KR20220102807A - 무용매 조건 하에서 고정화 효소를 이용한 에틸헥실 지방산 에스터의 합성방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무용매 조건 하에서 고정화 효소를 이용한 에틸헥실 지방산 에스터의 합성방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 (1) 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol) 및 지방산을 혼합한 기질을 준비하는 단계; 및 (2) 소수성 담체에 고정화된 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 자체고정화 리파아제를 상기 기질에 첨가하고 에스테르 반응시켜 에틸헥실 지방산 에스터를 합성하는 단계를 포함하는 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법에 관한 것이다.

Description

무용매 조건 하에서 고정화 효소를 이용한 에틸헥실 지방산 에스터의 합성방법{Synthetic method of 2-ethylhexyl fatty esters in a solvent-free system using immobilized enzyme}

본 발명은 무용매 조건 하에서 고정화 효소를 이용한 에틸헥실 지방산 에스터의 최적의 합성방법에 관한 것이다.

인간 피부의 최상층에는 일정량의 물이 있어야 한다. 표면 피부에 수분이 부족하면 피부가 갈라지고 벗겨져 피부 세포 사이에 열린 공간이 생긴다. 이로 인해 아토피, 습진, 건선 등과 같은 질병이 발생한다. 보습제로도 알려진 연화제는 이러한 질병에서 중요한 역할을 한다. 피부에 기름을 공급하고, 수분 증발을 방지하며 보습 층을 형성하고, 피부 사이에 침투하여 피부의 움직임을 부드럽게 한다.

피부 연화제는 화장품 성분인 정제수 다음으로 가장 많이 사용되며, 기름 등 물과 섞이지 않는 성분이다. 오늘날 사용되는 석유계 오일과 같은 대부분의 연화제는 화학 공정을 통해 제조된다. 그러나 이제 소비자들은 단순히 화장품 성분으로서 화학물질을 배제하고 천연자원을 사용하는 것뿐만 아니라 자원 재활용 및 지속 가능성과 같은 환경 보호에 대한 관심이 증가하면서 이러한 제품의 개발을 요구하고 있다.

한편, 연화제로 가장 널리 사용되고 있는 것 중의 하나가 2­EHFE(2­ethylhexyl fatty esters)이며, 2­EHFE에는 2­EHP(2-ethylhexyl palmitate) 및 2­EHC(2-ethylhexyl cocoate)가 포함되어 있고, 이들은 투명한 액체 물질이며, 무독성 물질이다. 이 두 물질은 미국 비영리 환경 단체인 EWG와 미국 화장품 성분 검토위원회에서 승인 및 안정성이 입증되었고, 다양한 화장품 및 퍼스널 케어 제품의 제형에 사용된다.

그러나 이들 물질을 합성하는 현재의 기술은 이산화탄소 배출, 폐기물 생성 및 합성비용이 많이 드는 문제점이 있어 친환경적이면서 합성비용을 줄일 수 있고, 합성 수율을 증진시킬 수 있는 새로운 합성 기술의 개발이 필요하다.

한국공개특허 10-2020-0102361 한국공개특허 10-2019-0125826

따라서 본 발명의 목적은 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법을 제공하는 것으로, (1) 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol) 및 지방산을 혼합한 기질을 준비하는 단계; 및 (2) 소수성 담체에 고정화된 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 자체고정화 리파아제를 상기 기질에 첨가하고 에스테르 반응시켜 에틸헥실 지방산 에스터를 합성하는 단계를 포함하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법을 제공하는 것이다.

그러므로 본 발명은, (1) 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol) 및 지방산을 혼합한 기질을 준비하는 단계; 및 (2) 소수성 담체에 고정화된 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 자체고정화 리파아제를 상기 기질에 첨가하고 에스테르 반응시켜 에틸헥실 지방산 에스터를 합성하는 단계를 포함하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지방산은 팔미트산(palmitic acid) 또는 코코넛 오일의 지방산일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코코넛 오일의 지방산은 코코넛 오일의 가수분해 지방산으로, 카프릴산(Caprylic acid), 카프릭산(capric acid), 라우릭산(Lauric acid), 미리스틱산( Myristic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 스테아릭산(Stearic acid), 올레익산(Oleic acid) 및 리놀렌산(Linoleic acid)을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계에서 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol)과 지방산은 1:1 내지 2:1의 몰비율로 혼합하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계의 리파아제의 양은 상기 기질의 무게 기준 2~3 중량%일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 지방산이 팔미트산(palmitic acid)인 경우, 상기 에틸헥실 지방산 에스터는 2-에틸헥실팔미테이트(2-ethylhexyl palmitate)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 지방산이 코코넛 오일의 지방산인 경우, 상기 에틸헥실 지방산 에스터는 2-에틸헥실코코에이트(2-ethylhexyl cocoate)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계의 에스테르 반응은 30~65℃에서 3~7시간 동안 반응시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 지방산이 팔미트산(palmitic acid)인 경우, 상기 (2) 단계의 에스테르 반응은 55℃에서 1시간 반응 후, 45℃에서 5시간 동안 반응시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 지방산이 코코넛 오일의 지방산인 경우, 상기 (2) 단계의 에스테르 반응은 50℃에서 1시간 반응 후, 30℃에서 5시간 동안 반응시키는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 에틸헥실 지방산 에스터의 합성방법은 무용매 하에서 소수성 담체로 고정화된 자체고정화 리파아제를 이용한 에스테르 반응에 의해 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol) 및 지방산으로부터 에틸헥실 지방산 에스터를 효과적으로 합성할 수 있다. 특히 본 발명에서는 에틸헥실 지방산 에스터를 높은 합성 전환율로 제조할 수 있는 조건을 규명함에 따라 수득률 증가, 반응시간 단축, 저렴한 생산단가의 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 효소 종류에 따른 2­EHP의 합성 전환율을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 자체고정화효소의 첨가량에 따른 2­EHP의 합성 전환율을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 반응 온도에 따른 2­EHP의 합성 전환율을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 반응 온도의 단계적 감소 변화에 따른 2­EHP의 합성 전환율을 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 효소 종류에 따른 2­EHC의 합성 전환율을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서 자체고정화효소의 첨가량에 따른 2­EHC의 합성 전환율을 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에서 반응 온도에 따른 2­EHC의 합성 전환율을 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에서 반응 온도의 단계적 감소 변화에 따른 2­EHC의 합성 전환율을 분석한 결과이다.

본 발명은 에틸헥실 지방산 에스터를 높은 수율로 합성할 수 있는 최적의 제조방법을 제공함에 특징이 있다.

구체적으로 본 발명은 (1) 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol) 및 지방산을 혼합한 기질을 준비하는 단계; 및 (2) 소수성 담체에 고정화된 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 자체고정화 리파아제를 상기 기질에 첨가하고 에스테르 반응시켜 에틸헥실 지방산 에스터를 합성하는 단계를 포함하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법을 제공함에 특징이 있다.

본 발명의 에틸헥실 지방산 에스터의 합성은 무용매 조건 하에서 수행함으로써 유기용매를 이용한 반응보다 친환경적이면서 높은 수율로 반응 생성물을 얻을 수 있는 효과적인 방법이다.

한편, 유기용매는 휘발성과 발화성이 높고 환경에 유해하다. 에틸헥실 지방산 에스터의 합성에서 효소를 이용한 합성 시 유기용매는 기질의 반응 온도를 낮출 수 있지만 효소 활성을 저해하는 문제점이 있으며, 반응 후 유기용매를 제거해야 하는 별도의 제거 공정이 필요하다. 따라서 유기용매의 사용은 그린케미칼을 추구하는 지금의 산업방향에 부합되지 않으며 화장품의 원료로서 잔류 독성을 무시할 수 없기 때문에 안전하지 못하다. 한편, 본 발명의 방법은 이러한 유기용매의 사용 없이도 자체 고정화 효소의 사용으로 비교적 낮은 온도에서도 높은 수율로 반응 생성물을 얻을 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 방법에서 상기 (1) 단계는 기질을 준비하는 단계로서, 구체적으로는 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol)과 지방산을 혼합하여 기질을 준비하는 단계이다.

여기서 상기 지방산은 식물성 유래 지방산을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 팔미트산(palmitic acid) 또는 코코넛 오일의 지방산을 사용할 수 있다.

상기 코코넛 오일의 지방산은 코코넛 오일의 가수분해 지방산으로, 카프릴산(Caprylic acid), 카프릭산(capric acid), 라우릭산(Lauric acid), 미리스틱산( Myristic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 스테아릭산(Stearic acid), 올레익산(Oleic acid) 및 리놀렌산(Linoleic acid)을 포함하는 코코넛 오일의 가수분해물일 수 있다.

상기 (1) 단계의 기질 준비가 완료되면, 다음으로, 상기 기질을 효소 하에서 에스테르 반응을 시킨다.

구체적으로 상기 (2) 단계는 자체고정화 효소 하에서 기질인 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol) 및 지방산을 에스테르 반응시키는 단계이다.

본 발명에서 ‘고정화 효소’란 소수성 담체에 리파아제를 물리적으로 흡착시킨 효소로서, 리파아제와 담체가 결합된 형태를 의미한다.

효소를 담체에 고정화시킨 고정화 효소의 사용은 유리 형태의 효소의 사용에 비해 반응 시스템의 제어가 용이하고, 효소에 의한 생성물의 오염을 최소화하면, 반응기 선택의 폭을 넓힐 수 있으므로 본 발명에서는 리파아제 효소를 소수성 담체에 고정화시킨 자체고정화 효소를 사용하였다.

본 발명에서 ‘자체고정화 효소’란 액체형태의 상업용 리파아제인 Eversa transform 2.0 (Thermomyces lanuginosus)를 효소로 하고 Lewatit VP OC 1600을 담체로 하여 자체 생산된 고정화 효소를 의미한다.

써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus)는 자낭균문이라도 불리우는 진핵생물로서 한계 생존 가능 온도가 60℃이고, 적정 생존 가능 온도가 50℃인 호열성 세균이다.

한편, 효소를 이용하여 에틸헥실 지방산 에스터를 제조하는 경우, 효소의 종류 및 반응 조건에 따라 합성물의 수율이 현저하게 달라지게 된다. 이에 본 발명자들은 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 최적 합성(제조) 조건을 확립하기 위해, 효소의 종류, 효소의 첨가량 및 에스테르 반응 시간을 각각 달리하여 에틸헥실 지방산 에스터의 합성 전환율을 비교 분석하였다.

이와 관련하여 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 사용한 자체고정화 효소(Lewatit® VP OC 1600 소수성 담체에 써모마이세스 라누지노서스 유래 Eversa® transform 2.0 리파아제를 물리적으로 흡착시킨 효소)와 상업적으로 사용되는 다른 리파아제 효소를 동일 반응 조건으로 하여 에틸헥실 지방산 에스터의 합성 전환율을 분석한 결과, 상업적으로 사용되는 다른 리파아제 효소에 비해 본 발명의 자체고정화효소를 사용한 경우, 에틸헥실 지방산 에스터의 합성 전환율이 월등히 우수한 것으로 나타났다(도 1 및 도 5 참조).

따라서 에틸헥실 지방산 에스터를 고수율로 합성하기 위해서는 본 발명의 자체고정화 효소를 선택하여 사용하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있었다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 자체고정화 효소의 첨가량을 달리하여 반응을 수행한 후, 에틸헥실 지방산 에스터의 합성 전환율을 분석하였는데, 그 결과, 2중량%로 사용한 경우가 다른 첨가량으로 사용한 경우에 비해 에틸헥실 지방산 에스터의 합성 전환율이 우수한 것으로 나타났고, 비용 효율성 측면에서도 더 우수한 것으로 나타났다.

따라서 상기 자체고정화 리파아제는 상기 기질(2-에틸헥산올 및 지방산)의 무게 기준 2~3 중량%로 첨가하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 2 중량%로 사용할 수 있다.

한편, 상기 자체고정화 리파아제를 2 중량% 미만으로 사용하게 되면 효소 촉매반응이 원활하지 못하여 에틸헥실 지방산 에스터의 합성 전환율이 낮아지는 문제가 있고, 반면 3 중량%를 초과하여 사용하여도 최대 합성 전환율이 증가하지 못하여 경제성이 떨어지는 문제점이 있다. 따라서 상기 자체고정화 리파아제는 상기 기질의 무게 기준 2~3 중량%로 사용한다.

또한, 본 발명자들은 에스테르 반응에 있어서, 반응 온도가 미치는 영향을 분석하였다. 반응온도는 반응속도 및 효소의 잔존 활성에도 영향을 미치므로 효소 반응에서 중요한 요소라 할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 (2) 단계에서의 반응은 30~65℃에서 3~7시간 동안 수행할 수 있다.

상기 반응 온도 및 반응 시간의 범위보다 낮은 온도 및 짧은 시간으로 수행하게 되면 목적하는 에틸헥실 지방산 에스터의 합성 수율이 낮아지는 문제점이 발생하며, 높은 온도 및 오랜 시간으로 수행하게 되면 효소가 변질될 수 있는 문제점이 있다.

따라서 에스테르 반응의 온도 및 시간은 상기 범위 내에서 수행하는 것이 중요하다.

또한, 에틸헥실 지방산 에스터의 합성에 미치는 기질간의 몰비율 역시 효소 반응에서 중요한 요소이다.

본 발명의 일실시예에서는 에틸헥실 지방산 에스터 합성 시 기질간의 몰비율이 미치는 영향을 측정한 결과, 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol)과 지방산의 몰비율이 1:1 내지 2:1인 것이 바람직한 것으로 확인되었고, 1:1로 사용하는 것이 가장 바람직한 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명의 일실시예에서는, 상기 기질 준비 과정에서 지방산으로 팔미트산(palmitic acid) 또는 코코넛 오일의 지방산을 이용하여 에틸헥실 지방산 에스터를 각각 합성하였는데, 팔미트산(palmitic acid)을 사용한 경우, 에틸헥실 지방산 에스터인 2-에틸헥실팔미테이트(2-ethylhexyl palmitate)가 합성되는 것을 확인하였고, 상기 지방산으로 코코넛 오일의 지방산을 사용한 경우, 2-에틸헥실코코에이트(2-ethylhexyl cocoate)가 합성되는 것을 확인하였다.

상기 지방산이 팔미트산(palmitic acid)인 경우, 상기 (2) 단계의 에스테르 반응은 55℃에서 1시간 반응 후, 45℃에서 5시간 동안 반응시키는 과정으로 수행한 경우, 다른 온도 변화 조건에서 수행한 경우에 비해 2-에틸헥실팔미테이트를 더 높은 수율로 효과적으로 제조할 수 있는 것으로 나타났다.

또한 상기 지방산이 코코넛 오일인 경우, 상기 (2) 단계의 에스테르 반응은 50℃에서 1시간 반응 후, 30℃에서 5시간 동안 반응시킨 경우, 다른 온도 변화 조건에서 수행한 경우에 비해 2-에틸헥실코코에이트를 더 높은 수율로 효과적으로 제조할 수 있는 것으로 나타났다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 실험방법>

(1) 재료

2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol)은 시그마 사(Sigma-Aldrich Co. LLC.; St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였다. 팔미트산(palmitic acid)은 99% 순도를 갖는 것으로 일신 웰스 (서울, 한국)로부터 지원받아 사용하였다. 코코넛 오일은 삼양 사(서울, 한국)로부터 지원받아 사용하였다.

효소로는 Novozyme 435(Candida antarctica에서 유래된 고정화 효소), Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei에서 유래된 고정화 효소), Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus에서 유래된 고정화 효소) 및 액상의 Eversa Transform 2.0 (Thermomyces lanuginosus에서 유래된 효소)은 노보자임(서울, 한국)으로부터 구입하여 사용하였다. 효소 고정화를 위한 담체로 사용된 Lewatit VP OC 1600은 Membrana GmbH Accurel System(Obernburg, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 또한 모든 실험에 사용된 다른 시약들은 특급 이상의 것을 사용하였다.

(2) 효소 고정화

Thermomyces lanuginosus 유래된 액상 리파아제 효소인 Eversa Transform 2.0은 물리적 흡착을 이용하여 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600에 고정화시켰다. 구체적으로, 효소 원액 120 mL와 인산 나트륨 완충액 30 mL(50 mM, pH 7.0)를 혼합하여 고정화를 위한 효소용액으로 사용하였다. 담체와 효소용액을 250 mL 삼각플라스크에 첨가하고 오비탈 쉐이커에서 교반하였다. 이때 교반속도 250 rpm, 30℃의 온도 및 17 시간의 흡착시간으로 상기 효소를 담체에 고정화시켰다. 교반과정이 완료된 후, 담체에 부착되지 않은 효소는 여과하여 제거하고 완충액 (750mL)으로 세척하였다. 이후 담체에 고정된 효소는 상온에서 약 하루 동안 건조한 후, 진공 오븐에서 12 시간 동안 40℃에서 건조 과정을 수행하여, 담체에 고정화된 자체고정화 효소(즉, 담체에 고정화된 Eversa Transform 2.0 효소)를 제조하였고, 실험에 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

(3) 수분 활성도 평형

에틸헥실 지방산 에스터 합성에 사용할 효소는 합성 반응에 첨가하기 이전에 수분활성도(Aw)가 0.5인 질산 마그네슘 포화용액이 들어있는 습도 챔버에서 최소 48 시간 이상 보관하여 수분을 일정하게 조정한 후, 사용하였다.

(4) 가스크로마토그래피를 이용한 합성물의 분석

합성물의 분석은 DB-1ht 컬럼 (15m x 0.25mm Id; J & W Scientific, Folsom, CA, USA)과 화염 이온화 검출기(FID)가 장착된 가스크로마토그래피 (model 3800; Varian, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였고, 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼을 초기 80℃에서 2 분 동안 유지하고 20℃/min의 속도로 350℃까지 상승한 후, 3 분 동안 유지하였다. 캐리어(carrier) 가스는 헬륨을 사용하였고, 컬럼 유속은 1.5 mL/min으로 하였다. Split ratio는 1:50이고, Injector 및 detector의 온도는 각각 340℃ 및 350℃로 설정하였다.

2­EHP의 합성 전환율 (%)은 아래 함수식을 이용하여 계산하였다.

또한, 2­EHC의 합성 전환율 (%)은 아래 함수식을 이용하여 계산하였다.

<실시예 1>

2-에틸헥실팔미테이트(2­EHP)의 최적의 합성조건 확립

2-에틸헥실팔미테이트(2­EHP)의 합성은 무용매 하에서 효소적 에스테르 반응에 의해 합성하였다. 사용된 고정화 효소는 각 효소를 수분 활성도 평형이 되도록 맞춰준 후, 사용하였다.

효소적 에스테르 반응은 오비탈 쉐이커(모델 Innova 3100; New Brunswick Scientific Co. Inc., New Brunswich, NJ)에서 실시하였고, 구체적인 과정은 다음과 같다. 25 mL 플라스크에 팔미트산 1.326g(0.52 mmol)과 에틸헥사놀 0.674g(0.52 mmol)을 첨가하여 총 합이 2g이 되도록 하고, 효소를 첨가한 후 250rpm 속도로 교반하면서 효소적 에스테르 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 후, 합성물의 분석을 위해 반응물 중 일부를 취해 클로로포름에 용해시키고 0.45 μm GHP Acrodisc membrane 필터 (Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)로 여과한 후 가스 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 본 발명의 2-에틸헥실팔미테이트(2­EHP)의 합성반응의 과정은 하기에 나타낸 바와 같다.

<본 발명의 방법에 따른 2­EHP의 합성과정>

<1-1> 효소 종류에 따른 2­EHP의 합성 전환율 분석

본 발명의 방법에 있어서, 2­EHP의 합성 전환율에 효소에 따른 영향이 있는지 확인하기 위해, 상기 기술된 2­EHP의 합성과정에서 효소로서 3가지 상업적으로 사용하고 있는 리파아제인 Novozyme 435, Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM와 Thermomyces lanuginosus 유래된 액상 리파아제 효소인 Eversa Transform 2.0을 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600에 고정화시킨 자체고정화효소를 각각 사용하여 에스터 반응을 수행하였다. 이때 반응의 온도는 50℃로 하였고, 팔미트산(PA) 및 2-에틸헥산올(2-EH)의 몰비율은 1:2가 되도록 하였으며, 상기 효소는 총 기질 중량 기준 2중량%가 되도록 사용하였다. 각 반응에 의해 합성된 2­EHP의 합성 전환율을 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상업적 효소들을 사용한 군에 비해 Thermomyces lanuginosus 유래된 액상 리파아제 효소인 Eversa Transform 2.0을 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600에 고정화시킨 자체고정화효소를 사용한 군이 가장 높은 합성 전환율을 보였고, 가장 빠른 반응속도 및 높은 활성도를 보였다. 구체적으로 자체고정화효소를 사용한 군은 반응 2시간에 90%의 합성 전환율을 나타내었고, 3시간 반응 시 약 96%의 매우 높은 합성 전환율을 보이는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 2­EHP의 합성에 가장 적합한 효소는 자체고정화효소라는 것을 알 수 있었다.

<1-2> 효소 첨가량에 따른 2­EHP의 합성 전환율 분석

상기 <1-1>의 실험을 통해 리파아제 효소로서 Thermomyces lanuginosus 유래된 액상 리파아제 효소인 Eversa Transform 2.0을 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600에 고정화시킨 자체고정화효소를 사용하는 것이 2­EHP을 가장 높은 합성율로 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

이에 본 발명자들은 상기 자체고정화효소의 첨가량을 달리하여 최적의 첨가량을 확인하는 실험을 수행하였다. 이를 위해 자체고정화효소의 양을 0.5, 1, 2 및 3 중량%(총 기질 중량 기준)으로 사용하여 에스터 반응을 수행하였고, 2­EHP의 합성 전환율을 분석하였다. 이때, PA 및 2­EH의 몰비율은 1:1로 하였고, 50^oC의 온도에서 반응시간은 6시간으로 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 자체고정화 효소를 3 중량%로 사용한 군에서의 초기 반응속도가 가장 빠른 것으로 나타났으나, 최대 전환율(%)에서는 2중량% 및 3중량% 사용 군 모두에서 큰 차이를 보여주지 않았으며 약 93%의 전환율을 나타내는 효소량 2 중량%가 경제적인 측면에서 최적의 효소량임을 알 수 있었다. 한편, 3중량%를 초과하여 사용한 5중량% 사용 군에서는 2중량% 사용 군에 비해 반응 5시간 이후 합성 전환율이 오히려 감소하는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해, 2­EHP의 합성을 위해 자체고정화 효소를 2 중량%로 사용하는 것이 가장 효과적임을 알 수 있었고, 나아가 이는 종래 사용되는 다른 종류의 효소 첨가량에 비해 매우 적은 양으로 높은 합성 전환율을 보이는 것임을 알 수 있었다.

<1-3> 반응 온도에 따른 2­EHP의 합성 전환율 분석

이번에는 반응 온도가 2­EHP의 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 에스터 반응 조건을 각각 달리하여 2­EHP의 합성을 수행하였다. 구체적인 조건은 반응온도를 35, 45, 55 및 65℃로 각각 달리하고, Palmitic acid 및 2­Ethyl hexanol의 몰비율은 1:1, 효소량은 2 중량%(총 기질 중량 기준)로 하여 반응을 수행하였다. 여기서 상기 효소는 본 발명의 자체고정화효소를 사용하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 반응 온도가 높아질수록 반응속도가 증가하는 것으로 나타났으며, 65℃에서의 반응 속도는 55℃보다 높은 것으로 나타났으나, 2­EHP의 합성 전환율을 살펴보면 55 및 65℃ 모두에서 거의 동일하게 6 시간 후에는 평형 상태에 도달한 것으로 나타났고 최대 전환율도 유사한 것으로 나타났다. 따라서 에너지 효율과 효소의 잔존 활성을 고려할 때, 55℃의 온도가 2­EHP 합성에 가장 적합한 온도임을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 상기 결과를 토대로 반응 온도 변화를 통해 가장 효율적인 반응 조건을 더 구체화하는 과정을 수행하였다. 2­Ethyl hexanol는 Palmitic acid의 용매 역할을 하지만 Palmitic acid의 높은 융점으로 인해 최소 55℃에서 시작해야 한다. 그러나 반응이 진행됨에 따라 Palmitic acid의 감소와 융점이 낮은 생성물, 즉 2­EHP의 양의 증가로 반응 온도를 낮출 수 있다고 판단하여, 2­EHP의 합성을 위한 반응 온도의 단계적 감소 조건을 확인하기로 하였다.

이를 위해, 반응 초기에는 55℃의 온도로 시작하여 1 시간 반응 후, 온도를 각각 45℃와 35℃로 낮추어 5시간의 나머지 반응을 수행하고, 각 반응에 따른 합성 전환율을 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 1 시간 반응 후, 45℃에서 반응을 수행한 군이 6 시간 동안 55℃로 반응을 수행한 군과 합성 전환율은 거의 동일한 수준으로 확인되었다. 한편, 1시간 반응 후, 35℃로 낮춰 수행한 군은 합성 전환율이 크게 감소한 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해, 온도의 단계적 감소를 수행하는 것이 에너지 절감 차원에서 효과적이라는 것을 알 수 있었고, 특히 55℃에서 1 시간 동안 반응하고 이후 나머지 5시간을 45℃에서 반응할 경우, 90% 이상의 2­EHP의 합성 전환율을 가지면서 동시에 에너지 절감 효과도 함께 도출할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 2>

2-에틸헥실코코에이트(2­EHC)의 최적의 합성조건 확립

2-에틸헥실코코에이트(2­EHC)의 합성은 무용매 하에서 효소적 에스테르 반응에 의해 합성하였다. 사용된 고정화 효소는 각 효소를 수분 활성도 평형이 되도록 맞춰준 후, 사용하였다. 효소적 에스테르 반응은 상기 실시예 1의 2-에틸헥실팔미테이트(2­EHP)의 합성반응과 동일하게 수행하되, 팔미트산 대신 코코넛 오일을 지방산으로 가수분해한 가수분해물을 사용하였다. 구체적으로, 2­EHC 합성에 앞서 코코넛 오일은 기질로 사용하기 위해 화학적 가수분해를 통해 지방산으로 전환하였다.

코코넛 오일의 가수분해를 보다 구체적으로 설명하면, 2-EHC 합성에 앞서 코코넛 오일은 먼저 기질로 사용하기 위해 FA(가수 분해된 코코넛 오일의 지방산)로 전환되었다. 코코넛 오일 (150g)에 NaOH (60g)가 용해된 증류수 (150mL)와 에탄올 (99 %, 200mL)을 첨가하였다. 혼합물을 300 ^oC 이상의 열을 가하면서 1 시간 동안 280 rpm으로 교반하면서 환류 냉각시켰다. 비누화 반응 후, 반응 혼합물을 2L 분별 깔때기로 옮겼다. 증류수 (300mL) 및 6N HCl (180mL)을 분리 깔때기에 첨가하여 잔류 Na를 회수하고 유리 지방산을 분리하였다. 그리고 발생된 가스를 제거하면서 분액 깔때기를 격렬하게 흔들었다. 두 층이 분리되었을 때 하층 (HCl, 증류수 포함)은 버리고, FA가 함유된 상층에 n-헥산 (750mL)과 증류수 (300mL)를 첨가한 후 가스를 제거하면서 분리 깔때기를 세게 흔들었다. 다시 하층을 버리고 증류수 (150mL)를 첨가하여 잔류 HCl을 제거하기 위해 위의 과정을 두 번 반복 수행하였다. 지방산이 추출된 상층 (n- 헥산 층)은 최종적으로 무수 황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하였다. 추출에 사용된 n- 헥산은 45 ^oC에서 회전식 진공 농축기(N-N series, Eyela, Japan)를 사용하여 제거하였다. 그리고 지방산에 남아있는 용매는 70 ^oC의 수조에서 질소 플러싱을 통해 완전히 제거하였고, 이러한 과정을 통해 가수 분해된 코코넛 오일의 지방산(FA)을 수득하였다.

가수분해 된 코코넛 오일의 지방산 조성은 하기 표 1에 나타내었고, 2­EHC의 합성반응 과정은 하기 반응 모식도로 나타낸 바와 같다.

<본 발명의 방법에 따른 2­EHC 합성과정>

<2-1> 효소 종류에 따른 2­EHC의 합성 전환율 분석

2­EHC의 합성 전환율에 효소의 종류가 미치는 영향이 있는지 확인하기 위해, 3가지 상업적으로 사용하고 있는 리파아제인 Novozyme 435, Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM와 Thermomyces lanuginosus 유래된 액상 리파아제 효소인 Eversa Transform 2.0을 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600에 고정화시킨 자체고정화효소를 각각 사용하여 에스터 반응을 수행하였다. 이때 반응의 온도는 50℃로 하였고, 코코넛 오일 가수분해물(FA) 및 2-에틸헥산올(2-EH)의 몰비율은 1:1이 되도록 하였으며, 상기 효소는 총 기질 중량 기준 2중량%가 되도록 사용하였다. 각 반응에 의해 합성된 2­EHC의 합성 전환율을 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상업적 효소들을 사용한 군에 비해 Thermomyces lanuginosus 유래된 액상 리파아제 효소인 Eversa Transform 2.0을 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600에 고정화시킨 자체고정화효소를 사용한 군이 월등히 높은 2­EHC 합성 전환율을 보였고, 가장 빠른 반응속도 및 높은 활성도를 보였다. 구체적으로 자체고정화효소를 사용한 군은 반응 4시간 안에 약 94%의 높은 합성 전환율을 나타내었다. 반면, Novozyme 435 및 Lipozyme RM IM 효소를 사용한 군은 각각 약 71% 및 40%의 최대 전환율을 보였다.

따라서 이러한 결과를 통해 2­EHC의 합성에 가장 적합한 효소는 자체고정화효소라는 것을 알 수 있었으며 특정 효소를 선택하여 사용하는 것이 2­EHC을 높은 수율로 수득하는데 중요한 요소임을 알 수 있었다.

<2-2> 효소 첨가량에 따른 2­EHC의 합성 전환율 분석

상기 <2-1>의 실험을 통해 리파아제 효소로서 Thermomyces lanuginosus 유래된 액상 리파아제 효소인 Eversa Transform 2.0을 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600에 고정화시킨 자체고정화효소를 사용하는 것이 2­EHC를 가장 높은 합성율로 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

이에 본 발명자들은 상기 자체고정화효소에 대한 최적의 첨가량을 확인하는 실험을 수행하였다. 이를 위해 자체고정화효소의 양을 0.5, 1, 2 및 3 중량%(총 기질 중량 기준)으로 사용하여 에스터 반응을 수행하였고, 2­EHC의 합성 전환율을 분석하였다. 이때, 코코넛 오일의 가수분해물 및 2­EH의 몰비율은 1:1로 하였고, 50^oC의 온도에서 250rpm의 교반속도로 6시간 반응시간으로 수행하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 자체고정화 효소를 3 중량%로 사용한 군에서의 초기 반응속도가 가장 빠른 것으로 나타났으나, 최대 전환율(%)에서는 2중량% 및 3중량% 사용 군 모두에서 큰 차이를 보여주지 않았다. 평형에 도달하기 위한 반응 시간도 4 시간으로 동일하였고, 효소량 2% 및 3%의 사용군에서 최대 전환율이 각각 94%와 95%로 거의 유사하게 나타났다.

한편, 3중량%를 초과하여 사용한 5중량% 사용 군에서는 2중량% 및 3중량% 사용 군에 비해 합성 전환율이 오히려 감소하는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해, 2­EHC의 합성을 위해 자체고정화 효소를 2 중량%로 사용하는 것이 가장 효과적임을 알 수 있었고, 나아가 이는 종래 사용되는 다른 종류의 효소 첨가량에 비해 매우 적은 양으로 높은 합성 전환율을 보이는 것임을 알 수 있었다.

<2-3> 반응 온도에 따른 2­EHC의 합성 전환율 분석

이번에는 반응 온도가 2­EHC의 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 에스터 반응 조건을 각각 달리하여 2­EHC의 합성을 수행하였다. 구체적인 조건은 반응온도를 30, 40, 50 및 60℃로 각각 달리하고, 코코넛 오일의 지방산 및 2­EH의 몰비율은 1:1, 효소량은 2 중량%(총 기질 중량 기준)로 하여 반응을 수행하였다. 여기서 상기 효소는 본 발명의 자체고정화효소를 사용하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 반응 온도가 높아질수록 반응속도가 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 30℃에서 60℃로 온도가 증가함에 따라 초기 2시간의 반응속도가 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 3시간 이후부터는 50℃와 60℃사이에 반응속도는 큰 차이를 보이지 않았고, 최대 합성 전환율도 50℃에서는 약 94%, 60℃에서는 약 95%로 거의 차이가 없는 것으로 나타났다.

따라서 에너지 효율과 효소의 잔존 활성을 고려할 때, 50℃의 온도가2­EHC 합성에 가장 적합한 온도임을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 상기 결과를 토대로 반응 온도 변화를 통해 가장 효율적인 반응 조건을 더 구체화하는 과정을 수행하였다. 이를 위해, 반응 초기에는 50℃의 온도로 시작하여 1 시간 반응 후, 온도를 각각 40℃, 30℃ 및 20℃로 낮추고 5시간의 나머지 반응을 수행한 다음, 각 반응에 따른 2­EHC의 합성 전환율을 분석하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 50℃에서 1 시간 반응 후, 40℃ 및 30 ℃에서 각각 5 시간 반응한 경우, 50℃에서 6 시간 반응한 경우와 매우 유사한 결과를 보였다. 온도의 단계적 감소에서 40℃와 30℃로 낮춘 반응은 약 92 %의 전환율을 보였고, 50℃에서 수행 된 반응은 약 93%의 전환율을 보여 그 차이가 미비함을 알 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해, 온도의 단계적 감소를 수행하는 것이 에너지 절감 차원에서 효과적이라는 것을 알 수 있었고, 특히 50℃에서 1 시간 동안 반응하고 이후 나머지 5시간을 30℃에서 반응할 경우, 90% 이상의 2­EHC의 합성 전환율을 가지면서 동시에 에너지 절감 효과도 도출할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

1. (1) 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol) 및 지방산을 혼합한 기질을 준비하는 단계; 및
   (2) 소수성 담체에 고정화된 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 자체고정화 리파아제를 상기 기질에 첨가하고 에스테르 반응시켜 에틸헥실 지방산 에스터를 합성하는 단계를 포함하는,
   무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 지방산은 팔미트산(palmitic acid) 또는 코코넛 오일의 지방산인 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 코코넛 오일의 지방산은 코코넛 오일의 가수분해 지방산으로, 카프릴산(Caprylic acid), 카프릭산(capric acid), 라우릭산(Lauric acid), 미리스틱산( Myristic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 스테아릭산(Stearic acid), 올레익산(Oleic acid) 및 리놀렌산(Linoleic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 (1) 단계에서 2-에틸헥산올(2-Ethylhexanol)과 지방산은 1:1 내지 2:1의 몰비율로 혼합시키는 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 (2) 단계의 리파아제의 양은 상기 기질의 무게 기준 2~3 중량%인 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 (1) 단계의 지방산이 팔미트산(palmitic acid)인 경우, 상기 에틸헥실 지방산 에스터는 2-에틸헥실팔미테이트(2-ethylhexyl palmitate)인 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 (1) 단계의 지방산이 코코넛 오일의 지방산인 경우, 상기 에틸헥실 지방산 에스터는 2-에틸헥실코코에이트(2-ethylhexyl cocoate)인 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 (2) 단계의 에스테르 반응은 30~65℃에서 3~7시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 (1) 단계의 지방산이 팔미트산(palmitic acid)인 경우, 상기 (2) 단계의 에스테르 반응은 55℃에서 1시간 반응 후, 45℃에서 5시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 지방산이 코코넛 오일의 지방산인 경우, 상기 (2) 단계의 에스테르 반응은 50℃에서 1시간 반응 후, 30℃에서 5시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는, 무용매 하에서 에틸헥실 지방산 에스터의 제조방법.

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