JPWO2013187328A1 - リン脂質含有組成物の製造方法及びリン脂質含有組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
工程(1):ホスホリパーゼA2(PLA2)により、リゾリン脂質と高度不飽和脂肪酸とのエステル化反応を行い、リン脂質を得る。
工程(2):工程(1)の後、リン脂質中のPLA2活性を10U/g(リン脂質)以下にする。
工程(3):ホスホリパーゼD(PLD)の存在下、リン脂質とセリンの混合物における塩基交換反応を行い、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を形成する。
工程(4):ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を分離する。
リン脂質またはリン脂質含有組成物中のホスファチジルセリンの定量は、Journal of High Resolution Chromatography,13(1990),pp126−129に記載の方法に沿って、HPLC−ELSD装置により分析する。ホスファチジルセリンの定量には、あらかじめ標準的な方法で大豆レシチンからホスホリパーゼDを用いて合成し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製したホスファチジルセリン標品を用いて検量線を作成し、それを基に定量する。
ホスホリパーゼA2(以下、PLA2ともいう)を用いて、リゾリン脂質と高度不飽和脂肪酸とのエステル化反応を行い、高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質を得る。前記エステル化反応は、常法に従えばよいが、酵素の至適温度や脂肪酸の酸化等を考慮し、30〜80℃の温度範囲で行うのが好ましく、40〜70℃の範囲で行うことがより好ましい。30℃未満であると酵素活性が低い場合があり、80℃を超えると酵素が失活したり、脂肪酸が酸化したりする場合がある。また反応時間は、3〜72時間が好ましい。PLA2の添加量は、リゾリン脂質100重量部あたり1〜100重量部が好ましい。反応はリン脂質の脂肪酸組成を分析し、高度不飽和脂肪酸が構成脂肪酸中少なくとも10重量%以上になったことを確認した後、終了させることが好ましい。
工程(1)の後、工程(1)で得られたリン脂質中のPLA2活性を10U/g(リン脂質)以下にする。この工程は、具体的には、以下で説明するようなリン脂質からPLA2を除去する工程(2)−1、または、リン脂質中のPLA2を失活させる工程(2)−2で実現される。工程(2)−1と工程(2)−2の両方を併用してもよい。
工程(1)の後、リン脂質(工程(1)でエステル化反応して得られたリン脂質含有反応溶液からリン脂質を有機溶剤に抽出した抽出溶液、この抽出溶液から有機溶剤を留去したリン脂質含有組成物、又はさらにアセトンなどにより脂肪酸が除去されたリン脂質含有組成物)に対して、無機塩のグリセリン溶液、炭素数4以下のアルコール、及び、グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤を添加し、混合する。それらの添加量は、PLA2の除去効果を考慮して適宜決定すればよく、前記反応溶液や抽出溶液が当該溶剤をあらかじめ含んでいる場合は適宜調整することができる。
工程(1)の後、酸性プロテアーゼをリン脂質に添加することで、リン脂質中のPLA2を失活させてリン脂質中のホスホリパーゼA2活性を下げる。該プロテアーゼは、たんぱく質中のペプチド結合を切断する酵素であり、動物・植物・微生物に広く存在する。
本発明におけるリン脂質中のホスホリパーゼA2活性の測定方法は以下の通りである。まず、脱脂大豆レシチン6gに蒸留水400mLを加えて室温で30分間攪拌する。その脱脂大豆レシチン溶液に、デオキシコール酸ナトリウム0.7g及び塩化カルシウム2水和物0.5gを水110mLに溶かした溶液を加え、氷冷しながら8000rpmで15分間ホモジナイズする。得られた溶液を活性測定溶液とする。活性測定溶液20mLを50mLのサンプル瓶に計り取り、1M水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを8.0に調整する。測定対象であるリン脂質サンプル20mgを1mLの蒸留水に分散させ、その溶液をpH8.0に調整した活性測定溶液に加えて、再度pHを8.0に調整し、pHを8.0に維持するために必要な20mM水酸化ナトリウム溶液の1分当たりの滴定量を測定する。あらかじめ酵素標準溶液で作成した検量線を用いて、リン脂質中のPLA2活性を算出する。
工程(2)で得られたリン脂質又は市販のリン脂質をセリンと混合して、ホスホリパーゼD(以下、PLDともいう)の存在下、塩基交換反応を行い、リン酸基にセリンを結合させる。これにより、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を形成する。前記塩基交換反応としては、リン脂質を溶解する有機溶剤と、セリンやホスホリパーゼDを溶解する水との二層系で実施する方法、もしくは水のみで実施する方法などがあり、何れの方法でも構わないが、リン脂質の溶解性の観点から二層系で実施する方法が好ましい。
工程(3)で形成されたホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を分離する。
実施例・比較例で得られたリン脂質含有組成物10mgをイソオクタン2mLに溶かし、0.2Mナトリウムメチラートのメタノール溶液1mLを加えて60℃で攪拌しながら10分間加熱した。酢酸で中和し、水を加えて上層のイソオクタン層を回収してガスクロマトグラフで分析した。その際、ガスクロマトグラフとしては、アジレント社製「5890seriesII」を使用した。カラムとしては、アジレント社製「DB−23」(長さ30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm)を用いて、注入口温度:260℃、検出温度:260℃、オーブン温度:200℃一定で分析を行った。
以下の工程(1)〜(4)を行い、リン脂質含有組成物を得た。
1Lのガラス製反応容器にグリセリン(阪本薬品社製):200gを注入し、そこに、リゾリン脂質(辻製油社製「SLP−ホワイトリゾ」、リゾホスファチジルコリン含量規格:18〜30重量%):15g、ホスホリパーゼA2(サンヨーファイン社製「リゾナーゼ」、活性:5万U/g):6g、DHA含有トリグリセリド(クローダジャパン「インクロメガDHA−J46」、DHA含有量:49.7重量%)、定法によりアルカリ加水分解した脂肪酸:6g、グリシン:6g、アラニン:6g、および2M塩化カルシウム水溶液:2mLを加えて攪拌しながら、300Paの減圧下、50℃で24時間反応させた。
工程(1)の反応終了後、エタノール:100mL、ヘキサン:100mLを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を15g得た。該回収物にアセトン:50mLを加えてよくかき混ぜ、0℃で1時間冷却して得られた沈澱を回収し、リン脂質含有組成物を10g得た。このリン脂質含有組成物中に残存するPLA2の活性は、75U/gであった。また、リン脂質中の脂肪酸組成の内、DHAの含量は16.5重量%であった。
1Lのガラス製反応容器に、工程(2)で得られたリン脂質含有組成物:8gを入れ、そこにヘキサン:336mL/アセトン:84mLの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、さらに緩衝液(0.05N酢酸ナトリウム:0.05N酢酸=6:1(容積比)):100mL、塩化カルシウム:0.84g、L−セリン:60gを混合し、最後にホスホリパーゼD(TH−2株:Streptomyces septatus由来、岡山県):324mgを水:8mLに溶解してから加え、42℃で12時間反応させ、セリン化した。
工程(3)を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収した。回収した上層に水:50mLを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収することを2回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を6.4g回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は28重量%だった。また回収したリン脂質含有組成物の構成脂肪酸中のDHA含量は16.2重量%、リノール酸の含量は30重量%であった。
以下の工程(1)〜(4)を行い、リン脂質含有組成物を得た。
リゾリン脂質として「SLP−LPC70」(辻製油社製、リゾホスファチジルコリン含量規格:65〜75重量%)を用いた以外は実施例1と同様にして反応を行った。
工程(1)の反応終了後、実施例1と同様にしてDHA結合リン脂質含有組成物:9gを得た。このリン脂質含有組成物中に残存するPLA2の活性は、86U/gであった。また、リン脂質中の構成脂肪酸組成全体中、DHAの含量は16.4重量%であった。
1Lのガラス製反応容器に、工程(2)で得られたリン脂質含有組成物:6gを入れ、そこにヘキサン:240mL/アセトン:60mLの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、緩衝液(0.05N酢酸ナトリウム:0.05N酢酸=6:1(容積比)):70mL、塩化カルシウム:0.6g、L−セリン:45gを混合し、最後にホスホリパーゼD(Streptomyces septatus由来TH−2株:岡山県):250mgを水:6mlに溶解してから加え、42℃で12時間反応させ、セリン化した。
工程(3)を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収した。回収した上層に水:50mLを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収することを2回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を5g回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は48重量%であった。また回収したリン脂質含有組成物の構成脂肪酸中のDHA含量は16.9重量%、リノール酸の含量は31重量%であった。
以下の工程(1)〜(4)を行い、リン脂質含有組成物を得た。
100mLのガラス製反応容器にグリセリン(阪本薬品社製):20gを注入し、そこにリゾホスファチジルコリン(辻製油社製「SLP−LPC70」):1.5g、ホスホリパーゼA2(サンヨーファイン社製「リゾナーゼ」、活性:5万U/g):0.6g、試薬DHA(シグマアルドリッチ社製、純度98%以上):0.6g、グリシン:0.6g、アラニン:0.6g、2M塩化カルシウム水溶液:0.1mLを加えて攪拌しながら、300Paの減圧下、50℃で24時間反応させた。
工程(1)の反応終了後、エタノール:10mL、ヘキサン:10mLを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を1.7g得た。このリン脂質含有回収物中に残存するPLA2の活性は、91U/gであった。また、リン脂質中の脂肪酸組成の内、DHAの含量は33.2重量%であった。
1Lのガラス製反応容器に、工程(2)で得られたリン脂質含有組成物:1gを入れ、ヘキサン:30mL、アセトン:8mLの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、緩衝液(0.05N酢酸ナトリウム:0.05N酢酸=6:1(容積比)):10mL、塩化カルシウム:84mg、L−セリン:6gを混合し、最後にホスホリパーゼD(TH−2株、岡山県):32mgを水:0.8mLに溶解してから加え、42℃で12時間反応させ、セリン化した。
工程(3)を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収した。回収した上層に水:10mLを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収することを2回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を0.8g回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は46重量%だった。また回収したリン脂質含有組成物の構成脂肪酸中のDHA含量は34.5重量%、リノール酸含量は31重量%であった。
工程(1)における試薬DHAの代わりに、試薬アラキドン酸(シグマアルドリッチ社製、純度99%以上)を用いた以外は、実施例3と同様にして工程(1)〜(4)に従ってリン脂質含有組成物を得た。
(工程(1)) 高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質の作製
実施例1の工程(1)と同様に反応を行った。
工程(1)の反応終了後、エタノール:100mL、ヘキサン:100mLを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を15g得た。該回収物にアセトン:50mLを加えてよくかき混ぜ、0℃で1時間冷却して得られた沈澱を回収し、リン脂質含有組成物を10g得た。このリン脂質含有組成物中に残存するPLA2の活性は、75U/gであった。また、リン脂質中の脂肪酸組成の内、DHAの含量は16.5重量%だった。
1Lのガラス製反応容器に、工程(2)で得られたリン脂質含有組成物:7g、ヘキサン:280mL、アセトン:70mLの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、緩衝液(0.05N酢酸ナトリウム:0.05N酢酸=6:1(容積比)):80mL、塩化カルシウム:0.6g、L−セリン:50gを混合し、最後にホスホリパーゼD(Streptomyces septatus由来「TH−2株」、岡山県):240mgを水:6mLに溶解してから加え、42℃で12時間反応させた。
工程(3)を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収した。回収した上層に水:40mLを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収することを2回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を6.1g回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は29重量%であった。また該組成物の構成脂肪酸中のDHA含量は16.9重量%、リノール酸量は30重量%であった。
(工程(3)) ホスホリパーゼDによるリン脂質のセリン化
1Lのガラス製反応容器に、リン脂質(辻製油社製「SLP−PC70」):10gを入れ、そこへヘキサン:360mL、アセトン:90mLの混合溶媒を混合・攪拌して溶解し、さらに緩衝液(0.05N酢酸ナトリウム:0.05N酢酸=6:1(容積比)):100mL、塩化カルシウム:1g、L−セリン:70gを混合し、最後にホスホリパーゼD(TH−2株:岡山県):350mgを水:9mLに溶解してから加え、42℃で12時間反応させた。
工程(3)を終えた反応溶液を分液ロートに移し、静置して層分離させた後、下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収した。回収した上層に水:100mLを加えて静置し、層分離させた後で下層を廃棄して上層(溶剤層)を回収することを2回繰り返した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを加えて水分を溶剤層から除去し、ろ紙で固形物を除いた。ロータリーエバポレーターで溶剤を留去し、リン脂質含有組成物を8g回収した。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は52重量%だった。
工程(3)で得たリン脂質含有組成物:9gを水:50mLに分散させ、1M水酸化ナトリウム溶液を用いてpH8.0に調整した。塩化カルシウム2水和物:150mgを加え、さらにホスホリパーゼA2(サンヨーファイン社製「リゾナーゼ」、活性:5万U/g):100mgを加えて50℃で3時間反応させ、該リン脂質含有組成物中の2位の脂肪酸を切断してリゾ化した。反応液にアセトン:300mLを加えて0℃で30分間冷却し、沈澱したリゾホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を回収して得た。
工程(1)の反応終了後、エタノール:35mL、ヘキサン:35mLを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を5.2g得た。この回収物中のリン脂質含有組成物中に残存するPLA2の活性は、56U/gであった。また、該リン脂質含有組成物中の脂肪酸組成の内、DHAの含量は14.6重量%、リノール酸の含量は32重量%であった。該組成物全体中のホスファチジルセリンの含有量は40重量%であった。
実施例1と全く同様にして工程(1)の反応を行った。工程(1)の反応終了後、エタノール:100mL、ヘキサン:100mLを加えてグリセリン溶液層と有機溶剤層の二層を形成した。ここから上層である有機溶剤層を回収し、溶剤を留去してリン脂質含有回収物を15g得た。該回収物にアセトン:50mLを加えてよくかき混ぜ、0℃で1時間冷却して得られた沈澱を回収し、リン脂質含有組成物を10g得た。このリン脂質含有組成物中に残存するPLA2の活性は、75U/gであった。また、該組成物中の脂肪酸組成のうち、DHAの含量は16.5重量%だった。
市販の脱脂大豆レシチンを原料として、工程(1)、工程(2)を行うことなく、実施例1と同様に工程(3)、工程(4)を行った。その結果、最終的に得られたリン脂質含有組成物中のホスファチジルセリンの含有量は30重量%であった。また該リン脂質含有組成物からDHAは検出されなかった。
工程(1):ホスホリパーゼA2(PLA2)により、リゾリン脂質と高度不飽和脂肪酸とのエステル化反応を行い、リン脂質を得る。
工程(2):工程(1)の後、リン脂質に、無機塩のグリセリン溶液、炭素数4以下のアルコール、及び、グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤を添加し、撹拌した後静置して、リン脂質を含む有機溶剤層と、PLA2を含むグリセリン溶液層とを形成させ、該有機溶剤層を該グリセリン溶液層から分離することで、リン脂質からPLA2を除去し、リン脂質中のPLA2活性を10U/g(リン脂質)以下にする。
工程(3):ホスホリパーゼD(PLD)の存在下、リン脂質とセリンの混合物における塩基交換反応を行い、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を形成する。
工程(4):ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を分離する。
Claims (15)
- リン脂質含有組成物全体中ホスファチジルセリンを10重量%以上含有し、且つ構成脂肪酸全体中高度不飽和脂肪酸の含有量が10〜40重量%であるリン脂質含有組成物の製造方法であって、以下の工程(1)、(2)及び工程(3)、(4)を含むリン脂質含有組成物の製造方法。
工程(1):ホスホリパーゼA2(PLA2)により、リゾリン脂質と高度不飽和脂肪酸とのエステル化反応を行い、リン脂質を得る。
工程(2):工程(1)の後、リン脂質中のPLA2活性を10U/g(リン脂質)以下にする。
工程(3):ホスホリパーゼD(PLD)の存在下、リン脂質とセリンの混合物における塩基交換反応を行い、ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を形成する。
工程(4):ホスファチジルセリンを含むリン脂質含有組成物を分離する。 - 前記工程(2)においてリン脂質からPLA2を除去する及び/又は前記工程(2)においてリン脂質中のPLA2を失活させることを特徴とする請求項1に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 工程(2)において、工程(1)の後、リン脂質に、無機塩のグリセリン溶液、炭素数4以下のアルコール、及び、グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤を添加し、撹拌した後静置して、リン脂質を含む有機溶剤層と、PLA2を含むグリセリン溶液層とを形成させ、該有機溶剤層を該グリセリン溶液層から分離することで、リン脂質からPLA2を除去することを特徴とする請求項2に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 工程(2)において、工程(1)の後、酸性プロテアーゼをリン脂質に添加し、リン脂質中のPLA2を失活させることを特徴とする請求項2に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 酸性プロテアーゼでリン脂質を処理した後、さらに中性プロテアーゼを当該リン脂質に添加し、リン脂質中のPLA2を失活させることを特徴とする請求項4に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 高度不飽和脂肪酸がDHAである、請求項1〜5の何れかに記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- リゾリン脂質が植物または卵黄由来のリゾレシチンである、請求項1〜6の何れかに記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- リゾリン脂質が大豆由来のリゾレシチンである、請求項7に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 無機塩のグリセリン溶液中の水分量が10重量%以下である、請求項3に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤が、炭素数が5〜8の炭化水素溶剤、及び/又は、エーテルである、請求項3に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- グリセリン溶液中の無機塩濃度が、0.2〜40重量%である、請求項3に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 無機塩が、硫酸亜鉛、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項3に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 有機溶剤がヘキサンである、請求項3に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 炭素数4以下のアルコールがエタノールである、請求項3に記載のリン脂質含有組成物の製造方法。
- 植物由来のリン脂質、又は植物由来及び卵黄由来のリン脂質を原料として合成されたリン脂質含有組成物であり、ホスファチジルセリンを10重量%以上含有し、構成脂肪酸全体中DHAの含有量が10〜40重量%且つリノール酸の含有量が15〜40重量%であるリン脂質含有組成物。
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