氯甲烷(95mL)。在氮气气氛中滴加5，5，5-三氟-1-戊醇(5.00g，35.18mmol)的二氯甲烷(238mL)溶液。4小时后，通过Celite

过滤该反应混合物。真空浓缩滤液；与50mL二氯甲烷合并，用1∶110％硫代硫酸钠∶氢氧化钠水溶液(1N)洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩，得到5，5，5-三氟戊醛，为无色油状物(2.13g，43％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.61(s，1H)，2.50(m，2H)，2.21(m，2H)，1.66(m，2H)。

c.5，5，5-三氟-2-氧代戊醛：

合并5，5，5-三氟戊醛(2.01g，14.35mmol)、1，4-二噁烷(10mL)、二氧化硒(1.62g，1.0eq)、水(0.51mL)和乙酸(0.69mL)。在90℃加热该混合物，搅拌过夜。将该反应混合物冷却至室温。过滤，用二噁烷洗涤固体。合并滤液和洗涤液，得到5，5，5-三氟-2-氧代戊醛(2.21g，100％)。GCMS m/z＝154。

d.4-(4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

合并28％氢氧化铵水溶液(18.6mL)、4-甲脱基哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.04g，14.25mmol)和甲醇(22.6mL)。放入氮气气氛中，冷却至0℃。在氮气气氛中加入5，5，5-三氟-2-氧代戊醛(2.21g，1.0eq，为二噁烷水溶液)。将其温至室温。搅拌2天。真空浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠水溶液。分离各层。再用9∶1二氯甲烷∶异丙醇洗涤水层。用无水硫酸钠干燥合并的有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用己烷-1∶1己烷∶乙酸乙酯-乙酸乙酯洗脱，得到4-(4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，为浓稠琥珀色油状物(2.32g，47％)。MS(ES)m/z＝348[M]⁺。

e.4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

在二甲亚砜(100mL)中合并4-(4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.27g，6.53mmol)、氢氧化钾(1.20g，3.3eq)(新粉末化的)和1-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(1.34g，1.2eq)。将该反应混合物在50℃加热过夜，然后使其冷却至室温。用乙酸乙酯稀释。用水、然后用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化，用4∶1二氯甲烷∶异丙醇洗脱，得到4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，为浓稠黄色油状物(0.73g，25％)。MS(ES)m/z＝445[M]⁺。

f.4-(4-(3，3，3-三氟丙基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三(2，2，2-三氟乙酸盐)：

合并4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.73g，1.64mmol)和二氯甲烷(16.2mL)。放入氮气气氛中，冷却至0℃。加入三氟乙酸(16.2mL)。1小时后，真空浓缩，得到4-(4-(3，3，3-三氟丙基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三(2，2，2-三氟乙酸盐)(1.12g，100％)。MS(ES)m/z＝345[M]⁺。

g.(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

在微波试管内加入(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(0.33g，1.66mmol)、4-(4-(3，3，3-三氟丙基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶三(2，2，2-三氟乙酸盐)(1.12g，1.0eq)、N-甲基吡咯烷酮(10mL)和二异丙基乙胺(2.30mL，8.0eq)。用螺纹帽密封。在200℃在微波反应器中加热10分钟。用水稀释该反应混合物，用乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过正向色谱法纯化，用己烷-10％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到标题化合物(R)-5-甲基-4-(4-(1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-4-(3，3，3-三氟丙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮，为琥珀色固体(0.23g，27％)。MS(ES)m/z＝506[M]⁺。

实施例98

(R)-4-(4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮

a.(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮；

根据例92的步骤a-e制备。

b.4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

合并28％氢氧化铵水溶液(373mL)、4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(127.00g，595.47mmol)和甲醇(508mL)。在室温搅拌。15分钟后，在氮气气氛中加入乙二醛(86.30mL，1.0eq)(6.9M水溶液)。1小时后，在45分钟内滴加水(1.14L)。在室温搅拌得到的混悬液过夜。过滤，真空干燥得到的白色固体，得到4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(128.00g，86％)。MS(ES)m/z＝252[M]⁺。

c.4-(4，5-二碘-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

合并4-(1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(50.00g，198.94mmol)和二甲亚砜(200mL)。在15分钟内逐步加入碘(104.03g，2.1eq)。将该反应混合物在氮气气氛中加热至45℃。30分钟后，加入氢氧化钾(19.70g，1.5eq)。使其冷却至室温，搅拌过夜。将该反应混合物缓慢加入到硫酸氢钠水溶液(1.25L，1.65wt％)中。搅拌得到的混悬液45分钟。过滤，用水洗涤，干燥得到的固体，得到4-(4，5-二碘-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(98.00g，98％)。MS(ES)m/z＝504[M]⁺。

d.4-(4，5-二碘-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

在N-甲基吡咯烷酮(258mL)中合并4-(4，5-二碘-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(86.00g，170.93mmol)和氢氧化钾(45.13g，4.0eq)，维持温度低于40℃。在室温搅拌25分钟，然后加入1-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(47.47g，1.6eq)。将该反应混合物在40℃加热过夜，然后使其冷却至室温。

在N-甲基吡咯烷酮(30mL)中合并4-(4，5-二碘-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(10.00g，19.88mmol)和氢氧化钾(5.25g，4.0eq)。在40℃搅拌30分钟，然后加入1-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐(5.52g，1.6eq)。将该反应混合物在40℃加热过夜，然后使其冷却至室温。

合并上述两反应混合物。加入到水(3.36L)中，用15％磷酸水溶液将得到的混合物的pH调整至7.5-8.0。在0-5℃搅拌得到的混悬液1小时。过滤，用水洗涤，真空干燥得到的固体，得到4-(4，5-二碘-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(102.00g，89％)。MS(ES)m/z＝601[M]⁺。

e.4-(4-碘-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯：

合并4-(4，5-二碘-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(51.00g，84.96mmol)和2-甲基四氢呋喃(357mL)。将该反应混合物冷却至0℃。在45分钟内滴加2M氯化异丙基镁的四氢呋喃(55.22mL，1.3eq)溶液，维持温度低于5℃。加入饱和氯化铵水溶液。分离各层。用甲基叔丁基醚洗涤水相。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。用无水硫酸镁干燥有机相，用活性炭脱色，过滤，真空浓缩，得到4-(4-碘-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，为黄色固体(39.50g，98％)。MS(ES)m/z＝475[M]⁺。

f.4-(4-(1-羟基乙基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯；磷酸：

合并4-(4-碘-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(40.00g，82.63mmol)和四氢呋喃(600mL)。在氮气气氛中冷却至-70℃。滴加2.5M正丁基锂的己烷溶液(67.76mL，2.1eq)。加入乙醛(23.22mL，5.0eq)，搅拌15分钟。用饱和氯化铵水溶液(75mL)使反应停止。分离各层。用甲基叔丁基醚洗涤水相。用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。用无水硫酸镁干燥有机相，过滤，真空浓缩。溶于乙醇。滴加85％磷酸水溶液得到混悬液。将该混合物在室温搅拌过夜。过滤，真空干燥得到的黄白色固体，得到4-(4-(1-羟基乙基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯；磷酸(28.00g，69％)。MS(ES)m/z＝393[M]⁺。

g.4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯；磷酸：

将氢氧化钯/碳(4.20g，60％湿，0.15g/g限制试剂)加入到4-(4-(1-羟基乙基)-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯；磷酸(28.00g，57.08mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中。在氢气气氛中在Parr系统中(150psi，60℃)搅拌6天。再在氢气气氛中在Parr系统中(300psi，80℃)搅拌7天。用Celite

过滤。真空浓缩滤液，用丙酮(280mL)稀释。在室温搅拌过夜。过滤，真空干燥得到的白色固体，得到4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯；磷酸(23.00g，85％)。MS(ES)m/z＝377[M]⁺。

h.4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶：

合并4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯；磷酸(18.27g，38.50mmol)和水(9.1mL)。滴加12M盐酸的水(9.63mL，3.0eq)溶液。在室温搅拌。1小时后，用2M氢氧化钠水溶液将该反应混合物的pH调整至10。用二氯甲烷稀释。分离各层。用二氯甲烷洗涤水相。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。用无水硫酸镁干燥有机相，过滤，真空浓缩，得到4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶(7.70g，72％)。MS(ES)m/z＝277[M]⁺。

i.(R)-4-(4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮：

合并4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶(7.70g，27.86mmol)、(R)-4-氯-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(6.06g，1.1eq)、N-甲基吡咯烷酮(25.4mL)和三乙胺(4.27mL，1.1eq)。在氮气气氛中在110℃搅拌过夜，然后使其冷却至室温。用乙酸乙酯和水稀释。用2M氢氧化钠水溶液将pH调整至10。分离各层。用乙酸乙酯洗涤水相。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。真空浓缩有机相。用乙酸乙酯和水稀释。调整pH至5。分离各层；弃去有机层。用2M氢氧化钠水溶液将水相的pH调整至11。用乙酸乙酯洗涤水相。用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。真空浓缩有机相。用2-甲基四氢呋喃∶己烷(15∶85，77mL)稀释。在室温搅拌过夜。过滤，真空干燥得到的白色固体，得到标题化合物(R)-4-(4-(4-乙基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-咪唑-2-基)哌啶-1-基)-5-甲基-5，6-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(7.90g，65％)。MS(ES)m/z＝438[M]⁺。

制剂实施例

甘露糖醇制剂

合并实施例73的化合物(500mg)和甘露糖醇(500mg)，掺合干燥2小时，或直到形成均匀混合物为止。手工将确定量的该掺合物(184.54mg；相当于92.29mg实施例73的化合物)称入硬胶囊壳底，合上囊壳以封闭该掺合物。作为可替代选择，使用例如Xcelodose

S精密粉末微-剂量系统和封口机这样的设备将本发明的化合物与甘露糖醇的掺合物转入硬明胶胶囊。

PEG400制剂

在容器内合并实施例73的化合物(126mg)和PEG400(621.5mg)，使用搅拌器以250rpm加热至70℃2小时或直到实施例73的化合物完全溶解为止。手工或通过自动化系统将确定量的该掺合物称入软明胶胶囊壳底，合上囊壳以封闭胶囊。

AKT1体外酶测定

使用AKT1 Transcreener^TM激酶ADP-FP测定法测定对AKT1靶标的化合物IC₅₀值。该测定法通过测定激酶反应中形成的腺苷二磷酸(ADP)的浓度评价在化合物抑制剂的存在下的AKT1活性。在96-孔半区域黑色聚苯乙烯培养板上进行激酶反应(25μL反应体积)。加入腺苷三磷酸(ATP)以启动反应。最终反应条件是56毫摩尔N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)pH 7.4、0.008％TRITON^TM X-100、5毫摩尔氯化镁、30微摩尔Crosstide肽、20微摩尔ATP、hAKT1人重组体、在昆虫细胞中表达的组氨酸标记的V-AKT鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1、4％二甲亚砜和顺序稀释的化合物(按照1∶3从20,000-1纳摩尔稀释)。在添加ATP后，将该反应体系在室温温育60分钟，然后通过添加25μL包含52毫摩尔HEPES pH7.5、20毫摩尔乙二胺四乙酸(EDTA)、0.4摩尔氯化钠、0.02％BRIJ-35^TM、10微克/微升抗-ADP抗体和4纳摩尔ADP Far Red Tracer的终止检测试剂使反应停止。将终止的反应体系温育4-16小时，然后在平板读出器上以荧光偏振模式、使用Ex_612nm和Em_633nm波长偏振滤光片读取。使用制备的ADP/ATP标准曲线将微偏振(mP)原始数据转化成微摩尔ADP(Huss等人Development of a Transcreener^TM Kinase Assay for Protein Kinase A andDemonstration of Concordance of Data with a Filter-Binding AssayFormat，Journal of Biomolecular Screening，12(4)；2007，578-584)。使用抑制百分比数据衍生每种化合物的IC₅₀值，所述的抑制百分比数据使用相对于平板上对照品的微摩尔ADP反应数据计算(活性酶与100毫摩尔抑制的酶对照品)。然后使用ACTIVITYBASE 4.0(Assay Guidance ManualVersion 5.0，2008，Eli Lilly and Company和NIH Chemical GenomicsCenter)使抑制百分比和10-点化合物浓度数据与4-参数逻辑方程拟合。

基本上如上所述测试实施例41，经测定具有0.017μM的IC₅₀。这显示实施例41作为AKT1抑制剂具有活性。

U87MG细胞中AlphaScreen SureFire检测磷酸化GSK3β(S9)

使用用于pGSK3β(TGRGBS10K)的AlphaScreen SureFire测定化合物对内源性磷酸化GSK3β丝氨酸9(pGSK3β)形成的效果。这是使用磷酸化分析物的夹心式免疫俘获物的同源性测定方式，然后使用抗体-包被的Alphascreen珠检测，以生成扩增的信号。

使用由补充了10％胎牛血清、1％非必需氨基酸和1％丙酮酸钠的DMEM组成的U87MG将U87MG细胞维持在生长培养基中。为了进行本测定，通过标准方法收集细胞，然后使用Vi-Cell计数。将细胞(50,000/孔)在100μL U87MG生长培养基中铺板入Costar #3596 96孔培养板。将培养板在37℃，5％CO₂温育过夜。

在本测定的当天，用20μL/孔的在包含6％二甲亚砜的培养基中稀释的化合物处理细胞。在37℃1小时后，除去培养基，每孔加入50μLSureFire裂解缓冲液(TGR Biosciences SureFire

Kit成分)，在室温与适度振摇下持续温育10分钟。将裂解液(6.0μL)转入384孔ProxiPlate^TM(Perkin Elmer#6006280)。将包含0.96μL活化缓冲液、0.19μL的各供体和受体珠和8.7μL用于pGSK3β测定的反应缓冲液(TGR Biosciences，TGRGBS10K)的混合物加入到各孔中。用箔密封培养板，在室温与适度振摇下持续温育4小时，然后用安装TurboModule的Perkin ElmerEnVision、使用标准AlphaScreen设置(Ex_680nm和Em_520-620nm)读取。然后使用ACTIVITYBASE 4.0(Assay Guidance Manual Version 5.0，2008，EliLilly and Company和NIH Chemical Genomics Center)将根据各培养板上的对照品测定的抑制百分比和10-点化合物浓度数据与4-参数逻辑方程拟合。

基本上如上所述测试全部实施例化合物，其中A是

具有小于或等于2.8μM的IC₅₀。基本上如上所述测试实施例41，经测定具有1.5μM的IC₅₀。

这证实了本发明化合物抑制AKT活性的能力。

AKT体内靶标抑制(IV)的测定

通过单一IV注射的体内靶标抑制：

将呈指数生长的来源于人胶质母细胞瘤的U87MG细胞经皮下植入无胸腺大鼠的后胁腹。当肿瘤达到200-250mm³大小时，在剂量响应研究或时程研究中通过单一IV注射将化合物施用于动物。在每次治疗结束时，用CO₂使动物窒息。通过手术切开收集肿瘤，速冻在液氮中，贮存在-80℃至分析为止。由通过心脏穿刺从心脏采集的血液制备血清，贮存在-80℃至分析为止。

样品分析：

用乙腈/甲醇从血清中提取AKT抑制剂，通过LC/MS/MS通过内标对AKT抑制剂进行分析。就剂量响应研究而言进行化合物血清暴露和TMEC₅₀计算(最低有效浓度阈值)。

使用Powergen 125匀化器在包含25mM Tris(pH 7.5)、Roche完全蛋白酶抑制剂和1mM钒酸盐的2体积裂解缓冲液中匀化肿瘤，然后使其依次通过18号计量注射针和23号计量注射针。在以20,000x g将裂解液离心30分钟后从上清液级分中采集可溶性胞质提取物。用BCA试剂盒测定胞质提取物中的蛋白质浓度。用ELISA试剂盒分析可溶性提取物中的Phospho-GSK3b(pGSK3b)。就每一研究而言，相对于媒介物对照组计算抑制百分比，使用用于测定统计学显著性的JMP软件包进行ANOVA分析。

在体内靶标抑制测定法中基本上如上所述测试实施例78，经测定具有如下活性：

IV剂量(mp中)	后IV剂量(hr)	p(S9)GSK3β-％抑制
			20	4	48(n＝2)

这证实了实施例78体内抑制AKT的能力。

ROCK2体外酶测定

使用ROCK2Transcreener^TM激酶ADP-FP测定法测定对ROCK2激酶的化合物IC₅₀值。本测定法通过测定激酶反应中形成的ADP浓度评价在化合物抑制剂的存在下的ROCK2活性。在96-孔半区域黑色聚苯乙烯培养板上进行激酶反应(25μL反应体积)。加入酶，以启动反应。最终反应条件是20毫摩尔3-(N-吗啉代)-丙磺酸pH 7.4、4毫摩尔β-甘油磷酸、0.01％TRITON^TM X-100、5毫摩尔氯化镁、25微摩尔肽底物(序列RFARKGSLRQKNV(SEQ ID NO：1))、10微摩尔ATP、ROCK2人重组酶(残基11-552，组氨酸标记的，在昆虫细胞中表达的)、4％二甲亚砜和顺序稀释的化合物(按照1∶3从20,000至1纳摩尔稀释)。在添加酶后，将该反应体系在室温温育60分钟，然后通过添加25μL包含52毫摩尔HEPESpH 7.5、20毫摩尔EDTA、0.4摩尔氯化钠、0.02％BRIJ-35^TM、10微克/微升抗-ADP抗体和4纳摩尔ADP Far Red Tracer的终止检测试剂终止反应。将终止的反应体系温育4-16小时，然后在平板读出器上以荧光偏振模式、使用Ex_612nm和Em_633nm波长偏振滤光片读取。使用ADP/ATP标准曲线将微偏振(mP)原始数据转化成微摩尔ADP(Huss等人，Development of aTranscreener^TM Kinase Assay for Protein Kinase A and Demonstration ofConcordance of Data with a Filter-Binding Assay Format，Journal ofBiomolecular Screening，12(4)；2007，578-584)。使用抑制百分比数据衍生每种化合物的IC₅₀值，所述的抑制百分比数据使用相对于平板上对照品的微摩尔ADP反应数据计算(活性酶与100毫摩尔EDTA-抑制的酶对照品)。然后使用ACTIVITYBASE 4.0(Assay Guidance Manual Version 5.0，2008，Eli Lilly and Company和NIH Chemical Genomics Center)使抑制百分比和10-点化合物浓度数据与4-参数逻辑方程拟合。

基本上如上所述测试全部实施例化合物，其中A是

具有小于或等于20μM的IC₅₀。基本上如上所述测试实施例41，经测定具有大于20μM的IC₅₀。

本发明的优选化合物具有低ROCK2活性。

细胞增殖和组合研究

本增殖测定法使用CellTiter-Glo发光细胞存活测定系统(购自Promega)测定培养物中基于存在的ATP定量的活细胞的细胞数量，其在代谢活细胞的存在下发出信号。

将细胞以2000个细胞/孔体积在50μL培养基(DMEM、10％FBS、25mM HEPES、1.0mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸)的96-孔培养板中铺板，除外在第1栏中仅有培养基作为空白对照。将培养板在37℃和5％CO₂下温育过夜。第2天，制备在DMSO中40mM的化合物储备溶液(500X)，用DMSO在96-孔圆底聚丙烯培养板中顺序稀释。一式两份测定10个化合物浓度，每个培养板中4种化合物。

将4μL顺序DMSO稀释液转入96深孔培养板，将1mL完全培养基加入，以生成给药用2X储备溶液。将50μL各2X给药储备溶液缓慢转入细胞培养板相应的孔，得到0.2％DMSO浓度和100μL最终体积。将50mL培养基加入到对照栏(第12栏)和背景栏(第1栏)中。将细胞与化合物一起在37℃，5％CO₂温育72hr。

温育后，100μL预制备的CellTiter-Glo试剂(Promega，Cat：G7571)加入到各孔中，然后通过在定轨振荡器上混合2min匀化细胞，在RT温育10分钟，以使发光信号稳定。用Wallac Victor V培养板读出器记录发光原始数据，使用抑制百分比数据生成各化合物的IC₅₀值。将4-参数逻辑曲线拟合每次剂量响应。

组合研究使用固定比例的方法，其中以相当于单一活性剂的IC50等效值的固定比例的浓度提供另外的治疗剂和本发明的化合物。组合研究的读出值是使用Cell Titer Glo试剂的相应细胞系中的细胞增殖。类似地处理对照组，但不使用化合物。根据Zhao等人(Clinical Cancer Research 10，7994-8004，2004年12月1日)中所述的方法、使用内部研发的基于web的工具进行数据分析。根据如下方程对每一细胞增殖活性水平计算组合指数。

活性水平下的组合指数x＝[活性水平x下的组合中另外的治疗剂的浓度/另外的治疗剂的ICx]+[活性水平x下组合中本发明化合物的浓度/本发明化合物的ICx]

为清楚起见，将在50％抑制下的组合指数值概述如下。

AKT体内靶标抑制测定(口服和胃肠外)

将在0.2mL基质胶中的U87MG人胶质母细胞瘤细胞(5x 10⁶)经皮下植入无胸腺裸鼠的胁腹。植入后2周，根据时程、单剂量/单一时间点或用于测定TMED₅₀的剂量响应方案(最低有效剂量阈值)对小鼠口服或胃肠外给药。收集时速冻肿瘤，采血用于测定母体化合物的血浆暴露，在剂量响应研究中计算TMEC₅₀(最低有效浓度阈值)。将肿瘤或组织在液N₂中粉碎，使用裂解基质D管(MP Biomedicals，Solon，OH，cat#6913-500)和BIO101Thermo Savant Fast Prep FP12在400μL XY裂解缓冲液(10μg/mL亮抑蛋白酶肽、10μg/mL糜胰蛋白酶抑制剂、10μg/mL甲苯磺酰基苯基-内氨酰基氯甲基酮、10μg/mL抑肽酶、60mMβ-甘油磷酸、1％Triton X100、25mM Tris pH 7.5、2.5mM焦磷酸盐、150mM NaCl、2mM对-甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯、15mM磷酸对-硝基苯酯、5mM苄脒、1mM钒酸Na、10mM NaF、50μg/mL苯-甲磺酰氟、1mM 1，4-二硫苏糖醇(DTT)、15mM EDTA pH 8.0、5mM EGTA pH 8.0、1μM微囊藻毒素、1μM黑软海绵素A和1Roche完全蛋白酶抑制剂小-片/10mL)中裂解。等分裂解液，即刻测定或贮存在-80℃稍后测试。使用Meso Scale Discovery(Gaithersburg，MD)ELISA技术测定AKT体内靶标抑制，以评价对FOXO、PRAS40和GSK3β(S9)的下游效应物的磷酸化的效果。概括地说，将20μg裂解液加入到包含碳电极的用适合的俘获抗体预点板的96-孔培养板中。使用钌标记的检测抗体探测所关注的蛋白质。在包含共反应剂TPA的读取缓冲液的存在下，在电流通过电极时，电化发光导致生成光，对其定量，使用MSD Sector 6000仪器记录。就每一研究而言，相对于媒介物对照组计算抑制百分比，使用用于测定统计学显著性的JMP软件包进行ANOVA分析。

基本上如上所述在AKT体内靶标抑制测定法中测试实施例26，经测定在12.5mg/kg下2小时后具有的如下活性(6只动物/组的平均值)：

这证实了实施例26在体内抑制AKT的能力。