CN102302487A - 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用 - Google Patents

穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102302487A
CN102302487A CN201110184294A CN201110184294A CN102302487A CN 102302487 A CN102302487 A CN 102302487A CN 201110184294 A CN201110184294 A CN 201110184294A CN 201110184294 A CN201110184294 A CN 201110184294A CN 102302487 A CN102302487 A CN 102302487A
Authority
CN
China
Prior art keywords
andrographolide
medicine
hepatitis
preparation
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201110184294A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102302487B (zh
Inventor
戴桂馥
徐海伟
蒋志雯
刘宏民
王亚楠
李伟义
巫凤娟
朱丽平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Original Assignee
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN2011101842944A priority Critical patent/CN102302487B/zh
Publication of CN102302487A publication Critical patent/CN102302487A/zh
Priority to JP2014517429A priority patent/JP5923167B2/ja
Priority to PCT/CN2012/078083 priority patent/WO2013004171A1/zh
Priority to US14/130,695 priority patent/US20140187627A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN102302487B publication Critical patent/CN102302487B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D307/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/32—Oxygen atoms
    • C07D307/33—Oxygen atoms in position 2, the oxygen atom being in its keto or unsubstituted enol form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，公开了穿心莲内酯C15位取代系列衍生物在制备抗乙型病毒性肝炎药物中的应用。本发明利用HepG2.2.15细胞，检测培养液上清中乙肝病毒表面抗原（HBsAg）分泌量，通过对大量穿心莲内酯衍生物化合物进行筛选，优选具有良好抗HBV作用的化合物，其具有通式1结构。该类化合物抗HBV活性高效低毒，将作为活性成份用于制备抗乙型病毒性肝炎药物，为肝炎的治疗提供了新的药物途径，从而扩大了临床用药的可选择范围。通式1 。

Description

穿心莲内酯C15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及穿心莲内酯衍生物的药物用途，具体涉及穿心莲内酯C15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用，属于药物化学技术领域。
背景技术
穿心莲内酯(andrographolide，AD)为爵床科植物穿心莲[Andrographis paniculata (Burm. f) Nees] 中提取得到的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成分之一，临床上主要用于治疗上呼吸道感染、细菌性痢疾等疾病。近年来，研究发现穿心莲内酯还具有抗肿瘤、保肝利胆、抗病毒等作用。有关穿心莲及其提取物抗病毒研究已有许多报道。穿心莲提取物可有效治疗呼吸道感染和病毒性肺炎，有效降低与普通感冒有关症状的流行性和强度；穿心莲总黄酮和穿心莲内酯或其衍生物组合对流感病毒、腺病毒有抑制作用，对疱疹病毒有一定的延缓作用（CN: 200610080719.6）。穿心莲内酯及其衍生物有抗黄病毒、瘟病属或丙型肝炎病毒（CN: 200580046253.1）、抗SARS(CN：03129127.9) 作用。穿心莲中的成分与其它植物或其成分形成的组合物具有抗病毒作用。美国专利（5，833，994）公开了芳烃受体配体和穿心莲内酯联合用于治疗病毒感染的用途。穿心莲内酯琥珀酸单酯通过干扰病毒与细胞结合和在病毒复制周期随后至病毒与细胞结合阶段干扰抑制HIV。穿心莲甲醇提取物可通过抑制c-Mos 在体外抑制HIV-1复制。然而，也有报道称，穿心莲的水性提取物对HIV-1活性作用很小或无抗病毒作用；穿心莲的提取物对乙型肝炎表面抗原的表达作用很小或无作用。
肝炎B病毒（hepatitis B virus，HBV）是人类hepadnaviradae病毒家族的一员，是乙型肝炎的病原体。全球有超过3.5亿人感染了HBV，在中国约有1.2亿人长期携带乙肝病毒。因此，抗HBV药物的市场需求巨大。目前抗HBV的药物主要是以拉米夫定为代表的核苷类似物和以干扰素类为代表的免疫调节剂。临床应用中存在停药后反跳、不良反应和易产生耐药性等问题。
以穿心莲内酯（AD）为先导化合物合成的15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物，在专利CN: 200510107247.4已有所报导，为本申请人前期研究成果。随后，发现其中α-葡萄糖苷酶抑制剂15-对氯苯基亚甲基-3，19-烟酸酯-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯体外具有显著的抗HBV作用，在专利CN：200810231375.3.已有所报导，为本申请人前期研究成果。在此领域继续开发研究、探讨穿心莲内酯C15位取代系列化合物是否对乙型肝炎有抑制活性，对开拓此类化合物的应用及保护我国自主知识产权具有重要意义。
发明内容
本发明人在前期研究成果的基础上，通过对合成的化合物进行抗乙型肝炎活性筛选，发现通式1 结构的穿心莲内酯衍生物具有显著的抗乙型肝炎作用。本发明目的在于提供其在制备抗乙型肝炎药物中的应用。
本发明所述化合物的结构式为：
Figure 418968DEST_PATH_IMAGE001
通式1
R1为氢；R2为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基或甲氧基多取代的苯基或甲氧基单取代的苯基；R3、R4为氢、COR5；R5为3-吡啶基；但R2为4-氯苯基时，R3、R4不为COR5；
优选化合物为：R1为氢；R2为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基或者3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基； R3、R4为氢。
优选化合物为：R1为氢；R2为苯基、4-氟苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基或者3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基；R3、R4为COR5 ，R5=3-吡啶基。
更优选化合物为：A: R1=H，R2=4-Cl-C6H4， R3= R4=H；
B: R1=H，R2=C6H5， R3= R4=H；
C: R1=H，R2=4-F-C6H4， R3= R4=H；
D: R1=H，R2=4-F-C6H4， R3= R4=COR5，R5=C5H4N；
E: R1=H，R2=4-Br-C6H4， R3= R4=H；
F: R1=H，R2=3-Br-C6H4， R3= R4=COR5，R5=C5H4N；
G: R1=H，R2=2,4,5-triMeO-C6H2，R3= R4=H；
本发明提出的上述化合物，其制备方法已在本研究前期申请的发明专利 CN: 200510107247.4中公开，还可以参考文献BMC, 2007 (Xu HW, et al.)。其合成方法如下：将14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯或者14-脱氧-11,12-脱氢-3,19-酯化穿心莲内酯中的一种与不同的醛溶解于甲醇或者乙醇或者四氢呋喃中，在碱催化下，于温度15~70℃下加热反应即可得到通式1所示的穿心莲内酯衍生物。其中所用的碱是碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、三乙胺、吡啶、N,N-二甲基氨基吡啶中的一种；其用量为0.2~5%摩尔。
所用醛是苯甲醛、卤代苯甲醛、对甲氧基苯甲醛等，卤代苯甲醛优选对氟苯甲醛，对氯苯甲醛，对溴苯甲醛；所用14-脱氧-11,12-脱氢-3,19-酯化穿心莲内酯与通式1中当 R3、R4为COR5，R5为3-吡啶基时相对应。
为实现本发明目的，本实验采用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌HepG2.2.15细胞，研究穿心莲内酯C15位取代衍生物体外抗HBV作用；采用鸭乙型肝炎病毒感染模型，研究体内抗鸭乙肝病毒作用。研究证实上述化合物具有抗HBV（DHBV）作用，可以用于制备抗HBV药物。以该类化合物为有效药用成份，或与其它药物组合，按目前各种常规的制药方法和工艺要求，与制药中可以接受的辅助和/或添加成份混合后，制成用于抗乙肝病毒的口服型制剂、注射型制剂等药物。口服型制剂为含片、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆等；注射型制剂包括注射液或冻干粉针剂型等。
本发明优点及创新点：本实验通过活性筛选，确定上述化合物具有明确的抗HBV活性，高效低毒，用于乙型肝炎的治疗和预防，为开发抗HBV药物提供了新的药物途径，而且扩大了临床用药的可选择范围。
附图说明
图1为本发明衍生物A～G体外抗 HBsAg 分泌结果图；拉米夫定IC50约为10μg/mL（43.67μmol/L）；药物作用时间为9d ；
图2为本发明衍生物A～G体外抗HBV治疗指数结果图；拉米夫定TI >2 ；药物作用时间为9d ；
图3 本发明衍生物A～G（浓度0.35mmol/kg）体内抗DHBV作用（第5d）结果图；阳性药拉米夫定（3TC）给药剂量为20mg/kg体重；与模型组相比，*P<0.05, ** P<0.01。
图4本发明衍生物A体内抗DHBV作用结果图；阳性药拉米夫定（3TC）给药量为50mg/kg；与模型组相比，*P<0.05, ** P<0.01。
具体实施方式
通过上述方法合成化合物A～G。
A化合物: R1=H，R2=4-Cl-C6H4， R3= R4=H；其IR 3413, 2934, 1749, 1632, 1490, 1442, 1090, 1035, 891 cm-1; 1H NMR(400M Hz, CDCl3) 7.77(2H, d, J=6.8 Hz), 7.49(1H, m), 7.40(3H, m), 6.86(1H, dd.J=10.0, 15.6 Hz), 6.24(1H, d, J=16.0 Hz), 6.17(1H, s), 4.76(1H, s), 4.48(1H, s), 4.03(1H.d, J=10.8 Hz), 3.25(1H, d, J=10.8 Hz), 3.31(1H, t, J=7.2 Hz), 2.41(2H, m), 2.03(1H, m), 1.78(1H, m), 1.64(2H.m), 1.44(1H, m), 1.35(1H, 1H, m), 1.23(2H, m), 1017(3H, s), 0.82(3H, s); 13CNMR (100M Hz, CDCl3): δ 168.4, 148.9, 148.1, 137.7, 136.5, 131.7, 131.2, 129.9, 126.9, 121.5, 131.5, 108.8, 79.5, 63.4, 61.6, 5434, 42.7, 38.8, 38.4, 36.6, 28.1, 23.2, 15.9；HR-MS m/z: [M+Na]+, 461.2130, (calcd.461.2104).
B化合物: R1=H，R2=C6H5， R3= R4=H；其IR 3393, 2933, 2847, 1750, 1644, 1450, 1036, 942, 894, 758, 690 cm-1; 1H NMR(400M Hz, CDCl3) 7.77(2H, d, J=7.6 Hz), 7.40(2H, m), 7.32(1H, m), 7.12(1H, s), 6.92(1H, dd, J=10.0, 15.7 Hz), 6.20(1H, d, J=15.7 Hz), 5.96(1H, s), 4.80(1H, s), 4.54(1H, s), 4.24(1H, bs), 3.49(1H, bs), 3.38(1H, bs), 2.46(1H, d, J=13.4 Hz), 2.36(1H, d, J=10.0 Hz), 2.27(2H, bs), 2.05(1H, t, J=13.0 Hz), 1.8(3H, m), 1.54(1H, J=13.0 Hz), 1.41(1H, m), 1.38(3H, s), 1.14(2H, m), 0.84(3H, s); 13CNMR (100M Hz, CDCl3): δ 168.8, 148.0, 147.5, 137.6, 135.5, 133.2, 130.4, 128.9, 128.8, 127.0, 121.5, 133.1, 109.3, 80.8, 64.2, 61.9, 54.6, 13.0, 38.7, 38.3, 36.5, 28.1, 22.9, 22.8, 15.9；HR-MS m/z: [M+Na]+, 443.2187, (calcd.443.2199).
C化合物: R1=H，R2=4-F-C6H4， R3= R4=H；其IR 3293, 3081, 2944, 2849, 1747, 1642, 1600, 1507, 1449, 1418, 1232, 1362, 1038, 986, 943, 989 cm-1; 1H NMR (400M Hz, CDCl3) 7.80(2H, m), 7.73(1H, s), 7.30(2H, m), 6.83(1H, dd, J=10.1, 15.8 Hz), 6.35(1H, s), 6.27(1H, d, 15.8 Hz), 5.05(1H, bs), 4.75(1H, s), 4.45(1H, s), 4.1(1H, bs), 3.86 (1H, d, J=10.9), 3.30(1H, d, J=13.0 Hz), 3.23(1H, m), 2.43(1H, d, J=10.1 Hz), 2.38(1H, br), 2.0(1H, m), 1.71(1H, br), 1.59(2H, m), 1.38(1H, m), 1.34(1H, m), 1.20(2H, m), 1.10(3H, s), 0.79(3H, s). 13CNMR(100M Hz, CDCl3): δ 168.6, 163.4, 163.4, 160.9, 148.9, 147.3, 137.2, 132.6, 132.5, 130.1, 126.2, 121.5, 136.3, 136.1, 131.8, 108.4, 78.8, 62.9, 60.9, 53.9, 42.6, 38.7, 38.2, 36.4, 27.8, 23.3, 23.2, 15.7；HR-MS m/z: [M+Na]+ 461.2130 (calcd. 461.2104).
D化合物: R1=H，R2=4-F-C6H4， R3= R4=COR5，R5=C5H4N；其IR: 3440.3, 2938.6, 2849.1, 1763.8, 1716.9, 1639.9, 1593.7, 1465.9, 1287.9, 1248.1, 1194.5, 1115.6, 1027.9, 743.3 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ9.15(2H, br), 8.75(2H, br), 8.24(2H, m), 7.73(2H, d, J=8.8Hz), 7.39(1H, br), 7.26(1H, br), 7.12(1H, s), 7.02(1H, dd, J=10.0, 15.6Hz), 6.95(2H, d, J=8.8Hz), 6.27(1H, d, J=15.4Hz), 6.02(1H, s), 5.02(1H, t, J=8.04), 4.85(2H, om), 4.62~4.56(2H, om), 2.55(1H, d, J=13.3Hz), 2.46(1H, d, J=10.0Hz), 2.13(1H, br), 1.98(1H, br), 1.89(2H, br), 1.68(2H, om), 1.52(1H, m), 1.39(1H, m), 1.25(3H, s), 1.01(3H, s).
E化合物: R1=H，R2=4-Br-C6H4， R3= R4=H；其IR 3291, 2927, 2851, 1747, 1642, 1603, 1510, 1457, 1257, 1377, 1035, 941, 900 cm-1; 1H NMR(400M Hz, CDCl3) 7.73(2H, d, J=8.8 Hz), 7.10(1H, s), 6.92(2H, d, J=8.8 Hz), 6.87(1H, dd, J=10.1, 15.8 Hz), 6.19(1H, d, J=15.8 Hz), 5.92(1H, s), 4.79(1H, d, J=0.89 Hz), 4.55(1H, d, J=0.89 Hz), 4.22(1H, d, J=13.0 Hz), 3.48(1H, m), 3.35(1H, d, J=13.0 Hz), 2.45(1H, m), 2.35(1H, d, J=10.0 Hz), 2.04(1H, m), 1.79(2H, m), 1.74(1H, m), 1.54(1H, m), 1.34(1H, m), 1.27(3H, s), 1.24(1H, m), 1.15(1H, m), 0.84(3H, s)；13CNMR (100M Hz, CDCl3): δ 169.0, 160.2, 148.1, 146.2, 136.8, 135.6, 132.2, 126.2, 125.9, 121.6, 134.4, 133.1, 109.3, 64.2, 61.9, 55.3, 54.7, 43.0, 38.7, 38.3, 36.6, 28.1, 22.9, 22.6, 15.9.
F化合物: R1=H，R2=3-Br-C6H4， R3= R4=COR5，R5=C5H4N；其IR:3426, 2929, 2853, 1768, 1720, 1640, 1591, 1473, 1421, 1285, 1117, 990, 895, 742, 700 cm-1; 1H NMR (400 M Hz, CDCl3): δ 9.14(2H, br), 8.73(2H, br), 8.26(1H, d, J=8.8 Hz), 8.22(1H, d, J=8.0 Hz), 7.86(1H, s), 7.73(1H, d, J=8.0 Hz), 7.43(1H, m), 7.38(1H, m), 7.29(1H, d, J=7.9 Hz), 7.24(1H, m), 7.13(1H, s), 6.90(1H, dd, J=10.0, 15.6 Hz), 6.27(1H, d, J=15.6 Hz), 5.89(1H, s), 5.02(1H, t, J=8.0 Hz), 4.86(2H, ol), 4.61(1H, s), 4.57(1H, m), 2.55(1H, br), 2.48(1H, d, J=10.0 Hz), 2.16(1H, br), 2.02(1H, br), 1.91(2H, br), 1.71(2H, ol), 1.52(1H, d, J=11.4 Hz), 1.29(1H, m), 1.25(3H, s), 1.02(3H, s); 13C NMR (100.6 M Hz, CDCl3): δ :168.4, 165.1, 164.7, 153.2, 150.5, 148.3, 147.4, 137.7, 137.5, 135.6, 135.3, 132.9, 131.7, 131.4, 130.5, 126.2, 123.5, 121.9, 111.4, 109.9, 81.2, 65.5, 61.9, 54.9, 42.2, 38.9, 38.3, 36.6, 29.7, 24.4, 23.9, 22.8, 15.5; HRMS m/z: (M+H+)709.1918(calcd.709.1913).
G化合物：R1=H，R2=2,4,5-triMeO-C6H2，R3= R4=H；其IR 3431, 2936, 2845, 1760, 1643, 1578, 1505, 1455, 1422, 1335, 1250, 1128, 1033, 892; 1H NMR(400M Hz, CDCl3) δ 7.1(1H, s), 7.01(2H, br), 6.90(1H, dd, J=10.1, 15.6 Hz), 6.22(1H, d, J=15.6 Hz), 5.88(1H, s), 4.80(1H, s), 4.54(1H, s), 4.22(1H, d, J=10.7 Hz), 3.90(9H, om), 3.48(1H, m), 3.35(1H, d, J=10.8 Hz), 2.45(1H, d, J=13.2 Hz), 2.35(1H, d, J=10.1 Hz), 2.01(1H, br), 1.82~1.74(3H, om), 1.53(1H, d, J=13.2 Hz), 1.38(1H, m), 1.27(3H, s), 1.24~1.13(2H, om), 0.84(1H, s); 13CNMR (100M Hz, CDCl3): δ 168.7, 153.2, 148.0, 147.1, 137.5, 135.3, 128.8, 126.6, 121.4, 114.8, 113.0, 109.3, 107.7, 106.5, 80.8, 64.1, 61.8, 60.9, 56.3, 56.2, 54.6, 43.0, 38.7, 38.3, 36.5, 28.1, 22.9, 22.6, 15.9, 14.1; HR-MS m/z: [M+Na]+ 533.2519, (calcd.533.2515).
以化合物A～G 为例，通过药理试验，详细说明其抗HBV活性。
实施例1 穿心莲内酯衍生物体外抗HBV活性实验
1、细胞培养和药物处理
采用人乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌HepG2.2.15细胞，检测本发明药物对HepG2.2.15细胞培养液上清中分泌HBV 表面抗原（HBsAg）的影响。将HepG 2.2.15 细胞悬液接种于48孔板中，细胞数为1.25×104/孔, 加RPMI1640培养液0.5 mL, 培养液中含体积分数10 %胎牛血清、380 μg/ mL G418、100μg/ mL 链霉素、100 IU/ mL 青霉素, 置体积分数5 %CO2的二氧化碳培养箱中置于37 ℃培养，24 h换含药培养液，药物浓度设5个梯度。用拉米夫定(lamivudine, 3TC)做阳性药物对照。分别于培养3d 、6d更换一次培养液, 培养第9天取出培养孔中的上清液, 进行HBsAg检测。板中细胞用MTT 法测细胞活性。
2、MTT法测定细胞毒
细胞培养9 d 后, 吸出各孔上清液，每孔加100μL 浓度为0. 5mg/ mL MTT [3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）] 的PBS 溶液，37 ℃培养4 h , 弃去培养液, 每孔加入100μL 二甲基亚砜, 振荡10min , 用酶标仪测定490 nm 处A 值, 与空白对照孔A 值比较, 以空白对照孔的细胞存活率为100 % , 计算各孔存活细胞百分比。
3、ELISA法检测HepG2.2.15细胞培养上清中的HBsAg
采用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（市售品），按照说明书操作对HBsAg进行检测。用酶标仪（美国BIO-TEK公司Powerwave X型）使用双波长比色，测定波长为450nm，参考波长为630nm，读取各孔OD值。计算药物对HBsAg的抑制率和治疗指数。
抑制率= [对照孔OD - 实验孔OD] ÷ 对照孔OD ×100%；治疗指数(TI)=半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50)。其中TI≥2为有效低毒。
4、活性结果
通过对穿心莲内酯衍生物进行筛选，发现本发明所述的化合物A-G显著降低HepG2.2.15细胞培养液上清中HBV表面抗原HBsAg的含量，呈时间、剂量依赖性。化合物作用9d 对HBsAg的IC50值均小于4.0μmol/L，如图1所示。阳性对照物拉米夫定的IC50值约为10μg/mL (43.67μmol/L)。
各化合物的治疗指数结果见图2。除了化合物F外，治疗指数均大于2。说明该类衍生物有效低毒。
实施例2 穿心莲内酯衍生物体内抗DHBV活性实验
1、实验动物及材料：樱桃谷鸭，雄性，购自某鸭厂；DHBV阳性血清由本实验室收集并保存。
2、仪器、药物及其配制：瑞士Roche公司生产的型号为LightCycler® 1.5荧光定量PCR系统；美国Millipore有限公司生产的Milli-Q-B.S型超纯水仪；美国Sigma公司生产的3K30型冷冻高速离心机。本发明化合物A-G由本申请人合成；拉米夫定为市售品。将上述实验药物配成0.5%的CMC-Na溶液，用吐温-80(终浓度0.1%)助溶。SYBR Green I 为宝生物工程（大连）有限公司产品。上下游引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
3、实验方法：
1日龄樱桃谷鸭经颈静脉无菌采血约200µL，分离血清，提取DNA，用普通PCR方法检测筛选出先天DHBV阴性、体况基本一致的雏鸭供实验用。对3日龄阴性鸭经腿胫静脉注射DHBV阳性鸭血清（0.2ml/只）攻毒，感染后7天自颈静脉采血，分离血清，经PCR检测阳性者分组给药。动物于每天早晨根据体重空腹灌胃给药，1次/日，1mL/200g；先选取结构具有代表性的化合物进行初筛，给药5天，无菌操作从颈静脉采血，分离血清，分析血清中DHBV-DNA 拷贝数，计算抑制率。进一步选取活性较好的化合物A, 给药2周（1次/日），分别于给药后7d、14d 和停药后5d，颈静脉采血，分离血清，分析血清中DHBV-DNA拷贝数，计算抑制率。血清中DHBV-DNA的测定采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法 [扬州大学学报(农业与生命科学版)；2010，31（3）]。
DHBV-DNA抑制率（%）=(模型组copies-给药组copies) /模型组copies×100%
实验数据用 SPSS17.0 统计软件处理，采用t检验法进行统计学分析。数据以均数±标准差（
Figure 323339DEST_PATH_IMAGE002
）表示，以P<0.05 作为差异显著的统计学意义界限。
4、活性结果：
如图3、图4所示， 给药5d，各试验化合物均能显著降低血清中DHBV-DNA的拷贝数，与模型组比P<0.05，其中化合物A抑制率达57.8%，与模型组比P<0.01。说明本发明的化合物体内抗DHBV作用明确。进一步以化合物A为代表，研究给药7d、14d及停药后5d对血清中DHBV-DNA拷贝数的影响。结果表明，与模型组相比，化合物A低、高剂量组均显著降低血清中DHBV-DNA拷贝数，停药后5d，化合物A的抗DHBV 效果仍基本保持。拉米夫定在20mg/kg（图3）和50mg/kg剂量（图4），在给药期间对DHBV-DNA的抑制作用均较强，但停药后出现严重的反跳现象。
实施例3 化合物A和B的限量毒性实验
动物：清洁级昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄各半，河南省实验动物中心提供。合格证号：0009898。
药物：本申请人合成的化合物A、B。
实验方法：动物随机分组，禁食12h后（不限饮水），分别一次性灌胃给予剂量为5.00g/kg的化合物A和B。观察、记录动物的状态，有无中毒表现。结果见表1。
实验结果：小鼠没有出现明显中毒表现，且未有死亡，说明该类化合物的急性毒性甚微。作为制备抗HBV药物，具有较好的实用、开发价值。
表1限量毒性实验
化合物 剂量（g/kg） 动物数n 死亡数n 死亡百分率%
A 5.00 10 0 0
B 5.00 10 0 0
综上所述，该类衍生物具有明确的抗HBV活性，高效低毒，可用于治疗和预防乙型肝炎药物的制备，为临床药物的开发和筛选提供可能，具有应用价值。

Claims (6)

1.结构如通式1所示的穿心莲内酯C15位取代衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份用于制备抗乙型病毒性肝炎药物，
通式1
R1为氢；R2为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基或甲氧基多取代的苯基或甲氧基单取代的苯基；R3、R4为氢或COR5；但R2为4-氯苯基时，R3、R4不为COR5；R5为3-吡啶基。
2.如权利要求1所述的穿心莲内酯C15位取代衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，所述的化合物为 ：R1为氢；R2为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基或者3-甲氧基苯基或4-甲氧基苯基； R3、R4为氢。
3.如权利要求1所述的穿心莲内酯C15位取代衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，所述的化合物为 ：R1为氢；R2为苯基、4-氟苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、3-甲氧基苯基或4-甲氧基苯基；R3、R4为COR5 ，R5=3-吡啶基。
4.如权利要求1所述的穿心莲内酯C15位取代衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，所述的化合物为以下其中之一 ：A: R1=H，R2=4-Cl-C6H4， R3= R4=H；
B: R1=H，R2=C6H5， R3= R4=H；
C: R1=H，R2=4-F-C6H4， R3= R4=H；
D: R1=H，R2=4-F-C6H4， R3= R4=COR5，R5=C5H4N；
E: R1=H，R2=4-Br-C6H4， R3= R4=H；
F: R1=H，R2=3-Br-C6H4， R3= R4=COR5，R5=C5H4N；
G: R1=H，R2=2,4,5-triMeO-C6H2，R3= R4=H。
5.
如权利要求1-4其中之一所述的穿心莲内酯C15 位取代衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份或与其它药物组合，与制药中可以接受的辅助和/或添加成分混合后，按常规的制药方法和工艺要求，制成用于抗病毒性肝炎的口服型制剂、注射型制剂药物。
6.如权利要求5所述的穿心莲内酯C15位取代衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，口服型制剂为含片、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆；注射型制剂为注射液或冻干粉针剂型。
CN2011101842944A 2011-07-04 2011-07-04 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用 Active CN102302487B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011101842944A CN102302487B (zh) 2011-07-04 2011-07-04 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用
JP2014517429A JP5923167B2 (ja) 2011-07-04 2012-07-03 抗ｂ型肝炎薬の調製のためのアンドログラホリドｃ１５位置換シリーズ誘導体の使用
PCT/CN2012/078083 WO2013004171A1 (zh) 2011-07-04 2012-07-03 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用
US14/130,695 US20140187627A1 (en) 2011-07-04 2012-07-03 Uses of c15-substituted andrographolide derivatives in the preparation of anti-hepatitis b virus medicament

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011101842944A CN102302487B (zh) 2011-07-04 2011-07-04 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102302487A true CN102302487A (zh) 2012-01-04
CN102302487B CN102302487B (zh) 2013-04-10

Family

ID=45376477

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011101842944A Active CN102302487B (zh) 2011-07-04 2011-07-04 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20140187627A1 (zh)
JP (1) JP5923167B2 (zh)
CN (1) CN102302487B (zh)
WO (1) WO2013004171A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102526026A (zh) * 2012-02-10 2012-07-04 郑州大学 15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备保肝药物中的用途
CN102600129A (zh) * 2012-02-10 2012-07-25 郑州大学 穿心莲内酯c15位取代衍生物在制备抗丙型肝炎药物中的应用
WO2013004171A1 (zh) * 2011-07-04 2013-01-10 郑州大学 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用
WO2013117149A1 (zh) * 2012-02-10 2013-08-15 郑州大学 15-苄亚基-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备保肝及抗丙肝病毒药物中的用途
CN103739597A (zh) * 2014-01-09 2014-04-23 中国科学院昆明植物研究所 14-脱氧-14,15-二脱氢穿心莲内酯衍生物及其药物组合物和用途
WO2018177301A1 (zh) * 2017-04-01 2018-10-04 郑州大学 15-亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物及其在制备抗纤维化药物中的应用
CN109796429A (zh) * 2018-03-02 2019-05-24 郑州大学 穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物系列iii及其制备方法和用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220047663A1 (en) * 2020-08-12 2022-02-17 Shibban Krishen Ganju Formulation for inhibiting virus replication

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101416958A (zh) * 2008-12-15 2009-04-29 郑州大学 15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100543021C (zh) * 2005-12-07 2009-09-23 郑州大学 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物及其制备方法
CN101416959B (zh) * 2008-12-15 2010-11-10 郑州大学 15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物在制备抗炎解热镇痛药物中的用途
CN101972247B (zh) * 2010-10-22 2012-06-06 郑州大学 15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物的药物用途
CN102302487B (zh) * 2011-07-04 2013-04-10 郑州大学 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101416958A (zh) * 2008-12-15 2009-04-29 郑州大学 15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的用途

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013004171A1 (zh) * 2011-07-04 2013-01-10 郑州大学 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用
JP2015506964A (ja) * 2012-02-10 2015-03-05 ツェンチョウ ユニバーシティー １５−ベンジリデン−１４−デオキシ−１１，１２−ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の肝臓保護及び抗ｃ型肝炎ウイルス医薬品製造における使用
CN102600129A (zh) * 2012-02-10 2012-07-25 郑州大学 穿心莲内酯c15位取代衍生物在制备抗丙型肝炎药物中的应用
WO2013117149A1 (zh) * 2012-02-10 2013-08-15 郑州大学 15-苄亚基-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备保肝及抗丙肝病毒药物中的用途
CN102600129B (zh) * 2012-02-10 2014-05-28 郑州大学 穿心莲内酯c15位取代衍生物在制备抗丙型肝炎药物中的应用
CN102526026A (zh) * 2012-02-10 2012-07-04 郑州大学 15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备保肝药物中的用途
US9388169B2 (en) 2012-02-10 2016-07-12 Zhengzho University Use of 15-benzylidene-14-deoxy-11, 12-dehydroandrographolide derivative in manufacture of medicaments for protecting liver and anti-hepatitis C virus
US9636324B2 (en) 2012-02-10 2017-05-02 Zhengzhou University Use of 15-benzylidence-14-deoxy-11, 12 -dehyroandrographolide derivative in manufacture of medicaments for protecting liver and anti-hepatitis C virus
CN103739597A (zh) * 2014-01-09 2014-04-23 中国科学院昆明植物研究所 14-脱氧-14,15-二脱氢穿心莲内酯衍生物及其药物组合物和用途
CN103739597B (zh) * 2014-01-09 2016-04-06 中国科学院昆明植物研究所 14-脱氧-14,15-二脱氢穿心莲内酯衍生物及其药物组合物和用途
WO2018177301A1 (zh) * 2017-04-01 2018-10-04 郑州大学 15-亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物及其在制备抗纤维化药物中的应用
CN109796429A (zh) * 2018-03-02 2019-05-24 郑州大学 穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物系列iii及其制备方法和用途
CN109796429B (zh) * 2018-03-02 2023-04-11 郑州大学 穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物系列iii及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
US20140187627A1 (en) 2014-07-03
JP5923167B2 (ja) 2016-05-24
JP2014518225A (ja) 2014-07-28
CN102302487B (zh) 2013-04-10
WO2013004171A1 (zh) 2013-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102302487B (zh) 穿心莲内酯c15位取代系列衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的应用
CN102219725B (zh) 苯并杂环类化合物及其制备方法和用途
CN101132795A (zh) 用于hiv治疗的化合物
CN101416958B (zh) 15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的用途
CN104490909B (zh) 一种咖啡酸衍生物在制备具有抗rsv病毒作用的药物中的应用
CN102600129B (zh) 穿心莲内酯c15位取代衍生物在制备抗丙型肝炎药物中的应用
CN104208070B (zh) 蒲公英甾醇在制备抗hbv的药物中的应用
CN114344288B (zh) 盐酸多塞平在制备抗病毒药物中的应用
CN102218047B (zh) 治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用
CN102068452B (zh) 一种具有抗病毒作用的药物组合物
CN101856347B (zh) 火绒草属植物提取物及其活性成分在治疗肝炎中的用途
CN101774921A (zh) 二咖啡酰奎尼酸类甲酯化合物的制备方法及其组合物
CN113197901A (zh) 一种含有法匹拉韦的药物组合物及其制备方法和其应用
CN1325048C (zh) 汉黄芩素在制备治疗或预防乙肝药物中的应用
CN105601586B (zh) 一种治疗乙肝的药物组合物
CN1935131B (zh) 1β-羟基冬青酸用于制备抑制乙肝病毒的药物用途
CN103690552A (zh) 一种药物组合物及其在制备治疗乙型肝炎药物制剂中的应用
CN102050780A (zh) 喹啉衍生物,其药物组合物及其用途
CN100503592C (zh) 抗艾滋病毒活性成分毛叶假鹰爪素d和假鹰爪素及其类似物
CN110041283B (zh) 板蓝根中具有抗多种病毒活性的含硫类化合物及其用途
CN109045062B (zh) 泥鳅多糖在制备治疗或预防乙肝药物中的用途
CN105943535B (zh) 一种治疗乙肝的药物组合物
CN106619591A (zh) 奥昔卡因在制备药物中的用途及药物组合物
CN117427065A (zh) 土木香内酯抗人巨细胞病毒的新用途
CN103989688B (zh) 一种抗hbv的药物组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant