WO2011004794A1

WO2011004794A1 - リン脂質の製造方法

Info

Publication number: WO2011004794A1
Application number: PCT/JP2010/061414
Authority: WO
Inventors: 立志田中; 雄吾岩崎
Original assignee: 株式会社カネカ; 国立大学法人名古屋大学
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2010-07-05
Publication date: 2011-01-13
Also published as: US8530208B2; JPWO2011004794A1; US20120100580A1; EP2453020B1; CN102471788A; CN102471788B; JP4978751B2; EP2453020A4; CL2012000020A1; EP2453020A1; ES2468799T3

Abstract

　グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるエステル化反応を用いてリン脂質の２位に任意の脂肪酸を結合させたリン脂質を製造する方法において、ホスホリパーゼＡ２の再利用により、低コストで該リン脂質を製造する方法を提供することを目的とする。　グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質とアシルドナーとのエステル化反応によりリン脂質を生成させた後、グリセリンと混和しない溶剤を添加してグリセリン層と溶剤層を形成させて、前記リン脂質を前記溶剤層に抽出し、ホスホリパーゼＡ２を前記グリセリン層に移行させ、その後分取したグリセリン層から残留溶剤を留去したグリセリン溶液にリゾリン脂質及びアシルドナーを更に添加することにより、前記グリセリン溶液に残存するホスホリパーゼＡ２を利用して再度のエステル化反応を行うことを特徴とするリン脂質の製造方法により上記目的を達成した。

Description

リン脂質の製造方法

　本発明は、リン脂質の製造方法に関し、特にホスホリパーゼＡ２によるリン脂質の製造方法に関する。

　近年の脂質に関する研究から、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの高度不飽和脂肪酸が学習機能向上、動脈硬化症予防、脂質代謝改善機能など様々な機能を持つことが明らかになっている。特にＤＨＡは、ホスファチジルコリンのようなリン脂質に結合した形態で摂取することにより、トリグリセリド型と比較して抗酸化性が強く安定性が高まり、また吸収が良いためＤＨＡの持つ生理活性が発現しやすいことが明らかになっている。ＤＨＡ以外のＥＰＡや共役リノール酸、アラキドン酸などの機能性脂肪酸においてもリン脂質に結合することで生理活性が高まることが期待できる。

　ＤＨＡをはじめとする機能性の脂肪酸が結合したリン脂質の製造方法は、天然に存在するものを抽出する方法と、大豆リン脂質などを原料として合成する方法に分けられる。先ず前者として具体的には、水産動物の卵を原料としてＤＨＡ結合リン脂質を抽出する方法（特許文献１）、イカなどの海産物から有機溶剤により抽出する方法などが挙げられる（特許文献２）。しかし、これらの方法では、原料が高価であり供給が必ずしも安定しておらず、またリン脂質の組成が原料に依存しているため、ＤＨＡ以外の機能性脂肪酸を結合させたものは製造することはできない。

　また、原料の組成によらず所望の脂肪酸を導入できる方法として、微生物の培養液に任意の脂肪酸を添加し、微生物に該脂肪酸が結合したリン脂質を生産させる方法が挙げられるが（特許文献３）、この方法では大量の培養液から少量のリン脂質しか得られず、生産効率が良いものではない。

　次に後者の方法のうち、大豆リン脂質等にＤＨＡを結合させる方法としては、リパーゼ及びホスホリパーゼの反応系に高誘電率水素結合形成物を添加する方法が挙げられるが（特許文献４）、この方法ではリパーゼによるリゾリン脂質と脂肪酸の反応で高反応率が得られているものの、ホスホリパーゼＡ２による反応では高い反応率が得られなかった。また、ＤＨＡ結合リン脂質の生理活性の発現にはＤＨＡが２位に結合していることが重要であるところ、リパーゼによる反応では主に目的の脂肪酸はリン脂質の１位に結合するため、実用性が高いとは言えない。

　一方、リン脂質の２位に効率的に所望の脂肪酸を結合させる方法として、ホスホリパーゼＡ２を用いてグリセリン中で行う方法が幾つか報告されている（特許文献５、非特許文献１）。しかしこれらの報告では、反応後の抽出方法は有害なクロロホルム－メタノールが用いられていることからリン脂質の用途によっては前記溶媒を用いることができないか、前記溶剤を除去する設備が必要となり、さらにホスホリパーゼＡ２は高価なため、大幅なコストダウンが求められている。

　また、一般的な酵素反応においては、酵素を有効利用するため、酵素の固定化が広く行われている。しかしホスホリパーゼＡ２によるエステル化反応において固定化したホスホリパーゼＡ２を用いた場合、リゾリン脂質に対して大量の脂肪酸を使用しても効率よくエステル化反応を進行させることは困難であるとの報告がある（非特許文献２、非特許文献３）。

特開平８－５９６７８号公報特開平８－３２５１９２号公報特開２００７－１２９９７３号公報特開平８－５６６８３号公報特開平５－２３６９７４号公報

Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、７２巻、９０９－９１１頁Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’　Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９５年、７２巻、６４１－６４６頁Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、１９９７年、１３４３巻、７６－８４頁

　上記のように、ホスホリパーゼＡ２による効率的なエステル化反応後、リン脂質を回収し、なおかつホスホリパーゼＡ２を再利用する方法が望まれている。そこで本発明は、グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるエステル化反応を用いてリン脂質の２位に任意の脂肪酸を結合させたリン脂質を製造する方法において、ホスホリパーゼＡ２の再利用により、低コストで該リン脂質を製造する方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応後にグリセリンと混和しない溶剤によりリン脂質を抽出した後、前記溶剤を留去し、リゾリン脂質及びアシルドナーを添加することでグリセリン中に残存するホスホリパーゼＡ２を利用して、再度、リゾリン脂質とアシルドナーとのエステル化反応が行えることを見出し、本発明を完成するに至った。

　即ち、本発明は、グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質とアシルドナーとのエステル化反応によりリン脂質を生成させた後、グリセリンと混和しない溶剤を添加してグリセリン層と溶剤層を形成させて、前記リン脂質を前記溶剤層に抽出し、ホスホリパーゼＡ２を前記グリセリン層に移行させ、その後分取したグリセリン層から残留溶剤を留去したグリセリン溶液にリゾリン脂質及びアシルドナーを添加することにより、前記グリセリン溶液に残存するホスホリパーゼＡ２を利用してのエステル化反応を行うことを特徴とするリン脂質の製造方法に関する。

　また、本発明では、前記グリセリンと混和しない溶剤として、ケトン溶剤を添加しても良いし、あるいは、前記エステル化反応後に炭素数４以下のアルコールを加えてから、グリセリンと混和しない溶剤として、炭化水素溶剤、ケトン溶剤及びエステル溶剤からなる群から選ばれる少なくとも１種からなる溶剤を添加しても良い。

　また、本発明では、前記エステル化反応において、当該反応系にアミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチドを添加してもよい。

　前記アミノ酸としては、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。

　前記ペプチドとしては、グリシン、アラニン、セリンの組み合わせからなるものが好ましい。

　本発明によれば、グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるエステル化反応を用いてリン脂質の２位に任意の脂肪酸を結合させたリン脂質を製造する方法において、ホスホリパーゼＡ２の再利用により、低コストで該リン脂質を製造する方法を提供することができる。

　以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明のリン脂質の製造方法は、グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質とアシルドナーとのエステル化反応によりリン脂質を生成させた後、グリセリンと混和しない溶剤を添加してグリセリン層と溶剤層を形成させて、前記リン脂質を前記溶剤層に抽出し、ホスホリパーゼＡ２を前記グリセリン層に移行させ、その後分取したグリセリン層から残留溶剤を留去したグリセリン溶液にリゾリン脂質及びアシルドナーを更に添加することにより、前記グリセリン溶液に残存するホスホリパーゼＡ２を利用して再度のエステル化反応を行うことを特徴とする。

　本発明におけるリゾリン脂質は、リン脂質から２位の脂肪酸を除いたものを指し、リン脂質とは異なる脂質を意味する。本発明に用いるリゾリン脂質は、リン脂質を改質したものを用いることができ、入手のし易さからは大豆由来、菜種由来、卵黄由来のものが好ましく、価格面からは大豆由来のものがより好ましいが、その他の植物由来のリゾリン脂質も用いることができる。

　リン脂質を改質してその２位の脂肪酸残基を除く方法としては、特に限定はないが、例えばホスホリパーゼＡ２などを用いてリン脂質の２位の脂肪酸残基を加水分解する方法などが挙げられる。この場合に用いることができるリン脂質は、グリセリン骨格とリン酸基及び２つの脂肪酸エステルを持つ分子で、ホスホリパーゼＡ２の基質になり得るものであり、スフィンゴシン骨格を持つものは含まれない。具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンなどが例示できる。ホスホリパーゼＡ２を用いた方法は、有害な物質を使用しないでも行うことができることから、例えば食品用途のリン脂質を製造する際に有効である。

　本発明においては、グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応でリゾリン脂質の２位に導入するアシルドナーである脂肪酸としては特に限定はなく、遊離の脂肪酸を用いたり、エチルエステル体やトリグリセリドになっているものを反応系内でリパーゼ等の酵素で加水分解して用いることもできるが、反応性の点から遊離の脂肪酸を用いることが好ましい。具体的には、機能性の面から考えてＤＨＡ、ＥＰＡ、アラキドン酸、共役リノール酸等の高度不飽和脂肪酸が挙げられ、例えば前記ＤＨＡやＥＰＡとしては、主に海産動物油や藻類から得られる油脂を加水分解し遊離脂肪酸の形態にしたものを用いることができる。尚、本発明に用いるアシルドナーは、反応効率およびコストの面から、リゾリン脂質１００重量部に対して、３０～１０００重量部を用いることが好ましい。

　また、ＤＨＡなどのように、天然由来のものを単体で入手が困難である場合は、所望の脂肪酸を含有する脂肪酸の混合物を用いることができる。その際、脂肪酸混合物中の所望の脂肪酸の含有量は、概ね２０重量％以上であることが望ましい。ＤＨＡの場合を例示すると、ＤＨＡ含有脂肪酸中のＤＨＡの濃度は好ましくは２０重量％以上であり、４５重量％以上のＤＨＡ濃度を持つものを用いることがより好ましい。尚、本発明によるエステル化反応の後に溶剤分別などを行い反応生成物であるリン脂質の濃度を高めても構わない。

　本発明に用いるホスホリパーゼＡ２は、特にその由来は問わないが、一般に食用に用いることができるものが好ましく、例えばブタ膵臓由来のものや微生物由来のものが挙げられる。尚、本発明に用いるホスホリパーゼＡ２は、反応効率およびコストの観点から、リゾリン脂質１ｇに対して１０００～１０００００Ｕ用いることが好ましい。

　本発明では、グリセリン中でエステル化反応を行う。これは、グリセリンが高い極性を有しエステル化反応の場として有効であること、食品への使用が可能なことによるものである。また任意成分である後述のアミノ酸を溶解し得る点でも有効である。尚、グリセリンは、反応性等を考慮して、リゾリン脂質１００重量部に対して、５００～１００００重量部用いるのが好ましい。

　本発明では、上記のようにグリセリン中でエステル化反応を行うことから、生成するリン脂質を抽出するために、グリセリンと混和しない溶剤を用いてリン脂質の抽出処理を行う。本発明に用いるグリセリンと混和しない溶剤としては、炭化水素溶剤、ケトン溶剤およびエステル溶剤からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる溶剤を用いることができ、それらを用いることで目的のリン脂質を効率的に抽出することができる。但し、ケトン溶剤のみを用いる場合を除き、グリセリンを含む反応溶液の粘度を下げて抽出処理を行いやすくするため、炭素数４以下のアルコールを加えてから、前記溶剤を添加するのが好ましい。また、ケトン溶剤のみを使用する場合に前記アルコールの添加が不要な理由は、グリセリンに対する溶解性が炭化水素溶剤やエステル溶剤よりも良好なためである。尚、前記溶剤は、リン脂質の回収効率などを考慮して、グリセリン１００重量部に対して２０～３００重量部添加するのが好ましい。

　前記炭化水素溶剤とは、炭素と水素のみから構成される化合物のうち溶剤として用いることができるものを指す。具体的にはペンタン、ヘキサン、ヘプタン等であるが、沸点が低いため留去しやすく、かつ食品添加物として使用できることからヘキサンがより好ましい。

　前記ケトン溶剤とは、分子内にケト基を持つ化合物のうち溶剤として用いることができるものを指す。具体的にはアセトン、ブタノン等であるが、沸点が低いため留去しやすくかつ食品添加物として使用できることからアセトンが好ましい。

　前記エステル溶剤とは、分子内にエステル結合を持つ化合物のうち、溶剤として利用できるものを指し、具体的には酢酸メチル、酢酸エチル等であるが、食品用途として用いられることから酢酸エチルが好ましい。

　また本発明では、ホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質のエステル化反応において、アシルドナーの酸化防止のために抗酸化剤を用いたり、ホスホリパーゼＡ２の活性化のために、塩化カルシウム等のカルシウム源、あるいはアミノ酸やアミノ酸が３残基以下のペプチドを用いたりすることができ、また必要に応じてその他の添加物を使用しても良い。

　前記抗酸化剤としては、ＤＨＡなどの脂肪酸に対する抗酸化力が期待できるものであれば種類を問わないが、例えば、食品用途として用いる観点からすると、カテキンなどのポリフェノール、トコフェロール、アスコルビン酸およびその誘導体、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などが例示できる。
　また、脂肪酸の酸化を防止するため、リゾリン脂質のエステル化反応は酸素を遮断し、窒素雰囲気下で行ってもよい。

　前記アミノ酸としては、主にタンパク質の構成要素となるもので分子内にカルボキシル基とアミノ基を有する化合物を指し、食用として用いることができるものが好ましい。中でも、ホスホリパーゼＡ２の電荷状態に比較的影響を与えずホスホリパーゼＡ２を活性化できることから、中性アミノ酸が好ましく、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、チロシンなどが例示でき、本発明のリン脂質の製造方法に用いる場合は、それらの群より選ばれる少なくとも１種を用いることができる。

　前記のアミノ酸が３残基以下のペプチドとは、アミノ酸同士がアミド結合により主に２量体または３量体になったものを指し、アミノ酸から合成したものであるか、タンパク質を酵素などにより分解したものであるかは問わないが、グリセリンに対する溶解度が比較的高いことからグリシン、アラニン、セリンからなるペプチドであることが好ましく、グリシルグリシンなどが例示できる。このように、アミノ酸残基が少ないペプチドを用いることで、グリセリンに溶解した際に高いモル濃度が得られ、効率的にホスホリパーゼＡ２を活性化できる場合がある。

　前記カルシウム源は、上述のように、ホスホリパーゼＡ２を活性化させるために使用するが、反応系にカルシウムイオンとして存在し得るものであるのが好ましい。そのため、カルシウム源としては、溶解度が比較的高く、食品原料としても用いられるものが好ましい。その好適例としては上記のように、塩化カルシウムが挙げられる。

　尚、前記抗酸化剤、カルシウム源、アミノ酸、アミノ酸が３残基以下のペプチドの使用量としては、前記各目的を達成するのに適した量であればよい。但し、アミノ酸、アミノ酸が３残基以下のペプチドに関しては、リゾリン脂質１００重量部に対して１０～２０００重量部加えることが好ましく、より好ましくは５０～５００重量部である。１０重量部未満であると反応効率が悪くなる場合があり、２０００重量部を超えるとコストが不利になり、また反応効率も悪くなる場合がある。また、アミノ酸や、アミノ酸が３残基以下のペプチドは、エステル化反応系中における合計の溶解量を多くするために２種類以上を組み合わせて添加してもかまわない。

　本発明のリン脂質の製造方法の好適例の一つを以下に示す。
　まず、リゾリン脂質およびアシルドナーを、グリセリンに溶解し、ホスホリパーゼＡ２、及び必要に応じて酸化防止剤、ホスホリパーゼＡ２を活性化するためのアミノ酸やアミノ酸が３残基以下のペプチド、塩化カルシウムを加えて得られるグリセリン反応液を攪拌することによりリゾリン脂質とアシルドナーとのエステル化反応を行う。また、必要に応じ、脂肪酸の酸化防止のため、酸素を遮断して窒素雰囲気下でエステル化反応を行ってもよい。

　この際、前記エステル化反応は、ホスホリパーゼＡ２の至適温度やアシルドナーである脂肪酸の酸化等の観点から、３５℃～８０℃の温度範囲で行うことが好ましく、４５℃～７０℃の範囲で行うことがより好ましい。

　反応中はホスホリパーゼＡ２によるエステル化反応により生成する水分を除去してエステル化反応を促進するために減圧操作を行っても良い。減圧により水分を除去する場合、その条件としては、例えば、温度が３５～８０℃、１５０ｔｏｒｒ（２０ｋＰａ）以下で、１２～２４時間行えばよい。

　以上のようにしてリゾリン脂質とアシルドナーである脂肪酸のエステル化反応を行うことによりリゾリン脂質の２位に所望の脂肪酸を導入したリン脂質が生成される。尚、エステル化反応の進行は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）等により確認することができる。

　上記のようにエステル化反応を行って生成したリン脂質を含むグリセリン反応液に、ケトン溶剤を添加するか、あるいは、炭素数４以下のアルコールを添加してグリセリンの粘度を下げて抽出処理を行いやすくしてから炭化水素溶剤、ケトン溶剤およびエステル溶剤からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる溶剤を前記反応液に加えて、グリセリン層と溶剤層を形成させる。そして、溶剤層にエステル化反応により生成したリン脂質を抽出し、グリセリン層にホスホリパーゼＡ２を移行させ、目的のリン脂質を抽出することができる。この際、前記溶剤層（上層）には目的のリン脂質／リゾリン脂質、前記溶剤、アシルドナーが含まれ、前記グリセリン層（下層）には主にグリセリン、前記溶剤、ホスホリパーゼＡ２、抽出しきれなかったリン脂質／リゾリン脂質、その他添加物等が含まれる。次いで、前記溶剤層（上層）とグリセリン層（下層）とを分離（分取）する。この際、所定溶剤の添加および分離操作は、リン脂質の純度の向上と作業効率を考慮し、適宜繰り返しても良い。このようにして、目的のリン脂質をグリセリン反応液から効率的に抽出することができる。

　尚、上記のようにしてリン脂質とホスホリパーゼＡ２とを分離することが可能であるが、目的のリン脂質に付随するようにしてホスホリパーゼＡ２が溶剤層に極微量含まれる場合がある。この場合、下記に例示するような処理を行った後も、目的のリン脂質とホスホリパーゼＡ２が混在することがある。このようにホスホリパーゼＡ２が含まれていても、食品利用としては特に問題はないが、必要であれば、適宜プロテアーゼなどの分解酵素を用いるなどしてホスホリパーゼＡ２を分解、不活化しても良い。

　前記炭素数４以下のアルコールとはメタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールのことを指すが、毒性が低く食品添加物として利用できることからエタノールがより好ましい。また前記アルコールは、グリセリン１００重量部に対して１０～１５０重量部添加するのが好ましい。

　また本発明では、上記のようにして目的のリン脂質を含む分取した溶剤層（上層）から、アシルドナーである脂肪酸を除去しても良い。このように分取した上層からアシルドナーである脂肪酸を除去する方法としては特に限定はなく、ケトン溶剤、エタノール－ヘキサン混合溶剤などで脱脂する方法、シリカゲルを用いて脂肪酸を除去する方法などが例示できる。

　例えば、ケトン溶剤等を用いる方法としては、分離（分取）した上層中の前記溶剤を留去した後に別途新たにケトン溶剤等を加え、５℃以下に冷却することでリン脂質を析出させ、脂肪酸の溶解したケトン溶剤を分離除去することで、リゾリン脂質の２位に所望の脂肪酸を導入したリン脂質を得ることができる。ここで、上記溶剤留去後に加えるケトン溶剤等は、沸点が低く、留去し易く且つ食品添加物として使用できるアセトンが好ましい。

　またシリカゲルを用いて脂肪酸を除去する方法としては、上記上層を分離（分取）後に、当該上層を、シリカゲルを充填したカラムに流してリン脂質を吸着させ、脂肪酸を流出させることにより取り除き、その後カラムにメタノールなどの流出溶剤を流してシリカゲルに吸着したリン脂質を脱着させ、所望のリン脂質画分のみを分取した後、リン脂質を再結晶化することで、リゾリン脂質の２位に所望の脂肪酸を導入したリン脂質を得ることができる。

　一方、エタノール等の溶剤によりホスホリパーゼＡ２の活性が阻害されることがあるため、上記のようにして上層と下層とを分離（分取）して、下層であるグリセリン層を減圧処理し、残留する溶剤を留去することができる。これにより、ホスホリパーゼＡ２、リン脂質／リゾリン脂質の残部、その他の任意の添加物等を含むグリセリン溶液が得られる。
　その後、当該グリセリン溶液に、反応基質であるリゾリン脂質及びアシルドナーである脂肪酸を更に添加すれば、グリセリン溶液中に残存するホスホリパーゼＡ２を利用して再度のエステル化反応をさせることにより、ホスホリパーゼＡ２を再利用することができることとなる。
　この際、リゾリン脂質及びアシルドナーの添加の仕方に特に限定はなく、グリセリン溶液にリゾリン脂質とアシルドナーを同時に添加しても良いし、リゾリン脂質を添加した後にアシルドナーを添加し、あるいは、その逆であっても良い。また添加量としては、グリセリン溶液に未反応のリゾリン脂質が残留していることも考慮しながら、反応の進行度合いや抽出度合いに応じて、先に行ったエステル化反応の場合と同等となるように適宜調整すればよい。また、リゾリン脂質とアシルドナー以外の原料である、カルシウム源、アミノ酸又は／及びアミノ酸が３残基以下のペプチド、グリセリンなどについても、リン脂質を抽出することにより減少した分は、リゾリン脂質およびアシルドナーを添加する際に適宜追加することができる。また、再度のエステル化反応の条件は前述のエステル化反応の場合と同様にすればよいし、リン脂質の抽出処理も前述と同様にして行えばよい。

　このように、ホスホリパーゼＡ２が活性を維持している限り、上記のような操作を繰り返し、ホスホリパーゼＡ２を何度も繰り返し利用することで、所望のリン脂質をより低コストで生産することも可能となる。またこの時、リン脂質の生産性が低下した場合は、ホスホリパーゼＡ２、アミノ酸、アミノ酸が３残基以下のペプチドや塩化カルシウム等の任意の添加物、グリセリン等が抽出操作により一部減少していたり、ホスホリパーゼＡ２等の活性が低下していることが考えられるため、必要に応じてそれらを追加してもかまわない。また、先のエステル化反応の場合と同様に、脂肪酸の酸化防止のため、必要に応じて、抗酸化剤を添加したり、酸素を遮断して反応系を窒素雰囲気にしたりして、エステル化反応を行っても良い。

　本発明のリン脂質の製造方法は、その２位に所望の脂肪酸が導入されたリン脂質を製造する方法として好適に用いることができるが、製造過程で食用に適さない原料やクロロホルムなどの溶剤を使用せずに行うことが可能なため、特に食用リン脂質の製造に好適に用いることができる。また、このようにして得られたリン脂質、特に、その２位に高度不飽和脂肪酸が導入されたものは、高機能の食用リン脂質として好適に用いることができる。

　以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例において「部」や「％」は重量基準である。
　＜リン脂質の脂肪酸組成の測定＞
　実施例および比較例などにおいて、反応終了後、反応溶液５０μｌにクロロホルム：メタノール＝２：１（容量比）の溶媒２００μｌと飽和塩化ナトリウム溶液５００μｌとを加えて攪拌し、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して下層を抽出し、再度クロロホルム：メタノール＝２：１（容量比）の溶媒２００μｌで同様に遠心分離して下層を抽出した。リン脂質と脂肪酸を含有する前記処理を施した下層をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）で前記溶媒にて展開し、リン脂質及びリゾリン脂質画分を分取して、ナトリウムメチラートでメチルエステル化を行い、リン脂質及びリゾリン脂質に結合している脂肪酸の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィー（島津製作所製「ＧＣ－１４Ｂ」）で分析した。ガスクロマトグラフィーにおける各脂肪酸の面積％を脂肪酸の重量％とみなした。

　（実施例１）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ＬＰＣ７０」）３５ｍｇに、ＤＨＡ－５０Ｇ（日本化学飼料社製、ＤＨＡ含量：５１．８重量％）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸１０５ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）３７．５ｍｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）３７．５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」、５３Ｕ／ｍｇ）２０ｍｇを加えて０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分間減圧して水分を除去した後、０．３ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液１０μｌ、及び水３０μｌを加えて５０℃で２４時間反応させた。反応液中に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量は１３．４重量％であった。

　この反応液にエタノール１ｍｌを加え攪拌した後、ヘキサン１ｍｌで２回抽出操作を行って、定法によりヘキサン層（上層）とグリセリン層（下層）とを分離（分取）した。分離（分取）したヘキサン層（上層）とグリセリン層（下層）に含まれるリン脂質、及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量はそれぞれヘキサン層が２０．７重量％、グリセリン層が６．３重量％であった。

　分離（分取）したグリセリン層（下層）を０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１５分間減圧して溶剤を留去した。この減圧したグリセリン層（グリセリン溶液）に前記のリゾホスファチジルコリン（ＳＬＰ－ＬＰＣ７０）１８ｍｇ、前記のＤＨＡ含有脂肪酸１０５ｍｇを加えて、さらに水４０μｌを加えて５０℃で２４時間反応させた。反応液中に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量は１３．６重量％であった。

　（実施例２）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにインクロメガＤＨＡ－Ｊ４６（クローダジャパン社製、ＤＨＡ含量：４９．７重量％）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸３０ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）２５ｍｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）２５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」、５３Ｕ／ｍｇ）２０ｍｇを加えて０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分間減圧して水分を除去した後、０．３ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液１０μｌを加えて５０ｔｏｒｒ（６．７ｋＰａ）で減圧しながら５０℃で２４時間反応させた。反応液中に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量は１６．９重量％であった。

　この反応液をアセトン１ｍｌで２回抽出操作を行って、定法によりアセトン層（上層）とグリセリン層（下層）とを分離（分取）した。分離（分取）したアセトン層（上層）とグリセリン層（下層）に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量はそれぞれアセトン層が１７．６重量％、グリセリン層が１４．１重量％であった。

　分離（分取）したグリセリン層を０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１５分間減圧してアセトンを留去した。この減圧したグリセリン層（グリセリン溶液）にリゾホスファチジルコリン（ＳＬＰ－ＬＰＣ７０）３０ｍｇを添加して５０℃で３０分間攪拌して溶解させ、反応液中に含まれるリン脂質、及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量を測定した結果、４．８重量％であった。そこへＤＨＡ含有脂肪酸３０ｍｇを加えて５０ｔｏｒｒ（６．７ｋＰａ）で減圧しながら５０℃で２４時間反応させた。２４時間反応後の反応液中に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量は１１．２重量％であった。

　（実施例３）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ホワイトリゾ」）５０ｍｇにインクロメガＤＨＡ－Ｊ４６（クローダジャパン社製、ＤＨＡ含量：４９．７重量％）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸３０ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）２５ｍｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）２５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」、５３Ｕ／ｍｇ）２０ｍｇを加えて０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分間減圧して水分を除去した後、０．３ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液１０μｌを加えて５０ｔｏｒｒ（６．７ｋＰａ）で減圧しながら５０℃で２４時間反応させた。反応液中に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量は１５．３重量％であった。

　この反応液にエタノール０．５ｍｌを加え攪拌した後、ヘキサン０．５ｍｌとアセトン０．２ｍｌの混合溶剤で２回抽出操作を行って、定法によりヘキサン／アセトン層（上層）とグリセリン層（下層）とを分離（分取）した。分離（分取）したヘキサン／アセトン層（上層）とグリセリン層（下層）に含まれるリン脂質、及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量はそれぞれヘキサン／アセトン層が１８．０重量％、グリセリン層が１１．６重量％であった。

　分離（分取）したグリセリン層を０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１５分間減圧して溶剤を留去した。この減圧したグリセリン層（グリセリン溶液）にリゾホスファチジルコリン（ＳＬＰ－ホワイトリゾ）３０ｍｇを添加して５０℃で３０分間攪拌して溶解させ、反応液中に含まれるリン脂質、及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量を測定した結果、６．６重量％であった。そこへＤＨＡ含有脂肪酸３０ｍｇを加えて５０ｔｏｒｒ（６．７ｋＰａ）で減圧しながら５０℃で２４時間反応させた。２４時間反応後の反応液中に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量は１２．３重量％であった。

　（実施例４）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ホワイトリゾ」）５０ｍｇにＥＰＡ－４５Ｇ（日本化学飼料社製、ＥＰＡ含量：４５．７重量％）を定法により加水分解して調製したＥＰＡ含有脂肪酸３０ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）２５ｍｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）２５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」、５３Ｕ／ｍｇ）２０ｍｇを加えて０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分間減圧して水分を除去した後、０．３ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液１０μｌを加えて５０ｔｏｒｒ（６．７ｋＰａ）で減圧しながら５０℃で２４時間反応させた。反応液中に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中のＥＰＡ含量は１９．５重量％であった。

　この反応液にエタノール０．２５ｍｌを加え攪拌した後、酢酸エチル０．７５ｍｌで２回抽出操作を行って、定法により酢酸エチル層（上層）とグリセリン層（下層）とを分離（分取）した。分離（分取）した酢酸エチル層とグリセリン層に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＥＰＡ含量はそれぞれ酢酸エチル層が２２．１重量％、グリセリン層が１７．８重量％であった。

　分離（分取）したグリセリン層を０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１５分間減圧して溶剤を留去した。この減圧したグリセリン層（グリセリン溶液）にリゾホスファチジルコリン（ＳＬＰ－ホワイトリゾ）３６ｍｇを添加して５０℃で３０分間攪拌して溶解させ、反応液中に含まれるリン脂質、及びリゾリン脂質中のＥＰＡ含量を測定した結果、１１．２重量％であった。そこへＥＰＡ含有脂肪酸３０ｍｇを加えて５０ｔｏｒｒ（６．７ｋＰａ）で減圧しながら５０℃で２４時間反応させた。２４時間反応後の反応液中に含まれるリン脂質及びリゾリン脂質中のＥＰＡ含量は１６．３重量％であった。

（実施例５）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ホワイトリゾ」）７．５ｇにインクロメガＤＨＡ－Ｊ４６（クローダジャパン社製、ＤＨＡ含量：４９．７重量％）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸３ｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１００ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）３ｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）３ｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」、５３Ｕ／ｍｇ）３ｇを加え、２ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液０．５ｍｌを加えて、３ｔｏｒｒ（０．４０ｋＰａ）の減圧下、５０℃で２４時間反応させた。

　この反応液にエタノール５０ｍｌを加え攪拌し、ヘキサン５０ｍｌで２回抽出操作を行って、定法によりヘキサン層（上層）とグリセリン層（下層）とを分離（分取）した。分離したヘキサン層（上層）の溶剤を留去し、アセトン５０ｍｌを加えて０℃で１時間冷却して目的のリン脂質を沈殿物として６．３ｇ得た。このリン脂質中の脂肪酸組成のうち、ＤＨＡ含量は１７．０重量％であった。分離したグリセリン層（下層）に含まれるリン脂質、及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は８．３重量％であった。

　分離したグリセリン層にリゾホスファチジルコリン（ＳＬＰ－ホワイトリゾ）５．５ｇ、ＤＨＡ含有脂肪酸（インクロメガＤＨＡ－Ｊ４６）３ｇを加えてグリセリン層を１００ｔｏｒｒ（１３ｋＰａ）で３０分攪拌して溶剤を留去し、３ｔｏｒｒ（０．４０ｋＰａ）で減圧しながら５０℃で２４時間反応させた。反応終了後、前記と同様にして、エタノール及びヘキサンで抽出し、アセトンで精製して、目的のリン脂質を６．０ｇ得た。このリン脂質中の脂肪酸組成のうちＤＨＡ含量は１５．８重量％であった。

　上記のようにして、ホスホリパーゼＡ２を再利用して、リン脂質の２位に任意の脂肪酸を結合させたリン脂質を製造することが可能であることが示された。以下では、各種のアミノ酸、アミノ酸が３残基以下のペプチド等を用い、１回目のエステル化反応のみを行った結果を参考例として示す。
　下記に示すように、各種のアミノ酸、アミノ酸が３残基以下のペプチド等を用いることで、所望のリン脂質を効率よく製造することが可能であることが分かる。従って、これらを用いてホスホリパーゼＡ２を再利用した場合も、所望のリン脂質の効率の良い製造が期待できる。

　（参考例１）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ＬＰＣ７０Ｈ」）３５ｍｇにオレイン酸（東京化成工業社製）９７ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（和光純薬工業社製）５０ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（ノボザイムズジャパン社製「レシターゼ１００Ｓ」、１３０Ｕ／ｍｇ）１０ｍｇと１．０ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液２．５μｌを加えて６０℃で２４時間反応させ、オレイン酸が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、オレイン酸含量は３９．２重量％であった。

　（参考例２）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにＤＨＡ（東京化成工業社製）１１３ｍｇ、グリセリン（和光純薬工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（和光純薬工業社製）５０ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（ノボザイムズジャパン社製「レシターゼ１００Ｓ」、１３０Ｕ／ｍｇ）１０ｍｇと１．０ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（和光純薬工業社製）溶液２．５μｌを加え、さらに抗酸化剤としてジブチルヒドロキシトルエン３ｍｇ（和光純薬工業社製）を加えて６０℃で４８時間反応させ、高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は３４．２重量％であった。

　（参考例３）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製ＳＬＰ－ＬＰＣ７０）３５ｍｇにＤＨＡ（東京化成工業社製）１１３ｍｇ、グリセリン（和光純薬工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシルグリシン（和光純薬工業社製）６０ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製、粉末リゾナーゼ、５３Ｕ／ｍｇ）２０ｍｇと１．２ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（和光純薬工業社製）溶液２．５μｌを加え、さらに抗酸化剤としてカテキンを含有するサンカトールＮＯ１（太陽化学社製）３ｍｇ、及びアスコルビン酸３ｍｇ（和光純薬工業社製）を加えて６０℃で４８時間反応させ、高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は３０．７重量％であった。

　（参考例４）
　ＤＨＡ１１３ｍｇの代わりにＥＰＡ（ナカライテスク社製）１０４ｍｇを用い、さらにグリシルグリシン６０ｍｇの代わりにグリシン６０ｍｇを用いた以外は実施例２と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＥＰＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＥＰＡ含量は２８．５重量％であった。

　（参考例５）
　ＤＨＡ１１３ｍｇの代わりにアラキドン酸（シグマアルドリッチジャパン社製）１０３ｍｇを用い、さらにグリシルグリシン６０ｍｇの代わりにグリシン４０ｍｇを用いた以外は実施例２と同様にして高度不飽和脂肪酸（アラキドン酸）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、アラキドン酸含量は３２．３重量％であった。

　（参考例６）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにＤＨＡ－５０Ｇ（日本化学飼料社製、ＤＨＡ５１．８重量％含有）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸１０５ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）７５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」）２０ｍｇを加えて０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分減圧して水分を除去した後、０．３ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液１０μｌを加えて６０℃で４８時間反応させ、高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は１５．５重量％であった。

　（参考例７）
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにＤＨＡ－５０Ｇ（日本化学飼料社製、ＤＨＡ５１．８重量％含有）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸１０５ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）３７．５ｍｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）３７．５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」）２０ｍｇを加えて０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分減圧して水分を除去した後、０．３ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液１０μｌを加えて６０℃で４８時間反応させ、高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質（ホスファチジルコリン）を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は１７．２重量％であった。

　（参考例８）　ホスファチジルコリン純度向上用リン脂質含有エステル化反応溶液の作製
　リゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ－ＬＰＣ７０」）３５ｍｇにＤＨＡ－５０Ｇ（日本化学飼料社製、ＤＨＡ５１．８重量％含有）を定法により加水分解して調製したＤＨＡ含有脂肪酸３０ｍｇ、グリセリン（阪本薬品工業社製）１ｇを加えて、さらにグリシン（昭和電工社製）３７．５ｍｇとアラニン（武蔵野化学研究所社製）３７．５ｍｇを加えた。さらにホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「粉末リゾナーゼ」）２０ｍｇを加え、さらに０．５ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム（富田製薬社製）溶液６μｌを加え、０．６ｔｏｒｒ（８０Ｐａ）で１０分減圧して水分を除去し、５０℃で２４時間反応させ、ホスファチジルコリン純度向上用のリン脂質含有エステル化反応溶液を得た。該反応液中に含まれるリン脂質、及びリゾリン脂質中のＤＨＡ含量は１５．３重量％であった。

　（比較対照例１）
　グリシンを用いなかった以外は参考例１と同様にしてオレイン酸が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、オレイン酸含量は１９．４重量％であった。

　（比較対照例２）
　グリシルグリシンを用いなかった以外は参考例３と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は１２．９重量％であった。

　（比較対照例３）
　グリシンを用いず、水を６０μｌ加えた以外は参考例４と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＥＰＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質の及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＥＰＡ含量は８．９重量％であった。

　（比較対照例４）
　グリシンを用いなかった以外は参考例５と同様にして高度不飽和脂肪酸（アラキドン酸）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、アラキドン酸含量は５．５重量％であった。

　（比較対照例５）
　グリシンを用いなかったこと以外は参考例６と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質の、及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は４．４重量％であった。

　（比較対照例６）
　グリシン及びアラニンを用いなかったこと以外は参考例８と同様にして高度不飽和脂肪酸（ＤＨＡ）が２位に結合したリン脂質を得た。得られたリン脂質の、及びリゾリン脂質中の脂肪酸組成において、ＤＨＡ含量は７．６重量％であった。

Claims

　グリセリン中でのホスホリパーゼＡ２によるリゾリン脂質とアシルドナーとのエステル化反応によりリン脂質を生成させた後、グリセリンと混和しない溶剤を添加してグリセリン層と溶剤層を形成させて、前記リン脂質を前記溶剤層に抽出し、ホスホリパーゼＡ２を前記グリセリン層に移行させ、その後分取したグリセリン層から残留溶剤を留去したグリセリン溶液にリゾリン脂質及びアシルドナーを更に添加することにより、前記グリセリン溶液に残存するホスホリパーゼＡ２を利用して再度のエステル化反応を行うことを特徴とするリン脂質の製造方法。
　グリセリンと混和しない溶剤として、ケトン溶剤を添加する請求項１に記載のリン脂質の製造方法。
　エステル化反応後に炭素数４以下のアルコールを加えてから、グリセリンと混和しない溶剤として、炭化水素溶剤、ケトン溶剤及びエステル溶剤からなる群から選ばれる少なくとも１種からなる溶剤を添加する請求項１に記載のリン脂質の製造方法。
　前記エステル化反応において、当該反応系にアミノ酸及び／又はアミノ酸が３残基以下のペプチドを添加する請求項１～３の何れかに記載のリン脂質の製造方法。
　前記アミノ酸が、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項４に記載のリン脂質の製造方法。
　前記ペプチドが、グリシン、アラニン、セリンの組み合わせからなる請求項４又は５に記載のリン脂質の製造方法。