ES2468799T3 - Procedimiento para producir fosfol�pido - Google Patents

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Yugo Iwasaki
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Abstract

Un procedimiento para producir un fosfolípido, comprendiendo el procedimiento: producir un fosfolípido mediante esterificación de un lisofosfolípido con un donante de acilo por la fosfolipasa A2 en glicerina; y entonces añadir un disolvente inmiscible con glicerina, formando una capa de glicerina y una capa de disolvente; extraer el fosfolípido en la capa de disolvente; transferir la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina; y entonces recoger la capa de glicerina; retirar el disolvente restante por evaporación de la capa de glicerina, dando una disolución de glicerina; añadir un lisofosfolípido y un donante de acilo a la disolución de glicerina; y reesterificar usando la fosfolipasa A2 restante en la disolución de glicerina.

Description

Procedimiento para producir fosfol�pido
Campo técnico
La presente invención se refiere a procedimientos para producir fosfol�pidos, y en particular se refiere a procedimientos para producir fosfol�pidos mediante fosfolipasa A2.
Antecedentes de la técnica
Estudios recientes sobre lípidos han revelado que los ácidos grasos altamente insaturados tales como ácido docosahexenoico (DHA) y ácido eicosapentenoico (EPA) tienen diversas funciones tales como la mejora de la función de aprendizaje, la prevención de arteriosclerosis y la función de mejora del metabolismo lip�dico. En particular, se ha revelado que la toma de DHA en una forma unida a un fosfol�pido tal como fosfatidilcolina proporciona una mayor actividad antioxidante y una mayor estabilidad que las de la forma de triglic�rido, as� como conduce a una buena absorción para proporcionar fácilmente las actividades fisiológicas del DHA. Se espera también que ácidos grasos funcionales distintos de DHA, tales como EPA, ácido linoleico conjugado y ácido araquid�nico, consigan mayores actividades fisiológicas por la unión a un fosfol�pido.
Los procedimientos para producir un fosfol�pido unido a un ácido graso funcional tal como DHA se clasifican en un procedimiento de extracción de un producto natural y un procedimiento de síntesis de un material tal como fosfol�pidos de soja. Los ejemplos específicos del primer procedimiento incluyen un procedimiento de extracción de un fosfol�pido unido a DHA de huevas de animales acuáticos como material (documento de patente 1) y un procedimiento de extracción de productos marinos tales como un calamar con un disolvente orgánico (documento de patente 2). Sin embargo, estos procedimientos no pueden producir fosfol�pidos unidos a ácidos grasos funcionales distintos de DHA debido a que estos materiales son caros, no pueden suministrarse establemente y la composición de fosfol�pidos depende de los materiales.
Los ejemplos de procedimientos capaces de introducir un ácido graso deseado no dependiente de la composición del material incluyen un procedimiento de adición de cualquier ácido graso a una disolución de cultivo de un microorganismo para producir un fosfol�pido unido con el ácido graso por el microorganismo (documento de patente 3). Sin embargo, el procedimiento produce el fosfol�pido en una pequeña cantidad a partir de una gran cantidad de disolución de cultivo, y por tanto la eficacia de producción es baja.
Entre los últimos procedimientos, los ejemplos de procedimiento de unión de DHA a fosfol�pidos de soja y similares incluyen un procedimiento de adición de una sustancia de alta permitividad capaz de formar enlace de hidrógeno con un sistema de reacción de lipasa y fosfolipasa (documento de patente 4). Sin embargo, el procedimiento puede conseguir una alta velocidad de reacción en la reacción de un lisofosfol�pido y un ácido graso por lipasa, pero no puede conseguir una alta velocidad de reacción por fosfolipasa A2. Además, es importante para la expresión de las actividades fisiológicas del fosfol�pido unido a DHA que el DHA est� unido en posición 2, pero un ácido graso diana se une principalmente a la posición 1 de un fosfol�pido mediante una reacción por lipasa, y por lo tanto dicho procedimiento no es muy práctico.
Al mismo tiempo, como procedimiento para unir eficazmente un ácido graso deseado con la posición 2 de un fosfol�pido, se han reseñado varios procedimientos de unión que usan fosfolipasa A2 en glicerina (documento de patente 5 y documento no de patente 1). Sin embargo, en estos informes se usa cloroformo-metanol tóxicos para extracción después de la reacción. Por tanto, el disolvente no puede usarse, dependiendo del uso pretendido del fosfol�pido, o se requiere un aparato para retirar el disolvente. Además, la fosfolipasa A2 es cara, y por ello se requiere dicho procedimiento para reducir costes.
En una reacción enzim�tica común, se efectúa ampliamente la inmovilización enzim�tica para un uso eficaz de la enzima. Sin embargo, ha habido informes de que cuando se usa una fosfolipasa A2 inmovilizada en la esterificaci�n por fosfolipasa A2, es improbable que la esterificaci�n proceda eficazmente, incluso cuando se usa un ácido graso en gran cantidad con respecto a un lisofosfol�pido (documento no de patente 2 y documento no de patente 3).
Lista de referencias
Bibliograf�a de patentes
Documento de patente 1: JP-A n� 8-59678 Documento de patente 2: JP-A n� 8-325192 Documento de patente 3: JP-A n� 2007-129973 Documento de patente 4: JP-A n� 8-56683 Documento de patente 5: JP-A n� 5-236974
Bibliograf�a no de patentes
Documento no de patente 1: Fisheries Science, vol. 72, páginas 909-911 (2006) Documento no de patente 2: Journal of the American Oil Chemists' Society, vol. 72, páginas 641-646 (1995) Documento no de patente 3: Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1343, páginas 76-84 (1997)
Sumario de la invención
Problema técnico
Como se describe anteriormente, se demanda desarrollar un procedimiento de recuperación de un fosfol�pido después de una esterificaci�n eficaz por fosfolipasa A2 y de reutilización de la fosfolipasa A2. Por ello, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para producir un fosfol�pido a bajo coste, mediante reutilización de fosfolipasa A2, en el procedimiento de producción del fosfol�pido unido a cualquier ácido graso en
posici�n 2’ del fosfol�pido mediante esterificaci�n por fosfolipasa A2 en glicerina.
Soluci�n del problema
Los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos para resolver los problemas, como resultado, han encontrado que, esterificando un lisofosfol�pido con fosfolipasa A2 en glicerina, extrayendo entonces un fosfol�pido con un disolvente inmiscible con glicerina, retirando entonces el disolvente por evaporación y añadiendo el lisofosfol�pido y un donante de acilo, puede efectuarse la reesterificaci�n del lisofosfol�pido con el donante de acilo reutilizando la fosfolipasa A2 restante en la glicerina, y se ha logrado la invención.
A saber, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un fosfol�pido caracterizado por incluir producir un fosfol�pido mediante la esterificaci�n de un lisofosfol�pido con un donante de acilo por fosfolipasa A2 en glicerina, añadir entonces un disolvente inmiscible con glicerina formando una capa de glicerina y una capa de disolvente, extraer el fosfol�pido en la capa de disolvente, transferir la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina y recoger entonces la capa de glicerina, retirar el disolvente restante por evaporación de la capa de glicerina, dando una disolución de glicerina, añadir el lisofosfol�pido y el donante de acilo a la disolución de glicerina y esterificar usando la fosfolipasa A2 restante en la disolución de glicerina.
En la presente invención, puede añadirse un disolvente cetona como disolvente inmiscible con glicerina, o puede añadirse un alcohol que tenga 4 átomos de carbono o menos después de la esterificaci�n y añadirse entonces al menos un disolvente seleccionado del grupo consistente en disolventes hidrocarburos, disolventes cetonas y disolventes ésteres como disolvente inmiscible con glicerina.
En la presente invención, en la esterificaci�n, puede añadirse un amino�cido y/o un p�ptido que tenga 3 o menos residuos aminoac�dicos al sistema de reacción.
El amino�cido es preferiblemente al menos uno seleccionado del grupo consistente en glicina, alanina, asparagina, glutamina, isoleucina, leucina, serina, treonina, valina, fenilalanina y tirosina.
El p�ptido es preferiblemente una combinación que incluye glicina, alanina y/o serina.
Efectos ventajosos de la invención
Seg�n la presente invención, puede proporcionarse un procedimiento de producción de un fosfol�pido a bajo coste reutilizando la fosfolipasa A2 en el procedimiento de producción del fosfol�pido unido a cualquier ácido graso en la posición 2 del fosfol�pido mediante esterificaci�n por fosfolipasa A2 en glicerina.
Descripci�n de realizaciones
De aquí en adelante, la presente invención se describir� con más detalle. El procedimiento de producción de un fosfol�pido de la presente invención se caracteriza por incluir producir un fosfol�pido mediante esterificaci�n de un lisofosfol�pido con un donante de acilo por fosfolipasa A2 en glicerina, añadir entonces un disolvente inmiscible con glicerina formando una capa de glicerina y una capa de disolvente, extraer el fosfol�pido en la capa de disolvente, transferir la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina, recoger entonces la capa de glicerina, retirar el disolvente restante por evaporación de la capa de glicerina, dando una disolución de glicerina, añadir el lisofosfol�pido y el donante de acilo a la disolución de glicerina y reesterificar usando la fosfolipasa A2 restante en la disolución de glicerina.
El lisofosfol�pido de la presente invención es un compuesto resultante de la retirada de un ácido graso de la posición 2 de un fosfol�pido, y significa un lípido diferente de fosfol�pidos. El lisofosfol�pido usado en la presente invención puede ser un fosfol�pido modificado y deriva preferiblemente de soja, semilla de colza y yema de huevo debido a su fácil disponibilidad. Los lisosfosfol�pidos derivados de soja son más preferidos debido al bajo coste, pero pueden usarse lisofosfol�pidos derivados de otras plantas.
Los ejemplos del procedimiento para modificar un fosfol�pido para retirar un residuo de ácido graso de la posición 2 incluyen, pero no est�n necesariamente limitados a, un procedimiento de uso de fosfolipasa A2 o similar para hidrolizar el residuo de ácido graso en la posición 2 del fosfol�pido. El fosfol�pido utilizable en este caso es una molécula que tiene un esqueleto de glicerina, un grupo fosfato y dos ésteres de ácido graso, puede ser un sustrato de fosfolipasa A2 y no incluye una molécula que tenga un esqueleto de esfingosina. Los ejemplos específicos incluyen fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. El procedimiento que usa la fosfolipasa A2 puede llevarse a cabo sin usar ninguna sustancia tóxica, y puede emplearse por lo tanto para la producción de un fosfol�pido usado, por ejemplo, para alimentos.
En la invención, el ácido graso como donante de acilo que se introduce en posición 2 de un lisofosfol�pido en la esterificaci�n del lisofosfol�pido por fosfolipasa A2 en glicerina no est� específicamente limitado. Puede usarse un ácido graso libre o se hidroliza un éster etílico o un triglic�rido por una enzima tal como lipasa en el sistema de reacción para usar, pero desde el punto de vista de la reactividad, se usa preferiblemente un ácido graso libre. Los ejemplos específicos incluyen, considerando la funcionalidad, ácidos grasos altamente insaturados tales como DHA, EPA, ácido araquid�nico y ácido linoleico conjugado. Los ejemplos de DHA y EPA utilizables incluyen ácidos grasos libres que se obtienen mediante la hidrólisis principalmente de aceites de animales marinos o aceites y grasas derivados de algas. El donante de acilo usado en la presente invención se usa preferiblemente en una cantidad de 30 a 1000 partes en peso con respecto a 100 partes en peso de un lisofosfol�pido desde los puntos de vista de eficacia y costes.
Cuando un ácido graso es difícil de obtener como compuesto individual a partir de fuentes naturales, por ejemplo DHA, puede usarse una mezcla de ácidos grasos que contiene el ácido graso deseado. En dicho caso, la mezcla de ácidos grasos incluye deseablemente el ácido graso deseado en una cantidad de aproximadamente 20 % en peso o más. Por ejemplo, en el caso de DHA, una mezcla de ácidos grasos que contiene DHA tiene preferiblemente una concentración de DHA de 20 % en peso o más, y se usa más preferiblemente una mezcla que tiene una concentración de DHA de 45 % en peso o más. Después de la esterificaci�n según la invención, puede llevarse a cabo la separación de disolvente o similar para aumentar la concentración de un fosfol�pido como producto de reacción.
La fosfolipasa A2 usada en la presente invención puede derivar de cualquier fuente, y es preferiblemente fosfolipasa A2 que puede usarse comúnmente para alimentos. Los ejemplos incluyen aquellas derivadas de páncreas porcino y microorganismos. La fosfolipasa A2 usada en la presente invención se usa preferiblemente a una cantidad de 1.000 a 10.0000 U con respecto a 1 g de lisofosfol�pido desde los puntos de vista de eficacia y costes.
En la presente invención, la esterificaci�n se lleva a cabo en glicerina. Esto es debido a que la glicerina tiene una alta polaridad eficaz para esterificaci�n y puede usarse para alimentos. Tiene también una ventaja porque puede disolver los amino�cidos descritos a continuación como componentes opcionales. La glicerina se usa preferiblemente en una cantidad de 500 a 10.000 partes en peso con respecto a 100 partes en peso de un lisofosol�pido, considerando reactividad y similares.
En la presente invención, la esterificaci�n se lleva a cabo en glicerina como se menciona anteriormente, y por ello, para la extracción de un fosfol�pido resultante se usa un disolvente inmiscible con glicerina para extraer el fosfol�pido. Como disolvente inmiscible con glicerina usado en la presente invención, puede usarse al menos un disolvente seleccionado del grupo consistente en disolventes hidrocarburos, disolventes cetonas y disolventes ésteres, y el uso de dicho disolvente conduce a una extracción eficaz de un fosfol�pido diana. Donde, excepto para la extracción con disolvente cetona solo, es preferible añadir un alcohol de 4 átomos de carbono o menos y añadir entonces el disolvente para reducir la viscosidad de una disolución de reacción que contiene glicerina para una fácil extracción. La razón por la que la adición de alcohol no es necesaria cuando se usa solo el disolvente cetona es porque tiene una mayor solubilidad en glicerina que la de los disolventes hidrocarburos y disolventes éster. El disolvente se añade preferiblemente en una cantidad de 20 a 300 partes en peso con respecto a 100 partes en peso de glicerina, considerando la eficacia de recuperación de fosfol�pido y similares.
Disolvente hidrocarburo significa un compuesto que puede usarse como disolvente entre los compuestos constituidos por carbonos e hidrógenos solos. Los ejemplos específicos incluyen pentano, hexano y heptano, y es más preferido el hexano porque se retira fácilmente por evaporación debido a su bajo punto de ebullición, y puede usarse como aditivo alimentario.
Disolvente cetona significa un compuesto que puede usarse como disolvente entre los compuestos que tienen un grupo ceto en la molécula. Los ejemplos específicos incluyen acetona y butanona, y se prefiere la acetona porque se retira fácilmente por evaporación debido a su bajo punto de ebullición y puede usarse como aditivo alimentario.
Disolvente éster significa un compuesto que puede usarse como disolvente entre los compuestos que tienen un ligamiento éster en la molécula. Los ejemplos específicos incluyen acetato de metilo y acetato de etilo, y se prefiere acetato de etilo debido que se usa para alimentos.
En la presente invención, en la esterificaci�n de un lisofosfol�pido por fosfolipasa A2, puede usarse un antioxidante para suprimir la oxidación de un donante de acilo, y pueden usarse una fuente de calcio tal como cloruro de calcio, un amino�cido y un p�ptido de 3 residuos aminoac�dicos para activar la fosfolipasa A2. Pueden usarse también otros aditivos según sea necesario.
Como antioxidante, puede usarse cualquier antioxidante en la medida en que pueda esperarse un efecto antioxidante sobre ácidos grasos tales como DHA, y los ejemplos incluyen polifenoles tales como catequina, tocoferol, ácido asc�rbico, derivados de los mismos y dibutilhidroxitolueno (BHT) desde el punto de vista de las aplicaciones alimentarias.
Para suprimir la oxidación de un ácido graso, puede llevarse a cabo la esterificaci�n de un lisofosfol�pido en atmósfera de nitrógeno sin oxígeno.
Amino�cido significa un compuesto constituyente principal de una proteína y que tiene un grupo carboxilo y un grupo amino en la molécula, y es preferiblemente un compuesto que puede usarse para alimentos. Entre ellos, se prefieren los amino�cidos neutros porque dicho amino�cido puede activar la fosfolipasa A2 causando un efecto relativamente pequeño sobre el estado de carga de la fosfolipasa A2, y los ejemplos incluyen glicina, alanina, asparagina, glutamina, isoleucina, leucina, serina, treonina, valina, fenilalanina y tirosina. Para el procedimiento de producción de un fosfol�pido de la presente invención, puede usarse al menos uno seleccionado de los mismos.
P�ptido que tiene 3 residuos aminoac�dicos o menos significa principalmente un d�mero o tr�mero de amino�cidos mediante ligamientos amida. Puede sintetizarse a partir de amino�cidos o puede ser el producto de degradación de una proteína por una enzima o similar. Es preferiblemente un p�ptido que incluye glicina, alanina y/o serina porque dicho p�ptido tiene una solubilidad comparativamente alta en glicerina, y los ejemplos incluyen glicilglicina. El uso de dicho p�ptido que tiene unos pocos residuos aminoac�dicos conduce a una alta molaridad cuando se disuelve en glicerina, y puede activar eficazmente la fosfolipasa A2.
La fuente de calcio se usa para activar la fosfolipasa A2 como se describe anteriormente, y es preferiblemente un compuesto que puede estar presente como i�n de calcio en el sistema de reacción. Por tanto, las fuentes de calcio preferidas son compuestos que tienen una solubilidad comparativamente alta y son también utilizables como materiales alimentarios. Los ejemplos adecuados de fuente de calcio incluyen cloruro de calcio como se menciona anteriormente
Cada cantidad de antioxidante, fuente de calcio, amino�cido y p�ptido que tiene 3 residuos aminoac�dicos o menos puede ser la cantidad adecuada para la consecución de cada fin. Sin embargo, cada uno de amino�cido y p�ptido que tiene 3 residuos aminoac�dicos o menos se añade preferiblemente en una cantidad de 10 a 2.000 partes en peso con respecto a 100 partes en peso de un lisofosfol�pido, y más preferiblemente de 50 a 500 partes en peso. La adición de dicho compuesto en una cantidad de menos de 10 partes en peso puede reducir la eficacia de la reacción, y la adición de dicho compuesto en una cantidad de más de 2.000 partes en peso aumenta el coste y puede reducir la eficacia de reacción. Pueden añadirse dos o más de los amino�cidos y p�ptidos que tienen 3 residuos aminoac�dicos o menos en combinación entre s� para aumentar la cantidad total en disolución en el sistema de esterificaci�n.
Se describir� a continuación un ejemplo preferido de procedimiento para producir un fosfol�pido de la presente invención.
En primer lugar, se disuelven un lisofosfol�pido y un donante de acilo en glicerina; se añade fosfolipasa A2 y, si es necesario, un antioxidante y un amino�cido, un p�ptido de 3 residuos aminoac�dicos o menos y cloruro de calcio para activar la fosfolipasa A2, dando una disolución de reacción de glicerina; y se agita la disolución de reacción de glicerina para esterificar el lisofosfol�pido con el donante de acilo. Si es necesario, la esterificaci�n puede llevarse a cabo en atmósfera de nitrógeno sin oxígeno para suprimir la oxidación del ácido graso.
En ese momento, la esterificaci�n se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 35 a 80 �C y más preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 45 a 70 �C desde los puntos de vista de la temperatura óptima de la fosfolipasa A2 y la supresión de la oxidación del ácido graso como donante de acilo.
Puede llevarse a cabo una despresurizaci�n durante la reacción para retirar el agua que se forma mediante la esterificaci�n por la fosfolipasa A2 para acelerar la esterificaci�n. La despresurizaci�n para retirar agua puede llevarse a cabo, por ejemplo, a una temperatura de 35 a 80 �C a 20 kPa o menos durante 12 a 24 horas.
Como se describe anteriormente, la esterificaci�n del lisofosfol�pido con el ácido graso como donante de acilo forma un fosfol�pido con el ácido graso deseado introducido en la posición 2 del lisofosfol�pido. Puede comprobarse la progresión de la esterificaci�n por cromatograf�a en capa fina (TLC) y similares.
Se añade a una disolución de reacción de glicerina que contiene el fosfol�pido formado mediante la esterificaci�n como anteriormente, un disolvente cetona o un alcohol de 4 átomos de carbono o menos para reducir la viscosidad de la glicerina para una fácil extracción, y se añade entonces al menos un disolvente seleccionado del grupo consistente en disolventes hidrocarburos, disolventes cetonas y disolventes ésteres a la disolución de reacción, formando una capa de glicerina y una capa de disolvente. Se extrae entonces el fosfol�pido formado mediante la esterificaci�n en la capa de disolvente, se transfiere la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina y por consiguiente puede extraerse el fosfol�pido diana. En ese momento, la capa de disolvente (capa superior) incluye el fosfol�pido/lisofosfol�pido diana, el disolvente y el donante de acilo, y la capa de glicerina (capa inferior) incluye principalmente la glicerina, el disolvente, la fosfolipasa A2 y el fosfol�pido/lisofosfol�pido que no puede extraerse completamente, otros aditivos y similares. A continuación, se separan (recogen) la capa de disolvente (capa superior) y la capa de glicerina (capa inferior). En ese momento, puede repetirse apropiadamente la adición de un disolvente predeterminado y la separación, considerando la mejora de la pureza del fosfol�pido y de la eficacia operativa. De esta manera, puede extraerse eficazmente el fosfol�pido diana de la disolución de reacción de glicerina.
El fosfol�pido y la fosfolipasa A2 pueden separarse como anteriormente, pero la fosfolipasa A2 puede incluirse en la capa de disolvente en cantidades traza acompañando al fosfol�pido diana. En este caso, el fosfol�pido diana puede mezclarse con la fosfolipasa A2 incluso después del tratamiento como se ejemplifica a continuación. Dicha mezcla que incluye fosfolipasa A2 puede usarse para alimentos pero, si es necesario, la fosfolipasa A2 puede degradarse apropiadamente e inactivarse, por ejemplo, usando una enzima degradativa tal como una proteasa.
Alcohol de 4 átomos de carbono o menos significa metanol, etanol, propanol y butanol, y es más preferido etanol porque tiene una baja toxicidad y puede usarse como aditivo alimentario. El alcohol se añade preferiblemente en una cantidad de 10 a 150 partes en peso con respecto a 100 partes en peso de glicerina.
En la presente invención, el ácido graso como donante de acilo puede retirarse de la capa de disolvente separado (capa superior) que contiene el fosfol�pido diana como anteriormente. El procedimiento para retirar el ácido graso como donante de acilo de la capa superior separada no est� específicamente limitado, y los ejemplos del procedimiento incluyen un procedimiento de desgrasado con un disolvente cetona, un disolvente mixto de etanolhexano o similares y un procedimiento de retirada del ácido graso usando gel de sílice.
Por ejemplo, en el procedimiento que usa un disolvente cetona o similar, se retira el disolvente de la capa superior separada (recogida) por evaporación; se añade entonces de nuevo un disolvente cetona o similar; se enfría la mezcla a 5 �C o menos para precipitar el fosfol�pido y se separa el disolvente cetona que disuelve el ácido graso y se retira, dando el fosfol�pido con el ácido graso deseado introducido en la posición 2 del lisofosfol�pido. En el procedimiento, el disolvente cetona o similar para adición después de la retirada de disolvente por evaporación es preferiblemente acetona, porque tiene un bajo punto de ebullición para retirar fácilmente por evaporación, y puede usarse como aditivo alimentario.
En el procedimiento de retirada de ácido graso usando gel de sílice, se separa (recoge) la capa superior; se pasa entonces la capa superior a través de una columna empaquetada con gel de sílice para adsorber el fosfol�pido y para efluir el ácido graso para retirada; y se pasa entonces un disolvente eluyente tal como metanol a través de la columna para desorber el fosfol�pido que est� adsorbido al gel de sílice y recoger la fracción de fosfol�pido deseado solo, se recristaliza entonces el fosfol�pido, dando el fosfol�pido con el ácido graso deseado introducido en la posición 2 del lisofosfol�pido.
Mientras tanto, un disolvente tal como etanol puede inhibir la actividad fosfolipasa A2. Por tanto, se separan (recogen) la capa superior y la capa inferior y la capa de glicerina puede descomprimirse como capa inferior, retirando el disolvente restante. Dicho tratamiento proporciona una disolución de glicerina que contiene la fosfolipasa A2, el fosfol�pido/lisofosfol�pido restante, otros aditivos opcionales y similares.
Se añaden adicionalmente entonces a la disolución de glicerina el lisofosfol�pido como sustrato de reacción y el ácido graso como donante de acilo, consiguiendo la reesterificaci�n usando la fosfolipasa A2 restante en la disolución de glicerina, y por consiguiente puede reutilizarse la fosfolipasa A2.
En este momento, la manera de añadir el lisofosfol�pido y el donante de acilo no esta específicamente limitada. Pueden añadirse a la disolución de glicerina el lisofosfol�pido y el donante de acilo simultáneamente, el lisofosfol�pido puede añadirse seguido por la adición del donante de acilo o el donante de acilo puede añadirse seguido de la adición del lisofosfol�pido. Cada cantidad puede ajustarse apropiadamente para que sea sustancialmente la misma que en la primera esterificaci�n, dependiendo de la progresión de la reacción o del grado de extracción, y considerando que est� presente lisofosfol�pido no reaccionado en la disolución de glicerina. Además, pueden añadirse apropiadamente materiales distintos de lisofosfol�pido y donante de acilo, tales como fuente de calcio, amino�cido y/o p�ptido de 3 residuos aminoac�dicos o menos y glicerina, en una cantidad reducida por la extracción del fosfol�pido cuando se añaden lisofosfol�pido y donante de acilo. La reesterificaci�n puede llevarse a cabo en las mismas condiciones que aquellas de la primera esterificaci�n, y la extracción del fosfol�pido puede llevarse a cabo de la misma manera que anteriormente.
De esta manera, a condición de que la fosfolipasa A2 mantenga su actividad, se repite dicha operación para reutilizar la fosfolipasa A2 muchas veces, y por consiguiente puede producirse un fosfol�pido deseado a menor coste. En este momento, cuando la productividad del fosfol�pido se reduce, puede reducirse parcialmente la cantidad de fosfolipasa A2, aditivos opcionales tales como amino�cido, p�ptido de 3 residuos aminoac�dicos o menos y cloruro de calcio, glicerina o similares debido a la extracción, o puede reducirse la actividad de la fosfolipasa A2 o similar. Por ello, dicho material puede añadirse según sea necesario. Además, de la misma manera que en la primera esterificaci�n, para suprimir la oxidación del ácido graso, puede llevarse a cabo la esterificaci�n con un antioxidante o en atmósfera de nitrógeno sin oxígeno, según sea necesario.
El procedimiento para producir un fosfol�pido de la presente invención puede emplearse adecuadamente como procedimiento para producir un fosfol�pido con un ácido graso deseado introducido en posición 2. El procedimiento puede llevarse a cabo sin usar materiales ni disolventes tales como cloroformo, inadecuados para alimentos en el proceso de producción, y por lo tanto se emplea adecuadamente especialmente para la producción de fosfol�pidos comestibles. Además, el fosfol�pido obtenido de esta manera, en particular el fosfol�pido con un ácido graso altamente insaturado introducido en la posición 2, puede usarse adecuadamente como fosfol�pido comestible de alta funcionalidad.
EJEMPLOS
De aquí en adelante, se describir� la presente invención con más detalle por referencia a ejemplos, pero la presente invención no se pretende que est� limitada a los ejemplos. En los ejemplos, “parte” y “%” est�n basados en peso.
<Determinación de la composición de ácidos grasos del fosfol�pido >
En los ejemplos, ejemplos comparativos y similares, después de la terminación de la reacción, se añadieron 200 él de un disolvente cloroformo:metanol = 2:1 (relación en volumen) y 500 él de una disolución saturada de cloruro de sodio a 50 él de la disolución de reacción, se agit� entonces el conjunto, se centrifug� a 13.000 rpm durante 1 minuto y se extrajo la capa inferior. Se llev� la cabo la centrifugaci�n de nuevo usando 200 él de un disolvente cloroformo/metanol= 2:1 (relación en volumen) de manera similar, y se extrajo la capa inferior. Se revel� la capa inferior tratada que contenía un fosfol�pido y un ácido graso por TLC (cromatograf�a en capa fina) con el disolvente, recogiendo una fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido. Se esterific� la fracción con metilato de sodio, formando ésteres met�licos y se analizó la composición de ácidos grasos de los ácidos grasos unidos a fosfol�pido y lisofosfol�pido con un cromat�grafo de gases ("GC-14B" fabricado por Shimadzu Corporation). El porcentaje de relación de áreas de cada ácido graso en el cromatograma se consider� como el porcentaje de relación en peso del correspondiente ácido graso.
(Ejemplo 1)
Se añadieron 105 mg de una mezcla de ácidos grasos que contenía DHA que se prepar� por hidrólisis común de DHA�50G (fabricado por Nippon Chemical Feed Co., Ltd., contenido de DHA: 51,8 % en peso) y 1 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 35 mg de lisofosfatidilcolina ("SLP-LPC70" fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd.) y se añadieron adicionalmente 37,5 mg de glicina (fabricada por Showa Denko K. KJ y 37,5 mg de alanina (fabricada por Musashino Chemical Laboratory, Ltd.). A continuación, se añadieron adicionalmente 20 mg de fosfolipasa A2 ("Lysonase en polvo” fabricada por SANYO FINE CO., LTD., 53 U/mg) y se descomprimi� el conjunto a 80 Pa durante 10 minutos para retirar el agua. Se añadieron entonces 10 él de una disolución de cloruro de calcio 0,3 mol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) y 30 él de agua y se hizo reaccionar el conjunto a 50 �C durante 24 horas. Se La fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de DHA de 13,4 % en peso.
Se a�adi� 1 ml de etanol a la disolución de reacción. Se agit� el conjunto y se extrajo entonces con 1 ml de hexano dos veces, separando (recogiendo) la capa de hexano (capa superior) y la capa de glicerina (capa inferior) en un procedimiento común. En cuanto a la composición de ácidos grasos de la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en cada una de la capa de hexano (capa superior) y capa de glicerina (capa inferior) separadas (recogidas), la capa de hexano tenía un contenido de DHA de 20,7 % en peso y la capa de glicerina tenía un contenido de DHA de 6,3 % en peso.
Se descomprimi� la capa de glicerina (capa inferior) separada (recogida) a 80 Pa durante 15 minutos para retirar el disolvente. Se añadieron 18 mg de lisofosfatidilcolina (SLP-LPC70) y 105 mg de mezcla de ácidos grasos que contenía DHA a la capa de glicerina descomprimida (disolución de glicerina), se añadieron adicionalmente entonces 40 él de agua y se hizo reaccionar el conjunto a 50� C durante 24 horas. La fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de DHA de 13,6 % en peso.
(Ejemplo 2)
Se añadieron 30 mg de una mezcla de ácidos grasos que contenía DHA que se prepar� mediante hidrólisis común de Incromega DHA-J46 (fabricado por Croda Japan KK., contenido de DHA: 49,7 % en peso) y 1 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 35 mg de lisofosfatidilcolina ("SLP-LPC70" fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd.), y se añadieron adicionalmente 25 mg de glicina (fabricada por Showa Denko K. K.) y 25 mg de alanina (fabricada por Musashino Chemical Laboratory, Ltd.). Se añadieron a continuación 20 mg de fosfolipasa A2 (“Lysonase en polvo” fabricada por SANYO FINE CO., LTD., 53 U/mg), y se descomprimi� el conjunto a 80 Pa durante 10 minutos para retirar el agua. Se añadieron entonces 10 él de una disolución de cloruro de calcio 0,3 mol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) y se hizo reaccionar el conjunto a 50 �C durante 24 horas con descompresión a 6,7 kPa. La fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de DHA de 16,9 % en peso.
Se extrajo la disolución de reacción con 1 m l de acetona dos veces para separar (recoger) la capa de acetona (capa superior) y la capa de glicerina (capa inferior) en un procedimiento común. En cuanto a la composición de ácidos grasos de la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en cada una de la capa de acetona (capa superior) y capa de glicerina (capa inferior) separadas (recogidas), la capa de acetona tenía un contenido de DHA de 17,6 % en peso y la capa de glicerina tenía un contenido de DHA de 14,1 % en peso.
Se descomprimi� la capa de glicerina separada (recogida) a 80 Pa durante 15 minutos para retirar la acetona. Se añadieron 30 mg de lisofosfatidilcolina (SLP-LPC70) a la capa de glicerina descomprimida (disolución de glicerina) y se agit� a 50 �C durante 30 minutos para disolver. Se determin� que el contenido de DHA en la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción era de 4,8 % en peso. Se añadieron a la mezcla 30 mg de la mezcla de ácidos grasos que contenía DHA y se hizo reaccionar el conjunto a 50 �C durante 24 horas con descompresión a 6,7 kPA. La fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de DHA de 11,2 % en peso después de 24 horas de reacción.
(Ejemplo 3)
Se añadieron 30 mg de una mezcla de ácidos grasos que contenía DHA que se prepar� mediante la hidrólisis común de Incromega DHA-J46 (fabricado por Croda Japan KK., contenido de DHA: 49,7 % en peso) y 1 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 50 mg de lisofosfatidilcolina (fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd. "SlLP-WhiteLyso"), y se añadieron adicionalmente 25 mg de glicina (fabricada por Showa Denko K. K.) y 25 mg de alanina (fabricada por Musashino Chemical Laboratory, Ltd.). A continuación, se añadieron adicionalmente 20 mg de fosfolipasa A2 (“Lysonase en polvo” fabricada por SANYO FINE CO., LTD., 53 U/mg) y se descomprimi� el conjunto a 80 Pa durante 10 minutos para retirar el agua. Se añadieron entonces 10 él de disolución de cloruro de calcio 0,3 mol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) y se hizo reaccionar el conjunto a 50 �C durante 24 horas con descompresión a 6,7 kPa. La fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de DHA de 15,3 % en peso.
Se añadieron a la disolución de reacción 0,5 ml de etanol. Se agit� el conjunto y se extrajo con un disolvente mixto de 0,5 ml de hexano y 0,2 ml de acetona dos veces para separar (recoger) la capa de hexano/acetona (capa superior) y la capa de glicerina (capa inferior) en un procedimiento común. En cuanto a la composición de ácidos grasos de la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en cada una de la capa de hexano/acetona (capa superior) y capa de glicerina (capa inferior) separadas (recogidas), la capa de hexano/acetona tenía un contenido de DHA de 18,0 % en peso y la capa de glicerina tenía un contenido de DHA de 11,6 % en peso.
Se descomprimi� la capa de glicerina separada (recogida) a 80 Pa durante 15 minutos para retirar el disolvente. Se añadieron 30 mg de lisofosfatidilcolina (SLP�WhiteLyso) a la capa de glicerina descomprimida (disolución de glicerina) y se agit� a 50 �C durante 30 minutos para disolver. Se determin� que el contenido de la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción era de 6,6 % en peso. Se añadieron a la mezcla 30 mg de mezcla de ácidos grasos que contenía DHA y se hizo reaccionar el conjunto a 50 �C durante 24 horas con descompresión a 6,7 kPa. La fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de DHA de 12,3 % en peso después de 24 horas de reacción.
(Ejemplo 4)
Se añadieron 30 mg de una mezcla de ácidos grasos que contenía EPA que se prepar� mediante la hidrólisis común de EPA-45G (fabricado por Nippon Chemical Feed Co., Ltd., contenido de EPA: 45,7 % en peso) y 1 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 50 mg de lisofosfatidilcolina (fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd. "SLP�WhiteLyso''), y se añadieron adicionalmente 25 mg de glicina (fabricada por Showa Denko K. K.) y 25 mg de alanina (fabricada por Musashino Chemical Laboratory, Ltd.). A continuación, se añadieron adicionalmente 20 mg de fosfolipasa A2 (“Lysonase en polvo” fabricada por SANYO FINE CO., LTD., 53 U/mg) y se descomprimi� el conjunto a 80 Pa durante 10 minutos para retirar el agua. Se añadieron entonces 10 él de una disolución de cloruro de calcio 0,3 mol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) y se hizo reaccionar el conjunto a 50 �C durante 24 horas con descompresión a 6,7 kPa. La fracción de fosfol�pido y lisofosfosl�pido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de EPA de 19,5 % en peso.
Se añadieron a la disolución de reacción 0,25 ml de etanol. Se agit� el conjunto y se extrajo entonces con 0,75 ml de acetato de etilo dos veces, para separar (recoger) la capa de acetato de etilo (capa superior) y la capa de glicerina (capa inferior) en un procedimiento común. En cuanto a la composición de ácidos grasos de la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en cada una de la capa de acetato de etilo y la capa de glicerina separadas (recogidas), la capa de acetato de etilo tenía un contenido de EPA de 22,1 % en peso y la capa de glicerina tenía un contenido de EPA de 17,8 % en peso.
Se descomprimi� la capa de glicerina separada (recogida) a 80 Pa durante 15 minutos para retirar el disolvente. Se añadieron 36 mg de lisofosfatidilcolina (SLP�WhiteLyso) a la capa de glicerina descomprimida (disolución de glicerina) y se agit� a 50 �C durante 30 minutos para disolver. Se determin� que el contenido de EPA en la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción era de 11,2 % en peso. Se añadieron a la mezcla 30 mg de mezcla de ácidos grasos que contenía EPA y se hizo reaccionar el conjunto a 50 �C durante 24 horas con descompresión a 6,7 kPa. La fracción de fosfol�pido y lisofosfolipido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de EPA de 16,3 % en peso después de 24 horas de reacción.
(Ejemplo 5)
Se añadieron 3 g de una mezcla de ácidos grasos que contenía DHA que se prepar� mediante la hidrólisis común de Incromega DHA�J46 (fabricado por Croda Japan KK., contenido de DHA: 49,7 % en peso) y 100 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 7,5 g de lisofosfatidilcolina (fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd. "SLP-WhiteLyso”), y se añadieron adicionalmente 3 g de glicina (fabricada por Showa Denko K K.) y 3 g de alanina (fabricada por Musashino Chemical Laboratory, Ltd.). A continuación, se añadieron adicionalmente 3 g de fosfolipasa A2 ("Lysonase en polvo” fabricada por SANYO FINE CO., LTD., 53 U/mg) y se añadieron 0,5 ml de una disolución de cloruro de calcio 2 mmol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.). Se hizo reaccionar el conjunto a 50 �C durante 24 horas a presión reducida de 0,40 kPa.
Se añadieron a la disolución de reacción 50 ml de etanol. Se agit� el conjunto y se extrajo entonces con 50 ml de hexano dos veces para separar (recoger) la capa de hexano (capa superior) y la capa de glicerina (capa inferior) en un procedimiento común. Se retir� el disolvente de la capa de hexano separada (capa superior) por evaporación, y se añadieron 50 ml de acetona. Se enfri� el conjunto a 0� C durante 1 hora, dando 6,3 g del fosfol�pido diana en forma de precipitado. En cuanto a la composición de ácidos grasos, el fosfol�pido tenía un contenido de DHA de 17,0 % en peso. En cuanto a la composición de ácidos grasos de la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido, la capa de glicerina separada (capa inferior) tenía un contenido de DHA de 8,3 % en peso.
Se añadieron a la capa de glicerina separada 5,5 g de lisofosfatidilcolina (SLP�WhiteLyso) y 3 g de la mezcla de ácidos grasos que contenía DHA (preparada a partir de Incromega DHA-J46). Se agit� la capa de glicerina a 13 kPa durante 30 minutos para retirar el disolvente por evaporación y se hizo reaccionar a 50 �C durante 24 horas con descompresión a 0,40 kPa. Después de terminada la reacción, se extrajo la mezcla de reacción con etanol y hexano y se purificó con acetato de manera similar a la anterior, dando 6,0 g del fosfol�pido diana. En cuanto a la composición de ácidos grasos, el fosfol�pido tenía un contenido de DHA de 15,8 % en peso.
Como se describe anteriormente, se revel� que la reutilización de fosfolipasa A2 puede conducir a la producción de un fosfol�pido unido a un ácido graso arbitrario en la posición 2 del fosfol�pido. De aquí en adelante, se describirán como ejemplos de referencia los resultados de la primera esterificaci�n que usaba diversos amino�cidos, p�ptidos que tienen 3 residuos aminoac�dicos o menos y similares.
Como se menciona anteriormente, resulta evidente que el uso de diversos amino�cidos, p�ptidos que tienen 3 residuos aminoac�dicos o menos y similares puede conseguir una producción eficaz de un fosfol�pido deseado. Por lo tanto, la reutilización de la fosfolipasa A2 con dicho compuesto se espera que consiga también una producción eficaz de un fosfol�pido deseado
(Ejemplo de referencia 1)
Se añadieron 97 mg de ácido oleico (fabricado por TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.) y 1 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 35 mg de lisofosfatidilcolina (fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd. "SLP�LPC70H"), y se añadieron adicionalmente 50 mg de glicina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A continuación, se añadieron adicionalmente10 mg de fosfolipasa A2 (“Lecitase 100S” fabricada por Novozymes Japan, 130 U/mg) y 2,5 él de una disolución de cloruro de calcio 1,0 mol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) y se hizo reaccionar el conjunto a 60 �C durante 24 horas, dando un fosfol�pido (fosfatidilcolina) unido con ácido oleico en posición 2. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de ácido oleico de 39,2 % en peso.
(Ejemplo de referencia 2)
Se añadieron 113 mg de DHA (fabricado por TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.) y 1 g de glicerina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a 35 mg de lisofosfatidilcolina ("SLP-LPC70" fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd.), y se añadieron adicionalmente 50 mg de glicina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A continuación, se añadieron 10 mg de fosfolipasa A2 ("Lecitase 100S" fabricada por Novozymes Japan, 130 U/mg) y se añadieron adicionalmente 2,5 él de una disolución de cloruro de calcio 1,0 mol/l (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y 3 mg de dibutilhidroxitolueno (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
como antioxidante. Se hizo reaccionar el conjunto a 60 �C durante 48 horas, dando un fosfol�pido (fosfatidilcolina) unido a un ácido graso altamente insaturado (DHA) en posición 2. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de DHA de 34,2 % en peso.
(Ejemplo de referencia 3)
Se añadieron 113 mg de DHA (fabricado por TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.) y 1 g de glicerina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a 35 mg de lisofosfatidilcolina (SLP-LPC70 fabricado por Tsuji Oil Mills Co., Ltd.), y se añadieron adicionalmente 60 mg de glicilglicina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A continuación, se añadieron 20 mg de fosfolipasa A2 (fabricada por SANYO FINE CO., LTD., Lysonase en polvo, 53 U/mg) y 2,5 él de una disolución de cloruro de calcio 1,2 mol/l (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), y se añadieron adicionalmente 3 mg de Sankatol NO1 (fabricado por Taiyo Kagaku Co., Ltd.) que contenía catequina y 3 mg de ácido asc�rbico (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como antioxidantes. Se hizo reaccionar el conjunto a 60 �C durante 48 horas, dando un fosfol�pido (fosfatidilcolina) unido a un ácido graso altamente insaturado (DHA) en posición 2. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de DHA de 30,7 % en peso.
(Ejemplo de referencia 4)
Se obtuvo un fosfol�pido unido a un ácido graso altamente insaturado (EPA) en posición 2 de manera similar a la del ejemplo de referencia 3, excepto porque se usaron 104 mg de EPA (fabricado por NACALAI TESQUE, INC.) en lugar de 113 mg de DHA y se usaron 60 mg de glicina en lugar de 60 mg de glicilglicina. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de EPA de 25,5 % en peso.
(Ejemplo de referencia 5)
Se obtuvo un fosfol�pido (fosfatidilcolina) unido a un ácido graso altamente insaturado (ácido araquid�nico) en posición 2 de manera similar a la del ejemplo de referencia 3, excepto porque se usaron 103 mg de ácido araquid�nico (fabricado por Sigma Aldrich Japan) en lugar de 113 mg de DHA y se usaron 40 mg de glicina en lugar de 60 mg de glicilglicina. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido tenía un contenido de ácido araquid�nico de 32,3 % en peso.
(Ejemplo de referencia 6)
Se añadieron 105 mg de una mezcla de ácidos grasos que contenía DHA que se prepar� mediante la hidrólisis común de DHA-50G (fabricado por Nippon Chemical Feed Co., Ltd., contenido de DHA de 51,8 % en peso) y 1 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 35 mg de lisofosfatidilcolina ("SLP�LPC70" fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd.), y se añadieron adicionalmente 75 mg de glicina (fabricada por Showa Denko K. K.). A continuación, se añadieron adicionalmente 20 mg de fosfolipasa A2 (“Lysonase en polvo” fabricada por SANYO FINE CO., LTD.) y se descomprimi� el conjunto a 80 Pa durante 10 minutos para retirar el agua. Se añadieron entonces 10 él de una disolución de cloruro de sodio 0,3 mol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) y se hizo reaccionar el conjunto a 60 �C durante 48 horas, dando un fosfol�pido (fosfatidilcolina) unido a un ácido graso altamente insaturado (DHA) en posición 2. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de DHA de 15,5 % en peso.
(Ejemplo de referencia 7)
Se añadieron 105 mg de una mezcla de ácidos grasos que contenía DHA que se prepar� mediante la hidrólisis común de DHA-50G (fabricado por Nippon Chemical Feed Co., Ltd., contenido de DHA de 51,8 % en peso) y 1 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 35 mg de lisofosfatidilcolina ("SLP-LPC70" fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd.), y se añadieron adicionalmente 37,5 mg de glicina (fabricada por Showa Denko K. K.) y 37,5 mg de alanina (fabricada por Musasbino Chemical Laboratory, Ltd.). A continuación, se añadieron adicionalmente 20 mg de fosfolipasa A2 (“Lysonase en polvo” fabricada por SANYO FINE CO., LTD.) y se descomprimi� el conjunto a 80 Pa durante 10 minutos para retirar el agua. Se añadieron entonces 10 él de una disolución de cloruro de calcio 0,3 mol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.) y se hizo reaccionar el conjunto a 60 �C durante 48 horas, dando un fosfol�pido (fosfatidilcolina) unido a un ácido graso altamente insaturado (DHA) en posición 2. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de DHA de 17,2 % en peso
(Ejemplo de referencia 8). Preparación de una disolución de esterificaci�n que contiene fosfol�pido para mejorar la pureza de la fosfatidilcolina
Se añadieron 30 mg de una mezcla de ácidos grasos que contenía DHA que se prepar� mediante la hidrólisis común de DHA-50G (fabricado por Nippon Chemical Feed Co., Ltd., contenido de DHA de 51,8 % en peso) y 1 g de glicerina (fabricada por Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) a 35 mg de lisofosfatidilcolina ("SLP�LPC70" fabricada por Tsuji Oil Mills Co., Ltd.), y se añadieron adicionalmente 37,5 mg de glicina (fabricada por Showa Denko K K) y 37,5 mg de alanina (fabricada por Musashino Chemical Laboratory, Ltd.). A continuación, se añadieron 20 mg de fosfolipasa A2 (“Lysonase en polvo” fabricada por SANYO FINE CO., LTD,) y se añadieron adicionalmente 6 μl de una disolución de cloruro de calcio 0,5 mol/l (fabricada por Tomita Pharmaceutical Co., Ltd.). Se descomprimi� el conjunto a 80 Pa durante 10 minutos para retirar el agua, y se hizo reaccionar a 50 �C durante 24 horas, dando una disolución de esterificaci�n que contiene fosfol�pido para mejorar la pureza de la fosfatidilcolina. La fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido incluida en la disolución de reacción tenía un contenido de DHA de 15,3 % en peso.
(Ejemplo comparativo 1)
Se obtuvo un fosfol�pido unido a ácido oleico en posición 2 de manera similar a la del ejemplo de referencia 1, excepto porque no se us� glicina. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de ácido oleico de 19,4 % en peso.
(Ejemplo comparativo 2)
Se obtuvo un fosfol�pido unido a un ácido graso altamente insaturado (DHA) en posición 2 de manera similar a la del ejemplo de referencia 3, excepto porque no se us� glicilglicina. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de ácido oleico de 12,9 % en peso.
(Ejemplo comparativo 3)
Se obtuvo un fosfol�pido unido a un ácido graso altamente insaturado (EPA) en posición 2 de manera similar a la del ejemplo de referencia 4, excepto porque no se us� glicina y se añadieron 60 él de agua. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de EPA de 8,9 % en peso.
(Ejemplo comparativo 4)
Se obtuvo un fosfol�pido unido a un ácido graso altamente insaturado (ácido araquid�nico) en posición 2 de manera similar a la del ejemplo de referencia 5, excepto porque no se us� glicina. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de ácido araquid�nico de 5,5 % en peso.
(Ejemplo comparativo 5)
Se obtuvo un fosfol�pido unido a un ácido graso altamente insaturado (DHA) en posición 2 de manera similar a la del ejemplo de referencia 6, excepto porque no se us� glicina. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de DHA de 4,4 % en peso.
(Ejemplo comparativo 6)
Se obtuvo un fosfol�pido unido a un ácido graso altamente insaturado (DHA) en posición 2 de manera similar a la del ejemplo de referencia 8, excepto porque no se usaron glicina ni alanina. En cuanto a la composición de ácidos grasos, la fracción de fosfol�pido y lisofosfol�pido obtenida tenía un contenido de DHA de 7,6 % en peso.

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un procedimiento para producir un fosfol�pido, comprendiendo el procedimiento:
    producir un fosfol�pido mediante esterificaci�n de un lisofosfol�pido con un donante de acilo por la fosfolipasa A2 en glicerina; y entonces añadir un disolvente inmiscible con glicerina, formando una capa de glicerina y una capa de disolvente; extraer el fosfol�pido en la capa de disolvente; transferir la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina; y entonces recoger la capa de glicerina; retirar el disolvente restante por evaporación de la capa de glicerina, dando una disolución de glicerina; añadir un lisofosfol�pido y un donante de acilo a la disolución de glicerina; y reesterificar usando la fosfolipasa A2 restante en la disolución de glicerina.
  2. 2.
    El procedimiento para producir un fosfol�pido según la reivindicación 1, en el que se añade un disolvente cetona como disolvente inmiscible con glicerina.
  3. 3.
    El procedimiento para producir un fosfol�pido según la reivindicación 1, en el que se añade un alcohol de 4 átomos de carbono o menos después de la esterificaci�n, y se añade entonces al menos un disolvente seleccionado del grupo consistente en disolventes hidrocarburos, disolventes cetonas y disolventes ésteres como disolvente inmiscible con glicerina.
  4. 4.
    El procedimiento para producir un fosfol�pido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que, en la esterificaci�n, se añade un amino�cido y/o un p�ptido de 3 residuos aminoac�dicos o menos a un sistema de reacción, en el que el amino�cido es al menos uno seleccionado del grupo consistente en glicina, alanina, asparagina, glutamina, isoleucina, leucina, serina, treonina, valina, fenilalanina y tirosina, y en el que el p�ptido es una combinación que incluye glicina, alanina y/o serina.
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