CZ2004619A3 - Léčivo pro léčení akutní myeloidní leukemie - Google Patents

Description

LÉČIVO PRO LÉČENÍ AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIE

Oblast techniky

Předložený vynález se týká léčiva pro léčení akutní myeloidní leukemie obsahujícího indolinonovou sloučeninu. Akutní myeloidní leukemie (AML) je onemocnění, při kterém vznikají rakovinové buňky v krvi a kostní dřeni. Neléčená AML je smrtelné onemocnění s průměrnou dobou přežití 3 měsíce. Pacienti s AML, kteří jsou FLT-3-ITD (interní tandemové duplikace) pozitivní typicky vykazují slabou reakci na tradiční chemoterapii. Předložený vynález se týká léčení pacientů s AML a výhodně pacientů, kteří jsou pozitivní na FLT-3-ITD, ale léčba není omezena je na FLT-3-ITD, podáním indolinonových sloučenin obecného vzorce (I) nebo (II). Předložený vynález se také týká způsobu inhibice fosforylace FLT-3.

Dosavadní stav techniky

Akutní myeloidní leukemie, také nazývaná akutní nelymfocytární leukemie, je forma rakoviny, při které se v krvi a kostní dřeni nachází příliš mnoho nezralých bílých krvinek. Tyto nezralé buňky, nazývané také blasty, nejsou schopny dozrát do stádia mateřských buněk schopných boje proti infekcím.

Pokroky při léčení AML vedly k výraznému zlepšení celkových remisí onemocní. K tomu, aby se dosáhlo úplné remise onemocnění, musí být léčení agresivní, protože jinak při částečné remisi není výrazná výhoda, co se týče počtu přeživších. Lze očekávat, že přibližně u 60% až 70% dospělých s AML po příslušné indukční terapii dojde k úplné remisi onemocnění. U více než 15% dospělých s AML (asi 25% z těch, u kterých došlo k úplné remisi onemocnění) lze očekávat, že přežijí 3 nebo více let a mohou být vyléčeny. Míra remise onemocnění u dospělých s AML nepřímo souvisí s věkem, kde u mladších 60 let se očekává více než 65% remise onemocnění. Z dat vyplývá, že jakmile jednou dojde k remisi, může být u starších pacientů doba kratší. Zdá se, že zvýšená

I · • 1» • · ♦ · · • · · · · · · » ·· ··· ····· • ·· · · · · · morbidita a mortalita během indukce přímo souvisí s věkem. Další nepříznivé prognostické faktory zahrnují zasažení centrálního nervového systému při leukémii, systémové infekci při diagnóze, zvýšený počet bílých krvinek ( > 100000 na mm³), AML indukovanou ošetřením a anamnézu myelodysplastického syndromu. Počet přežití během 5 let bez nemoci u pacientů s relapsem leukemie, kterým nebyla provedena transplantace hematopoezních kmenových buněk, je menší než 5 %.

Při lidské formě leukemie byly zjištěny mutace receptorových tyrosinkináz (RTK), včetně cKIT, PDGFRp a FLT-3. Mutace FLT-3 zahrnují jakékoliv změny kterékoliv genové sekvenci FLT-3, včetně bodových mutací, delecí, inzercí, interních tandemových duplikací, polymorfizmů. Příklad známé mutace v FLT-3 je bodová mutace v aminokyselinovém zbytku 835 v lidské FLT-3, která byla identifikována přibližně u 7 % pacientů podle Abu-Duhier et al. (Br. J. Haematol 2001 Jun; 113(4): 983-8. Indentification of novel FLT-3 Asp835 mutations in adult acute myeloid leukaemia. Abu-Duhier FM, Goodeve Ac, Wilson GA, Care RS, Peake IR, Reilly JT). Tato mutace je v aktivující smyčce FLT-3 a pravděpodobně je výsledkem konstitutivní aktivace na bázi homologie s jinými receptory tyrosinkináz, např. c-kit.

Interní tandemové duplikace (ITD) sekvence kódující juxtamembránu (JM) genu FLT-3 je jedna z nej frekventovanějších mutací (25 - 30% pacientů s AML). ITD jsou interní tandemové duplikace, mutace zjištěné v doméně juxtamembrány, repetice lišící se rozsahem, ale duplikovaná sekvence se vyskytuje vždy v jednom rámci. Mutantní FLT-3 byla zjištěna u několika pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML) a 3 % případů myelodysplastického syndromu, zatímco u chronické myeloidní leukemie a lymfoidních zhoubných bujení se vyskytuje méně často. Přítomnost mutace genu FLT-3 souvisí s vysokým počtem periferních bílých krvinek. Během progrese MDS nebo při relapsu AML, která zprvu neměla diagnózu na ITD, se někdy objeví ITD genu FLT-3, což ukazuje na to, že mutace FLT-3 podporuje progresi leukemie. Viz Zhao et al., Leukemia, vol. 14, 374-378 (2000).

• ·· φ · ·· · • · · · · · · φ φ · ΦΦΦΦ · · · · ···· ·« « · φ · · · κ· • · · · · ·· · • · φ« · * φφ ·

FLT-3 (tyrosinkináza 3 typu fras) je členem skupiny III receptorových tyrosinkináz. Odborníci v oboru určitě rozpoznají, že FLT-3 byla v odborné literatuře také nazývána flk2. Termín FLT-3 se v předloženém vynálezu vztahuje na polypeptid mající např. sekvenci uvedenou pod přístupovým číslem gi|4758396|ref|NP_004110.1| tyrosinkináza 3 typu fms [Homo sapiens] nebo gi|544320|sp|P36888|FLT-3_HUMAN FL CYTOKINE RECEPTOR PRECURSOR (TYROSINE-PROTEIN KINASE RECEPTOR FLT-3) (STEM CELL TYROSINE KINASE 1) (STK-1) (CD135 ANTIGEN) nebo gi|409573 |gb|AAA18947.11 (U02687) serin/threonin proteinkináza [Homo sapiens]. Odpovídající přístupová čísla pro mRNA prvních dvou sekvencí jsou gi|4758395|ref|NM-004119.11 Homo sapiens tyrosinkináza 3 typu fms (FLT-3), mRNA gi|406322|emb|Z26652.1|HSFLT-3RTK H. sapiens FLT-3 mRNA pro receptorovou tyrosinkinázu FLT-3. Pro přehled FLT-3, viz Gilliland, Current Opin. Hematol. 9 (4) 276-281 July 2002.

Zhao et al., Leukemia (2000) dále publikuje in vivo léčení mutantní FLT-3 transformované myší leukemie inhibitorem tyrosinkinázy. Při vývoji terapeutické metody objevil Zhao využití inhibitorů tyrosinkinázy pro in vitro supresi růstu transformovaných buněk 32D (IL-3 dependentní myší buněčná linie).

Interní tandemové duplikace (ITD) mutací receptorové tyrosinkinázy FLT-3 byly zjištěny u 20-30% pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML), viz např. Levis et al., Blood, vol. 98, 885-887 (2001). Odborník v oboru jistě pozná, že diagnóza FLT-3-ITD pozitivních pacientů se snadno provede PCR technikou a testy genomické DNA od pacientů s AML pomocí gelové elektroforézy. Viz AbuDuhier et al., British J. of Heamotology, Vol. 11, 190 - 195 (2000). Gen FLT-3 kóduje receptor tyrosinkinázy, který reguluje proliferaci a diferenciaci hematopoezních kmenových buněk. Levis publikuje, že tyto mutace konstitutivně aktivují receptor a zdá se, že souvisejí se špatnou reakcí na chemoterapii. Z důkazů vyplývá, že tato konstitutivní aktivace je leukemogenní, činící tento receptor potenciálním cílem pro specifickou terapii.

Je známo, že pacienti s ITD mutantní FLT-3 mají špatnou prognózu, vysokou míru relapsu a sníženou celkovou míru přežití po konvenčním léčení vzhledem k pacientům bez ITD mutantu. Současné terapie AML mají špatnou míru reakcí pacientů a špatné toxické profily. Terapie jsou obecně nespecifické a necílené vzhledem k zasaženým buňkám nebo mechanizmu, který řídí zhoubné bujení. Inhibice FLT-3, která zprostředkovává přežití buněk, a proliferačních signálů, by měla přímo zasáhnout leukemické buňky, inhibovat přenos signálu vyplývající z eliminace populace leukemických buněk.

Na základě potřeby zlepšené prognózy pacientů postižených ITD-AML vyvinuly zde uvedení vynálezci způsob léčení akutní myeloidní leukemie podáním účinného množství inhibitoru tyrosinkinázy obecného vzorce (I) nebo (II).

Podstata vynálezu

Podstatou předloženého vynálezu se týká použití indolinonové sloučeniny obecného vzorce (I):

substituent R je nezávisle H, OH, alkyl, aryl, cykloalkyl, heteroaryl, alkoxyskupina, heterocykl a aminoskupina;

každý substituent R¹ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, halogenu, arylu, alkoxyskupiny, halogenalkylu, halogenalkoxyskupiny, cykloalkylu, heteroarylu, heterocyklu, hydroxyskupiny, -C(O)-Rs, -NR9R10, -NRí>C(O)-Ri₂ a C(O)NR₉R₁₀;

• «

každý substituent R₂ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, arylu, heteroarylu, -C(O)-R₈ a SO2R, kde substituent R je alkyl, aryl, heteroaryl, NR9R10 nebo alkoxyskupina;

každý substituent R5 je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, halogenalkylu, cykloalkylu, heteroarylu, heterocyklu, hydroxyskupiny, -C(O)-R₈ a (CHR)_rRn;

X je O nebo S;

jje 0-1;

Pje 0-3;

qje 0-2;

r je 0-3;

substituent R₈ je vybrán ze skupiny sestávající z -OH, alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylu a heterocyklu;

substituenty R9 a Rio jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z H, alkylu, arylu, aminoalkylu, heteroarylu, cykloalkylu a heterocyklu, nebo substituenty R9 a R10 společně s N mohou vytvářet kruh, kde atomy kruhu jsou vybrány ze skupiny sestávající z C, N, O a S;

substituent Rn je vybrán ze skupiny sestávající z -OH, aminoskupiny, monosubstituované aminoskupiny, disubstituované aminoskupiny, alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylu a heterocyklu;

substituent Ri₂ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylu a heterocyklu;

Z je -OH;

-Oalkyl;

-NR3R4, kde substituenty R3 a R₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu, cykloalkylu a heterocyklu, nebo substituenty R3 a R₄ mohou být spojeny s N za vzniku kruhu, kde atomy kruhu jsou vybrány ze skupiny sestávající z CH₂, N, O a S nebo

kde Y je nezávisle CH2, O, N nebo S,

Q je C nebo N;

n je nezávisle 0-4; a m je 0-3; nebo její soli, pro přípravu léčiva pro léčení akutní myeloidní leukemie (AML) u pacientů, kteří jsou FLT-3-ITD pozitivní. Podle jednoho provedení je akutní myeloidní leukemie pozitivní na standardní typ FLT-3.

Ve výhodném provedení je substituent R1 je halogen a p je 1, přičemž halogen je s výhodou fluor nebo chlor, a dále kde Z je -NR₃R₄, kde substituenty R₃ a R₄ vytvářejí morfolinový kruh.

Podle dalšího výhodného provedení substituent R2 je methyl a q je 2, přičemž methyly jsou připojeny v poloze 3 a 5.

Podle dalšího výhodného provedení Z znamená:

kde každé Y je CH₂, každé n je 2, m je 0 a substituenty R₃ a R₄ vytvářejí morfolinový kruh.

Podle dalšího výhodného provedení uvedenou sloučeninou je sloučenina obecného vzorce (II):

přičemž substituent R5 je s výhodou H, substituent R₂ je s výhodou methyl, q je 2, kde methyly jsou připojeny v polohách 3 a 5.

V konkrétním provedení předloženého vynálezu je podávaná sloučenina vybrána ze skupiny sestávající z:

kde X je F, Cl, I nebo Br.

• · · « • · · • · * • · ·

V konkrétním provedení předloženého vynálezu je sloučenina obecného vzorce (I) vybrána ze skupiny sestávající z:

r

Mntičeuina S

Sloučenina 3

Sloučenina 4

Sloučenina 5 sloučenina W

Do podstaty vynálezu patří rovněž způsob in vitro detekce inhibice fosforylace FLT-3 a analýzy fosforylace v periferní krevní buňce nebo krevním lyzátu zahrnující kontaktování uvedené buňky nebo buňkového lyzátu s inhibičním množstvím sloučeniny definované výše.

Podle jednoho provedení FLT-3 je vybrán ze skupiny sestávající ze standardního typu FLT-3 a mutantního FLT-3. Podle jiného provedení FLT-3 je FLT-3-ITD.

Podle výhodného provedení fosforylace FLT-3 je detekována měřením zvýšené exprese VEGF proteinu.

Dalším aspektem předloženého vynálezu je způsob in vitro inhibice fosforylace FLT-3 v buňce nebo buňkovém lyzátu, který spočívá v tom, že zahrnuje kontaktování uvedené buňky nebo buňkového lyzátu s inhibičním množstvím sloučeniny definované v nároku 1.

Podle jednoho provedení FLT-3 je vybrán ze skupiny sestávající ze standardního typu FLT-3 a mutantního FLT-3. Podle jiného provedení FLT-3 je FLT-3-ITD.

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je uveden je FACS profil buněčné linie značené kaspázou 3. Na obrázku 2 je uveden Western blotting PARP štěpení ukazující, že FLT3-ITD mutantní buňky jsou susceptibilnější vůči apoptóze indukované sloučeninou 1 než standardní typ.

* · • 9 ♦ 9 ·

4ο • · · · · · « · · 9 99··

9999 Λ 9 9 9 · · · 9 · 9 9 9 9 9 9

9

9 9·

Na obrázku 3 je uveden Western blotting fosfotyrosinu po immunoprecipitaci FLT-3 ukazující, že sloučenina 1 inhibuje standardní typ i mutantní-ITD FLT-3.

Na obrázku 4a je uveden Western blotting fosfotyrosinu po immunoprecipitaci FLT-3 ukazující, že sloučenina 1 inhibuje fosforylaci FLT-3ITD na modelech xenoimplantátu.

Na obrázku 4b je uveden graf ukazující závislost velikosti nádoru na době po ošetření lékem.

Na obrázku 5 je uvedeno procentuální přežití po různém dávkování sloučeniny 1.

Detailní popis vynálezu

Sloučeniny obecného vzorce (I) a (II) jsou účinné při léčení pacientů s

AML.

Konkrétně jsou účinné při léčení pacientů s AML, kteří jsou FLT-3-ITD pozitivní. Navíc pacienti s diagnózou sarkomů, melanomů a pevných nádorů, kde patofyziologie ukazuje na spojitost FLT-3-ITD nebo FLT-3 se zhoubným bujením, mohou být léčeni podáním sloučenin obecného vzorce (I) nebo (II).

V rámci jednoho provedení se předložený vynález týká způsobu léčení akutní myeloidní leukemie (AML), vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství sloučeniny obecného vzorce (I):

kde (I) • ·

• ♦ · · · · · • · · · 9 ·· « ··· ···· · · · ♦ ·*« · ·«· • · · ♦ · · · · • · » ·» · · 9 substituent R je nezávisle H, OH, alkyl, aryl, cykloalkyl, heteroaryl, alkoxyskupina, heterocykl a aminoskupina;

každý substituent Ri je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, halogenu, arylu, alkoxyskupiny, halogenalkylu, halogenalkoxyskupiny, cykloalkylu, heteroarylu, heterocyklu, hydroxyskupiny, -C(O)-R₈, -NR9R10, -NR9C(O)-Ri₂ a C(0)NR₉Rio;

každý substituent R₂ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, arylu, heteroarylu, -C(O)-R₈ a SO₂R, kde substituent R je alkyl, aryl, heteroaryl, NR9R10 nebo alkoxyskupina;

každý substituent R₅ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, halogenalkylu, cykloalkylu, heteroarylu, heterocyklu, hydroxyskupiny, -C(O)-R₈ a (CHR)_rRn;

X je O nebo S;

jje 0-1;

Pje 0-3;

Qje 0-2;

rje 0-3;

substituent R₈ je vybrán ze skupiny sestávající z -OH, alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylu a heterocyklu;

substituenty R9 a R10 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z H, alkylu, arylu, aminoalkylu, heteroarylu, cykloalkylu a heterocyklu, nebo substituenty R9 a R10 společně s N mohou vytvářet kruh, kde atomy kruhu jsou vybrány ze skupiny sestávající z C, N, O a S;

substituent Rn je vybrán ze skupiny sestávající z -OH, aminoskupiny, monosubstituované aminoskupiny, disubstituované aminoskupiny, alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylu a heterocyklu;

substituent Rj₂ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylu a heterocyklu;

Z je -OH;

-Oalkyl;

-NR3R4, kde substituenty R3 a R4 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu, cykloalkylu a heterocyklu, nebo

4 ·

4444 4 4

4

4 4 4 4

4 4 4 4 ♦ 4

4 · substituenty R3 a R4 mohou být spojeny s N za vzniku kruhu, kde atomy kruhu jsou vybrány ze skupiny sestávající z CH2, N, O a S nebo

kde Y je nezávisle CH2, O, N nebo S,

Q je C nebo N;

n je nezávisle 0-4; a m je 0-3; nebo její soli, pacientovi při potřebě takového ošetření.

V alternativním provedení předloženého vynálezu je sloučenina obecného vzorce (I) podávána pacientovi při potřebě léčení AML za předpokladu, že sloučenina není 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-l//pyrrol-3-yl]-propionová kyselina.

V dalším provedení předloženého vynálezu zahrnuje terapeutický způsob podání účinného množství sloučeniny pacientovi s AML, kde sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající z:

(2-diethylamino-ethyl)-amidu 5-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 1);

(2-pyrrolidin-1 -yl-ethyl)-amidu 5-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 2);

(2-morfolin-4-yl-ethyl)-amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/Z-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 3);

(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu (<S')-5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 4);

(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu (R)-5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 5);

(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroκ

Ή9 9 9 • 999 • · · · · · • 9 9 · · 9 ♦ · 9 9 9 9 9· • ······ ·· • * · · 9 · · ♦ · •·· · 9 9 99 99 9

-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 6);

(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu 5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 7);

(2-ethylamino-ethyl)-amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 8);

3-[3,5-dimethyl-4-(4-morfolin-4-yl-piperidin-l-karbonyl)-l/7-pyrrol-2-methylen]-5-fhior-l,3-dihydro-indol-2-onu (sloučenina 9); a

3-[5-methyl-2-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-177-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny (sloučenina 10),

K lepšímu pochopení sloučenin obecného vzorce (I) a (II) použitelných ve způsobu podle předloženého vynálezu jsou uvedeny následující definice.

Termín alkyl se vztahuje na nasycený alifatický uhlovodíkový radikál zahrnují lineárních a rozvětvených řetězců majících 1 až 20 atomů uhlíku (vždy, když je uvedeno číslo; například 1-20 znamená v předloženém vynálezu, že skupina, v tomto případě alkylová skupina, může obsahovat 1 atom uhlíku, 2 atomy uhlíku, 3 atomy uhlíku, např. až 20 atomů uhlíku). Alkylové skupiny obsahující 1 až 4 atomy uhlíku jsou označovány jako nižší alkylové skupiny. Pokud uvedené nižší alkylové skupiny nemají substituenty, jsou označovány jako nesubstituované nižší alkylové skupiny. Výhodněji je alkylová skupina alkylová skupina o střední velikosti mající 1 až 10 atomů uhlíku, např. methyl, ethyl, propyl, 2-propyl, «-butyl, wo-butyl, Zerc-butyl, pentyl, atd. Nejvýhodněji nižší alkylová skupina mající 1 až 4 atomy uhlíku např. methyl, ethyl, propyl, 2-propyl, n-butyl, iso-butyl nebo terc-butyl, atd. Alkylová skupina může být substituovaná nebo nesubstituovaná. Pokud je substituovaná, pak je substituována výhodně jedním nebo více, výhodněji jedním až třemi, ještě výhodněji jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z halogenu, hydroxyskupiny, nesubstituované nižší alkoxyskupiny, arylu případně substituovaného jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, aryloxyskupiny případně substituované jednou nebo více skupinami, výhodně

1 9 9 9

911 jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, 6-ti členného heteroarylu majícího 1 až 3 atomy dusíku v kruhu, přičemž uhlíky v kruhu jsou případně substituované jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, 5-ti členného heteroarylu majícího 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, atomy uhlíku a dusíku ve skupině jsou případně substituované jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, 5-ti nebo 6-ti členné heterocyklické skupiny mající 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, atomy uhlíku a dusíku (pokud jsou přítomné) ve skupině jsou případně substituované jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, merkaptoskupiny, (nesubstituovaný nižší alkyl) thioskupiny, arylthioskupiny případně substituované jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo alkoxyskupiny, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, č>-karbamylu, V-karbamylu, ČMhiokarbamylu, V-thiokarbamylu, C-amidoskupiny, ÍV-amidoskupiny, nitroskupiny, TV-sulfonamidoskupiny, Ssulfonamidoskupiny, RS(O)-, RS(O)2-, -C(O)OR, RC(O)O- a -NR13R14, kde substituenty R13 a R14 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenmethylu, cykloalkylu, heterocyklu a arylu případně substituovaného jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny.

Výhodně je alkylová skupina substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, 5-ti nebo 6-ti členné heterocyklické skupiny mající 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, atomy uhlíku a dusíku (pokud jsou přítomné)

4Γ

9 9 9 9 9 · • · 9 9 9

9999 · 999

999 9999

9999 99 9

99 99 99 9 • · 9

9999 * 9 ve skupině jsou případně substituované jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, 5-ti členného heteroarylu majícího 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, atomy uhlíku a dusíku ve skupině jsou případně substituované jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, 6-ti členný heteroaryl mající 1 až 3 atomy dusíku v kruhu, uhlíky v kruhu jsou případně substituované jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, nebo NR13R14, kde substituenty R13 a R14 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku a alkylu. Ještě výhodněji je alkylová skupina substituována jedním nebo dvěma substituenty, které jsou nezávisle jeden na druhém hydroxyskupina, dimethylaminoskupina, ethylaminoskupina, diethylaminoskupina, dipropylaminoskupina, pyrrolidinoskupina, piperidinoskupina, morfolinoskupina, piperazinoskupina, 4-nižší alkylpiperazinoskupina, fenyl, imidazolyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, oxazolyl, triazinyl, atd.

Termín cykloalkyl se vztahuje na 3 až 8 členný zcela uhlíkový monocyklický kruh, zcela uhlíkový 5- ti/6-ti členný nebo 6-ti/6-ti členný kondenzovaný bicyklický kruh nebo multicyklický kondenzovaný kruh (kondenzovaný kruhový systém znamená, že každý kruh v systému si vlastní vzájemně sousední pár atomů uhlíku v systému), kde jeden nebo více kruhů může obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, ale žádný z kruhů nemá zcela konjugovaný π-elektronový systém.

Příklady cykloalkylových skupin, ale není to nikterak limitováno, zahrnují cyklopropan, cyklobutan, cyklopentan, cyklopenten, cyklohexan, cyklohexadien, adamantan, cykloheptan, cykloheptatrien, atd. Cykloalkylová skupina může být substituovaná nebo nesubstituovaná. Pokud je substituovaná, pak je výhodně jedním nebo více, výhodněji jedním nebo dvěma substituenty, nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, halogenu, hydroxyskupiny, nesubstituované nižší alkoxyskupiny, • · φ • · · • φ φ φ φ φ φ·ΦΦ • φ φ • φ φ arylu případně substituovaného jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, aryloxyskupiny případně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, 6-ti členného heteroarylu majícího 1 až 3 atomy dusíku v kruhu, uhlíky v kruhu jsou případně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, 5-ti členného heteroarylu majícího 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, atomy uhlíku a dusíku ve skupině jsou případně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, 5- nebo 6-ti členné heterocyklické skupiny mající 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, atomy uhlíku a dusíku (pokud jsou přítomné) ve skupině jsou případně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, merkaptoskupiny, (nesubstituovaný nižší alkyl) thioskupiny, arylthioskupiny případně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nesubstituovaný nižší alkyl nebo nesubstituované nižší alkoxyskupiny, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, (7-karbamylu, TV-karbamylu, Othiokarbamylu, /V-thiokarbamylu, C-amidoskupiny, /V-amidoskupiny, nitroskupiny, /V-sulfonamidoskupiny, 5-sulfonamidoskupiny, RS(O)-, RS(O)₂-, -C(O)OR,

RC(O)O- a -NR13R14 mají shora definovaný význam.

Termín alkenyl se vztahuje na shora definovanou nižší alkylovou skupinu sestávající z alespoň dvou atomů uhlíku a alespoň jedné dvojné vazby typu uhlíkuhlík. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-, 2- nebo 3-butenyl, atd.

Termín alkynyl se vztahuje na shora definovanou nižší alkylovou skupinu sestávající z alespoň dvou atomů uhlíku a alespoň jedné trojné vazby typu uhlík9 9 9

Fh

9 9 9 9 • 999 uhlík. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-, 2- nebo 3-butynyl, atd.

Termín aryl se vztahuje na zcela uhlíkové monocyklické nebo polycyklické skupiny s kondenzovaným kruhem (tzn. kruhy, které mají sousedící páry atomů uhlíku) mající 1 až 12 atomů uhlíku mající a zcela konjugovaný πelektronový systém. Příklady arylových skupin, ale není to nikterak limitováno, zahrnují fenyl, naftalenyl a anthracenyl. Arylová skupina může být substituovaná nebo nesubstituovaná. Pokud je substituovaná, pak je výhodně jednou nebo více, výhodněji jednou, dvěma nebo třemi, ještě výhodněji jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, halogenu, hydroxyskupiny, nesubstituované nižší alkoxyskupiny, merkaptoskupiny, (nesubstituovaný nižší alkyl) thioskupiny, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, O-karbamylu, A-karbamylu, č?-thiokarbamylu, A-thiokarbamylu, C-amidoskupiny, A-amidoskupiny, nitroskupiny, A-sulfonamidoskupiny, S-sulfonamidoskupiny, RS(O)-, RS(O)₂-, C(O)OR, RC(O)O- a -NR13R14, kde substituenty R_J3 a Rj₄ mají shora definovaný význam. Výhodně je arylová skupina případně substituovaná jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, kyanoskupiny, Aamidoskupiny, mono- nebo di-alkylaminoskupiny, karboxyskupiny nebo Asulfonamidoskupiny.

Termín heteroaryl se vztahuje na monocyklickou skupinu nebo skupinu s kondenzovaným kruhem (tzn. kruhy, které mají sousedící páry atomů) mající 5 až 12 atomů v kruhu a obsahující jeden, dva nebo tři heteroatomy v kruhu vybrané z N, O, nebo S, kde zbývající atomy kruhu jsou C a navíc mající zcela konjugovaný π-elektronový systém. Příklady nesubstituovaných heteroarylových skupin, ale není to nikterak limitováno, zahrnují pyrrol, furan, thiofen, imidazol, oxazol, thiazol, pyrazol, pyridin, pyrimidin, chinolin, izochinolin, purin a karbazol. Heteroarylová skupina může být substituovaná nebo nesubstituovaná. Pokud je substituovaná, pak je výhodně jednou nebo více, výhodněji jednou, dvěma nebo třemi, ještě výhodněji jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, halogenu, hydroxyskupiny, nesubstituované nižší alkoxyskupiny, ··«· 0 0 re • 0 0

0 0

0 0 0

0 0 0 0

0 0

0 merkaptoskupiny, (nesubstituovaný nižší alkyl) thioskupiny, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, (9-karbamylu, TV-karbamylu, (9-thiokarbamylu, V-thiokarbamylu, C-amidoskupiny, V-amidoskupiny, nitroskupiny, N-sulfonamidoskupiny, 5-sulfonamidoskupiny, RS(O)-, RS(O)2-, -C(O)OR, RC(O)O- a

-NRi₃R 14, kde substituenty R13 a R14 mají shora definovaný význam. Výhodně je heteroarylová skupina případně substituovaná jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, kyanoskupiny, Namidoskupiny, mono- nebo di-alkylaminoskupiny, karboxyskupiny nebo Nsulfonamidoskupiny.

Termín heterocykl se vztahuje na monocyklickou skupinu nebo skupinu s kondenzovaným kruhem mající v kruhu(zích) 5 až 9 atomů, ze kterých jeden nebo dva atomy v kruhu jsou heteroatomy vybrané z N, O nebo S(O)n (kde n celé číslo od 0 do 2) a zbývající atomy v kruhu jsou C. Kruhy mohou mít také jednu nebo více dvojných vazeb. Nicméně nemají zcela konjugovaný π-elektronový systém. Příklady nesubstituovaných heterocyklických skupin, ale není to nikterak limitováno, zahrnují pyrrolidinoskupinu, piperidinoskupinu, piperazinoskupinu, morfolinoskupinu, thiomorfolinoskupinu, homopiperazinoskupinu, atd. Heterocyklický kruh může být substituovaný nebo nesubstituovaný. Pokud je substituovaný, pak výhodně jednou nebo více, výhodněji jednou, dvěma nebo třemi, ještě výhodněji jednou nebo dvěma skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, halogenu, hydroxyskupiny, nesubstituované nižší alkoxyskupiny, merkaptoskupiny, (nesubstituovaný nižší alkyl) thioskupiny, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, (9-karbamylu, V-karbamylu, (9-thiokarbamylu, TV-thiokarbamylu, Camidoskupiny, V-amidoskupiny, nitroskupiny, V-sulfonamidoskupiny, Ssulfonamidoskupiny, RS(O)-, RS(O)2-, -C(O)OR, RC(O)O- a -NR13R14, kde substituenty R13 a R14 mají shora definovaný význam. Výhodně je heterocyklická skupina případně substituovaná jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, kyanoskupiny, /V-amidoskupiny, mono- nebo di-alkylaminoskupiny, karboxyskupiny nebo V-sulfonamidoskupiny.

• * · · · · · • · · · · • · ·· · ··· • · ··· · · · · • · · ♦ · · · • · · · · · · ···· · ·

Výhodně je heterocyklická skupina případně substituovaná jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, kyanoskupiny, Vamidoskupiny, mono- nebo di-alkylaminoskupiny, karboxyskupiny nebo Vsulfonamidoskupiny.

Termín hydroxyskupina se vztahuje na skupinu -OH.

Termín alkoxyskupina se vztahuje na skupinu -<9-(nesubstituovaný alkyl) i na skupinu -č>-(nesubstituovaný cykloalkyl). Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, např. methoxyskupinu, ethoxyskupinu, propoxyskupinu, butoxyskupinu, cyklopropyloxyskupinu, cyklobutyloxyskupinu, cyklopentyloxyskupinu, cyklohexyloxyskupinu, atd.

Termín aryloxyskupina se vztahuje na shora definovanou - O-arylovou i na

-O-heteroarylovou skupinu. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, fenoxyskupinu, pyridinyloxyskupinu, furanyloxyskupinu, thienyloxyskupinu, pyrimidinyloxyskupinu, pyrazinyloxyskupinu, atd. a jejich deriváty.

Termín merkaptoskupina se vztahuje na skupinu -SH.

Termín alkylthioskupina se vztahuje na skupinu -S-(nesubstituovaný alkyl) i na skupinu -S-(nesubstituovaný cykloalkyl). Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, např. methylthioskupinu, ethylthioskupinu, propylthioskupinu, butylthioskupinu, cyklopropylthioskupinu, cyklobutylthioskupinu, cyklopentylthioskupinu, cyklohexylthioskupinu, atd.

Termín arylthioskupina se vztahuje na shora definovanou -S-arylovou i na -S-heteroarylovou skupinu. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, fenylthioskupinu, pyridinylthioskupinu, furanylthioskupinu, thientylthioskupinu, pyrimidinylthioskupinu, atd. a jejich deriváty.

Termín acyl se vztahuje na skupinu -C(O)-R, kde substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenmethylu, nesubstituovaného cykloalkylu, arylu případně substituovaného jedním nebo více, výhodně jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenmethylu, nesubstituované nižší alkoxyskupiny, halogenu a -NR13R14

• · * 4 · · Φ · • · · · · · · • · · ···· · ··· ···· · · · · · · · · ··» • · · · · · · · • · ·· ·· ·· · skupin, heteroarylu (vázaný přes uhlík v kruhu) případně substituovaného jedním nebo více, výhodně jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, nesubstituované nižší alkoxyskupiny, halogenu a -NR13R14 skupin a heterocyklu (vázaného přes uhlík v kruhu) případně substituovaného jedním nebo více, výhodně jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenalkylu, nesubstituované nižší alkoxyskupiny, halogenu a -NR13R14 skupin. Reprezentativní acylové skupiny zahrnují, ale není to nikterak limitováno, acetyl, trifluoracetyl, benzoyl, atd.

Termín aldehyd se vztahuje na acylovou skupinu, ve které substituent R je atom vodíku.

Termín thioacyl se vztahuje na skupinu -C(S)-R, kde substituent R má shora definovaný význam.

Termín ester se vztahuje na skupinu -C(O)O-R, kde substituent R má shora definovaný význam s výjimkou toho, že substituent R nemůže být atom vodíku.

Termín acetyl se vztahuje na skupinu -0(0)0¾.

Termín halogen se vztahuje na fluor, chlor, brom nebo jod, výhodně fluor nebo chlor.

Termín trihalogenmethyl se vztahuje na skupinu -CX3, kde X je shora definovaný halogen.

Termín methylendioxyskupina se vztahuje na skupinu -OCH2O-, kde dva atomy kyslíku jsou připojeny k sousedním atomům uhlíku.

Termín ethylendioxyskupina se vztahuje na -OCH2CH2O-, kde dva atomy kyslíku jsou připojeny k sousedním atomům uhlíku.

Termín Á-sulfonamidoskupina se vztahuje na skupinu -S(O)₂NRi3Ri4, kde substituenty R13 a R14 mají shora definovaný význam.

Termín 'W-sulfonamidoskupina se vztahuje na skupinu -NRi3S(O)₂R, kde substituenty R13 a R14 mají shora definovaný význam.

Termín <9-karbamyl se vztahuje na skupinu -OC(O)NRi3Ri4, kde substituenty R13 a R14 mají shora definovaný význam.

Termín W-karbamyl se vztahuje na skupinu R0C(0)NRh-, kde substituenty R a R14 mají shora definovaný význam.

• ·

< · » « · • · · · • · · · • · · · • · · • · · · • · · · · • · ·

9

Termín O-thiokarbamyl se vztahuje na skupinu -OC(S)NRi3Ri4, kde substituenty R13 a R14 mají shora definovaný význam.

Termín 'W-thiokarbamyl se vztahuje na skupinu R0C(S)NRi4-, kde substituenty R a R14 mají shora definovaný význam.

Termín aminoskupina se vztahuje na skupinu -NR13R14, kde substituenty R13 a R14 jsou oba atomy vodíku.

Termín C-amidoskupina se vztahuje na skupinu -C(O)NRi3Ri4, kde substituenty R13 a R14 mají shora definovaný význam.

Termín W-amidoskupina se vztahuje na skupinu RC(O)NRh-, kde substituenty R a R14 mají shora definovaný význam.

Termín nitro se vztahuje na skupinu -NO2.

Termín halogenalkyl znamená nesubstituovaný alkyl, výhodně nesubstituovaný nižší alkyl mající shora definovaný význam, který je substituovaný jedním nebo více stejnými nebo rozdílnými atomy halogenu, např. CH₂C1, -CF₃, -CH2CF3, -CH2CCI3, atd.

Termín aralkyl znamená nesubstituovaný alkyl, výhodně nesubstituovaný nižší alkyl mající shora definovaný význam, který je substituovaný arylovou skupinou mající shora definovaný význam, např. -CFbfenyl, -(CFL^fenyl, (CFhfifenyl, CH3CH(CH3)CH2fenyl, atd. a jejich deriváty.

Termín heteroaralkyl znamená shora definovaný nesubstituovaný alkyl, výhodně nesubstituovaný nižší alkyl, který je substituován heteroarylovou skupinou, např. -CFLpyridinylem, -(CřLhpyrimidinylem, -(CFLfiimidazolylem, atd. a jejich deriváty.

Termín monoalkylaminoskupina znamená radikál -NHR', kde substituent R' je shora definovaná nesubstituovaná alkylová nebo nesubstituovaná cykloalkylová skupina, např. methylaminoskupina, (l-methylethyl)aminoskupina, cyklohexylaminoskupina, atd.

Termín dialkylamino znamená radikál -NR'R', kde každý substituent R'je nezávisle nesubstituovaná alkylová nebo nesubstituovaná cykloalkylová skupina mající shora definovaný význam, např. dimethylaminoskupina, diethylaminoskupina, (1 -methylethyl)-ethylaminoskupina, cyklohexylmethylaminoskupina, cyklopentylmethylaminoskupina, atd.

2-222

9« 99 99 9 • 9 9 9 9 9

9999 9 999

9« 99 9 9 9 9 *««

9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 * 9 9

Termín kyanoalkyl znamená nesubstituovaný alkyl, výhodně nesubstituovaný nižší alkyl mající shora definovaný význam, který je substituován 1 nebo 2 kyanoskupinami.

Termín případný nebo případně znamená, že následně popsané případy nebo okolnosti se mohou, ale nemusí vyskytovat, a že popis zahrnuje situace, ve kterých případ nebo okolnost se nevyskytuje, a situace, ve kterých se případ nebo okolnost vyskytuje. Například termín heterocyklická skupina případně substituovaná alkylovou skupinou znamená, že alkyl může, ale i nemusí být přítomen, a popis zahrnuje situace, ve kterých heterocyklická skupina je substituována alkylovou skupinou, a situace, ve kterých heterocyklická skupina není substituována akylovou skupinou.

Termín farmaceutický přípravek se vztahuje na směs jedné nebo více sloučenin popsaných v předloženém vynálezu nebo jejich fyziologicky/farmaceuticky přijatelných solí nebo proléčiv s dalšími chemickými složkami, např. fyziologicky/farmaceuticky přijatelné nosiče a excipienty. Účel farmaceutického přípravku je usnadnit podání sloučeniny do organizmu.

Sloučenina obecného vzorce (I) nebo (II) může také fungovat jako proléčivo. Termín proléčivo se vztahuje na agens, které je konvertováno na mateřské léčivo in vivo. Proléčiva jsou často použitelná, jelikož v některých situacích může být jejich podání jednodušší než podání mateřského léku. Mohou být biologicky dostupná perorálním podáním, zatímco mateřské léčivo nikoliv. Proléčivo může mít také zlepšenou rozpustnost ve farmaceutických přípravcích než mateřské léčivo. Příkladem, nikoliv však limitujícím, proléčiva může být sloučenina podle předloženého vynálezu, která je podávána jako (ester) k usnadnění prostupu přes buněčnou membránu, kde rozpustnost ve vodě narušuje mobilitu, ale poté, jakmile vstoupí do buňky, kde rozpustnost ve vodě je výhodou, je metabolicky hydrolyzována na karboxylovou kyselinu, aktivní entitu.

Dalším příkladem proléčiva může být krátký polypeptid například, ale není to nikterak limitováno, polypeptid o 2 - 10 aminokyselinách, vázaný přes koncovou aminoskupinu na karboxyskupinu sloučeniny podle předloženého vynálezu, kde polypeptid je hydrolyzován nebo metabolizován in vivo k uvolnění aktivní molekuly. Proléčiva sloučeniny obecného vzorce (I) nebo (II) spadají do rozsahu předloženého vynálezu.

• · φφφφ • φ · φφφ • φ φφφ φ φφφ φ · φ φ φφφ φ φφφφ φ φφφφ φφφ φ φφ φφ φφ φ

i.7

Dále by měla být sloučenina obecného vzorce (I) nebo (II) metabolizována enzymy v těle organizmu, např. lidském, k vytvoření metabolitu, který může modulovat aktivitu proteinkináz. Tyto metabolity spadají rovněž do předloženého vynálezu.

Termín fyziologicky/farmaceuticky přijatelný nosič, jak je používán v předloženém vynálezu, se vztahuje na nosič nebo ředící roztok, který nezpůsobuje výraznou iritaci organizmu a neruší biologickou aktivitu a vlastnosti podávané sloučeniny.

Termín farmaceuticky přijatelný excipient se vztahuje na inertní látku přidávanou do farmaceutického přípravku k dalšímu usnadnění podání sloučeniny. Příklady excipientů, které nemají nikterak limitovat, zahrnují uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry a typy škrobu, deriváty celulózy, želatinu, rostlinné oleje a polyethylenglykoly.

Termín farmaceuticky přijatelná sůl se vztahuje na ty soli, které si uchovávají biologickou účinnost a vlastnosti mateřské sloučeniny. Tyto soli zahrnují:

(1) adiční sůl s kyselinou, která se připraví reakcí volné báze mateřské sloučeniny s anorganickými kyselinami, např. kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina dusičná, kyselina fosforečná, kyselina sírová a kyselina chloristá, atd. nebo s organickými kyselinami, např. kyselina octová, kyselina oxalová, (D) nebo (L) kyselina jablečná, kyselina maleinová, kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová, /7-toluensulfonová kyselina, salicylová kyselina, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina sukcinová nebo kyselina malonová, atd. výhodně kyselina chlorovodíková nebo kyselina (L)-jablečná, např. L-malát (2-diethylaminoethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny; nebo (2) soli vytvořené v případě, kdy kyselý proton nacházející se v mateřské sloučenině je nahrazen iontem kovu, např. iont alkalického kovu, iont kovu alkalických zemin nebo iont hliníku; nebo se koordinuje s organickou bází, např. ethanolaminem, diethanolaminem, triethanolaminem, tromethaminem, Nmethylglukaminem, atd.

Termín způsob se vztahuje na způsoby, prostředky, techniky a postupy, které jsou buď známé nebo se dají snadno vyvinout ze známých způsobů,

prostředků, technik a postupů odborníky v oboru chemických, farmaceutických, biologických, biochemických a lékařských věd.

Termín in vivo se vztahuje na postupy prováděné v živém organizmu například, ale není to nikterak limitováno, myši, krysy a králíci.

Termín ošetření a léčení se vztahuje na způsob zmírnění nebo odstranění akutní myeloidní leukemie, jiných leukémií, rakovin souvisejících s FLT-3 a/nebo jejich doprovodných symptomů. Leukémie, které jsou léčitelné sloučeninami obecného vzorce (I) nebo (II), zahrnují akutní myeloidní leukémii (AML), akutní lymfocytární leukémii (ALL), chronickou myeloidní leukémii (CLL), chronickou myeloidní leukémii (CML), myelodysplastický syndrom (MDS), akutní myelomonoblastickou leukémii (AMMOL) a akutní monoblastickou leukémii (AMOL). Navíc další typy rakovin související s FLT-3 zahrnují, ale není to nikterak limitováno, lymfomy, karcinomy, myelomy, rakoviny získané z neurálních crist, sarkomy a gliomy mohou být léčitelné podáním sloučeniny obecného vzorce (I) nebo (II). Termín ošetření znamená zjednodušeně, že délka života jednotlivce zasaženého AML nebo rakovinou související s FLT-3 bude prodloužena, nebo že jeden nebo více symptomů onemocnění bude redukován.

Termín rakovina související s FLT-3 zahrnuje, ale není to nikterak limitováno, akutní myeloidní leukémii (AML), akutní lymfocytární leukémii (ALL), chronickou myeloidní leukémii (CLL), chronickou myeloidní leukémii (CML), myelodysplastický syndrom (MDS), akutní myelomonoblastickou leukémii (AMMOL) a akutní monoblastickou leukémii (AMOL).

Termín pacient se vztahuje na kteroukoliv živou entitu mající alespoň jednu buňku. Živoucí organizmus může být například tak jednoduchý jako je eukaryotická buňka nebo tak komplexní jako je savec, včetně lidí.

Termín terapeuticky účinné množství se vztahuje na množství podávané sloučeniny, které zabraňuje, zmírňuje, zlepšuje nebo zbavuje do jisté míry jednoho nebo více symptomů onemocnění, které je ošetřováno. S ohledem na ošetření rakoviny se terapeuticky účinné množství vztahuje na množství, které má účinek na:

(1) snížení velikosti nádoru;

• · • 4 4 • 4 · • 444 « ·

2/- ...... ·· ··

3é(2) inhibici (tzn. zpomalení do určité míry, výhodně zastavení) metastáze nádoru;

(3) inhibici do jisté míry (tzn. zpomalení do určité míry, výhodně zastavení) růstu nádoru, (4) snížení počtu blastů, a/nebo (5) zbavení do určité míry (nebo výhodně eliminaci) jednoho nebo více symptomů spojených s rakovinou.

Podání a farmaceutický přípravek

Nárokované způsoby zahrnují podání sloučeniny obecného vzorce (I) nebo (II) nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli lidskému pacientovi. Alternativně mohou být sloučeniny obecného vzorce (I) nebo (II) ve farmaceutických přípravcích, ve kterých jsou smíchány s vhodnými nosiči nebo excipienty(tem). Techniky přípravy a podání sloučenin mohou být nalezeny v „Remington's Pharmacological Sciences“, Mack Publishing Co., Easton, PA, poslední vydání.

Termín podání, jak je používán v předloženém vynálezu, se vztahuje na dodání sloučeniny obecného vzorce (I) nebo (II) nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu obecného vzorce (I) nebo (II) nebo její farmaceuticky přijatelné soli do organizmu za účelem léčení AML.

Vhodné způsoby podání mohou zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, perorální, rektální, transmukózní nebo intestinální podání nebo intramuskulární, subkutánní, intramedulární, intratekální, přímé intraventrikulární, intravenózní, intravitreální, intraperitoneální, intranazální nebo intraokulární injekce. Výhodné způsoby podání jsou perorální a parenterální.

Alternativně lze podávat sloučeninu spíše místním než systémovým způsobem, např. injekcí sloučeniny přímo do pevného nádoru, často v depotní formě nebo formě s trvalým uvolňováním.

Dále lze podávat léčivo v cíleně směrovaných lékových systémech, např. v lipozómu potaženém protilátkou specifickou vůči nádoru. Lipozómy budou zaměřeny a selektivně vychytávány nádorem.

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu mohou být vyrobeny procesy, které jsou z dosavadní techniky známé, např. standardním mícháním, rozpouštěním, granulací, výrobou dražé, leštěním, emulzifikací, opouzdřením (enkapsulací), zachytáváním a lyofilizací.

Farmaceutické přípravky pro použití podle předloženého vynálezu mohou být připraveny standardním způsobem pomocí jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosičů obsahujících excipienty a pomocné látky, které usnadňují zpracování aktivních sloučenin do přípravku, který může být používán farmaceuticky. Vlastní formulace je závislá na vybraném způsobu podání.

Pro injekce mohou být agens podle předloženého vynálezu připraveny ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, např. Hanksův roztok, Ringerův roztok nebo pufru na bázi fyziologického roztoku. Pro transmukózní podání jsou ve formulaci používány takové penetrátory, které jsou vhodné pro překonání dané bariéry. Tyto penetrátory jsou v oboru obecně známy.

Pro perorální podání mohou být sloučeniny snadno připraveny spojením aktivních sloučenin se standardními farmaceuticky přijatelnými nosiči známými ze stavu techniky. Tyto nosiče umožňují připravit sloučeniny podle předloženého vynálezu ve formě tablet, pilulek, dražé, kapslí, roztoků, gelů, sirupů, kašovitých směsí, suspenzí, atd., pro perorální požití léku pacientem. Farmaceutické preparáty pro perorální použití mohou být připraveny spojením aktivní sloučeniny s tuhým excipientem, případně rozemletím výsledné směsi a zpracováním směsi granulí, čímž po přidání vhodných pomocných látek, pokud je třeba, lze získat tablety nebo dražé. Vhodné excipienty jsou zejména plnidla, např. cukry, včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu; celulózové preparáty, např. kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob a další materiály jako například želatina, tragant, methyl-celulóza, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP). Pokud je třeba, mohou být přidány agens zajišťující rozpad tablety po požití, např. zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová nebo jejich soli. Může být používána sůl jako například alginát sodný.

Jádra dražé jsou opatřena vhodnými potahy. Pro tento účel mohou být používány koncentrované roztoky cukrů, které mohou případně obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol

a/nebo oxid titaničitý, roztoky šelaku a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Organická barviva nebo pigmenty mohou být přidány do tablet nebo potahů dražé k identifikaci nebo charakterizaci rozdílných kombinací dávek aktivní sloučeniny.

Farmaceutické preparáty, které mohou být používány perorálně, zahrnují kapsle typu „push-fit“ vyrobené ze želatiny, jakož i měkké, uzavřené kapsle vyrobené ze želatiny a změkčovadla, např. glycerol nebo sorbitol. Kapsle typu „push-fit“ mohou obsahovat aktivní složky v příměsi s plnidlem, např. laktózou, pojivý, např. škroby, a/nebo lubrikanty, např. talek nebo stearát hořečnatý, a případně stabilizátory. V měkkých kapslích mohou být aktivní sloučeniny rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných roztocích, např. mastných olejích, minerálním oleji nebo tekutých polyethylenglykolech. Navíc mohou být přidávány stabilizátory.

Farmaceutické přípravky, které mohou být používány, zahrnují tvrdé želatinové kapsle. Nelimitujícím příkladem je sloučenina 1 ve formě kapsle jako peorálního léčiva s 50 a 200 mg dávkami. Obě formy dávky jsou připraveny ze stejných granulí jejich naplněním do různých velikostí tvrdých želatinových kapslí, velikost 3 pro 50 mg kapsli a velikost 0 pro 200 mg kapsli.

Kapsle mohou být baleny do hnědého skla nebo plastických lahviček kvůli ochraně aktivní sloučeniny před světlem. Kontejnery obsahující aktivní sloučeninu ve formě kapsle musí být skladovány při kontrolované pokojové teplotě (15-30°C).

Pro podání inhalací jsou sloučeniny podle předloženého vynálezu standardně podávány ve formě aerosolového spreje v rozprašovači nebo v balení se stlačeným obsahem s vhodným propelantem, například, ale není to nikterak limitováno, dichlordifluormethanem, trichlorfluormethanem, dichlortetrafluorethanem nebo oxidem uhličitým. V případě stlačeného aerosolu může být pro jednotkovou dávku využit „ventil“, který umožní uvolnění přesného množství látky. Kapsle a catridge, např. želatina, pro použití v inhalačním přístroji nebo insuflatoru mohou být připraveny způsobem, při kterém je spojena prášková směs sloučeniny a vhodná prášková báze, např. laktóza nebo škrob.

Sloučeniny mohou být připraveny pro parenterální podání, např. injekcí bolusu nebo kontinuální infuzí. Formulace pro injekce mohou být v jednotkových dávkovačích formách, např. v ampulích nebo v obalech pro více dávek, s přidanou • · • · • · · · « · · · u

• · · 9« · konzervační látkou. Přípravky mohou být také ve formách suspenze, roztoků nebo emulzí v olejových nebo vodných nosičích a mohou obsahovat pomocné agens, např. suspendační, stabilizační a/nebo dispergační prostředky.

Farmaceutické přípravky pro parenterální podání zahrnují vodné roztoky ve vodě rozpustné formy, např. bez omezení sůl aktivní sloučeniny. Dále mohou být suspenze aktivních sloučenin připraveny v lipofilním nosiči. Vhodné lipofilní nosiče zahrnují mastné oleje, např. sezamový olej, estery syntetických mastných kyselin, např. ethyl-oleát a triglyceridy, nebo materiály jako například lipozómy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, např. sodná sůl karboxymethyl-celulózy, sorbitol nebo dextran. Případně suspenze mohou také obsahovat vhodné stabilizátory nebo agens, které zvyšují rozpustnost sloučenin, čímž umožňují připravit vysoce koncentrované roztoky.

Nebo může být aktivní složka ve formě prášku určeného ke spojení s vhodným nosičem, např. sterilní voda bez pyrogenu.

Sloučeniny mohou být také připraveny jako rektální přípravky, např. čípky nebo retenční klyzma, obsahující standardní čípkové báze, např. kakaové máslo nebo jiné glyceridy.

Kromě výše uvedených formulací, mohou být také připraveny sloučeniny ve formě depotních preparátů. Tyto formulace s dlouhou dobou účinku mohou být podávány implantací (např. subkutánní nebo intramuskulární podání) nebo intramuskulární injekcí. Pro tento účel může být připravena sloučenina s vhodnými polymerními nebo hydrofóbními materiály (např. v emulzi s farmaceuticky přijatelným olejem) nebo ionexy nebo jako špatně rozpustný derivát, např. bez omezení špatně rozpustná sůl.

Nelimitující příklad farmaceutického nosiče pro hydrofóbní sloučeniny podle předloženého vynálezu je systém spolurozpouštědel obsahující benzylalkohol, nepolární surfaktant neb organický polymer mísitelný s vodou a vodná fáze, např. systém spolurozpouštědel VPD. VPD je roztok 3 % obj. hmotnosti benzylalkoholu, 8 % obj. hmotnosti nepolárního surfaktantového polysorbátu 80 a 65 % obj. hmotnosti polyethylenglykolu 300 doplněný na konečný objem absolutním ethanolem. Systém spolurozpouštědel VPD (VPD:D5W) se sestává z VPD zředěného 1:1 5% dextrosou ve vodném roztoku. Tento systém spolurozpouštědel dobře rozpouští hydrofóbní sloučeniny a sám má • ·

•3Ό po systémovém podání nízkou toxicitu. Přirozeně mohou být podíly systému spolurozpouštědel značně měněny, nicméně tak, aby se zachovaly charakteristické rysy jeho rozpustnosti a toxicity. Jednotlivé složky systému spolurozpouštědel mohou být měněny: např. místo polysorbátu 80 mohou být používány další nepolární surfaktanty o nízké toxicitě; velikost částic polyethylenglykolu může být různá; polyethylenglykol může být nahrazen dalšími biokompatibilními polymery, např. polyvinylpyrrolidonem; a další cukry nebo polysacharidy mohou nahradit dextrózu.

Alternativně může být pro hydrofobní farmaceutické sloučeniny použit jiný systém podání. Pro hydrofobní léčiva jsou standardními příklady přenašečů a nosičů využívaných při tomto způsobu lipozómy a emulze. Mohou být používána určitá organická rozpouštědla, např. dimethylsulfoxid, nicméně obvykle na úkor větší toxicity. Navíc sloučeniny mohou být podávány systémem postupného uvolňování, např. semipermeabilními matricemi tuhých hydrofóbních polymerů obsahujících terapeutické agens. V této technice se používají různé látky s postupným uvolňováním a odborníci v oboru je jistě dobře znají. Kapsle s postupným uvolňováním mohou v závislosti na svém chemickém charakteru uvolňovat sloučeniny po dobu několika týdnů až 100 dnů. V závislosti na chemickém charakteru a biologické stabilitě terapeutického reagens mohou být používány další strategie pro stabilizaci proteinu.

Farmaceutické přípravky také mohou obsahovat vhodnou pevnou látku nebo nosiče gelové fázové nosiče nebo excipienty. Příklady takových nosičů nebo excipientů zahrnují, ale není do nikterak limitováno, uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, např. polyethylenglykoly.

Příklady formulací pro použití v předloženém vynálezu jsou uvedeny v tabulkách 1 - 3:

44Tabulka 1

Složení tvrdých želatinových kapslí (2-diethylamino-ethyl)-amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2- dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny
Název složky	Koncentrace v granulací (hmotn. %)	Množství v 50 mg kapsli (mg)	Množství v 75 mg kapsli (mg)	Množství v 200 mg kapsli (mg)
API	65,0	50,0	75,0	200,0
Mannitol	23,5	18,1	27,2	72,4
Sodná sůl kroskaramelózy®	6,0	4,6	6,9	18,4
Povidon (K-25)	5,0	3,8	5,7	15,2
Stearát hořečnatý	0,5	0,38	0,57	1,52
kapsle	-	Velikost 1	Velikost 3	Velikost 0

Tabulka 2

Složení tvrdých želatinových kapslí L-malátu (2-diethylamino-ethyl)-amidu 5-(5-fluor-2- oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny
Název složky	Koncentrace v (hmotn. %)	granulací	Množství v 50 mg kapsli (mg)
API	75,0	66,800c
Mannitol	13,5	12,024
Sodná sůl kroskaramelózyb	6,0	5,344
Povidon (K-25)	5,0	4,453
Stearát hořečnatý	0,5	1,445
kapsle	-	Velikost 3

• · • ···

Tabulka 3

Složení tvrdých želatinových kapslí L-malátu (2-diethylamino-ethyl)-amidu 5-(5-fluor-2- oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny
Název složky	Koncentrace v granulaci (hmotn. %)	Množství v 25 mg kapsli (mg)	Množství v 50 mg kapsli (mg)	Množství v 100 mg kapsli (mg)
API	40,0	33,400υ	66,800c	200,0B
Mannitol	47,5	39,663	79,326	158,652
Sodná sůl kroskaramelózy5	6,0	5,010	10,020	20,04
Povidon (K-25)	5,0	4,175	8,350	16,700
Stearát hořečnatý	1,5	1,252	2,504	5,008
kapsle	-	Velikost 3	Velikost 1	Velikost 0

^A množství léku pro dávku bude upraveno tak, aby mělo 100 % množství uvedeného pro kapsli. Vhodné upravení bude provedeno pro množství mannitolu k zachování stejné plnící hmotnosti pro každé množství (velikost) dávky.

^B kvantitativní ekvivalent k 100 mg volné báze.

^c kvantitativní ekvivalent k 50 mg volné báze.

^D kvantitativní ekvivalent k 25 mg volné báze.

^E polovina intragranulární, polovina extragranulární.

což lze nalézt v přihlášce vynálezu US č. 10/237,966, podané 10.září 2002, která je zde ve své celistvosti uvedena jako odkaz.

Velký počet sloučenin obecného vzorce (I) a (II) může být poskytnut ve formě farmaceuticky přijatelných solí, kde sloučeniny mohou tvořit negativně nebo pozitivně nabité zbytky. Příklady solí, ve kterých sloučeniny vytvářejí pozitivně nabité zbytky zahrnují, ale není to nikterak limitováno, kvarterní amonné soli, soli, např. hydrochlorid, sulfát, uhličitan, laktát, tartrát, malát, maleát, sukcinát, kde atom dusíku kvarterní amonné skupiny je dusík vybrané /

• · • · ·· ·

ϊν ........

sloučeniny podle předloženého vynálezu, který reagoval s příslušnou solí. Soli, ve kterých sloučeniny podle předloženého vynálezu vytvářejí negativně nabité zbytky zahrnují, ale není to nikterak limitováno, sodné, draselné, vápenaté a hořečnaté soli vzniklé reakcí skupiny karboxylové kyseliny ve sloučenině s příslušnou bází (např. hydroxid sodný (NaOH), hydroxid draselný (KOH), hydroxid vápenatý (Ca(OH)₂), atd.)

Farmaceutické přípravky vhodné pro použití v předloženém vynálezu zahrnují přípravky, ve kterých jsou aktivní složky obsaženy v množství, jenž je dostatečné k dosažení určeného záměru, např. léčení AML u FLT-3-ITD pozitivních pacientů.

Konkrétněji znamená termín terapeuticky účinné množství sloučeniny takové množství sloučeniny, které je účinné k prevenci, zmírnění nebo zlepšení symptomů onemocnění nebo k prodloužení přežití subjektu, jenž je ošetřován.

Stanovení terapeuticky účinného množství spadá do schopností odborníků v oboru, zejména pak v závislosti na zde uvedených skutečnostech.

Pro jakoukoliv sloučeninu používanou ve způsobu podle předloženého vynálezu může být terapeuticky účinná dávka nejprve stanovena podle testů na buněčných kulturách. Například dávka může být testována na buněčných a zvířecích modelech k získání oběhové koncentrace, která zahrnuje hodnotu IC50 stanovenou podle testů na buněčných kulturách (tzn. koncentrace testované sloučeniny, která je potřebná k dosažení 50% inhibice fosforylace FLT-3). Tyto informace mohou být používány u lidských subjektů k přesnějšímu stanovení účinných dávek.

Toxicita a terapeutická účinnost zde popsaných sloučenin může být stanovena standardními farmaceutickými postupy na buněčných kulturách nebo experimentálních zvířatech, např. stanovením hodnoty IC50 a LD50 pro konkrétní sloučeninu, kde LD50 je koncentrace sloučeniny, která způsobí 50% úmrtnost. Data získaná z testů na buněčné kultuře a zvířecích studií mohou být používána při formulování rozmezí dávky k použití na lidech. Míra dávky se může lišit v závislosti na používané dávkovači formě a způsobu podání. Přesná formulace, způsob podání a dávka může být vybrána konkrétním lékařem v závislosti na stavu pacienta, (viz Fingl et al., 1975, v „Pharmacological Basis of Therapeutics“, Ch. 1 pl)· • ·

34K dosažení plazmové hladiny aktivních species, které jsou dostatečné k udržení účinků modulujících kinázu nebo minimální účinné koncentrace (MEC) může být množství dávky a interval individuálně upraven. Hodnota MEC bude pro každou sloučeninu jiná, nicméně může být stanovena podle in vitro údajů; např. koncentrace potřebná k dosažení 50-90% inhibice kinázy pomocí testů popsaných v předloženém vynálezu. Rozsahy dávek potřebné k dosažení MEC budou záviset na jednotlivých charakteristikách a způsobu podání. Nicméně ke stanovení plazmových koncentrací může být používána HPLC nebo biotesty.

Rozsahy dávky mohou být také stanoveny pomocí hodnoty MEC. Sloučeniny by měly být podávány podle režimu, při kterém se zachovají plazmové hladiny nad hodnotou MEC v průběhu 10-90% doby, výhodně mezi 30-90% a nejvýhodněji 50-90%.

V současné době se mohou terapeuticky účinná množství sloučenin obecného vzorce (I) nebo (II) pohybovat v rozmezí přibližně od 25 mg/m² do 1500 mg/m² denně; výhodně asi 3 mg/m² denně. Ještě výhodněji 50 mg/qm qd až 400 mq/qd.

V případech místního podání nebo selektivního vychytávání nemusí účinná místní koncentrace léku odpovídat plazmové koncentraci a k určení správného rozmezí dávek a intervalu mohou být používány postupy známé v oboru.

Množství podávaného přípravku bude samozřejmě záviset na ošetřovaném subjektu, závažnosti nemoci, způsobu podání, posouzení ošetřujícího lékaře, atd.

Rovněž je zamýšleno, aby způsob podle předloženého vynálezu mohl být používán v kombinaci s dalšími rakovinovými terapiemi, včetně ozařování a transplantace kostní dřeně.

Nakonec je zamýšleno, aby kombinace sloučeniny podle předloženého vynálezu byla účinná v kombinaci s Endostatin©, Gleevec©, Camptosar©, Herceptin©, Imclone C225©, mitoxantronem, daunorubicinem, cytarabinem, methotrexatem, vinkristinem,

6-thioguainem, 6-merkaptopurinem nebo paklitaxelem pro léčení pevných rakovin nebo leukémií, včetně, ale není to nikterak limitováno, AML. Dále způsob podle předloženého vynálezu může zahrnovat kombinovanou terapii s antiangiogenním agens, například, ale není to nikterak limitováno, inhibitory cyklooxygenázy, např. celecoxib.

• · • · · • ···

Pro kombinované terapie a farmaceutické přípravky popsané v předloženém vynálezu mohou být odborníky v oboru stanoveny účinná množství sloučeniny podle předloženého vynálezu a chemoterapeutických nebo jiných agens použitelných pro inhibici abnormálního buněčného růstu (např. jiná antiproliferativní agens, antiangiogenní agens, inhibitor přenosu signálu nebo posilovače imunitního systému) na základě účinných množství sloučenin popsaných v předloženém vynálezu a sloučenin známých nebo popsaných pro chemoterapeutická nebo jiná agens. Formulace a způsob provedení takových terapií a přípravek může založen na informace popsané v předloženém vynálezu pro přípravky a terapie zahrnující sloučeninu podle předloženého vynálezu jako jedinou aktivní agens a na informaci poskytované pro chemoterapeutické a jiné agens v kombinaci se zde popsanými údaji.

Příklad provedení vynálezu

Obecné syntézy

Následující obecná metodologie může být používána k přípravě sloučenin podle předloženého vynálezu.

Vhodně substituovaný 2-oxindol (1 ekviv.), vhodně substituovaný aldehyd (1,2 ekviv.) a báze (0,1 ekviv.) se smíchají v rozpouštědle (1-2 ml/mmol 2oxindol) a směs se pak zahřívá od asi 2 hodin do asi 12 hodin. Po ochlazení se vzniklý precipitát filtruje, promyje studeným ethanolem nebo etherem a suší za vakua, čímž se získá pevný produkt. Pokud nevznikne precipitát, tak se reakční směs koncentruje a zbytek se trituruje směsí dichlormethanu a etheru, čímž se získá pevný podíl, který se spojí filtrací a suší. Produkt může být dále purifikován a chromatografován.

Báze může být organického nebo anorganického původu. Pokud se používá organická báze, pak je to výhodně báze obsahující dusík. Příklady organických bází obsahujících dusík zahrnují, ale není to nikterak limitováno, diizopropylamin, trimethylamin, triethylamin, anilin, pyridin, l,8-diazabicyklo[5.4.1]undec-7-en, pyrrolidin a piperidin.

Příklady anorganických bází, ale není to nikterak limitováno, zahrnují amoniak, hydroxidy alkalického kovu nebo kovů alkalických zemin, fosfáty, ·· 4

4 4

4444 4 4

4 «

4 «

44 ar • 4 ·

4 4 4

4 4444

4 4

4 uhličitany, hydrogenuhličitany, bisulfáty a amidy. Alkalické kovy zahrnují, ale není to nikterak limitováno, lithium, sodík, a draslík, a kovy alkalických zemin zahrnují vápník, hořčík a barium.

Ve výhodném provedení předloženého vynálezu, pokud je rozpouštědlo protické, např. voda nebo alkohol, je báze anorganická báze s alkalickým kovem nebo kovem alkalické zeminy, výhodně hydroxid alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy.

Z hlediska obecně platných principů organické syntézy a zde uvedených údajů bude odborníkům v oboru zřejmé, která báze by měla být pro zamýšlenou reakci nej vhodnější.

Rozpouštědlo, ve kterém se reakce provádí může být protické nebo aprotické, výhodně protické rozpouštědlo. Termín protické rozpouštědlo je rozpouštědlo, které má atom vodíku(ů) kovalentně vázaný k atomům kyslíku nebo dusíku, díky čemuž je atom vodíku značně kyselejší, a tudíž schopný vodíkových můstků se solutem. Příklady protických rozpouštědel zahrnují, ale není to nikterak limitováno, vodu a alkoholy.

Termín aprotické rozpouštědlo, které může být polární nebo nepolární, v jakémkoliv případě neobsahuje kyselé atomy vodíku, a tudíž není schopné vodíkových můstků se solutem. Příklady nepolárních aprotických rozpouštědel, ale není to nikterak limitováno, zahrnují pentan, hexan, benzen, toluen, methylenchlorid a tetrachlormethan. Příklady polárních aprotických rozpouštědel zahrnují chloroform, tetrahydrofuran, dimethylsulfoxid a dimethylformamid.

Ve výhodném provedení předloženého vynálezu je rozpouštědlo protické rozpouštědlo, výhodně voda nebo alkohol, např. ethanol.

Reakce se provádí při teplotách, které jsou větší než pokojová teplota. Teplota se obecně pohybuje v rozmezí od asi 30°C do asi 150°C, výhodně od asi 80°C do asi 100°C, nejvýhodněji od asi 75°C do asi 85°C, což je teplota varu ethanolu. Termín asi znamená, že rozmezí teploty se výhodně pohybuje v rozmezí 10°C okolo uvedené teploty, výhodněji v rozmezí 5°C okolo uvedené teploty, nejvýhodněji 2°C okolo uvedené teploty. Například termín asi 75°C znamená 75°C ± 10°C, výhodně 75°C ± 5°C, nejvýhodněji 75°C ± 2°C.

2-Oxindoly a aldehydy mohou být snadno připraveny známými organickými způsoby. Odborníkům v oboru budou jistě zřejmé i jiné způsoby přípravy

9

9 sloučenin podle předloženého vynálezu, a tedy následující příklady mají pouze ilustrativní charakter.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou připraveny podle následujících postupů a jsou popsány např. v přihlášce vynálezu US č. 09/783,264 a WO 01/60814, WO 00/08202, v prozatímní přihlášce US č. 60/312,353, podané 15. srpna 2001, nyní v přihlášce vynálezu US č. 10/281,985, podané 13. srpna 2002, v prozatímní přihlášce vynálezu US č.60/411,732, podané 18. září 2002, v prozatímní přihlášce US č.60/328,226, podané 10. října 2001, nyní v přihlášce vynálezu US č., podané 10.října 2002 a v přihlášce vynálezu US č. 10/076,140, podané 15.února, 2002, které jsou všechny zde ve své celistvosti uvedeny jako odkaz.

Způsob A: Formylace pyrrolů

POCI3 (1,1 ekviv.) se přidává po kapkách do dimethylformamidu (3 ekviv.) při teplotě -10°C, poté se přidá vhodný pyrrol rozpuštěný v dimethylformamidu. Po 2 hodinovém míchání se reakční směs zředí H2O a alkalizuje na pH 11 s 10 N KOH. Vzniklý precipitát se spojí filtrací, promyje H2O a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá požadovaný aldehyd.

Způsob B: Saponifikace esterů pyrrolkarboxylové kyseliny

Směs esteru pyrrolkarboxylové kyseliny a KOH (2-4 ekviv.) v EtOH se refluxuje, dokud není reakce podle TLC hotova. Ochlazená reakční směs se okyselí na pH 3 s 1 N HC1. Vzniklý precipitát se spojí filtrací, promyje H₂O a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá požadovaná pyrrolkarboxylová kyselina.

Způsob C: Amidace

Do míchaného roztoku pyrrolkarboxylové kyseliny rozpuštěné v dimethylformamidu (0,3 M) se přidá l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid (1,2 ekviv.), 1-hydroxybenzotrizaol (1,2 ekviv.) a triethylamin (2 ekviv.). Přidá se vhodný amin (1 ekviv.) a reakce se míchá, dokud není podle TLC kompletní. Do reakční směsi se pak přidá ethylacetát a roztok se promyje • 9 9

Μnasyceným roztokem NaHCCL a solankou (s extra solí), suší nad bezvodým MgSCL a koncentruje, čímž se získá požadovaný amid.

Způsob D: Kondenzace aldehydů a oxindolů obsahujících substituenty karboxylové kyseliny

Směs oxindolů (1 ekviv.), 1 ekviv. aldehydu a 1 - 3 ekvivalenty piperidinu (nebo pyrrolidinu) v ethanolu (0,4 M) se míchá při teplotě 90 - 100°C, dokud není reakce podle TLC hotova. Směs se pak koncentruje a zbytek alkalizuje 2N HC1. Vzniklý precipitát se promyje vodou a ethanolem a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá produkt.

Způsob E: Kondenzace aldehydů a oxindolů neobsahujících substituenty karboxylové kyseliny

Směs oxindolů (1 ekviv.), 1 ekviv. aldehydu a 1 - 3 ekvivalenty piperidinu (nebo pyrrolidinu) v ethanolu (0,4 M) se míchá při teplotě 90 - 100°C, dokud není reakce podle TLC hotova. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a vzniklý pevný podíl se spojí vakuovou filtrací, promyje ethanolem a suší, čímž se získá produkt. Pokud po ochlazení reakční směsi nevznikne precipitát, směs se koncentruje a purifikuje na sloupcové chromatografii.

Následující příklady mají ilustrovat předložený vynález, nicméně by mělo být zřejmé, že předložený vynález není nikterak limitován specifickými situacemi nebo detaily uvedeným v těchto příkladech. V celých podlohách přihlášky jsou jeden či všechny odkazy na veřejně dostupné dokumenty specificky začleněny do předložené přihlášky vynálezu jako odkaz.

Příklady syntéz

Příklad 1

Syntéza (3Z)-3-{[3,5-dimethyl-4-(morfolin-4-yl)piperidin-l-ylkarbonyl]-17i/'pyrrol-2-ylmethyliden}-5-fluor-l,3-dihydro-2/7-indol-2-on (Sloučenina 9)

Krok 1

4#

39• * ··«« ·

Do míchané směsi 4-amino-l-benzylpiperidinu (Aldrich, 1,53 ml, 7,5 mmol), K2CO3 (2,28 g, 16,5 mmol) a DMF (15 ml) zahřívaného při teplotě 50°C se po kapkách v průběhu 60 minut přidává bis(2-bromethyl)ether (Aldrich, těch. 90%, 0,962 ml, 7,65 mmol). Po 6 hodinovém míchání při teplotě 80°C vznikne podle TLC (90:10:1 chloroform/MeOH/vodný konc. roztok NH4OH) nová látka. V zahřívání se pokračuje, rozpouštědlem se v průběhu 2 hodin nechá probublávat dusík, surová látka je relativně čistá, ale stejně se ještě přečistí na relativně krátkém sloupci silikagelu (1% až 6% gradient 9:1 MeOH/vodný roztok NH4OH v chloroformu). Odpařením čistých frakcí se získá ~1,7 g diaminu 4-(morfolin-4-yl)1-benzylpiperidinu ve formě voskovité pevné látky. *H NMR (400 MHz, dóDMSO) δ 7,31 (m, 4H), 7,26 (m 1H), 3,72 (t, J= 4,7 Hz, 4H), 3,49 (s, 2H), 2,94 (br d, J= 5,9 Hz, 2H), 2,54 (t, J= 4,7 Hz, 4H), 2,19 (tt, J= 11, 5,3, 9 Hz, 1H), 1,96 (td, J= 11,7, 2,2 Hz, 2H), 1,78 (br d, J= 12,5 Hz, 2H), 1,55 (m, 2H).

Krok 2

Do míchané směsi Pd(OH)₂ (20% na aktivním uhlíku ( < 50% vlhkost), 390 mg, 25 hmotn. %), methanolu (50 ml) a < 1,7 M HC1 (3 ekviv., -10,6 ml - včetně vody přidávané později při zpozorování ppt) pod dusíkem se střídavě pouští 1 atm. vodíku (-20 sekund) a dusík přes balónek a únik plynu se sleduje na probublávačce. Po 20 minutách se reakční směs pod atmosférou vodíku zahřívá na teplotu 50°C a po kapkách se v průběhu 30 minut přidává 4-(morfolin-4-yl)-lbenzylpiperidin (1,56 g, 6,0 mmol) v methanolu (8 ml). Po 10 hodinách podle TLC již není výchozí amin a vznikne polárnější produkt (aktivní s ninhydrinem). Reakční směs se pak filtruje přes celit a odpařuje, čímž se získá dihydrochlorid 4(morfolin-4-yl)piperidinu ve formě bělavé pevné látky. Tato látka se nanese na bazický ionex (> 16 g, Bio-Rad Laboratories, AG 1-X8, 20-50 mesh, hydroxidový cyklus, dvakrát promytý methanolem) a promývá methanolickou směsí hydrochloridu aminu. Po 30 minutovém míchání se methanolický roztok dekantuje *

• · · • 9 9 9

9 999

9 9 «

99

9 · • · 999

9 9 9 9

9 9 9

99 • · ····

7?

4»a odpařuje, čímž se získá 932 mg volné báze 4-(morfolin-4-yl)piperidinu ve formě voskovité krystalické pevné látky.

*H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 3,53 (br s, 4H), 3,30 (v br s, 1H (+H₂O)), 2,92 (br d, J= 11,7 Hz, 1H), 2,41 (s, 4H), 2,35 (~obscd t, J- 11,7 Hz, 2H), 2,12 (br t, 1H), 1,65 (br d, J= 11,7 Hz, 2H), 1,18 (br q, J= 10,9 Hz, 2H); LCMS-APCI m/z 171 [M+l]⁺.

Krok 3 (3Z)-3-(3,5-Dimethyl-4-karboxy-l/f-pyrrol-2-ylmethyliden)-5-fluor-l,3dihydro-2//-indol-2-on (120 mg, 0,40 mmol), připravený podle PCT přihlášky vynálezu č. 01/60814, a BOP (221 mg, 0,50 mmol) se za intenzivního míchání a při pokojové teplotě suspendují v DMF (5 ml), pak se přidá triethylamin (134 μΐ, 0,96 mmol). Po 10 - 15 minutách se do homogenní reakční směsi najednou přidá 4-(morfolin-4-yl)piperidin (85 mg, 0,50 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 48 hodin (někdy i méně), pak převede do děličky obsahující chloroformizopropanol (5/1) a 5% vodný roztok LiCl. Kalná oranžová organická fáze se separuje, promyje dalším 5% vodným roztokem LiCl (2X), 1 M vodným roztokem

NaOH (3X), nasyceným vodným roztokem NaCl (IX), pak suší (Na₂SO4) a odpařuje, čímž se získá surový produkt (96,3% čistý; podle H NMR obsahuje zbytkový HMPA). Tento surový produkt se pak dále purifikuje filtrací přes krátký sloupec (3 cm) silikagelu (5 až 15% gradient MeOH v DCM), kde stopy rychlejšího 3E-izomeru se odstraní, čisté frakce se odpařují a rekrystalizují z nasyceného roztoku EtOAc, který se naředí Et₂O (~3-krát) a ochladí na teplotu 0°C, matečný louh se dekantuje, čímž se získá po vakuovém sušení požadovaná sloučenina ve formě oranžových krystalů (153 mg 85%).

*H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 13,60 (s, 1H), 10,87 (s, 1H), 7,72 (dd, J= 9,4, 2,7 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 6,91 (td, J= 9,3, 2,6 Hz, 1H), 6,82 (dd, J= 8,6, 4,7 Hz, 1H), 3,54 (app br t, J = 4,3 Hz, 4H), 3,31 (2x s, 3H+3H), 2,43 (br s, 4H), 2,36 (m, 1H), 2,25 (br tn, 6H), 1,79 (br s, 2H), 1,22 (br s, 2H); LCMS m/z 453 [M+l]⁺.

Postupuje se podle příkladu 1 výše a výměnou (3Z)-3-(3,5-dimethyl-4karboxy-l/7-pyrrol-2-ylmethyliden)-5-fluor-l,3-dihydro-277-indol-2-onu za (3Z)3-(3,5-dimethyl-4-karboxy-l/7-pyrrol-2-ylmethyliden)-l,3-dihydro-2/í-indol-2-on se získá (3Z)-3-{[3,5-dimethyl-4-(morfolin-4-yl)piperidin-l-ylkarbonyl]-l//'pyrrol-2-ylmethyliden}-3-dihydro-27/-indol-2-on.

• · • · · • ·· · ·

4=ř 'H NMR (400 MHz, d_ó-DMSO) δ 13,55 (s, 1H), 10,87 (s, 1H), 7,74 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,11 (t, J= 7,6 Hz, 1H), 6,97 (t, J= 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J= 7,4 Hz, 1H), 3,54 (app br t, J = 4,3 Hz, 4H), 3,31 (2x s, 3H+3H), 2,43 (br s, 4H), 2,35 (m, 1H), 2,28 (br m, 6H), 1,79 (br s, 2H), 1,22 (br s, 2H); LCMS m/z 435 [M+l]⁺.

Postupuje se podle příkladu 1 výše a výměnou (3Z)-3-(3,5-dimethyl-4karboxy-177-pyrrol-2-ylmethyliden)-5-fluor-l,3-dihydro-2/7-indol-2-onu za (3Z)3- (3,5-dimethyl-4-karboxy-l/7-pyrrol-2-ylmethyliden)-5-chlor-l,3-dihydro-277indol-2-on se získá (3Z)-3-{[3,5-dimethyl-4-(morfolin-4-yl)piperidin-lylkarbonyl]- l//-pyrrol-2-ylmethyliden} -5-chlor-1,3-dihydro-277-indol-2-on.

‘H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 13,56 (s, 1H), 10,97 (s, 1H), 7,95 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,11 (dd, J= 8,2, 2,0 Hz, 1H), 6,85 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 3,54 (app br t, J = ~ 4 Hz, 4H), 3,31 (2x s, 3H+3H), 2,43 (br s, 4H), 2,37 (m, 1H), 2,25 (br m, 6H), 1,79 (br s, 2H), 1,23 (br s, 2H); LCMS m/z 470 [M+l]⁺.

Postupuje se podle příkladu 1 výše a výměnou 4-(morfolin-4-yl)-piperidinu za komerčně dostupný 4-(l-pyrrolidinyl)-piperidin se získá (3Z)-3-{[3,5-dimethyl4- [4-(pyrrolidin-l-yl)piperidin-l-ylkarbonyl]-l/7-pyrrol-2-yl)methyliden]-5-fluorl,3-dihydro-2/7-indol-2-on.

*H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ E/Z izomerní směs; LCMS m/z 437 [M+l]⁺.

Syntéza shora uvedených příkladů může být provedena podle pozatímní přihlášky US č. 60/328,226, podané 10.října 2001 a přihlášky vynálezu US č. ____, podané 10.října 2002, které jsou zde jako celek uvedeny jako odkaz.

Příklad 2

Syntéza (3Z)-3-{[3,5-dimethyl-4-(morfolin-4-yl)azetidin-l-ylkarbonyl]-177-pyrrol2-ylmethyliden}-5-fluor-l,3-dihydro-277-indol-2-onu

Krok 1

Roztok l-azabicyklo[1.1.0]butanu, připravený z hydrobromidu 2,3-dibrompropylaminu (58,8 mmol) podle známého postupu popsaného v Tetrahedron Letters 40 (1999) 3761-64, se pomalu přidá do roztoku morfolinu (15,7 ml; 180 mmol) a kyseliny sírové (3,3 g z 96% roztoku) v bezvodém nedenaturovaném ethanolu (250 ml) při teplotě 0°C. Reakční směs se míchá v ledové lázni po dobu 30 minut, pak při pokojové teplotě po dobu 8 hodin. Přidá se

42• · · ♦ · •9 9 9999 9

999999 99 999 • 9 9 9 9 9 • 99 99 99 hydroxid vápenatý (5,5 g) a 100 ml vody, vzniklá směs se míchá po dobu 1 hodiny, pak filtruje přes vrstvu celitu, filtrát se koncentruje a destiluje za sníženého tlaku (20 mm Hg) k odstranění vody a přebytku morfolinu, destilační zbytek se znova destiluje za vysokého vakua na přístroji Kugelrohr, čímž se získá čistý 4-(azetidin-3-yl)morfolin v 33% výtěžku (2,759 g) ve formě bezbarvé olejovité tekutiny.

^I3C-NMR (CDCI3, 100 MHz): 66,71 (2C), 59,37 (1C), 51,46 (2C), 49,95 (2C) ^lH (CDCb, 400 MHz): 3,727 (t, J=4,4 Hz, 4H), 3,619 (t, J=8Hz, 2H), 3,566 (t, J=8Hz, 2H), 3,227 (m, J=7Hz, 1H), 2,895 (br s, 1H), 2,329 (br s, 4H)

Krok 2 l-(8-Azabenztriazolyl)-ester z (3Z)-3-({3,5-dimethyl-4-karboxy]-l Vpyrrol-2-yl}methylen)-5-fluor-l,3-dihydro-2V-indol-2-onu (0,5 mmol, 210 mg) [připravený aktivací (3Z)-3-(3,3-dimethyl-4-karboxy-l V-pyrrol-2ylmethylen)-5-fluor-l,3-dihydro-27/-indol-2-onu (480 mg; 1,6 mmol) s činidlem HATU (570 mg, 1,5 mmol) v přítomnosti Hunigovy báze (3,0 mmol, 0,525 ml) v DMF (5ml), izoluje v čisté formě precipitací s chloroformem (5 ml), suší za vysokého vakua v 92% výtěžku (579 mg)] se suspenduje v bezvodém DMA (1,0 ml). Najednou se přidá roztok 4-(azetidin-3-yl)-morfolinu (142,5 mg, 1 mmol) v bezvodém DMA (1,0 ml) a vzniklý roztok se míchá při pokojové teplotě po dobu 20 minut. Reakční směs se odpařuje při pokojové teplotě na olejové pumpě, hustý zbytek se zředí 6 ml směsi methanolu s diethylaminem (20:1; obj.), mechanicky inokuluje a vloží do ledničky (+3°C) na 8 hodin, precipitáty se filtrují (rychle se promyjí studeným methanolem) a suší za vysokého vakua, čímž se získá požadovaný produkt. Výtěžek činí 71,5 % (152 mg oranžové pevné látky)

LC/MS: +APCI: M+l=425; -APCI: M-l=423 ¹⁹F-NMR (d-DMSO, 376,5 MHz): -122,94 (m, 1F) *H (d-DMSO, 400 MHz): 13,651 (s, 1H), 10,907 (s, 1H), 7,754 (dd, J=9,4 Hz, J=2,4 Hz, 1H), 7,700 (s, 1H), 6,935 (dt, J-8,2 Hz, J=2,4 Hz, 1H), 6,841 (dd, J=8,6 Hz, J=3,9Hz; 1H), 3,963 (br s, 2H), 3,793 (br s, 2H), 3,581 (br t, J=4,3 Hz, 4H), 3,133 (m, 1H), 2,367 (s, 3H), 2,340 (s, 3H), 2, 295 (br s, 4H).

Postupuje se podle příkladu 2 výše a výměnou (3Z)-3-(3,5-dimethyl-4karboxy-l//-pyrrol-2-ylmethyliden)-5-fluor-l,3-dihydro-27/-indol-2-onu za (3Z)3-(3,5-dimethyl-4-karboxy-l V-pyrrol-2-ylmethyliden)-5-chlor-l,3-dihydro-2V• *» indol-2-on se získá (3Z)-3-{[3,5-dimethyl-4-(morfolin-4-yl)azetidin-lylkarbonyl]-177-pyrrol-2-ylmethyliden}-5-chlor-l,3-dihydro-2/7-indol-2-on ve formě oranžové pevné látky.

LC/MS: +APCI: M+l=441; -APCI: M-l=440,441 'H (d-DMSO, 400 MHz): 13,607 (s, 1H), 11,006 (s, 1H), 7,976 (d, J=2, 0Hz, 1H), 7,756 (s, 1H), 7,136 (dd, J=8,2 Hz, J=2,0 Hz, 1H), 6,869 (d, J=8,2 Hz, 1H), 3,964 (br s, 2H), 3,793 (br s, 2H), 3,582 (br t, J=4,3 Hz, 4H), 3,134 (m, 1H), 2,369 (s, 3H), 2,347 (s, 3H), 2,296 (br s, 4H).

Postupuje se podle příkladu 2 výše a výměnou 4-(azetidin-3-yl)morfolinu za

4-(azetidin-3-yl)-czó'-3,5-dimethylmorfolin (připravený postupem, který je analogický přípravě 4-(azetidin-3-yl)-morfolinu a použitím cis-3,5dimethylmorfolinu (20,7 g; 180 mmol) místo morfolinu) za se získá (3Z)-3-{[3,5dimethyl-4-(2,5-dimethylmorfolin-4-yl)azetidin-l-ylkarbonyl]-17í-pyrrol-2ylmethyliden}-5-fluor-l,3-dihydro-277-indol-2-on ve formě oranžové pevné látky. LC/MS: +APCI: M+l=453; -APCI: M-l=451 ¹⁹F-NMR (d-DMSO, 376,5 MHz): -122,94 (m, 1F) ’H (d-DMSO, 400 MHz): 13,651 (s, 1H), 10,907 (s; 1H), 7,758 (dd, J=9,4 Hz, J=2,3 Hz; 1H), 7,700 (s, 1H), 6,935 (dt, J=8,6 Hz, J=2,7 Hz, 1H), 6,842 (dd, J=8,2 Hz, J=4,3 Hz, 1H), 3,961 (br s, 2H), 3,790 (br s, 2H), 3,546 (br m, 2H), 3,092 (m, 1H), 2,690 (br s; 2H), 2,364 (s, 3H), 2,338 (s, 3H), 1,492 (br m, 2H), 1,038 (br s, 6H).

Postupuje se podle příkladu 2 výše a výměnou (3Z)-3-(3,5-dimethyl-4karboxy-17/-pyrrol-2-ylmethyliden)-5-fluor-l,3-dihydro-2//-indol-2-onu za (3Z)3-(3,5-dimethyl-4-karboxy-177-pyrrol-2-ylmethyliden)-5-chlor-l,3-dihydro-277indol-2-on a 4-(azetidin-3-yl)morfolinu za 4-(azetidin-3-yl)-czs-3,5dimethylmorfolin se získá (3Z)-3-{[3,5-dimethyl-4-(3,5-dimethylmorfolin-4yl)azetidin-l-ylkarbonyl]-17/-pyrrol-2-ylmethyliden}-5-chlor-l,3-dihydro-277indol-2-on ve formě oranžové pevné látky.

LC/MS: +APCI : M+l=469, 470;-APCI : M-l= 468, 469 ^lH (d-DMSO, 400 MHz): 13,606 (s, 1H), 11,008 (s, 1H), 7,979 (d, J=2, 0Hz, 1H), 7,758 (s, 1H), 7,138 (dd, J=8,2Hz, J=2, 0Hz, 1H), 6,870 (d, J=8,2Hz, 1H), 3,964 (br s, 2H), 3,790 (br s, 2H), 3,547 (br m, 2H), 3,095 (m, 1H), 2,691 (br s, 2H), 2,366 (s, 3H), 2,345 (s, 3H), 1,494 (br m, 2H), 1,039 (br s, 6H).

Postupuje se podle příkladu 1 výše a výměnou 4-(morfolin-4-yl)-piperidinu za

2-(R)-pyrrolidin-l-ylmethylpyrrolidin připravený podle níže uvedeného způsobu se získá (3Z)-3- {[3,5-dimethyl-2Á-(pyrrolidin-1 -ylmethyl)pyrrolidin-1 -ylkarbonyl]lH-pyrrol-2-ylmethyliden} -5-fluor-1,3-dihydro-27/-indol-2-on

Syntéza 2(7ř)-pyrrolidin-l-ylmethylpyrrolidinu

Krok 1

Do roztoku (+)-karbobenzyloxy-D-prolinu (1,5 g, 6,0 mmol), EDC (2,3 g, 12,0 mmol) a HOBt (800 mg, 12,9 mmol) v DMF (20 ml) se přidá trietylamin (1,5 ml) a pyrrolidin (1,0 ml, 12,0 mmol). Směs se míchá po dobu 18 hodin při pokojové teplotě, přidá se nasycený roztok NaHCCb, látka se extrahuje CH2CI2 (3x), organické vrstvy se oddělí a suší nad Na2SC>4, rozpouštědlo se odstraní a zbytek čistí chromatografií na sloupci silikagelu (EtOAc), čímž se získá 1 -(R)-[N(benzyloxykarbonyl)-pyrolyl]pyrrolidin ve formě bílé pevné látky (94%).

*H NMR (400 MHz, CDC1₃, všechny rotamery) 1,57-1,66 (m, 1H), 1,71-2,02 (m, 5H), 2,04-2,19 (m, 2H), 3,26-3,43 (m, 3H), 3,44-3,78 (m, 3H), 4,41 (dd, J= 4,5, 7,6 Hz, 0,5H), 4,52 (dd, J= 3,7, 7,6 Hz, 0,5H), 4,99 (d, J= 12,1 Hz, 0,5H), 5,05 (d, J= 12,5 Hz, 0,5H), 5,13 (d, J= 12,1 Hz, 0,5H), 5,20 (d, J= 12,5 Hz, 0,5H), 7,27-7, 38 (m, 5H).

Krok 2

Směs l-(7?)-[A-(benzyloxykarbonyl)prolyl]pyrrolidinu (2,7 g, 8,9 mmol) a katalyzátoru 5% Pd-C (270 mg) v methanolu (15 ml) se míchá pod atmosférou vodíku po dobu 20 hodin. Reakční směs se filtruje přes vrstvu celitu a rozpouštědlo se odstraní, čímž se získá 2(R)-prolylpyrrolidin ve formě viskózního oleje (80%), který se použije v následujícím kroku bez další purifikace.

*H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 1,52-1,78 (m, 5H), 1,82-1,89 (m, 2H), 1,97-2,04 (m, 1H), 2,63-2,71 (m, 1H), 2,97-3,02 (m, 1H), 3,22-3,35 (m, 3H), 3,48-3,54 (m, 1H), 3,72 (dd, J= 6,1, 8,0 Hz, 1H).

Krok 3

2(R)-Prolylpyrrolidin (1,2 g, 7,1 mmol) se rozpustí v THF (10 ml). Reakční směs se ochladí na teplotu 0°C a po kapkách při teplotě 0°C se přidá BH3, 1M v

THF (10 ml, 10 mmol). Reakční směs se refluxuje po dobu 16 hodin, přidá se 3 M HC1 (4,7 ml), 2 M roztok NaOH dokud není pH 10, produkt se extrahuje 5% MeOH v CH2CI2 (3x), organické vrstvy se suší nad Na₃SO4 a rozpouštědlo se odstraní, čímž se získá požadovaná sloučenina ve formě světle žluté tekutiny (73%), která se použije v následujícím kroku bez dalšího čištění.

‘H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 1,22-1,30 (m, 1H), 1,55-1,69 (m, 6H), 1,71-1,79 (m, 1H), 2,26-2,30 (m, 1H), 2,33-2,38 (m, 1H), 2,40-2,45 (m, 4H), 2,65-2,71 (m, 1H), 2,78-2,84 (m, 1H), 3,02-3,09 (m, 1H).

Postupuje se podle příkladu 1 výše a výměnou 4-(morfolin-4-yl)-piperidinu za

2-(5)-pyrrolidin-l-ylmethylpyrrolidin (připravený podle popisu výše substitucí (+)-karbobenzyloxy-7)-prolinu za karbobenzyloxy-Á-prolin) se získá (3Z)-3-{[3,5dimethyl-25'-(pyrrolidin-l-ylmethyl)pyrrolidin-l-ylkarbonyl]-17/-pyrrol-2ylmethyliden}-5-fluor-l,3-dihydro-277-indol-2-on.

Příklad 3

Syntéza 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-yliden-methyl]-2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylové kyseliny Krok 1

Dimethylformamid (25 ml, 3 ekviv.) se za míchání ochladí v ledové lázni, pak se do něj přidá POCI3 (1,1 ekviv., 10,8 ml). Po 30 minutách se do reakční směsi přidá roztok 3,5-dimethyl-4-ethylsterpyrrolu (17,7 g, 105,8 mmol) v DMF (2M, 40 ml) a v míchání se pokračuje. Po 2 hodinách s reakce zředí vodou (250 ml) a alkalizuje na pH = 11 IN vodným roztokem NaOH, bílý pevný podíl se odstraní filtrací, promyje vodou, pak hexany a suší, čímž se získá ethylester 5formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (19,75 g, 95%) ve formě hnědé pevné látky.

NMR (360 MHz, DMSO-d_ó) δ 12,11 (br s, 1H, NH), 9,59 (s, 1H, CHO), 4,17 (q, J= 6,7Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,26 (d, J= 6,7Hz, 3H, OCH₂CH₃).

Krok 2 • · • · ·

999 9 ^ζ~ .Σ. Σ .· .· ·

46Ethylester 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (2 g, 10 mmol) se přidá do roztoku hydroxidu draselného (3 g, 53 mmol) rozpuštěného v methanolu (3 ml) a vodě (10 ml). Směs se refluxuje po dobu 3 hodin, ochladí na pokojovou teplotu a okyselí 6 N kyselinou chlorovodíkovou na pH = 3. Pevný podíl se spojí filtrací, promyje vodou a suší ve vakuové sušárně přes noc, čímž se získá 5-formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxy]ová kyselina (1,6 g, 93%).

*H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 12,09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃).

Krok 3

5-Fluorisatin (8,2 g, 49,7 mmol) se rozpustí v 50 ml hydrazin-hydrátu a refluxuje po dobu 1 hodiny. Reakční směs se pak nalije do ledové vody, precipitát filtruje, promyje vodou a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá 5-fluor-2-oxindol (7,5 g).

Krok 4

Reakční směs 5-fluoroxindolu (100 mg, 0,66 mmol), 5-formyl-2,4dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (133 mg, 0,79 mmol) a 10 kapek piperidinu v ethanolu (3 ml) se míchá při teplotě 60°C přes noc a filtruje. Pevný podíl se promyje 1M vodným roztokem hydrochloridu, vodou a suší, čímž se získá 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3karboxylová kyselina (201 mg, kvantitativní výtěžek) ve formě žluté pevné látky. MS m/z (relativní intenzita, %) 299 ([M-l]⁺, 100).

Příklad 4

Syntéza (3-diethylamino-2-hydroxy-propyl)-amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-yliden-methyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny Krok 1

Do 2-chlormethyloxiranu (95 g, 1,03 mol) se přidá směs vody (3,08 g, 0,17 mol) a diethylaminu (106,2 ml, 1,03 mol) při teplotě 30°C. Reakční směs se pak míchá při teplotě 28 - 35°C po dobu 6 hodin a ochladí na teplotu 20-25°C, čímž se získá l-chlor-3-diethylamino-propan-2-ol.

Krok 2

_t · · · • · · · · · · ····*· ·· · • 9 9 9 9

Do roztoku hydroxidu sodného (47,9 g, 1,2 mol) v 78 ml vody se přidá 1chlor-3-diethylamino-propan-2-ol, výsledná směs se míchá při teplotě 20-25°C po dobu 1 hodiny, zředí 178 ml vody a extrahuje etherem (2x). Spojené etherové roztoky se suší pevným hydroxidem draselným a odpařují, čímž se získá 135 g surového produktu, který se čistí frakční destilací, čímž se získá čistý glycidyldiethylamin (98 g, 76%) ve formě oleje.

Krok 3

Do ledově studeného roztoku 25 hmotn. % hydroxidu amonného (25 ml,

159 mmol) se v průběhu 10 minut po kapkách přidá glycidyldiethylamin (3,2 g, 24,8 mmol). Reakční směs se míchá při teplotě 0-5°C po dobu 1 hodiny, pak při pokojové teplotě po dobu 14 hodin. Výsledná reakční směs se odpařuje a destiluje (84-90°C při 500-600 mT), čímž se získá l-amino-3-diethylamino-propan-2-ol (3,3 g, 92%). MS m/z 147 ([M+l]⁺).

Krok 4

Do roztoku 5-formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (100 mg, 0,43 mmol), EDC (122,7 mg, 0,64 mmol) a HOBt (86,5 mg, 0,64 mmol) v 1,0 ml DMF se přidá l-amino-3-diethylamino-propan-2-ol (93,2 mg, 0,64 mmol). Výsledný reakční roztok se míchá při pokojové teplotě přes noc a odpařuje. Zbytek se suspenduje v 10 ml vody a filtruje, pevný podíl se promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vody, suší ve vakuové sušárně, čímž se získá surový produkt, který se čistí chromatografií na sloupci silikagelu směsí 6% methanol/dichlormethan obsahující tri ethyl amin jako mobilní fází (2 kapky/ÍOOml 6% methanol-dichlormethanu), čímž se získá (3-diethylamino-2-hydroxy-propyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-177-pyrrol3-karboxylové kyseliny (62 mg, 34%) ve formě žluté pevné látky.

*H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13,70 (s, 1H, NH-1’), 10,90 (s, 1H, NH-1), 7,76 (dd, J= 2, 38, 9, 33 Hz, 1H, H-4), 7,72 (s, 1H, vinyl-H), 7,60 (m, br, , 1H, CONHCH₂CH (OH)-CH₂N(C₂H₅)2-4’), 6,93 (dt, J= 2,38, 8,99 Hz, 1H, H-5), 6,85 (dd, J= 4,55, 8,99 Hz, 1H, H-6), 3,83 (m, br, 1H, OH), 3,33 (m, 4H), 2,67 (m, br, 5H), 2,46 (s, 3H, CH₃), 2,44 (s, 3H, CH₃), 1,04 (m, br, 6H, CH₃x2), MS m/z (relativní intenzita, %) 427 ([M+l]⁺, 100).

48·

Příklad 5

Syntéza (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-(3Z)-yliden-methyl]-2,4-dimethyl-lZ/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (/?),(Y) a (R/S) (Sloučeniny 4, 5 a 6)

Krok 1

Směs morfolinu (2,6 ml, 30 mmol) a epichlorhydrinu (2,35 ml, 30 mmol) v ethanolu (50 ml) se míchá při teplotě 70°C přes noc. Po odstranění rozpouštědla se zbytek zředí methylenchloridem (50 ml). Vyprecipitovaná čistá pevná látka se spojí vakuovou filtrací, čímž se získá l-chlor-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol (2,0 g, 37%). ‘H NMR (DMSO-de) δ 3,49 (t, J=4,8 Hz, 2H), 3,60 (t, J=4,6Hz, 2H), 3,75 (m, 4H, 2xCH₂), 4,20 (dd, J=5,2, 12 Hz, 2H), 4,54 (m, 2H), 4,62 (m, 1H, CH), 6,64 (d, J=6,4 Hz, 1H, OH). MS (m/z) 180,2 (M+l).

Krok 2 l-Chlor-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol (2,0 g, 11 mmol) se podrobí účinkům roztoku NH3 v methanolu (25 hmotn.%, 20 ml) při pokojové teplotě. Dusík se nechá probublávat reakční směsí k odstranění amoniaku. Odpařením rozpouštědla se získá hydrochlorid l-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-olu (2,0 g, 91%).

^!H NMR (DMSO-d₆) δ 2,30 (d, J=6,0Hz, 2H), 2,36 (m, 4H, NCH₂), 2,65 (dd, J=8,4, 12,8Hz, 1H), 2,91 (dd, J=3,6, 12,8Hz, 1H), 3,52 (m, 4H, OCH₂), 3,87 (m, 1H, CH), 5,32 (s, 1H, OH), 8,02 (brs, , 3H, NH₃ ⁺). MS (m/z)161,l (M+l).

Krok 3

5-(5-Fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3karboxylové kyseliny (120 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s l-amino-3-morfolin-4yl-propan-2-olem (74 mg, 0,48 mmol) k precipitaci (2-hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl)-amidu 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-l/Z-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (65 mg, 36%). Matečný roztok se zahušťuje do sucha a zbytek se čistí zrychlenou chromatografií, čímž se získá další 2N (70 mg, 39%).

*H NMR (DMSO-de) δ 2,28 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3,15 (s, 1H), 3,31 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,78 (m, 1H), 4,73 (brs, 1H, OH), 6,82 (dd, J=4,5, 8,4Hz, 1H), 6,90 (td, ²J-2,8, ³J=10,0 Hz, 1H), 7,53 (m, 1H),

497,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J=2,0, 9,6Hz, lH)(aromatický a vinyl), 10,87 (s, 1H, CONH), 13,66 (s, 1H, NH).

LC-MS (m/z)441,4 (M-l).

Syntéza 2-hydroxy-7-oxa-4-azoniaspiro[3,5]nonan-chloridu _ 1)ethanol Τ'

O. ci ' i —--í I

HN^J 2) aceton

Do trojhrdlé baňky s kruhovým dnem (1 litr) vybavené termočlánkem, přívodem dusíku a přikapávačkou se přidá morfolin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 ekviv.) a 100 ml ethanolu, roztok se za přidávání epichlorhydrinu (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol, 1,03 ekviv.) z přikapávačky v průběhu 30 minut intenzivně míchá. Teplota reakce se sleduje, a jakmile dosáhne 27°C, reakce se ochladí v ledové lázni. Čirý roztok se míchá po dobu 18 hodin. Reakce se sleduje technikou GC (5 kapek reakční směsi se naředí v 1 ml ethanolu a injektuje do 15m DB-5 kapilárního GC sloupce s následující parametry, injektor 250°C, detektor 250°C, počáteční teplota v sušárně 28°C, ohřátí na 250°C při 10°C za minutu). Reakce je hotova s méně než 3% zbylého morfolinu. Reakce se koncentruje na rotační odparce při teplotě 50°C za plného vakua do té doby, dokud nekondenzuje žádný destilát. Výsledný olej se skladuje při pokojové teplotě po dobu 24 - 48 hodin, nebo dokud nevypadne výrazná hmota krystalů (naočkované zrychleným způsobem), směs se zředí 250 ml acetonu a filtruje, pevný podíl se suší ve vakuové sušárně při teplotě 60°C po dobu 18-24 hodin, čímž se získá 84 g krystalického produktu. Ke zvýšení výtěžku se matečné roztoky mohou koncentrovat a krystalizační proces opakovat.

*H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 6,55 (d, 1 H), 4,64 (m, 1 H), 4,53 (m, 2 H), 4,18 (m, 2 H), 3,74 (m, 4 H), 3,60 (m, 2 H), 3,48 (m, 2 H).

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 70,9, 61,39, 61,04, 60,25, 58,54, 57,80.

• · 9 9· • 9 9 9 · ··· •9 999 9 ··· • · 9 9 9 9 ·· ♦

Syntéza l-amino-3-(4-morfolinyl)-2-propanolu (racemát) cr

NH_3> MeOH

HCI [^/^N'^XXT^XXN^h2

OH

Do trojhrdlé baňky s kulatým dnem a magnetickým míchadlem se vloží 2hydroxy-7-oxa-4-azoniaspiro[3,5]nonan-chlorid (150 g, 835 mmol), poté 23 hmotn. % bezvodého amoniaku v methanolu (2120 ml). Baňka se uzavře a výsledný čirý roztok se míchá při teplotě 20 - 23°C po dobu 18 hodin. Podle GC za shora uvedených podmínek již po této době není výchozí látky, baňka se otevře a amoniak se během 30 minut nechá odbublat. Baňka se vloží na rotační odparku a za plného vakua a při teplotě 45°C se směs koncentruje na bílou pevnou látku.

NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,57 (dd, 2H), 3,3-3,5 (m, 6 H), 2,59 (m, 2 H),

2,2-2,4 (m, 6 H);

¹³C NMR (100 MHz DMSO-d₆) δ 70,8, 67,1, 60,1, 53,8, 48,1.

Postupuje se podle příkladu 3 výše a výměnou 2-(7?5)-l-amino-3-morfolin4-yl-propan-2-olu za 2-(5)-l-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol, který se připraví níže uvedeným způsobem, se získá požadovaná sloučenina, (2-(S)-hydroxy-3morfolin-4-yl-propyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

Syntéza l-amino-3-(4-morfolinyI)-2-pronanol (není racemát)

Do trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybavené mechanickým míchadlem, termočlánkem a přikapávačkou se vloží morfolin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 ekviv.) a 45 ml /-butanolu. Za přidávání R-epichlorhydrinu (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol, 1,03 ekviv.) z přikapávačky v průběhu 30 minut se roztok intenzivně míchá, teplota se sleduje, a pokud teplota reakční směsi dosáhne 27°C, reakce se ochladí v ledové lázni a čirý roztok se míchá po dobu 18 hodin. Reakce se sleduje technikou GC (5 kapek reakční směsi se nalije do 1 ml ethanolu injektuje na 15m

4 4

4444

4 4 4 4

W 54

DB-5 kapilární GC sloupec s následujícími parametry: injektor 250°C, detektor 250°C, počáteční teplota v sušárně 28°C ohřátí na 250°C při 10°C za minutu). Reakce je hotova s méně než 3% zbylého morfolinu. Roztok se ochladí na teplotu 0°C a po kapkách se přidá 20 hmotn.% roztok Z-butoxidu draselného v THF (576 g), přičemž teplota se udržuje pod 15°C. Výsledná bílá směs se míchá při teplotě 10-15°C po dobu 2 hodin a kontroluje GC za shora uvedených podmínek, přičemž žádný chlorohydrin již není detekován. Reakce se koncentruje na rotační odparce při teplotě 50°C za plného vakua, výsledná směs se zředí vodou (500 ml) a methylenchloridem, fáze se oddělí a vodná fáze se promyje methylenchloridem (500 ml), spojené organické vrstvy se suší nad síranem sodným a koncentrují na čirý, bezbarvý olej. Výtěžek činí 145 g, 97 % epoxidu.

*H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,3 (dd, 4 H), 3,1 (m, 1 H), 2,6 (dd, 1 H), 2,5 (dd, 1 H), 2,4 (m, 4 H), 2,2 (dd, 2 H);

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 65,4, 60,1, 53,1, 48,9, 43,4.

Shora připravený surový epoxid se vloží do trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybaveným magnetickým míchadlem, přidá se bezvodý amoniak v methanolu (24 hmotn. %, 2,5 litru), baňka se uzavře a směs míchá při pokojové teplotě po dobu 24 hodin. Podle GC za výše uvedených podmínek již po této době není výchozí látky, baňka se otevře a během 30 minut se amoniak nechá odbublávat pryč, baňka se pak vloží na rotační odparku a koncentruje při teplotě lázně 45°C a za plného vakua na čirý, bezbarvý olej. Tímto způsobem se získá 124 g produktu.

*H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,57 (dd, 2H), 3,3-3,5 (m, 6 H), 2,59 (m, 2 H),

2,2-2,4 (m, 6 H);

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 70,8, 67,1, 60,1, 53,8, 48,1.

Syntéza l-amino-3-(4-morfolinyl)-2-(5')-propanolu

Do trojhrdlé baňky s kulatým dnem, vybavené mechanickým míchadlem, termočlánkem a přikapávačkou se vloží morfolin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 ekviv.) a 200 ml methanolu. Za přidávání R-epichlorhydrinu (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol, 1,03 ekviv.) z přikapávačky v průběhu 30 minut se roztok intenzivně míchá, teplota se sleduje, a pokud teplota reakční směsi dosáhne 27°C, reakce se ochladí v ledové lázni a Čirý roztok míchá po dobu 18 hodin. Reakce se sleduje technikou

Λ

9· ·· ·

9 9 9 9 9

9 9 9 · 9 ··♦

99 9 9 · 99···

GC (5 kapek reakční směsi se zředí v 1 ml ethanolu injektuje na 15m DB-5 kapilární GC sloupec s následujícími parametry: injektor 250°C, detektor 250°C, počáteční teplota v sušárně 28°C ohřátí na 250°C při 10°C za minutu). Reakce je hotova s méně než 3 % zbylého morfolinu. Roztok se ochladí na teplotu 10°C a po kapkách se přidává 25% hmotn. roztok methoxidu sodného v methanolu (233 g, 1,08 mol, 247 ml), přičemž teplota se udržuje pod 15°C. Výsledná bílá kašovitá směs se míchá při teplotě 10 - 15°C po dobu 2 hodin a sleduje technikou GC za shora uvedených podmínek. Po této době již není detekován žádný chlorhydrin. Směs se koncentruje na rotační odparce při teplotě 50°C za plného vakua, výsledná směs se zředí vodou (500 ml) a methylenchloridem, fáze se oddělí a vodná fáze se promyje methylenchloridem (500 ml), spojené organické vrstvy se suší nad síranem sodným a koncentrují na čirý, bezbarvý olej. Výtěžek činí 145 g, 97% 1,2-epoxy-3-morfolin-4-ylpropanu.

’H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ 3,3 (dd, 4 H), 3,1 (m, 1 H), 2,6 (dd, 1 H), 2,5 (dd, 1 H), 2,4 (m, 4 H), 2,2 (dd, 2 H);

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 65,4, 60,1, 53,1, 48,9, 43,4.

Shora uvedený surový l,2-epoxy-3-morfolin-4-ylpropan se vloží do trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem, přidá se bezvodý amoniak v methanolu (24 % hmotn., 2,5 litru), baňka se uzavře a směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 24 hodin. Po této době již podle GC není výchozí látka, baňka se otevře a během 30 minut se amoniak nechá vybublávat. Baňka se vloží na rotační odparku a koncentruje za teploty lázně 45°C a plného vakua na čirý bezbarvý olej. Tímto způsobem se získá 124 g l-amino-3-(4-morfolinyl)-2-(S)-propanolu.

^]H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,57 (dd, 2H), 3,3-3,5 (m, 6 H), 2,59 (m, 2 H),

2,2-2,4 (m, 6 H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 70,8, 67,1, 60,1, 53,8, 48,1.

Imidazolamid (7,0 g, 32,3 mmol), amin (15,0 g, 64,6 mmol), 5-fluoroxindol (4,93 g, 32,6 mmol), triethylamin (9,79 g, 96,9 mmol) a THF (88 ml) se míchají a

55·

SZ• ·

0000 0

0

00« 0 0

0

0 0 0 0 0 0 0 · zahřívají při teplotě 60°C, čímž vznikne hnědý roztok. Po 24 hodinovém míchání při teplotě 60°C se žlutá směs ochladí na pokojovou teplotu a filtruje, filtrační koláč se promyje 80 ml THF a suší přes noc při teplotě 50°C za vysokého vakua, čímž se získá hnědá pevná látka (23,2 g). Směs se míchá v 350 ml vody po dobu 5 hodin při pokojové teplotě a filtruje, filtrační koláč se promyje 100 ml vody a suší při teplotě 50°C za vysokého vakua přes noc. Tímto způsobem se získá 8,31 g s 56% výtěžkem.

HO

Do 250 ml baňky vybavené teploměrem, zpětným chladičem, magnetickým míchadlem a přívodem dusíku se vloží 4,92 g 5-fluoroxindolu, 7,0 g imidazolamidu, 15,5 g (R)-l-amino-3-(4-morfolinyl)-2-propanolu, 9,78 g triethylaminu a 88 ml tetrahydrofuranu, směs se zahřívá při teplotě 60°C po dobu 16,5 hodiny. Reakce se ochladí na pokojovou teplotu a filtruje, pevné podíly se smíchají (3x) s podílem acetonitrilu v množství 11 ml/g, suší za vakua, čímž se získá 3,6 g (25,25 %). [HPLC, Hypersil BDS, C-18, 5 μ (6:4), acetonitril: 0,lM chlorid amonný, PHA-571437 = 4,05 minut] *H NMR (DMSO): δ 10,86 (1H, bs); 7,75 (1H, d); 7,70 (1H, s); 7,50 (1H, m); 6,88 (2H, m); 4,72 (1H, bs); 3,78 (1H, bs); 3,56 (4H, m); 3,32 (6H, m); 3,15 (1H, m); 2,43 (8H, bm).

Příklad 6

Syntéza (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny ·· 9

9 9 9 9 9 9 ··· · .· .· ·

5-(2-Oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/í-pyrrol-3karboxylová kyselina (113 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s l-amino-3-morfolin-4yl-propan-2-olem (74 mg, 0,48 mmol) k precipitaci (2-hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl)-amidu 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-l/7pyrrol-3-karboxylové kyseliny (77 mg, 45,3 %).

*H NMR (DMSO-d₆) δ 2,27 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2, 40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3,15 (s, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J=4,8Hz, 1H, OH), 6, 86 (d, J=7,6Hz, 1H), 6,96 (t, J=7,2 Hz, 1H), 7,10 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,49 (t, J=5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,77 (d, J=8,0 Hz, lH)(aromatický a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 425,4 (M+l).

Příklad 7

Syntéza (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu 5-[5-chlor-2-oxo-l,2-dihydroindol-(3Z)-yliden-methyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 7)

5-(5-Chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//pyrrol-3-karboxylová kyselina (126,6 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s l-amino-3morfolin-4-yl-propan-2-olem (74 mg, 0,48 mmol) k precipitaci (2-hydroxy-3morfolin-4-yl-propyl)-amidu 5-[5-Chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (107 mg, 58 %).

^JH NMR (DMSO-de) δ 2,29 (m, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,39 (m, 4H), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3,15 (s, 1H), 3,37 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J=4,8Hz, 1H, OH), 6,85 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,0, 8,0Hz, 1H), 7,53 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,97 (d, J=2, 0Hz, 1H) (aromatické a vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH).

LC-MS (m/z)457,4 (M-l).

Příklad 8

Syntéza (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu 5-[5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-(3Z)-yliden-methyl]-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny ♦

·· * '

5-(5-Brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7pyrrol-3-karboxylová kyselina (72,2 mg, 0,2 mmol) se kondenzuje s l-amino-3morfolin-4-yl-propan-2-olem (38 mg, 0,24 mmol) k precipitaci (2-hydroxy-3morfolin-4-yl-propyl)-amidu 5-[5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)yIidenmethyl]-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (55 mg, 55 %).

*H NMR (DMSO-d₆) δ 2,27 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,39 (m, 4H), 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3,13 (s, 1H), 3, 35 (m, 1H), 3, 55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J=4,4Hz, 1H, OH), 6,80 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J=2,0, 8,0Hz, 1H), 7,51 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J=2, 0Hz, lH)(aromatické a vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH).

LC-MS (m/z)503,4 (M-l).

Příklad 9

Syntéza (2-hydroxy-3-[ 1.2.3]triazol-1 -yl-propyl)-amidu 2,4-dimethyl-5-[2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)-yliden-methyl]- 177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny Krok 1

Směs 3-[1.2.3]triazolu (2,0 g, 29 mmol), epichlorhydrinu (3,4 ml, 43,5 mmol) a N,7V-diizopropyl-ethylaminu (2,6 ml, 15 mmol) v ethanolu (50 ml) se míchá při pokojové teplotě přes noc. Po odstranění rozpouštědel se zbytek čistí zrychlenou chromatografií (CH2CI2/CH3OH-IOO/I-IOO/2-IOO/4), čímž se získá 1chlor-3-(l,2,3)-triazol-2-ylpropan-2-ol (2,1 g, 45 %). ^!H NMR (CDC1₃) δ 3,52 (m, 2H, OH a CH₂), 3,60 (dd, J=5,2, 11,2 Hz, 1H), 4,36 (m, 1H, CH), 4,68 (m, 2H), 7,67 (s, 2H), MS (m/z) 162,1 (M+l) a l-chlor-3-(l,2,3)triazol-l-ylpropan-2-ol (2, 3 g, 49 %).

*H NMR (CDCI3) δ 3,56 (s, 1H), 3,57 (s, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,53 (dd, J=7,2, 14 Hz, 1H), 4,67 (dd, J=3,8, 14Hz, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,71 (s, 1H). MS (m/z) 162,1 (M+l).

Krok 2 l-Chlor-3-(l,2,3)triazol-l-ylpropan-2-ol (2,3 g, 13 mmol) se podrobí účinku roztoku NH₃ v methanolu (25 % hmotn., 20 ml) při teplotě 60°C přes noc v uzavřené tlakové nádobě. Po ochlazení na pokojovou teplotu se do reakční směsi • · • ·· ♦ nr* · · · · · · · ··· · Μ ·· · zavede dusík, aby se odstranil amoniak. Odpařením rozpouštědel se získá hydrochlorid l-amino-3-(l,2,3)triazol-l-ylpropan-2-olu (2,57 g, 100 %).

‘H NMR (DMSO-de) δ 2,68 (dd, >8,8, 12,8Hz, 1H), 2,97 (dd, >3,6, 12,8Hz, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,44 (dd, >6,4, 14Hz, 1H), 4,57 (dd, >4,6, 14Hz, 1H), 5,95 (d, J=5,2Hz, 1H, OH), 7,77 (s, 1H), 8,01 (brs, , 3H, NH₃ ⁺), 8,12 (s, 1H). MS (m/z)143,l (M+l).

Krok 3

5-(2-Oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3karboxylová kyselina (113 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s l-amino-3(1.2.3) triazol-l-yl-propan-2-olem (85 mg, 0,48 mmol) k precipitaci (2-hydroxy-3(1.2.3) triazol-l-yl-propyl)-amidu 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (70 mg, 41 %).

’H NMR (DMSO-de) δ 2,45, 2,48 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3,35 (m, 2H), 4,02 (m, 1H), 4,32 (dd, >7,6, 14 Hz, 1H), 4,53 (dd, >3,4, 14 Hz, 1H), 5,43 (d, >5,6Hz, 1H, OH), 6,91 (d, >7,6Hz, 1H), 7,01 (t, >7,6 Hz, 1H), 7,15 (t, >8,0Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,12 (t, >5,6 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,77 (d, >7,6 Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 10,93 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 405,4 (M-l).

Příklad 10

Syntéza (2-hydroxy-3-[1.2.3]triazol-l-yl-propyl)-amidu 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-yliden-methyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-(5-Fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7pyrrol-3-karboxylová kyselina (120 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s l-amino-3(1.2.3) triazol-l-yl-propan-2-olem (85 mg, 0,48 mmol) k precipitaci (2-hydroxy-3[ 1,2.3]triazol-1 -yl-propyl)-amidu 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (100 mg, 62 %).

’H NMR (DMSO-dó) δ 2,42, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3,27 (m, 2H), 3,98 (m, 1H),

4,27 (dd, >7,6, 14 Hz, 1H), 4, 50 (dd, >3,4, 13,6 Hz, 1H), 5, 38 (d, >5, 6Hz, 1H, OH), 6,82 (dd, >4,4, 8,4Hz, 1H), 6,91 (td, 2>2, 4, 3>9,0Hz, 1H), 7,70 (m, 3H), 7,75 (dd, >2,4, 9,2Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 10,93 (s, 1H, CONH), 13,73 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 423,4 (M-l).

« · «· · * ···· • · ··· · ·« ·· • · · • · ··· • · · · · • · · « ·· ·· ·· * * • * · • ··· • ·

Příklad 11

Syntéza (2-hydroxy-3-[1.2.3]triazol-l-yl-propyl)-amidu 5-[5-chlor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-yliden-methyl]-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-(5-Chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylová kyselina (126,6 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s l-amino-3(l,2,3)triazol-l-yl-propan-2-olem (85 mg, 0,48 mmol) k precipitaci (2-hydroxy-3[ 1.2.3]triazol-1 -yl-propyl)-amidu 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (48 mg, 27 %).

'H NMR (DMSO-d₆) δ 2,42, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3,27 (m, 2H), 3,99 (m, 1H),

4,28 (dd, J=7,8, 14 Hz, 1H), 4,51 (dd, >3, 2,14 Hz, 1H), 5, 39 (d, 1=6,0Hz, 1H, OH), 6,85 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,12 (dd, J=2,0, 8,2Hz, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,74 (s, 1H), 7,97 (d, J=2,0Hz, 1H), 8,07 (s, 1H), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 439,4 (M-l).

Příklad 12

Syntéza (2-hydroxy-3-[1.2.3]triazol-l-yl-propyl)-amidu 5-[5-brom-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-yliden-methyl]-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-(5-Brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylová kyselina (144,4 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s l-amino-3(1.2.3) triazol-l-yl-propan-2-olem (85 mg, 0,48 mmol) k precipitaci (2-hydroxy-3[1.2.3] triazol-l-yl-propyl)-amidu 5-[5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH^r-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (130 mg, 67 %).

*H NMR (DMSO-d₆) δ 2,41, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3,27 (m, 2H), 3,99 (m, 1H),

4,28 (dd, J=7,6, 14 Hz, 1H), 4,50 (dd, J=3,6, 14 Hz, 1H), 5,40 (d, J=5,6Hz, 1H, OH), 6,81 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J=2,0, 8,0Hz, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,77 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,10 (d, J=l, 6Hz, 1H), 11,0 (s, 1H, CONH), 13,64 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 485,4 (M-l).

5-^58

Příklad 13 (2-Diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 1)

5-Fluor-l,3-dihydroindol-2-on (0,54 g, 3,8 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, čímž se získá 0,83 g (55 %) požadované sloučeniny ve formě žlutozelené pevné látky.

’H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J = 2,5 & 9,4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinyl), 7,37 (t, 1H, CONHCH₂CH₂), 6,91 (m, 1H), 6,81 - 6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH₂), 2,51 (m, 6H, 3xCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂). MS-EI m/z 398[M+],

Alternativní syntéza (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fIuor-2-oxo-l,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-lZ7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Hydrazin-hydrát (55 %, 3000 ml) a 5-fluorisatin (300 g) se zahřívají při teplotě 100°C. Během 120 minut se za míchání po částech (100 g) přidává 5-fluorisatin (500 g), směs se zahřívá při teplotě 110°C a míchá po dobu 4 hodin, směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevné podíly se spojí vakuovou filtrací, čímž se získá surový hydrazid (2-amino-5-fluor-fenyl)-octové kyseliny (748 g), který se suspenduje ve vodě (700 ml) a pH směsi se upraví na < 3 pomocí 12 N kyseliny chlorovodíkové. Směs se míchá po dobu 12 hodin při pokojové teplotě, pevné podíly se spojí vakuovou filtrací a promyjí vodou. Produkt se suší za vakua, čímž se získá 5-f!uor-l,3-dihydro-indol-2-on (600 g, 73% výtěžek) ve formě hnědého prášku.

’Η-NMR (dimethylsulfoxid-dó) δ 3,46 (s, 2H, CH₂), 6,75, 6,95, 7,05 (3 x m, 3H, aromatické), 10,35 (s, 1H, NH). MS m/z 152[M+1],

2-7’erc-butylester 4-ethylester 3,5-dimethyl-177-pyrrol-2,4-dikarboxylové kyseliny (2600 g) a ethanol (7800 ml) se intenzivně míchají za pomalého přivání 10 N kyseliny chlorovodíkové (3650 ml). Teplota se zvýší na 25°C až 35°C a začne se uvolňovat plyn. Směs se ohřeje na teplotu 54°C a míchá při zahřívání další hodinu, při které teplota vystoupá na 67°C. Směs se ochladí na teplotu 5°C a • ·

-59*4 4

4444 4 4

4 4

4 4 4 4

pomalu se za míchání přidá 32 litrů ledu a vody, pevný podíl se spojí vakuovou filtrací a promyje (3x) vodou, pevný podíl se suší na konstantní hmotnost, čímž se získá ethylester 2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1418 g, 87 % výtěžek) ve formě narůžovělé pevné látky.

'H-NMR (dimethylsulfoxid-dó) δ 2,10, 2,35 (2xs, 2x3H, 2xCH₃), 4,13 (q, 2H, CH₂), 6,37 (s, 1H, CH), 10,85 (s, 1H, NH). MS m/z 167[M+1],

Dimethylformamid (322 g) a dichlormethan (3700 ml) se ochladí v ledové lázni na teplotu 4°C a za míchání se přidá oxychlorid fosforečný (684 g). Pevný ethylester

2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (670 g) se pomalu po alikvótních částech přidává v průběhu 15 minut, přičemž maximální teplota dosáhne 18°C. Směs se zahřívá k refluxu po dobu 1 hodiny, ochladí na teplotu 10°C v ledové lázni a najednou se za intenzivního míchání přidá 1,6 litrů ledové vody. Teplota se zvýší na 15°C, za intenzivního míchání se přidá 10N kyselina chlorovodíková (1,6 litrů), teplota se zvýší na 22°C, směs se nechá stát po dobu 30 minut a vrstvy se oddělí, přičemž teplota dosáhne maximálně 40°C, vodná vrstva se upraví na pH 12-13 pomocí 10 N hydroxidu draselného (3,8 litrů) takovým způsobem, aby teplota během přidávání dosáhla a udržela se na 55°C. Po přidání se směs ochladí na teplotu 10°C a míchá po dobu 1 hodiny, pevný podíl se spojí vakuovou filtrací a promyje vodou, čímž se získá ethylester 5-formyl-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3karboxylové kyseliny (778 g, 100 % výtěžek) ve formě žluté pevné látky.

'H-NMR (DMSO-d₆) δ 1,25 (t, 3H, CH₃), 2,44, 2,48 (2xs, 2x3H, 2xCH₃), 4,16 (q, 2H, CH₂), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH). MS w/z 195[M+1],

Ethylester 5-formyl-2,4-dimethyI-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (806 g), hydroxid draselný (548 g), voda (2400 ml) a methanol (300 ml) se refluxují po dobu 2 hodin za míchání, pak ochladí na teplotu 8°C. Směs se extrahuje (2x) dichlormethanem, vodná vrstva se upraví na pH 4 použitím 1000 ml 10 N kyseliny chlorovodíkové, přičemž teplota se udržuje pod 15°C. Kvůli míchání se přidá voda, pevný podíl se spojí vakuovou filtrací, promyje (3x) vodou a suší za vakua při teplotě 50°C, čímž se získá 5-formyl-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylová kyselina (645 g, 93,5% výtěžek) ve formě žluté pevné látky.

‘H-NMR (DMSO-de) δ 2,40, 2,43 (2xs, 2x3H, 2xCH₃), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (br s, 2H, NH+COOH). MS m/z 168[M+1], • » • · · · · · · ·

I ··· · ·· ·· •60

5-Formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylová kyselina (1204 g) a 6020 ml dimethylformamidu se míchá při pokojové teplotě, přičemž se přidá hydrochlorid l-(3-dimethyl-aminopropyl-3-ethylkarbodiimidu (2071 g), hydroxybenzotriazol (1460 g), triethylamin (2016 ml) a diethylethylendiamin (1215 ml), směs se míchá po dobu 20 hodin při pokojové teplotě, zředí 3000 ml vody, 2000 ml solanky a 3000 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a pH se upraví na > 10 použitím 10N hydroxidu sodného. Směs se extrahuje 2 x 5000 ml 10% methanolu v dichlormethanu. Spojené extrakty se suší nad bezvodým síranem hořečnatým a odpařují na rotační odparce do sucha. Směs se zředí 1950 ml toluenu a znovu zahušťuje na rotační odparce. Zbytek se trituruje směsí (3:1) hexan:diethylether (4000 ml). Pevné podíly se spojí vakuovou filtrací, promyjí 2 x 400 ml ethylacetátu a suší za vakua při teplotě 34°C po dobu 21 hodin, čímž se získá (2-diethylamino-ethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (819 g, 43% výtěžek) ve formě světle hnědé pevné látky.

'H-NMR (dimethylsulfoxid-d₆) δ 0,96 (t, 6H, 2xCH₃), 2, 31, 2,38 (2xs, 2 x CH₃), 2,51 (m, 6H 3xCH₂), 3,28 (m, 2H, CH₂), 7,34 (m, 1H, amid NH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, pyrrol NH). MS m/z 266[M+1], (2-Diethylaminoethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny (809 g), 5-fluor-l,3-dihydro-indol-2-on (438 g), ethanol (8000 ml) a pyrrolidin (13 ml) se zahřívají při teplotě 78°C po dobu 3 hodin. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevné podíly se spojí vakuovou filtrací a promyjí ethanolem, pevné podíly se smíchají s ethanolem (5900 ml) při teplotě 72°C po dobu 30 minut. Směs se ochladí na pokojovou teplotu. Pevné podíly se spojí vakuovou filtrací, promyjí ethanolem a suší za vakua při teplotě 54°C po dobu 130 hodin, čímž se získá (2-diethylamino-ethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-líř-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1013 g, 88% výtěžek) ve formě oranžové pevné látky.

¹ H-NMR (dimethylsulfoxid-dó) δ 0,98 (t, 6H, 2xCH₃), 2,43, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH₃), 2,50 (m, 6H, 3x CH₂), 3,28 (q, 2H, CH₂), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5xm, 5H, aromatické, vinyl, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pyrrol NH). MS m/z 397[M-1].

• · fa

-6-1 • * · · * ·

Sůl (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l W-pyrrol-3-karboxylové kyseliny a kyseliny jablečné může být připravena podle přihlášky vynálezu US č. 10/281,985, podané 13. srpna 2002, která nárokuje prioritu z prozatímní přihlášky US č. 60/312,353, podané 15. srpna 2001, které jsou zde celé uvedeny jako odkaz.

Syntéza 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, 5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-lfí^r-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, 5-(2-oxo-l,2dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny je popsána v č. 09/783,264 podané 14. února 2001, pod názvem PYRROL SUBSTITUTED 2-INDOLINONE-PROTEIN KINASE INHIBITORS, jejíž popis je zde celý uveden jako odkaz.

Příklad 14 (2-PyrroIidin-1 -yl-ethyl)-amid 5-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 2)

5-Fluor-l,3-dihydro-indolin-2-on se kondenzuje s (2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, čímž se získá požadovaná sloučenina. MS + ve APCI 397 [M+l].

Příklad 15 (2-Ethylamino-ethyl)-amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 8) (2-Ethylamino-ethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (99 g), ethanol (400 ml), 5-fluor-2-oxindol (32 g) a pyrrolidin (1,5 g) se za míchání refluxují po dobu 3 hodin. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevné podíly se spojí vakuovou filtrací, míchají v ethanolu při teplotě 60°C, ochladí na pokojovou teplotu a spojí vakuovou filtrací, produkt se suší za vakua, čímž se získá (2-ethylamino-ethyl)-amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (75 g, 95% výtěžek).

-6261 • · · ·· · · · • 9 · 9 · · · • · 9 · · · · · 9 9 9 • 999 99 99 999 · ·♦·

9999 99 9

99 99 99 9 ‘H-NMR (dimethylsulfoxid-d₆) δ 1,03 (t, 3H, CH₃), 2,42, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH₃), 2,56 (q, 2H, CH₂), 2,70, 3,30 (2xt, 4H, 2xCH₂), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5xm, 5H, aromatické, vinyl a CONH), 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s, 1H, pyrrol NH).

MS m/z 369 [M-l],

Příklad 16

3-5[Methyl-2-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-177-pyrrol-3-yl]propionová kyselina (Sloučenina 10) l,3-Dihydroindol-2-on se kondenzuje s 3-(2-formyl-5-methyl-l/7-pyrrol-3yl)-propionovou kyselinou, čímž se získá požadovaná sloučenina.

Příklad 17 (2-Morfolin-4-yl-ethyl)-amid 5-(5-f1uor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 3)

5-Fluor-l,3-dihydro-indolin-2-on se kondenzuje s (2-morfolin-l-yl-ethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, čímž se získá požadovaná sloučenina.

Biologické příklady

První použitou buněčnou linií byla OC1-AML5 buněčná linie, která exprimuje FLT-3 tyrosinkinázu. Tato buněčná linie byla uchovávána v konvenčním médiu obsahujícím cytokiny k zachování růstu v tekuté kultuře. Tato buněčná linie poskytuje model pro stanovení aktivace a inhibice přenosu signálu FLT-3 přes ligand FLT-3 a sloučeninami, které mohou inhibovat FLT-3. Pomocí této buněčné linie mohou být stanoveny biologické následky FLT-3.

Příklad 1 - Test přenosu signálu FLT-3

Buňky byly stimulovány ligandem FLT-3 a lyžovány. FLT-3 byla imunoprecipitována z lyzátů komerčně dostupnou protilátkou. Proteiny byly • « · ···· · ··· ······ · · ··· ····

separovány gelovou elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, převedeny do membrán a analyzovány technikou Western blotting na fosfotyrosin a následně na celkový protein FLT-3 jako kontrolní měření.

0C1-AML5 buněčná linie, která exprimuje standardní typ FLT-3 byla získána u firmy Pharmacia. Nejprve byla testována schopnost ligandů FLT-3 stimulovat a schopnost sloučeniny 1 inhibovat biologické odpovědi zprostředkované FLT-3 analýzou životaschopnosti buněk (testem s trypanovou modří) a proliferace buněk (testem s alamarovou modří). Z dat vyplývá, že ligand FLT-3 zvyšoval počet buněk, přičemž byla pozorována určitá inhibice v reakci na sloučeninu 1, z čehož se vyvodilo, že sloučenina 1 inhibuje FLT-3.

Příklad 2 - exprese a fosforylace FLT-3 technikami imunoprecipitace/Westernové analýzy (i) 0C1-AML5 buňky

Při testech s 0C1-AML5 buňkami bylo pozorováno, že ligand FLT-3 stimuluje fosforylaci FLT-3. Fosforylace byla redukována sloučeninou 1, což potvrzuje závěr, že sloučenina 1 inhibuje receptor FLT-3.

Rovněž byla zkoumána aktivace dráhy ve směru toku ligandem FLT-3, specificky pro Stat5 a erk, což jsou mediátory přenosu signálu ve směru toku RTK a mohou poskytovat informace o přenosu signálu FLT-3. Stát 5 je transkripční faktor, který reguluje mnoho genů podílejících se na přežití buněk a proliferaci. Erk‘A jsou kinázy v dráze přenosu signálu Raf. Aktivace Stat5 byla pozorována v reakci na ligand FLT-3 prostřednictvím 3 přístupů; IP/Western, přímý Western pomocí fosfo-specifických protilátek a analýzou posunu gelu. Aktivita Stat5 byla inhibována sloučeninou 1. Fosforylace erk A byla také aktivována ligandem FLT-3 a inhibována sloučeninou 1, kdežto IL-3 dependentní aktivace erk nebyla inhibována, z čehož lze usuzovat, že účinek sloučeniny 1 je specifický.

(ii) normální PBMC

K prozkoumání přenosu signálu FLT-3 v normálních krvinkách byly izolovány periferní krevní jednojaderné buňky (PBMC) z normální krve od dárců a byly používány k přenosu signálu FLT-3. Jen slabě byla detekována ligandem FLT-3 stimulovaná fosforylace Stat5 v PBMC a aktivovaná FLT-3.

• · ·· ·· ·· · • · · · · · · · · ··· · ··♦· · ··· • ···· ♦· ·· · · · · ···· • · · · · · · · ·

Příklad 3 - Použití dalších buněčných linií; MV411 (ITD mutantní FLT-3) a RS411 (standardní typ FLT-3) ke sledování účinků sloučeniny 1 na proliferaci in vitro.

Tento příklad byl prováděn kvůli stanovení, zda-li inhibice přenosu signálu FLT-3 sloučeninou 1, která byla pozorována v 0C1-AML5 buněčných liniích, bude také pozorována u standardního typu (RS411) nebo mutantní FLT-3 (MV411).

Buněčné linie byly získány u ATCC. Analýza buněčné proliferace ukázala, že sloučenina 1 inhibovala expanzi RS411 (standardní typ FLT-3) i MV411, což ukazuje, že sloučenina 1 by potencionálně mohla postihovat ITD mutantní FLT-3 v leukémiích, kromě zasažení standardního typu FLT-3.

K prokázání, zda-li budou ITD-mutantní buňky vykazovat zvýšenou citlivost vůči sloučenině 1, byly provedeny další experimenty. Apoptóza byla měřena analýzou štěpení PARP a značením kaspázou 3. Obě metody ukázaly, že sloučenina 1 způsobuje apoptózu, a že ITD-mutantní buňky byly mnohem citlivější než buňky standardního typu. Viz obrázky 1 a 2.

Příklad 4 - Účinek sloučeniny 1 na fosforylaci FLT-3 v MV411 (ITD mutantní FLT-3) a RS411 (standardní typ FLT-3)

FLT-3 byl imunoprecipitován z lyzátů komerčně dostupnou protilátkou. Proteiny byly separovány gelovou chromatografií na SDS-polyakrylamidu, převedeny do membrán a analyzovány technikou Western blotting na fosfotyrosin a následně na celkový protein FLT-3 jako kontrolní měření.

IP/W analýza ukázala, že sloučenina 1 inhibuje fosforylaci FLT-3 v MV411 (ITD mutantní FLT-3) i RS411 (standardní typ FLT-3) buněčných linií. Přibližné hodnoty IC50 pro sloučeninu 1 v WT a ITD mutantní FLT-3 jsou 250 nM, resp. 50 nM, což ukazuje, že ITD mutanty zvyšovaly citlivost vůči sloučenině 1. Viz obrázek 3. Srovnávací příklad je známý inhibitor proteinkinázy mající následující obecný vzorec:

Srovnávací sloučenina nevykazovala žádnou inhibici jak u standardního typu FLT-3, tak i u mutantní FLT-3.

++: inhibice +/-: slabá inhibice

-: žádná inhibice nd: nedetekováno

Příklad 5 - Provedení modelu naočkování krve s MV411 (ITD mutantní FLT3) a RS411 (standardní typ FLT-3) k sledování účinků sloučeniny 1 in vitro

Model naočkování krve je ex-νίνο model, který byl vyvinut ke snadnému převedení preklinických pozorování s in vitro modely na klinické případy. U pacientů s leukémií, kde jsou cíle exprimovány na krvinkách, je žádoucí • ·

• · · · · · · • · · · · · · · · · · ···· * · ·· ··· ···· • · · · · ·· · • ·· · · ·· · monitorovat účinky léků analýzou cílové (např. FLT-3) fosforylace v krvinkách nebo celé krvi. V modelu naočkování krve jsou buňky exprimující požadovaný receptor vpraveny do normální lidské krve od dárců (normální krev neexprimuje vysoké hladiny cílového proteinu). Sloučenina a ligand jsou přidány podle potřeby a buňky jsou pak lyžovány a analyzovány na fosforylaci proteinu a expresi imunoprecipitací a analýzou Western blotting. Tento stav mimikuje klinické případy a umožňuje predikovat dobu a závislost dávky na sloučenině potřebné k inhibici cíle.

K predikci schopnosti sloučeniny 1 inhibovat fosforylaci FLT-3 v leukémii byly buněčné linie exprimující FLT-3 přidány do normální lidské krve od dárců a byly měřeny kinetiky a inhibice fosforylace závislé na dávce. Tato metoda by měla poskytovat přesnější stanovení expozice sloučeniny, která je potřebná k inhibici cílové fosforylace než konvenční biochemické nebo buněčné testy prováděné v umělém médiu.

Příklad 6 - Stabilizace in vivo modelů pomocí MV411 a RS411 buněk a účinnost sloučeniny 1 na tumorogenezi.

Nádorové buňky MV411 v uvedeném příkladu byly implantovány subkutánně do zadního boku athymických myší. Ošetření sloučeninou nebo kontrolním nosičem bylo započato v době, kdy nádory dosáhly specifické velikosti. Pro měření účinnosti byl růst nádoru změřen v různých dobách posuvným měřítkem s noniem. Pro analýzu fosforylace byly nádory resekovány po dávkování (zde 4 hodiny), rozemlety v tekutém dusíku a homogenizovány v lyzovacím pufru. FLT-3 a Stat5 fosforylace byly měřeny imunoprecipitací a analýzou Western blotting.

Athymické myši byly injektovány subkutánně MV411 a RS411 buňkami za účelem tvorby nádoru. Injektování MV411 vedlo k rychlé tvorbě nádoru, zatímco RS411 buňky tvořily nádor mnohem pomaleji. Ošetření sloučeninou 1 dramaticky snížilo velikost nádoru na téměř nedetekovatelnou hladinu v průběhu 4 dnů léčení. Navíc aktivovaná FLT-3 byla detekovatelná u neošetřovaných nádorů a zcela inhibována po 4 hodinovém ošetření sloučeninou 1. Viz obrázek 4a a 4b. Tato data • 99 9 • 9999 9 999

99 999 9 999

9 9 9 9 9 9

99 99 9 ukazují, že sloučenina má účinnost vůči FLT-3 řízeným nádorům in vivo, což je v souladu s inhibici fosforylace FLT-3.

Příklad 7 - In vivo model kostní dřeně pro produkci VEGF

NOD-SCID myši byly předem léčeny cyklofosfamidem (Neosar, Pharmacia, Kalamazoo, MI) intraperitoneální injekcí 150 mg/kg/denně po dobu 2 dnů⁽⁴⁶⁾, po 24 hodinách odpočinku následovala intravenózní (i.v.) injekce 5 X 10⁶ buněk skrz ocasní tepnu. Na koncích experimentu byly myši anestetizovány, poté byl proveden odběr terminální krve intrakardiální punkcí. Buněčné suspenze kostní dřeně byly připraveny propláchnutím stehenních kostí myší studeným sterilním PBS. Rozsah dávek sloučeniny 1 nebo jejího nosiče byl perorálně podáván jednou denně, jak je uvedeno na obrázku a v legendě k tabulce. U všech studií byl k stanovení rozdílů mezi ošetřovanými a kontrolními skupinami používán Studentův test (P < 0,05 bylo považováno za signifikantní)

	MV411	OC1-AML5	RS411
Slouč.l μΜ	Střední sd	%	Střední sd	%	Střední sd	%
0	346,7 100,	±	100,8 ±	100,	31,03 ±	100,
0,00	287,8 83,0	±	92,5 ±	91,8	32,82 ±	105,
0,01	65,4 ± 18,9		35,6 ±	35,3	9,62 ±	31,0
0,1	31,2 ±	9,0	33,6 ±	33,3	1,24 ±	4,0
1	30,5 ±	8,8	28,3 ±	28,0	2,3 ±	7,4
10	23,3 ±	6,7	15,6 ±	15,5	2,94 ±	95

Z dat uvedených výše vyplývá, že ošetřením sloučeninou 1 dochází k prodloužení přežití způsobem, který je závislý na dávce s nejvyšší účinností při 20 mg/kg/denně sloučeniny 1.

• 9 99 99 9 • 9 9 9 9 9

9 999 9 9 9 9

9999 99 99 9*9 9 9999 • 9999 99 9

9· 99 99 9

Příklad 8 - Detekce VEGF v NOD-SCID myších

Plazma z NOD-SCID myší popsané výše bylo analyzováno technikou ELISA na hladiny VEGF proteinu komerčně dostupným kitem. V souladu s in vitro daty ukazujícími, že aktivace FLT-3 (standardní typ nebo ITD) korelují se sekrecí VEGF (jak je vidět z tabulky výše), která je inhibována sloučeninou 1, bylo stanoveno, že VEGF byla detekovatelná v plazmě nemocných myší (průměr 49 pg/ml), které byly ošetřovány sloučeninou 1. Z těchto dat vyplývá, že VEGF je cílem přenosu signálu FLT-3 a může být biologickým markérem pro aktivitu FLT3.

Příklad 9 - In vivo lidská studie inhibice fosforylace FLT-3

Byla provedena fáze I klinické studie jednorázové dávky u pacientů s AML. Primárním záměrem bylo stanovit modulaci (inhibici) fosforylace FLT-3. Všichni pacienti také měli korelativní farmakokinetiky a provedenou genotypizaci FLT-3. Fosforylace FLT-3 byla analyzována před dávkováním a v 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 hodinu po podání sloučeniny 1. Metody vývoje ukázaly, že optimální metodou k usnadnění analýzy fosforylace FLT-3 bylo přímé přidání celé krve, jakmile byla odebrána od pacientů s AML, do lyzovacího pufru před zmrazením v suchém ledu.

Následně byly vzorky rozmraženy a analyzovány na fosforylaci FLT-3 imunosupresí anti-FLT-3 protilátkami konjugovanými na korálcích, poté analýzou Western blotting fosfo-tyrosinu a FLT-3 jako u modelu naočkování krve (příklad 5). Primární koncový bod, > 50% inhibice fosforylace FLT-3 v 3/6 pts, byl dosažen v 3 pts u každé hladiny dávky > 200 mg, včetně pacientů s WT i mutantní FLT-3. Uvedeni jsou dva pacienti. Data získaná při této studii byla v souladu s preklinickými daty z in vitro a in vivo modelů a potvrzovala, že sloučenina 1 inhibuje FLT-3 u lidí. Tato nová studie jednorázové dávky využívající analýzu celé periferní krve demonstruje, že sloučenina 1 moduluje FLT-3 a dráhy přenosu signálu ve směru toku, který zprostředkovává přežití a proliferaci AML blastů in vivo.

··· • · ···

69^

Postup odběru krve pro studie modulace cílového receptoru

A. Lyzovací pufr s přiváděným Sugenem (20 ml zmrazených alikvótních podílů, 1,5 X zásobního roztoku je připraveno způsobem uvedeným níže):

i. Rozmražený lyzovací pufr (1,5 X zásobního roztoku obsahuje inhibitory proteázy/fosfatázy) o pokojové teplotě. 20 ml lyzovacího pufru je třeba pro každých 10 ml krve.

ii. Skladování rozmraženého lyzovacího pufru v ledu iii. Odebrání krve a přidání 10 ml krve do 20 ml lyzovacího pufru.

iv. Smíchání několikanásobným převrácením a okamžitým umístněním do suchého ledu nebo při teplotě -70°C.

v. Skladování při teplotě -70°C a přenos do suchého ledu.

(i) Složení lyzovacího pufru - celkem 500 ml z 1,5 X zásobního roztoku

Objem	Zásobní roztok	Finální koncentrace
10 ml	1M Tris, pH 7,5	20mM
13,7 ml	5M NaCl	137 mM
50 ml	Glycerol	10%
5 ml	NP-40	1%
5 ml	10% SDS	0,1%
2 ml	0,5 EDTA	2mM

Deionizovaná voda se přidá do 500 ml. Pak se směs filtruje přes 0,2 μΜ filtr. Směs se skladuje při teplotě 4°C nebo v alikvótních podílech při teplotě 20°C, pokud se přidají inhibitory proteázy.

(ii) Přidání inhibitorů proteázy

Do 9 ml 1,5 X lyzovacího pufru se přidá:

Obj em 0,5 ml

Zásobní roztok lMNaF

Finální koncentrace 50mM

100 μΐ 100mMNa3V04 1 mM

200 μΐ směs inhibitoru proteázy

200 μΐ lOOmM (PefaBloc* nebo PMSF)

2mM

0000 · • Φ0 0 0 0 0 0 · 0000 0 0 0 • 0 0

7Θ~~ '

Směs inhibitoru proteázy =100 μΜ leupeptinu, 200 μΜ pepstatinu, 60 μΜ aprotoninu, 2mM bestatinu.

PefaBloc je stabilnější, ve vodě rozpustnější forma PMSF dostupná u Boehringer Mannheim.

Způsob analýzy fosforylace FLT-3 v krvi: Zmrazené vzorky byly do použití skladovány při teplotě -70°C. Krevní lyzáty byly ihned rozmraženy na teplotu 37°C a lyžovány v 2 X objemu lyzovacího pufru (20mM Tris, pH 7,5, 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP - 40,0, 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM NasVCL, 2 mM Pefabloc, 2 pg/ml aprotonin, 3,5 pg/ml betstatin, 0,5 pg/ml E - 64, 0,5 pg/ml leupeptinu a 0,7 pg/ml pepstatinu A). Množství proteinu v každém lyzátu bylo stanoveno testem BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, II). Přibližně 35 mg lyzátu z každého vzorku bylo imunoprecipitováno na FLT-3, c-kit nebo Stat5.

Immunoprecipitace a Western Blotting (IP/W): Buňky byly lyžovány v lyzovacím pufru (20 mM Tris, pH 7,5; 137 mM NaCl; 10% glycerol; 1% NP - 40;

0,1% SDS; 2 mM EDTA) obsahujícím inhibitory proteázy a fosfatázy (50 mM fluoridu sodného, 1 mM orthovanadičnanu sodného, 2 mM Pefabloc, 1,2 mM aprotininu, 40 mM bestatinu, 5,6 mM E - 64,4 mM leupeptinu a 4 mM pepstatinu A). Ekvivalentní množství proteinu bylo separováno technikou SDS-PAGE, poté převedeno na nitrocelulózové membrány. K analýze fosforylace FLT-3 byla ekvivalentní množství proteinu z každého vzorku imunoprecipitována přes noc při 4°C s anti-FLT-3 protilátkou konjugovanou k agaróze (Santa Cruz Biotechnology,

Santa Cruz, CA). Imunitní komplexy se promyly (150 mM NaCl, 1,5 mM MgCU, mM HEPES, pH 7,5, 10% glycerol, 0,1% Triton X -100 a 1 mM EGTA), poté následovalo SDS-PAGE. Proteiny byly převedeny na nitrocelulózové membrány. Membrány byly zkoumány anti-fosfotyrosinovou protilátkou (Upstate, Lake Placid, NY nebo Transduction Laboratories, Lexington, KY), pak stripovány pomocí Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce, Rockford, IL). Membrány byly znovu zkoumány anti-FLT-3 protilátkou (Santa Cruz Biotechnology). Stat5 protilátky pro imunoprecipitaci a analýzu Western blotting byly získány u firmy Upstate Biotechnology, resp. Transduction labs.

Odborníkům v oboru bude jistě zřejmé, že ve způsobech a přípravcích podle předloženého vynálezu mohou být bez odchýlení se od rozsahu a charakteru

99 99 99 *

9 9 9 9 9 9 · 9999 9 999

9999 99 99 999 9 ····

9999 99 9

99 99 99 9 předloženého vynálezu provedeny různé změny a modifikace. Tím je zamýšleno, že tento vynález pokrývá tyto změny a modifikace za předpokladu, že jsou v rozsahu přiložených nároků a jejich ekvivalentů.

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití sloučeniny obecného vzorce (I), substituent R je nezávisle H, OH, alkyl, aryl, cykloalkyl, heteroaryl, alkoxyskupina, heterocykl a aminoskupina;

   každý substituent Ri je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, halogenu, arylu, alkoxyskupiny, halogenalkylu, halogenalkoxyskupiny, cykloalkylů, heteroarylu, heterocyklu, hydroxyskupiny, -C(O)-R₈, -NR9R10, -NR9C(O)-Ri₂ a -C(O)NR₉R₁₀;

   každý substituent R₂ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, arylu, heteroarylu, -C(O)-R₈ a SO₂R, kde substituent R je alkyl, aryl, heteroaryl, NR9R10 nebo alkoxyskupina;

   každý substituent R5 je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, halogenalkylu, cykloalkylů, heteroarylu, heterocyklu, hydroxyskupiny, -C(O)-R₈ a (CHR)_rRn;

   X je O nebo S;

   j je 0 až 1;

   p je 0 až 3;

   q je 0 až 2;

   r je 0 až 3;

   substituent R₈ je vybrán ze skupiny sestávající z -OH, alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylů a heterocyklu;

   7-2·· substituenty R₉ a Rio jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z H, alkylu, arylu, aminoalkylu, heteroarylu, cykloalkylu a heterocyklu, nebo substituenty R₉ a Rio společně s N mohou vytvářet kruh, kde atomy kruhu jsou vybrány ze skupiny sestávající z C, N, O a S;

   substituent Rn je vybrán ze skupiny sestávající z -OH, aminoskupiny, monosubstituované aminoskupiny, disubstituované aminoskupiny, alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylu a heterocyklu;

   substituent R12 je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, arylu, heteroarylu, alkoxyskupiny, cykloalkylu a heterocyklu;

   Z je -OH;

   -Oalkyl;

   -NR3R4, kde substituenty R₃ a R₄ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu, cykloalkylu a heterocyklu, nebo substituenty R₃ a R₄ mohou být spojeny s N za vzniku kruhu, kde atomy kruhu jsou vybrány ze skupiny sestávající z CH₂, N, O a S nebo kde Y je nezávisle CH₂, O, N nebo S,

   Q je C nebo N;

   n je nezávisle 0 až 4; a m je 0 až 3; nebo její soli, pro přípravu léčiva pro léčení akutní myeloidní leukemie (AML) u pacientů, kteří jsou FLT-3-ITD pozitivní.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde substituent Ri je halogen a p je 1.
3. 3. Použití podle nároku 2, kde halogen je vybrán z F a CL
4. 4. Použití podle nároku 2, kde Z je -NR₃R₄, kde substituenty R₃ a R₄ vytvářejí morfolinový kruh.

   Ή
5. 5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde substituent R2 je methyl a q je 2, přičemž methyly jsou připojeny v poloze 3 a 5.
6. 6. Použití podle nároku 1, kde Z je:

   kde každé Y je CH2, každé nje 2, mje 0 a substituenty R3 a R4 vytvářejí morfolinový kruh.
7. 7. Použití podle nároku 1, kde uvedenou sloučeninou je sloučenina obecného vzorce (II):

   (^{10 11}).
8. 8. Použití podle nároku 7, kde substituent R5 je H.
9. 9. Použití podle nároku 7, kde substituent R2 je methyl, q je 2, kde methyly jsou připojeny v polohách 3 a 5.
10. 10. Použití podle nároku 1, kde akutní myeloidní leukémii je pozitivní na standardní typ FLT-3.

    99 ·· ♦ · 9 9

    99 9

    9 9 9 • 9 9 9

    9 · · ···9

    9 9 9
11. 11. Použití podle nároku 1, kde uvedená sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající z:

    kdeXjeF, Cl, I nebo Br.
12. 12. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce (I) je vybrána ze skupiny sestávající z:

    • Μ
13. 13. Způsob in vitro detekce inhibice fosforylace FLT-3 a analýzy fosforylace v periferní krevní buňce nebo krevním lyzátu, vyznačující se tím, že zahrnuje • · ·

    99 ·9·· ·· 9 • * 9 • *99 • · 9999 «99 kontaktování uvedené buňky nebo buňkového lyzátu s inhibičním množstvím sloučeniny definované v nároku 1.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že FLT-3 je vybrán ze skupiny sestávající ze standardního typu FLT-3 a mutantního FLT-3.
15. 15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že FLT-3 je FLT-3-ITD.
16. 16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15, vyznačující se tím, že fosforylace FLT-3 je detekována měřením zvýšené exprese VEGF proteinu.
17. 17. In vitro způsob inhibice fosforylace FLT-3 v buňce nebo buňkovém lyzátu, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování uvedené buňky nebo buňkového lyzátu s inhibičním množstvím sloučeniny definované v nároku 1.
18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že FLT-3 je vybrán ze skupiny sestávající ze standardního typu FLT-3 a mutantního FLT-3.
19. 19. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že FLT-3 je FLT-3-ITD.