CN104379757A - 含磷脂组合物的制造方法及含磷脂组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含磷脂组合物整体中含有10重量％以上的磷脂酰丝氨酸、且构成脂肪酸整体中高度不饱和脂肪酸的含量为10～40重量％的含磷脂组合物的制造方法，利用包括以下的工序(1)、(2)及工序(3)、(4)的方法，低价且稳定地供给包含2位键合有大量高度不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物。工序(1)：利用磷脂酶A2(PLA2)，进行溶血磷脂与高度不饱和脂肪酸的酯化反应，得到磷脂；工序(2)：在工序(1)之后，使磷脂中的PLA2活性为10U/g(磷脂)以下；工序(3)：在磷脂酶D(PLD)的存在下，进行磷脂与丝氨酸的混合物中的碱交换反应，形成包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物；工序(4)：分离该组合物。
Description
技术领域
本发明涉及包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物的制造方法及含磷脂组合物。
背景技术
磷脂酰丝氨酸被认为对认知功能障碍、记忆力、集中力的改善等脑功能的提高是有效的，已知通过键合DHA(二十二碳六烯酸)其效果进一步提高。DHA键合磷脂酰丝氨酸可以通过从牛脑中萃取来生产，但出于疯牛病的影响近年来没有进行。另外，已知DHA键合磷脂酰丝氨酸可以通过在丝氨酸的存在下使磷脂酶D作用于DHA键合磷脂酰胆碱、DHA键合磷脂酰乙醇胺等来合成(专利文献1)。另外，关于作为DHA键合磷脂酰丝氨酸的原料的DHA键合磷脂酰胆碱，有从包含大量多元不饱和脂肪酸的、金枪鱼、鲣鱼、鲐鱼、沙丁鱼、秋刀鱼、竹荚鱼等鱼类的组织；由用包含多元不饱和脂肪酸的饲料饲养的鸡得到的鸡蛋中萃取的方法(专利文献1)。另外，还已知将来自大豆的磷脂酰丝氨酸与海洋性的DHA键合磷脂酰丝氨酸(丝氨酸甘油磷脂接合体)混合来使用的方法(专利文献2)。但是，这些方法中原料高价，且供给不稳定。
另一方面，作为使DHA键合于磷脂来制作DHA键合磷脂的方法，有使用磷脂酶A2将磷脂的2位的脂肪酸水解而得的溶血磷脂、或在市售的溶血磷脂中导入DHA的方法(专利文献3)。
但是，在专利文献3中记载的方法中，未进行将磷脂的2位的脂肪酸水解时所使用的磷脂酶A2的除去和失活操作，因此磷脂酶A2等量残留，因而有时键合于溶血磷脂的DHA在保存中经时性脱离。另外，若想要将该DHA键合磷脂按照专利文献1记载的方法进行丝氨酸化，则基于丝氨酸和磷脂酶D的丝氨酸化需要水，因而存在反应中在2位发生水解的问题，未能高效地进行DHA键合磷脂酰丝氨酸的合成。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平9－121879号公报
专利文献2：日本特表2011－525525公报
专利文献3：日本特开2010－068799号公报
发明内容
发明要解决的课题
使用安全的原料低价且稳定地供给大量键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸、尤其是DHA键合磷脂酰丝氨酸的方法尚未知。
因此，本发明的目的在于，提供能够低价且稳定地供给包含2位键合有大量高度不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物的制造方法、以及包含大量键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题而反复认真研究的结果发现，若以磷脂和高度不饱和脂肪酸为原料，并实施包括特定的工序的制造方法，则能够得到以高效率导入了高度不饱和脂肪酸的含磷脂组合物，并完成了本发明。
即，本发明的第一发明涉及一种含磷脂组合物的制造方法，其是含磷脂组合物整体中含有10重量％以上的磷脂酰丝氨酸、且构成脂肪酸整体中高度不饱和脂肪酸的含量为10～40重量％的含磷脂组合物的制造方法，并包括以下的工序(1)、(2)及工序(3)、(4)。
工序(1)：通过磷脂酶A2(PLA2)，进行溶血磷脂与高度不饱和脂肪酸的酯化反应，得到磷脂。
工序(2)：在工序(1)之后，使磷脂中的PLA2活性为10U/g(磷脂)以下。
工序(3)：在磷脂酶D(PLD)的存在下，进行磷脂与丝氨酸的混合物中的碱交换反应，形成包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物。
工序(4)：将包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物分离。
作为本发明的实施方式，可以采用在上述工序(2)中从磷脂除去PLA2的方式、和在上述工序(2)中使磷脂中的PLA2失活的方式中的至少一种。
本发明的一实施方式中，在工序(2)中，在工序(1)之后，向磷脂中添加无机盐的甘油溶液、碳数4以下的醇、以及不与甘油混溶且溶解磷脂的有机溶剂，搅拌后静置，形成包含磷脂的有机溶剂层、和包含PLA2的甘油溶液层，将该有机溶剂层从该甘油溶液层分离，由此从磷脂中除去PLA2。
在此，优选无机盐的甘油溶液中的水分量为10重量％以下。
优选不与甘油混溶且溶解磷脂的有机溶剂是碳数为5～8的烃溶剂和/或醚。
优选甘油溶液中的无机盐浓度为0.2～40重量％。
优选无机盐为选自由硫酸锌、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠及氯化钙构成的组的至少1种。
优选有机溶剂为己烷。
优选碳数4以下的醇为乙醇。
本发明的其它实施方式中，在工序(2)中，在工序(1)之后，向磷脂中添加酸性蛋白酶，使磷脂中的PLA2失活。另外，还可以用酸性蛋白酶处理磷脂后，进一步向该磷脂中添加中性蛋白酶，使磷脂中的PLA2失活。
在本发明中，例如，高度不饱和脂肪酸为DHA。另外，溶血磷脂为来自植物或蛋黄的溶血卵磷脂。进一步，溶血磷脂为来自大豆的溶血卵磷脂。
本发明的第二发明涉及一种含磷脂组合物，其是以来自植物的磷脂、或来自植物及来自蛋黄的磷脂为原料而合成的含磷脂组合物，其中，含有10重量％以上的磷脂酰丝氨酸，构成脂肪酸整体中DHA的含量为10～40重量％且亚油酸的含量为15～40重量％。
发明效果
根据本发明，能够低价且稳定地供给在2位键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸、尤其是包含DHA键合磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物。
具体实施方式
以下，对本发明进一步详细地进行说明。本发明的含磷脂组合物的制造方法的特征在于，包括特定的工序。另外，本发明的含磷脂组合物的特征在于，其是以来自植物、蛋黄的磷脂等为原料而合成的含磷脂组合物，含有特定量的磷脂酰丝氨酸，并包含特定量的高度不饱和脂肪酸作为磷脂的构成脂肪酸。
本发明的磷脂酰丝氨酸是磷脂的一种，集中存在于神经细胞中，在脑内的信息传递、血流中发挥重要的作用。
本发明的高度不饱和脂肪酸是指碳－碳间的双键为4个以上的不饱和脂肪酸、以及共轭亚油酸。高度不饱和脂肪酸具有提高学习能力、预防动脉硬化、改善脂质代谢等功能。对于这些高度不饱和脂肪酸而言，与磷脂键合的形态被认为比与甘油三酯键合的形态的抗氧化性强，稳定性提高，摄取时的吸收性也好。作为具体的高度不饱和脂肪酸，可以举出DHA、EPA、花生四烯酸等，从获得的容易程度和功能的强度的观点出发，优选DHA。
本发明的含磷脂组合物优选在组合物整体中含有磷脂酰丝氨酸10重量％以上，更优选为10～80重量％、进一步优选为30～80重量％、特别优选为40～80重量％。若含量少于10重量％，则有时不能得到本发明的效果。另外，含磷脂组合物中的高度不饱和脂肪酸的含量优选在构成脂肪酸整体中为10～40重量％。若高度不饱和脂肪酸的含量少于10重量％，则存在基于高度不饱和脂肪酸的效果低的情况，多于40重量％时存在制造上成本花费过高的情况。
＜磷脂酰丝氨酸的定量方法＞
磷脂或含磷脂组合物中的磷脂酰丝氨酸的定量按照Journal of HighResolution Chromatography,13(1990),pp126-129中记载的方法，利用HPLC－ELSD装置进行分析。对于磷脂酰丝氨酸的定量，使用预先用标准的方法由大豆卵磷脂使用磷脂酶D进行合成并利用硅胶柱色谱法精制的磷脂酰丝氨酸标准样品制成标准曲线，以其为基准进行定量。
本发明的含磷脂组合物的制造方法基本上按顺序包括以下的工序(1)、(2)，且按顺序包括工序(3)、(4)。
＜工序(1)＞
使用磷脂酶A2(以下也称PLA2)，进行溶血磷脂与高度不饱和脂肪酸的酯化反应，得到键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂。所述酯化反应按照常法进行即可，但考虑到酶的最适温度、脂肪酸的氧化等，优选在30～80℃的温度范围内进行，更优选在40～70℃的范围内进行。若低于30℃则存在酶活性低的情况，若超过80℃则存在酶失活、或脂肪酸发生氧化的情况。另外，反应时间优选为3～72小时。PLA2的添加量相对于每100重量份的溶血磷脂优选为1～100重量份。优选反应在分析磷脂的脂肪酸组成，并确认高度不饱和脂肪酸达到构成脂肪酸中的至少10重量％以上后结束。
在此使用的磷脂酶A2是用于将磷脂的2位水解、或在溶血磷脂的2位导入脂肪酸的酶。对于其来源没有特别要求，但通常优选能够用于食用的酶，可以举出来自猪胰脏的酶、来自微生物的酶。
本发明的溶血磷脂可以通过将工业上通过磷脂酶A2而键合于磷脂的2位的脂肪酸进行水解而得到。其中，从获得的容易程度出发，优选由来自植物或蛋黄的卵磷脂得到的溶血卵磷脂，更优选由大豆、蛋黄中含有的卵磷脂得到的溶血卵磷脂，从成本方面考虑，进一步优选来自大豆的溶血卵磷脂。将键合于来自大豆的磷脂的2位的脂肪酸按照常法通过磷脂酶A2进行水解而得到的糊状、粉末状的来自大豆的溶血卵磷脂中，溶血磷脂酰胆碱的含量为18～30重量％左右，浓缩后的含量为60～75重量％。另外，将键合于来自蛋黄的磷脂的2位的脂肪酸按照常法进行水解而得到的糊状、粉末状的来自蛋黄的溶血卵磷脂中，溶血磷脂酰胆碱的含量为50～80重量％左右。
如上所述，使用来自大豆的溶血卵磷脂作为溶血磷脂时，最终在工序(2)或(4)中得到的含磷脂组合物中，含有大量亚油酸作为构成脂肪酸。此时，构成脂肪酸整体中的亚油酸的含量大致在15～40重量％的范围内，更优选在20～40重量％的范围内。
＜工序(2)＞
在工序(1)之后，使工序(1)中得到的磷脂中的PLA2活性为10U/g(磷脂)以下。具体来说，该工序通过以下说明的从磷脂中除去PLA2的工序(2)－1、或使磷脂中的PLA2失活的工序(2)－2来实现。也可以并用工序(2)－1和工序(2)－2这两个。
＜工序(2)－1＞
在工序(1)之后，对磷脂(从在工序(1)中发生酯化反应而得到的含磷脂反应溶液中将磷脂萃取到有机溶剂中的萃取溶液、从该萃取溶液中蒸馏除去有机溶剂而得到的含磷脂组合物、或进一步利用丙酮等除去了脂肪酸的含磷脂组合物)添加无机盐的甘油溶液、碳数4以下的醇、以及不与甘油混溶且溶解磷脂的有机溶剂，进行混合。它们的添加量考虑PLA2的除去效果来适当决定即可，所述反应溶液、萃取溶液预先包含该溶剂的情况下可以进行适当调整。
在混合后，将温度调整到20～60℃，强力搅拌以使溶解有磷脂的有机溶剂与甘油不分离。优选将温度调整到40～60℃。然后充分搅拌后静置，形成包含PLA2的甘油溶液层、和包含磷脂的有机溶剂层，分离(分取)该有机溶剂层。即，通过使在磷脂中残留的PLA2转移到甘油溶液层侧而将其除去，从而降低磷脂中的磷脂酶A2活性。考虑到纯度的提高和工作效率，可以适当重复上述那样的规定溶剂的添加和分取操作。
在分离上述有机溶剂层后，蒸馏除去有机溶剂能够回收磷脂。优选在蒸馏除去有机溶剂后，用不溶解磷脂而溶解脂肪酸、水的溶剂进行洗涤处理，并回收沉淀的磷脂的方法。
在此，作为上述碳数4以下的醇，可以举出甲醇、乙醇、丙醇及丁醇，可以使用选自它们中的至少1种。其中，从毒性低可以作为食品添加物利用出发，优选乙醇。
作为无机盐，若为具有对甘油的溶解性的无机盐则没有特别限定，但优选使用选自由氯化镁、硫酸镁、硫酸锌、氯化钾、氯化钠及氯化钙构成的组的至少1种。优选无机盐按照在甘油溶液整体中为0.2重量％以上的方式进行混合来使用。若无机盐的浓度少于0.2重量％则存在PLA2的除去不充分的情况。无机盐的浓度越浓则PLA2的除去效率越变高，但优选在甘油溶液整体中为40重量％以下。若无机盐的浓度超过40重量％，则存在甘油溶液的粘度上升、或无机盐析出而变得难以使用的情况。
上述无机盐的甘油溶液的制备考虑到无机盐向甘油的分散性，优选使无机盐形成水溶液后再与甘油进行混合。另外，无机盐的甘油溶液整体中的水分量越少越优选，优选为30重量％以下，更优选为10重量％以下，进一步优选为1重量％以下。若甘油溶液中的水分量超过30重量％，则存在PLA2的除去不能充分进行的情况。另外，使无机盐形成水溶液后制备甘油溶液的情况下，优选在蒸馏除去甘油溶液中的水后使用。
作为不与甘油混溶且溶解磷脂的有机溶剂，优选碳数为5～8的烃溶剂和/或醚。具体来说，可以举出庚烷、己烷、戊烷、二乙基醚、二异丙基醚等，从在食品用途中的利用的观点出发，更优选己烷。
作为不溶解磷脂而溶解脂肪酸、水的溶剂，可以举出丙酮等。
在工序(2)－1之后，磷脂中的磷脂酶A2活性越低越好，优选为10U/g(磷脂)以下，更优选为1U/g以下。若磷脂酶A2活性高于10U/g，则存在工序(1)中键合于磷脂的高度不饱和脂肪酸过度脱离的情况。
需要说明的是，作为工序(2)，可以实施工序(2)－1，也可以实施下面的工序(2)－2。
＜工序(2)－2＞
在工序(1)之后，向磷脂添加酸性蛋白酶，从而使磷脂中的PLA2失活而降低磷脂中的磷脂酶A2活性。该蛋白酶是切断蛋白质中的肽键的酶，在动物、植物、微生物中广泛存在。
具体来说，从工序(1)中发生酯化反应而得到的含磷脂反应溶液中利用有机溶剂萃取磷脂，从萃取溶剂中蒸馏除去溶剂，优选向将利用丙酮等溶剂除去了脂肪酸的含磷脂组合物分散于水中的含磷脂水溶液(酸性的水溶液)中添加酸性蛋白酶，优选保持在规定温度并搅拌0.5～48小时来发生酶反应。若反应时间短于0.5小时，则存在磷脂酶A2活性降低效果小的情况，若长于48小时，则存在磷脂劣化、或磷脂凝集、或蛋白酶失活等而磷脂酶A2活性降低效果令人头疼的情况。上述规定温度可以是酶的最适温度，为了防止磷脂的劣化优选不超过60℃的温度。作为酸性蛋白酶，可以举出例如，来自动物的胃蛋白酶、来自Aspergillus niger的酸性蛋白酶等。酸性蛋白酶的添加量相对于每含磷脂溶液100重量份优选为0.1～10重量份。
工序(2)－2可以在使用酸性蛋白酶的处理后结束，但优选在使用酸性蛋白酶的处理后，继续将含磷脂溶液的pH中和到4.0～8.0，并向其中添加中性蛋白酶。更优选将含磷脂溶液的pH中和到5.0～7.0，并向其中添加中性蛋白酶。优选在添加中性蛋白酶后，保持在规定温度并搅拌0.5～48小时来发生酶反应。若反应时间短于0.5小时，则存在磷脂酶A2活性降低效果小的情况，若长于48小时，则存在磷脂劣化、或磷脂凝集、或蛋白酶失活等而磷脂酶A2活性降低效果令人头疼的情况。上述规定温度可以是酶的最适温度，为了防止磷脂的劣化优选不超过60℃的温度。作为中性蛋白酶，可以举出来自Aspergillus Oryzae、来自Bacillus Subtilis等。中性蛋白酶的添加量相对于每含磷脂溶液100重量份优选为0.1～10重量份。
可以在利用酸性蛋白酶的酶反应、或利用酸性蛋白酶及中性蛋白酶的酶反应结束后，相对于含磷脂水溶液100重量份，添加10～200重量份的溶解磷脂且不与水混溶的溶剂(例如己烷等)并进行搅拌，分取上层(溶剂层)，从该层除去溶剂而萃取磷脂。在含磷脂水溶液的粘度变高等、而难以仅凭上述溶剂萃取磷脂的情况下，有时进一步加入乙醇等与水混溶的醇溶剂从而提高萃取效率。在加入醇溶剂的情况下，优选相对于含磷脂水溶液100重量份加入10～100重量份。通过以上的处理而得的磷脂中的磷脂酶A2活性大幅降低。
在上述中，从上层除去溶剂后，优选用丙酮洗涤磷脂。通过丙酮洗涤，能够除去残留的水分、因水解而游离的脂肪酸等。
在工序(2)－2之后，磷脂中的磷脂酶A2活性越低越好，优选为10U/g(磷脂)以下，更优选为1U/g以下。若高于10U/g，则存在工序(1)中键合于磷脂的高度不饱和脂肪酸过度脱离的情况。
＜磷脂酶A2活性的测定方法＞
本发明中的磷脂中的磷脂酶A2活性的测定方法如下。首先，在脱脂大豆卵磷脂6g中加入蒸馏水400mL在室温下搅拌30分钟。在该脱脂大豆卵磷脂溶液中，加入将脱氧胆酸钠0.7g及氯化钙二水合物0.5g溶于水110mL的溶液，边用冰浴冷却边以8000rpm均化15分钟。将得到的溶液作为活性测定溶液。将活性测定溶液20mL称取至50mL的样品瓶中，加入1M氢氧化钠水溶液将pH调整到8.0。将作为测定对象的磷脂样品20mg分散于1mL的蒸馏水中，将该溶液加入调整到pH8.0的活性测定溶液中，再次将pH调整到8.0，测定为了将pH保持在8.0所需的20mM氢氧化钠溶液的每1分钟的滴定量。利用预先用酶标准溶液制作的标准曲线，算出磷脂中的PLA2活性。
＜工序(3)＞
将工序(2)中得到的磷脂或市售的磷脂与丝氨酸进行混合，在磷脂酶D(以下也称PLD)的存在下，进行碱交换反应，在磷酸基上键合丝氨酸。由此，形成包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物。作为上述碱交换反应，有以溶解磷脂的有机溶剂与溶解丝氨酸、磷脂酶D的水的二层系来实施的方法、或者仅以水来实施的方法等，可以采用任意方法，但从磷脂的溶解性的观点出发，优选以二层系实施的方法。
具体来说，展示以二层系实施的方法。首先，制备溶解了工序(2)中得到的磷脂或市售的磷脂的有机溶剂溶液。另外，预先制备溶解了丝氨酸及磷脂酶D的水。然后将它们混合，优选在20～55℃的温度下按照不发生层分离的方式强力搅拌0.5～48小时而使其反应。若在低于20℃的温度下使其反应，则存在反应效率差的情况，若在高于55℃的温度下使其反应，则存在磷脂酶D失活的情况。另外，若反应时间少于0.5小时，则存在反应效率差的情况，若反应时间超过48小时，则存在水解等副反应进行的情况。
工序(3)中使用的有机溶剂的种类没有特别要求，可以使用例如己烷、丙酮、乙酸乙酯等。在并用己烷和丙酮的情况下，优选将己烷/丙酮(体积比)设为20/1～1/1。若己烷/丙酮(体积比)大于20，则存在与水的混溶性变差而反应效率变差的情况，若己烷/丙酮(体积比)小于1，则存在磷脂的溶解变差而反应效率变差的情况。
有机溶剂的量若为磷脂充分溶解的量则没有问题，但相对于磷脂100重量份，优选使用500～20000重量份。若有机溶剂的量少于500重量份，则存在磷脂的溶解不充分而反应效率变差的情况，若有机溶剂的量多于20000重量份，则存在溶剂的使用量多而回收等的成本过度增加的情况。
对于水的量，若为能够与溶剂混溶并高效地搅拌的量即可，但相对于溶剂100重量份优选使用10～1000重量份。若水的量少于10重量份，则存在丝氨酸、酶的溶解不充分因而反应效率降低的情况，若水的量多于1000重量份，则存在基于磷脂酶D的水解占优势而反应效率降低的情况。
关于丝氨酸的量，与所使用的水的量等相关，但相对于磷脂100重量份优选使用50～5000重量份。若丝氨酸的量少于50重量份，则存在反应效率降低的情况，若丝氨酸的量多于5000重量份，则存在成本过度增加的情况。
本发明的磷脂酶D是用于交换键合于磷脂中的磷酸基上的氨基的酶，可以举出来自洋白菜等植物的磷脂酶、来自植物中的花生等豆类的磷脂酶、来自Actinomadura属、Streptomyces属等微生物的磷脂酶。关于磷脂酶D的量，优选按照每1g磷脂为20～1000U左右的方式使用，若磷脂酶D的量少于20U，则存在反应效率降低的情况，若磷脂酶D的量超过1000U，则存在成本过度增加的情况。
＜工序(4)＞
分离在工序(3)中形成的包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物。
以二层系实施工序(3)的情况下，若在反应结束后停止搅拌，则含有磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物转移至有机溶剂层，因此，在回收有机溶剂层后，通过水洗来除去酶，然后进行浓缩。然后，优选用丙酮洗涤，再进行干燥，由此能够得到包含磷脂酰丝氨酸的精制的含磷脂组合物。
另外，仅以水来实施工序(3)的情况下，在反应结束后，例如可以通过以下方式回收该组合物：(1)相对于水100重量份，添加己烷等有机溶剂25～200重量份，充分搅拌后，将含有磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物转移至有机溶剂层，回收有机溶剂层后，通过水洗来除去酶，然后进行浓缩；或者(2)对从水层析出的含有磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物进行过滤。回收后，优选用丙酮洗涤，再进行干燥，由此能够得到含有磷脂酰丝氨酸的精制的含磷脂组合物。
以上，对于按照工序(1)、工序(2)、工序(3)、及工序(4)的顺序进行本发明的制造方法的情况进行了说明。但是，本发明并不限于该顺序，根据其它方式，本发明还可以按照工序(3)、工序(4)、工序(1)、工序(2)的顺序来实施。这种情况下，在工序(4)之后，使PLA2作用于工序(4)中得到的磷脂，从而将键合于磷脂的2位的脂肪酸水解而得到溶血磷脂即可。使用该溶血磷脂实施工序(1)。而且，在工序(2)中使PLA2活性降低而得到的磷脂相当于作为目标生成物的大量包含磷脂酰丝氨酸和高度不饱和脂肪酸的含磷脂组合物。另外，如上所述在工序(3)中，将转移有含磷脂组合物的有机溶剂层回收后，可以通过水洗来除去酶，因此若不考虑成本增加，也可以按照工序(3)、(1)、(2)、(4)的顺序来实施本发明的制造方法。
按照工序(3)、工序(4)、工序(1)、工序(2)的顺序实施的方式中，为了在工序(1)中抑制水解反应进行，优选在不过度抑制酯化反应的反应速度的范围内，降低工序(1)的酯化反应的体系中所含水分量。因此，优选在减压下实施工序(1)中的酯化反应，并预先降低原料中所含水分量。
本发明的含磷脂组合物的制造方法能够适宜地用于制造食用、饲料用的含磷脂组合物。为此，在制造过程中也不使用不适合食用的原料、甲苯、甲酰胺等溶剂等即可。另外，本发明的含磷脂组合物可以适宜地用作高机能的食用或饲料用磷脂。此时，可以添加在食品中，也可以直接摄取。
实施例
以下示出实施例，更具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。需要说明的是，实施例中“份”、“％”为重量基准。
＜含磷脂组合物的脂肪酸组成的分析＞
将实施例、比较例中得到的含磷脂组合物10mg溶于异辛烷2mL，加入0.2M甲醇钠的甲醇溶液1mL，边在60℃搅拌边加热10分钟。用乙酸进行中和，加入水后回收上层的异辛烷层，用气相色谱仪进行分析。此时，作为气相色谱仪，使用了安捷伦公司制“5890系列II”。作为柱，使用安捷伦公司制“DB－23”(长度30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm)，在注入口温度：260℃、检测温度：260℃、炉温度：200℃固定的条件下进行分析。
(实施例1)
进行以下的工序(1)～(4)，得到含磷脂组合物。
(工序(1))键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂的制作
向1L的玻璃制反应容器注入甘油(阪本药品公司制)：200g，向其中加入溶血磷脂(Tsuji Oil Mille Co.,Ltd.制“SLP－ホワイトリゾ”、溶血磷脂酰胆碱含量规格：18～30重量％)：15g、磷脂酶A2(Sanyo Fine Co.,Ltd.制“Lysonase”、活性：5万U/g)：6g、含有DHA的甘油三酯(CrodaJapan“INCROMEGA DHA－J46”、DHA含量：49.7重量％)、利用常规方法碱水解的脂肪酸：6g、甘氨酸：6g、丙氨酸：6g、以及2M氯化钙水溶液：2mL，边进行搅拌边在300Pa的减压下，在50℃反应24小时。
(工序(2))降低了磷脂酶A2活性的磷脂的回收
在工序(1)的反应结束后，加入乙醇：100mL、己烷：100mL而形成甘油溶液层和有机溶剂层这两层。从中回收作为上层的有机溶剂层，蒸馏除去溶剂而得到含磷脂回收物15g。向该回收物中加入丙酮：50mL充分混合，回收在0℃冷却1小时而得到的沉淀，得到含磷脂组合物10g。该含磷脂组合物中残留的PLA2的活性为75U/g。另外，磷脂中的脂肪酸组成内，DHA的含量为16.5重量％。
向甘油：50g中，加入2M氯化钙水溶液：10mL、饱和氯化钠水溶液：10mL，在300Pa的减压下，在60℃除去水分30分钟，从而制备了甘油溶液。向该甘油溶液中，加入上述得到的含磷脂回收物：10g、己烷：50mL及乙醇：50mL，在50℃搅拌1小时。搅拌结束后，经过静置回收上层(有机溶剂层)，从该层蒸馏除去溶剂后，加入丙酮：50mL在0℃静置1小时，回收含磷脂组合物的沉淀。回收的含磷脂组合物中的PLA2残留活性示于表1。
[表1]
(PLA2活性单位：U/g、含量单位：重量％)
(工序(3))回收的磷脂的丝氨酸化
向1L的玻璃制反应容器中，加入工序(2)中得到的含磷脂组合物：8g，向其中混合、搅拌己烷：336mL/丙酮：84mL的混合溶剂并进行溶解，进一步将缓冲液(0.05N乙酸钠：0.05N乙酸＝6：1(体积比))：100mL、氯化钙：0.84g、L－丝氨酸：60g混合，最后将磷脂酶D(TH－2株：来自Streptomyces septatus、冈山县)：324mg溶解于水：8mL中后加入，在42℃反应12小时，进行丝氨酸化。
(工序(4))包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物的回收及精制
将结束工序(3)后的反应溶液转移至分液漏斗，静置而使其层分离后，废弃下层而回收上层(溶剂层)。重复2次如下操作：向回收的上层中加入水：50mL并静置，使其层分离后废弃下层而回收上层(溶剂层)。向回收的上层加入无水硫酸钠而从溶剂层除去水分，用滤纸除去固态物质。用旋转式蒸发器蒸馏除去溶剂，回收含磷脂组合物6.4g。该组合物整体中的磷脂酰丝氨酸的含量为28重量％。另外，回收的含磷脂组合物的构成脂肪酸中的DHA含量为16.2重量％、亚油酸的含量为30重量％。
(实施例2)
进行以下的工序(1)～(4)，得到含磷脂组合物。
(工序(1))键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂的制作
除了使用“SLP－LPC70”(Tsuji Oil Mille Co.,Ltd.制、溶血磷脂酰胆碱含量规格：65～75重量％)作为溶血磷脂以外，与实施例1同样地进行反应。
(工序(2))降低了磷脂酶A2活性的磷脂的回收
在工序(1)的反应结束后，与实施例1同样地得到含DHA键合磷脂组合物：9g。该含磷脂组合物中残留的PLA2的活性为86U/g。另外，磷脂中的构成脂肪酸组成整体中，DHA的含量为16.4重量％。
向甘油：45g中，加入2M氯化钙水溶液：9mL、饱和氯化钠水溶液：9mL，在300Pa的减压下，在60℃除去水分30分钟而制备了甘油溶液。向该甘油溶液中，加入上述得到的含磷脂回收物：9g、己烷：45mL和乙醇：45mL并在50℃搅拌1小时。搅拌结束后，经过静置回收上层(有机溶剂层)，从该层蒸馏除去溶剂后，加入在丙酮：45mL中溶解有柠檬酸：400mg的溶液并在0℃静置1小时，回收含磷脂组合物的沉淀。回收的含磷脂组合物中的PLA2残留活性示于表1。
(工序(3))回收的磷脂的丝氨酸化
向1L的玻璃制反应容器中，加入工序(2)中得到的含磷脂组合物：6g，向其中混合、搅拌己烷：240mL/丙酮：60mL的混合溶剂并溶解，将缓冲液(0.05N乙酸钠：0.05N乙酸＝6：1(体积比))：70mL、氯化钙：0.6g、L－丝氨酸：45g混合，最后将磷脂酶D(来自Streptomyces septatus的TH－2株：冈山县)：250mg溶解于水：6ml后加入，在42℃反应12小时，进行丝氨酸化。
(工序(4))包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物的回收及精制
将结束工序(3)后的反应溶液转移至分液漏斗，静置而使其层分离后，废弃下层而回收上层(溶剂层)。重复2次如下操作：向回收的上层加入水：50mL并静置，使其层分离后废弃下层而回收上层(溶剂层)。向回收的上层加入无水硫酸钠而从溶剂层除去水分，用滤纸除去固态物质。用旋转式蒸发器蒸馏除去溶剂，回收含磷脂组合物5g。该组合物整体中的磷脂酰丝氨酸的含量为48重量％。另外，回收的含磷脂组合物的构成脂肪酸中的DHA含量为16.9重量％、亚油酸的含量为31重量％。
(实施例3)
进行以下的工序(1)～(4)，得到含磷脂组合物。
(工序(1))键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂的制作
向100mL的玻璃制反应容器中注入甘油(阪本药品公司制)：20g，向其中加入溶血磷脂酰胆碱(Tsuji Oil Mille Co.,Ltd.制“SLP－LPC70”)：1.5g、磷脂酶A2(Sanyo Fine Co.,Ltd.制“Lysonase”、活性：5万U/g)：0.6g、试剂DHA(Sigma-Aldrich公司制、纯度98％以上)：0.6g、甘氨酸：0.6g、丙氨酸：0.6g、2M氯化钙水溶液：0.1mL，边搅拌边在300Pa的减压下，在50℃反应24小时。
(工序(2))降低了磷脂酶A2活性的磷脂的回收
在工序(1)的反应结束后，加入乙醇：10mL、己烷：10mL而形成甘油溶液层和有机溶剂层这两层。从中回收作为上层的有机溶剂层，蒸馏除去溶剂而得到含磷脂回收物1.7g。该含磷脂回收物中残留的PLA2的活性为91U/g。另外，在磷脂中的脂肪酸组成内，DHA的含量为33.2重量％。
向甘油：6g中，加入2M氯化钙水溶液：1.2mL、饱和氯化钠水溶液：1.2mL，在300Pa的减压下，在60℃除去水分30分钟，从而制备了甘油溶液。向该甘油溶液中，加入己烷：6mL和乙醇：6mL及上述含磷脂回收物，在50℃搅拌1小时。搅拌结束后，经过静置回收上层，蒸馏除去溶剂后，加入在丙酮：6mL中溶解有柠檬酸：54mg的溶液并在0℃静置1小时，回收含磷脂组合物的沉淀。回收的含磷脂组合物中的PLA2残留活性示于表1。
(工序(3))利用磷脂酶D的回收的磷脂的丝氨酸化
向1L的玻璃制反应容器中，加入工序(2)中得到的含磷脂组合物：1g，混合、搅拌己烷：30mL、丙酮：8mL的混合溶剂并进行溶解，将缓冲液(0.05N乙酸钠：0.05N乙酸＝6：1(体积比))：10mL、氯化钙：84mg、L－丝氨酸：6g混合，最后将磷脂酶D(TH－2株、冈山县)：32mg溶解于水：0.8mL中后加入，在42℃反应12小时，进行丝氨酸化。
(工序(4))包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物的回收及精制
将结束工序(3)后的反应溶液转移至分液漏斗，静置而使其层分离后，废弃下层而回收上层(溶剂层)。重复2次如下操作：向回收的上层加入水：10mL并静置，使其层分离后废弃下层而回收上层(溶剂层)。向回收的上层加入无水硫酸钠而从溶剂层除去水分，用滤纸除去固态物质。用旋转式蒸发器蒸馏除去溶剂，回收含磷脂组合物0.8g。该组合物整体中的磷脂酰丝氨酸的含量为46重量％。另外，回收的含磷脂组合物的构成脂肪酸中的DHA含量为34.5重量％、亚油酸含量为31重量％。
(实施例4)
除了代替工序(1)中的试剂DHA，而使用试剂花生四烯酸(Sigma-Aldrich公司制、纯度99％以上)以外，与实施例3同样地按照工序(1)～(4)得到含磷脂组合物。
工序(2)中回收的含磷脂回收物中残留的PLA2的活性为87U/g。另外，在磷脂中的脂肪酸组成内，花生四烯酸的含量为36.4重量％。
另外，工序(4)中回收的含磷脂组合物量为0.8g。该组合物整体中的磷脂酰丝氨酸的含量为48重量％。另外，回收的含磷脂组合物的构成脂肪酸中的花生四烯酸含量为37.7重量％、亚油酸含量为31重量％。
(实施例5)
(工序(1))键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂的制作
与实施例1的工序(1)同样地进行反应。
(工序(2))降低了磷脂酶A2活性的磷脂的回收
在工序(1)的反应结束后，加入乙醇：100mL、己烷：100mL而形成甘油溶液层和有机溶剂层这两层。从中回收作为上层的有机溶剂层，蒸馏除去溶剂而得到含磷脂回收物15g。向该回收物中加入丙酮：50mL并充分混合，回收在0℃冷却1小时而得到的沉淀，得到含磷脂组合物10g。该含磷脂组合物中残留的PLA2的活性为75U/g。另外，在磷脂中的脂肪酸组成内，DHA的含量为16.5重量％。
将该含磷脂组合物：10g分散于0.2M柠檬酸水溶液：100mL，向该水溶液中加入酸性蛋白酶(HBI公司制“Orientase 20A”)：1g在45℃搅拌5小时。搅拌结束后，向反应液中添加1M氢氧化钠水溶液调整到pH7.0，加入中性蛋白酶(天野酶公司制“PEPTIDASE R”)：1g在45℃搅拌3小时。搅拌结束后，向反应液中加入乙醇：50mL和己烷：50mL进行搅拌并静置分离后回收上层。蒸馏除去回收的上层的溶剂，向残渣中加入丙酮：50mL在0℃静置1小时，并回收含磷脂组合物的沉淀。回收的磷脂中的PLA2残留活性示于表1。
(工序(3))利用磷脂酶D的回收的磷脂的丝氨酸化
向1L的玻璃制反应容器中，混合、搅拌工序(2)中得到的含磷脂组合物：7g、己烷：280mL、丙酮：70mL的混合溶剂并溶解，将缓冲液(0.05N乙酸钠：0.05N乙酸＝6：1(体积比))：80mL、氯化钙：0.6g、L－丝氨酸：50g混合，最后将磷脂酶D(来自Streptomyces septatus的“TH－2株”、冈山县)：240mg溶解于水：6mL中后加入，在42℃反应12小时。
(工序(4))包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物的回收及精制
将结束工序(3)后的反应溶液转移至分液漏斗，静置而使其层分离后，废弃下层而回收上层(溶剂层)。重复2次如下操作：向回收的上层中加入水：40mL并静置，使其层分离后废弃下层而回收上层(溶剂层)。向回收的上层加入无水硫酸钠而从溶剂层除去水分，用滤纸除去固态物质。用旋转式蒸发器蒸馏除去溶剂，回收含磷脂组合物6.1g。该组合物整体中的磷脂酰丝氨酸的含量为29重量％。另外，该组合物的构成脂肪酸中的DHA含量为16.9重量％、亚油酸量为30重量％。
(实施例6)
(工序(3))利用磷脂酶D的磷脂的丝氨酸化
向1L的玻璃制反应容器中，加入磷脂(Tsuji Oil Mille Co.,Ltd.制“SLP－PC70”)：10g，向其中混合、搅拌己烷：360mL、丙酮：90mL的混合溶剂并溶解，进一步将缓冲液(0.05N乙酸钠：0.05N乙酸＝6：1(体积比))：100mL、氯化钙：1g、L－丝氨酸：70g混合，最后将磷脂酶D(TH－2株：冈山县)：350mg溶解于水：9mL中后加入，在42℃反应12小时。
(工序(4))包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物的回收及精制
将结束工序(3)后的反应溶液转移至分液漏斗，静置而使其层分离后，废弃下层而回收上层(溶剂层)。重复2次如下操作：向回收的上层中加入水：100mL并静置，使其层分离后废弃下层而回收上层(溶剂层)。向回收的上层加入无水硫酸钠而从溶剂层除去水分，用滤纸除去固态物质。用旋转式蒸发器蒸馏除去溶剂，回收含磷脂组合物8g。该组合物整体中的磷脂酰丝氨酸的含量为52重量％。
(工序(1))键合有高度不饱和脂肪酸的磷脂的制作
将工序(3)中得到的含磷脂组合物：9g分散于水：50mL中，使用1M氢氧化钠溶液调整到pH8.0。加入氯化钙二水合物：150mg，进一步加入磷脂酶A2(Sanyo Fine Co.,Ltd.制“Lysonase”、活性：5万U/g)：100mg，在50℃反应3小时，切断该含磷脂组合物中的2位的脂肪酸而溶血化。向反应液中加入丙酮：300mL，在0℃冷却30分钟，回收获得沉淀的包含溶血磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物。
向500mL的玻璃制反应容器中，注入甘油(阪本药品公司制)：70g，向其中加入上述包含溶血磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物：5g、磷脂酶A2(Sanyo Fine Co.,Ltd.制“Lysonase”、活性：5万U/g)：2g、含有DHA的甘油三酯(Croda Japan公司制“INCROMEGA DHA－J46”、DHA含量：49.7重量％)、利用常规方法碱水解的脂肪酸：2g、甘氨酸：2g、丙氨酸：2g、2M氯化钙水溶液：1mL，边进行搅拌边在300Pa的减压下，在50℃反应24小时。
(工序(2))降低了磷脂酶A2活性的磷脂的回收
在工序(1)的反应结束后，加入乙醇：35mL、己烷：35mL而形成甘油溶液层和有机溶剂层这两层。从中回收作为上层的有机溶剂层，蒸馏除去溶剂而得到含磷脂回收物5.2g。该回收物中的含磷脂组合物中残留的PLA2的活性为56U/g。另外，在该含磷脂组合物中的脂肪酸组成内，DHA的含量为14.6重量％、亚油酸的含量为32重量％。该组合物整体中的磷脂酰丝氨酸的含量为40重量％。
向甘油：30g中加入2M氯化钙水溶液：12mL，在300Pa的减压下，在60℃减压30分钟而除去水分，从而制备了甘油溶液。加入己烷：30mL和乙醇：30mL及上述含磷脂组合物，在室温下搅拌1小时。搅拌结束后，经过静置回收上层，蒸馏除去溶剂后，加入在丙酮30mL中溶解有柠檬酸：270mg的溶液并在0℃静置1小时，回收含磷脂组合物的沉淀。回收的含磷脂组合物中的PLA2残留活性示于表1。
(比较例1)无PLA2失活
与实施例1完全同样地进行工序(1)的反应。在工序(1)的反应结束后，加入乙醇：100mL、己烷：100mL而形成甘油溶液层和有机溶剂层这两层。从中回收作为上层的有机溶剂层，蒸馏除去溶剂而得到含磷脂回收物15g。向该回收物中加入丙酮：50mL并充分混合，回收在0℃冷却1小时而得到的沉淀，得到含磷脂组合物10g。该含磷脂组合物中残留的PLA2的活性为75U/g。另外，在该组合物中的脂肪酸组成内，DHA的含量为16.5重量％。
若不进行工序(2)而使用得到的含磷脂组合物与实施例1同样地进行工序(3)、工序(4)，则受到因残留的PLA2导致的分解的影响，未从回收物中检测出包括磷脂酰丝氨酸的磷脂。
(比较例2)在不键合高度不饱和脂肪酸的情况下，进行丝氨酸化
以市售的脱脂大豆卵磷脂为原料，在不进行工序(1)、工序(2)的情况下，与实施例1同样地进行工序(3)、工序(4)。其结果是，最终得到的含磷脂组合物中的磷脂酰丝氨酸的含量为30重量％。另外，未从该含磷脂组合物中检测出DHA。
Claims (15)
1.一种含磷脂组合物的制造方法，其是含磷脂组合物整体中含有10重量％以上的磷脂酰丝氨酸、且构成脂肪酸整体中高度不饱和脂肪酸的含量为10～40重量％的含磷脂组合物的制造方法，包括以下的工序(1)、(2)及工序(3)、(4)，
工序(1)：通过磷脂酶A2即PLA2，进行溶血磷脂与高度不饱和脂肪酸的酯化反应，得到磷脂；
工序(2)：在工序(1)之后，使磷脂中的PLA2活性为10U/g磷脂以下；
工序(3)：在磷脂酶D即PLD的存在下，进行磷脂与丝氨酸的混合物中的碱交换反应，形成包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物；
工序(4)：将包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物分离。
2.如权利要求1所述的含磷脂组合物的制造方法，其特征在于，
在所述工序(2)中从磷脂中除去PLA2和/或在所述工序(2)中使磷脂中的PLA2失活。
3.如权利要求2所述的含磷脂组合物的制造方法，其特征在于，
在工序(2)中，在工序(1)之后，向磷脂中添加无机盐的甘油溶液、碳数4以下的醇、以及不与甘油混溶且溶解磷脂的有机溶剂，搅拌后静置，形成包含磷脂的有机溶剂层和包含PLA2的甘油溶液层，将该有机溶剂层从该甘油溶液层分离，由此从磷脂中除去PLA2。
4.如权利要求2所述的含磷脂组合物的制造方法，其特征在于，
在工序(2)中，在工序(1)之后，向磷脂中添加酸性蛋白酶，使磷脂中的PLA2失活。
5.如权利要求4所述的含磷脂组合物的制造方法，其特征在于，
用酸性蛋白酶处理磷脂后，进一步向该磷脂中添加中性蛋白酶，使磷脂中的PLA2失活。
6.如权利要求1～5中任一项所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
高度不饱和脂肪酸为DHA。
7.如权利要求1～6中任一项所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
溶血磷脂为来自植物或蛋黄的溶血卵磷脂。
8.如权利要求7所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
溶血磷脂为来自大豆的溶血卵磷脂。
9.如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
无机盐的甘油溶液中的水分量为10重量％以下。
10.如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
不与甘油混溶且溶解磷脂的有机溶剂是碳数为5～8的烃溶剂和/或醚。
11.如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
甘油溶液中的无机盐浓度为0.2～40重量％。
12.如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
无机盐为选自由硫酸锌、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠及氯化钙构成的组的至少1种。
13.如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
有机溶剂为己烷。
14.如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中，
碳数4以下的醇为乙醇。
15.一种含磷脂组合物，其是以来自植物的磷脂、或来自植物及来自蛋黄的磷脂为原料而合成的含磷脂组合物，其中，
含有10重量％以上的磷脂酰丝氨酸，构成脂肪酸整体中DHA的含量为10～40重量％且亚油酸的含量为15～40重量％。
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