KR20090069723A

KR20090069723A - 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분으로 구성된 간경화및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR20090069723A
Application number: KR1020070137488A
Authority: KR
Inventors: 마응천; 신종헌
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-12-26
Filing date: 2007-12-26
Publication date: 2009-07-01
Also published as: KR101033253B1

Abstract

본 발명은 레이노신(reynosine)을 월계수(Laurus nobilis)의 잎에서 분리하여 얻은 생리활성 물징에 대한 것으로, 월계수 잎 추출물은 알콜섭취에 의한 혈중 알콜 농도를 감소시키는 활성과 항산화 활성, nitric oxide(NO) 생성 억제 활성이 있고, 간세포 독성을 유발하기 위하여 TAA 유도 간독성 모델을 이용하여 Thioacetamide(TAA)는 세포의 괴사와 사멸을 유도하는 CCl₄나 D-galactosamine와 유사한 간독소의 일종으로 핵에서 세포질로의 RNA의 이동을 방해하여 세포막의 손상과 세포의 구조적, 기능적 파괴를 유도하고, TAA로 일차배양된 간세포와 동물에 간세포 독성을 유발하여 월계수의 활성성분인 레이노신(reynosine)과 간손상 보호 효과가 있는 레이노신을 포함하는 월계수의 단일성분으로 구성된 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

레이노신을 포함하는 월계수 단일성분으로 구성된 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물{The effects of reynosin and other compounds isolated from Laurus nobilis leaves for the treatment and prevention of liver fibrosis and liver cirrhosis}

본 발명은 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분으로 구성된 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 월계수 추출물 및 월계수 나무에서 추출된 레이오신(Reynosin)에서 간세포 자가사멸을 방지하는 효능이 있고, 세포막의 손상과 세포의 구조적, 기능적 파괴를 유도하고 간섬유화와 간경화를 유발하는 것을 억제하고 간 성상세포의 증식 및 활성화를 억제함으로써, 간경화 및 간섬유화를 저지할 수 있는 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분으로 구성된 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

간은 다양한 기능을 수행하는 장기의 일종이며, 최근 간질화 발병과 간질환에 의한 사망이 점차 증가하고 있다. 우리나라의 간질환의 추세는 예전까지 B형이 나 C형 간염의 환자가 많았지만 현재는 구미 지역과 마찬가지로 간염성 간질환보다 알콜 등에 의한 질환 환자가 늘어나고 있으며 여성의 사회 활동이 많아져 여성의 음주 기회 또한 늘어나므로 여성 질환자도 예전에 비해 증가하고 있는 추세이다. 이러한 추세에 발맞추어 세계적으로 간질환 치료제에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.

일반적으로 간 경화(liver cirrhosis)란 만성적인 간 질환의 최종 상태이다. 간 경화의 주원인은 간염바이러스 감염, 알콜 중독, 답즙산 분비 장애, 약물 중독, 알레르기, 철분의 과잉침착 등으로 다양하다.

간세포는 재생 능력이 강하여 어느 정도 파괴되어도 다시 재생에 의하여 보수될 수 있으나, 어느 시점이 되면 재생이 되지 않고 섬유화되어 버리고 섬유성분이 되어 버리면 간은 굳어져 버린다. 이렇게 간의 구조가 변하여 원상태로 돌아갈 수 없게 굳어진 것을 간 경화라 한다.

간 경화에 이르는 간 섬유화의 과정은 지속적인 자극에 대항하여 나타나는 반응으로서 이는 상처 치유 과정과 유사하게 1) 급성 염증, 2) 콜라겐을 비롯한 세포외막 매트릭스(ECM, extracellular matrix) 구성 성분들의 합성, 3) 조직재구성(상흔 형성)의 3단계로 나눌 수 있다(Ramadori R, Knittel R, and Saile B. (1998) Fibrosis and Altered Matrix Synthesis Digestion 59 :372-375). 세포외막 매트릭스의 구성성분은 콜라겐, 매트릭스 당단백질(피브로넥틴, 라미닌 등), 프로테오글리칸 등으로 구성되어 있으나 주성분은 콜라겐이다. 간세포가 파괴된 후, 새로운 간세포로 조직재구성을 하는 과정에서 세포질과 세포외막 등 완벽한 세포구조를 이 루지 못하고 세포의 골격구조를 유지하게 하는 세포외막 매트릭스만 발달하게 되어, 간세포의 세포외막 매트릭스의 주성분인 콜라겐이 과도하게 침착되게 되고 섬유화된 콜라겐에 의해서 간조직이 딱딱하게 굳어지면서 간경화에 이르게 되는 것이다.

간섬유증은 만성염증상태에 있는 간조직이 손상과 재생을 반복하여, 조직 중에 콜라겐 등과 같은 결합조직이 과도하게 축적됨으로써, 간조직에 흉터(scar)가 생기는 질환을 의미한다.

일반적으로 간섬유증은 간경변과는 달리 가역적(reversible)이고, 얇은 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule) 형성이 없다. 또한, 간손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있다. 그러나, 이러한 간섬유증 기작이 반복적으로 지속되면, 결합조직간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 두꺼운 원섬유(thick fibril)가 축적되며, 간소엽의 정상구조를 상실하여 결절을 형성하는 것을 특징으로 하는 비가역적인(irreversible) 간경변으로 진행된다.

간질환은 그 원인이 다양하지만, 만성화될 경우 결국 그 원인과는 상관없이 공통적으로 간섬유증 내지 간경변에 이르게 된다. 간질환은 초기 자각증세가 없어 조기진단이 어렵고, 일반적으로 만성에 이르러서야 발견되기 때문에, 그 치료가 쉽지 않고, 사망률이 높아 사회적인 문제를 야기하고 있다. 또한, 효능이 우수한 치 료제는 아직 개발되지 않았다.

당업계에서 간섬유증의 발병 기작은 세포, 사이토카인(cytokine) 및 결합조직(extracellular matrix, ECM)간의 복잡한 상호작용에 의해 유발되는 것으로 알려 져 있다. 간섬유화시 ECM의 과다생성은 간내 대식세포인 쿠퍼세포(Kupffer cell)가 활성화됨으로써 분비되는 여러 사이토카인에 의해 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)의 활성화가 촉진되고 활성화된 간성상 세포에서 결합조직의 생성이 증가됨으로써 야기되는 것으로 알려져 있다.

간성상세포는 1876년 쿠퍼(Kupffer)에 의해 발견되었고, 이토(Ito)에 의해 기술되었으며, 1971년 웨이크(Wake)에 의해 정립되었다. 간성상세포는 동모양혈관 내피세포와 간세포사이의 딧세강(space of Disse)에 위치한 세포로서 별모양을 하고 있어서 간성상세포, 이토 세포(Ito cell), 비타민 A를 함유하고 있는 지방소적 (lipid droplet)을 갖고 있어서 비타민 A 저장 세포(vitamin A storing cell), 지방 저장 세포(fat storing cell) 또는 동양구조유사 간 지질세포(perisinusoidal hepatic lipocyte) 등으로 여러 가지로 명명되었으나 1990년대 말에 공식용어로 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)라 결정되어 현재까지 사용되고 있다.

쿠퍼세포는 여러 독성물질에 의해 손상된 간세포를 식작용(phagocytosis)함으로써 활성화되거나 또는 독성물질에 의해 직접 활성화되어 형질발현 성장인자-베타(transforming growth factor-β; TGF-beta), 혈소판-유도된 성장인자 (platelet-derived growth factor; PDGF) 등의 사이토카인을 분비하며, 이들 사이토카인에 의 해 쿠퍼세포 자기 자신이 다시 활성화(autocrine)된다. 또한, 쿠퍼세포가 분비한 사이토카인들에 의해 간조직내 동모양혈관 내피세포(sinusoidal endothelial cell) 및 간성상세포가 활성화된다. 활성화된 간성상세포에 의해 분비되는 4형 콜라겐나아제(collagenase type IV)와 증가된 콜라겐 생산에 의해 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)의 정상구성비율이 깨지면서 기저막 ECM(basement membrane-like matrix, 예를 들어 4형 콜라겐)은 분해되고, 세포간 ECM (interstitial type matrix, 예를 들어 1형 및 3형 콜라겐)은 서로 꼬여 소섬유상 콜라겐(fibril-forming collagen)을 형성한 후 딧세강(space of Disse)에 축적되며, 분해된 기저막 ECM 및 축적된 세포간 ECM에 의해서 간성상세포가 활성화된다.

또한, 활성화된 간성상세포는 콜라겐분해효소(Metalloproteinase; MMP)의 활성 억제물질인 마크로글로불린(macroglobulin) 및 TIMP 등의 생성을 촉진시켜, 과도하게 생성되는 세포간 ECM의 분해도 억제한다. 딧세강에 축적된 세포간 ECM에 의해 혈액과 간세포간의 물질교환이 저해됨으로써, 간세포는 영양물질의 공급 및 독성물질의 배출이 어렵게 되고, 간세포 역시 지속적으로 손상된다. 이러한 일련의 반응이 반복되면서 간조직 중에 결합조직이 축적되면서, 간섬유화 내지 간경화가 유발된다.

현재 간섬유증에 대한 연구는 ECM에 대한 연구, 이에 관여하는 세포와 각종 세포간의 관계, 세포의 활성화 기전, 각종 사이토카인 및 항섬유화제 (antifibrogenic agents)에 대한 연구 등 여러가지 방면으로 활발히 진행되고 있으며, 간섬유증의 조기 진단방법 및 치료제 개발을 목표로 하고 있다. 특히, 과다축적된 결합조직의 생산을 수반하는 간섬유화 및 간경화의 가장 큰 유발원인이 간성상세포의 활성화라고 것이 밝혀지면서, 현재 성상세포(stellate cell)의 활성 및 활성화를 억제할 수 있는 약물 개발에 대한 연구가 지속되고 있다.

요즘 사용되고 있는 약물들은 매우 다양하나 대부분이 간염등의 간질환에 쓰이는 것들이고 이들 중에는 임상에서 사용 시 부작용을 유발하거나 높은 비용의 것이 많다.

본 발명에서 이용한 reynosine은 월계수(Laurus nobilis)의 잎에서 분리한 것으로 월계수 잎의 추출물은 알콜섭취에 의한 혈중 알콜 농도를 감소시키는 활성과 항산화 활성, nitric oxide(NO) 생성 억제 활성 등이 보고되어 있다. [Matsuda H, Shimoda H, Ninomiya K, Yoshikawa M Inhibitory mechanism of costunolide, a sesquiterpene lactone isolated from Laurus nobilis, on blood-ethanol elevation in rats: involvement of inhibition of gastric emptying and increase in gastric juice secretion. Alcohol Alcohol. 2002; 37(2); 121-7; De Marono B, Borbone N, Zollo F, Ianaro A, Di Meglio P, Iorizzi M New sesquiterpene lactones from Laurus nobilis leaves as inhibitors of nitric oxide production. Planta Med. 2005; 71(8); 706-10; Conforti F, Stalti G, Uzunov D, Menichini F Comparative chemical composition and antioxidant activities of wild and cultivated Laurus nobilis L. leaves and Foeniculum vulgare subsp. piperitum (Ucria) coutinho seeds. Biol Pharm Bull. 2006; 29(10); 2056-64;]

간세포 독성을 유발하기 위하여 TAA 유도 간독성 모델을 이용하였다. Thioacetamide (TAA)는 세포의 괴사와 사멸을 유도하는 CCl₄나 D-galactosamine와 유사한 간독소의 일종으로 핵에서 세포질로의 RNA의 이동을 방해하여 결과적으로는 세포막의 손상과 세포의 구조적, 기능적 파괴를 유도하는 것으로 알려져 있다. [ Caballero ME, Berlanga J, Ramirez D, Lopez-Saura P, Gozalez R, Floyd DN, Marchbank T, et al. Epidermal growth factor reduces multiorgan failure induced by thioacetamide. Gut 2001;48:34-40; Morio LA, Chiu H, SprowlesKA, Zhou P, Heck DE, Gordon MK, Laskin DL. Distinct roles of tumor necrosis factor-alpha and nitric oxide in acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice. Toxicol Appl Pharmacol 2001;172:44-51; Chen LH, Hsu CY, Weng CF. Involvement of P53 and Bax/Bad triggering apoptosis in thioacetamide-induced hepatic epithelial cells. World J Gastroenterol 2006;12:5175-5181.]

따라서 본 발명에서는 TAA로 일차배양된 간세포와 동물에 간세포 독성을 유발하여 월계수의 활성성분인 reynosine의 간손상 보호 효과를 연구하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 그 목적은 월계수의 잎에서 분리한 레이노신(Reynosin)을 TAA로 일차배양된 간세포와 동물에 간세포 독성을 유발하여 월계수의 활성성분인 레이노신(Reynosin)이 간손상 보호, 간경화 및 간섬유화에 효능이 있어, 간세포 독성을 유발하기 위한 Thioacetamide(TAA) 유도 간독성 모델을 이용하여 세포의 괴사와 사멸을 유도하여 간경화 및 간섬유화를 유발하는 것을 억제하고 간 성상세포의 증식 및 활성화를 억제함으로써, 간경화 및 간섬유화를 저지할 수 있는 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분으로 구성된 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명자 등은 간섬유증 및 간경화의 치료에 보다 효과적으로 이용될 수 있는 물질을 찾고자 많은 연구를 수행한 결과, 월계수의 잎에서 분리한 레이노신(Reynosin)을 TAA로 일차배양된 간세포와 동물에 간세포 독성을 유발하여 월계수의 활성성분인 레이노신이 간손상 보호, 간경화 및 간섬유화에 효능이 있어, 월계수 잎에서 분리한 레이노신(Reynosin)을 함유하는 조성물이 간섬유증 및 간경화 치료에 이용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 간경화 및 간섬유증 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따르면, 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간 보호 또는 간 경화 및 간섬유화 치료 또는 예방에 유효한 양으로 함유함을 특징으로 하는 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

이때, 본 발명의 부가적인 특징에 따르면, 상기 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간세포의 자가사멸을 억제하는 작용을 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 부가적인 특징에 따르면, 상기 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간세포의 손상을 억제하는 작용을 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 부가적인 특징에 따르면, 상기 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간성상 세포의 자가사멸을 촉진하는 작용을 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 부가적인 특징에 따르면, 상기 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방에 유효한 양의 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 1∼200 ㎎/㎏체중의 양으로 함유되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 부가적인 특징에 따르면, 상기 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방에 유효한 추출물의 유효성분으로서reynosin (A)외에 baynol C (B), 3-hydroxycarvotagenone (E), 2-cyclohexene-1-one (F), Methyl p-hydroxy-trans cinnamate (I), zaluzanin D (K), Cis-p-menth-1 (10)-ene-2,7-diol 7-acetate (M), Vanilin (P), Anhydroperoxycostunolide (Q), 14-Oxomelampolide (R), Parthenolide (S) 또는 1,5-Naphtalenediol (T) 중 어느 하나의 화합물이 함유되어 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분으로 구성된 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물은 월계수 추출물 및 월계수에서 추출된 레이오신(Reynosin)에서 간세포 자가사멸을 방지하는 효능이 있고, 산화적 손상 또는 그 이외의 원인에 의한 간세포 손상을 방지하는 효능이 있고, 간경화 또는 간섬유화의 새로운 치료방법 및 예방방법으로 대두되고 있는 간성상세포의 자가사멸을 유도하는 효능이 있어 간 보호용 또는 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 간경화 및 간섬유화로 진단된 환자의 치료에 이용될 수 있는 물질로서 레이노신(Reynosine)을 포함하는 월계수 단일성분을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 기존에 항-헬리코박터 파이로리 활성, 항알러지, 항박테리아, 항균, 항염증 및 신경보호, 일산화질소 생성 및 TNF-α발현 활성 억제 또는 항암 등의 효능이 있는 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간보호 효능 및 간경화 또는 간섬유화 치료 또는 예방 효능이 있음을 밝힌 데 그 특징이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 간경화 및 간섬유화의 치료 또는 예방에 이용될 수 있는 물질로서 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분의 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방에 이용될 수 있는 물질로서 reynosin (A)외에 baynol C (B), 3-hydroxycarvotagenone (E), 2-cyclohexene-1-one (F), Methyl p-hydroxy-trans cinnamate (I), zaluzanin D (K), Cis-p-menth-1 (10)-ene-2,7-diol 7-acetate (M), Vanilin (P), Anhydroperoxycostunolide (Q), 14-Oxomelampolide (R), Parthenolide (S) 또는 1,5-Naphtalenediol (T) 중 어느 하나의 단일 화합물을 월계수 단일성분의 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 조성물은 간성상세포의 증식 및 활성화를 억제함으로써, 간조직에서 과도하게 증가되는 콜라겐 및 결합조직(connective tissue)의 생성을 억제함으로써, 간섬유증 발현 및 간섬유증의 간경화으로의 발전을 막을 수 있다

본 발명의 간경화 및 간섬유증 치료제로서 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분을 1∼2,00㎎/㎏체중의 농도로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기범위를 벗어난 양일 수도 있다.

레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 간섬유증 및 간경화 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예들을 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니고, 당업자에 의해서 용이하게 실시될 수 있는 삽입, 삭제 및 수정 등의 변형 등도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 또 다른 목적은 간 섬유화에 의한 간 경화의 예방 및 치료 효과를 나타내는 약제학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분의 분리방법에 따른 모식도를 나타내고, 도 2는 본 발명에 따른 레이노신을 포함하는 월계수 단일 성분의 화학 구조식이며, 도 3은 간세포에 대한 reynosin의 세포독성 결과를 도시한 그래프이며, 도 4는 간세포에서 reynosin을 전처리하고 TAA로 세포사멸을 유도한 후 세포 생존율 비교표를 나타내고, 도 5는 간세포에서 reynosin에 의해 apoptosis가 감소함에 따라 TAA로 세포사멸을 결과를 나타내는 도표이며, 도 6은 reynosin에 의해 DNA 손상이 감소함에 따라 TAA로 세포사멸의 변화를 나타내는 도면이고, 도 7은 간세포에서 RT-PCR 방법으로 Bcl-2 mRNA 발현의 결과를 도시한 도면이며, 도 8은 간세포에서 RT-PCR 방법으로 reynosin 전처리 후 Bcl-xL mRNA의 발현의 결과를 도시한 도면이고, 도 9는 간세포에서 reynosin을 전처리한 다음 TAA로 aopotosis를 유도한 후 Bax mRNA를 전기영동한 결과를 도시한 도면이며, 도 10a는 TAA유도 간경화 동물모델실험에서 혈청을 분리하여 reynosin이 ALT에 영향에 대해 대조군과 TAA처리군 측정한 결과를 도시한 도면를 나타내고, 도 10b는 TAA유도 간경화 동물모델실험에서 혈청을 분리하여 reynosin이 AST에 영향에 대해 대조군과 TAA처리군 측정한 결과를 도시한 도면이고, 도 11은 쥐 간세포에서 reynosin전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bcl-2 mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기영동한 결과를 도시한 도면를 나타내며, 도 12는 쥐 간세포에서 reynosin전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bcl-xL mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기 영동한 결과를 도시한 도면이며, 도 13은 쥐 간세포에서 reynosin전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bax mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기영동한 결과를 도시한 도면를 나타내며, 도 14a 내지 도 14d는 TAA의 reynosin의 효과로서 쥐 간세포에서 DNA 손상 감소를 도시한 그림이고, 도 15a 내지 도 15d는 TAA의 reynosin의 효과로서 간경화 손상 감소를 도시한 그림을 나타내며, 도 16 내지 도 18은 본 발명에 따른 월계수 추출물에서 새롭게 분리된 순수 단일 물질의 화학 구조식을 나타낸다

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 월계수 잎에서 분리되는 단일 화합물중 레이노신(Reynosin)에 대해 실시예로서 상세히 설명한다.

실험예 1

실험 재료

월계수 잎에서 Reynosine 및 기타 단일화합물의 분리방법은 첨부된 도 1에 도시되어 있다.

먼저, 레이노신(Reynosin)의 분리방법을 살펴보면, 실리카 겔상에서 클로로포름층(Q003C-F2, 9.78 g)을 크로마토그래프했고 헥산과 에틸 아세테이트 혼합 용매를 사용하여 용해 분리하였고, 분획은 TLC로 조정하였고 에틸 아세테이트과 메탄올 용매를 증가하면서 7개의 분획을 얻었다. 모든 분획물은 퀴논 리덕테이즈 활성과 세포독성을 수행하였다.

그후, 6번 분획(Q003C-F2-6)을 normal phase의 실리카 칼럼을 이용하여 HPLC에 의해 분리를 시작하였다. 에틸 아세테이트와 헥산 혼합용매로 용해 분리하여 총 20개 분획을 하였고 그 중 8번 분획에서 순수한 A compound, 즉 reynosin을 얻었다. 상기에 의해 분리된 레이노신(Reynosin)의 화학 구조식 첨부된 도 2와 같이 나타난다. 또한, Q003C-F2-6-9에서 순수 단일 물질 B compound, 즉, Baynol C를 분리 하였다.

상기 순수 단일 물질 Baynol C의 화학 구조식은 첨부된 도 16과 같이 나타난다.

한편, 상기 분획 2번 (Q003C-F2-2)에서 상기와 같은 분획은 모으는 과정을 거쳐 다음과 같은 단일 물질을 분리하였다.

a. Q003C-F2-2 fr.1 ---------> I : Methyl p-hydroxy-trans-cinnamate

b. Q003C-F2-2 fr.2 ---------> K : Zaluzanin D

c. Q003C-F2-2 fr.3 ---------> P : Vanilin

d. Q003C-F2-2 fr.4 ---------> M : Cis-p-Menth-1 (10)-ene-2, 7-diol 7-acetate

e. Q003C-F2-2 fr.5 ---------> F : 2-cyclohexene-1-one

f. Q003C-F2-2 fr.6 ---------> E : 3-Hydroxycarvotagenone

상기의 순수 단일 물질 Methyl p-hydroxy-trans-cinnamate, Zaluzanin D , Vanilin, Cis-p-Menth-1 (10)-ene-2, 7-diol 7-acetate, 2-cyclohexene-1-one 및 3-Hydroxycarvotagenone의 화학 구조식은 첨부된 도 17과 같이 나타난다.

또한, 분획 3번(Q003C-F2-3)과 4번(Q003C-F2-4)은 물과 메탄올이 포함된 혼합 용매로 용해 분리하면서 reverse phase HPLC로 분리하였다. 그 중량은 각각 60 과 120 mg이었다. 또 각각 10개와 19개의 분획을 분리하였고 같은 물질은 합치고 HPLC로 분리하였다.

a. Q003C-F2-4 fr.1 + fr.2 ---------> Q : Anhydroperoxycostunolide

b. Q003C-F2-4 fr.5 ---------> T : 1,5-Naphtalenediol

c. Q003C-F2-4 fr.4 ---------> S : Parthenolide

d. Q003C-F2-4 fr.3 ---------> R : 14-Oxomelampolide

상기의 순수 단일 물질 Anhydroperoxycostunolide, 1,5-Naphtalenediol, Parthenolide 및 14-Oxomelampolidedml 화학구조식은 첨부된 도 18과 같이 나타난다.

동물실험

본 실험에서 사용한 실험동물은 (주)샘타코에서 구입한 20-25 g 의 Balb/c계 웅성 흰쥐와 200-250 g 의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 사육실 환경에서 1주간 순응시켜 사용하였다. 사육실 내의 명암은 12시간씩 자동으로 조절되도록 하였으며 사료는 (주)샘타코의 고형사료를 공급하였으며 물은 정수를 충분히 공급하였다. 사육실 내의 조건은 온도 22±2 ℃, 습도, 60%의 항온, 항습을 유지하였다.

간세포 분리 및 배양

200-250g 의 SD계 웅성 흰쥐를 이용하여 간세포를 pronase-collagenase법으 로 분리하여 일차 배양하였다 [Mantena SK, Sharma SD, Katiyar SK. Berberine, a natural product, induces G1-phase cell cycle arrest and caspase-3-dependent apoptosis in human prostate carcinoma cells. Mol Cancer Ther 2006;5:296-308; Sukocheva OA, Carpenter DO. Anti-apoptotic effects of 3,5,3'-tri-iodothyronine in mouse hepatocytes. J Endocrinol 2006;191:447-458 참조]

흰쥐를 마취 후 복부를 열어 16-gauge의 cannula를 이용하여 10분간 Ca²⁺/Mg²⁺-free Hank's balanced salt solution(HBSS, pH 7.4) (SIGMA, USA)으로 관류하였다.

다시 pronase E (Furuka, Japan)가 포함된 Ca² ⁺/Mg²⁺-free HBSS, collagenase type Ⅰ (SIGMA, USA)이 포함된 Ca² ⁺/Mg² ⁺-free HBSS를 이용하여 같은 조건으로 관류하였다. 이후 간을 적출하여 deoxyribonuclease (SIGMA, USA)가 포함된 Ca² ⁺/Mg² ⁺-free HBSS를 이용하여 잘게 조각낸 후 이를 여과하고 BSA (SIGMA, USA)가 포함된 차가운 HBSS로 세척한 후 이를 10％ FBS를 첨가한 DMEM 배지가 들어있는 collagen coating된 plate에서 배양하였다.

실험예 2

세포 독성 실험

일차 배양된 간세포를 1 × 10⁴ cells/well로 well plate에서 24시간 배양 후 reynosine을 0.64, 3.22, 16.11, 80.54 ㎛로 처리하고 72시간 배양하였다. 72시간 후 각 well에 MTT (SIGMA, USA) 용액을 0.5 ㎎/㎖로 처리하고 4시간 다시 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 이를 건조시킨 후 여기에 DMSO (SIGMA, USA) 용액을 첨가하여 각 well에 형성된 formazan을 녹여 흡광도를 595 ㎚에서 측정하였다.

Thioacetamide (TAA) 처리 후 reynosine에 의한 세포 사멸 억제 실험

일차 배양된 간세포를 5 × 10⁴ cells/well로 well plate에서 24시간 배양 후 0.64, 3.22, 16.11, 80.54 ㎛의 reynosine을 처리하고 다시 48시간 배양하였다. 시료의 전처리 후에 100 mM의 TAA (SIGMA, USA)를 각 well에 처리하여 세포 사멸을 유도하였다.

MTT assay

배양 종료 후 각 well에 MTT (SIGMA, USA) 용액을 0.5 mg/㎖로 처리하고 4시간 다시 배양한다. 그 후 배지를 제거하고 이를 건조시킨 후 여기에 DMSO (SIGMA, USA) 용액을 첨가하여 각 well에 형성된 formazan을 녹여 흡광도를 595 nm에서 측정하였다.

Annexin Ⅴ-PI 염색

배양 종료 후 well에 trypsin-EDTA (SIGMA, USA)용액을 처리하고 차가운 PBS 를 이용하여 세포를 모았다. 모아진 세포는 반응 용액 200 ㎕에 다시 부유시키고 Annexin Ⅴ-PI 염색용 kit (Bender Medsystem, Austria)를 이용하여 염색하였다. Annexin Ⅴ-FITC 항체와 PI 용액을 10 ㎕씩 첨가하고 15분간 반응하였다. 반응 후에는 flow cytometer (Coulter, USA)를 이용하여 세포 사멸 정도를 측정하였다.

DNA fragmentation

배양 종료 후 well에 trypsin-EDTA (SIGMA, USA)용액을 처리하고 차가운 PBS를 이용하여 세포를 모았다. 이를 0.2% Triton X-100 (SIGMA, US), 10 mM EDTA (SIGMA, USA), 10 mM Tris (pH 7.4) (SIGMA, USA)가 포함된 용액에 부유시켰다. 이를 4 ℃, 12000 g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이 상층액에 1% SDS 용액에 200 ㎍/ml로 희석된 proteinase K (SIGMA, USA)를 넣고 50 ℃에서 3시간 반응하였다. 그 후 여기에 다시 200 ㎍/ml의 Rnase A (SIGMA, USA)를 넣고 37 ℃에서 3시간 이상 반응하였다. 3 M sodium acetate (SIGMA, USA)용액을 넣고 -20 ℃에서 하룻밤 방치하였다. 그 후 이를 EtOH를 이용하여 씻어내고 증류수에 녹여 EtBr로 염색하고 전기영동하였다.

RNA 추출

모아진 세포와 적출된 간조직을 Easy Blue solution (iNtRON Biotech, Korea)을 1㎖ 첨가하여 진탕한다.

chloroform (SIGMA, USA) 120 ㎕를 첨가하여 다시 30초간 진탕한다. 이를 4 ℃, 15000 rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액에 동량의 isopropanol (SIGMA, USA)을 넣고 30초간 진탕한 뒤 상온, 15000 rpm에서 원심분리하였다. 이때 얻어진 pellet을 EtOH로 씻어내고 말려 RNase를 제거한 3차 증류수 100 ㎕를 넣고 55 ℃에서 15분간 두었다. UV spectrometer (JASCO, Japan)를 이용하여 정량하였다.

RT-PCR

추출된 RNA를 One step RT-PCR pre mix (iNtRON Biotech, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR primer는 Bcl-2: forward 5’-CTG TAC GGC CCC AGC ATG CG-3’ and reverse 5’-GCT TTG TTT CAT GGT ACA TC-3’, Bcl-xL: forward 5’-AGG CTG GCG ATG AGT TTG AA-3’ and reverse 5’-CGG CTC TCG GCT GCA TT-3’, Bax: forward 5’-GGG AAT TCT GGA GCT GCA GAT GAT T-3’ and reverse 5’-GCG GAT CCA AGT TGC CAT CAG CAA ACA T-3’, β-actin: forward 5’-GAC CCA GAT CAT GTT TGA GA-3’ and reverse 5’-GCT TGC TGA ACA TCT GC-3’를 이용하였다. 45 ℃에서 30min, 95 ℃에서 5분간 역전사 반응을 수행하고 다시 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 60초, 72 ℃에서 90초간 30번 반복하여 증폭하였다.

Thioacetamide (TAA) 유발 간경화에 미치는 영향

웅성의 Balb/c계 흰쥐 10마리를 1군으로 하여 TAA를 200 ㎍/kg의 농도로 2주간 매일 복강 주사하였다. 1주후 TAA와 reynosine을 5 mg/kg, 1 mg/kg 및 0.2 mg/kg으로 복강 주사하였다. TAA와 검액의 동시 투여 3주 후 24시간 절식시켰다.

절식시킨 후 채혈하고 채혈한 혈액은 4 ℃, 13000 rpm에서 5분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 이를 이용하여 aspatate aminotransperase(AST)와 alanine aminotransperase(ALT)의 수준을 아래의 방법으로 측정하였다. 또한 간을 적출하여 RNA와 조직 절편을 얻어 이를 이용하여 아래의 방법으로 간손상의 지표가 될 수 있는 유전자들의 발현 여부와 조직내 단백질 발현 여부를 확인하였다.

혈청 내 AST와 ALT의 수준 측정

혈액 채취 후 분리된 혈청은 측정용 kit (FUJIFILM, Japan)을 이용하여 Dry chemistry analyzer (FUJI DRI-CHEM 3500i, FUJIFILM, Japan)로 측정하였다. [Canbay A, Friedman S, Gores GJ. Apoptosis: the nexus of liver injury and fibrosis. Hepatology 2004;39:273-278; 20. Yin XM, Ding WX. Death receptor activation-induced hepatocyte apoptosis and liver injury. Curr Mol Med 2003;3:491-508]

조직 염색

적출된 간조직을 4% formaldehyde (SIGMA, USA)에 24시간 고정하였다. 고정 후 흐르는 증류수에 수세하고 파라핀을 이용하여 포매하였다. 포매한 조직을 절편하여 조직을 56 ℃에서 24시간 방치하였다. 24시간 후 이를 30분간 상온에서 말리고 이를 zylen 용액에 5분씩 3번 담가두었다. 그 후 이를 70% EtOH에 5분, 90% EtOH에서 5분 100% EtOH에서 5분간 2번 담가 탈수하였다.

Hematoxylin & Eosin 염색

이를 hematoxylin (SIGMA, USA)에 10초간 담가 핵을 염색하고 증류수에서 씻어내었다. 이를 다시 eosin Y (SIGMA, USA) 용액에 5분간 담가 세포질을 염색하고 다시 TPBS에서 5분씩 3번 씻어내었다. 잘 닦은 후 봉입하여 현미경 상에서 관찰하였다.

TUNEL 염색

탈수된 조직을 acetone에 10분간 담가 고정하였다. 고정된 조직은 TPBS에서 5분씩 3번 씻어내고 TUNEL kit (Chemicon, USA)을 이용하여 염색하였다.

면역 염색

탈수된 조직을 acetone에 10분간 담가 고정하였다. 고정된 조직은 TPBS에서 5분씩 3번 씻어내고 3% 과산화수소수에 5분간 담가두었다. 이를 다시 TPBS에서 5분씩 3번 씻어내었다. goat serum에 30분간 방치하고 TPBS에서 5분씩 3번 씻어내었다. α-SMA (GeneTex, USA)와 TGF-β (ABGENT, USA)의 일차 항체를 1:200으로 희석하여 조직에 반응하였다. 4 ℃에서 24시간 반응한 후, TPBS에서 5분씩 3번 씻어내고 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 다시 TPBS에서 5분씩 3번 씻어내고 AEC kit (Chemicon, USA)을 이용하여 발색반응하고 현미경 상에서 관찰하였다.

실험결과 1

Reynosine의 세포 독성 결과

상기의 실험에 사용한 일차 배양된 간세포에서 reynosine의 존재하에 생기는 reynosine의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.

시료를 0.64, 3.22, 16.11, 80.54 μM의 농도로 처리하고 시료를 처리하지 않고 vehicle만 처리한 것을 대조군으로 하여 세포 사멸 정도를 확인하였다.

그 결과 도 3에 도시된 바와 같이 간세포에 대한 reynosin의 세포독성 결과 80.54 uM에서 3일간 세포 배양을 했을 때 53%까지 세포 생존율이 떨어져 47％의 세포 독성에 의한 세포 사멸이 나타났다. 그러나, 세포독성을 나타내지 않은 10 uM이하의 농도에서 간세포에 대한 실험을 수행하였고, 이후에는 reynosine을 3.22, 0.64, 0.13 μM의 농도 범위에서 처리하고 실험을 수행하였다. 그 결과 3.22 μM의 농도 이하로 처리한 실험군에서는 세포 독성에 의한 세포 사멸은 관찰되지 않았다.

또한, 상기의 농도변화에 다른 간세포의 실험 수행은 첨부된 도 4에서 도시된 바와 같이 간세포에서 reynosin을 전처리 하고 TAA로 세포사멸을 유도한 후 세포 생존율을 비교하였는데 3.22 uM에서 26%정도의 증가하는 것을 확인할 수 있다.

TAA 처리에 의한 reynosine의 간세포 사멸 억제 활성

일차 배양된 간세포에 reynosine을 3.22, 0.64, 0.13 μM의 농도로 전처리하고 48시간 후에 100 mM의 TAA를 처리하여 24시간 반응하고 MTT assay와 annexin Ⅴ-PI 염색을 수행하였다.

TAA만을 처리한 대조군의 경우 정상의 간세포에 비하여 MTT assay 결과 세포 사멸이 54% 일어난 것으로 확인되었다. 그러나 TAA와 reynosine을 함께 처리한 결과 3.22 μM의 농도에서 세포 사멸은 28%로 대조군에 비하여 감소한 것으로 나타났다. 또한 이 결과는 농도 의존적이었다.

즉, 첨부된 도 5에 도시된 바와 같이 TAA를 처리하여 세포사멸을 유도하기 전에 reynosin 3.22 uM, 0.64 uM, 0.13 uM을 전처리하여 apoptosis정도를 FACS를 이용하여 측정하였는데 TAA만 처리했을 때 apoptotic cell이 50.20%였는데 농도 의존적으로 각각에 대하여 19.09%, 25.08%, 41.24%로 감소된 것을 확인할 수 있다.

따라서, ryenosine은 TAA 처리에 의한 간세포 사멸을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다. 이러한 결과는 annexin Ⅴ-PI 염색 실험을 통해서도 확인할 수 있었다. 위와 같은 방법으로 실험을 수행한 뒤 세포를 모아 annexin Ⅴ-PI 염색 kit을 이용하여 세포를 염색한 뒤 FACs 분석을 수행하였다. 그 결과 MTT assay에서와 마찬가지로 TAA만을 처리한 대조군에서는 49.8%의 세포 사멸을 확인할 수 있었다. 그러나 TAA와 reynosine을 함께 처리한 결과 3.22, 0.64, 0.13 μM의 농도에서 각각 19.09, 25.08, 50.20％의 세포 사멸 정도를 확인할 수 있었고 이는 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하는 것을 하기의 표 1에서 확인할 수 있다.

[표 1]

Treatment	％ of Apoptotic cells
Saline	0.38 ± 0.91
TAA 100mM	50.20 ± 2.39
TAA + Rrynosin 3.2μM	19.09 ± 1.15
TAA + Rrynosin 0.64 μM	25.08 ± 2.52
TAA + Rrynosin 0.13 μM	41.24 ± 3.09

Reynosine의 TAA에 의한 간세포 억제 활성은 DNA fragmentation을 통해서도 확인할 수 있었다. 세포 사멸이 일어나면 세포 핵 내의 DNA는 뉴크레오좀의 링커 DNA 부분이 작은 조각으로 잘려지게 되어 이를 이용하여 전기 영동을 수행하면 DNA의 단편들이 ladder를 형성하게 된다.

TAA만을 처리한 대조군의 경우 첨부된 도 6에 도시된 DNA fragmentation assay를 통하여 간세포의 apoptotic cell의 변화에 대해 lane 2에서 보이는 바와 같이 ladder를 많이 형성하여 세포 사멸이 현저히 진행되었음을 확인할 수 있으나 TAA와 reynosine을 함께 처리한 결과 농도 의존적으로 ladder의 형성이 줄어들었음을 확인할 수 있었다

위의 세 가지 실험 결과를 종합해 볼 때 reynosine은 TAA에 의한 간세포 사멸을 3.22 μM 이하의 농도에서 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

세포 사멸 관련 유전자 발현에 미치는 Reynosine의 활성

RT-PCR 기법을 이용하여 일차 배양된 간세포에서 세포사멸에 관련된 유전자의 발현에 미치는 reynosine의 영향을 알아보았다. 본 실험에서는 세포 사멸 억제에 관련하는 bcl-2와 bcl-xL의 발현과 세포 사멸 유도에 관련하는 bax의 발현을 측정하였다.

TAA만을 처리한 대조군에서는 정상의 대조군에 비하여 bcl-2의 경우 87.3%, bcl-xL의 경우는 68.7% 그 발현이 감소되었다. 그러나 도 7 및 도 8에서 보여지는 것과 같이 reynosine을 전처리하고 TAA를 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 그 발현이 증가함을 확인하였다. 세포 사멸에 관련하는 bax의 경우 TAA만을 처리한 대조군은 정상군의 bax 발현을 100%라 하였을 때 197.2％가 발현하여 세포 사멸이 진행됨으로써 bax의 발현이 현격히 증가함을 확인할 수 있다.

즉, 도 7의 간세포에서 RT-PCR 방법으로 Bcl-2 mRNA발현이 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있고, 도 8의 간세포에서 RT-PCR로 실험한 결과로서 reynosin전처리 후 Bcl-xL mRNA의 발현이 3.22 uM농도에 상당한 발현 양상을 나타남을 확인할 수 있다.

그리고, reynosine을 전처리하고 TAA를 처리한 실험군은 도 8에서 도시된 바와 같이 bax의 발현을 억제하였다. 따라서 reynosine은 bax의 발현은 억제하고 bcl-2와 bcl-xL의 발현을 증가시킴으로써 TAA에 의한 세포 사멸을 억제함을 확인할 수 있었다.

즉, 도 9는 간세포에서 reynosin을 전처리한 다음 TAA로 aopotosis를 유도한 후 Bax mRNA를 RT-PCR을 한 결과를 전기영동한 결과이며, TAA는 대조군(salin)에 비해 197.2%까지 Bax mRNA를 up-regulation하는 것으로 나타난다.

Reynosine의 간섬유화 억제 활성

TAA는 동물 체내 투여 시 간의 섬유화를 유도하고 이것이 더 진행되면 간세포의 사멸을 유도하여 간조직 괴사를 유발함과 동시에 간경화를 일으키게 된다. 앞 의 생체외 실험 결과 reynosine은 TAA에 의한 간세포의 사멸을 억제함을 확인하고 이를 생체내 실험에 적용하고자 다음의 동물 실험을 수행하였다. 웅성의 balb/c계 흰쥐에 TAA (200 μg/kg)를 매일 2주간 복강 주사하고 다음 3주간은 매일 TAA와 reynosine을 복강 주사하였다. 실험 종료 후 혈액을 채취하고 간 조직을 적출하여 다음의 실험을 수행하였다.

Reynosine이·혈청 내 AST와 ALT의 수준에 미치는 활성

혈청내 AST와 ALT의 수준을 확인한 결과 TAA를 처리한 대조군의 경우 정상군에 비하여 AST와 ALT의 수준이 현저히 증가하였다. 이에 비하여 5 mg/kg의 reynosine을 투여한 실험군의 경우 대조군에 비하여 AST의 경우 69.7％, ALT의 경우 77％ 감소함을 확인할 수 있었다.

즉, 도 10a 내지 도 10b에 도시된 바와 같이 TAA 유도 간경화 동물모델실험에서 혈청을 분리하여 reynosin이 ALT와 AST에 영향을 주는지 대조군과 TAA처리군과 함께 측정하였다. 대조군(salin)에 비해 TAA만 처리한 그룹에서는 ALT와 AST의 수치가 상당히 높게 올라갔으나 reynosin전처리 그룹에서는 농도 의존적으로 억제되는 것을 볼 수 있었다.

간 조직 내에서 세포 사멸 관련 유전자 발현에 미치는 Reynosine의 활성

동물 실험의 종료 후 적출된 간조직으로부터 RNA를 추출하고 RT-PCR을 이용하여 세포 사멸에 관련한 유전자의 발현을 측정하였다. 그 결과 간 세포의 사멸을 억제하는 유전자인 bcl-2와 bcl-xL의 경우 TAA만을 처리한 대조군에서는 정상군에 비하여 bcl-2의 경우 22.9％, bcl-xL의 경우 19.6％ 감소하였고, reynosine 처리군은 도 11 및 도 12에서와 같이 농도 의존적으로 그 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.

즉, 도 11에서 마우스 간세포에서 reynosin전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bcl-2 mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기영동한 결과이다. 대조군을 100%로 기준했을 때, TAA만 처리한 그룹에서는 22.9%까지 감소되었으나 reynosin전처리 그룹에서는 농도 의존적으로 증가되는 양상을 나타내고, 도 12에서 마우스 간세포에서 reynosin 전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bcl-xL mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기 영동한 결과이다. 대조군을 100%로 기준했을 때, TAA만 처리한 그룹에서는 19.6%까지 감소되었으나 reynosin전처리 그룹에서는 농도 의존적으로 증가되는 양상을 나타낸다.

또한, 세포 사멸을 유도하는 유전자인 bax의 경우 첨부된 도 13에서 도시된 바와 같이 마우스 간세포에서 reynosin전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bax mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기영동한 결과로서, 이 대조군을 100%로 기준했을 때, TAA만 처리한 그룹에서는 393.2%까지 증가되었으나 reynosin 전처리 그룹에서는 농도 의존적으로 억제되는 양상을 나타남으로서, TAA를 처리한 대조군의 경우 정상군에 비하여 그 발현 정도가 3.9배 증가하였으며 reynosine 처리군의 경우 그 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.

TUNEL 염색결과 rynosine의 간세포 사멸 억제 활성

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick-end-labelin (TUNEL) 염색법은 세포 사멸을 확인할 때 쓰이는 실험기법이다.

본 실험에서도 이를 확인하기 위하여 TUNEL 기법을 이용하여 간 조직을 염색하였다. 도 14a 내지 도 14d에서 도시된 바와 같이 정상군 도 14a에 비하여 TAA를 처리한 실험군 도 14b의 경우 붉은 갈색으로 염색된 핵이 많이 관찰되는데 이것이 세포 사멸이 일어나 DNA 응축이 일어난 것이다. 이러한 염색된 핵의 비율은 정상군에 비하여 TAA 처리한 대조군에서 높아져 간조직내 세포 사멸을 TAA가 증가시킴을 확인하였다. 그러나 reynosine의 경우 도 14c, 도 14d에서와 같이 염색된 핵의 비율이 감소하여 세포 사멸이 억제 되었음을 확인할 수 있다.

즉, 첨부된 도 14a 내지 도 14d에서 갈색으로 염색된 핵은 TUNEL positive cell로 TAA처리군에서는 증가하였다가 reynosin을 투여한 군에서는 농도 의존적으로 줄어드는 것을 확인할 수 있다.

조직학적 분석 결과

TAA에 의한 간세포 사멸 및 간 섬유화의 정도와 reynosine에 의한 억제 활성을 확인하기 위하여 hematoxilin & eosine 염색을 수행하여 그 결과를 첨부된 도 15a 내지 도 15d에 도시하였다. 그 결과 TAA를 처리한 대조군 도 15b의 경우 정상군 15a에 비하여 조직의 괴사가 일어난 부분과 섬유화가 진행되는 부분이 많이 관 찰된데 비하여 reynosine의 경우 그러한 괴사 부분과 섬유화 진행 부분이 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있다.

즉. 도 15a 내지 도 15d에서 Reynosin을 전처리하고 TAA로 간경화를 유도하는 동물실험에서 간조직을 paraformaldehyde로 고정하고 paraffin section을 통해 헤마톡실린/에오신 염색을 하였다. 그 결과, TAA만 처리한 간조직의 손상이 reynosin의 농도 의존적으로 간의 손상을 줄이고 있음을 확인할 수 있다.

실험결과 2

TAA는 흰쥐에 공급하였을 때 간 세포의 사멸 및 세포의 괴사를 유도하는 물질로 잘알려져 있다.(Chen LH, Hsu CY, Weng CF. Involvement of P53 and Bax/Bad triggering apoptosis in thioacetamide-induced hepatic epithelial cells. World J Gastroenterol 2006;12:5175-5181. 참조)

간세포의 사멸은 만성과 급성의 간질환에 나타나는 기본적인 과정이다. 간 조직의 괴사, 염증, 섬유화등이 이러한 세포 사멸 과정을 동반하여 일어난다.(Franchini C, Fontana F, Minuzzo M, Babbio F, Privitera E. Apoptosis promoted by up-regulation of TFPT (TCF3 fusion partner) appears p53 independent, cell type restricted and cell density influenced. Apoptosis 2006; Faouzi S, Burckhardt BE, Hanson JC,Campe CB, Schrum LW, Rippe RA, Maher JJ. Anti-Fas induces hepatic chemokines and promotes inflammation by an NF-kappa B-independent, caspase-3-dependent pathway. J Biol Chem 2001;276:49077- 49082. 참조)

간 조직의 괴사 및 염증 등의 과정이 지나면 간 세포의 섬유화가 일어나는데 이것이 더욱 진행되게 되면 간경변까지 이르게 된다.

예를 들어 담관 폐쇄에 의한 담즙 억제 유도 동물 모델에서 세포 사멸 억제 물질을 투여해 준 결과 간의 섬유화 진행이 많이 완화되었다. 또한 간성상 세포의 활성화에 의해 간세포의 사멸이 유도된다.

본 발명에서는 TAA를 처리한 간세포에서 유도되는 간세포의 사멸이 reynosine에 의해 억제될 수 있는지 생체 내외 실험을 통하여 확인하였다.

TAA 100 mM을 일차 배양된 간세포에 처리한 결과 50％ 이상의 세포 사멸이 관찰되었는데 reynosine의 전처리 결과 대조군에 비하여 세포 사멸을 억제한 것으로 확인되었다. 이러한 활성은 농도 의존적이다. 간 세포의 사멸은 Annexin-V와 PI 염색을 통한 flow cytometry 분석을 통해 확인하였고 DNA 손상은 DNA fragmentation 기법을 통해 확인하였는데 reynoine은 두 결과 모두에서 세포 사멸 억제 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 동물 실험을 통해서도 확인되었는데 간조직의 TUNEL 염색결과에서도 확인하였다.

이러한 세포 사멸은 세포 사멸 관련 유전자의 활성화 혹은 억제에 의해서 조절된다. 이들 중 Bcl-2 관련 단백질은 세포 사멸을 억제시키거나 활성화시키는 작용을 하게 된다. 그 중 Bcl-2, Bcl-xL, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1 와 A는 세포 사멸 억제작용을 하게 되고 Bax, Bak, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik 와 Hrk의 경우는 세포 사멸을 유도하는 작용을 한다.

본 실험에서는 이들 유전자의 발현을 통해 TAA에 의해 유도되는 세포 사멸에서 reynosine의 작용을 확인하기 위하여 RT-PCR을 통해 이들 유전자의 발현을 정량하였다. 그 결과 세포 사멸을 억제하는 bcl-2와 bcl-xL의 경우는 그 발현이 증가하였으며 세포 사멸을 유도하는 bax의 경우는 그 발현이 감소하여 reynosine은 세포 사멸 관련 유전자의 발현을 조절하여 세포 사멸을 억제함을 확인할 수 있다.

간 세포의 사멸을 억제하는 reynosine의 활성이 생체내 간조직에서도 나타나는지 확인하기 위하여 TAA에 의해 간세포의 사멸과 간 섬유화를 유도한 동물 모델을 이용하였다. 우선 간손상 억제 여부를 판단하기 위하여 혈청내 AST와 ALT의 수준을 확인한 결과 간손상시 그 효소 활성이 증가하는 AST와 ALT의 수준이 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 간의 조직학적 분석에서도 확인할 수 있다.

이상의 결과로 미루어 보아 Laurus nobilis의 잎에서 분리된 reynosine은 간세포의 사멸을 억제하여 간손상을 줄임으로써 간세포의 사멸에 의해 동반되는 간섬유화 역세 억제함을 생체 내외 실험을 통해 확인하다.

이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예들에 의해 한정되지 않고, 당업자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

도 1은 본 발명에 따른 월계수 추출물의 레이노신 분리방법에 따른 모식도

도 2는 본 발명에 따른 월계수 추출물의 레이노신의 화학 구조식

도 3은 간세포에 대한 reynosin의 세포독성 결과를 도시한 그래프

도 4는 간세포에서 reynosin을 전처리하고 TAA로 세포사멸을 유도한 후 세포 생존율 비교표

도 5는 간세포에서 reynosin에 의해 apoptosis가 감소함에 따라 TAA로 세포사멸을 결과를 나타내는 도표

도 6은 reynosin에 의해 DNA 손상이 감소함에 따라 TAA로 세포사멸의 변화를 나타내는 도면

도 7은 간세포에서 RT-PCR 방법으로 Bcl-2 mRNA 발현의 결과를 도시한 도면

도 8은 간세포에서 RT-PCR 방법으로 reynosin 전처리 후 Bcl-xL mRNA의 발현의 결과를 도시한 도면

도 9는 간세포에서 reynosin을 전처리한 다음 TAA로 aopotosis를 유도한 후 Bax mRNA를 전기영동한 결과를 도시한 도면

도 10a는 TAA유도 간경화 동물모델실험에서 혈청을 분리하여 reynosin이 ALT에 영향에 대해 대조군과 TAA처리군 측정한 결과를 도시한 도면

도 10b는 TAA유도 간경화 동물모델실험에서 혈청을 분리하여 reynosin이 AST에 영향에 대해 대조군과 TAA처리군 측정한 결과를 도시한 도면

도 11은 쥐 간세포에서 reynosin전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bcl-2 mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기영동한 결과를 도시한 도면

도 12는 쥐 간세포에서 reynosin전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bcl-xL mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기 영동한 결과를 도시한 도면

도 13은 쥐 간세포에서 reynosin전처리 후 TAA유도 apoptosis에 대한 Bax mRNA의 발현을 RT-PCR로 수행하고 전기영동한 결과를 도시한 도면

도 14a 내지 도 14d는 TAA의 reynosin의 효과로서 쥐 간세포에서 DNA 손상 감소를 도시한 그림.

도 15a 내지 도 15d는 TAA의 reynosin의 효과로서 간경화 손상 감소를 도시한 그림

도 16 내지 도 18은 본 발명에 따른 월계수 추출물에서 새롭게 분리된 순수 단일 물질의 화학 구조식

Claims

하기 화학식의 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간 보호 또는 간 경화 및 간섬유화 치료 또는 예방에 유효한 양으로 함유함을 특징으로 하는 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물.

[화학식]
제 1 항에 있어서,

상기 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간세포의 자가사멸을 억제하는 작용을 가짐을 특징으로 하는 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간세포의 손상을 억제하는 작용을 가짐을 특징으로 하는 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 간성상 세포의 자가사멸을 촉진하는 작용을 가짐을 특징으로 하는 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방에 유효한 양의 레이노신을 포함하는 월계수 단일성분은 1∼200 ㎎/㎏체중의 양으로 함유되는 것을 특징으로 하는 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방에 유효한 추출물의 유효성분으로서 reynosin (A)외에 baynol C (B), 3-hydroxycarvotagenone (E), 2-cyclohexene-1-one (F), Methyl p-hydroxy-trans cinnamate (I), zaluzanin D (K), Cis-p-menth-1 (10)-ene-2,7-diol 7-acetate (M), Vanilin (P), Anhydroperoxycostunolide (Q), 14-Oxomelampolide (R), Parthenolide (S) 또는 1,5-Naphtalenediol (T) 중 어느 하나의 화합물이 함유되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 간경화 및 간섬유화 치료 또는 예방용 조성물.