TWI259081B

TWI259081B - Treatment of acute myeloid leukemia with indolinone compounds

Info

Publication number: TWI259081B
Application number: TW091125049A
Authority: TW
Inventors: Ann-Marie O'farrell; Julie Cherrington
Original assignee: Sugen Inc
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2006-08-01
Also published as: PL370553A1; WO2003035009A2; US20030130280A1; ZA200403091B; KR20040062591A; MXPA04003853A; EP1446117A2; NZ532405A; CA2464790A1; EP1446117A4; HUP0500422A3; HUP0500422A2; BR0213960A; IS7222A; CN101052394A; WO2003035009A3; TNSN04065A1; JP2005511540A; AU2002360314B2; IL161378A0

Description

1259081 公告本五、發明説明（1 ) 相關申請案本申請案係請求關於美國臨時專利申請案序號60/330,623 之優先權，其係據此以其全文併於本文供參考。發明範圍本發明係關於一種藉由投予啕哚啉酮化合物以治療急性骨髓性白血病之方法。急性骨髓性白血病（AML)為一種其中癌細胞係於血液與骨髓中發展之疾病。未經治療之AML為具有平均存活時間為3個月之致死疾病。具有AML之病患為 FLT-3-ITD (内部協力複製）陽性，其典型上對傳統化學療法顯示不良回應。本發明係針對藉由投予式I或II之㈣嗓4 i同化合物，以治療AML病患，且較佳為對FLT-3-ITD為陽性之病患，但不限於FLT-3-ITD。本發明亦針對一種抑制FLT-3之磷醯化作用之方法。發明背景急性骨髓性白血病，亦稱為急性非淋巴球白血病，為一種癌症形式，其中係於血液與骨髓中發現太多未成熟之白血球。此等未成熟細胞，亦稱為胚細胞，未能發展成為成熟之與感染搏鬥之細胞。於AML治療上之進展，已造成實質上經改良之完全緩解率。治療係強效達成完全缓解，因為部份緩解並沒有提供實質存活利益。大約60%至70%患有AML之成人，在適當謗發治療後，可預期會達到完全緩解狀態。超過15%患有 AML之成人（達到完全缓解者之約25% )可預期會存活3年或更多年，且可被治癒。在成人AML中之缓解率係與年齡呈 -4- 本纸条尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7

五、發明説明（2 B7 逆相關，其中對於比60歲年輕者，所預期之緩解率係大於 65%。數據指出，一旦達到時，於較年老病患中之緩解期間可能較短。於誘發期間增加之發病率與死亡率，似乎直接與年齡有關聯。其他不利預後因素，包括中樞神經系統涉及白血病、於診斷下之系統性感染、高白血球計數（每立方亳米>100,000)、治療所引致之AML及脊髓發育不良徵候簇之病歷。對於未接受造血幹細胞移植之復發病患而言，5年疾病自由存活者係低於5%。受體酪胺酸激酶（RTK)之突變型，包括cKIT、PDGFR冷及 FLT-3，已在人類白血病中發現。FLT-3之突變型包括任何 FLT-3基因順序之任何改變，包括點突變、刪除、插入、内部協力複製、多晶型現象。FLT-3中已知突變之一種實例，為在人類FLT-3中胺基酸殘基835處之單點突變，於大約7% 病患中確認，如在Abu-Duhier等人，（Br J Haematol 2001年6月； 113(4) : 983-8,新穎FLT-3 Asp835突變在成人急性骨髓性白血病中之確認，Abu-Duhier FM，Goodeve AC，Wilson GA, Care RS，Peak IR， Reilly JT)中所報告者。此突變係於FLT-3之活化圈環中，且可能會對其他酪胺酸激酶受體，譬如c-kit，造成以同種性為基礎之構成活化作用。 FLT-3基因之近細胞膜（JM)功能部位-編碼順序之内部協力複製（ITD)，係為最經常突變之一（AML病患之乃％ 40% )。 ITD為内部協力複製，於近細胞膜功能部位中發現之突變，重複範圍在大小上，但4复製順序似乎總是在架構中。FLT-3 突變型已被發現於一些患有急性骨髓性白血病（AML)之病患 -5- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（3 ) 及3%脊髓發育不良徵候簇病例中，然而其較少出現在慢性骨髓性白血病與淋巴樣惡性病症中。FLT-3基因突變之存在，係與高末梢白血球計數有關。FLT-3基因之ITD時常出現於MDS之進展期間，或在最初診斷沒有ITD之AML復發時。這指出FLT-3突變會促進白血病進展。參閱Zhao等人，白血病，第 14 卷，第 374-378 頁（2000)。 FLT-3 (fins狀酪胺酸激酶3)為第III類受體酪胺酸激酶之一員。熟諳此藝者將明瞭FLT-3於科學文獻中亦已被稱為”flk2” 。於本文中使用之"FLT-3”，係指一種多肽，其具有例如在收受號碼gi丨4758396 | ref | ΝΡ_004110·1丨fins-相關酪胺酸激酶 3 [人類]，或gi | 544320丨sp丨P36888丨FLT-3_人類FL細胞活素受體先質（酪胺酸-蛋白質激酶受體FLT-3)(幹細胞酪胺酸激酶 1)(STK-1)(CD135 抗原），或 gi 丨 409573 丨 gb | AAA18947.1 | (U02687)絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶[人類]中所提出之順序。最初兩個順序之相應mRNA收受號碼為gi | 4758395丨ref丨 NM—004119.1 丨人類 fms-相關酪胺酸激酶 3 (FLT-3)，mRNA gi | 406322丨611*|226652.1|1^?1^-31〇^人類？1^-3 1111^八，對 FLT-3受體酷胺酸激酶而言。關於FLT-3之回顧，可參閱 Gilliland，Current Opin· Hematol·，9 (4) 276-281，2002 年 7 月0

Zhao等人，白血病（2000)，進一步揭示突變型FLT-3轉變之老鼠白血病，以酪胺酸激酶抑制劑之活體内治療。在發展此治療擬案時，Zhao係研究酪胺酸激酶抑制劑，用於已轉變之32D細胞（一種IL-3依賴之老鼠細胞系）之活體外生長抑制用途。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（4 ) 受體酪胺酸激酶FLT-3之内部協力複製（ITD)突變，已在20-30%患有急性骨髓性白血病（AML)之病患中發現，參閱，例如Levis等人，Blood，第98卷，第885-887頁（2001)。熟諳此藝者將明瞭診斷FLT-3-ITD陽性病患，係容易地使用得自AML病患之基因組DNA之PCR與凝膠電泳測試法施行。參閱Abu-Duhier等人，英國血液學期刊，第11卷，第190-195頁（2000)。 FLT-3基因會使調節造血幹細胞增生與分化之酪胺酸激酶受體編碼。Levis揭示此等突變係於構成上活化該受體，並顯現出與對於化學療法之不良回應有關聯。証據指出此構成活化作用係為白血病原質性，使得此受體成為特殊療法之潛在標的。已知帶有ITD突變型FLT-3之病患，在習用治療後，相對於非ITD突變型之病患，具有不良預後、高復發率及降低之整體存活率。對AML之現行療法具有不良病患回應率與不良毒性作用形態。療法一般為非專一的，且並非只限於以害病細胞或以驅動惡性病症之機制為標的。會媒介細胞存活與增生訊息之FLT-3，其抑制係直接以白血病細胞為標的，抑制發出訊息作用，會造成消除白血病細胞個體群。基於對罹患ITD-AML病患之經改良預後之需求，本案發明人發展出一種藉由投予有效量之式I或Π酪胺酸激酶抑制劑，以治療急性骨體性白血病之方法。發明摘述本發明之一項具體實施例，係關於一種治療急性骨髓性白血病（AML)之方法，其包括對需要此種治療之病患投予有本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1259081 A7

境氧基、環烷基 R8係選自包括-OH、烷基、芳基、雜芳基、及雜環族；〜與係獨立選自包括Η、垸基、芳基、胺基燒基、雜芳，、我基及雜環族，或R9#RlQ—起和財形成環，其中環原子係選自包括C、N、〇及S; ’

Ru係選自包括-OH、胺基、單取代胺基、雙取代胺基、烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、環烷基及雜環族；儿 U選自包㈣基、芳基、雜芳基、燒氧基、環垸基及雜環族； z 為-OH ; -〇烷基； NR3及4，其中R3與R4係獨互選自包括氫、淀基、芳基、雜芳基、環烷基及雜環族，或&與&可和N合併，以形成環 ’其中環原子係選自包括CH2、N、〇及s，或

其中Y係獨立為CH2、〇、N或S， Q為C或N ; η係獨立為〇-4 ;及 m 為 0-3 ; 或其鹽。於本發明之一項具體貫施例中，當投予有需要之病患時本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公爱） 1259081 A7 B7

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（9 )

化合物10 本發明之另一項具體實施例係關於一種抑制FLT-3之磷醯化作用之方法，其包括對需要此種治療之病患投予抑制量之式I化合物： -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7

及雜環族； %與〜係獨立選自包括Η、燒基、芳基、胺基燒基 '雜芳，、環烷基及雜環族，或化與尺…一起和?^可形成環，其中環原子係選自包括C、Ν、〇及s ;

Ru係選自包括-ΟΗ、胺基、單取代胺基、雙取代胺基、烷基、方基、雜芳基、烷氧基、環烷基及雜環族； R12係選自包括貌基、芳基、雜芳基、燒氧基、環燒基及雜環族； z 為-OH ; 〇烷基； -Ni^R4，其中化與心係獨立選自包括氫、烷基、芳基、雜方基、環烷基及雜環族，或&與&可和N合併，以形成環，其中環原子係選自包括CH2、N、〇及s，或

其中Y係獨立為CH2、〇、N或s， Q為C或N ; η係獨立為〇-4 ;及 m 為 0-3 ; 或其鹽。在本發明之一項具體實施例中，FLT_3為突變型FLT_3或辱生型FLT-3。一種特定FLT-3突變型為;pLT-3-ITD。 -14-

I纸張尺度適用中國g家鮮(CNS) A4規格(21Gx 29?^y 1259081 A7 B7 五、發明説明（12 ) 附圖簡述圖1為卡斯蛋白酶-3沾染細胞系之FACS分佈形態。圖2係說明關於PARP分裂之Western氏沾吸，顯示FLT-3-ITD突變型細胞比野生型更容易接受化合物1所引致之細胞凋零。圖3係說明在FLT-3免疫沉殿作用之後，鱗酸酷胺酸之 Western氏沾吸，顯示化合物1會抑制野生型與突變型-ITD FLT-3兩者。圖4a係說明在FLT-3免疫沉澱作用之後，磷酸酪胺酸之 Western氏沾吸，顯示化合物1於異種移植模式中，抑制FLT-3-ITD磷醯化作用，而圖4b係說明一個顯示在藥物治療後之腫瘤大小對時間之圖表。圖5係說明改變化合物1劑量後之存活百分比。發明詳述式I與II化合物可用於治療患有AML之病患。特定言之，其可用於治療患有AML之病患，其係為FLT-3-ITD陽性。此外，被診斷患有肉瘤、黑色素瘤及固態腫瘤之病患，其中病理生理學顯示FLT-3-ITD或FLT-3係與該惡性病症有關聯，可經由投予式I或II化合物而被治療。本發明之一項具體實施例係關於一種治療急性骨髓性白血病（AML)之方法，其包括對需要此種治療之病患投予有效量之式I化合物： -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081

及雜環族；

Mr1g係獨立選自包括H、燒基、芳基、胺基燒基、雜芳基、環烷基及雜環族，或化與心^一起和^^可形成環，其中環原子係選自包括C、N、〇及s ;

Ri 1係選自包括-OH、胺基、單取代胺基、雙取代胺基、烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、環烷基及雜環族；

Rl2係選自包括烷基、芳基、雜芳基、燒氧基、環燒基及雜環族； Z 為·》〇Η ; -0烷基；，其中Rs與R4係獨立選自包括氫、烷基、芳基、雜万基、％烷基及雜環族，或心與心可和N合併以形成環，其中環原子係選自包括CH2、N、〇及3，或

其中Y係獨立為CH2、Ο、N或S， Q為C或N ; η係獨立為〇-4 ;及 m 為 0-3 ; 或其鹽。。於本發明之_項替代具體實施例巾，係將式I化合物投予需要AML治療之病|，其條件是該化合物不為3保二甲基· -17- 1259081 A7 B7 五、發明説明（15 ) 5-(2-酮基义2-二氫-亞啕哚基曱基）-1Η·吡咯各基]-丙酸。於本發明之另一項具體實施例中，治療方法係涉及對 AML病患投予有效量之化合物，其係選自包括 5·(5·氟基-2-酮基-1，2-二氫-亞啕哚各基甲基）-2,4•二甲基·m•吡洛-3·羧酸(2-二乙胺基-乙基）·醯胺（化合物i); 5·(5-氟基-2·酮基-1，2-二氫-亞啕哚各基甲基）-2,4_二曱基·1Η•吡咯各羧酸(2-四氫吡咯小基·乙基>醯胺（化合物2); 5-(5-氟基·2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚各基甲基）_2,4_二甲基·ιη·吡哈-3·羧酸(2-嗎福啉冰基-乙基）·醯胺（化合物3); (S)-5-(5-氟基-2-酮基-1，2-二氫-亞$丨嗓各基甲基）-2,4-二甲基_ 1Η·咐嘻-3-羧酸(2-羥基各嗎福啉冰基-丙基)·醯胺（化合物4); (R)_5-(5-氟基-2-酮基-1,2-二氫-亞，引哚-3-基曱基）-2,4-二甲基· 1Η-ρ比咯各羧酸（2-羥基各嗎福啉冰基-丙基）-醯胺（化合物5); 5分氟基冬酮基-1，2-二氫-亞吲哚各基甲基）-2,4-二甲基·1Η-吡嘻-3-羧酸(2-羥基·3-嗎福啉斗基-丙基)-醯胺（化合物6); 5-(5-氯基-2-酮基-1，2-二氫·亞啕哚各基甲基）-2,4-二甲基·1Ιϋ 洛-3邊酸(2-經基-3-嗎福4 -4-基·丙基)-酿胺（化合物7); 5-(5-氟基-2-酮基-1，2-二氫·亞吲哚各基曱基）·2,4·二甲基巧扎吡洛各羧酸(2-乙胺基-乙基）_醯胺（化合物8); 3-[3,5-二甲基-4-(4-嗎福啉-4-基-六氫吡啶-1-羰基）-lH-吡咯-2-亞甲基]-5-氟基-1，3-二氫^引哚-2-酉同（化合物9);及 Η5-甲基-2-(2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚各基甲基）_1Η_吡咯基]· 丙酸（化合物10)。 — 為清楚地說明可使用於本發明方法中之式I與Π化合物， -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7

五、發明説明故提供下述定義。 ”烷基”係指飽和脂族烴基團，包括丨至2〇個碳原子之直與分枝狀鏈基團(無論何時於本文中敘述之數字範圍，例如 ”1-20” ’係、意謂該基團，於此情況中為烷基，可含有！個功原子、2個碳原+、3個碳原子等，至高達且包含加個碳^ 子）。含有1至4個竣原子之垸基，係被稱為低魏基。當該低碳烷基缺乏取代基時，其係被稱為未經取代之低碳烷基。更佳烷基為具有1至10個碳原予之中等大小烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正-丁基、異丁基、第三-丁基、戊基等。其最佳為具有1至4個碳原子之低碳烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正-丁基、異丁基或第三-丁基等。此烷基可經取代或未經取代。當經取代時，取代基較佳為一或多個，更佳為一至三個，又更佳為一或兩個取代基，獨乂選自包括自基、經基、未經取代之低碳燒氧基，芳基，視情況被一或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代，取代基係互相獨立為函基、羥基、未經取代之低碳燒基或未經取代之低碳烷氧基，芳氧基，視情況被一或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代，取代基係互相獨JL為#基、輕基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低竣燒氧基’ 6-員雜芳基，具有1至3個氮原子在環中，在環中之竣係視情況被一或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代，取代基係互相獨立為鹵基、經基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基，5-員雜芳基，具有1至3 個選自包括氮、氧及硫之雜原子，在此基團中之碳與氮原 -19- 本紙張尺度適用中国國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1259081 A7 B7 、發明説明（17) 子，係視情況被一或多個基團，較佳為—、二或三個基團取代，取代基係互相獨立為齒基、羥基、未經取代之低碳基或未纟k取代之低碳纪氧基’ 5-或6-員雜環族基團，具有！至3個選自包括氮、氧及硫之雜原子，在此基團中之碳與氮（若存在時）原子，係視情況被一或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代，取代基係互相獨立為函基、羥基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基，鲩基、（未經取代之低碳烷基）硫基，芳基硫基，視情況被一或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代，取代基係互相獨立為鹵基、羥基、未經取代之低碳烷基或烷氧基、氰基、醯基、硫醯基、0-胺甲醯基、N_胺甲醯基、〇_硫代胺平醯基、N-硫代胺甲醯基、〇醯胺基、沭醯胺基、硝基、N•磺醯胺基、S- % 醯胺基、RS(O)-、RS(0)2 -、-C(〇)〇R、RC(0)0-及 NRuRb，其中心纟與!^4係獨立選自包括氫、未經取代之低碳烷基、三自甲基、環烷基、雜環族及芳基，此芳基係視情況被一或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代，取代基係互相獨立為函基、羥基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基。说基較佳係被一或兩個取代基取代，取代基獨立選自包括羥基，5-或6-員雜環族基團，具有丨至3個選自包括氮、氧及硫之雜原子，在此基團中之碳與氮（若存在時）原子係視情況被一或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代，取代基係互相獨立為虑基、羥基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基，5-員雜芳基，具有1至3個選自包 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210X297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（18 括虱、氧及硫之雜原子，在此基團中之碳與氮況被-或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代= 基係互相獨互為南基、羥基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基，員雜芳基，具有1至3個氮原子在環中，在绾中足碳係視情況被一或多個基團，較佳為一、二或三個基團取代，取代基係互相獨立為鹵基、㈣、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基，或视，其中心3與心4係獨立選自包括氫與烷基。烷基又更佳係被一或兩個取代基取代，取代基係互相獨立為羥基、二甲胺基乙胺基一乙胺基、二丙胺基、四氫峨。各基、六氫峨哫基、嗎福啉基、六氫吡畊基、4•低碳烷基六氫吡畊基、苯基、咪唑基、吡呢基、嗒畊基、嘧啶基、噚唑基、三畊基等。一 ”環烷基”係指3至8員全碳單環狀環，全碳孓員/6_員或 6-員/6-員稠合雙環狀環或多環狀稠合環（”稠合，，統，係意謂系統中之各環係與系統中之各其他環共有一對相鄰碳原子)基團，其中一或多個環可含有一或多個雙键，但其中並典一個環具有完全共輛π -電子系統。環烷基之貫例係為但不限於環丙烷、環丁烷、環戊烷、環戊烯、環己烷、環己二烯、金剛烷、環庚烷、環庚三埽等。環烷基可經取代或未經取代。當經取代時，取代基較佳為一或多個，更佳為一或兩個取代基，獨立選自包括未經取代之低碳烷基、三齒烷基、齒基、羥基、未經取代之低碳烷氧基，芳基，視情況被一或多個，較佳為一或兩個 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（19 ) 基團取代，取代基互相獨立為自基、羥基、未經取代之低後燒基或未經取代之低碳烷氧基，芳氧基，視情況被一或多個，較佳為一或兩個基團取代，取代基互相獨立為函基、基、未經取代之低碳燒基或未經取代之低碳燒氧基， 6-員雜芳基，具有1至3個氮原子在環中，在環中之碳係視情況被一或多個，較佳為一或兩個基團取代，取代基互相獨JL為||基、經基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基，5-員雜芳基，具有1至3個選自包括氮、氧及硫之雜原子’此基團之碳與氮原子係視情況被一或多個，較佳為一或兩個基團取代，取代基互相獨立為鹵基、羥基、未經取代之低破燒基或未經取代之低碟燒氧基，5-或6_員雜環族基團，具有1至3個選自包括氮、氧及硫之雜原子，在此基團中之碳與氮（若存在時）原子係視情況被一或多個，較佳為一或兩個基團取代，取代基互相獨立為卣基、羥基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基，巯基、（未經取代之低後燒基）硫基，芳基硫基，視情況被一或多個，較佳為一或兩個基團取代，取代基互相獨立為鹵基、羥基、未經取代之低碳烷基或未經取代之低碳烷氧基、氰基、醯基、硫醯基、0-胺甲醯基、N-胺甲醯基、〇·硫代胺甲醯基、N-硫代胺甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、硝基、N-磺醯胺基、S-磺醯胺基、RS(〇)·、RS(0)2 …-C(0)〇R、 RC(0)0-及NR〗3 Ri 4 ’均如上文定義。 ”浠基π係指如本文車定義之低碳烷基，包含至少兩個碳原子與至少一個碳-碳雙键。代表性實例包括但不限於乙缔 -22- 本纸張尺度適财g g家群(CNS) Α4規格(21GX 297公茇)" "' 1259081 A7

基、1-丙埽基、2-丙烯基，μ、2-或3- 丁缔基等。 ”炔基”係指如本文中定義之低碳烷基，包含至少兩個碳原子與至少一個碳-碳參鍵。代表性實例包括但不限於乙^ 基、丙炔基、2-丙炔基，1-、2-或3_ 丁块基等。 ”芳基”係指1至12個碳原子之全碳單環狀或稠合環多環狀 (意即，共有相鄰碳原子對之環）基團，具有完全共軛π _電子系統。芳基之實例係為但不限於苯基、苯基及蔥基。= 基可經取代或未經取代。當經取代時，取代基較佳為一戋多個，更佳為一、二或三個，又更佳為一或兩個，獨立選自包括未經取代之低碳烷基、三函烷基、鹵基、羥基、未經取代足低碳烷氧基、巯基、（未經取代之低碳烷基）硫基、氰基、醯基、硫醯基、〇-胺甲醯基、胺甲醯基、硫代胺甲醯基、N-硫代胺曱醯基、c·醯胺基、醯胺基、硝基、N-磺醯胺基、S-磺醯胺基、RS(〇)·、RS(〇)2·、_c(〇)〇r 、RC(0)0-及-NR13R14，其中Rl3與Rm如上文定義。芳基較佳係視情況被一或兩個取代基取代，取代基獨立選自鹵基、未經取代之低碳燒基、三卣燒基、經基、鏡基、氰基、 N-驢胺基、單或一 fe胺基、幾基或N-橫酿胺基。 π雜芳基”係指5至12個環原子之單環狀或稠合環（意即，共有相鄰原子對之環），含有一、二或三個選自Ν、〇或s 之環雜原子，其餘環原子為C，且另外具有完全共軛之；Γ· 電子系統。未經取代雜芳基之實例，係為但不限於ρ比哈、呋喃、嘍吩、咪唑、嘮唑、4唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹琳、異4淋、嘌吟及咔嗤。雜芳基可經取代或未經取代。 -23-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) l259〇81

A7 B7 五、發明説明（21 ) 當經取代時，取代基較佳為一或多個，更佳為一、二或三個，又更佳為一或兩個，獨立選自包括未經取代之低碳烷基、三卣烷基、齒基、羥基、未經取代之低碳烷氧基、鲮基、（未經取代之低碳烷基）硫基、氰基、醯基、硫醯基、〇·胺甲酿基、N-胺甲醯基、〇·硫代胺甲醯基、N_硫代胺甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、硝基、队磺醯胺基、s_磺醯胺基、RS(O)-、RS(0)2-、-C(0)0R、rc(〇)〇_ 及-NR13R14，其中Rl 3與Ri 4如上文定義。雜芳基較佳係視情況被一或兩個取代基取代，取代基獨立選自函基、未經取代之低碳烷基、二鹵烷基、羥基、銃基、氰基、N-醯胺、單或二烷胺基、幾基或N-續醯胺。雜環族”係指單環狀或稠合環基團，在環中具有5至9個壤原子，其中一或兩個環原子為雜原子，選自N、〇或 S(0)n (其中n為〇至2之整數），其餘環原子為c。此等環亦可具有一或多個雙键。但是，此等環未具有完全共軛冗-電子系統。未經取代雜環族基團之實例，係為但不限於四氫吡咯基、六氫吡啶基、六氫吡畊基、嗎福啉基、硫代嗎福啉基、高六氫吡畊基等。此等雜環可經取代或未經取代。當經取代時，取代基較佳為一或多個，更佳為一、二或三個，又更佳為一或兩個，獨立選自包括未經取代之低碳烷基、二由烷基、函基、羥基、未經取代之低碳烷氧基、銃基（未経取代之低碳烷基）硫基、氰基、醯基、硫醯基、〇胺甲醯基、Ν-胺曱醯基、〇-硫代胺甲醯基、Ν_硫代胺甲醯基醯胺基、Ν-醯胺基、硝基、Ν_磺醯胺基、s•磺醯 24- 1259081 A7 B7 五、發明説明（22 ) 胺基、RS(O)-、RS(0)2-、-C(0)0R、RC(0)0-及-NR13R14，其中R! 3與R14如上文定義。雜環族基團較佳係視情況被一或兩個取代基取代，取代基獨立選自函基、未經取代之低碳烷基、三鹵烷基、羥基、酸基、氰基、N-醯胺基、單或二烷胺基、羧基或N-磺醯胺。雜環族基團較佳係視情況被一或兩個取代基取代，取代基獨立選自鹵基、未經取代之低碳烷基、三函烷基、羥基、鲛基、氰基、N-醯胺基、單或二烷胺基、羧基或N-磺醯胺。 ’’羥基’’係指-OH基團。 ’’烷氧基’’係指-〇-(未經取代之烷基）與-〇-(未經取代之環烷基）基團兩者。代表性實例包括但不限於例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基等。 ’’芳氧基’’係指如本文中定義之-0-芳基與-〇·雜芳基兩者。代表性實例包括但不限於苯氧基、吡啶基氧基、呋喃基氧基、4吩基氧基、嘧啶基氧基、吡呼基氧基等，及其衍生物。 ’’銃基”係指-SH基團。 ’’烷硫基π係指各(未經取代之烷基）與-S-(未經取代之環烷基）兩者。代表性實例包括但不限於例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、環丙硫基、環丁硫基、環戊硫基、環己硫基等。 π芳基硫基”係指如本文中定義之芳基與各雜芳基兩者 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐） 1259081 A7 ___ B7 五、發明説明（23 ) 。代表性實例包括但不限於苯硫基、吡啶基硫基、呋喃基繞基、p塞吩基硫基、喊咬基硫基等，及其衍生物。醯基係指-C(0)-R"基團’其中Rn係選自包括氫、未經取代之低碳烷基、三鹵甲基、未經取代之環烷基，芳基，視情況被一或多個，較佳為一、二或三個取代基取代，取代基選自包括未經取代之低碳烷基、三自甲基、未經取代之低碳烷氧基、自基及NR! 3 R! 4基團，雜芳基（經過環碳結合），視情況被一或多個，較佳為一、二或三個取代基取代，取代基選自包括未經取代之低碳烷基、三函烷基、未經取代之低碳烷氧基、自基及NRuRm基團，及雜環族（經過環碳結合），視情況被一或多個，較佳為一、二或三個取代基取代’取代基選自包括未經取代之低碳烷基、三鹵烷基、未經取代之低碳烷氧基、卣基INRuRh基團。代表性醯基包括但不限於乙醯基、三氟乙醯基、苯曱醯基等。 Π醛••係指醯基，其中R”為氫。 π硫醯基’’係指-C(S)-R”基團，其中R”如本文中定義。 ’’酯’’係指-C(〇)〇-R”，其中R”如本文中定義，惟R，，不能為氫。 ’、、 ’’乙醯基”係指-C(0)CH3基團。 ’’鹵基”係指氟、氯、溴或碘，較佳為氟或氯。一鹵甲基係指_CX3基團，其中X為如本文中定義之卣基。亞甲一氧基”係指-OCH2 0-基團，其中兩個氧原子係結合至相鄰碳原子。口口 ’’次乙二氧基”係指-〇CH2CH2〇-基團，其中兩個氧原予係 -26- 1259081

五、發明説明（24 結合至相鄰碳原子。 ”s-續醯胺基”係指卻)2NRi3Ri4基團，其中文中定義。 ” N-橫61胺基”係指视i3S(〇)2R基團，其中R^R如本文中定義。胺甲SI基”係指-0C(0)NRi3Ri4基圈，其巾h 本文中定義。 "N-胺甲醯基"係指R〇c(〇輝14•基團，其中“如中定義。硫代胺甲醯基，，係指-OC⑸NRi3Rm基團，其中與 Ri4如本文中定義。 3 ” N-硫代胺甲醯基”係指R〇c(s)NRi4_基團，其中&與心如本文中定義。〃 14 ’’胺基’’係指-NRuh4基團，其中&3與1^4均為氫。 ”C-酿胺基，，係指（(〇輝一4基團，其中r13與Rm如本文中定義。 "N·醯胺基，，係RC(0)NRl4_基團’其中汉與尺"如本文中定義。 ”硝基”係指-N〇2基團。 ”函烷基”係意謂未經取代之烷基，較佳為如上文定義之未經取代低碳烷基，其係被一或多個相同或不同齒基原子取代，例如，-CH2C1、-CF3、·〇Η2〇Ρ3、CH2Ccl3 等。 ”芳燒基”係意謂未經取代之燒基，較佳為如上文定義之未經取代低碳燒基’其係被如上文定義之芳基取代，例如 -27- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（25 ) ，-CH2苯基、-(ch2)2 苯基、-(ch2)3 苯基、CH3CH(CH3)CH2 苯基等，及其衍生物。 ’’雜芳烷基’’係意謂未經取代之烷基，較佳為如上文定義之未經取代低碳烷基，其係被雜芳基取代，例如，-CH2吡啶基、-(CH2)2嘧啶基、-(CH2)3咪唑基等，及其衍生物。 ’’單烷胺基’’係意謂基團-NHRf，其中R’為如上文定義之未經取代烷基或未經取代環烷基，例如甲胺基、（1-甲基乙基）胺基、環己胺基等。 ”二烷胺基”係意謂基團-NRfR’，其中各R’係獨立為如上文定義之未經取代烷基或未經取代環烷基，例如二·甲胺基、二乙胺基、（1-甲基乙基）-乙胺基、環己基甲胺基、環戊基甲胺基等。 ’’氰基烷基’’係意謂未經取代之烷基，較佳為如上文定義之未經取代低碳烷基，其係被1或2個氰基取代。 ’’選用’’或π視情況’’係意謂隨後所述之事件或狀況可以但未必發生，且該描述係包括其中發生該事件或狀況之情況，及其中未發生之情況。例如，”視情況被烷基取代之雜環基π係意謂該烷基可以但未必存在，且該描述係包括其中雜環基被烷基取代之狀況，及其中雜環基未被烷基取代之狀況。 ’’醫藥組合物’’係指一或多種本文中所述化合物之混合物，或其生理學上/藥學上可接受之鹽或前體藥物，伴隨著其他化學成份，譬如生理學上/藥學上可接受之載劑與賦形劑。醫藥組合物之目的係為幫助化合物對生物體之投藥。 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1259081 五、發明説明（26 式/1)或（II)化合物亦可充作前體藥物。"前體藥物"係指一種藥劑，其係於活體内轉化成母體藥物。前體藥物經常是有用的’因為在-些狀況中，其可能比母體藥物更易於投藥二例如，其可藉口服投藥而為生物可利用的，，然而母體藥物則否。前體藥物亦可在醫藥組合物中具有經改良之溶解度，優於母體藥物。前體藥物之實例係為但^限於本發明化合物’其係以酯(”前體藥物,’)投藥，以f助傳輸越過細胞膜，其中水溶解度係不利於移動性，但然後係被代謝 T水解成羧酸活性本體，-旦在細胞内時，其中水溶解度疋有利的〇 ^體藥物之另—項實例可為短多肽，例如但不限於2-10胺基故多肽’經過末端胺基結合至本發明化合物之幾基，其中多肽料活體内經水解或代謝，以釋出活性分子或(II)化合物之前體藥物係在本發明之範圍内。，如白此外’意欲涵蓋的是’式(1)或(11)化合物係被生物體譬酵素代謝’以產生新陳代謝產物，其可調制蛋貝激酶《活性。此種新陳代謝產物係在本發明之範圍内。於本文中使用之，，生理學上/藥學上可接受之載劑，，，係指不會對生物體造成顯著刺激，且不會廢除所投藥化合物 <生物學活性與性質之載劑或稀釋劑。 :藥—學上可接受之賦形劑”係指被添加至醫藥組合物中，二p艮^ = ^物投藥之惰性㈣°賦形劑之實例包括二艮於竣㈣、鱗_、各種糖類與爽粉類型、纖維素丁生物、明膠、植物油及聚乙二醇。 “ -29· 本紙張尺反·宁g S家料(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（27 ) 於本文中使用之”藥學上可接受之鹽”一詞，係指保持體化合物之生物有效性與性質之鹽。此種鹽包括· /)酸加成貞，其係經由母體化合物之自由'態驗與無機酸或與有機酸之反應而獲得，該無機酸譬如鹽酸、氫臭酸、硝酸、磷酸、硫酸及過氯酸等，該有機酸譬如醋二酸、（D)或（L)蘋果酸、順丁烯二酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸對·甲苯磺酸、柳酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、丁2酸戈丙二酸等，較佳為鹽酸或（L>蘋果酸，譬如5_(5_氟基^同 1，2·二氫亞吲哚-3-基甲基>2,4·二甲基-1H-吡咯各羧酸（2_二乙胺基乙基）醯胺之L-蘋果酸鹽；或 (2)當存在於母體化合物中之酸性質子，無論是被金屬離子例如鹼金屬離子、鹼土金屬離子或鋁離子置換；或與有機鹼譬如乙醇胺、=乙醇胺、三乙醇胺、丁三醇胺、N:甲基葡萄糖胺等配位時，所形成之鹽。、”方法”係指用以達成特定工作之方式、裝置、技術及程序，包括但不限於無論是化學、藥學、生物學、生物化學及醫學技藝之執行者所已知，或者易於由其從已知之方式、裝置、技術及程序所發展之方式、裝置、技術及程序。 ”活體内”係指在有生命生物體譬如但不限於老鼠、大白鼠或兔子内所施行之程序。 ’口療處理及治療作業”係指減輕或消除急性骨髓性白血病、其他白血病、FLT.3相關癌症及/或其伴隨病徵之万法。T以式I或II化合物治療之白血病，包括急性骨髓除白血病（AML)、急性淋巴球白血病（从乙）、慢性骨髓性白 1259081 A7 B7 五、發明説明（28 ) 血病（CLL)、慢性骨髓白血病（CML)、脊髓發育不良徵候簇 (MDS)、急性骨髓單核母細胞白血病（AMMOL)及急性單核母細胞白血病（AMOL)。此外，與FLT-3有關聯之其他類型癌症，包括但不限於白血病、淋巴瘤、癌瘤、骨聽細胞瘤、神經脊衍生之癌症、肉瘤及神經膠質瘤，可藉由式（I)或（II)化合物之投藥治療。π治療” 一詞僅意謂患有AML或FLT-3相關癌症之個體之預期壽限將被增加，或該疾病之一或多種徵候將被減少。 ’’FLT-3相關癌症π包括但不限於急性骨髓性白血病（AML)、急性淋巴球白血病（ALL)、慢性骨髓性白血病（CLL)、慢性骨髓白血病（CML)、脊髓發育不良徵候簇（MDS)、急性骨髓單核母細胞白血病（AMMOL)及急性單核母細胞白血病（AMOL)。 ”病患”係指包含至少一個細胞之任何有生命實體。有生命之生物體，可簡單如單一真核細胞，或複雜如哺乳動物，包括人類。 ”治療上有效量’’係指所投予化合物之量，其將預防、減輕、改善或舒解被治療病症之一或多種病徵，達某種程度。關於癌症之治療，治療上有效量係指具有以下作用之量： (1) 降低腫瘤大小； (2) 抑制（意即，減慢至某種程度，較佳為停止）腫瘤轉移； (3) 抑制腫瘤生長達某種程度（意即，減慢至某種程度，較佳為停止）， (4) 減少胚細胞計數，及/或 (5) 使與癌症有關聯之一或多病徵，舒解達某種程度（或 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X 297公釐） 1259081

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/、使用於根據本發明之醫藥組合物，可以習用方式調配或夕種生理學上可接受之載劑，包括賦形劑與輔 J其有助於活性化合物加工處理成為可以藥學方式使用之製劑。適當配方係依所選擇之投藥途徑而定。對注射而言，可將本發明化合物調配於水溶液中，較佳係在生理學上可相容之緩衝劑中，譬如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理食鹽水緩衝劑。對經黏膜投藥而言，對於欲被滲透障壁適當之浸透劑，係被使用於此配方中。此種浸透劑係為此項技藝中一般已知的。對口服投藥而言，可經由將活性化合物與此項技藝中所習知之藥學上可接受之載劑合併，調配此等化合物。此種載劑使得本發明化合物能夠被調配成片劑、丸劑、錠劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，以供病患口服攝食。供口服使用之醫藥製劑，可使用固體賦形剑，視情況將所形成之混合物研磨，及加工處理此顆粒混合物，若需要則在添加其他適當輔助劑後，獲得片劑或糖衣錠核芯而製成。可使用之賦形劑係為特別是填料，譬如糖類’包括乳糖、蔗糖、甘露醇或花楸醇，纖維素製劑，例如玉米澱粉、小麥澱粉、稻米澱粉及馬鈐薯澱粉，及其他物質，譬如明膠、西黃蓍樹膠、甲基纖維素、幾丙甲基纖維素、瘦甲基纖維素鋼及/或聚乙缔基四氫p比嘻酉同。若需要，可添加崩解劑，譬如交聯聚乙缔基四氫^哈酮、瓊脂或海蕩酸。亦可使用鹽，譬如海藻酸鋼。糖衣錠核芯具有適當塗層。為達此項目的，可使用濃糖 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1259081

落液’其可視情況含有阿拉伯膠、滑石、$乙浠基四氫吡洛鲷、聚幾乙晞凝膠、冑乙二醇’及/或二氧化鈥、漆溶液及適當有機溶劑或溶劑混合物。可將染料或色素添加至片劑或糖衣錠塗層中，以供識別或特徵表現出活性化合物劑量之不同組合。可以口服方式使用之醫藥組合物，包括由明膠製成之推送配合膠囊，以及由明膠與增塑劑（譬如甘油或花揪醇）製成之軟性密封膠囊。推送配合膠囊可含有活性成份，並混合填料，譬如乳糖，黏合劑，譬如殿粉，及/或潤滑劑，譬如滑石或硬脂酸鎂，及視情況選用之安定劑。於軟性膠囊中，可使活性化合物溶解或懸浮於適當液體中，譬如脂防油類、液態石it或液態聚乙二醇。安定劑亦可添二在^ 等配方中。亦可使用之醫藥組合物，包括硬明膠膠囊。以下述作為非限制性實例，於膠囊口服藥物產物配方中之化合物丨可為 5〇與200笔克劑量強度。此兩種劑量強度係製自相同顆粒，其方式是裝填至不同大小硬明膠膠囊中，3號為5〇毫克膠囊，而〇號為200毫克膠囊。可將膠囊包裝至褐色玻璃或塑膠瓶中，以保護活性化合物隔離光線。含有活性化合物膠囊配方之容器，必須儲存於受控室溫（15-30。〇下。、士於藉及入投藥’供根據本發明使用之化合物，可合宜地以氣溶膠噴霧形式傳輸，使用加壓包裝或霧化器，及適當推進劑，例如但不限於二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二 -34 297公釐） 1259081 A7

1259081 A7 ----B 7 五、發明説明（33 ) 除了前述配方之外办可將化合物調配成積貯製劑。此種長期作用配方可藉由植人（例如，皮下方式或肌内方式）或精由肌内注射投藥。本發明化合物可經調配以供此投藥途徑使用，其係使料當聚合性或疏水性物質（例如，在且有藥學上可接受油之乳化液中），使用離子交換樹脂，㈣成節制性地可溶之衍生物，譬如但不限於節制性可溶鹽。供本發明疏水性化合物用之醫藥載劑之非限制性實例， =為共溶劑ι统，包料醇、非極性界面活性劑、水可溶混之有機聚合體及水相，譬如WD共溶m卿為^ *宇醇、8%W/V非極性界面活性劑聚絲酸義及65% = 聚乙二醇細’在無水乙醇中财體積之溶液。VPD业溶刊系統(VPD: D5W)包含使用5%右旋糖水落液，以i: i稀釋i VPD。此共溶劑系統係良好地溶解疏水性化合物，且其本身在系統投藥上係產生低毒性。當然，此種共溶劑系统之比例’可相當大地被改變，而不會破壞其溶解度盘毒性特徵。再者，共溶劑成份之身分可以改變：例如，可使用其他低毒性非極性界面活性劑，以代替聚花楸酸㈣，聚/乙二醇之分率大小可以改變，其他生物可相容聚合體可替聚乙二醇’例如聚乙埽基四氫…，而其他類可取代右旋糖。 /聰或者’可對疏水性醫藥化合物，採用其他傳輸系統。微脂粒與乳化液係為疏水性藥物之傳輪媒劑或載劑例。此外’亦可採用某些有機溶劑，羧、、 5如一甲亞颯，惟吊以較大毒性為代價。 -36-

1259081 發明説明（34 、此外，此等化合物可使用持續釋出系統傳輸，譬如厶 …療劑體疏水性聚合體之半、滲透性基質。各種持出物質已被確立，且係為熟諳此藝者所習知。持續釋出膠囊’依其化學性質而定，可釋出化合物歷經數週，至高達超過⑽天。依治療試劑之化學性質與生物钱性而定Ϊ可如用其他供蛋白質安定化之策略。此處之醫藥組合物亦可包含適當固體或凝膠相載劑或賦形劑。此種載劑或賦形劑之實例包括但不限於碳酸鈣'磷酸鈣、各種糖類、澱粉、纖維素衍生物、明膠，及聚合體，譬如聚乙二醇。供使用於本發明之配方，其實例係在表1-3中：表1 5-0氟基-2-酮基-i，2-二氫-亞吲哚-3·基甲基)·2,4-二甲基-1H-吡哈-3-羧酸（2-二乙胺基-乙基）-醯胺硬明膠膠囊之組合物成份名稱於造粒時之濃度 (% W/W) 於50毫克膠囊中之量 (毫克）於75毫克膠囊中之量 (毫克）於200毫克膠囊中之量 (毫克） API 65.0 50.0 75.0 200.0 甘露醇 23.5 18.1 27.2 72.4 CR0SCARA MELL0SE 鈉E 6.0 4.6 6.9 18.4 POVIDONE (K-25) 5.0 3.8 5.7 15.2 硬脂酸鎂 0.5 0.38 0.57 1.52 膠囊 - 1號 3號 0號 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（35 ) 表2 5-(5-氟基-2-酮基-1，2-二氫-亞啕哚-3-基甲基）-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（2-二乙胺基-乙基）-醯胺L-蘋果酸鹽硬明膠膠囊之組合物成份名稱/等級於造粒時之濃度 (% W/W) 於50毫克膠囊中之量（毫克） API 75.0 66.800c 甘露醇 13.5 12.024 CROSCARAMELLOSE 鈉 E 6.0 5.344 POVIDONE (K-25) 5.0 4.453 硬脂酸鎂 0.5 1.445 膠囊 - 3號表3 5-(5-氣基-2-酉同基-1，2-二氮-亞4丨嗓-3-基甲基）-2,4-二甲基-IH-吡咯-3-羧酸（2-二乙胺基-乙基）-醯胺L-蘋果酸鹽硬明膠膠囊之組合物成份名稱/ 等級於造粒時之濃度 (%W/W) 於25毫克膠囊中之量 (毫克）於50毫克膠囊中之量 (毫克）於100毫克膠囊中之量 (毫克） APIa 40.0 33.400° 66.800° 200.0b 甘露醇 47.5 39.663 79.326 158.652 CROSCARA MELLOSE 鈉E 6.0 5.010 10.020 20.04 POVIDONE (K-25) 5.0 4.175 8.350 16.700 硬脂酸鎂 1.5 1.252 2.504 5.008 膠囊 - — 3號 1號 0號 -38- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（36 ) A此批料所需要之藥物量，係被調整為對膠囊具有100%經標識強度。對甘露醇量施行適當調整，以對各強度保持相同填充重量。 B相當於100毫克自由態鹼之量。 C相當於50毫克自由態鹼之量。 D相當於25毫克自由態鹼之量。 E半顆粒内，半顆粒外。其可參閱2002年9月10曰提出申請之美國專利申請案序號 10/237,966，其係明確地以其全文併於本文供參考。許多式I與II化合物可以生理學上可接受之鹽提供，其中化合物可形成帶負或帶正電荷物種。其中化合物形成帶正電荷部份基團之鹽，其實例包括但不限於四級銨，一些鹽類，譬如鹽酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽，其中四級銨基團之氮原子係為所選擇本發明化合物之氮，而其已與適當酸反應。其中本發明化合物係形成帶負電荷物種之鹽，係包括但不限於鈉、鉀、鈣及鎂鹽，藉由化合物中之羧酸基與適當鹼（例如，氫氧化鈉（NaOH)、氫氧化鉀（KOH)、氫氧化鈣 (Ca(OH)2)等）之反應所形成。適用於本發明之醫藥組合物，包括其中包含足量活性成份以達成所意欲目的之組合物，例如治療FLT-3-ITD陽性病患中之AML。更明確言之，”治療上有效量”係意謂有效預防、減輕或改善AML病徵，或延長被治療病患存活率之化合物量。治療上有效量之測定，係良好地在熟諳此藝者之能力範 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（37 ) 圍内，尤其是在明白本文中 … --^ 中斤k供艾評細揭示内容之後。錢用於本發明方法中之任何化合物而_治療上有效最初自細胞培養物檢測估計。然後，可調配中之劑量，以達成循環濃度範圍，其包 3 :::養物中測定時之1C5。(意即，達成FLT-3獅化 2= 測化合物漠度)。接著，可使用此種資訊以更精確地測疋人類中之有用劑量。武〜I斤述化'物〈毒性與治療功效，可^細胞培養物二貫中，藉由標準醫藥程序測定，例如經由測定IC50 Λ 5 0其中LE>5 0為關於主題化合物達成致死率之半最高抑制（相化合物I度。得自此等細胞培養物檢測與動物 :數據’可使㈣調配使用於人類之劑量範圍。此劑量可依所採用之劑量形式及所使用之投藥途徑而改變。正確配方、投藥途徑及劑量，可蓉於病患症狀，由個別醫師作選擇。（㈣，例如Fingl《人，1975,於”治療學之藥理學基礎"，第1章，第1頁中）。劑量與間隔可個別地調整，以提供活性物種足以保持激 f凋制作用之血漿含量。此等血漿含量係被稱為最低有效濃度(MEC)。MEC將對各化合物改變，但可自活體外數據估計，例如為達成激酶之50-90%抑制所必須之濃度，可使用本文中所述之檢測確定。達成MEC所必須之劑量，係依個別特性與投藥途徑而定。HPLC檢測或生物檢測可用以測定血漿濃度。 > 副量間隔亦可使用MEC數值測定。化合物應使用會保持 -40-

1259081 A7 B7 五、發明説明（38 ) 血漿含量高於MEC歷經此時間之10-90%，較佳係在30-90% 之間，且最佳係在50-90%間之服用法進行投藥。目前，式（I)或（Π)化合物之治療上有效量可涵蓋每天從大約25毫克/平方米至1500毫克/平方米之範圍；較佳為約3 毫克/平方米/天。又更佳為50毫克/平方米每天至400毫克/每天。於局部投藥或選擇性吸收之情況中，藥物之有效局部濃度可能不與血漿濃度有關聯，則可採用此項技藝中已知之其他程序，以測定正確劑量與間隔。所投予組合物之量，當然係依被治療病患、疾患之嚴重性、投藥方式、指定醫師之判斷等而定。意欲涵蓋的是，本發明方法可併用其他癌症療法，包括放射與骨髓移植。最後，亦意欲涵蓋的是，本發明化合物之組合，在與 ENDOSTATIN©、GLEEVEC©、CAMPTOSAR©、HERCEPTIN©、 IMCLONE C225©、絲裂黃酮、道諾紅菌素、阿糖胞：y：、胺甲蝶呤、長春新鹼、6-硫基鳥嘌呤、6-銃基嘌呤或培克里他索（paclitaxel)之組合上，將有效用於治療固體癌症或白血病，包括但不限於AML。此外，本發明方法可涉及與抗血管生成劑之組合療法，該抗血管生成劑，譬如但不限於環氧化酶抑制劑，譬如塞拉庫西比（celecoxib)。 < 對本文中所述之組合治療劑與醫藥組合物而言，本發明化合物與可用於抑制異常細胞生長之化學治療劑或其他藥劑（例如其他抗增生劑、抗血管生成劑、訊息轉導抑制劑或 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（39 ) 免疫系統增強劑）之有效量，可由_般熟諳此藝者，以本文中所述化合物及關於化學治療劑或其他藥劑所已知或已描述疋有效量為基準而決定。此種治療劑與組合物之配方及投藥途徑，可以本文中關於包含本發明化合物作為單獨活性劑之組合物與治療劑所述之資訊，及以關於與其組合之化學治療劑及其他藥劑所提供之資訊為基礎。一般合成程序可採用下述一般操作法，以製備本發明化合物：將經適當取代之2-氧化啕哚（1當量）、經適當取代之醛（1.2 f量）及鹼（0.1當量）混合於溶劑（1·2毫升/亳莫耳2_氧化吲 % )中，然後將混合物加熱約2至約12小時。於冷卻後，將形成之沉澱物過濾，以冷乙醇或醚洗滌，且經真空乾燥，而得固m產物。若兴、况殿物形成，則使反應混合物濃縮，並將殘留物以二氯甲燒/醚研製，藉過滤收集所形成之固體，然後乾燥。產物可視情況進一步藉層析純化。驗可為有機或無機驗。若使时⑽，則其較佳為氮驗。有機氮鹼之實例包括但不限於二異丙基胺、三甲胺、三乙胺、苯胺、吡啶、i，8·二氮雙環并[5A1]十一丨烯、四氫吡洛及7T氮卩比喊〇無機鹼之實例係為但不限於氨、鹼金屬或鹼土氫氧化物、磷酸鹽、碳酸鹽、酸性碳酸鹽、酸性硫酸鹽及胺化物。鹼金屬包括鋰、鈉及鉀，而鹼土族包括鈣、鎂及鋇。在本發明之一項目前較佳具體實施例中，當溶劑為質子性溶劑譬如水或醇時，鹼係為鹼金屬或鹼土金屬無機鹼， -42-

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較佳為驗金屬或驗土金屬氫氧化物。以有機合成之已知-般原理及以本文揭示内容兩者為基礎，熟諳此藝者將明瞭何種鹼最適合所意欲涵蓋之反應。於其中進行反應之容劑，可為質子性或非質子性溶劑，其較佳為質子性溶劑。，，質子性溶劑,,為—種溶劑，其具有氫料，經共價結合至氧或氮原子，其會賦與該氫原子具有少許酸性，因此能夠經過氫鍵而與溶質"共有"。質子性 a劑之貫例係包括但不限於水與醇類。 "非質予性溶劑”可為極性或非極性，但在任一情況中，未含有酸性氫，因此不能夠與溶質形成氫鍵。非極性非質子性溶劑之實例係為但不限於戊烷、己烷、苯、甲苯、二氯曱燒及四氯化竣。極性非質子性溶劑之實例為氣仿、四氫呋喃、二甲亞颯及二甲基甲醯胺。在本發明之-項目前較佳具體實施例中，溶劑為質子性溶劑，較佳為水或醇，譬如乙醇。反應係在大於室溫之溫度下進行。溫度大致上為約3〇它至約 150t，較佳為約 8(TC^100t：，^Aw5t^^5t ，其約為乙醇之沸點。所謂”約”係指溫度範圍較佳係在所指示溫度之1G攝氏度數内，更佳係在所指示溫度之5攝氏度數内，及最佳係在所指示溫度之2攝氏度數内。因此，例如，所所約75 C ’’係指75°C ± 10°C，較佳為75°c ± 5°c，而最佳為 75°C ± 2°C。 2-氧化吲哚類與醛類可容易地使用化學技藝上習知之技術合成。熟讀此藝者應明瞭的是，其他用於形成本發明化 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（41 ) 合物之合成途徑可以採用，且下述係提供作為實例而非限制。本發明化合物係根據下述操作法，及按例如在美國專利申請案序號〇9/783,264，與 W001/60814，WO 00/08202，2001 年 8月15曰提出申請之美國臨時申請案號60/312,353，目前為 2002年8月13曰提出申請之美國專利申請案序號10/281，985， 2002年9月18曰提出申請之美國臨時申請案號60/411,732， 2001年10月10日提出申請之美國臨時申請案號60/328,226，目前為2002年10月10日提出申請之美國專利申請案序號 __，及2002年2月15曰提出申請之美國專利申請案序號 10/076，140中所述製成，其全部均以其全文併於此處供參考。合成操作法方法A :吡咯類之甲醯基化作用將ρ〇α3 (1.1當量）逐滴添加至-io°c下之二甲基甲醯胺（3當量）中，接著添加已溶於二甲基甲醯胺中之適當吡咯内。攪拌兩小時後，將反應混合物以H2 0稀釋，並以10 N KOH鹼化至pH 11。藉過濾收集所形成之沉澱物，以H20洗滌，並在真空烘箱中乾燥，而得所要之醛。方法B:吡咯甲酸酯類之皂化作用使吡咯甲酸酯與KOH (2-4當量）於EtOH中之混合物回流，直到藉由薄層層析法（TLC)顯示反應完成。將已冷卻之反應混合物以1 N HC1酸化至pH 3。藉過濾收集所形成之沉澱物，以H20洗滌，並在真空烘箱中乾燥，獲得所要之吡咯甲酸。 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（42 ) 方法C :醯胺化作用在已溶於二甲基甲醯胺中之吡咯甲酸之經攪拌溶液（0.3 M) 内，添加1-乙基-3-(3-二甲胺基-丙基）碳化二亞胺（L2當量）、 1-羥基苯并三唑（1.2當量）及三乙胺（2當量）。添加適當胺（1 當量），並攪拌反應物，直到藉TLC顯示完成為止。然後，將醋酸乙酯添加至反應混合物中，並以飽和NaHC03與鹽水（具有額外鹽）洗條該溶液，以無水MgS〇4脫水乾燥，及濃縮，而得所要之醢胺。方法D:醛類與含有羧酸取代基之氧化啕哚類之縮合將氧化啕哚（1當量）、1當量醛及於乙醇中之1-3當量六氫吡啶（或四氫吡咯）(0.4 M)之混合物，在9(M00°C下攪拌，直到藉TLC顯示反應完成為止。然後，使混合物濃縮，並以 2NHC1酸化殘留物。以H20與EtOH洗滌所形成之沉澱物，然後在真空烘箱中乾燥，而得產物。方法E:醛類與不含有羧酸取代基之氧化吲哚類之縮合將氧化啕哚（1當量）、1當量醛及於乙醇中之1-3當量六氫吡啶（或四氫吡咯）(0.4 M)之混合物，在90-100°C下攪拌，直到藉TLC顯示反應完成為止。使混合物冷卻至室溫，並藉真空過濾收集所形成之固體，以乙醇洗滌，並乾燥，獲得產物。若沉澱物並未在反應混合物冷卻時形成，則使混合物濃縮，並藉管柱層析純化。氺本氺氺給予下述實例係為說明本發明。但應明瞭的是，本發明並不受限於此等實例中所述之特定條件或細節。在整個本 -45- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 —— ____B7 五、發明説明（43 ) 專利說明書中，對於公開可取得文件之任何及所有引用，均特別地併於本專利申請案中供參考。合成實例實例1 - (3Z)-3-{[3,5c甲基冰(嗎福淋_4_基）六氫吡啶·^基幾基】 1H-P比洛-2-基亞甲基}-5-氟基-1,3-工氫哚-2-嗣（化合物9) 之合成

步驟1 於4-胺基-1-爷基六氫p比咬(Aldrich，1.53亳升，7.5毫莫耳）、 K2C〇3(2.28克，16.5毫莫耳）及DMF(15毫升）在50°C下加熱之經攪拌混合物中，在60分鐘内逐滴添加雙（2-溴基乙基）醚 (Aldrich工業級90%，0.962毫升，7.65毫莫耳）。於8(rc下攪拌6小時後，TLC(90 : 10 : 1氯仿/ MeOH/濃NH4OH水溶液）顯示新光點形成。當經由以氮氣流吹送而使溶劑蒸發時，持續加熱’歷經2小時。粗製物質相對較純，但使其接受相對較短矽膠管柱（9 : IMeOH/ NH4OH水溶液在氯仿中之至6%梯度液）。蒸發純溶離份，獲得〜ι·7克二胺4-(嗎福琳_4_ 基基六氫p比淀，為蝶狀固體。 1 H NMR (400 MHz，d6 -DMSO) 5 7·31 (m5 4H)，7.26 (m 1H)，3.72 (t，J= 4.7 Hz，4H)，3.49 (s，2H)，2.94 (br d，J= 5.9 Hz，2H)，2.54 (t，4.7 Hz，4H)， 2·19 (tt，11 ·5, 3.9 Hz，1H)，1.96 (td，11.7, 2·2 Hz，2H)，1.78 (br d，J= •46- 本紙張尺度適財ϋ g家料(CNS) A4規格(21QX297公爱)~-- 1259081 A7 B7

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發明説明毛克一〇亳莫耳）與B0P (221毫克，〇 5〇毫莫耳）懸浮於 DMF (5¾升）中，並在室溫下充分撥拌，且添加三乙胺⑽ 微升0·96毫莫耳）。1(M5分鐘後，於均相反應混合物中，全部上即添加七(嗎福啉冬基）六氫吡啶（85毫克，〇·5〇亳莫耳）。將反應/昆合物授拌48小時（可能會遠較早完成），然後轉移至έ有氟仿《•異丙醇（5/丨）與5% LiCi水溶液之漏斗中。將混濁橘色有機相分離，以另外之5% Licl水溶液（2χ)、i M Ν/ΟΗ水溶液（3Χ)、飽和Naa水溶液（ιχ)洗滌，然後脫水乾燥(Na2S〇4)，並蒸發而產生粗產物（96.3%純；微量ΗΜΡΑ，藉H NMR得知）。然後，藉由通過矽膠之極短管柱（3公分） (MeOH於DCM中之5至15%梯度液）排出，使此粗產物進一步純化，於其中移除微量較快速移動之3E-異構物。使純溶離份蒸發’並自飽和EtOAc溶液再結晶過夜，該溶液係以 Ε^Ο稀釋(〜3倍）’並在〇°C下冷卻。傾析母液，在充分真空後，產生所要之化合物，為橘色結晶（153毫克，85%)。 1 H NMR (400 MHz，d6 -DMSO) 5 13.60 (s，1H)，10.87 (s，1H)，7.72 (dd， J = 9.4, 2.7 Hz，1H)，7.68 (s，1H)，6·91 (td，J = 9·3, 2·6 Hz，1H)，6·82 (dd，J =8.6, 4.7 Hz，1H)，3.54 (app br t，J = 4·3 Hz，4H)，3.31 (2x s，3H+3H)，2·43 (br s，4H)，2.36 (m，1H)，2·25 (br m，6H)，1·79 (br s，2H)，L22 (br s，2H); LCMS m/z453 [M+l]+. 按上文實例1中所述進行，但以（3Z)-3-(3,5-二曱基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亞甲基）·5-氟基-1，3-二氫-2H-啕哚-2-酮，取代（3Z)-3-(3,5-二甲基斗羧基-1H-吡咯-2-基亞甲基>1，3-二氫-2H-吲哚-2-酮，獲得（3Z)-3-{[3,5-二甲基斗(嗎福啉-4-基）六氫吡啶小基羰 -48- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 ____B7 五、發呢兑明（47~~ 國專利申請案序號-之程序進行，以其全文併於本文供參考。實例2 -(网-3-{[3,5-二甲基_4·(嗎福啉冰基）一氮四圜+基羧基】· 比洛-2-基亞甲基}·5·氟基-1，3-二氫嗓-2-嗣之合成步驟1 將根據Tetrahedron Letters 40 (1999) 3761-64中所述之已知程序，製自2,3-二溴基丙胺氫溴酸鹽（58.8亳莫耳）之1-氮雙環并 [1.1.0]丁燒之溶液，慢慢添加至嗎福4(157亳升；18〇亳莫耳）與硫酸（3·3克，96%溶液）於無水非變性乙醇(250毫升）中，在〇°C下之溶液内。將反應混合物在冰浴上攪拌3〇分鐘，然後在室溫下歷經8小時。添加氫氧化鈣（5·5克）與1〇〇毫升水，並將所獲得之漿液揽摔1小時，接著經過珍蕩土塾過滤。使遽液濃縮，並於減壓（20毫米Hg)下蒸餘，以移除水及過量嗎福琳。將蒸館殘留物於高真空下，使用Kugelrohr裝置再蒸餾，獲得純4-(一氮四圜-3-基）嗎福琳，33%產率（2·759克），為無色油性液體。 13 C-NMR (CDC13，100 MHz) : 66.71 (2C)，59.37 (1C)，51.46 (2C)，49.95 (2C) 1 H (CDC13，400 MHz) : 3.727 (t，J = 4·4 Hz，4H)，3·619 (t，J = 8 Hz， 2H)，3.566 (t，J = 8 Hz，2H)，3.227 (m，J = 7 Hz，1H)，2.895 (br s，1H)， 2.329 (br s，4H) 步驟2 使（3Z)-3-({3,5-二甲基-4-叛基]1-H-吡咯-2-基}亞甲基）_5—氟基-1，3-二氫-2H-啕哚-2-酮之1-(8-氮苯并三唑基）-酯（0.5毫莫耳， 210毫克）[使用HATU試劑（570毫克，1.5毫莫耳），於Hunig氏 -50- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1259081 A7

1259081 A7 ___ B7 五、發明説明（49 ) LC/MS: +APCI: M+l=441; -APCI: M-卜440,441 1 H (d-DMSO, 400 MHz): 13.607 (s，1H)，11.006 (s，lH)，7.976 (d，J=2.0Hz， 1H)，7.756 (s，1H)，7.136 (dd，J=8.2 Hz，J =2.0 Hz，1H)，6.869 (d，J=8.2 Hz， 1H)，3.964 (br s，2H)，3.793 (br s，2H)，3·582 (br t，J=4.3 Hz，4H)，3.134 (m， 1H)，2.369 (s，3H)，2.347 (s，3H)，2.296 (br s，4H)· 按上文實例2中所述進行，但以一氮四圜各基 >順式·3,5· 二甲基嗎福啉（以類似4-(一氮四圜各基）-嗎福啉之製備程序製成，但使用順式-3,5-二甲基嗎福啉(2〇·7克；180亳莫耳）取代嗎福啉），取代4-(一氮四圜各基）嗎福啉，獲得（3Ζ)-3-{[3,5-一甲基-4-(2,5-一甲基嗎福琳-4-基）一氮四圜-1-基羰基比洛 -2-基亞甲基}-5-氟基-1,3-二氫-2Η-ΘΙ哚-2-酮，為橘色固體。 LC/MS: +APCI: M+l=453; -APCL: M-l=451 1 9F-NMR (d-DMS0? 376.5 MHz): -122.94 (m3 IF) 1 H (d-DMSO, 400 MHz): 13.651 (s，1H)，10.907 (s，1H)，7.758 (dd，J=9.4 Hz，J-2·3 Hz，1H)，7.700 (s，1H)，6.935 (dt，J=8.6 Hz，J=2.7 Hz，1H)，6.842 (dd3 J-8.2 Hz? J=4.3 Hz, 1H)? 3.961 (br s, 2H)3 3.790 (br s, 2H)? 3.546 (br m? 2H)，3.092 (m，1H)，2.690 (br s; 2H)，2.364 (s，3H)，2.338 (s，3H)，1.492 (br m，2H)，1.038 (br s，6H) 按上文實例2中所述進行，但以（3Z)各(3,5-二甲基冰幾基_ ΙΗ-说洛-2-基亞甲基）·5_氯基'3·二氫·2H-吲哚冬酮，取代（3Z)_ 3-(3,5-二曱基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亞甲基）-5-氟基-l，3-二氫-2H· 吲哚冬酮，並以4·(一氮四圜各基）-順式-3,5-二甲基嗎福啉，取代4-(一氮四圜各基）嗎福啉，獲得（3Ζ)各{〇二甲基冰(3,5· 二甲基嗎福啉斗基）一氮四圜小基羰基]_1Η_吡咯·2—基亞曱基卜 •52- 本纸張尺度適财g g家碎咖）M規格----- 1259081 A7 _____B7 五、發明説明（5〇 ) 5-氯基-1，3·二氫-2H·啕哚-2-酮，為橘色固體。

LC/MS: +APCI: M+l=469? 470; -APCI: M-l-4685469 1 H (d-DMSO? 400 MHz): 13.606 (s? 1H)? ll.〇〇8 (Sj 1H)? 7.979 (d? J=2.0Hz5 1H)? 7.758 (s5 1H), 7.138 (dd, J=8.2Hz? J=2.0H25 1H)? 6.870 (d, J=8.2Hz, 1H )，3.964 (br s，2H)，3.790 (br s，2H)，3.547 (br m，2H)，3.095 (m，1H)，2.691 (br s，2H)，2·366 (s，3H)，2.345 (s，3H)，1.494 (br m，2H)，L039 (br s，6H) 按上文實例1中所述進行，但以如下文所述製成之厶(R)_四氫吡咯小基甲基四氫吡咯，取代4-(嗎福啉斗基 > 六氫吡啶，提供(3Z)-3-{[3,5:甲基-2R-(四氫吡咯-1-基甲基）四氫吡咯小基談基HH·吡咯-2·基亞甲基}-5-氟基-u·二氫-2H、|哚冬酮。 2(只)-四氣n比略小基甲基四氪p比洛之合成步騾1 於(+)-爷氧談基-D-脯胺酸（1.5克，6·0亳莫耳）、EDC (2·3克，12.0毫莫耳）及HOBt(800毫克，12.9毫莫耳）在DMF(20毫升）中之溶液内’添加三乙胺（1.5毫升）與四氫P比TT各（1〇毫升， 12.0毫莫耳）。將其在室溫下攪拌is小時。添加飽和NaHC03 ’將其以CH2C12萃取（三次）。分離有機液層，並以Na2s〇4 脫水乾燥。移除溶劑，並藉矽膠層析純化（Et〇Ac)殘留物，而得HRHN-^氧羰基)-峨咯基]四氫吡咯，為白色固體(94% )。 1 H NMR (400 MHz，CDC13，全部旋轉異構物）1.57-1.66 (111，111)，1.71-2.02 (m，5H)，2.04-2.19 (m，2H)，3.26-3.43 (m，3H)，3.44-3.78 (m，3H)，4.41 (dd，J = 4.5, 7.6 Hz，0.5H)，4.52 (dd，J = 3.7, 7.6 Hz，0·5Η)，4.99 (d，J = 12.1 Hz，0.5H)，5.05 (d，J = 12.5 Hz，0.5H)，5.13 (d，J = 12.1 Hz，0·5Η)，5·20 (d，卜 12.5 Hz，0.5H)，7.27-7.38 (m，5H). -53- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNTS) A4規格(210X297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（μ 步驟2 將(爷氧羰基)脯胺醯基]四氫吡咯(2 7克，8·9毫莫耳）與5%PcK：觸媒(270毫克）在甲醇（15毫升）中之混合物，於氫大氣下攪拌20小時。經過矽藻土過濾反應混合物，並移除落劑，產生2(R>脯胺醯基四氫吡咯，為黏稠油（8〇% )，將其使用於下一步驟’無需進一步純化。 1 H NMR (400 MHz, d6 -DMSO) δ 1.52-1.78 (m? 5H), 1.82-1.89 (m? 2H), 1.97-2Ό4 (m，1H)，2.63-2.71 (m，1H)，2.97-3.02 (m，1H)，3.22-3.35 (m，3H)， 3.48-3.54 (m? 1H), 3.72 (dd, J = 6.1, 8.0 Hz, 1H). 步驟3 使2-(R)-脯胺醯基四氫吡咯（12克，71亳莫耳）溶於THF (1〇耄升）中。使反應混合物冷卻至〇°C，並於。c下逐滴添加thf 中t BH3，1M (10毫升，1〇毫莫耳）。使反應混合物回流16小時’添加3 M HC1 (4·7毫升）。添加2 M NaOH溶液，直至達到 pH 10。將產物以CH2 C〗2中之5% MeOH萃取（三次）。將有機層以Na] SO4脫水乾燥，並移除溶劑，提供標題化合物，為微黃色液體（73% )，將其使用於下一步驟，無需進一步純化。 iHNMRGOOMHz^-DMSO) 5 1.22-1.30 (m，lH)，1.55-1.69 (m，6H)， 1.71-1.79 (m，1Η)，2.26-2.30 (m，1Η)，2.33-2.38 (m，1H)，2.40-2.45 (m，4H)， 2.65-2.71 (m，1H)，2·78_2·84 (m，1H)，3.02-3.09 (m，1 H)· 按上文貫例1中所述進行，但以2-(s)-四氫p比嘻小基甲基四氫吡咯（按上述，經由以芊氧羰基小脯胺酸取代㈩-芊氧羰基脑胺故製成）’取代4-(嗎福淋-4-基）-六氮ρ比淀，提供（32)各 {[3,5-二甲基-2S-(四氫吡咯+基曱基）四氫吡咯+基羰基HH★匕 1259081

咯基亞甲基}_5·氟基-1，3-二氫·2Η-啕哚-2-酮。實例3 - 5-[5-氟基-2-嗣基-1，2_二氫-亞丨嗓-(3Ζ)-基-甲基】-2,4-二甲基-1Η-吡咯-3-叛酸之合成使二甲基甲醯胺(25毫升，3當量）在冰浴中冷卻，並搅摔。於其中添加POCI3 (1.1當里’ 10.8毫升）。30分鐘後，將3,5· 二甲基-4-乙酯吡咯（17.7克，105.8毫莫耳）於DMF中之溶液 (2M，40毫升）添加至反應中，並持續攪拌。2小時後，將反應物以水（250耄升）稀釋’並以1 n NaOH水溶液驗化至pH=l 1 。藉過濾移除白色固體，以水，然後以己燒沖洗，並乾燥而得5-甲醯基-2,4-二曱基-1H-吡咯各羧酸乙酯（19.75克，95% ) ’為黃褐色固體。 1 H NMR (360 MHz，DMSO-d6) 5 12.11 (br s，1H，NH)，9.59 (s，1H， CHO)，4·17 (q，J = 6·7Ηζ，2H，OCH2 CH3 )，2.44 (s，3H，CH3 )，2.40 (s，3H， CH3 )，1.26 (d，J = 6.7Hz，3H，〇CH2 CH3 )· 步驟2 將5-甲酿基-2,4-«一曱基]H-p比p各-3-複酸乙g旨（2克，i〇毫莫耳）添加至已溶於甲醇（3毫升）與水（1〇毫升）中之氫氧化鉀（3克 ’ 53毫莫耳）落液内。使混合物回流3小時，冷卻至室溫，並以6 N鹽故故化至pH 3。藉過滤收集固體，以水洗務，並在真空烘箱中乾燥過夜，而得5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡洛各羧酸（1.6 克，93%)。 H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s5 br? 2H? NH & COOH), 9.59 (s5 1H，CHO)，2.44 (s，3H，CH3 )，2·40 (s，3H，CH3). -55- 本纸狀度適财S g家辟(CNS) A4規格(21G x 297公复)" ----- 1259081 A7 B7 五、發明説明（S3 使5-氟基啕哚醌（8·2克，49.7毫莫耳）溶於50亳升胼水人物中’並回流1小時。然後，將反應混合物傾倒在冰水中。接著’過濾沉澱物，以水洗滌，並在真空烘箱中乾燥，獲得5 氟基•氧化吲哚（7.5克）。將5-氟基氧化啕哚（100毫克，〇·66毫莫耳）、孓甲酿基々斗二甲基-1H-吡咯各羧酸（133毫克，0J9毫莫耳）及10滴六氣峨淀於乙醇（3亳升）中之反應混合物，在6〇°C下攪拌過夜，並過濾。將固體以1 Μ鹽酸鹽水溶液及水洗滌，並乾燥而得5 (5-氟基-2-酮基·ι，2-二氫-亞啕哚-3-基曱基）-2,4·二甲基_1Η·ρ比洛 3-幾酸(201毫克，定量），為黃色固體。MSm/ζ(相對強度， %) 299([M-l]+，i〇〇)。實例4- 5-(5-氟基-2-嗣基-1，2-二氫-亞吲嗓-3-基-甲基)_2,4_二甲基 -1H-吡咯各羧酸(3-二乙胺基-2·經基-丙基醯胺之合成步驟1 在2-氯基甲基環氧乙貌（95克’ 1.03莫耳）中添加水（3〇8克，0.17莫耳）與二乙胺（106.2毫升，1.03莫耳）於3(rc下之混合物。然後，將反應混合物於28-35。(：下攪拌6小時，並冷卻1 20-25 C，獲得1-氯基-3-二乙胺基-丙-2-醇。步驟2 於氫氧化鈉（47.9克，1.2莫耳）在78亳升水中之溶液内，添加1-氯基-3-二乙胺基-¾冬醇。將所形成物於2〇-25^下攪拌工小時，以178毫升水稀釋，並以醚萃取兩次。以固體氫氧化 -56- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) 1259081 A7 發明説明鉀，使合併之醚溶液脫水乾燥，並蒸發，而得135克粗產物，將其藉部份蒸餾而純化，獲得純縮水甘油基二乙胺（98克，76% )，為油狀物。 ±ΜΛ 在25%(wAv)氫氧化銨(25亳升，I%毫莫耳）之冰冷溶液中，於10分鐘内逐滴添加縮水甘油基二乙胺（3·2克，24 8毫莫耳）。將反應混合物在0-5°C下攪捽}小時，然後在室溫下14 小時。使所形成之反應混合物蒸發，並蒸餾（84_9〇。〇，於5〇〇_ 600mT下）’而得1-胺基各二乙胺基·丙·2·醇（33克，92%)。 MSm/z 147([Μ+1]+)· 步驟4 於5-甲醯基-2,4-二甲基吡咯各羧酸（1〇〇毫克，〇·43毫莫耳）、EDC (122.7毫克，0.64 亳莫耳）&HOBt(86 5 毫克，〇.64毫莫耳）在1.0毫升DMF中之溶液内，添加丨_胺基各二乙胺基·丙 -2-醇（93.2毫克，0.64耄莫耳）。將所形成之反應溶液於室溫下攪拌過夜，並蒸發。使殘留物懸浮於1〇毫升水中，並過濾。將固體以飽和碳酸氫鈉與水洗滌，並在高真空烘箱中乾燥過夜，獲得粗產物，使其在管柱層析上純化，以含有三乙胺(2滴/ 100毫升6%甲醇-二氯甲烷）之6%甲醇·二氯甲烷溶離，獲得5-(5-氟基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚各基甲基>2,4· 二甲基-1如比哈-3邊酸（3-二乙胺基-2-¾基-丙基）_醯胺（62毫克，34%)，為黃色固體。 1 H NMR (400 MHz，DMSO-d6) 5 13.70 (s，1H，NH]，)，10.90 (s，1H， NH-1)，7.76 (dd，J = 2.38, 9·33 Hz，1H，H-4)，7.72 (s5 1H，乙缔基-η)，7·60 -57- 本纸泵尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐）

裝 η

1259081

(m，br，1H，CONHCH2 CH(OH)-CH2 N(C2 H5 )2 -4’)，6.93 (dt，J = 2·38, 8.99 Hz，1H，H-5)，6.85 (dd，J = 4.55, 8.99 Hz，1H，H-6)，3.83 (m，br，1H，OH)， 333 (m，4H)，2.67 (m，br，5H)，2.46 (s，3H，CH3 )，2.44 (s，3H，CH3 )，1.04 (m，br，6H，CH3 x2)· MS m/z (相對強度，％ ) 427 ([M+l]+，100)· 實例5- 5-[5-氟基-2-嗣基-1，2-二氫-亞4丨嗓-ρζ)-基-甲基]-2,4-二甲基洛-3-羧酸（2-經基-3-嗎福淋-4-基-丙基）-酿胺（R)，(s)與 (R/S)(化合物4, 5及6)之合成步驟1 將嗎福啉（2.6毫升，30毫莫耳）與環氧氣丙烷（2.35毫升， 30毫莫耳）於乙醇（50毫升）中之混合物，在70°C下攪拌過夜。移除溶劑後，以二氯甲烷（50毫升）稀釋殘留物。藉真空過濾、收集已沉殿之透明固體，而得1-氯基-3-嗎福淋-4-基-丙· 2-醇（2·0 克，37%)。 1 H NMR (DMSO-d6) δ 3.49 (t5 J=4.8 Hz5 2H)? 3.60 (t5 J=4.6Hz? 2H)? 3.75 (m，4H，2xCH2 )，4.20 (dd，J=5.2, 12 Hz，2H)，4.54 (m，2H)，4.62 (m， 1H，CH)，6.64 (d，J=6.4 Hz，1H，OH). MS (m/z) 180.2 (M+l)· 步驟2 將1-乳基-3-嗎福淋-4-基-丙-2-醇（2.0克，Π亳莫耳），在室溫下’以NH3在甲醇（25%重量比，20毫升）中之溶液處理。使氮起泡進入反應混合物中，以移除氨。蒸發溶劑，獲得胺基-3-嗎福啉-4-基-丙-2-醇之氯化氫鹽（2·〇克，91 % )。 1 H NMR (DMSO-d6) 5 2.30 (d5 J=6.0Hz? 2H)? 236 (m? 4H? NCH2 )5 2.65 (dd，J二8.4, 12.8Hz，1H)，2.91 (dd，J=3.6, 12.8Hz，1H)，3.52 (m，4H，〇CH2)， 3.87 (m，1H，CH)，5.32 (s，1H，〇H)，8.02 (brs，3H，NH3 + ). MS (m/z) 161.1 -58- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（56 (M+1)· 步驟3 使5-(5-默基-2-酮基-1，2-二氫-亞p引嗓-3-基甲基）-2,4-二甲基-1H-吡咯各羧酸（120毫克，0.4毫莫耳）與1-胺基-3-嗎福啉斗基-丙-2-醇（74毫克，0.48毫莫耳）縮合，以沉澱5-〇氟基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯各羧酸（2-羥基-3-嗎福淋-4·基-丙基）-醯胺（65毫克，36% )。蒸發母液至乾滴，並藉急驟式層析使殘留物純化，獲得另外之2N (70毫克，39 % )。1 H NMR (DMSO-d6) (5 2·28 (m，1H)，2.32 (m，1H)，2.40 (m5 4H)， 2.40, 2·42 (2xs，6H，2xCH3 )，3.15 (s，1H)，3.31 (m，1H)，3.55 (m，4H)，3.78 (m，1H)，4.73 (brs，1H，OH)，6.82 (dd，J=4.5, 8.4Hz，1H)，6.90 (td，2 j=2.8， 3 >10·0Ηζ，1H)，7.53 (m，1H)，7.70 (s，1H)，7.74 (dd，J=2.0, 9.6Hz，1H)(芳族與乙晞基），1〇·87 (s，1H，CONH)，13.66 (s，1H，NH)· LC-MS (m/z) 441.4 (M-l). 墓化2-幾基氧偶氛尼亞螺丨3·5]壬燒之合成

HN

1)乙醇 2)丙酮於裝有熱電偶、氮氣入口管及250毫升添液漏斗之1升3· 頸圓底燒瓶中，添加嗎福啉(915克，915毫升，1〇5莫耳， i·0田量）與1〇〇耄升乙醇。將此溶液迅速地攪拌，同時自添液漏斗添加環氧氯丙烷（100克，84.5毫升，1·〇8莫耳，1·〇3當量）’歷經約30分鐘。一監控溫度，且當锅溫達到27。〇時，以冰水洛使反應物冷卻。將透明溶液攪拌18小時。藉GC檢測 -59- Η 張尺度 297公釐) 1259081 A7 B7 五、發明説明（57 ) 反應物（將5滴反應混合物稀釋於1毫升乙醇中，並注入 15m DB-5毛細管GC管柱中，使用下列操作參數，注射器250 °C，偵測器250°C，起始烘箱溫度28°C，在每分鐘l〇°C下預熱至250°C )。反應完成，並留下少於3%之嗎福啉。使反應物於50°C與全罩框真空下，在旋轉蒸發器上濃縮，直到不再有餾出物可被凝結為止。將所形成之油在室溫下儲存24-48小時，或直至觀察到顯著量之結晶為止（加入晶種將會加速此過程）。將此漿液以250毫升丙酮稀釋，並過濾。使固體在60°C下，於真空烘箱中乾燥18-24小時。這提供84克結晶性產物。可濃縮母液，並重複此結晶程序，以增加回收率。1 H NMR (400 MHz，DMSO-d6) 5 6.55 (d，1H)，4.64 (m，1H)，4.53 (m，2H)，4.18 (m，2H)，3.74 (m，4H)，3.60 (m，2H)，3.48 (m，2H)· 1 3 C NMR (100 MHz，DMSO-d6) (5 70·9, 61.39, 61.04, 60.25, 58.54, 57.80. 1-胺基-3-(4-嗎福啉基)-2-丙醇（外消旋）之合成 cr 〇0+^〇H NH3<Me〇H >

於具有磁攪拌棒之3升1-頸圓底燒瓶中，添加氯化2-羥基-7-氧-4-偶氮尼亞螺[3.5]壬烷（150克，835毫莫耳），接著為在甲醇中之23重量％無水氨(2120毫升）。以塞子塞住燒瓶，並將所形成之透明溶液於20-23°C下攪拌18小時。在上文條件下，GC顯示沒有殘留起始物質。將塞子移除，並使氨起泡離開溶液，歷經30分廣。然後，將燒瓶轉移至旋轉蒸發器，並以45°C浴液及全罩框真空，濃縮成白色固體。1 H NMR -60- 本纸張·尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210Χ 297公釐） 1259081 A7 _____ B7 五、發明説明（58 ) (400 MHz，DMSO-d6) δ 3.57 (dd5 2H)，3.3-3.5 (m，6 H)，2.59 (m，2 H)， 2·2-2·4 (m，6 H); 13 C NMR (loo MHz DMSO-d6) 6 70.8, 67.1，60山 53.8, 48.1. 按照上文實例3中所述之程序，但以按下文所述製成之2-(S)-l-胺基-3-嗎福啉冰基-丙冬醇，取代2-(RS)-l-胺基-3·嗎福啉· 4·基-丙-2-醇，獲得所要之化合物5-[5·氟基·2.基-丨，2_二氫-亞 +朵-(3Ζ)-基甲基]_2,4-二甲基-1Η-Ρ比咯-3-羧酸（2-(S)-羥基各嗎福淋-4-基-丙基）-酿胺。碰基_3_(4_嗎福啉基V24薛（非外消旋）之合盅

(〇Η 一敝.♦ OH d THF 〇 MeOH^ 於裝有機械攪:拌、熱電偶及添液漏斗之1升3_頸圓底燒瓶中’添加嗎福啉（91.5克，91.5毫升，1.05莫耳，1.0當量）與 45毫升第三-丁醇。將此溶液迅速地攪摔，同時自添液漏斗添加R-環氧氯丙烷（1〇〇克，845毫升，；^莫耳，1〇3當量），歷經約30分鐘。監控溫度，且當鍋溫達到2Γ(：時，以冰水浴使反應物冷卻。將透明溶液攪拌18小時。藉〇(：檢測反應物（使5满反應混合物稀釋於1毫升乙醇中，並注射至 15mDB-5毛細管GC管柱中，使用下列操作參數，注射器25〇 °C，偵測器250°C，起始烘箱溫度28°C，在每分鐘1〇艺下預熱至250°C)。反應完成，並留下少於3%之嗎福啉。使溶液冷卻至io°c，並逐滴憂加第三·丁醇鉀在THF中之2〇重量％溶液（576克），保持溫度低於15^。將所形成之白色漿液於 -61 - 1259081 A7 B7 五、發明説明（59 10-15°C下攪拌2小時，並藉GC使用上述條件進行檢查。未能發現氯醇。使混合物於旋轉蒸發器上，使用50艺浴液及全罩框真空進行濃縮。以水（5〇〇亳升）與二氯τ烷稀釋所形成之混合物。分離液相，並以二氯甲烷（5〇〇亳升）洗滌水相。將合併之有機層以硫酸鈉脫水乾燥，並濃縮成透明無色油。這提供145克，97%產率之環氧化物。iHNMR(4〇〇MHz， DMSO-d6) 53·3 (dd，4 Η)，3·1 (m，1 Η)，2·6 (dd，1 H)，2.5 (dd，1 Η)，2·4 (m， 4 H)，2.2 (dd，2 H); 1 3 C NMR (100 MHz，DMSO-d6) 5 65.4, 60.1，53.1， 48.9, 43.4. 將上述粗製環氧化物添加至具有磁授拌棒之3升頸圓底燒瓶中。添加在甲醇中之無水氨(24% w/w 2.5升），以塞子塞住燒瓶，並將混合物於室溫下攪拌24小時。在上文條件下，GC顯示沒有殘留起始物質。將塞子移除，並使氨起泡離開溶液，歷經30分鐘。然後，將燒瓶轉移至旋轉蒸發器，並以45°C浴液及全罩框真空，濃縮成透明無色油。這提供 124 克產物。1 H NMR (400 MHz，DMSO-d6) (5 3.57 (dd，2H)，3 3-3.5 (m，6 H)，2·59 (m，2 H)，2.2-2.4 (m，6 H); 1 3 C NMR (100 MHz，DMSO-d6) 5 70.8, 67.1，60.1，53.8, 48·1· 1-胺基_3·(4_嗎福啉基丙酶乏合成於裝有機械攪摔、熱電偶及添液漏斗之1升3-頸圓底燒瓶中，添加嗎福淋（91·5克，91.5毫升，L05莫耳，1.〇當量）與 200毫升甲醇。將此溶液迅速地授拌，同時自添液漏斗添加 R-環氧氯丙烷（100克，_ 84·5毫升，1.08莫耳，丨仍當量），歷經約30分鐘·。監控溫度，且當鍋溫達到27°C時，以冰水浴 -62- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1259081

使反應物冷卻。將透明溶液攪拌18小時。藉GC檢測反應物 (使5滴反應混合物稀釋至丨毫升乙醇中，注射至15^ db_5毛細管GC管柱中，使用下列操作參數，注射器25(rc，偵測器 250C，起始烘箱溫度28°C，在每分鐘l〇°c下預熱至250°C)。反應完成，並留下少於3%之嗎福啉。使溶液冷卻至1〇。〇，並逐滴添加在甲醇中之甲醇鈉之25重量％溶液（233克，1〇8 莫耳，247耄升），保持溫度低於15^。將所形成之白色漿液於1(M5°C下攪拌2小時，並藉GC使用上文條件進行檢查。未能觀察到氯醇。使混合物於旋轉式蒸發器上，使用5〇t 浴液及全罩框真空進行濃縮。以水（5〇〇亳升）及二氯甲烷稀釋所形成之混合物。分離液相，並以二氯甲烷（5〇〇毫升）洗滌水相。將合併之有機層以硫酸鈉脫水乾燥，並濃縮成透明無色油。這提供145克，97%產率之環氧基冰嗎福啉| 基丙烷。1HNMR(400MHz，DMSO-d6) 53.3(dd，4H)，3.1(m，1H)， 2.6 (dd，1 H)，2.5 (dd，1 H)，2.4’(m，4 H)，2.2 (dd，2 H); 1 3 C NMR (100 MHz，DMSO-d6) (5 65.4, 60.1，53.1，48·9, 43·4· 將上述粗製1，2-環氧基-3-嗎福啉斗基丙烷添加至具有磁攪拌棒之3升^頸圓底燒瓶中。添加在甲醇中之無水氨(24% w/w 2.5升），以墓子基住燒瓶，並將混合物於室溫下授拌μ 小時。在上文條件下，GC顯示沒有殘留起始物質。將塞子移除，並使氨起泡離開溶液，歷經30分鐘。然後，將燒瓶轉移至旋轉蒸發器，並以45t浴液及全罩框真空，濃縮成透明無色油。這提供:124克:U胺基各(4·嗎福啉基）·2•⑸·丙醇。 1 H NMR (400 MHz? DMSO-d6) ^ 3.57 (dd?2H)? 3.3-3.5 (m? 6 H)? 2.59 (m? -63 - 1259081 A7 B7 五、發明説明（61 2 Η)，2·2·2·4 (m，6 H); 1 3 C NMR (1〇〇 MHz，DMSOd6) d 70.8, 67.1，60:1， 53·8,48·1·

H2NXO 5·氟基氧化4哚>

Et3 N, THF 將咪唑醯胺（7.0克，32.3毫莫耳）、胺（15.0克，64.6毫莫耳）、5-氟基氧化啕嗓（4.93克，32·6亳莫耳）、三乙胺（9·79克， 96.9毫莫耳）及THF (88毫升）混合並加熱至6〇。(：。形成褐色溶液。於60°C下攪拌24小時後’使黃色漿液冷卻至室溫並過滤。將滤餅以80毫升THF洗滌，並於5〇艺與罩框真空下，乾燥過夜。獲得褐色固體（23·2克）。將固體於室溫下，在35〇毫升水中配成漿液，歷經5小時並過濾。將濾餅以1〇〇毫升水洗滌，並於50°C與罩框真空下，乾燥過夜。獲得8·31克，具有56%化學產率。

於裝有溫度計、冷凝器、磁攪拌及氮氣入口管之〇25升燒瓶中，添加4_92克5-氟基氧化㈣、7〇克味㈣胺、⑴克 (RH-胺基_3_(4·嗎福淋基㈣醇、A%克三乙胺㈣毫升四 -64- 1259081

氫呋喃。將混合物加熱至60t：，歷經16·5小時。使反應物冷卻至環境溫度並過濾。將所獲得之固體於U亳升/克下，在乙腈中配成漿液連續三次，在真空中乾燥而得3·6克（25.25 %)。[HPLC，HypersilBDS，C_18,5/z，（6: 4)，乙腈：〇.1Μ 氯化銨，ΡΗΑ-571437 = 4·05 分鐘。]i^NMRpMSO): 5 10.86(lH，bs);7.75 (lH，d); 7.70 (lH，s); 7·50 (lH，m); 6·88 (2Η，πι); 4·72 (lH，bs); 3·78 (lH，bs); 3.56 (4H，m); 3·32 (6H，m); 3.15 (lH，m); 2.43 (8H，bm). 實例6 - 2,4_二甲基-6-丨嗣基_1，2_二氫·亞吲嗓_(3Z)_基甲基】吡咯-3-叛酸(2-義基-3_嗎福淋冰基-丙基)-醯胺之合成使5-(2-酮基-1，2-二氫-亞啕哚各基甲基）·2,4·二甲基·1H-吡咯各羧酸（113毫克，0.4亳莫耳:）與1-胺基各，嗎福啉冰基·丙么醇（74 亳克，0·48毫莫耳）縮合，以沉澱2,4-二甲基-5-[2-酮基-1，2-二氫-亞W哚-(3Ζ)-基甲基；μΐΗ-吡咯-3-羧酸（2-羥基各嗎福啉-4-基-丙基）-醯胺（77毫克，45.3%)。 1 H NMR (DMSO-d6) 5 2·27 (m，1Η)，2·32 (m，1Η)，2.40 (m，4Η)，2.40, 2.42 (2xs，6H，2xCH3 )，3.15 (s，1H)，3.32 (m，1H)，3·55 (m，4H)，3·77 (m， 1H)，4.74 (d，J=4.8Hz，1H，OH)，6.86 (d，J=7.6Hz，1 H)，6.96 (t，J=7.2 Hz， 1 H)，7.10 (t，J=7.6Hz，1 H)，7.49 (t，J=5.6 Hz，1 H)，7.61 (s，1H)，7.77 (d， J =8·0 Hz，1H)(芳族與乙烯基），10.88 (s，1H，CONH)，13.62 (s，1H， NH). LC-MS (m/z) 425.4 (M+l). 實例7 - 5-[5-氯基-2-酮基-1，2-二氫-亞啕哚-(3Z)-基-甲基卜2,4-二甲基-lH-p比洛-3-叛酸（2-幾基-3-嗎福淋-4-基-丙基）-酿胺（化合物7)之合成使5-(5-氯基-2-酮基-1,2-二氫-亞啕哚各基甲基）-2,4-二甲基-1H- -65· 本纸泵尺度適用中國國家標準(C2\TS) A4規格(210X 297公釐) 1259081 A7 --------Β7 五、發明説明（63 ) 叶匕咯各羧酸（126.6毫克，0·4毫莫耳）與1-胺基各嗎福啉冰基-丙-2-醇（74毫克，0.48毫莫耳）縮合，以沉澱5-[5-氯基-2-酮基-1，2-二氫-亞啕哚-(3Ζ)-基甲基]-2,4-二甲基-1Η·吡咯各羧酸（2-羥基-3-嗎福琳-4-基-丙基）-酿胺（107毫克，58% )。 1 H NMR (DMSO-d6) δ 2·29 (m，1Η)，2·33 (m，1Η)，2.39 (m，4Η)，2.40, 2.42 (2xs，6H，2xCH3 )，3.15 (s，1H)，3.37 (m，1H)，3.55 (m，4H)，3.77 (m; 出)，4.74 (d，J=4.8Hz，1H，OH), 6.85 (d，J=8.4Hz，1H)，7.11 (dd，J=2.0, 8.0 Hz，1H)，7.53 (t，J=5.6Hz，1H)，7.75 (s5 1H)，7.97 (d，J =2·0Ηζ，1H)(芳族與乙烯基），10.99 (s，1H，CONH)，13.62 (s，1H，NH). LC-MS (m/z) 457·4 (M-l). 實例8 - 5-[5-溴基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚_(3Z)_基-甲基卜2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-幾基：嗎福啉冰基-丙基)-醯胺之合成使5-(5-溴基-2·酮基-1，2-二氫-亞啕哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(72·2毫克，0.2毫莫耳）與1-胺基各嗎福啉-4-基-丙 -2-醇（38毫克，0.24毫莫耳）縮合，以沉澱5-[5-溴基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚-(3Ζ)-基甲基]-2,4-二甲基-1Η-吡咯各羧酸（2-羥基-3-嗎福^林-4-基-丙基）-酿胺（55¾克’ 55%)。 1 H NMR (DMSO-d6) 5 2.27 (m，1H)，2.32 (m，1H)，2.39 (m，4H)，2.41， 2·42 (2xs，6H，2xCH3 )，3·13 (s，1H)，3·35 (m，1H)，3·55 (m，4H)，3.77 (m， 1H)，4·74 (d，J=4.4Hz，1H5 OH)，6.80 (d，J=8.4Hz，1H)，7.24 (dd，J=2.0, 8.0 Hz，1H)，7·51 (t，J=5.6Hz，1H)，7·76 (s，1H)，8·09 (d，>2·0Ηζ，1H)(芳族與乙烯基），10.99 (s，1H，CONH)，13.62 (s，1H，NH)· LC-MS (m/z) 503.4 (M-l). 實例9 - 2,4-二甲基-5-[2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基】-1H- -66- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 ____Β7 五、發明説明（64 ) 咐洛各叛酸(2邊基各[ι，2,3]三唑小基-丙基)_醯胺之合成步驟1 將3-[1，2,3]三唑（2·〇克，29毫莫耳）、環氧氯丙烷（3.4毫升， 43.5¾莫耳）與ν，Ν-二異丙基-乙胺(2.6亳升，15毫莫耳）於乙醇（50毫升）中之混合物，在室溫下攪拌過夜。移除溶劑後 ’將殘留物藉急驟式層析純化（α^Ονα^ΟΗ^ΙΟΟ/Ι-ΙΟΟΟ-ΐΟΟΜ) ，而得μ氯基-3-(1，2,3)-三唑-2-基丙-2-醇（2·1 克， 45%) ， 1 H NMR (CDC13) 5 3.52 (m，2Η，ΟΗ 及 CH2 )，3.60 (dd，J=5.2, 11 ·2 Ηζ， 1H)，4·36 (m，1H，CH)，4·68 (m，2H)，7·67 (s，2H)· MS (m/z) 162.1 (M+l); 與1-氯基-3-(l，2,3)三唑小基丙-2-醇（2.3克，49%)，iHNMR (CDC13) 5 3.56 (s，1H)，3.57 (s，1H)，4·35 (m，1H)，4.53 (dd，J=7.2, 14 Hz， 1H)5 4.67 (dd? J=3.8? 14Hz? 1H), 7.67 (s? 1H)? 7.71 (s? 1H). MS (m/z) 162.1 (M+l)· 步驟2 將1-氯基-3(1，2,3)三唑-1-基丙-2-醇（2.3克，13毫莫耳）以NH3 在甲醇中之溶液(25%重量比，20毫升）處理，於密封壓力容器中，在60 °C下過夜。冷卻至室溫後，使氮起泡進入反應混合物中，以移除氨。蒸發溶劑，獲得1-胺基-3(1，2,3)三唑小基丙-2-醇之氯化氫鹽（2·57克，100%)。 1 H NMR (DMSO-d6) 5 2.68 (dd，J=8.8, 12.8Hz，1H)，2.97 (dd，J=3.6, 12.8Hz，1H)，4.15 (m，1 H)，4.44 (dd，J=6.4, 14Hz，1 H)，4.57 (dd5J=4.6, 14 Hz，1 H)，5.95 (d，J=5.2Hz，1 H，OH)，7.77 (s，1H)，8.01 (brs，3H，NH3 + )， 8.12 (s5 1H). MS (m/z) 143.1 (M+l). 步驟3 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（65 ) 使5-(2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚各基甲基）·2,4·二甲基-1H-吡咯各羧酸（113毫克’ 0.4毫莫耳）與μ胺基-3(1，2,3)三唑-1-基-丙-2-醇 (85毫克，〇·48毫莫耳）縮合，以沉澱2,4-二甲基-5·[2-酮基-l，2-二氫-亞啕哚-(3Z)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基各[1，2,3]三唑-1**基-丙基）-醯胺（70毫克，41%)。 1 H NMR (DMSO-d6) 5 2.45, 2.48 (2xs，6H，2xCH3 )，3·35 (m，2H)， 4.02 (m，1H)，4·32 (dd，J=7.6, 14 Hz，1H)，4·53 (dd，J=3.4, 14 Hz，1H)，5.43 (d，J=5.6Hz，1 H，OH)，6.91 (d，J=7.6Hz，1 H)，7.01 (t，J=7.6 Hz，1 H)，7.15 (t，J=8.0Hz，1 H)，7.66 (s，1 H)，7.12 (t，J=5.6 Hz，1H)，7.74 (s，1H)，7.77 (d， J=7.6 Hz, 1H)? 8.11 (s? 1H)5 10.93 (s? 1H? CONH), 13.68 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 405.4 (M-l). 實例10 - 5-[5-氟基-2-嗣基-1，2·二氫-亞4丨嗓-(3Z)·基·甲基】_2,4-二甲基-1H-吡咯冬羧酸(2邊基-3-[1，2,3】三唑-1-基-丙基)-醯胺之合成使5-(5-默基-2-酮基-1，2-二氫-亞Θ丨嗓-3-基甲基）-2,4-二甲基-1H-吡咯各羧酸（120毫克，0.4毫莫耳）與1-胺基-3(1，2,3)三唑-1-基-丙-2-醇（85毫克，0.48毫莫耳）縮合，以沉澱5-[5-氟基-2-酮基-1，2-— 鼠"亞，嗓-(3Z)-基甲基]-2,4-二甲基哈-3-複酸（2-¾ 基各[1，2,3]三唑小基-丙基）·醯胺（1〇〇毫克，62%)。 1 H NMR (DMSO-d6) 5 2·42, 2·44 (2xs，6H，2xCH3 )，3.27 (m，2H)， 3.98 (m，1H)，4.27 (dd，J=7.6, 14 Hz，1 H)，4.50 (dd，J=3.4, 13.6 Hz，1 H)， 5.38 (d，>5·6Ηζ，1H，OH)，6.82 (dd，>4·4, 8·4Ηζ，1H)，6.91 (td，2 J=2.4， 3 J=9.0Hz，1H)，7·70 (m，3H)，7.75 (dd，J =2·4, 9.2Hz，1H)，8·11 (s. 1H)， 10.93 (s，1H，CONH)，13.73—(s，1H，NH)· LC-MS (m/z) 423.4 (M-l). 實例11 - 5-[5_氣基：酮基-l，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基】-2,4-二 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1259081

甲基-1H-吡咯-3-叛酸(2居基-3-[1，2,3】三唑小基-丙基)_酿胺之合成使5-(5-氯基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲噪-3-基甲基）-2,4-二甲基-1H-叶匕哈-3-羧酸（126.6毫克，0·4毫莫耳）與1·胺基-3(1，2,3)三唑小基 -丙-2-醇（85毫克，0.48毫莫耳）縮合，以沉澱5·[5-氯基酮基_ 1，2-二氫-亞啕嗓-(3Ζ)-基甲基]-2,4-二甲基-lH-p比洛各複酸（2-¾ 基Hl，2,3]三也小基-丙基）-酿胺(48毫克，27%)。 1 H NMR (DMSO-d6) (5 2.42, 2·44 (2xs，6H，2xCH3 )，3.27 (m，2H)，3.99 (m，1H)，4.28 (dd，J=7.8, 14 Hz，1H)，4·51 (dd，J=3.2, 14 Hz，1H)，5.39 (d，J= 6·0Ηζ，1H，OH)，6·85 (d，J=8.4Hz，1 H)，7.12 (dd，J=2.0, 8.2Hz，1 H)，7.70 (m，2H)，7·74 (s5 1 H)，7.97 (d，J=2.0Hz，1 H)，8·07 (s，1H)，10.99 (s，1H，CO NH)，13.65 (s，1H，NH)· LC-MS (m/z) 439.4 (M-l)· 實例Π- 5_[5_溴基嗣基-1，2_二氫-亞，嗓_(3Z)_基-甲基】_2,4-二甲基-ΙΗ-ρ比洛-3-羧酸(2名基各[1，2,3】三唆-1-基-丙基)-酿胺之合成使5-(5-溴基-2-酮基-1,2-二氫-亞吲嗓各基甲基）-2,4-二甲基-1H-吡咯·3-羧酸（144.4毫克，0.4亳莫耳）與1-胺基_3(1，2,3)三唑-1-基 -丙-2·醇（85毫克，0.48毫莫耳）縮合，·以沉澱5-[5-溴基-2-酮基-1，2-二氫-亞啕哚-(3Z)-基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-[1，2,3]三也小基-丙基）-醯胺（130亳克，67%)。 1 H NMR (DMS〇-d6) 5 2.41，2.44 (2xs，6H，2xCH3 )，3.27 (m，2H)，3.99 (m，1H)，4.28 (dd，J=7.6, 14 Hz，1 H)，4.50 (dd，J=3.6, 14 Hz，1 H)，5.40 (d， J=5.6Hz，1 H，OH)，6·81 (d，J=8.4Hz，1H)，7.24 (dd，J =2.0, 8.0Hz，1H)， 7.70 (m，2H)，7.77 (s，1H)，8·07 (s. 1H)，8.10 (d，J=1.6Hz，1H)，11.0 (s，1H， CONH)? 13.64 (s? 1H, NH). LC-MS (m/z) 485.4 (M-l). 實例I3- 5-(5-氟基-2-嗣基-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基- -69- 本紙杀尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（67 ) 1H-吡咯-3-幾酸(2-二乙胺基-乙基）醯胺（化合物1} 使5-氟基-1,3-二氫啕哚-2-酮（0.54克，3.8毫莫耳）與5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯各羧酸（2-二乙胺基乙基）酿胺縮合，獲得〇·83克（55% )標題化合物，為黃綠色固體。 1 H NMR (360 MHz，DMSO-d6) (5 13.66 (s，1Η，ΝΗ)，10.83 (s，br，1Η， NH)，7.73 (dd，J = 2·5 & 9·4 Hz，1H)，7·69 (s，1H，H-乙晞基），7·37 (t，1H， CONHCH2 CH2 )，6.91 (m，1H)，6.816.85 (m，1H)，3.27 (m，2H，CH2 )，2.51 (m，6H，3xCH2 )，2.43 (s，3H，CH3 )，2·41 (s，3H，CH3 )，0.96 (t，J = 6.9 Hz， 6H，N(CH2CH3)2)· MS-EI m/z 398 [M+]. 5-(5-氟基-2-酮基-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基)_2,4_二甲基_m_吡咯 -3-叛酸(2-二乙胺基-乙基）酿胺之替代合成將月井水合物（55%，3000毫升）與5-氟啕哚目昆(3〇〇克）加熱至 100°C。於120分鐘内，分次添加（100克）另外之孓氟4丨哚醌 (500克），並揽拌。將混合物加熱至1 i〇°c，並攪拌*小時。使混合物冷卻至室溫，並藉真空過濾收集固體，獲得粗製 (2-胺基-5-氟表基酿I井(748克）。使此醯耕懸浮於水(7〇〇毫升）中，並將混合物之pH值以12 N鹽酸調整至< pH 3。將混合物在室溫下攪拌12小時。藉真空過濾收集固體，並以水洗滌兩次。使產物在真空下乾燥，而得孓氟基二氫_吲哚冬酮（600克，73%產率），為褐色粉末。m-NMR(二甲亞石風) 5 3.46 (s, 2H, CH]), 6·75, 6.95, 7·05 (3 X m，3H，芳族）1〇 35 (s，1H，NH)· MS m/z 152 [M士 1]· 將3,5-二甲基-1H-吡咯-2,4-二羧酸2·第三-丁酯4_乙酯（26〇〇克） -70· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐）一 ------- 1259081 A7

1259081 A7 B7 五、發明説明（69 ) 使5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯（806克）、氫氧化鉀（548克）、水（2400毫升）及甲醇（300毫升）回流兩小時，並攪拌，然後冷卻至8°C。以二氯甲烷萃取混合物兩次。將水層以1000毫升10N鹽酸調整至pH4，保持溫度於15°C下。添加水以幫助攪摔。藉真空過濾收集固體，以水洗滌三次，並於50°C與真空下乾燥，獲得5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯各羧酸（645克，93.5%產率），為黃色固體。iH-NMRCDMSO^) (5 2.40, 2·43 (2xs，2x3H，2xCH3 )，9·57 (s，1H，CHO)，12.07 (br s，2H，NH+ COOH). MS m/z 168 [M+l]. 將5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（1204克）與6020毫升二甲基甲醯胺於室溫下攪拌，同時添加1-(3-二甲基-胺基丙基各乙基碳化二亞胺鹽酸鹽（2071克）、羥基苯并三唑（1460克）、三乙胺（2016毫升）及二乙基乙二胺（1215毫升）。將混合物在室溫下攪拌20小時。以3000毫升水、2000毫升鹽水及3000 毫升飽和破酸氫納溶液稀釋該混合物，並以10 N氫氧化#3 將pH值調整至大於10。以在二氯甲烷中之10%甲醇萃取混合物兩次，每次5000毫升，並將萃液合併，以無水硫酸鎂脫水乾燥，及旋轉蒸發至乾涸。將混合物以1950毫升甲苯稀釋，並再一次旋轉蒸發至乾涸。將殘留物以3 : 1己烷：乙醚（4000毫升）研製。藉真空過濾收集固體，以400毫升醋酸乙酯洗滌兩次，並在真空與34°C下乾燥21小時，而得5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯各羧酸（2-二乙胺基-乙基）-醯胺（819克，43%產率），為淡褐色固體。1H-NMR(二甲亞颯-d6) 5 0.96 (t，6H，2xCH3 )，2·31，2.38 (2xs，2x CH3 )，2·51 (m5 6H 3xCH2 )，3.28 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1259081 A7 B7 五發明説明（7〇 (m，2H，CH2)，7.34 (m，1H，醯胺丽)，9.56 (s，1H，CHO)，11.86 (s，1H，吡嘻 NH). MS m/z 266 [M+1]· 將5-甲醯基-2,4·二甲基-1H-吡咯各羧酸（2-二乙胺基乙基）屬胺（809克）、5-氟基-1，3-二氫…丨哚-2-酮（438克）、乙醇（80〇〇亳升）及四氫批咯（13毫升）於78°C下加熱3小時。使混合物冷卻至1：溫，並藉真空過濾收集固體，且以乙醇洗滌。將此固體與乙醇（5900毫升）於72°C下一起攪拌30分鐘。使混合物冷卻至至/JDL。藉真空過滤收集固體，以乙醇洗滌，並在真空與54°C下乾燥130小時，獲得5·[5-氟基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚 -(3Z)·基甲基]-2,4-二甲基·1Η·吡咯-3-羧酸（2-二乙胺基-乙基）·醯胺（1013克，88%產率），為橘色固體。1 H-NMR (二甲亞砜·必） ά 0.98 (t，6H，2xCH3)，2·41，2·44 (2xs，6H，2xCH3)，2.50 (m，6H，3xCH2)， 3.28 (q，2H，CH2)，6.84, 6.92, 7.42, 7.71，7.50 (5xm，5H，芳族，乙烯基，（:ONH)，10.88 (s，1H，CONH)，13.68 (s，1H，吡咯 NH). MS m/z 397 [M-l]. 5-(5-氟基-2-酮基·1，2-二氫亞吲哚-3_基甲基）44-二甲基·1Η•吡咯各羧酸（2-二乙胺基-乙基）醯胺之蘋果酸鹽，可根據2〇〇2年 8月13曰提出申請之美國專利申請案序號1〇/281，985之揭示内谷製備，其係請求對2001年8月15曰提出申請之美國專利臨時申印案號60/312,353之優先權’其係以其全文併於本文供參考。 5-(5-溴基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲嗓-3-基甲基）-2,4-二甲基-lH-p比咯各瘦酸、5-(5-氯基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲哚基甲基）-2,4-二甲基-lH-p比哈-3·幾酸、5-(2-酮基-1，2-二氫-亞嗓-3-基甲基）· 2,4-二甲基-1Η-吡咯各羧酸之合成，係描述於2〇〇1年2月14曰 -73- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公复) 1259081 A7 B7 五、發明説明提出申請之序號09/783,264中，標題為，，吡咯取代之2-u引哚，林酮-蛋白質激酶抑制劑’’，其揭示内容係以其全文併於本文。實例14_ 5·(5_氟基-2-嗣基-I，2-二氣-亞嗓-3-基甲基)-2,4_二甲基 -1Η-吡咯各羧酸（2-四氫吡咯小基-乙基)-醯胺（化合物2) 使5·氟基-1，3-二氫-二氫啕哚-2-酮與5-甲醯基-2,4-二甲基心Η-吡咯-3-羧酸（2-四氫吡咯小基-乙基）-醯胺縮合，獲得標題化合物。 MS + ve APCI397 [Μ+1]· 實例15- 5-(5-氟基-2-酮基-1，2·二氫-亞弓丨哚-(3Z)-基甲基)-2,4-二甲基-1H-〃比洛_3_叛酸(2·乙胺基-乙基)-酿胺（化合物8) 使5-甲醯基-2,4·二甲基-1H-吡咯各羧酸（2-乙胺基-乙基）_醯胺 (99克）、乙醇（400毫升）、5-氟基-2-氧化啕哚（32克）及四氫吡咯（1·5克）回流3小時，並攪拌。使混合物冷卻至室溫，並藉真空過濾收集固體。將固體在60 °C下，於乙醇中攪拌，冷卻至室溫，並藉真空過滤收集。使產物於真空下乾燥，而得5-(5-氟基-2-酮基-1，2-二氫-亞吲嗓-(3Z)-基甲基）-2,4-二甲基-1H-吡咯各羧酸（2-乙胺基-乙基）-醯胺（75克，95%產率）。1h-NMR (二甲亞砜-d6) (5 1.03 (t，3H，CH3 )，2,42, 2·44 (2xs，6H，2xCH3 )， 2.56 (q，2H，CH2)，2.70, 3.30 (2xt，4H，2xCH2)，6.85, 6.92, 7.58, 7·72, 7.76 (5xm，5H，芳族，乙晞基及 CONH)，10.90 (br s，1H，CONH)，13·65 (br s， 1H，p比 p各 NH). MS m/z 369 [M-l]. 實例16- 3-[5[曱基-2-(2-嗣基-1，2-二氫亞吲哚-3-基f基)·1Η-吡咯-3-基】丙酸（化合物1〇) 使1，3-二氫啕哚冬酮與3·(2-甲醯基-5-甲基-1H-吡咯各基）丙酸 -74- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1259081 A7 B7 五、發明説明（72 ) 縮合，而得標題化合物。實例17- 5-(5-氟基-2-酮基-1，2·二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基 -1Η-吡咯-3-叛酸(2-嗎福啉冰基-乙基)-醯胺（化合物3) 使5-氟基-1，3-二氫-二氫啕哚-2-酮與5-甲醯基-2,4-二甲基-1Η-吡咯各羧酸（2-嗎福啉小基-乙基）-醯胺縮合，獲得標題化合物。生物學實例所使用之第一種細胞系為OC1-AML5細胞系，已知其會表現FLT-3酪胺酸激酶。將此細胞系保持在含有細胞活素之習用培養基中，以保持在液體培養物中生長。此細胞系係提供一種模式，以評估FLT-3發出訊息作用被FLT-3配位體及可抑制FLT-3之化合物之活化與抑制。FLT-3之生物學重要性可以此細胞系進行評估。實例1-FLT-3發出訊息之評估將細胞以FLT-3配位體刺激及溶解。FLT-3係自溶胞產物，以市購可得之抗體進行免疫沉澱。將蛋白質藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，轉移至薄膜，並藉Western氏沾吸分析磷酸酪胺酸，接著對全部FLT-3蛋白質進行分析，作為對照組。獲得會表現FLT-3-野生型之OC1-AML5細胞系（Phannacia)。首先，FLT-3配位體刺激及化合物1抑制經由FLT-3所媒介生物回應之能力，係藉由細胞存活力（錐藍檢測）與細胞增生 (Alamar藍檢測）之分析進行評估。數據指出FLT-3配位體會增加細胞數目，其中一些抑制係顯著地回應化合物1，於是指出化合物1會抑制FLT-3。 -75- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（73 ) 實例2 -藉由免疫沉澱作用/ Western氏分析FLT-3表現與磷醯化作用 (i) OC1-AML5 細胞使用OC卜AML5細胞，已發現FLT-3配位體會刺激FLT-3之磷醯化作用。磷醯化作用係被化合物1降低，因此証實化合物1會抑制FLT-3受體。亦研究下游途徑被FLT-3配位體之活化作用，特別是對 Stat5與erk。Stat5與Erk係為RTK發出訊息之下游介體，且可提供關於FLT-3發出訊息之示值讀數。Stat5為一種轉錄因子，其會調節許多涉及細胞存活與增生之基因。Erkl/2為在 Raf發出訊息途徑上之激酶。Stat5之活化作用係藉由3種研究途徑，觀察對FLT-3配位體之回應：/ Western，使用磷驢基專一抗體之直接Western，及凝膠移轉分析。Stat5活性係被化合物1抑制。erkl/2之磷醯化作用亦被FLT-3配位體活化，且被化合物1抑制，然而IL-3依賴之eric活化作用並未被抑制，這指出化合物1之作用是專一的。

⑼正常PBMC 為研究正常血球中之FLT-3發出訊息作用，自正常供應者之血液中單離出末梢血液單核細胞（PBMC)，並將其用於 FLT-3發出訊息之分析。刺激PBMC中之Stat5磷醯化作用與活化FLT-3之FLT-3配位體，係被微弱地檢出。實例3 -使用其他細胞系MV411 (ITD突變型FLT-3)與RS411 ( 野生型FLT-3)，以研究化合物1對於活體外增生之作用進行此實例係為測定出在OC1-AML5細胞系中所發現之 -76- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（74 ) FLT-3發出訊息作用被化合物1之抑制，是否亦會在野生型 (RS411)或突變型FLT-3 (MV411)中觀察到。細胞系係得自ATCC。細胞增生之分析顯示化合物1會抑制RS411 (野生型FLT-3)與W411兩者之擴張。這顯示化合物1 除了以野生型FLT-3為標的之外，可有效地以白血病中之 ITD突變型FLT-3為標的。為尋求解答ITD-突變型細胞是否顯示對化合物1增加之敏感性，故進行其他實驗。細胞凋零係藉PARP分裂分析及卡斯蛋白酶3染色進行度量。兩種方法均顯示化合物1會造成細胞凋零，且ITD-突變型細胞顯得比野生型細胞更敏感。參閱圖1與2。實例4-化合物1對於MV411(ITD突變型FLT-3)與RS411(野生型FLT-3)中之FLT-3磷醯化作用之影嚮 FLT-3係自溶胞產物，以市購可得之抗體進行免疫沉澱。蛋白質係藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，轉移至薄膜，並藉Western氏沾吸分析磷酸酷胺酸，及接著分析全部FLT-3蛋白質，作為對照組。 IP/W分析顯示化合物1會抑制MV411 (ITD突變型FLT-3)與 RS411 (野生型FLT-3)兩細胞系中之FLT-3磷醯化作用。化合物1對於WT與ITD突變型FLT-3之約略IC5 〇，係個別為250nM 與50nM，這支持ITD突變型已增加對化合物1之敏感性之可能性。參閱圖3。此比較實例係為一種已知蛋白質激酶抑制劑，其具有下式： -77- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

裝玎

1259081 A7 B7 五、發明説明（75 )

此比較化合物未顯示無論是野生型FLT-3或突變型FLT-3之抑制。化合物野生型FLT-3 突變型FLT-3 1 ++ +++ 2 ++ ++ 3 +/- + 4 ++ nd 5 ++ nd 6 ++ ++ 7 ++ nd 8 ++ nd 9 ++ nd 10 +/_ 比較例 - - +++極強抑制 ++ :抑制 +/- ·弱抑制 -:無抑制 nd :未測得實例5 -使用MV411 (ITD突變型卩1^-3)與118411(野生型卩1^-3) -78- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 五、發明説明（76 ) 建立血液加料模式，以研究化合物以活體外之作用此血液加料模式為一種在活.體外之模式，其開發係為幫助將使用活體外模式之臨註前觀察，轉化成臨床狀況。在患«中標的係被表現於血球上之白血病之病患中，一般期主藉由刀析血球或全血液上之標的（譬如FIT』）鱗醯化作用，監測藥物之作用。於血液加料模式中，係將表現吾人 :趣又缸之細胞加入正常人類血液供應者之血液（正常血液不會表現高含量之標的蛋白質)中。按需要添加化合物與配位體，並使細胞溶解，並藉由免疫沉殿作用與Western氏占吸刀析法，刀析蛋白質磷醯化與表現。此係模擬臨床狀況，並使得能夠預測為抑制標的所需要之時間與化合物之劑量依存性。為預測化合物1抑制白血病中之FLT_3磷醯化作用之能力，將表現FLT-3〈細胞系添加至i常人類供應者之血液中，並度量抑制磷醯化作用之動力學與劑量依存性。此方法對於抑制標的磷醯化作用所需要之化合物曝露，應會比在合成培養基中施行之習用生物化學或細胞檢測，提供更精確之測定。實例6-使用MV411與RS411細胞建立活體内模式，及化合物 1對於腫瘤發生之作用將在所示實例中之腫瘤細胞MV411，以皮下方式植入無胸腺老鼠之後腰窩中。當腫瘤已達到特定大小時，開始以化口物或媒劑對照物進行治療。關於功效之度量，係於不同後％時間點上，使用游標尺測徑器度量腫瘤生長。關於磷 -79- IX 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（77 ) 醯化作用之分析，係將腫瘤在服藥後（此處為4小時）切除，於液態氮中粉碎，並於溶胞緩衝劑中均化。FLT-3與Stat5之磷醯化作用係藉免疫沉澱作用與Western氏沾吸分析進行度量。將無胸腺老鼠以皮下方式注射MV411與RS411細胞，以造成腫瘤成形。MV411會導致快速腫瘤形成，同時RS411細胞亦會形成腫瘤，惟較慢。以化合物1治療，會在治療之4天内，急驟地降低腫瘤大小至幾乎不可測得。此外，經活化之FLT-3可在未經治療之腫瘤中測得，並以化合物1藉由4小時治療，而完全被抑制。參閱圖4a與4b。此數據係提供化合物具有於活體内抵抗FLT-3所驅動腫瘤之功效之証據，與 FLT-3磷醯化作用之抑制一致。實例7-用於VEGF生產之活體内骨髓模式將 NOD-SCID 老鼠以環磷醯胺(Neosar，Pharmacia，Kalamazoo, MI) ，藉由腹膜腔内注射150毫克/公斤/天，歷經2天（46)，進行預處理，接著在經由尾靜脈進行靜脈内（i.v·)注射5 X 106 個細胞之前，休息24小時。於實驗終點時，使老鼠麻醉，接著經由心内穿刺，進行末端血液收集。骨髓細胞懸浮液係經由以冷無菌PBS沖洗老鼠股骨而製成。將一範圍之化合物1劑量或其媒劑，以經口方式投藥，每日一次，如圖與表說明文字中所示。對於所有研究，係使用成對Student氏t試驗，以評估經治療組與對照組間之差異（Ρ<〇·〇5被認為是有意義的）。 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210Χ 297公釐) 裝

線

1259081 A7 -—______B7 五、發明説明（^ " " ' ----- 3磷醯化作用。發展之方法顯示，使得能夠分析孔丁_3磷醯化作用（最適宜方法，係為一旦自胤病患中抽出全血液争於乾4上冷’東之如，直接將其添加至溶胞緩衝劑中。接著，使試樣解凍，並藉由免疫抑制，使用珠粒共軛之抗_ FUT-3抗體，分析FLT_3磷醯化作用，接著為對磷醯基-酪胺酸與FLT-3之Western氏沾吸，如同對於血液加料模式（實例5) 。初期終點，FLT-3磷醯化作用在3/6個點中〉5〇%抑制，係在各劑量程度>200毫克下，於3個點中達到，包括WT與突變型FLT-3病患。顯示出兩個病患。在此研究中產生之數據 ’係與臨註前活體外與活體内腫瘤模式數據一致，並証實化合物1會抑制人類中之FLT-3 ^此種使用全末梢血液分析之新穎單一劑量研究，証實化合物1會調制FLT-3與下游發出訊息途徑，此途徑會媒介AML胚細胞於活體内之存活與增生。览集受體標的調制研究用血淦之淼銮 A·由Sugen提供之溶胞緩衝劑（20亳升冷凍液份，1·5χ儲備液，係按下文詳述製成）： i· 使溶胞緩衝劑（1·5Χ儲備液，含有蛋白酶/磷酸酶抑制劑）於室溫下解凍。每10毫升血液需要20毫升溶胞緩衝劑。 ϋ· 將已解柬之溶胞緩衝劑儲存於冰上。 iii·抽出血液，並添加10愛升血液至20毫升落胞緩衝劑中。 _ iv.藉由翻轉數次使其混合，並立即放置於乾冰上或 -82 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（8〇 ) 於-70°C下。 v. 儲存於-7(TC下，並於乾冰上輸送。 ⑴溶胞緩衝劑組合物-組合物產生500毫升1·5χ儲備液體積儲備液最後濃度 10毫升 lMTris? pH 7.5 20 mM 13.7毫升 5M NaCl 137 mM 50毫升甘油 10% 5毫升 NP-40 1% 5毫升 10% SDS 0.1% 2毫升 0.5 EDTA 2mM 添加去離子水至等於500毫升。然後，使混合物經過0.2微米濾器過濾。將混合物儲存於41下，或若添加蛋白酶抑制劑，則在-20°C下，以數液份儲存。 (ii)添加蛋白酶抑制劑於9毫升1.5χ溶胞緩衝劑中添加：體積儲備液最後濃度 0.5毫升 lMNaF 50 mM 100微升 100 mM Na3 V04 1 mM 200微升蛋白酶抑制劑藥液 200微升 100 mM (PefaBloc* 或 PMSF) 2 mM 蛋白酶抑制劑藥液=100 /zM亮肽素、 200 胃蛋白酶抑制素、60 //M抑肽酶、2μΜ貝特制菌素。 *PefaBloc為PMSF之一種較安定水溶性形式，可得自

Boehringer Mannheim ° -83- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1259081 A7 B7 五、發明説明（81 ) 用於分析血液中FLT-3磷醯化作用之方法··將已冷凍之試樣儲存於-70°C下，直到使用為止。血液溶胞產物係迅速地在37°C下解凍，並溶解於2x體積之溶胞緩衝劑（20mM Tris， pH 7.5, 137mM NaCl，10 % 甘油，1 % NP-40, 0.1 % SDS，2mM EDTA， 50mM NaF，ImM Na3 VO4，2mM Pefabloc，2 微克 / 毫升抑肽酶，3.5 微克/毫升貝特制菌素，0.5微克/毫升E-64, 0.5微克/毫升亮肽素及0.7微克/毫升胃蛋白酶抑制素A)中。於各溶胞產物中之蛋白質量，係使用BCA蛋白質檢測（Pierce，Rockford，II) 測定。將得自每一試樣之大約35毫克溶胞產物，對FLT-3、 c-kit或Stat5進行免疫沉澱。免疫沉澱作用與Western氏沾吸（IP/W)分析··使細胞溶解於溶胞緩衝劑（20mMTris，pH7·5;137mMNaCl;10%甘油；l % NP-40 ; 0.1% SDS ; 2 mM EDTA)中，其含有蛋白酶與磷酸酶抑制劑（50 mM氟化納，1 mM正訊酸納，2 mM Pefabloc，1.2 mM抑肽酶，40 mM貝特制菌素，5.6 mM E-64, 4mM亮肽素及4mM胃蛋白酶抑制素A)。藉SDS-PAGE分離等量蛋白質，然後轉移至硝基纖維素薄膜。關於FLT3磷醯化作用之分析，係將得自每一試樣之等量蛋白質，以瓊脂糖-共軛之抗-FLT3.抗體 (Santa Cruz生物技術，Santa Cruz，CA)於4°C下免疫沉澱過夜。將免疫複合物洗滌（150mMNaCl，1.5mMMgCl2,50mMHEPES， pH 7·5, 10% 甘油，% TritonX-100 及 1 mM EGTA)，並在 SDS-PAGE之後，使蛋白質轉移至硝基纖維素薄膜。使用抗-磷酸酷胺酸抗體（Upstate，_Lake Placid，NY 或 Transduction Laboratories， Lexington，KY)探測薄膜，然後以復原Western氏沾吸剥除緩衝 -84· 本紙杀尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1259081 A7 B7 五、發明説明（82 ) 劑（Pierce，Rockford，IL)剝離。將薄膜以抗-FLT3 抗體（Santa Cruz 生物技術）再探測。供免疫沉澱作用與Western氏沾吸分析之 Stat5抗體，係個另,J得自Upstate生物技術與Transduction labs 。氺木氺木熟諳此藝者將明瞭的是，各種修正與變異可在未偏離本發明之精神或範圍下，於本發明之方法與組合物中施行。因此，本發明係意欲涵蓋本發明之修正與變異，其條件是其係在隨文所附申請專利範圍及其等效事物之範疇内。 -85- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

Claims

申請專利範圍圜基、或4 _(四氫吡咯氮四基、4 -(嗎福啉-4 _基） 1基）六氫P比σ定基；或其鹽。 2.根據申請專利範圍第丨 3 ^ <用延，其中p!為1〇 •根據申請專利範圍第2項之 4·根據申过袁刹# w斤、延，，、中R1係選自F與C1。甲w專利軏圍弟2項之用途，苴 5.根據申請專利範_項中：一項:用T=。基，且廿丄貝之用逆’其中R2為甲 6 #於由”、^曱基係結合在3與5位置。根據申請專利範圍第丨項之物： ’其令化合物為式II化合

0D, ，其中甲基係結合在3與5位置。土，q :，，、 9.根據申請專利範圍第〗括 1中化合物係選自包本紙張尺度適用中國國家標準(CNS7A4規格 -2 - 1259081 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍

Ηλ根據申請專利範圍第7項之用途，其中病患係為FLT-3-ITD陽性。 11.根據申請專利範圍第8項之用途，其中病患係為FLT-3野生型陽性。 12·根據申請專利範圍第1項之用途，其中式I化合物係選自包括： -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D 1259081 申請專利範圍

及

13. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中病患為人類。 14. 一種使用式I化合物製備偵測抑制FLT-3磷醯化作用及分析末稍血液溶胞產物中磷醯化作用之藥物的用途， -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A BCD 1259081 申請專利範圍

(㈣一(CHR)p- (I) 其中 R!為 Η、F、C1 或 Br ; p i為0至1 ; R2 為 CH3 ; q為1至2 ; r為0或2 ; X為Ο ; R5 為 Η ; j為0至1 ; R為Η或OH ; ρ為0、2或3 ; Ζ 為 ΟΗ、-N(CH2CH3)2、-NH(CH2CH3)、三唑基、嗎福ρ林基、四氫P比洛基、4 -(嗎福7林-4 -基）六氫P比口定基、4 -(嗎福淋-4 -基）一氮四圜基、或4 -(四氫卩比洛-1 -基）六氮？比σ定基。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 χ 297公釐) 1259081

其中FLT-3為突變型其中FLT-3為野生型其中 FLT-3 為 FLT-3- 11根據申請專利範圍第1 4項之用途 FLT-3。 16‘根據申請專利範圍第"項之用途 FLT-3。 17.根據申請專利範圍第15項之用途 ITD。 18.根f申請專利範圍第1項之用途，其中在該化合物投藥之則，急性骨髓性白血病為FLT-3-ITD AML。 19·根據申請專利範圍第1 4項之用it，其中FLT-3之伽化作用係藉由度量VEGF蛋白質增加之表現而被檢出。讥一種使用式I化合物製備抑制FLT_3磷醯化作用之藥物的用途，

-6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1259081 8 8 8 8 A BCD 六、申請專利範圍 R2 為 CH3 ; q為1至2 ; r為0或2 ; X為Ο ; R5 為 Η ; j為0至1 ; R為Η或OH ; ρ為0、2或3 ; Ζ 為 ΟΗ、-N(CH2CH3)2、-NH(CH2CH3)、三唑基、嗎福琳基、四氫P比洛基、4 -(嗎福4 - 4 -基）六氫ρ比口定基、4 -(嗎福琳-4 -基）一氮四圜基、或4 -(四氫？比口各- 1 -基）六氣p比σ定基。 21. 根據申請專利範圍第2 0項之用途，其中FLT-3為突變型 FLT-3。 22. 根據申請專利範圍第2 0項之用途，其中FLT-3為野生型 FLT-3。 23. 根據申請專利範圍第2 1項之用途，其中FLT-3為FLT-3-ITD。本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）