CN109796429A - 穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物系列iii及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了穿心莲内酯衍生物在制备预防和治疗各类纤维化药物中的应用，涉及穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物及其制备方法和用途，其具有通式III所示结构。经实验证明，该类化合物显著抑制肝星状细胞LX‑2的迁移活化；显著抑制TGF‑β1诱导的人肺泡Ⅱ型样细胞A549和肾上皮细胞HK‑2间充质转化（EMT）；显著抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的原代人心肌成纤维细胞HCFB的迁移。将该类化合物作为活性成份用于制备抗人体组织器官纤维化药物，高效低毒，为与纤维化相关疾病的治疗和预防提供了新的药物途径，从而扩大了临床用药的可选择范围，具有良好的应用开发前景。

Description

穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物系列III及其制备方法和 用途

技术领域

本发明涉及穿心莲内酯衍生物、合成方法及其作为抗肝纤维化药物的应用，具体涉及穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物，属医药技术领域。

背景技术

纤维化是一种慢性疾病，多发于肝、肺、心脏、肾脏等部位。全球有1/3的人死于组织纤维化以及由此产生的器官衰竭纤维化，原因在于上皮组织受到持续性损伤后，刺激相关的效应细胞过度增殖，使细胞外基质(extracellular matrix，ECM)大量沉积，发生组织纤维化，最终导致组织逐渐失去生物功能。上皮组织组成较多的器官更易受到影响，因此，纤维化多发于肝、肺、肾、心脏等器官。

肝纤维化是由各种慢性损伤所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，严重者发展至肝硬化，最终导致肝功能衰竭。其中成纤维细胞活化及产生大量细胞外基质是导致肝纤维化的重要环节。研究表明，肝脏上皮来源细胞(肝星状细胞(HSC)、肝细胞、胆管上皮细胞)均可通过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)转变为成纤维细胞。在肝脏受损伤时，由于炎症和细胞因子的作用，处于静止状态的HSCs被激活，进而分泌大量的细胞外基质，并表达α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型胶原、间质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinases-2，MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)等促纤维化因子,对肝纤维化的发生和发展起着重要的作用。

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种严重的肺间质疾病，其发生的主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎，后期大量成纤维细胞病理性增殖转型及细胞外基质(ECM)进行异常积聚并取代正常的肺组织结构，实质是肺泡损伤，肺组织过度修复，异常重塑的过程。统计资料显示其5年生存率低于50％，10年生存率约30％，目前尚缺乏有效防治手段。其病因多种多样，许多慢性肺疾病，包括哮喘、支气管扩张、慢阻肺、肺结核、肺癌、间质性肺病等，都伴有纤维化病理改变。其主要病理特点包括肺组织间充质细胞增殖、细胞外基质增生沉积及肺实质的重构等。对于特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合征、嗜酸性肉芽肿等多种肺疾病而言，肺组织纤维增生和纤维化程度决定了该疾病的临床后果。这些疾病发展到晚期，严重妨碍病人正常工作和生活质量，甚至导致病人因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。

无论是各种原发性肾小球疾病，还是糖尿病、输尿管阻塞，肾功能的损害都与肾脏纤维化病变的程度密切相关。这些疾病能引起肾小管上皮细胞的凋亡、肾间质炎性细胞的浸润、肌成纤维细胞的聚集，并在一些促纤维化因子的参与下，使间质成纤维细胞增殖、细胞外基质(ECM)过量沉积、肾小管萎缩等，而产生肾间质纤维化，导致肾功能严重受损。肾脏纤维化是慢性肾脏病的共同病理过程，是造成肾衰竭的主要原因之一。肾脏纤维化是一个多因素参与的复杂过程，包括转化生长因子、细胞分泌因子、氧化应激、炎症刺激等。

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是在现代医学研究基础上提出的病理名称，指在病理状态下心肌间质心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)(主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维)沉积异常增加，导致心室顺应性下降，影响心脏的正常收缩与舒张功能。MF是多种心脏疾病发展至一定阶段具有的共同病理改变，也是引起心室重塑的关键原因，近年来大量研究表明，心肌纤维化与许多心脏疾病有密切关系，如心房纤颤、心肌梗死、慢性心力衰竭、风湿性心瓣膜病等。常由风湿性心脏病、高血压、心肌梗死及心力衰竭等疾病诱发，在增龄和冠状动脉粥样硬化过程中也会发生MF，主要病理表现有心肌僵硬度增加，心肌收缩力下降，冠脉血流储备降低，甚至引起恶性心律失常和猝死。

在组织纤维化的发生过程中，成纤维母细胞和肌成纤维细胞是组织纤维化的关键效应细胞，这些效应细胞可以大量释放构成ECM的胶原成分，诸如Ⅰ型和Ⅲ型胶原。多种细胞因子也参与纤维化的进程，其中最关键的是转化生长因子-β(TGF-β)。TGF-β是调节细胞增殖、分化的多功能细胞生长因子，可以通过直接刺激原位成纤维细胞的活化或通过内皮间质化(endothelial-mesenchymal transition，EnMT)、上皮间质化(EMT)过程来刺激肌成纤维细胞的大量增殖和ECM的过度合成。当TGF-β由于损伤持续被活化时，会交叉激活MAPK、EGF、Wnt/β-catenin信号，导致纤维化的发展。除了TGF-β外，对血小板衍生因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管新生相关细胞因子、整合素、金属基质蛋白酶(MMP)及其抑制剂(TIMP)、肾素血管紧张素相关蛋白、利钠肽等的调节也将影响纤维化的发生。

现已有的治疗组织纤维化药物比如多肽类药物，已有显著的发展，比如治疗肝纤维化的药物LSKL通过竞争结合TSP-1 412～415位的Lys-Arg-Phe-Lys(KRFK)序列来抑制TSP-1激活TGF-β1调节TGFβ信号通路，已进入临床前研究阶段。已经上市的治疗心肌纤维化的药物Carperitide可显著降低TGF-β、CTGF、PAI-1、CollagenⅢ的表达，达到治疗腹膜透析所致腹膜纤维化的目的。AcSDKP作为一种多肽类药物，源自人体胸腺素β4(thymosinβ4)氨基端的四肽段，是ACE的底物。参与肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性的调节，具有显著的心血管保护作用。在多个动物模型中，诸如白介素-1β(IL-1β)诱导的心脏纤维化模型、博来霉素诱导的肺纤维化模型、四氯化碳诱导的肝纤维化模型、糖尿病相关肾脏纤维化和单侧输尿管梗阻(UUO)致肾间质纤维化模型等，AcSDKP均显示出其抗纤维化的作用：AcSDKP减弱了炎症反应，抑制纤维化效应细胞的增殖和分化，抑制胶原的沉积，减缓纤维化的发病进程，已进入临床前研究阶段。现已有的专利中涉及用于预防或治疗人体组织器官各种纤维化疾病的药物有很多：包括肺纤维化、肝纤维化、肾脏纤维化和心脏纤维化。THERALY制药公司(专利号：CN106573049A)，发现了一种组合物，可用于选择性地去除肝纤维化和肝硬化的起源(即肝星状细胞HSC)和胰腺纤维化和胰腺炎的起源(活化的胰星状细胞PSC)，并且可以通过同时减少由这些活化的星状细胞分泌或诱导的多种纤维化相关分子来有效地降低或预防人体组织器官的进一步慢性纤维化。普罗米蒂克生物科学公司(专利号：CN105143170A)发现的一种经取代的芳族化合物，可以治疗肺纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化和心脏纤维化。通过实时定量CTGF、胶原Ⅰ等因子的表达，结果显示，经口施用化合物治疗博莱霉素诱发的肺纤维化模型，治疗组显著降低这些炎性和纤维化标志物于肺中的表达。

穿心莲内酯(Andrographolide)为爵床科植物穿心莲(Andrographispanicultata(Burm.f)Nees)中提取得到的二萜内酯类化合物，是穿心莲的主要有效成分之一，具有清热解毒、凉血消肿等功能。现代药理研究表明，穿心莲内酯具有抗炎抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、治疗心脑血管疾病、保肝利胆等作用。Kapil A[Biochem Pharmacol,1993,46(1):182-185]等发现，小鼠给予穿心莲内酯，可抑制四氯化碳、叔丁基过氧化氢引起的肝毒性作用，其作用效果与水飞蓟素相似。同时穿心莲内酯具有抗心肌缺血和抗缺血再灌注损伤、保护血管内皮细胞、调脂、降血压、抗动脉粥样硬化和预防血管形成术后再狭窄以及改善血液流变性等作用。刘国利[医药导报,2006,25(1):48-50]等论述了穿心莲内酯能够抑制某些前炎症蛋白的表达，这些蛋白在基因中起到核因子NF-κB连接位的作用，穿心莲内酯通过抑制NF-κB与DNA连接发挥抗炎作用，进而降低前炎症蛋白如COX-2的表达。很多研究对穿心莲内酯的结构改造也取得了很多进展，Fan[中国药科大学学报,2010,41(4):326-332]等以穿心莲内酯为先导物，合成了一系列结构为12-N-取代-14-脱氧穿心莲内酯的衍生物，初步评价了这些衍生物的体外抗肿瘤活性，筛选出活性显著高于穿心莲内酯的化合物，这些化合物能够使HepG2细胞中p53和Bax表达增加，同时使Bcl-2表达减少，化合物在4d具有显著的体内外抗肿瘤作用。同时广州中医药大学在2017年申请的专利(专利号：CN106974906A)中提到涉及穿心莲内酯与博来霉素配合使用，能够显著提高肿瘤模型小鼠的生存周期、体重、腹围直径及活力，同时明显减轻了肿瘤模型小鼠的肺纤维化程度，提示该药物组合物能够在增强博来霉素抗肿瘤效果的同时减轻由博来霉素引起的肺纤维化。

本发明人在前期研究中(CN200510107247.4、CN200710053807.1、CN200710053806.7、CN200610017357.6)获得了大量结构新颖的穿心莲内酯衍生物，并对部分衍生物在抗肿瘤、抗炎、抗HBV、HCV及急性肝损伤保护作用等应用领域申请了专利保护，本发明进一步合成了十氢萘结构修饰穿心莲内酯衍生物，并通过在抗组织(器官)纤维化方面进行活性试验研究。

发明内容

本发明人在前期研究成果的基础上，通过对合成的化合物进行抗肝、肺、肾纤维化活性筛选，发现通式III结构的穿心莲内酯衍生物具有显著的预防和治疗人体组织器官纤维化相关疾病的作用，高效低毒，具有开发为抗人体组织器官纤维化药物的潜力。为此，本发明目的在于提供如通式III所示的穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物及其合成方法；另一目的在于提供如通式III所示的穿心莲内酯衍生物十氢萘结构修饰在制备抗纤维化药物中的应用。

本发明所述穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物具有通式III所示结构：

其中，R₁，R₂其中之一为氢，另一为羟基；或者R₁，R₂共同组成羰基、肟、亚胺或者腙中的一种；R₃为羟基。R₄为氢、羟基、氨基、甲氨基，以及醚基团中的一种；R₅为氢、羟基；或者R₄，R₅相连成环氧结构；R₆为CH₃、CHO、C＝NHR₁₀、C＝NHNHR₁₁中的一种，其中R₁₀为C1-5的烷基，R₁₁为C1-5的烷基、甲酰胺基或者硫代甲酰胺基中的一种，或R₅，R₆相连成环氧结构；R₇为氢或羟基；R₈，R₉各自为氢或苯基、甲基、2-呋喃基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、3，4，5-三甲氧基苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基、2-甲氧基-4-氯苯基、2-羟基-4-氯苯基、2-羟基-4-甲氧基苯基、3-氨基-4-氯苯基、2-氨基-4-氯苯基、4-(N,N-二甲胺基)苯基、3-氟-4-(4-吗啉基)苯基、3-氟-4-(4-甲基哌嗪基)苯基或R₈和R₉相连成环己基、环戊基；R₈，R₉同时相同或不同。虚线双键存在或不存在，当双键存在时，R₅，R₆其中之一不存在。

优选：R₁，R₂其中之一为氢，另一为羟基；或者R₁，R₂共同组成羰基，肟；R₃为羟基；R₄为氢、羟基、氨基、甲氨基中的一种；R₅为氢、羟基；或者R₄，R₅相连成环氧结构；R₆为CH₃；R₇为氢或羟基；R₈，R₉各自为氢或苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基；R₈，R₉不同；虚线双键不存在。

进一步优选：₁，R₂其中之一为氢，另一为羟基；或者R₁，R₂共同组成羰基，肟；R₃为羟基；R₄为氢、羟基、氨基中的一种；R₅为氢、羟基；或者R₄，R₅相连成环氧结构；R₆为R₆为CH3；R₇为氢或羟基；R₈，R₉各自为氢或苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基；R₈，R₉不同；虚线双键不存在。

其中，优选如下化合物：

如上所述，以优选化合物为代表的目标化合物具有以下合成路线：

为研究本发明所述化合物在制备抗纤维化药物中的应用效果，本发明利用人肝星状细胞LX-2，测定本发明化合物对细胞迁移和活化的抑制活性，评价化合物的抗肝纤维化活性；采用人肺泡Ⅱ型样细胞A549细胞评价本发明化合物对TGF-β1诱导的A549细胞间充质转化的抑制活性，评价化合物的抗肺纤维化活性；利用近端肾小管上皮细胞HK-2评价本发明化合物对TGF-β1诱导的HK-2细胞间充质转化的抑制活性，评价化合物的抗肾纤维化活性；采用AngⅡ刺激原代人心肌成纤维细胞HCFB后检测化合物对细胞迁移的影响，评价本发明化合物抗心肌纤维化作用。

该类化合物的顺、反结构均具有抗人体器官或组织纤维化活性，以该类化合物为有效药用成份，或该类化合物的各类前药形式，单独或与其它药物组合，按目前各种常规的制药方法和工艺要求，与制药中可以接受的辅助和/或添加成份混合后，制成用于抗纤维化的口服型制剂、注射型制剂等各类药物剂型。优选将其制备治疗或预防肝、肺、肾、心脏等各类器官或组织纤维化疾病的药物。口服型制剂为片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆等；注射型制剂包括注射液或冻干粉针剂型等。

本发明优点及创新点：通过活性筛选，确定上述化合物具有明确的抗器官和/或组织纤维化活性。经实验证明，与母体化合物穿心莲内酯(AD)相比，本发明化合物抗肝、肺、肾和/或心肌纤维化作用显著提高。因此，将该类化合物作为活性成份用于制备抗人体组织器官纤维化各类药物，为纤维化相关疾病的治疗和预防提供了新的药物途径，从而扩大了临床用药的可选择范围，具有良好的应用开发前景。

附图说明

图1为AD和本发明代表的化合物(30.00μM)对人肝星状细胞LX-2活力的影响，图中：1.AD；2.III-42；3.III-73；4.III-79；5.III-81；

图2为AD和本发明代表的化合物抑制人肝星状细胞LX-2迁移的结果(统计结果)，化合物浓度为1.00μM和5.00μM，图中：1.AD；2.III-42；3.III-73；4.III-79；5.III-81；

图3为AD和本发明代表的化合物(30.00μM)对人肺泡Ⅱ型样细胞A549活力的影响，图中：1.AD；2.III-42；3.III-79；4.III-81；

图4为AD和本发明代表的化合物抑制TGF-β1诱导的人肺泡Ⅱ型样细胞A549向间充质细胞转化作用(统计结果)，化合物的低、高浓度分别为0.63μM和1.25μM；图中：1.对照；2.TGF-β1；3.TGF-β1+AD；4.TGF-β1+III-42；5.TGF-β1+III-79；6.TGF-β1+III-81；

图5为AD和本发明代表的化合物(30.00μM)对人近端肾小管上皮细胞HK-2活力的影响，图中：1.AD；2.III-42；3.III-73；4.III-79；5.III-81；

图6为AD和本发明代表的化合物抑制TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞HK-2向间充质细胞转化作用(部分显微图片；×100倍)，图中：1.正常2.TGF-β1；3.TGF-β1+III-73(0.08μM)；4.TGF-β1+AD(1.25μM。

图7为AD和本发明代表的化合物抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的原代人心肌成纤维细胞HCFB迁移作用的结果，化合物的测试浓度远低于各自的毒性浓度，其中AD的低、高浓度分别为0.32μM和0,63μM，其余为0.16μM和0.32μM；图中：1.AD；2.III-42；3.III-73；4.III-79；5.III-81。

具体实施方案

下面结合具体实施方案来阐述本发明。应理解这些实施方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明涉及的化合物不限于实施例中使用的代表性结构，可以更换不同取代基，获得具有抗人体组织器官纤维化活性的化合物；可以用各种导致纤维化的原因作为研究对象来得出本发明化合物具有抗人体组织器官纤维化作用；也可以利用其他各种体内外研究模型(方法)来得出本发明化合物具有抗人体组织器官纤维化作用。

实施例1本发明化合物抑制人肝星状细胞LX-2迁移作用

在各种炎症介质、生长因子等细胞因子的刺激下，肝星状细胞迁移到受损肝组织的炎症部位，进而增殖、活化，合成胶原等ECM成分是肝纤维化发生发展的关键。因此，采用划痕损伤法评价本发明化合物抗肝纤维化作用。

1)细胞培养和药物处理

采用人肝星状细胞LX-2(由北京北纳创联生物技术研究院提供)，与穿心莲内酯比较，研究本发明化合物的体外抗肝纤维化作用。将LX-2细胞培养在含10％(V/V)胎牛血清、100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素RPMI1640培养液中，置体积分数5％CO₂培养箱中于饱和湿度、37℃培养。穿心莲内酯由四川什邡市金鑫生物科技有限公司生产(批号：120822)，纯度大于99％；本发明化合物由本发明人所在实验室合成，纯度大于99％，下同。

2)MTT法测定细胞毒

将生长对数期的LX-2细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成3.5×10⁵/mL细胞悬液，铺于96孔板内，200μL/孔，于37℃，体积分数5％CO₂培养箱中培养24h，加入含不同浓度药物的培养基，药物终浓度最高为30.00μM,每个处理4孔重复。继续培养48h，加入MTT(5mg/mL)，20μL/孔，培养4h，弃上清，加入150μLDMSO，震荡l0min，用酶标仪测定吸光值。测定波长为570nm，参考波长为450nm。计算化合物作用后的细胞存活率，存活率(％)＝药物组A值/细胞对照组A值×100％，结果取平均值，见附图1。

3)划痕损伤法观察药物对LX-2细胞迁移的影响

将生长对数期的LX-2细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成1.0×10⁶/mL细胞悬液，铺于96孔板内，每孔200μL。培养12h之后待细胞长成融合状态，弃去原培养基，加入含0.5％(V/V)血清的培养基再同步化培养12h之后划线，用PBS洗两遍，加入200μL含待测化合物的RPMI1640培养基后立即在显微镜下拍照。设3孔重复并且设置对照。培养24h后分别在显微镜下拍照测量。计算迁移抑制率，迁移抑制率＝[1－(给药组0h划痕距离－24h划痕距离)/(空白组0h划痕距离－24h划痕距离)]×100％，结果取平均值，见附图2。

4)实验结果

附图1结果表明：在30μM浓度下，与AD比，本发明化合物对LX-2增殖的抑制作用显著降低。

结合附图1、2，结果表明：在无毒浓度下，本发明化合物可显著抑制人肝星状细胞LX-2的迁移，且与AD比，对LX-2的迁移抑制作用更强，安全指数更高。

实施例2本发明化合物抑制TGF-β1诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549间充质转化作用

存在于肺泡里的Ⅱ型肺泡上皮细胞受到炎症介质、生长因子等细胞因子的刺激，细胞形态由鹅卵石状变为梭状，完成了上皮间充质转化(EMT)，具有了间质细胞的功能，进而合成胶原纤维，大量胶原纤维沉积可加剧间质肺纤维化的病程。因此，采用形态学观察法评价本发明化合物抗肺纤维化作用。

1)细胞培养和药物处理

采用人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549，与穿心莲内酯比较，研究本发明化合物的体外抗肺纤维化作用。将A549细胞培养在含10％(V/V)胎牛血清、100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素的RPMI1640培养液中，置体积分数5％CO₂培养箱中于饱和湿度、37℃培养。

2)MTT法测定细胞毒

将生长对数期的A549细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成2.5×10⁴/mL(核实)细胞悬液，铺于96孔板内，200μL/孔，于37℃，体积分数5％CO₂培养箱中培养24h，加入含药培养基，药物终浓度最高为30.00μmol/L，每个处理4孔重复，继续培养48h。其他同时实施例1。结果取平均值，如附图3所示。

3)形态学观察法检测药物对A549细胞EMT的影响

将生长对数期的A549细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成2.5×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，每孔200μL。培养24h之后细胞长成融合状态，弃去原培养基，加入不含血清的培养基再同步化培养24h，弃去培养基，用PBS洗两遍，同时加入200μL含有TGF-β1(5ng/mL)及不同浓度待测化合物的RPMI1640培养基后立即在显微镜下拍照(100×)。设3孔重复并且设置对照。培养48h后分别在显微镜下拍照。每种化合物相同浓度的三孔下共选取5个视野，测量大于100个细胞。利用photoshopCS6图像软件对图片进行处理，并计算其圆形度(公式e＝4π×S/C²，其中e代表圆形度，S代表面积，C代表周长)。结果取平均值，见附图4。

4)实验结果

附图3结果表明，与AD比，本发明化合物对人A549细胞增殖的抑制活性显著降低。

附图3和4结果表明：本发明化合物在无毒浓度下，可显著抑制A549细胞上皮充间质转化，且与AD比，对人Ⅱ型肺泡上皮细胞间充质转化的抑制作用更强，安全指数更高。

实施例3本发明化合物抑制TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞HK-2间充质转化作用

早期研究发现肾小管上皮细胞可以向成纤维细胞转分化并表达其标志蛋白成纤维特异性蛋白(FSP1，fibroblast-specific protein 1)，肾小管上皮细胞－间充质细胞转分化是肾脏间质纤维化的重要发病机制之一。因此，采用TGF-β1刺激后形态学观察法评价本发明化合物抗肾纤维化作用。

1)细胞培养和药物处理

采用人近端肾小管上皮细胞HK-2(由中国典型培养物保藏中心提供)，与穿心莲内酯AD比较，研究本发明化合物的体外抗肾纤维化作用。将HK-2细胞培养在含10％胎牛血清(V/V)、100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素的DMEM-F12培养液中，置含体积分数5％CO₂培养箱中，于饱和湿度、37℃培养。

2)MTT法测定细胞毒

将生长对数期的HK-2细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶+0.02％EDTA(W/V)消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的DMEM-F12培养基稀释成7.0×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，200μL/孔，于37℃，体积分数5％CO₂培养箱中培养24h，更换为含不同浓度药物培养基，药物最高终浓度为30.00μM，每个处理4孔重复，继续培养48h。其他同实施例1。结果取平均值，如附图5所示。

3)TGF-1刺激后观察药物对HK-2细胞形态的影响

将生长至对数期的HK-2细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶+0.02％EDTA消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的DMEM-F12培养基稀释成5.0×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，每孔200μL。培养24h之后细胞长成单层，弃去原培养基，用0.01M PBS清洗两遍，更换无血清培养基以同步化，再培养24h后，吸弃无血清培养基，加入200μL含不同浓度待测化合物与刺激因子TGF-β1(5ng/mL)的DMEM-F12培养基。设3孔重复并且设置对照。培养48h后分别在显微镜下拍照记录。部分本发明化合物作用细胞后的形态学变化见附图6。

4)实验结果

附图5结果表明，本发明化合物除了IV-71和III-81外，对人近端肾小管上皮细胞HK-2增殖的抑制作用均未比母体化合物AD显著增高。

附图5、表1和附图6的结果表明：本发明化合物在无毒浓度下，可显著抑制HK-2细胞上皮间充质转化，且与AD比，对HK-2细胞间充质转化的抑制作用更强，安全指数更高。

表1 AD和本发明化合物对人肾小管上皮细胞HK2间充质转化作用

注：测试浓度为0.08-1.25μM；对照：上皮细胞之间具有相互作用，组织结构紧密，细胞呈典型的铺路石状；TGF-β1处理：上皮细胞失去其典型状态，细胞之间相互作用消失，组织结构相对松散，细胞密度变小，立方呈铺路石状上皮细胞转变为纺锤状纤维细胞的形态；极强(抑制作用)：细胞几乎与对照无异，视野下极少见纺锤状，胞间恢复相互作用，形态恢复其典型的铺路石状；强(抑制作用)：抑制了细胞的侵袭性，细胞紧实，细胞状态几乎完全恢复，少见纺锤纤维状细胞；中强(抑制作用)：细胞密度变大，大部分细胞仍呈立方状态

实施例4本发明化合物抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的原代人心肌成纤维细胞迁移作用

有研究表明，心肌成纤维细胞是心肌纤维化的主要效应细胞，在受到AngⅡ等活性物质刺激后会发生表型变化，迁移能力增强，转化为有分泌胞外基质功能的肌成纤维细胞。因此，与穿心莲内酯比较，采用MTT法检测本发明化合物对原代人心肌成纤维细胞HCFB增殖活力的影响；采用划痕损伤法评价本发明化合物对AngⅡ诱导的原代人肌成纤维细胞迁移的抑制作用。

1)细胞培养

将原代人心肌成纤维细胞HCFB(商城北纳创联生物科技有限公司提供)培养在含8％胎牛血清、100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素的H-DMEM培养液的培养瓶中，置于体积分数为5％CO₂培养箱中于饱和湿度、37℃培养。

2)MTT法测定细胞毒

将对数生长期的HCFB细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，用含8％胎牛血清的H-DMEM培养基稀释成5.0×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，7000细胞/孔于37℃，体积分数5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养24h，加入含不同浓度AD或本发明化合物的培养基，继续培养48h，其它同实施例1。AD和本发明化合物同实施例1。结果取平均值。

3)划痕(迁移)实验观察药物对AngⅡ刺激的HCFB迁移能力的抑制作用生长

对数期的HCFB细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶消化后，用含8％胎牛血清的H-DMEM培养基稀释成细胞悬液，铺于96孔板内，每孔20000细胞。培养24h待细胞长成融合状态，弃去原培养基，加入无血清的培养基同步化培养24h后，用200μL规格枪头划线，再用0.01M PBS清洗两遍，药物组加入200μL含不同浓度待测化合物与AngⅡ(10^-7mol/L)的H-DMEM(含0.5％DMSO)培养基，以含0.5％DMSO的H-DMEM培养基为空白组，含AngⅡ和0.5％DMSO的H-DMEM培养基为AngⅡ组，设3孔重复。分别于培养前(0h)和培养24h在显微镜下拍照测量。迁移距离＝边缘距离(0h)－边缘距离(24h)。抑制率＝[(AngⅡ组迁移距离-药物组迁移距离)/(AngⅡ组迁移距离-空白组迁移距离)]×100％，结果取平均值，见附图7。

4)实验结果

结果表明：与相同浓度的AD处理相比，在实验浓度范围内，本发明化合物均无细胞毒，本发明化合物对AngⅡ刺激的HCFB迁移能力的抑制作用比AD更强(见附图7)。

实施例5化合物III-42的合成

将SeO₂(0.168g，1.5mmol)置于25mL圆底烧瓶中，加入10mL二氯甲烷，将1.16g70％过氧叔丁醇水溶液(相当于9mmol t-BuOOH)缓慢滴入反应体系中，室温下搅拌30min，加入1g脱水穿心莲内酯(3mmol)，继续在室温下反应12h，TLC监测反应结束，用饱和Na₂SO₃溶液调PH为中性，CH₂Cl₂/饱和食盐水萃取，合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压蒸除溶剂，炒样，干法硅胶柱层析分离，纯乙酸乙酯洗脱，得淡黄色固体550mg，即化合物I-41，收率55％。Mp 99.6-100.5℃。IR(KBr)3397,2933,2873,1747,1084,1039,1001,982cm^-1。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.18(s,1H),6.86(dd,J＝15.7,10.2Hz,1H),6.17(d,J＝15.8Hz,1H),5.02(s,1H),4.83(s,2H),4.71(s,1H),4.41(d,J＝2.7Hz,1H),4.22(d,J＝11.1Hz,1H),3.53(dd,J＝11.3,4.8Hz,1H),3.33(d,J＝11.1Hz,1H),2.84(d,J＝10.1Hz,1H),1.96(d,J＝13.9Hz,1H),1.81–1.74(m,3H),1.61(dd,J＝13.6,3.1Hz,1H),1.52(dt,J＝13.5,3.3Hz,1H),1.27(s,3H),1.18(dd,J＝13.6,4.2Hz,1H),0.80(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ172.34,149.46,143.45,135.12,129.12,121.66,112.60,80.71,72.67,69.69,64.10,56.13,46.86,42.39,38.82,37.97,29.69,29.63,28.03,22.36,15.00..

称取348mg(1mmol)化合物I-41，53mg(0.5mmol)无水Na₂CO₃和211mg(1.5mmol)对氯苯甲醛，置于25mL圆底烧瓶中，加入6mL甲醇，回流状态下反应5h，TLC监测反应完毕。将体系放置至室温后，置于冰箱中过夜，有大量淡黄色固体析出，抽滤，得粗品。乙酸乙酯：乙醇(3：1)重结晶，得淡黄色固体，为化合物III-42，收率63％。Mp 211.4～212.1℃。IR(KBr)3414,2933,1744,1491,1037cm^-1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.83-7.73(m,3H),7.57-7.49(m,2H),6.83(dd,J＝15.8,10.3Hz,1H),6.35(s,1H),6.29(d,J＝15.8Hz,1H),5.03(d,J＝4.8Hz,1H),4.90(d,J＝1.9Hz,1H),4.75(d,J＝2.8Hz,1H),4.50(t,J＝1.7Hz,1H),4.18(d,J＝2.9Hz,1H),4.13(dd,J＝7.4,2.9Hz,1H),3.88-3.79(m,1H),3.29-3.21(m,2H),2.86(d,J＝10.3Hz,1H),1.06(s,3H),0.76(s,3H).¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ168.39,150.31,149.02,136.17,135.17,133.82,130.85,130.75,129.47,124.88,124.58,115.73,107.60,74.47,73.01,67.84,55.97,41.83,41.26,38.72,36.14,32.33,28.45,15.23,12.59.

实施例6化合物化合物III-73的合成

称取345mg(1mmol)化合物CCW，53mg(0.5mmol)的Na₂CO₃和211mg(1.5mmol)的对氯苯甲醛加入5mL甲醇溶剂中于回流状态下进行反应，5h后反应完毕。将体系放置至室温后，再置于冰箱中过夜，有大量固体淡黄色固体析出，抽滤，得粗品。然后用20mL DCM重新溶解后，用1g柱硅胶进行炒样，过柱(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得淡黄色固体III-73。产率：50％；熔点：220℃；IR(KBr)3432，2935，1755，1631，1491，1449，1408，1091，1038，1013，942cm^-1；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),7.82–7.71(m,3H),7.52(t,J＝10.5Hz,2H),6.88(dd,J＝15.8,10.1Hz,1H),6.36(s,1H),6.30(d,J＝15.8Hz,1H),4.80(s,1H),4.49(s,1H),4.31(t,J＝5.5Hz,1H),3.65(dd,J＝10.7,5.6Hz,1H),3.20–3.07(m,1H),2.42(d,J＝13.6Hz,1H),2.01(d,J＝8.6Hz,1H),1.83(dd,J＝14.3,10.3Hz,2H),1.60–1.40(m,3H),1.24(s,1H),1.15(d,J＝14.2Hz,4H),0.95(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ168.83,161.49,149.15,148.37,137.55,133.82,132.71,132.20,129.53,126.88,122.03,111.90,64.63,60.83,55.91,46.92,36.56,23.83,22.08,17.93,15.74.

实施例7化合物III-79，III-81的合成

CC的合成，称取332mg(1mmol)的脱水穿心莲内酯溶于3mL甲醇溶剂中，于85℃条件下回流搅拌，5min内滴加完4mL的10％HCl溶液，继续反应5h后，停止反应。首先蒸除乙醇溶剂，然后加入10mL乙酸乙酯以溶解产物，用15mL饱和食盐水分3次对体系进行萃取，然后再用5mL乙酸乙酯进行反萃。合并有机相，用无水MgSO₄进行干燥，抽滤，滤饼用5mL乙酸乙酯洗涤，浓缩，加入600mg柱硅胶，炒样，过柱(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)得白色固体即为CC。产率：86％；熔点：130.6～131.3℃；IR(KBr)3383，2922，2848，1753，1454，1381，1353，1091，1040，985，812cm^-1；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(d,J＝2.0Hz,1H),6.65(dd,J＝15.7,10.6Hz,1H),6.17(d,J＝15.8Hz,1H),5.52(s,1H),4.84(d,J＝1.9Hz,3H),4.34–4.27(m,1H),3.57–3.44(m,2H),2.85(d,J＝45.5Hz,1H),2.60(s,1H),2.44(d,J＝9.8Hz,1H),2.18–2.07(m,2H),1.98–1.86(m,1H),1.81(dd,J＝10.0,6.3Hz,2H),1.78–1.73(m,1H),1.71(t,J＝4.6Hz,1H),1.62(s,3H),1.53(s,3H),1.36(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),1.31–1.28(m,2H),1.27(s,3H),1.24–1.14(m,1H),1.01(s,1H),0.85(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.33,142.59,137.76,134.01,132.61,129.27,129.08,121.92,121.39,81.22,69.65,64.16,60.49,50.19,42.29,38.25,36.03,35.93,27.80,23.20,22.35,22.27,15.88.

化合物ADC-1的合成

称取332mg(1mmol)化合物CC，53mg(0.5mmol)的Na₂CO₃和211mg(1.5mmol)的对氯苯甲醛加入5mL甲醇溶剂中于回流状态下进行反应，5h后反应完毕。将体系放置至室温后，再置于冰箱中过夜，有大量固体淡黄色固体析出，抽滤，得粗品。然后再用3mL甲醇溶剂在回流的状态下将粗品重新溶解后于室温下放置，再置于冰箱中过夜，得淡黄色纯品ADC-1。产率：63％；熔点：239.8～240.1℃；IR(KBr)3423,2966,2923,2848,1778,1629,1438,1143,1028,942,880cm^-1；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(d,J＝8.6Hz,2H),7.74(s,1H),7.52(d,J＝8.6Hz,2H),6.62(dd,J＝15.7,10.6Hz,1H),6.33(d,J＝17.3Hz,2H,overlap),5.51(s,1H),5.12(s,1H),4.31(s,1H),3.94(d,J＝10.9Hz,1H),3.41(d,J＝10.5Hz,1H),3.28–3.18(m,1H),2.48(s,1H,overlap),2.02(s,2H),1.70–1.50(m,3H),1.48(s,3H),1.26(dd,J＝10.4,6.5Hz,1H),1.22–1.13(m,1H),1.08(s,3H),0.81(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ168.81,148.37,139.47,137.27,133.81,132.71,132.40,132.18(2C,overlap),129.50(2C,overlap),126.75,122.81,122.20,111.86,79.35,62.98,60.23,49.97,42.13,38.31,36.23,27.81,23.72,23.23,22.70,16.03.HRMS(ESI):m/z calcd for C₂₇H₃₁ClNaO₄[M+Na]⁺,477.1809；found,477.1810.

化合物III-81的制备

称取454mg(1mmol)的化合物ADC-1和431mg(2.5mmol)的m-CPBA置于25mL圆底烧瓶中，加入15mL的氯仿溶解后，于冰浴条件下搅拌反应，3h后反应完毕。首先，加入过量的Na₂S₂O₃饱和溶液以去除过量的m-CPBA，然后加入饱和Na₂CO₃溶液调节PH至7。然后用21mL饱和食盐水溶液分3次对体系进行萃取，最后用10mL氯仿对水相进行反萃，合并有机相，用无水MgSO₄进行干燥，抽滤，滤饼用5mL氯仿洗涤，蒸除氯仿溶剂，加入4mL甲醇溶剂于回流状态下溶解后，慢慢降至室温。再置于冰箱中过夜，有淡黄色固体析出，抽滤，得粗品。然后再用3mL甲醇溶剂在回流的状态下将粗品重新溶解后于室温下放置，再置于冰箱中过夜，得淡黄色纯品III-81。产率：60％；熔点：186.3～186.8℃；IR(KBr)3421，2937，1756，1632，1490，1409，1092，1061，1043，981，943cm-1；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(d,J＝8.6Hz,2H),7.37(d,J＝8.6Hz,2H),7.14(s,1H),6.81(dt,J＝19.8,9.9Hz,1H),6.26(d,J＝15.6Hz,1H),5.95(s,1H),4.25(t,J＝12.4Hz,1H),3.55–3.37(m,2H),3.11(d,J＝17.2Hz,1H),3.09(s,1H),2.67(s,1H),2.21(dd,J＝15.1,3.3Hz,1H),2.14(d,J＝11.1Hz,1H),1.81–1.70(m,2H),1.70–1.60(m,3H),1.61–1.51(m,1H),1.32–1.27(m,1H),1.25(s,3H),1.21(d,J＝8.5Hz,3H),1.02(td,J＝13.6,4.2Hz,1H),0.90(d,J＝9.6Hz,3H).

化合物III-79的制备

称取471mg(1mmol)的化合物III-81，14mg(0.1mmol)的无水ZnCl₂溶于5mL的DMSO溶剂中，再加入70mg(2mmol)的NH₃.H₂0于70℃，N₂保护的条件下进行反应，5h后反应完毕。首先，相体系中加入10mL的乙酸乙酯溶剂，然后用30mL饱和食盐水分6次对体系进行萃取，然后再用5mL乙酸乙酯对水相进行反萃，合并有机相，用无水MgSO₄进行干燥，抽滤，滤饼用5mL乙酸乙酯洗涤，浓缩，加入1g柱硅胶，炒样，过柱(石油醚：乙酸乙酯：三乙胺＝1：2：0.05)得棕黄色固体III-79。产率：60％；熔点：121.5～122.1℃；IR(KBr)3420，2930，1699，1649，1491，1410，1255，1042cm^-1；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.52(s,1H),7.24(q,J＝8.6Hz,4H),6.71(d,J＝8.0Hz,1H),6.48(dt,J＝15.7,10.6Hz,1H),6.03(d,J＝1.4Hz,1H),5.90(dd,J＝15.6,1.9Hz,1H),5.06(d,J＝5.0Hz,1H),4.33(dd,J＝7.1,3.0Hz,1H),3.86(d,J＝10.9Hz,1H),3.47–3.37(m,1H),3.16–3.08(m,1H),3.04(dd,J＝22.1,9.4Hz,2H),2.94(d,J＝12.8Hz,1H),1.18(t,J＝7.1Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,Acetone)δ169.93,142.39,135.20,134.38,134.35,132.98,132.30,131.94,127.70,123.84,86.54,86.51,79.97,79.95,63.69,60.64,60.62,60.04,60.02,59.68,57.46,45.47,45.44,43.86,41.62,38.07,38.03,35.01,27.50,22.72,22.67,22.47,21.95,19.97,15.92,15.91,13.64.。

Claims (11)

1.穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物，其特征在于,具有通式III所示结构:

其中，R₁，R₂其中之一为氢，另一为羟基；或者R₁，R₂共同组成羰基、肟、亚胺或者腙中的一种；R₃为羟基；R₄为氢、羟基、氨基、甲氨基，以及醚基团中的一种；R₅为氢、羟基；或者R₄，R₅相连成环氧结构；R₆为CH₃、CHO、C＝NHR₁₀、C＝NHNHR₁₁中的一种，其中R₁₀为C1-5的烷基，R₁₁为C1-5的烷基、甲酰胺基或者硫代甲酰胺基中的一种，或R₅，R₆相连成环氧结构；R₇为氢或羟基；R₈，R₉各自为氢或苯基、甲基、2-呋喃基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、3，4，5-三甲氧基苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基、2-甲氧基-4-氯苯基、2-羟基-4-氯苯基、2-羟基-4-甲氧基苯基、3-氨基-4-氯苯基、2-氨基-4-氯苯基、4-(N,N-二甲胺基)苯基、3-氟-4-(4-吗啉基)苯基、3-氟-4-(4-甲基哌嗪基)苯基或R₈和R₉相连成环己基、环戊基；R₈，R₉同时相同或不同；虚线双键存在或不存在，当双键存在时，R₅，R₆其中之一不存在。

2.如权利要求1所述穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物，其特征在于,

R₁，R₂其中之一为氢，另一为羟基；或者R₁，R₂共同组成羰基，肟；R₃为羟基；R₄为氢、羟基、氨基、甲氨基中的一种；R₅为氢、羟基；或者R₄，R₅相连成环氧结构；R₆为CH₃；R₇为氢或羟基；R₈，R₉各自为氢或苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基；R₈，R₉不同；虚线双键不存在。

3.如权利要求1或2所述穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物，其特征在于,R₁，R₂其中之一为氢，另一为羟基；或者R₁，R₂共同组成羰基，肟；R₃为羟基；R₄为氢、羟基、氨基中的一种；R₅为氢、羟基；或者R₄，R₅相连成环氧结构；R₆为CH₃；R₇为氢或羟基；R₈，R₉各自为氢或苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基；R₈，R₉不同；虚线双键不存在。

4.如权利要求1-3其中之一所述穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物，其特征在于，优选如下化合物：

5.如权利要求1-4其中之一所述的穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份用于制备治疗或预防肝纤维化药物。

6.如权利要求1-4其中之一所述的穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份用于制备治疗或预防肺纤维化药物。

7.如权利要求1-4其中之一所述的穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份用于制备治疗或预防肾纤维化药物。

8.如权利要求1-4其中之一所述的穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份用于制备治疗或预防心肌纤维化药物。

9.如权利要求5-8其中之一所述的穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，其作为活性成份或与其它药物组合，与制药中可以接受的辅助和/或添加成分混合后，按常规的制药方法和工艺要求，制成用于抗纤维化的口服型制剂或注射型制剂药物。

10.如权利要求9所述的穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，口服型制剂为片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆；注射型制剂为注射液或冻干粉针剂型。

11.制备如权利要求4所述穿心莲内酯十氢萘结构修饰衍生物的方法，其特征在于，合成路线如下：