KR20190125826A - 써모마이세스 라누지노서스 유래 자체 고정화 리파아제를 이용한 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조방법 - Google Patents

써모마이세스 라누지노서스 유래 자체 고정화 리파아제를 이용한 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제를 담체에 고정화시킨 것인 고정화 리파아제 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따라 신규로 제조된 고정화 리파아제를 이용하여 에스테르 반응에 의해 트리메틸올프로판과 지방산으로부터 트리메틸올프로판 트리에스테르를 효과적으로 합성할 수 있다.

Description

써모마이세스 라누지노서스 유래 자체 고정화 리파아제를 이용한 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조방법{Manufacturing method for trimethylolpropane triester-using an self-immobilized lipase from Thermomyces lanuginosus}
본 발명은 트리메틸올프로판과 지방산으로부터 효소적 에스테르 반응을 이용하여 바이오윤활유인 트리메틸올프로판 트리에스테르를 합성하는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로 써모마이세스 라누지노서스 유래 자체 고정화 리파아제를 이용한 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조방법에 관한 것이다.
환경 문제에 대한 관심이 증가함에 따라, 기존 미네랄 오일 기반의 윤활유를 대신해 생분해성, 독성이 적은 동식물성 오일을 기반으로 한 합성 바이오 윤활유(biolubricant)에 대한 관심이 증가하고 있다. 그 중 한 형태로서 폴리올과 지방산의 합성으로 만들어진 폴리올 에스테르는 윤활유로서의 적절한 물리적 특성을 지니고 있어 미네랄 오일 기반 윤활유를 대체할 수 있는 환경 친화적 바이오 윤활유의 대표적인 예로 알려져 있다.
트리메틸올프로판 트리에스테르는 트리메틸올프로판과 지방산의 합성으로 만들어지는 폴리올 에스테르 형태의 대표적인 바이오 윤활유로서, 유압유, 고온용 그리즈, 압축기용 윤활유 등으로 이용된다.
산 또는 염기촉매를 이용한 에스테르 반응을 통해 트리메틸올프로판과 지방산으로부터 트리메틸올프로판 에스테르를 합성하는 연구들이 많이 보고되어있고, 몇몇 연구에서는 효소적 에스테르 반응을 통해 트리메틸올프로판 에스테르를 합성하였다. 현재, 트리메틸올프로판 에스테르의 효소적 에스테르 반응의 반응시간 단축 및 수득률 증가 등의 요구가 있다.
본 발명은 트리메틸올프로판 트리에스테르를 효소적 에스테르 반응을 이용하여 효과적으로 합성하기 위하여 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제를 고정화하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에서는 자체 제조된 고정화 효소를 이용하여 트리메틸올프로판 트리에스테르를 합성하는 반응을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 제1 양태는 리파아제 존재 하에 트리메틸올프로판과 지방산을 기질로 하여 반응시켜 트리메틸올프로판 트리에스테르를 제조하는 방법으로서,
써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제를 담체에 물리적 흡착 방법으로 고정화하여 고정화 리파아제를 제조하는 단계(단계 1); 및
상기 고정화 리파아제를 이용하는 에스테르 반응에 의해 트리메틸올프로판과 지방산으로부터 트리메틸올프로판 트리에스테르를 합성하는 단계(단계 2);
를 포함하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 양태는 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제가 담체에 고정화된 것인 고정화 리파아제를 제공한다.
본 발명에 따라 신규로 제조된 고정화 리파아제를 이용하여 에스테르 반응에 의해 트리메틸올프로판과 지방산으로부터 트리메틸올프로판 트리에스테르를 효과적으로 합성할 수 있다.
특히, 본 발명은 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제를 Duolite A568 담체(음이온 교환수지)에 고정화시킨 고정화 리파아제를 효소적 에스테르 반응을 통한 트리메틸올프로판 에스테르 합성에 사용함으로써 반응시간 단축 및 수득률 증가에 있어서 탁월한 결과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 자체 제조된 고정화 효소는 기존의 트리메틸올프로판 트리에스터 합성 효소(예를 들어 Novozym 435)에 비해 효소 원액의 가격이 훨씬 저렴하고 담체(예를 들어 Duolite A568)의 가격 또한 더 저렴하기 때문에, 효소 생산 공정에서 가격적인 장점을 나타낼 수 있다.
도 1은 효소 매개 에스테르 반응을 이용한 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 대한 효소 선별 결과를 나타낸 그래프이다. 사용된 효소는 다음과 같다:A, Candida rugosa 유래 Lipase OF; B, Candida rugosa 유래 Lipase AYS; C, Pseudomonas fluorescens 유래 Lipase PS; D, Rhizomucor miehei 유래 Lipozyme RM IM; E, Thermomyces lanuginosus 유래 Lipozyme TL IM; F, Candida antarctica 유래 Novozym 435; 및 G, 본 연구에서 제조된 고정화 효소(효소: Thermomyces lanuginosus 유래 Lipozyme TL 100L, 담체: Duolite A568). 반응 조건: 온도 60℃, 효소량 10%(총 기질량 대비), 진공도 0.7 kPa, 트리메틸올프로판과 지방산의 몰비율 1:3, 수분활성도 (Aw) 0.33
도 2은 반응 시간에 따른 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 반응 온도가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 반응 조건: 효소량 10% (총 기질량 대비), 진공도 0.7 kPa, 트리메틸올프로판과 지방산의 몰비율 1:3, 수분활성도 (Aw) 0.33
도 3은 반응 시간에 따른 트리메틸올프로판 트리에스테르의 합성에 진공도가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 반응 조건: 온도 60℃,효소량 15%(총 기질량 대비), 트리메틸올프로판과 지방산의 몰비율 1:3, 수분활성도 (Aw) 0.33
도 4는 반응 시간에 따른 트리메틸올프로판 트리에스테르의 합성에 미치는 효소의 수분활성도의 영향을 나타낸 그래프이다. 반응 조건: 온도 60℃,효소량 15% (총 기질량 대비), 진공도 6.7 kPa 트리메틸올프로판과 지방산의 몰비율 1:3
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자들은 효소적 에스테르 반응을 통해 트리메틸올프로판 에스테르를 효율적으로 합성하는 방법에 대해 예의 연구를 수행한 결과, 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제인 Lipozyme TL 100L을 Duolite A568 담체에 물리적 흡착방식으로 고정화하여 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성을 위한 효소로 사용함으로써 반응시간 단축 및 수득률 증가에 있어서 탁월한 결과를 나타냄을 확인하였다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.
본 발명의 제1 양태는 리파아제 존재 하에 트리메틸올프로판과 지방산을 기질로 하여 반응시켜 트리메틸올프로판 트리에스테르를 제조하는 방법으로서,
써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제를 담체에 물리적 흡착 방법으로 고정화하여 고정화 리파아제를 제조하는 단계(단계 1); 및
상기 고정화 리파아제를 이용하여 에스테르 반응에 의해 트리메틸올프로판과 지방산으로부터 트리메틸올프로판 트리에스테르를 합성하는 단계(단계 2);
를 포함하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 단계 1은 고정화 리파아제를 제조하는 단계이다. 본 발명은 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제를 담체에 물리적 흡착방식으로 고정화하여 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성을 위한 신규 고정화 리파아제를 제조하였다.
본 발명에서 사용하는 리파아제는 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래인 것(상품명: Lipozyme TL 100L, Lipozyme TL IM)으로서, 바람직하게는, Lipozyme TL 100L을 사용할 수 있다.
써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus)는 자낭균문이라도 불리우는 진핵생물로서 한계 생존 가능 온도가 60℃이고, 적정 생존 가능 온도가 50℃인 호열성 세균이다.
본 명세서에서 의미하는 고정화 리파아제란 고정화 담체에 고정된 리파아제 전체를 의미하는 것으로서, 상기 리파아제와 상기 담체가 결합된 형태를 의미한다.
상기 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제는 고정화 담체에 고정화되지 않은 유리 상태에서 100,000U/g~600,000U/g, 바람직하게는 300,000U/g~500,000U/g, 더 바람직하게는 350,000U/g의 활성을 가진 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 여러 리파아제에 대한 활성 스크리닝 결과, 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제(상품명: Lipozyme TL 100L, 담체: Duolite A568)는 다른 균주 유래의 리파아제(Candida antarctica 유래 리파아제: 상품명 Novozym 435, Rhizomucor miehie 유래 리파아제: 상품명 Lipozyme RM IM, C. rugosa 유래 리파아제: 상품명 Lipase OF, 상품명 Lipase AYS, Pseudomonas fluorescens 유래 리파아제: 상품명 Lipase PS)에 비하여 기본 조건에서 현저하게 높은 트리메틸올프로판 에스테르의 전환율을 보였다. (도 1 참조)
상기 지방산은 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(stearic acid), 피놀렌산(pinolenic acid), 미리스트산(myristic acid), 카프릴산(caprylic acid) 및 카프르산(capric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
바람직하게는, 상기 지방산은 올레산, 리놀레산, 팔미트산, 스테아린산 및 미리스트산으로 구성된다.
본 발명의 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법에 있어서, 리파아제를 고정화할 수 있는 담체는 매우 중요하다. 본 발명에서 리파아제를 고정화하기 위한 고정화 담체는 음이온 교환수지로서 Duolite A568이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 단계 2의 고정화 리파아제의 양은 총 기질(트리메틸올프로판 및 지방산) 무게 기준으로 5 내지 15 중량%인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실험예에서, 고정화 리파아제의 양에 따른 트리메틸올프로판 트리에스테르의 전환율을 측정한 결과, 고정화 리파아제의 양은 총 기질 무게 기준으로 5 내지 15 중량%인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10 내지 15 중량%인 것으로 확인되었다.
반응 온도는 반응 속도 및 효소의 잔존 활성에도 영향을 미치므로 효소 반응에서 중요한 요소이다.
본 발명에서 반응 온도는 40℃ 내지 80℃일 수 있다.
본 발명의 일 실험예에서 반응 온도가 트리메틸올프로판 트리에스테르의 합성에 미치는 영향을 측정한 결과, 55℃ 내지 75℃의 온도 범위에서 반응시간 9시간 이후 95% 이상의 트리메틸올프로판 트리에스테르의 전환율을 얻을 수 있음을 확인하였다.(효소량 15%(총 기질량 대비), 진공도 6.7 kPa, 수분활성도 (Aw) 범위 0.53 ~ 0.97) (도 2 참조)
상기 반응온도가 55℃보다 낮은 경우에는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 전환율이 낮으며, 75℃보다 높은 경우에는 효소가 변질될 우려가 있다. 더욱 바람직하게는, 반응온도는 60℃ 내지 70℃이다.
상기 단계 2는 0.7 내지 40 kPa의 압력, 바람직하게는 6.7 내지 13.3 kPa의 압력에서 진행할 수 있다.
일반적으로 효소를 이용한 에스테르화 반응에서 수분은 반응에 매우 큰 영향을 주는 요인으로 알려져 있다. 트리메틸올프로판과 지방산이 반응하여 트리메틸올프로판 에스테르가 합성될 때 물이 생성되는데, 과량의 물이 생성되면 에스테르 반응의 역반응인 가수분해 반응을 촉진하여 에스테르 반응에 바람직하지 못한 영향을 준다. 따라서 본 발명에서는 반응 중 생성되는 수분을 진공을 이용하여 효과적으로 제거하였다. 그러나 너무 높은 진공은 효소 활성에 필수적인 수분까지 제거하게 되어 오히려 효소 활성을 감소시킨다. 따라서 적절한 진공은 부적절한 가수분해 반응을 막을 뿐만 아니라 효소 내 최적의 효소 활성을 유지할 수 있는 수분을 조절하는데 필수적이다.
Novozym 435 효소를 이용하여 에스테르 반응을 하는 경우 최적의 진공도는 0.2 ~ 0.7 kPa인 것으로 나타났다(Seung In Hong et al., Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2012, 114; Heejin Kim et al., Food Chemistry 237 (2017). 그러나, 본 발명의 일 실시예에서 신규 고정화 리파아제에 의한 트리메틸올프로판 에스테르의 전환율에 진공도가 미치는 영향을 측정한 결과, 최적의 진공도는 6.7 ~ 13.3 kPa인 것으로 확인되었다.(도 3 참조) 따라서, 본 발명의 제조방법은 기존 방법에 비해 더 적은 진공도 하에서 최적 반응 활성을 나타내기 때문에 감압에 의한 에너지 소모를 줄일 수 있어 경제적인 측면에서 더욱 유리하다.
상기 단계 2에서 고정화 리파아제의 수분활성도(Aw)는 0.33 내지 0.97로 조절되는 것이 바람직하다.
일반적으로 효소의 활성에 있어서 효소 내 적정량의 수분은 필수적인데, 수분의 함량이 적정량 이하이면 효소의 촉매 활성을 유지할 수 없게 된다. 반면, 과도한 수분 역시 효소 활성에 있어서 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
실험 결과, 고정화 리파아제의 수분 활성도(Aw)가 0.33 내지 0.97인 범위에서 반응 속도에 약간의 차이는 관찰되지만, 트리메틸올프로판 트리에스테르의 최대 전환율은 그 범위 안에서 모두 9시간에 약 95%로 도달함을 확인하였다.(도 4 참조)
상기 단계 2에서 트리메틸올프로판 및 지방산의 몰비율은 1:2 내지 1:5인 것이 바람직하다. 트리메틸올프로판 및 지방산의 몰비율이 1:2보다 낮으면 트리메틸올프로판 트리에스테르의 전환율이 감소하여 최대 전환율이 낮게 나타날 수 있으며, 1:5보다 크면 반응 종결 후에 과량의 지방산이 반응물에 남아있어, 지방산을 제거하기 위해 증류와 같은 공정이 추가되어야 하는 문제점이 있다.
상기 단계 2에서 반응시간은 2시간 내지 12시간, 바람직하게는 4시간 내지 9시간이며, 가장 바람직하게는 9시간이다.
본 발명의 제2 양태는 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제가 담체에 고정화된 것인 고정화 리파아제를 제공한다
상기 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제는 Lipozyme TL 100L, Lipozyme TL IM 등일 수 있으며, 바람직하게는, Lipozyme TL 100L이다.
상기 담체는 이온 교환 수지일 수 있다. 상기 이온 교환 수지는 고체 지지체를 의미하고, 상기 고체 지지체는 교환성 이온을 지닌 고정된 관능기 또는 활성부위를 운반하는 불용성 전하를 띈 고분자 담체를 포함한다.
본 발명의 적절한 이온 교환 수지의 예는 약염기 음이온 교환 수지일 수 있다.
상기 약염기 음이온 교환 수지는 Duolite A568일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
다르게는, 이온 교환 수지로, Lewatit VP OC 1600 (다공성 디비닐벤젠 가교 중합체), Accurel MP 1000 (다공성 폴리프로필렌), Amberlite XAD4 (비이온성 거대망상 수지), octyl silica (옥틸 작용기화 소수성 실리카), Amberlite XAD 7HP (비이온성 양극성 거대망상 수지), Celite 545, Zeolite (미세다공성 수지), Dowex 50w xz8 (양이온 교환수지)를 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 사상이 당업자에게 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 설명된 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.
실시예 1: 재료 및 효소 선별
재료
기질로서 팜유, 콩기름, 코코넛유, 옥수수기름, 카놀라유 또는 해바라기유 유래 지방산을 사용할 수 있으며, 바람직하게 팜유 유래 고 올레산 함유 지방산을 사용하였다. 구체적으로, 팜유 유래 고 올레산 함유 지방산의 지방산 조성은 각각 올레산 80 wt%, 리놀레산 11 wt%, 팔미트산 6 wt%, 스테아린산 2 wt%, 미리스트산 1 wt%였다. 또 다른 기질로서 트리메틸올프로판(순도 99%)은 시판되고 있는 것을 사용하였다.
리파아제로는 Thermomyces lanuginosus 유래 리파아제(Lipozyme TL 100 L 등), Lipozyme TL IM, Candida antarctica 유래 리파아제(Novozym 435 등), Rhizomucor miehie 유래 리파아제(Lipozyme RM IM 등), C. rugosa 유래 리파아제(Lipase OF 등), Pseudomonas fluorescens 유래 리파아제(Lipase PS 등), C. rugosa 유래 리파아제(Lipase AYS 등) 등을 사용하였다.
Thermomyces lanuginosus 유래 리파아제인 Lipozyme TL 100 L(액체 형태)과 Lipozyme TL IM, Candida antarctica 유래 리파아제인 Novozym 435, Rhizomucor miehie 유래 리파아제인 Lipozyme RM IM 은 Novozymes(Seoul, Republic of Korea)에서 구매하였다.
C. rugosa 유래 리파아제인 Lipase OF 는 Meito Sangyo Co., Ltd. (Tokyo, Japan)에서 구매하였다. Pseudomonas fluorescens 유래 리파아제인 Lipase PS 와 C. rugosa 유래 리파아제인 Lipase AYS 는 Amano Enzymes(Troy, VA, USA)에서 구매하였다.
담체로 사용된 Duolite A568(음이온 교환수지)은 Rohm and Haas(Chauny, France)에서 구매하였다.
효소 선별
총 7종류의 효소에 대해 트리메틸올프로판 트리에스테르합성을 위한 효소로의 가능성을 조사하였다. 본 발명에서 사용하는 고정화 효소는 액체 리파아제인 Lipozyme TL 100 L 을 Duolite A568 담체에 고정화시킨 고정화 리파아제이다.
효소 활성은 트리메틸올프로판 트리에스테르로의 전환율에 따라 결정되었다. 각각 반응 온도는 60℃, 효소량은 10% (총 기질량 대비), 진공도는 0.7 kPa, 트리메틸올프로판과 지방산의 몰비율은 1:3, 효소의 수분활성도 (Aw)는 0.33 이었다.
트리메틸올프로판과 지방산으로부터 합성된 트리메틸올프로판 트리에스테르의 전환율은 다음의 식에 의해 계산하였다.
Figure pat00001
효소 선별 실험결과인 도 1을 참조하면, 본 발명에서 제조된 고정화 효소와 Novozym 435 두가지 효소만 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 효과가 있었다. 반면, 나머지 다섯 종류의 효소는 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 전혀 효과가 없었다. Novozym 435를 이용한 반응에서, 트리메틸올프로판 트리에스테르의 최대 전환율은 9시간에 약 53%로 나타난 반면, 본 발명에서 제조된 고정화효소를 이용한 반응에서는 단 4시간만에 약 58% 정도에 도달하였고, 9시간에 95%의 최대 전환율을 나타내었다. Lipozyme TL 100L 액체효소를 이용하여 트리메틸올프로판과 지방산의 에스테르 반응에 적용한 경우에는 트리메틸올프로판 트리에스테르가 합성되지 않았다. 그러나, Lipozyme TL 100L 액체효소를 Duolite A 568 담체에 물리적 흡착 방식으로 고정화하여 만든 고정화 효소를 이용하여 동일 반응에 적용한 경우에는, 위 결과에서 보여준 것과 같이 다른 어떤 효소에 비해서도 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 뛰어난 효과를 나타내었다.
이러한 결과는 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 가장 효과적인 효소로 알려진 Novozym 435에 비해 본 발명에서 제조된 고정화 리파아제가 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 훨씬 더 효과적임을 나타낸다. 결과적으로, 본 발명에서 제조된 고정화 리파아제를 이용하여 트리메틸올프로판과 지방산 간의 에스테르 반응을 통하여 트리메틸올프로판 트리에스테르를 효율적으로 합성할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성 조건의 각 반응변수에 대한 효과를 조사하기 위한 효소로서 본 발명의 고정화 효소를 선정하였다.
실시예 2: 써모마이세스 라누지노서스 유래 고정화 리파아제의 제조
액체 효소인 Lipozyme TL 100L(120 mL)와 sodium phosphate buffer solution(30mL, 50 mM, pH 7.0)을 섞어서 초기 효소 용액을 준비하였다.
초기 효소 용액(150 mL)을 담체인 Duolite A568(15 g)과 함께 삼각플라스크에 넣은 후, 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에 장착하여 30℃에서 15시간 동안 250rpm으로 교반하여 담체에 효소를 고정화하였다.
고정화가 끝난 후 담체에 고정화된 효소를 여과 후 150 mL의 완충 용액으로 수세하여 결합되지 않은 효소를 제거하였다. 고정화 효소를 상온에서 12시간동안 건조한 후 다시 40℃ 감압 오븐에서 12시간 동안 건조한 후 사용 전까지 4℃에서 냉장보관하였다.
실시예 3: 트리메틸올프로판 트리에스테르의 합성
사용된 고정화 효소를 각 수분 활성도(Aw)에 맞는 포화염용액이 들어있는 밀봉된 용기 안에 넣어 미리 효소의 수분 활성도(Aw) 평형을 맞춰 주었다. 사용된 염은 LiCl(Aw=0.11), MgCl2(Aw=0.33), Mg(NO3)2(Aw=0.53), NaCl(Aw=0.75), K2CO4(Aw=0.97) 이다. 이 과정은 25℃에서 48시간 이상 진행하였다.
총 3 g의 트리메틸올프로판과 팜유 유래 고 올레산 함유 지방산을 1:3 (트리메틸올프로판:지방산)의 몰비율로 50 mL 이중자켓 반응기에 넣고 에스테르화 반응을 수행하였다. 반응기의 온도를 미리 써큘레이터를 이용하여 정해진 온도(60℃)로 유지시켰고, 250rpm으로 교반하였다. 초기 기질의 수분함량을 일정하게 하기 위하여 0.1 kPa에서 약 5분간 진공을 가하였다. 실시예 1에서 제조한 고정화 효소를 넣음으로써 반응을 시작하였다. 진공도는 micrometering valve (Swagelok, solon, OH, USA)로 조절하였다. 진공도의 확인에 digital vacuum gauge (Teledyne, Thaousand Oaks, CA, USA)를 사용하였다. 반응 중간 일정 시간 간격으로 10 ㎕의 샘플을 채취하여 가스 크로마토그래피로 분석하였다.
실험예 1: 시료의 분석
반응 후 합성된 트리메틸올프로판 트리에스테르의 전환율은 일정한 간격으로 채취된 샘플(10mg)을 클로로포름(1 ㎖)에 녹여 가스크로마토그래피(model 3800; Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)로 분석하였다. 검출기로는 Flame ionization detector(FID)를 사용하였고, 컬럼은 DB-1ht column(15 m Х 0.25 mm i.d.; J&W Scientific, Folsom, CA, USA)을 사용하였다.
샘플 1 ㎕를 스플릿 모드(split mode, split ratio = 50:1)로 오토샘플러(autosampler)를 통해 주입하였고, 컬럼의 온도를 150℃에서 2분간 유지시킨 후 25℃/min 의 속도로 370℃까지 상승시킨 후 370℃에서 5분간 유지되도록 하였다. 이동상으로는 헬륨을 사용하였으며 이동속도는 1.5 mL/min였다. 주입구와 검출기 온도는 모두 370℃로 유지시켰다.
이하, 본 발명에 따라 제조한 써모마이세스 라누지노서스 유래 고정화 리파아제를 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 적용시켜 에스테르화 반응의 최적 온도, 진공도, 효소의 수분활성도(Aw)를 최적화하는 연구를 수행하였다.
실험예 2: 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 대한 반응 온도의 영향
트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 반응 온도가 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 도 2에 나타냈다. 본 실험에서 조사된 온도의 범위는 40 ~ 80℃였다. 나머지 반응 조건으로 효소량은 10%(총 기질량 대비), 진공도는 0.7 kPa, 트리메틸올프로판과 지방산의 몰비율은 1:3, 효소의 수분활성도(Aw)는 0.33 이었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 반응 온도가 40℃에서 60℃로 증가함에 따라, 반응 속도와 전환율 모두 눈에 띄게 증가하였지만, 반응 온도 60℃와 70℃ 사이에서는 유의적 차이를 나타내지 않았다. 한편, 반응 온도가 70℃에서 80℃로 증가함에 따라 전환율은 급격하게 감소하였다. 일반적으로 온도의 증가는 반응물 간의 용해도를 증가시키고 점도를 낮춤으로써 효소와 기질의 상호 작용을 용이하게 하여 반응 속도를 증가시킨다. 하지만 본 발명에서는 70℃이상의 온도에서 고정화 효소는 효소 활성이 감소되는 것으로 관찰되었다. 60℃와 70℃에서 9시간에 비슷한 트리메틸올프로판 트리에스테르의 최대 전환율에 도달하였지만, 경제성과 효소의 안정성을 고려하여 60℃를 최적 온도로 선정하였다.
실험예 3: 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 대한 진공도의 영향
트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 진공도가 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 조사된 진공도 범위는 0.7 ~ 40.0 kPa 였다. 나머지 반응 조건으로 반응 온도는 60℃, 효소량은 15%(총 기질량 대비), 트리메틸올프로판과 지방산의 몰비율은 1:3, 효소의 수분활성도(Aw)는 0.33이었다.
진공도 40.0 kPa 에서, 트리메틸올프로판 트리에스테르의 최대 전환율은 12시간에 88%에 미치지 못하였다. 반면, 진공도가 40.0 kPa에서 13.3 kPa으로 증가함에 따라, 반응속도와 전환율은 유의적으로 증가하였다. 진공도가 6.7 kPa까지 더 증가함에 따라, 반응 속도와 전환율은 약간 더 증가하였다. 그러나, 진공도가 6.7 kPa 이상으로 증가하게 되면, 반응 속도는 감소하였다. 결과적으로, 진공도 0.7과 6.7 kPa 사이에서 전환율에 있어서는 유의적인 차이가 나타나지 않았기 때문에, 6.7 kPa의 진공도가 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성을 위한 최적 진공도로 선정되었다.
실험예 4: 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 대한 효소의 수분 활성도(A w )의 영향
고정화 리파아제의 초기 수분활성도(Aw)를 조사하는 것은 효소적 에스테르 반응의 효율성을 최대로 증가시키기 위한 중요한 요소이다.
트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 고정화 리파아제의 초기 수분활성도(Aw)가 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 도 4에 나타냈다. 먼저, 각 수분 활성도(Aw)에 맞는 포화염용액을 이용한 수분활성도 챔버를 이용하여 초기 고정화 리파아제의 수분을 일정하게 조절하였다. 조사된 수분 활성도(Aw) 범위는 0.11 에서 0.97 이었다. 나머지 반응 조건으로 반응 온도는 60℃, 효소량은 15%(총 기질량 대비), 트리메틸올프로판과 지방산의 몰비율은 1:3, 진공도는 6.7 kPa 이었다.
고정화 리파아제의 수분활성도(Aw)가 0.11에서 0.33으로 증가함에 따라 반응 속도와 전환율은 유의적으로 증가하였다. 수분 활성도(Aw) 0.11에서 반응 속도는 본 발명에서 조사된 다른 수분활성도(Aw)에서의 반응 속도에 비해 눈에 띄게 느린 것으로 나타났다. 이는 효소의 활성을 위해 필수적으로 필요한 최소한의 수분 부족으로 인한 결과이다.
한편, 초기 반응 시간 4시간 동안에, 수분활성도(Aw)가 0.33에서 0.75로 증가함에 따라 반응 속도는 점차적으로 증가하였다. 그러나 수분활성도(Aw)가 0.75에서 0.97로 증가하여도 전환율에 있어서 큰 효과를 나타내지 않았다. 수분 활성도(Aw) 0.53에서 0.97 사이의 범위에서 반응 속도에 약간의 차이는 관찰되었지만, 트리메틸올프로판 트리에스테르의 최대 전환율은 그 범위 안에서 모두 9시간에 약 95%로 도달하였다. 따라서 본 발명의 고정화 리파아제는 수분활성도(Aw) 범위 0.33 ~ 0.97에서 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 매우 효과적이라고 할 수 있다.
추가적으로, 고정화 리파아제의 초기 수분활성도가 0.33 보다 낮은 경우에는 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성에 있어 반응 시간이 현저하게 느려지고, 트리메틸올프로판 트리에스테르의 최대 수득률에 도달하지 못하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 고정화 효소의 초기 수분활성도를 적절하게 조절함으로써 트리메틸올프로판 트리에스테르의 최대 수득률에 도달할 수 있을 뿐만 아니라 반응 시간 단축에 효과가 있음을 확인하였다.
결론적으로, 본 발명에서 제조된 고정화 리파아제는 트리메틸올프로판 트리에스테르 합성을 위한 매우 효과적인 효소이며, 최적 조건에서 반응시간 9시간 이후 95% 이상의 트리메틸올프로판 트리에스테르의 전환율을 얻을 수 있음을 확인하였다.(반응 온도 60℃, 효소량 15%(총 기질량 대비), 진공도 6.7 kPa, 수분활성도 (Aw) 범위 0.33 ~ 0.97)

Claims (14)

  1. 리파아제 존재 하에 트리메틸올프로판과 지방산을 기질로 하여 반응시켜 트리메틸올프로판 트리에스테르를 제조하는 방법으로서,
    써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제를 담체에 물리적 흡착 방법으로 고정화하여 고정화 리파아제를 제조하는 단계(단계 1); 및
    상기 고정화 리파아제를 이용하여 에스테르 반응에 의해 트리메틸올프로판과 지방산으로부터 트리메틸올프로판 트리에스테르를 합성하는 단계(단계 2);
    를 포함하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지방산은 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(stearic acid), 피놀렌산(pinolenic acid), 미리스트산(myristic acid), 카프릴산(caprylic acid) 및 카프르산(capric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지방산은 올레산, 리놀레산, 팔미트산, 스테아린산 및 미리스트산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 담체는 약염기 음이온 교환수지인 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 담체는 Duolite A568인 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 2의 고정화 리파아제의 양은 상기 기질의 무게 기준으로 5 내지 15 중량%인 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 2의 반응 온도는 40℃ 내지 80℃인 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 2의 트리메틸올프로판과 지방산은 1:2 내지 1:5의 몰비율로 반응시키는 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단계 2는 0.7 내지 40 kPa의 압력에서 진행하는 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단계 2에서 고정화 리파아제의 수분활성도(Aw)는 0.33 내지 0.97인 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 단계 2에서 반응시간은 2 내지 12시간 인 것을 특징으로 하는 트리메틸올프로판 트리에스테르의 제조 방법.
  12. 써모마이세스 라누지노서스(Thermomyces lanuginosus) 유래 리파아제를 담체에 고정화시킨 것인 고정화 리파아제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 담체는 약염기 음이온 교환수지인 것을 특징으로 하는 고정화 리파아제.
  14. 제12항에 있어서, 상기 담체는 Duolite A568인 것을 특징으로 하는 고정화 리파아제.
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