CN102471788A - 磷脂的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种制造磷脂的方法，该方法利用在甘油中进行的由磷脂酶A2引起的酯化反应来制造2位上键合有任意脂肪酸的磷脂，且通过对磷脂酶A2的再利用而低成本地制造该磷脂。该方法的特征在于：利用在甘油中进行的由磷脂酶A2引起的溶血磷脂与酰基供体的酯化反应生成磷脂，然后，添加与甘油不相混溶的溶剂以形成甘油层和溶剂层，将上述磷脂萃取至上述溶剂层，并使磷脂酶A2转移至上述甘油层，然后，向从分出的甘油层蒸馏除去残余溶剂后得到的甘油溶液中进一步添加溶血磷脂和酰基供体，由此，利用残留在上述甘油溶液中的磷脂酶A2再次进行酯化反应，从而达成了上述目的。

Description

磷脂的制造方法
技术领域
本发明涉及磷脂的制造方法，特别涉及利用磷脂酶A2来制造磷脂的方法。
背景技术
根据近年来有关脂质的研究，已发现：二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)等高度不饱和脂肪酸具有提高学习功能、预防动脉硬化症、改善脂质代谢功能等各种功能。特别是DHA，已发现通过以与卵磷脂这样的磷脂键合的形式对其进行摄取，可以获得比甘油三酯型更强的抗氧化性，可提高稳定性，并且吸收良好，因此易表现出DHA所具有的生理活性。对于DHA以外的EPA、共轭亚油酸、花生四烯酸等功能性脂肪酸而言，通过与磷脂键合，也可以期待生理活性的提高。
作为键合有以DHA为代表的功能性脂肪酸的磷脂的制造方法，可分为对天然存在的物质进行提取的方法、和以大豆磷脂等为原料进行合成的方法。首先，作为前一方法，具体可列举以水产动物的卵为原料来提取键合有DHA的磷脂的方法(专利文献1)、利用有机溶剂从乌贼等海产物中进行提取的方法等(专利文献2)。然而，这些方法由于原料价格昂贵、未必能够稳定地供应，并且磷脂的组成依赖于原料，因此尚无法制造出键合有DHA以外的功能性脂肪酸的磷脂。
另外，作为能够不依赖于原料组成而导入所需要的脂肪酸的方法，可列举在微生物培养液中添加任意脂肪酸，来生产在微生物上键合有该脂肪酸的磷脂的方法(专利文献3)，但就该方法而言，只能从大量的培养液中获取少量磷脂，其生产效率并不高。
其次，在上述后一方法中，作为使DHA键合于大豆磷脂等的方法，可列举向脂酶及磷脂酶的反应体系中添加高介电常数氢键形成物的方法(专利文献4)，但就该方法而言，尽管在由脂酶引起的溶血磷脂与脂肪酸的反应中可获得高反应率，但在由磷脂酶A2引起的反应中却未能获得高反应率。并且，为了使键合有DHA的磷脂表现出生理活性，使DHA键合于2位是至关重要的，但在由脂酶引起的反应中，目标脂肪酸却主要键合于磷脂的1位，因此实用性并不高。
另一方面，作为使所需脂肪酸有效地键合在磷脂的2位上的方法，已报道了几种使用磷脂酶A2在甘油中进行反应的方法(专利文献5、非专利文献1)。但在这些报道中，在反应后的提取方法中，要使用氯仿-甲醇，而从磷脂的用途考虑，或不能使用上述溶剂、或需要用以除去上述溶剂的设备，另外，由于磷脂酶A2价格高昂，因此需要大幅度缩减成本。
此外，在通常的酶反应中，为了对酶加以有效利用，已广泛进行了酶的固定化。然后，已有报道显示：在由磷脂酶A2引起的酯化反应中，使用经过固定化的磷脂酶A2时，即使相对于溶血磷脂使用大量的脂肪酸也难以有效地进行酯化反应(非专利文献2、非专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平8-59678号公报
专利文献2：日本特开平8-325192号公报
专利文献3：日本特开2007-129973号公报
专利文献4：日本特开平8-56683号公报
专利文献5：日本特开平5-236974号公报
非专利文献
非专利文献1：Fisheries Science、2006年、72卷、909-911页
非专利文献2：Journal of the American Oil Chemists’Society、1995年、72卷、641-646页
非专利文献3：Biochimica et Biophysica Acta、1997年、1343卷、76-84页
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，本发明期待一种在由磷脂酶A2引起的有效的酯化反应后，回收磷脂，并对磷脂酶A2进行再利用的方法。为此，本发明的目的在于提供一种制造磷脂的方法，该方法利用在甘油中进行的由磷脂酶A2引起的酯化反应来制造在磷脂的2位上键合有任意脂肪酸的磷脂，在该方法中，通过对磷脂酶A2进行再利用，从而以低成本制造该磷脂。
解决问题的方法
本发明人等为解决上述问题而进行了深入研究，结果发现：通过在利用在甘油中进行的由磷脂酶A2引起的溶血磷脂的酯化反应后，利用与甘油不相混溶的溶剂萃取磷脂，然后将上述溶剂蒸馏除去，并添加溶血磷脂及酰基供体对甘油中残留的磷脂酶A2进行利用，可再次进行溶血磷脂与酰基供体的酯化反应，并由此完成了本发明。
即，本发明涉及磷脂的制造方法，其特征在于：利用在甘油中进行的由磷脂酶A2引起的溶血磷脂与酰基供体的酯化反应生成磷脂，然后，添加与甘油不相混溶的溶剂以形成甘油层和溶剂层，将上述磷脂萃取至上述溶剂层，并使磷脂酶A2转移至上述甘油层，然后，向从分出的甘油层蒸馏除去残余溶剂后得到的甘油溶液中添加溶血磷脂及酰基供体，由此，利用残留在上述甘油溶液中的磷脂酶A2进行酯化反应。
此外，在本发明中，可以添加酮溶剂作为所述与甘油不相混溶的溶剂，或者，也可以在所述酯化反应后添加碳原子数为4以下的醇，然后再添加包含选自烃溶剂、酮溶剂及酯溶剂中的至少1种的溶剂作为与甘油不相混溶的溶剂。
此外，在本发明中，可以在所述酯化反应中，向其反应体系中添加氨基酸和/或具有3个以下氨基酸残基的肽。
作为所述氨基酸，优选选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸中的至少1种。
作为所述肽，优选由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸的组合构成。
发明的效果
根据本发明，可提供利用在甘油中进行的由磷脂酶A2引起的酯化反应来制造在磷脂的2位上键合有任意脂肪酸的磷脂的方法，在该方法中，通过对磷脂酶A2进行再利用，从而以低成本制造该磷脂。
具体实施方式
以下，针对本发明进行更为具体的说明。本发明的磷脂的制造方法的特征在于：利用在甘油中进行的由磷脂酶A2引起的溶血磷脂与酰基供体的酯化反应生成磷脂，然后，添加与甘油不相混溶的溶剂以形成甘油层和溶剂层，将上述磷脂萃取至上述溶剂层，并使磷脂酶A2转移至上述甘油层，然后，向从分出的甘油层蒸馏除去残余溶剂后得到的甘油溶液中进一步添加溶血磷脂和酰基供体，由此，利用残留在上述甘油溶液中的磷脂酶A2再次进行酯化反应。
本发明中的溶血磷脂意指从磷脂上除去2位的脂肪酸后的物质，代表与磷脂不同的脂质。作为用于本发明的溶血磷脂，可使用对磷脂进行改性后的物质，从获取的容易程度方面考虑，优选大豆来源、菜籽来源、蛋黄来源的溶血磷脂，从价格方面考虑，更优选大豆来源的溶血磷脂，但也可以使用其它植物来源的溶血磷脂。
作为对磷脂进行改性以除去其2位的脂肪酸残基的方法，并无特殊限制，可列举例如使用磷脂酶A2等将磷脂2位的脂肪酸残基水解的方法等。作为此时可以使用的磷脂，可以是具有甘油骨架、磷酸基及2个脂肪酸酯的分子、能够成为磷脂酶A2基质的磷脂，不包括具有鞘氨醇骨架的磷脂。具体可列举卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等。使用磷脂酶A2的方法在例如制造食品用途的磷脂时是有效的，原因在于该方法不使用有害物质也能够进行磷脂2位的脂肪酸残基的水解。
本发明中，作为在于甘油中进行的由磷脂酶A2引起的酯化反应中导入至溶血磷脂2位上的作为酰基供体的脂肪酸，并无特殊限制，可使用游离脂肪酸、或使形成为乙酯体、甘油三酯形式的物质在反应体系中于脂酶等酶的存在下进行水解后使用，但从反应性的观点出发，优选使用游离的脂肪酸。具体而言，从功能性方面考虑，可列举DHA、EPA、花生四烯酸、共轭亚油酸等高度不饱和脂肪酸，例如，作为所述DHA、EPA，可使用主要由从海产动物油、藻类中得到的油脂经水解而转变为游离脂肪酸形式后的物质。需要说明的是，从反应效率及成本方面考虑，相对于溶血磷脂100重量份，用于本发明的酰基供体优选使用30～1000重量份。
另外，难以以纯物质形式获取诸如DHA等这样的天然来源的脂肪酸的情况下，可使用含有所需脂肪酸的脂肪酸混合物。此时，脂肪酸混合物中的所需脂肪酸的含量优选基本在20重量％以上。以DHA的情况为例，含有DHA的脂肪酸中的DHA浓度优选为20重量％以上，更优选使用具有45重量％以上DHA浓度的脂肪酸。需要说明的是，也可以在本发明的酯化反应后进行溶剂分离等，来提高作为反应产物的磷脂的浓度。
作为用于本发明的磷脂酶A2，对其来源没有特殊限定，但通常优选能够食用的磷脂酶A2，可列举例如猪胰脏来源的磷脂酶A2、微生物来源的磷脂酶A2。需要说明的是，从反应效率及成本方面考虑，相对于溶血磷脂1g，优选使用1000～100000U的用于本发明的磷脂酶A2。
本发明中，在甘油中进行酯化反应。这是由于，甘油具有高极性，作为酯化反应的场所是有效的，并且能够应用于食品。另外，从能够溶解作为任意成分的后述氨基酸的方面考虑也是有效的。需要说明的是，考虑到反应性等，相对于溶血磷脂100重量份，优选使用500～10000重量份的甘油。
本发明中，从如上所述的在甘油中进行酯化反应的角度出发，为了对生成的磷脂进行提取，使用与甘油不相混溶的溶剂进行磷脂的萃取处理。作为用于本发明的与甘油不相混溶的溶剂，可使用包含选自烃溶剂、酮溶剂及酯溶剂中的至少1种的溶剂，通过使用这些溶剂，可有效地萃取目标磷脂。但除了仅使用酮溶剂的情况以外，为了降低含有甘油的反应溶液的粘度以使萃取处理易于进行，优选在添加碳原子数为4以下的醇之后再添加上述溶剂。而对于仅使用酮溶剂的情况而言，无须添加上述醇的理由在于：酮溶剂对甘油的溶解性优于烃溶剂及酯溶剂对甘油的溶解性。需要说明的是，考虑到磷脂的回收效率等，相对于甘油100重量份，优选添加20～300重量份的上述溶剂。
上述烃溶剂是指：仅由碳和氢构成的化合物中的可作为溶剂使用的化合物。具体为戊烷、己烷、庚烷等，但从沸点低而易于蒸馏除去、以及可作为食品添加物使用的观点出发，更优选己烷。
上述酮溶剂是指：分子内具有酮基的化合物中的可作为溶剂使用的化合物。具体为丙酮、丁酮等，但从沸点低而易于蒸馏除去、以及可作为食品添加物使用的观点出发，优选丙酮。
上述酯溶剂是指：分子内具有酯键的化合物中的可作为溶剂使用的化合物。具体为乙酸甲酯、乙酸乙酯等，但从可被用作食品用途的观点出发，优选乙酸乙酯。
另外，本发明中，在由磷脂酶A2引起的溶血磷脂的酯化反应中，可以使用抗氧化剂以实现酰基供体的抗氧化，或者使用氯化钙等钙源、或氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽来实现磷脂酶A2的活化，另外，还可以根据需要而使用其它添加物。
作为上述抗氧化剂，只要是能够期待对DHA等脂肪酸具有抗氧化能力的物质即可，对其种类并无限制，但从例如用作食品用途的观点考虑，可列举儿茶酸等多酚、生育酚、抗坏血酸及其衍生物、二丁基羟基甲苯(BHT)等。
另外，为了防止脂肪酸的氧化，也可以使溶血磷脂的酯化反应在隔绝氧的氮气氛围中进行。
作为上述氨基酸，指的是主要作为蛋白质的构成要素的、分子内具有羧基和氨基的化合物，优选能够用于食用的化合物。其中，从可以在不对磷脂酶A2的荷电状态造成某种影响的情况下将磷脂酶A2活化的观点出发，优选中性氨基酸，可列举甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等，用于本发明的磷脂的制造方法的情况下，可使用选自上述氨基酸中的至少1种。
所述具有3个以下氨基酸残基的肽，指的是氨基酸之间通过酰胺键而主要形成为二聚体或三聚体后得到的物质，可以是由氨基酸合成得到的物质，也可以是由蛋白质在酶等作用下分解而得到的物质，并无特殊限制，但从对甘油的溶解度较高的角度出发，优选由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸形成的肽，可列举甘氨酰甘氨酸等。通过使用上述的氨基酸残基少的肽，有时可以在溶解于甘油中时获得高摩尔浓度，从而能够有效地活化磷脂酶A2。
如上所述，上述钙源用于活化磷脂酶A2，但优选在反应体系中能够以钙离子形式存在的钙源。为此，作为钙源，优选溶解度较高、可作为食品原料使用的物质。作为其优选例，可列举上述氯化钙。
需要说明的是，作为上述抗氧化剂、钙源、氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽的用量，只要是适于达成上述各目的的量即可。但就氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽而言，优选相对于溶血磷脂100重量份添加10～2000重量份、更优选添加50～500重量份。添加量低于10重量份时，可能导致反应效率变差；超过2000重量份时，不利于成本，还可能导致反应效率不良。此外，为了增加氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽在酯化反应体系中的总溶解量，也可以组合添加2种以上的氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽。
本发明的磷脂的制造方法的优选例之一如下所示。
首先，可通过下述方法进行溶血磷脂与酰基供体的酯化反应：将溶血磷脂及酰基供体溶解在甘油中，并加入磷脂酶A2及视需要而使用的抗氧化剂、用于活化磷脂酶A2的氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽、氯化钙，对所得甘油反应液进行搅拌。另外，为了实现脂肪酸的抗氧化，也可以根据需要在隔绝氧的氮气氛围中进行酯化反应。
此时，从磷脂酶A2的最适温度、作为酰基供体的脂肪酸的氧化等观点出发，上述酯化反应优选在35℃～80℃的温度范围内进行，更优选在45℃～70℃的范围内进行。
反应中，为了将在由磷脂酶A2引起的酯化反应中生成的水分除去、以促进酯化反应，也可以进行减压操作。通过减压而除去水分时，作为其条件，可以在例如35～80℃的温度下于150torr(20kPa)以下进行12～24小时。
通过如上所述地进行溶血磷脂和作为酰基供体的脂肪酸的酯化反应，可生成在溶血磷脂的2位上导入了所需脂肪酸的磷脂。需要说明的是，酯化反应的进行可通过薄层色谱法(TLC)等加以确认。
在进行上述酯化反应后生成的含有磷脂的甘油反应液中，添加酮溶剂或碳原子数为4以下的醇来降低甘油粘度，以使萃取处理易于进行，然后，向上述反应液中加入包含选自烃溶剂、酮溶剂及酯溶剂中的至少1种的溶剂，以形成甘油层和溶剂层。于是，将酯化反应中生成的磷脂萃取至溶剂层，并使磷脂酶A2转移至甘油层，从而可实现对目标磷脂的萃取。此时，上述溶剂层(上层)中含有目标磷脂/溶血磷脂、上述溶剂、酰基供体，而上述甘油层(下层)中则主要包含甘油、上述溶剂、磷脂酶A2、未萃取完全的磷脂/溶血磷脂、及其它添加物等。接着，将上述溶剂层(上层)和甘油层(下层)分离。此时，为了达到提高磷脂纯度和操作效率的目的，也可以将添加指定溶剂及分离操作适当重复进行。这样一来，可以从甘油反应液中有效萃取目标磷脂。
需要说明的是，可以如上所述地将磷脂与磷脂酶A2分离，但有时磷脂酶A2会附随目标磷脂而极微量地包含于溶剂层中。这种情况下，可能在进行下述列举的处理之后，仍有目标磷脂和磷脂酶A2混合存在。即使如上所述地含有磷脂酶A2，在用于食品时也不存在特别的问题，但可以根据需要使用适当的蛋白酶等分解酶等来使磷脂酶A2分解、钝化。
上述碳原子数为4以下的醇指的是甲醇、乙醇、丙醇及丁醇，但从毒性低、可用作食品添加物的观点考虑，更优选乙醇。另外，相对于甘油100重量份，优选添加10～150重量份的上述醇。
另外，本发明中，也可以如上所述地从分出的包含目标磷脂的溶剂层(上层)中除去作为酰基供体的脂肪酸。作为这种从分出的上层除去作为酰基供体的脂肪酸的方法，并无特殊限制，可列举：利用酮溶剂、乙醇-己烷混合溶剂等进行脱脂的方法、使用硅胶除去脂肪酸的方法等。
例如，作为使用酮溶剂等的方法，可以在将分离出的(分出的)上层中的上述溶剂蒸馏除去之后，通过另外再添加新的酮溶剂等并冷却至5℃以下，使磷脂析出，并通过将溶解有脂肪酸的酮溶剂分离除去，来获得在溶血磷脂的2位上导入了所需脂肪酸的磷脂。这里，作为在蒸馏除去上述溶剂之后添加的酮溶剂等，优选沸点低、易于蒸馏除去、且可作为食品添加物使用的丙酮。
另外，作为使用硅胶除去脂肪酸的方法，可以在分离出(分出)上述上层之后，使该上层在填充有硅胶的柱中流过，以使磷脂吸附，使脂肪酸流出而除去，然后，再使柱中流通甲醇等流出溶剂，以使吸附于硅胶的磷脂脱吸附，仅分出所需的磷脂级分，然后再使磷脂重结晶，从而获得在溶血磷脂的2位上导入了所需脂肪酸的磷脂。
另一方面，由于乙醇等溶剂有时会对磷脂酶A2的活性造成阻碍，因此可以在如上所述地分离出(分出)上层和下层之后，对作为下层的甘油层进行减压处理，来蒸馏除去残留的溶剂。由此，可获得包含磷脂酶A2、磷脂/溶血磷脂的残部、其它任意添加物等的甘油溶液。
接着，如果在该甘油溶液中进一步添加作为反应基质的溶血磷脂及作为酰基供体的脂肪酸，则可以利用残留在甘油溶液中的磷脂酶A2再次进行酯化反应，从而实现对磷脂酶A2的再利用。
此时，对于溶血磷脂及酰基供体的添加方法并无特殊限制，可以将溶血磷脂和酰基供体同时添加到甘油溶液中，也可以在添加溶血磷脂后添加酰基供体、或者在添加酰基供体后添加溶血磷脂。另外，作为添加量，可以在考虑到甘油溶液中残留有未反应的溶血磷脂的情况下，根据反应的进行程度、萃取程度进行适当调整，使之与之前进行的酯化反应的情况达到等同。此外，对于溶血磷脂和酰基供体以外的原料，即钙源、氨基酸和/或具有3个以下氨基酸残基的肽、甘油等，可以在添加溶血磷脂及酰基供体时适当追加因萃取磷脂而减少的部分。另外，再次进行的酯化反应的条件可以与上述酯化反应的情况相同，磷脂的萃取处理也可以与上述同样地进行。
这样，在磷脂酶A2保持活性的情况下，通过重复进行上述操作、对磷脂酶A2进行多次的重复利用，还能够以更低的成本实现所需磷脂的生产。另外，对于此时磷脂的生产性下降的情况而言，考虑到磷脂酶A2、氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽、氯化钙等任意添加物、以及甘油等会因萃取操作而部分减少，磷脂酶A2等的活性会降低，因此也可以根据需要而追加上述成分。另外，由于与之前的酯化反应的情况同样地，要防止脂肪酸的氧化，因此也可以根据需要在添加抗氧化剂、或者隔绝氧以使反应体系成为氮气氛围后进行酯化反应。
本发明的磷脂的制造方法适宜作为一种在2位上导入了所需脂肪酸的磷脂的制造方法而使用，而由于在制造过程中未使用不适于食用的原料及氯仿等溶剂，因此可特别适用于食用磷脂的制造。而且，由此得到的磷脂、特别是在2位上导入了高度不饱和脂肪酸的磷脂适宜作为高机能的食用磷脂使用。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行更为具体的说明，但本发明完全不受这些实施例的限制。需要说明的是，实施例中的“份”及“％”为重量标准。
<磷脂的脂肪酸组成的测定>
在实施例及比较例等中，反应结束后，向反应溶液50μl中加入氯仿∶甲醇＝2∶1(体积比)的溶剂200μl和饱和氯化钠溶液500μl并进行搅拌，以13000rpm进行1分钟离心分离后，提取下层，再次用氯仿∶甲醇＝2∶1(体积比)的溶剂200μl同样地进行离心分离，提取下层。通过TLC(薄层色谱法)、利用上述溶剂将含有磷脂和脂肪酸的经过上述处理后的下层展开，分出磷脂及溶血磷脂级分，再利用甲醇钠进行甲酯化，利用气相色谱法(岛津制作所制造的“GC-14B”)对键合在磷脂及溶血磷脂上的脂肪酸的脂肪酸组成进行了分析。将气相色谱法中各脂肪酸的面积％视为脂肪酸的重量％。
(实施例1)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-LPC70”)35mg中添加以常规方法水解DHA-50G(日本化学饲料公司制造，DHA含量：51.8重量％)后制备的含有DHA的脂肪酸105mg、甘油(阪本药品工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(昭和电工公司制造)37.5mg和丙氨酸(武藏野化学研究所公司制造)37.5mg。然后，加入磷脂酶A2(SANYO FINE公司制造的“PowderLysonase”、53U/mg)20mg，在0.6torr(80Pa)下减压10分钟以除去水分之后，加入0.3mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液10μl及水30μl，于50℃反应24小时。反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量为13.4重量％。
向该反应液中加入乙醇1ml并进行搅拌之后，用己烷1ml进行2次萃取操作，通过常规方法分离出(分出)己烷层(上层)和甘油层(下层)。作为分离出(分出)的己烷层(上层)和甘油层(下层)中所含的磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量分别为：己烷层中20.7重量％、甘油层中6.3重量％。
于0.6torr(80Pa)下对分离出(分出)的甘油层(下层)进行15分钟减压以蒸馏除去溶剂。向该减压后的甘油层(甘油溶液)中加入上述溶血卵磷脂(SLP-LPC70)18mg、上述含有DHA的脂肪酸105mg，再加入水40μl，于50℃反应24小时。反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量为13.6重量％。
(实施例2)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-LPC70”)35mg中添加以常规方法水解Incromega DHA-J46(Croda Japan公司制造，DHA含量：49.7重量％)后制备的含有DHA的脂肪酸30mg、甘油(阪本药品工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(昭和电工公司制造)25mg和丙氨酸(武藏野化学研究所公司制造)25mg。然后，加入磷脂酶A2(SANYO FINE公司制造的“Powder Lysonase”、53U/mg)20mg，在0.6torr(80Pa)下减压10分钟以除去水分之后，加入0.3mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液10μl，边在50torr(6.7kPa)下减压边于50℃反应24小时。反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量为16.9重量％。
利用丙酮1ml对该反应液进行2次萃取操作，通过常规方法分离出(分出)丙酮层(上层)和甘油层(下层)。作为分离出(分出)的丙酮层(上层)和甘油层(下层)中所含的磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量分别为：丙酮层中17.6重量％、甘油层中14.1重量％。
于0.6torr(80Pa)下对分离出(分出)的甘油层进行15分钟减压以蒸馏除去丙酮。向该减压后的甘油层(甘油溶液)中加入溶血卵磷脂(SLP-LPC70)30mg，于50℃搅拌30分钟以使之溶解，对反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量进行了测定，结果为4.8重量％。向其中加入含有DHA的脂肪酸30mg，边在50torr(6.7kPa)下减压边于50℃反应24小时。反应24小时后的反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量为11.2重量％。
(实施例3)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-White Lyso”)50mg中添加以常规方法水解Incromega DHA-J46(Croda Japan公司制造，DHA含量：49.7重量％)后制备的含有DHA的脂肪酸30mg、甘油(阪本药品工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(昭和电工公司制造)25mg和丙氨酸(武藏野化学研究所公司制造)25mg。然后，加入磷脂酶A2(SANYO FINE公司制造的“PowderLysonase”、53U/mg)20mg，在0.6torr(80Pa)下减压10分钟以除去水分之后，加入0.3mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液10μl，边在50torr(6.7kPa)下减压边于50℃反应24小时。反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量为15.3重量％。
向该反应液中加入乙醇0.5ml并进行搅拌之后，用己烷0.5ml和丙酮0.2ml的混合溶剂进行2次萃取操作，通过常规方法分离出(分出)己烷/丙酮层(上层)和甘油层(下层)。作为分离出(分出)的己烷/丙酮层(上层)和甘油层(下层)中所含的磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量分别为：己烷/丙酮层中18.0重量％、甘油层中11.6重量％。
于0.6torr(80Pa)下对分离出(分出)的甘油层进行15分钟减压以蒸馏除去溶剂。向该减压后的甘油层(甘油溶液)中加入溶血卵磷脂(SLP-WhiteLyso)30mg，于50℃搅拌30分钟以使之溶解，对反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量进行了测定，结果为6.6重量％。向其中加入含有DHA的脂肪酸30mg，边在50torr(6.7kPa)下减压边于50℃反应24小时。反应24小时后的反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量为12.3重量％。
(实施例4)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-White Lyso”)50mg中添加以常规方法水解EPA-45G(日本化学饲料公司制造，EPA含量：45.7重量％)后制备的含有EPA的脂肪酸30mg、甘油(阪本药品工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(昭和电工公司制造)25mg和丙氨酸(武藏野化学研究所公司制造)25mg。然后，加入磷脂酶A2(SANYO FINE公司制造的“Powder Lysonase”、53U/mg)20mg，在0.6torr(80Pa)下减压10分钟以除去水分之后，加入0.3mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液10μl，边在50torr(6.7kPa)下减压边于50℃反应24小时。反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的EPA含量为19.5重量％。
向该反应液中加入乙醇0.25ml并进行搅拌之后，用乙酸乙酯0.75ml进行2次萃取操作，通过常规方法分离出(分出)乙酸乙酯层(上层)和甘油层(下层)。作为分离出(分出)的乙酸乙酯层和甘油层中所含的磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，EPA含量分别为：乙酸乙酯层中22.1重量％、甘油层中17.8重量％。
于0.6torr(80Pa)下对分离出(分出)的甘油层进行15分钟减压以蒸馏除去溶剂。向该减压后的甘油层(甘油溶液)中加入溶血卵磷脂(SLP-WhiteLyso)36mg，于50℃搅拌30分钟以使之溶解，对反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的EPA含量进行了测定，结果为11.2重量％。向其中加入含有EPA的脂肪酸30mg，边在50torr(6.7kPa)下减压边于50℃反应24小时。反应24小时后的反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的EPA含量为16.3重量％。
(实施例5)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-White Lyso”)7.5g中添加以常规方法水解Incromega DHA-J46(Croda Japan公司制造，DHA含量：49.7重量％)后制备的含有DHA的脂肪酸3g、甘油(阪本药品工业公司制造)100g，接着，添加甘氨酸(昭和电工公司制造)3g和丙氨酸(武藏野化学研究所公司制造)3g。然后，加入磷脂酶A2(SANYO FINE公司制造的“Powder Lysonase”、53U/mg)3g，并加入2mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液0.5ml，在3torr(0.40kPa)减压下，于50℃反应24小时。
向该反应液中加入乙醇50ml并进行搅拌，用己烷50ml进行2次萃取操作，通过常规方法分离出(分出)己烷层(上层)和甘油层(下层)。蒸馏除去分离出的己烷层(上层)的溶剂，加入丙酮50ml并于0℃冷却1小时，得到了目标磷脂的沉淀物6.3g。在该磷脂中的脂肪酸组成中，DHA含量为17.0重量％。作为分离出的甘油层(下层)中所含的磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量为8.3重量％。
向分离出的甘油层中加入溶血卵磷脂(SLP-White Lyso)5.5g、含有DHA的脂肪酸(Incromega DHA-J46)3g，于100torr(13kPa)下对甘油层搅拌30分钟以蒸馏除去溶剂，边在3torr(0.40kPa)下减压边于50℃反应24小时。反应结束后，与上述同样地利用乙醇及己烷进行萃取、并利用丙酮进行纯化，得到了目标磷脂6.0g。该磷脂中的脂肪酸组成中，DHA含量为15.8重量％。
上述实施例表明，能够对磷脂酶A2进行再利用，制造出在磷脂的2位上键合有任意脂肪酸的磷脂。以下，以参考例示出使用各种氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽等仅进行第一次酯化反应后的结果。
由后述内容可知，通过使用各种氨基酸、具有3个以下氨基酸残基的肽等，能够有效地制造出所需磷脂。因此期待在使用这些成分对磷脂酶A2进行再利用的情况下，也能够有效地制造出所需磷脂。
(参考例1)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-LPC70H”)35mg中加入油酸(东京化成工业公司制造)97mg、甘油(阪本药品工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(和光纯药工业公司制造)50mg。然后，加入磷脂酶A2(NovozymesJapan公司制造的“Lecitase 100S”、130U/mg)10mg和1.0mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液2.5μl，于60℃反应24小时，得到了2位上键合有油酸的磷脂(卵磷脂)。对于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，油酸含量为39.2重量％。
(参考例2)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-LPC70”)35mg中添加DHA(东京化成工业公司制造)113mg、甘油(和光纯药工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(和光纯药工业公司制造)50mg。然后，加入磷脂酶A2(Novozymes Japan公司制造的“Lecitase 100S”、130U/mg)10mg和1.0mol/l氯化钙(和光纯药工业公司制造)溶液2.5μl，再加入作为抗氧化剂的二丁基羟基甲苯3mg(和光纯药工业公司制造)，于60℃反应48小时，得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(DHA)的磷脂(卵磷脂)。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量为34.2重量％。
(参考例3)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的SLP-LPC70)35mg中添加DHA(东京化成工业公司制造)113mg、甘油(和光纯药工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业公司制造)60mg。然后，加入磷脂酶A2(SANYOFINE公司制造，Powder Lysonase、53U/mg)20mg和1.2mol/l氯化钙(和光纯药工业公司制造)溶液2.5μl，再加入作为抗氧化剂的含儿茶酸的SuncatolNO1(太阳化学公司制造)3mg及抗坏血酸3mg(和光纯药工业公司制造)，于60℃反应48小时，得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(DHA)的磷脂(卵磷脂)。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量为30.7重量％。
(参考例4)
除了使用EPA(Nacalai Tesque公司制造)104mg代替DHA 113mg、并使用甘氨酸60mg代替甘氨酰甘氨酸60mg以外，按照与实施例2相同的方法得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(EPA)的磷脂。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，EPA含量为28.5重量％。
(参考例5)
除了使用花生四烯酸(Sigma-Aldrich Japan公司制造)103mg代替DHA113mg、并使用甘氨酸40mg代替甘氨酰甘氨酸60mg以外，按照与实施例2相同的方法得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(花生四烯酸)的磷脂(卵磷脂)。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，花生四烯酸含量为32.3重量％。
(参考例6)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-LPC70”)35mg中添加以常规方法水解DHA-50G(日本化学饲料公司制造，DHA的含量为51.8重量％)后制备的含有DHA的脂肪酸105mg、甘油(阪本药品工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(昭和电工公司制造)75mg。然后，加入磷脂酶A2(SANYO FINE公司制造的“Powder Lysonase”)20mg，在0.6torr(80Pa)下减压10分钟以除去水分之后，加入0.3mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液10μl，于60℃反应48小时，得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(DHA)的磷脂(卵磷脂)。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量为15.5重量％。
(参考例7)
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-LPC70”)35mg中添加以常规方法水解DHA-50G(日本化学饲料公司制造，DHA的含量为51.8重量％)后制备的含有DHA的脂肪酸105mg、甘油(阪本药品工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(昭和电工公司制造)37.5mg和丙氨酸(武藏野化学研究所公司制造)37.5mg。然后，加入磷脂酶A2(SANYO FINE公司制造的“PowderLysonase”)20mg，在0.6torr(80Pa)下减压10分钟以除去水分之后，加入0.3mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液10μl，于60℃反应48小时，得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(DHA)的磷脂(卵磷脂)。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量为17.2重量％。
(参考例8)卵磷脂纯度提高用含有磷脂的酯化反应溶液的制备
向溶血卵磷脂(Tsuji-Seiyu公司制造的“SLP-LPC70”)35mg中添加以常规方法水解DHA-50G(日本化学饲料公司制造，DHA的含量为51.8重量％)后制备的含有DHA的脂肪酸30mg、甘油(阪本药品工业公司制造)1g，接着，添加甘氨酸(昭和电工公司制造)37.5mg和丙氨酸(武藏野化学研究所公司制造)37.5mg。然后，加入磷脂酶A2(SANYO FINE公司制造的“PowderLysonase”)20mg，再加入0.5mol/l氯化钙(富田制药公司制造)溶液6μl，在0.6torr(80Pa)下减压10分钟以除去水分，并于50℃反应24小时，得到了卵磷脂纯度提高用含有磷脂的酯化反应溶液。该反应液中所含的磷脂及溶血磷脂中的DHA含量为15.3重量％。
(比较对照例1)
除了未使用甘氨酸以外，按照与参考例1相同的方法得到了2位上键合有油酸的磷脂。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，油酸含量为19.4重量％。
(比较对照例2)
除了未使用甘氨酰甘氨酸以外，按照与参考例3相同的方法得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(DHA)的磷脂。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量为12.9重量％。
(比较对照例3)
除了未使用甘氨酸、而添加了60μl水以外，按照与参考例4相同的方法得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(EPA)的磷脂。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，EPA含量为8.9重量％。
(比较对照例4)
除了未使用甘氨酸以外，按照与参考例5相同的方法得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(花生四烯酸)的磷脂。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，花生四烯酸含量为5.5重量％。
(比较对照例5)
除了未使用甘氨酸以外，按照与参考例6相同的方法得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(DHA)的磷脂。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量为4.4重量％。
(比较对照例6)
除了未使用甘氨酸及丙氨酸以外，按照与参考例8相同的方法得到了2位上键合有高度不饱和脂肪酸(DHA)的磷脂。关于所得磷脂及溶血磷脂中的脂肪酸组成，DHA含量为7.6重量％。

Claims (6)

1.一种磷脂的制造方法，该方法包括：
通过在甘油中进行的由磷脂酶A2引起的溶血磷脂与酰基供体的酯化反应生成磷脂，然后，添加与甘油不相混溶的溶剂以形成甘油层和溶剂层，将上述磷脂萃取至上述溶剂层，并使磷脂酶A2转移至上述甘油层，然后，向从分出的甘油层蒸馏除去残留溶剂后得到的甘油溶液中进一步添加溶血磷脂和酰基供体，由此，利用残留在上述甘油溶液中的磷脂酶A2再次进行酯化反应。
2.根据权利要求1所述的磷脂的制造方法，其中，添加酮溶剂作为与甘油不相混溶的溶剂。
3.根据权利要求1所述的磷脂的制造方法，其中，在所述酯化反应后，添加碳原子数为4以下的醇，然后再添加包含选自烃溶剂、酮溶剂及酯溶剂中的至少1种的溶剂作为与甘油不相混溶的溶剂。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的磷脂的制造方法，其中，在所述酯化反应中，向其反应体系中添加氨基酸和/或具有3个以下氨基酸残基的肽。
5.根据权利要求4所述的磷脂的制造方法，其中，所述氨基酸为选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸中的至少1种。
6.根据权利要求4或5所述的磷脂的制造方法，其中，所述肽由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸的组合构成。
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